Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Верзија претраживача коју користите има ограничену подршку за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).У међувремену, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказаћемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Постоји потреба за поузданим ин витро системом који тачно може да репродукује физиолошко окружење срца за испитивање дрога.Ограничена доступност система културе људских срчаних ткива довела је до нетачних интерпретација ефеката срчаних лекова.Овде смо развили модел културе срчаног ткива (ЦТЦМ) који електромеханички стимулише резове срца и подлеже физиолошком истезању током систолне и дијастолне фазе срчаног циклуса.Након 12 дана културе, овај приступ је делимично побољшао одрживост срчаних пресека, али није у потпуности сачувао њихов структурни интегритет.Стога, након скрининга малих молекула, открили смо да је додавање 100 нМ тријодотиронина (Т3) и 1 μМ дексаметазона (Дек) нашем медијуму одржавало микроструктуру секција током 12 дана.У комбинацији са третманом Т3/Дек, ЦТЦМ систем је одржавао транскрипционе профиле, одрживост, метаболичку активност и структурни интегритет на истом нивоу као свеже срчано ткиво током 12 дана.Поред тога, прекомерно истезање срчаног ткива у култури индукује хипертрофичну срчану сигнализацију, пружајући доказе о способности ЦТЦМ-а да опонаша хипертрофична стања изазвана истезањем срца.У закључку, ЦТЦМ може моделирати физиологију и патофизиологију срца у култури током дугих временских периода, омогућавајући поуздан скрининг лекова.
Пре клиничког истраживања, потребни су поуздани ин витро системи који могу тачно да репродукују физиолошко окружење људског срца.Такви системи би требали опонашати мимички механички стрелићи, откуцаји срца и електрофизиолошке својства.Животињски модели се обично користе као платформа за скрининг за срчану физиологију са ограниченом поузданошћу у одражавању ефеката лекова на људско срце1,2.На крају крајева, Идеални експериментални модел културе срчаног ткива (ЦТЦМ) је модел који је веома осетљив и специфичан за различите терапеутске и фармаколошке интервенције, прецизно репродукујући физиологију и патофизиологију људског срца3.Одсуство таквог система ограничава откриће нових третмана за срчану инсуфицијенцију4,5 и довело је до кардиотоксичности лекова као главног разлога за излазак са тржишта6.
Током протекле деценије, осам некардиоваскуларних лекова је повучено из клиничке употребе јер изазивају продужење КТ интервала што доводи до вентрикуларних аритмија и изненадне смрти7.Стога, постоји све већа потреба за поузданим претклиничким скрининг стратегијама за процену кардиоваскуларне ефикасности и токсичности.Недавна употреба кардиомиоцита (хиПС-ЦМ) изазваних плурипотентним матичним ћелијама изазваних људима у скринингу лекова и тестирању токсичности пружа делимично решење за овај проблем.Међутим, незрели природа кукова-ЦМС-а и недостатак вишећелијске сложености срчаног ткива су главна ограничења ове методе.Недавне студије су показале да се ово ограничење може делимично превазићи коришћењем раног хиПС-ЦМ за формирање хидрогелова срчаног ткива убрзо након почетка спонтаних контракција и постепеног повећања електричне стимулације током времена.Међутим, ови кукови-цм микротизам недостају зрели електрофизиолошка и контрактилна својства одраслих миокарда.Поред тога, људско срчано ткиво има сложенију структуру, која се састоји од хетерогене мешавине различитих типова ћелија, укључујући ендотелне ћелије, неуроне и стромалне фибробласте, међусобно повезане специфичним скуповима протеина екстрацелуларног матрикса.Ова хетерогеност популација не-кардиомиоцита11,12,13 у срцу одраслих сисара је главна препрека моделирању срчаног ткива коришћењем појединачних типова ћелија.Ова главна ограничења наглашавају важност развоја метода за култивисање интактног ткива миокарда у физиолошким и патолошким условима.
Култивисани танки (300 µм) пресеци људског срца су се показали као обећавајући модел интактног људског миокарда.Ова метода омогућава приступ комплетном 3Д вишетешког система сличног ткива људског срца.Међутим, до 2019. године, употреба култивисаних срчаних одељења била је ограничена кратким преживљавањем (24 х) културе.Ово је због бројних фактора укључујући недостатак физичко-механичког истезања, интерфејс ваздух-течност и употребу једноставних медија који не подржавају потребе срчаног ткива.У 2019, неколико истраживачких група је показало да укључивање механичких фактора у системе културе срчаног ткива може продужити живот културе, побољшати срчану експресију и опонашати срчану патологију.Две елегантне студије 17 и 18 показују да једноосно механичко оптерећење има позитиван ефекат на срчани фенотип током културе.Међутим, ове студије нису користиле динамичко тродимензионално физичко-механичко оптерећење срчаног циклуса, пошто су делови срца били оптерећени или изометријским затезним силама 17 или линеарним ауксотонским оптерећењем 18 .Ове методе истезања ткива довеле су до супресије многих срчаних гена или прекомерне експресије гена повезаних са абнормалним одговорима на истезање.Посебно, Питоулис ет ал.19 је развио динамичку купку за културу исечака срца за реконструкцију срчаног циклуса коришћењем повратне спреге сонде силе и погона напетости.Иако овај систем омогућава прецизније ин витро моделирање срчаног циклуса, сложеност и ниска пропусност методе ограничавају примену овог система.Наша лабораторија је недавно развила поједностављени систем културе користећи електричну стимулацију и оптимизован медијум за одржавање виталности делова ткива свињског и људског срца до 6 дана20,21.
У тренутном рукопису описујемо модел културе срчаног ткива (ЦТЦМ) користећи делове свињског срца који укључује хуморалне знакове за рекапитулацију тродимензионалне срчане физиологије и патофизиолошке дистензије током срчаног циклуса.Овај ЦТЦМ може повећати тачност претклиничког предвиђања лекова на ниво који никада раније није постигнут тако што ће обезбедити исплатив срчани систем средњег протока који имитира физиологију/патофизиологију срца сисара за претклиничко тестирање лекова.
Хемодинамички механички сигнали играју критичну улогу у одржавању функције кардиомиоцита у виду 22,23,24.У тренутном рукопису развили смо ЦТЦМ (Слика 1а) који може да опонаша срчано окружење одраслих изазивањем и електричне и механичке стимулације на физиолошким фреквенцијама (1,2 Хз, 72 откуцаја у минути).Да бисте избегли прекомерно подешавање ткива током дијастоле, коришћен је 3Д уређај за штампање за повећање величине ткива за 25% (Сл. 1б).Електрични пејсинг индукован системом Ц-ПАЦЕ је временски подешен да почне 100 мс пре систоле коришћењем система за прикупљање података да би се у потпуности репродуковао срчани циклус.Систем културе ткива користи програмабилни пнеуматски актуатор (ЛБ Енгинееринг, Немачка) да циклично прошири флексибилну силиконску мембрану да изазове ширење срчаних кришки у горњој комори.Систем је повезан на спољни ваздушни вод преко претварача притиска, што је омогућило прецизно подешавање притиска (± 1 ммХг) и времена (± 1 мс) (слика 1ц).
а Причврстите део ткива на потпорни прстен од 7 мм, приказан плавом бојом, унутар коморе за културу уређаја.Комора за културу је одвојена од ваздушне коморе танком флексибилном силиконском мембраном.Поставите заптивку између сваке коморе да спречите цурење.Поклопац уређаја садржи графитне електроде који пружају електричну стимулацију.б Шематски приказ великог ткивног уређаја, водича за прстен и потпору.Секције ткива (смеђе) постављене су на превеликим уређају са водитељским прстеном постављеним у утор на спољној ивици уређаја.Помоћу водича пажљиво поставите прстен за подршку пресвучену акрилним лепилом ткива преко секције срчаног ткива.Ц Графикон приказује време електричне стимулације као функција притиска ваздушног комора који контролише програмибилни пнеуматски актуатор (ППД).Уређај за прикупљање података коришћен је за синхронизацију електричне стимулације користећи сензоре притиска.Када притисак у комори за културу дође до постављеног прага, сигнал пулса шаље се на Ц-ПАЦЕ-ЕМ да активира електричну стимулацију.д Слика четири ЦТЦМ-а постављена на полицу инкубатора.Четири уређаја су повезана на један ППД преко пнеуматског кола, а сензори притиска се убацују у хемостатски вентил за праћење притиска у пнеуматском колу.Сваки уређај садржи шест делова ткива.
Користећи један пнеуматски актуатор, могли смо да контролишемо 4 ЦТЦМ уређаја, од којих је сваки могао да држи 6 делова ткива (слика 1д).У ЦТЦМ-у, ваздушни притисак у ваздушној комори се претвара у синхрони притисак у комори за течност и индукује физиолошку експанзију срчаног пресека (слика 2а и додатни филм 1).Процена растезања ткива на 80 мм Хг.Уметност.показали да се истезање сектора ткива за 25% (слика 2б).Показало се да ово процентуално растезање одговара физиолошкој дужини саркомера од 2,2–2,3 µм за нормалну контрактилност срчаног пресека17,19,25.Покрет ткива је процењено коришћењем прилагођених поставки фотоапарата (додатна слика 1).Амплитуда и брзина кретања ткива (сл. 2ц, д) одговарале су истезању током срчаног циклуса и времену током систоле и дијастоле (слика 2б).Истезање и брзина срчаног ткива током контракције и опуштања остали су константни 12 дана у култури (Сл. 2Ф).Да бисмо проценили ефекат електричне стимулације на контрактилност током културе, развили смо метод за одређивање активног деформитета користећи алгоритам сенчења (додатна слика 2а, б) и били смо у стању да разликујемо деформитете са и без електричне стимулације.Исти део срца (слика 2ф).У покретном делу реза (Р6-9) напон током електричне стимулације био је 20% већи него у одсуству електричне стимулације, што указује на допринос електричне стимулације контрактилној функцији.
Репрезентативни трагови притиска у ваздушној комори, притиска у комори за течност и мерења кретања ткива потврђују да притисак у комори мења притисак у комори течности, изазивајући одговарајуће померање пресека ткива.б Репрезентативни трагови процентуалног растезања (плаво) делова ткива који одговарају проценту растезања (наранџасто).ц Измерено кретање срчаног пресека је у складу са измереном брзином кретања.(д) Репрезентативне путање цикличног кретања (плава линија) и брзине (наранџаста тачкаста линија) у делу срца.е Квантификација времена циклуса (н = 19 кришки по групи, од различитих свиња), времена контракције (н = 19 кришки по групи), времена релаксације (н = 19 кришки по групи, од различитих свиња), кретања ткива (н = 25).кришке)/групи од различитих свиња), вршну систолну брзину (н = 24(Д0), 25(Д12) кришке/групи од различитих свиња) и вршну стопу релаксације (н=24(Д0), 25(Д12) кришке/групи од различитих свиња).Т-тест са два реда није показало значајну разлику у било којем параметру.ф Репрезентативна анализа деформација трагова ткива са (црвеном) и без (плаве) електричне стимулације, десет регионалних области пресека ткива из истог пресека.Доњи панели показују квантификацију процентуалне разлике у напрезању у пресецима ткива са и без електричне стимулације у десет области из различитих пресека. (н = 8 кришке / група из различитих свиња, врши се двомесован студентски т-тест; **** п <0,0001, ** п <0,01, * п <0,05). (н = 8 кришке / група из различитих свиња, врши се двомесован студентски т-тест; **** п <0,0001, ** п <0,01, * п <0,05). (н = 8 срезов/група от разних свинеј, проводитса двусторонниј т-критериј Стьудента; ****п<0,0001, **п<0,01, *п<0,05). (н = 8 секција / група из различитих свиња, два репаног студента Т-тест; **** п <0,0001, ** п <0,01, * п <0,05). （н = 8 片/组, 来自不同的猪,进行双尾学生т 检验；****п < 0,0001,**п < 0,01，*п <0,01，。 （н = 8 片/组, 来自不同的猪,进行双尾学生т 检验；****п < 0,0001,**п < 0,01，*п <0,01，。 (н = 8 срезов/група, от разних свинеј, двусторонниј критеријум Стьудента; ****п <0,0001, **п <0,01, *п <0,05). (н = 8 секција / група, од различитих свиња, два репаног студента т-теста; **** п <0,0001, ** п <0,01, * п <0,05).Траке грешке представљају средњу вредност ± стандардну девијацију.
У нашем претходном статичком биомиметичком систему културе срчаних резова [20, 21], одржавали смо одрживост, функцију и структурни интегритет срчаних кришки током 6 дана применом електричне стимулације и оптимизацијом састава медијума.Међутим, након 10 дана, ове бројке су нагло пале.Позваћемо се на секције култивисане у нашем претходном статичком биомиметичком систему културе 20, 21 контролним условима (Цтрл) и користићемо наш претходно оптимизовани медијум као МЦ услове и културу под истовременом механичком и електричном стимулацијом (ЦТЦМ).зове .Прво смо утврдили да је механичка стимулација без електричне стимулације недовољна за одржавање виталности ткива током 6 дана (додатна слика 3а, б).Занимљиво је да је увођењем физио-механичке и електричне стимулације применом СТЦМ, одрживост 12-дневних пресека срца остала иста као код свежих пресека срца у условима МС, али не и под условима Цтрл, као што показује МТТ анализа (слика 1).3а).Ово сугерише да механичка стимулација и симулација срчаног циклуса могу одржати делове ткива одрживим двоструко дуже него што је пријављено у нашем претходном систему статичне културе.Међутим, процена структурног интегритета пресека ткива имунолошким обележавањем срчаног тропонина Т и конексина 43 показала је да је експресија конексина 43 била значајно већа у МЦ ткивима 12. дана него у контролама истог дана.Међутим, униформна експресија конексина 43 и формирање З-диска нису у потпуности одржани (слика 3б).Користимо оквир вештачке интелигенције (АИ) да квантификујемо структурни интегритет ткива26, цевовод дубоког учења заснован на сликама заснован на бојењу тропонином-Т и конексином43 да аутоматски квантификујемо структурни интегритет и флуоресценцију срчаних кришки у смислу јачине локализације.Овај метод користи конволуциону неуронску мрежу (ЦНН) и оквир дубоког учења да поуздано квантификује структурни интегритет срчаног ткива на аутоматизован и непристрасан начин, као што је описано у референци.26. МЦ ткиво је показало побољшану структурну сличност са даном 0 у поређењу са статичким контролним пресецима.Поред тога, Массоново трихромско бојење је открило значајно мањи проценат фиброзе у условима МС у поређењу са контролним условима 12. дана културе (Слика 3ц).Док је ЦТЦМ повећао одрживост делова срчаног ткива 12. дана на ниво сличан оном свежег срчаног ткива, није значајно побољшао структурни интегритет срчаних пресека.
Графикон показује квантификацију одрживости МТТ свежих кришки срца (Д0) или културе пресека срца током 12 дана било у статичкој култури (Д12 Цтрл) или у ЦТЦМ (Д12 МЦ) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл), 12 (Д12 МЦ) кришки/група, упоређено је у једном смеру од различитих тестова #1 #0#0;0п <#0ОВА; Д0 и **п ​​< 0,01 у поређењу са Д12 Цтрл). тракасти графикон приказује квантификацију одрживости МТТ свежих кришки срца (Д0) или културе пресека срца током 12 дана, било у статичкој култури (Д12 Цтрл) или у ЦТЦМ (Д12 МЦ) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл), 12 (Д12 МЦ) кришки/група, у једном смеру се изводи тест #1 ##0ОВА; на Д0 и **п ​​< 0,01 у поређењу са Д12 Цтрл).хистограм приказује квантификацију одрживости МТТ свежих пресека срца (Д0) или културе пресека срца током 12 дана у статичкој култури (Д12 контрола) или ЦТЦМ (Д12 МЦ) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 контрола). ), 12 (Д12 МЦ) начин на који се врши секција/група, један тест је изведен из различитих секција свиња/групе;####п < 0,0001 по сравнениу с Д0 и **п ​​< 0,01 по сравнениу с Д12 Цтрл). #### п <0,0001 у поређењу са Д0 и ** п <0,01 у поређењу са Д12 ЦТРЛ). а 条形图显示在静态培养(Д12 Цтрл) 或ЦТЦМ (Д12 МЦ) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл) 中新鲜心脏切片(Д2心脏切)片(Д12 МЦ)天的МТТ 活力的量化)，来自不同猪的的12 (Д12 МЦ) 切片/组，进行单向АНОВА 测向АНОВА 测自不同猪的的的 切片/组，进行单向АНОВА 测自不同猪的的，与Д12 Цтрл 相比，**п < 0,01). а 条形图显示在静态培养(Д12 Цтрл) 或ЦТЦМ (Д12 МЦ) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл) 中新鲜心脏切片(Д12 МЦ) (Д12 Цтрл) (Д12 МЦ) 切片/组,进行单向АНОВА 测试；与Д0 相比,####п < 0,0001,与Д12 Цтрл 相比，)**пхистограм који показује квантификацију виталности МТТ у свежим деловима срца (Д0) или пресецима срца култивисаним 12 дана у статичкој култури (Д12 контрола) или ЦТЦМ (Д12 МЦ) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 контрола)), 12 (Д12 МЦ) секција/група из различитих ОВАН тестова;####п < 0,0001 по сравнениу с Д0, **п < 0,01 по сравнени с Д12 Цтрл). #### п <0.0001 у поређењу са Д0, ** п <0,01 у поређењу са Д12 ЦТРЛ).б Тропонин-Т (зелено), конексин 43 (црвено) и ДАПИ (плаво) у свеже изолованим деловима срца (Д0) или деловима срца култивисаним у статичким условима (Цтрл) или ЦТЦМ условима (МЦ) током 12 дана) репрезентативних имунофлуоресцентних слика (празна скала = 100 µм). Квантификација структурног интегритета срчаног ткива вештачком интелигенцијом (н = 7 (Д0), 7 (Д12 Цтрл), 5 (Д12 МЦ) резова/група од сваке од различитих свиња, изведен је једносмерни АНОВА тест; ####п < 0,0001 у поређењу са Д0 и ****п < 01 у поређењу са Д0. Квантификација структурног интегритета срчаног ткива вештачком интелигенцијом (н = 7 (Д0), 7 (Д12 Цтрл), 5 (Д12 МЦ) резова/група, свака од различитих свиња, изведен је једносмерни АНОВА тест; ####п < 0,0001 у поређењу са Д0 и ****п < 01 у поређењу са Д0. Количественнаа оценка структурној целостности сердечној ткани искусственним интелектом (н = 7 (Д0), 7 (Д12 Цтрл), 5 (Д12 МЦ) срезов/група от разних свинеј, проводи се однофакторниј тест АНОВА; ####п < 0,0001 по сравнениу с Д0 и ****1 < 0, сравнено с Д0 и ****1 < 0,). Квантификација структурног интегритета срчаног ткива помоћу вештачке интелигенције (н = 7 (Д0), 7 (Д12 Цтрл), 5 (Д12 МЦ) секција/група од различитих свиња, изведен једносмерни АНОВА тест; ####п < 0,0001 наспрам Д0 и Д0.****п < у поређењу са Д0.****п <).人工智能量化心脏组织结构完整性（н = 7 (Д0), 7 (Д12 Цтрл), 5 (Д12 МЦ) пресека/група свака од различитих свиња, једносмерни АНОВА тест; ，****п < 0,0001 与Д12 Цтрл 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（н = 7 (Д0), 7 (Д12 Цтрл), 5 (Д12 МЦ) пресека/група свака од различитих свиња, једносмерни АНОВА тест; ****п < 0,0001 与Д12 Цтрл 相比）。 Искусственниј интеллект дла количественној оценки структурној целостности сердечној ткани (н = 7 (Д0), 7 (Д12 Цтрл), 5 (Д12 МЦ) срезов/група из разних свинеј, односторонниј тест АНОВА; ####п <0,0001 вс. Д0 Дла сравнениа ****п < 0, сравнениа ****п < 0, сЦтрл). Вештачка интелигенција за квантификацију структурног интегритета срчаног ткива (н = 7 (Д0), 7 (Д12 Цтрл), 5 (Д12 МЦ) секција/група сваки од различитих свиња, једносмерни АНОВА тест; ####п<0,0001 вс .Д00 За поређење ****02 < Цтрл). ц Репрезентативне слике (лево) и квантификација (десно) за кришке срца обојене Массоновом трихромном бојом (скала гола = 500 µм) (н = 10 резова/групи свака од различитих свиња, извршен је једносмерни АНОВА тест; ####п < 0,0001 у поређењу са Д0 и Д0201). ц Репрезентативне слике (лево) и квантификација (десно) за кришке срца обојене Массоновом трихромном бојом (скала гола = 500 µм) (н = 10 резова/групи од различитих свиња, извршен је једносмерни АНОВА тест; #### п < 0,0001 у поређењу са Д0 и Д0201). ц Репрезентативние изображениа (слева) и количественнаа оценка (справа) срезов сердца, украшених трихромним красителем Массона (масштаб без покритиа = 500 мкм) (н = 10 срезов/група от различитих свинеј, виполнаетса односсторонниј тест АНОВА; #### п < 0,0001 и 1 *** п < 0,0001 по сравнениу с Д Цтрл по сравнениу. ц Репрезентативне слике (лево) и квантификација (десно) пресека срца обојених Массоновом трихромном бојом (необложена скала = 500 µм) (н = 10 секција/групи од различитих свиња, извршен једносмерни АНОВА тест; #### п < 0 .0001 у поређењу са Д0 и 0 ***п < у поређењу са Д0 и 0 ***п <). ц 用Массон 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（右）（裸0 м 0º个切片/组,每组来自不同的猪,进行单向АНОВА 测试；#### п < 0,0001 与Д0 相比，，进行单向АНОВА 测试；#### п < 0,0001 与Д0 相比． 。 Ц 用 массон 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸壸度度 = 500 µм） （н = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 组 每 组 每 组 来自 不同 猪相比,***п <0,001 与Д12 Цтрл 相比）。 ц Репрезентативние изображениа (слева) и количественниј анализ (справа) срезов сердца, украшенних трихромним красителем Массона (чистаа скала = 500 мкм) (н = 10 срезов/група, каждиј от свиньи, протестировано с помосьу однофакторного дисперсионного анализа ;### #00, сравнено сравнено по сравнениу ;### #00, сравнено по сравнениу по ***0 по ***0 2 Цтрл). ц Репрезентативне слике (лево) и квантитација (десно) делова срца обојених Массоновом трихромном бојом (празно = 500 µм) (н = 10 делова/групи, сваки од различите свиње, тестирано једносмерном анализом варијансе ;### # п < 0,0001 у поређењу са Д0, ***02 у поређењу са Д0.Траке грешке представљају средњу вредност ± стандардну девијацију.
Претпоставили смо да би се додавањем малих молекула у медијум културе могао побољшати интегритет кардиомиоцита и смањити развој фиброзе током ЦТЦМ културе.Због тога смо прегледали мале молекуле користећи наше статичке контролне културе20,21 због малог броја збуњујућих фактора.За овај екран су изабрани дексаметазон (Дек), тријодотиронин (Т3) и СБ431542 (СБ).Ови мали молекули су раније коришћени у хиПСЦ-ЦМ културама да индукују сазревање кардиомиоцита повећањем дужине саркомера, Т-тубула и брзине проводљивости.Поред тога, познато је да и Дек (глукокортикоид) и СБ сузбијају упалу29,30.Стога смо тестирали да ли би укључивање једног или комбинације ових малих молекула побољшало структурни интегритет срчаних делова.За почетни скрининг, доза сваког једињења је одабрана на основу концентрација које се обично користе у моделима ћелијске културе (1 μМ Дек27, 100 нМ Т327 и 2,5 μМ СБ31).После 12 дана културе, комбинација Т3 и Дек-а је резултирала оптималним структурним интегритетом кардиомиоцита и минималним фиброзним ремоделирањем (додатне слике 4 и 5).Поред тога, употреба двоструких или двоструких ових концентрација Т3 и Дек-а произвела је штетне ефекте у поређењу са нормалним концентрацијама (додатна слика 6а, б).
Након почетног скрининга, извршили смо директно поређење 4 услова културе (Слика 4а): Цтрл: пресеци срца култивисани у нашој претходно описаној статичкој култури коришћењем нашег оптимизованог медијума;20.21 ТД: Т3 и Цтрл додали Дек у среду;МЦ: пресеци срца култивисани у ЦТЦМ коришћењем нашег претходно оптимизованог медијума;и МТ: ЦТЦМ са Т3 и Дек додатим медијуму.После 12 дана култивације, одрживост МС и МТ ткива остала је иста као у свежим ткивима процењеним МТТ тестом (слика 4б).Занимљиво је да додавање Т3 и Дек-а трансвелл културама (ТД) није резултирало значајним побољшањем одрживости у поређењу са условима Цтрл, што указује на важну улогу механичке стимулације у одржавању одрживости срчаних секција.
Дијаграм експерименталног дизајна који приказује четири услова културе коришћена за процену ефеката механичке стимулације и додатка Т3/Дек на медијуму током 12 дана. б Графикон показује квантификацију виталности 12 дана након културе у сва 4 услова културе (Цтрл, ТД, МЦ и МТ) у поређењу са свежим кришкама срца (Д0) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МТ), 12 (Д12 МЦ) кришки/група, једносмерни тест #0##ОВА је изведен из различитих пика. , ###п < 0,001 у поређењу са Д0 и **п ​​< 0,01 у поређењу са Д12 Цтрл). б Графикон показује квантификацију виталности 12 дана након културе у сва 4 услова културе (Цтрл, ТД, МЦ и МТ) у поређењу са свежим кришкама срца (Д0) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МТ), 12 (Д12 МЦ) кришки/група, једносмерни тест #0##ОВА је изведен из различитих пика. , ###п < 0,001 у поређењу са Д0 и **п ​​< 0,01 у поређењу са Д12 цтрл). б Гистограмма показује количествену оценку жизнеспособности кроз 12 дана после култивисања свих 4 услова култивисања (контроль, ТД, МЦ и МТ) по сравњењу са свежим срезама сердца (Д0) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 ТД и Д12 МТ1, Д12 ТД и Д12 МТ12 теста однорезниј 12), 12 тестова однорезниј (12) МЦ АНОВА; ####п < 0,0001, ###п < 0,001 по сравњењу с Д0 и **п ​​< 0,01 по сравнењу с Д12 Цтрл). б Графикон показује квантификацију виталности 12 дана након културе у сва 4 услова културе (контрола, ТД, МЦ и МТ) у поређењу са свежим пресецима срца (Д0) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МТ), 12 (Д12 МЦ, Д12 МТ), 12 (Д12, МЦ, МЦ из различитих секција; ##п један тест из различитих делова. 0001, ###п < 0,001 у односу на Д0 и **п ​​< 0,01 у поређењу са Д12 Цтрл). б 条形图显示所有4 种培养条件 (Цтрл、ТД、МЦ 和МТ)）与新鲜心脏切片 (Д0) (н = 18 (Д15) (н = 18 (Д15) ТД1 「ТД МТ)，来自不同猪的12 (Д12 МЦ) 切片/组，进行单向АНОВА 测试；####п < 0,0001，###п < 0,010 **0,00与Д12控制）.б 4 12 (Д12 МЦ) б Гистограмма, показиваусаа все 4 условиа култиварованиа (контроль, ТД, МЦ и МТ) по сравнениу со свежими срезами сердца (Д0) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МТ), от разних свинеј 12 (Д12 МЦ) ссторони, ## 0групп0 #1 #10 тест0 #1 #1 #1 #10 тест0 <0,001 по сравнениу с Д0, **п <0,01 по сравнениу с контролем Д12). б Хистограм који приказује сва 4 услова културе (контрола, ТД, МЦ и МТ) у поређењу са свежим пресецима срца (Д0) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МТ), од различитих свиња 12 (Д12 МЦ) секција/група, једносмерни АНОВА тест, ###0п<0.##0п<0. 0, **п<0,01 у односу на контролу Д12). ц Тракасти графикон приказује квантификацију протока глукозе 12 дана након културе у сва 4 услова културе (Цтрл, ТД, МЦ и МТ) у поређењу са свежим кришкама срца (Д0) (н = 6 резова/групи од различитих свиња, извршен је једносмерни АНОВА тест; ###п < 0,001, у поређењу са Д0 и 02 Цтрл < ). ц Тракасти графикон приказује квантификацију протока глукозе 12 дана након културе у сва 4 услова културе (Цтрл, ТД, МЦ и МТ) у поређењу са свежим кришкама срца (Д0) (н = 6 резова/групи од различитих свиња, извршен је једносмерни АНОВА тест; ###п < 0,001, у поређењу са Д0 и 02 Цтрл < ). ц Гистограмма показује количествену оцену потока глукози через 12 дана после култивисања во всех 4 условиа култиварованиа (контроль, ТД, МЦ и МТ) по сравнениу со свежими срезами сердца (Д0) (н = 6 срезов/група от разних свинеј, односторонниј Виполнаетса < тест АНОВА; ##00 с ***0 сравнени с АНОВА; ##00 ***п1 < 0 2 Цтрл). ц Хистограм показује квантификацију флукса глукозе 12 дана након културе под сва 4 услова културе (контрола, ТД, МЦ и МТ) у поређењу са свежим пресецима срца (Д0) (н = 6 секција/групи од различитих свиња, изведен једносмерни АНОВА тест; ###п < 0,001 у поређењу са Д0 и Д01 ***п1). ц 条形图显示所有4 种培养条件 (Цтрл、ТД、МЦ 和МТ) 与新鲜心脏切片 (Д0) 种培养条件 (Цтрл、ТД、МЦ 和МТ)）与新鲜心脏切片(Д0) 种培养条件（Цтрл、ТД、МЦ 和МТ)糖通量定量（н = 6 片/组,来自不同猪,单向执行АНОВА 测试；###п < 0.001，与п00.***相比）. Ц 条形图 显示 所有 4 种 条件 （ (цтрл 、 тд 、 мц 和 мт)养 后 后 12 天 的 通 量 定 量 （н = 6 片/组 , 来自 猪 ， ， ， , Ａ ， Ｇ ， ， ， ， ， ，测试；###п < 0,001,与Д0 相比,***п <0,001 与Д12 Цтрл 相比）。 ц Гистограмма, показиваусаа количественнуу оценку потока глукози через 12 днеј после култиварованиа дла всех 4 услова култиварованиа (контроль, ТД, МЦ и МТ) по сравнениу со свежими срезами сердца (Д0) (н = 6 срезов/група, от разних свињј, односторонниј Били ## тести п00, сравнено с АНОВА; 1 по сравнениу с Д12 (контроль). ц Хистограм који показује квантификацију флукса глукозе 12 дана након културе за сва 4 услова културе (контрола, ТД, МЦ и МТ) у поређењу са свежим пресецима срца (Д0) (н = 6 секција/групи, од различитих свиња, једнострано Да ли су АНОВА тестови урађени, ###п < 0,010 у поређењу са Д0,001 ***п < 0,010 ***п).д Графичке анализе соја свежих (плавих), 12. МЦ (зелено) и 12. МТ (црвено) ткива на десет тачака регионалног пресека ткива (н = 4 кришке/групи, једносмерни АНОВА тест; није било значајне разлике између група).е Вулкански графикон који приказује различито експримиране гене у свежим деловима срца (Д0) у поређењу са деловима срца култивисаним у статичким условима (Цтрл) или у МТ условима (МТ) током 10-12 дана.ф Хеатмап гена саркомера за срчане пресеке култивисане у сваком од услова културе.Траке грешке представљају средњу вредност ± стандардну девијацију.
Метаболичка зависност од преласка са оксидације масних киселина на гликолизу је обележје дедиференцијације кардиомиоцита.Незрели кардиомиоцити првенствено користе глукозу за производњу АТП-а и имају хипопластичне митохондрије са неколико криста5,32.Анализе искоришћења глукозе су показале да је у условима МЦ и МТ искоришћеност глукозе била слична оној у ткивима 0 дана (Слика 4ц).Међутим, Цтрл узорци су показали значајно повећање у искоришћењу глукозе у поређењу са свежим ткивом.Ово указује да комбинација ЦТЦМ и Т3/Дек побољшава виталност ткива и чува метаболички фенотип 12-дневних култивисаних пресека срца.Поред тога, анализа соја је показала да су нивои соја остали исти као у свежем срчаном ткиву током 12 дана у условима МТ и МС (слика 4д).
Да бисмо анализирали укупан утицај ЦТЦМ-а и Т3/Дек-а на глобални транскрипциони пејзаж ткива срчаног пресека, извели смо РНАсек на срчаним резовима из сва четири различита стања културе (додатни подаци 1).Занимљиво је да су МТ секције показале високу транскрипциону сличност са свежим срчаним ткивом, са само 16 различито експримираних од 13.642 гена.Међутим, као што смо раније показали, Цтрл резови су приказали 1229 различито експримираних гена након 10-12 дана у култури (слика 4е).Ови подаци су потврђени кРТ-ПЦР гена срца и фибробласта (додатна слика 7а-ц).Занимљиво је да су Цтрл секције показале смањење регулације гена срчаног и ћелијског циклуса и активацију програма инфламаторних гена.Ови подаци сугеришу да је дедиференцијација, која се обично јавља након дуготрајног култивисања, потпуно ослабљена под МТ условима (додатна слика 8а, б).Пажљиво проучавање гена саркомера показало је да су само у МТ условима очувани гени који кодирају саркомер (слика 4ф) и јонски канал (допунска слика 9), штитећи их од супресије под условима Цтрл, ТД и МЦ.Ови подаци показују да уз комбинацију механичке и хуморалне стимулације (Т3/Дек), транскриптом срчаног кришка може остати сличан свежим кришкама срца након 12 дана у култури.
Ови транскрипциони налази су подржани чињеницом да је структурни интегритет кардиомиоцита у срчаним пресецима најбоље очуван у МТ условима током 12 дана, као што показује интактни и локализовани конексин 43 (слика 5а).Поред тога, фиброза у срчаним деловима под МТ условима је значајно смањена у поређењу са Цтрл и слично свежим пресецима срца (слика 5б).Ови подаци показују да комбинација механичке стимулације и Т3/Дек третмана ефикасно чува срчану структуру у срчаним деловима у култури.
а Репрезентативне имунофлуоресцентне слике тропонина-Т (зелено), конексина 43 (црвено) и ДАПИ (плаво) у свеже изолованим деловима срца (Д0) или култивисани 12 дана у сва четири услова културе срчаног пресека (скала бар = 100 µм).). Квантификација структурног интегритета срчаног ткива вештачком интелигенцијом (н = 7 (Д0 и Д12 Цтрл), 5 (Д12 ТД, Д12 МЦ и Д12 МТ) резова/група од различитих свиња, извршен је једносмерни АНОВА тест; ####п < 0,0001, у поређењу са Д0****0 0 0 0 0 1. 2 Цтрл). Квантификација структурног интегритета срчаног ткива вештачком интелигенцијом (н = 7 (Д0 и Д12 Цтрл), 5 (Д12 ТД, Д12 МЦ и Д12 МТ) резова/група од различитих свиња, извршен је једносмерни АНОВА тест; #### п < 0,0001, у поређењу са Д0****0 0 0 0 0. 2 Цтрл). Количественнаа оценка структурне целостности ткани сердца помоћу искусног интелекта (н = 7 (Д0 и Д12 Цтрл), 5 (Д12 ТД, Д12 МЦ и Д12 МТ) срезов/група от разних свинеј, спроведен однофакторниј тест АНОВА; ### п < 0,0001 по < 0,0001 по <0,0001 по < 0,0001 по <0,0001 по сравнении с Д0,01 *п Цтрл). Квантификација структурног интегритета срчаног ткива коришћењем вештачке интелигенције (н = 7 (Д0 и Д12 Цтрл), 5 (Д12 ТД, Д12 МЦ и Д12 МТ) секција/група од различитих свиња, обављен једносмерни АНОВА тест; #### п < 0,0001 или *п <0,0001 или *п <0,00 01 у поређењу са Д****01. Цтрл).对不同猪的心脏组织结构完整性(н = 7(Д0 和Д12 Цтрл)、5(Д12 ТД、Д12 МЦ)（Д12躉绌（Д12 МТ工智能量化,进行单向АНОВА 测试；#### п < 0,0001 与Д0 和*п < 0,05 相比,或相比, 或****п < 0,00012对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （н = 7 (д0 和 д12 цтрл) （5 (д12 тд 、 д12 мц （д12 мц （ （庉 （ мц （智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## п < 0,0001 与Д0 和*п < 0,05 相1我**** ； 01 戔相比）.Квантификација структурног интегритета срчаног ткива коришћењем вештачке интелигенције код различитих свиња (н = 7 (Д0 и Д12 Цтрл), 5 (Д12 ТД, Д12 МЦ и Д12 МТ) секција/група) са једносмерним АНОВА тестом;#### п < 0,0001 по сравнениу с Д0 и *п < 0,05 или ****п < 0,0001 по сравнениу с Д12 Цтрл). #### п < 0,0001 у поређењу са Д0 и *п < 0,05 или ****п < 0,0001 у поређењу са Д12 Цтрл). б Репрезентативне слике и квантификација за кришке срца обојене Массоновом трихромном бојом (барем на скали = 500 µм) (н = 10 (Д0, Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МЦ), 9 (Д12 МТ) кришке/групи од различитих свиња, изведен је једносмерни АНОВА тест <10##0п; 0,001, или ****п < 0,0001 у поређењу са Д12 Цтрл). б Репрезентативне слике и квантификација за кришке срца обојене Массоновом трихромном бојом (барем на скали = 500 µм) (н = 10 (Д0, Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МЦ), 9 (Д12 МТ) кришке/групи од различитих свиња, изведен је једносмерни АНОВА тест <10##0п; 0,001, или ****п < 0,0001 у поређењу са Д12 Цтрл). б Репрезентативние изображениа и количественнаа оценка срезов сердца, украшених трихромним красителем Массона (масштабнаа линејка = 500 мкм) (н = 10 (Д0, Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МЦ), 9 (Д12 МТ) срезов/группа отсторонниј свинеј, сравнаваетса ## односторонниј тест, Д# сравнаваетса одно1 свинеј, Д12. 0 и ***п < 0,001 или ****п < 0,0001 по сравнениу с Д12 Цтрл). б Репрезентативне слике и квантификација пресека срца обојених Массоновом трихромном бојом (скала бар = 500 µм) (н = 10 (Д0, Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МЦ), 9 (Д12 МТ) секција/група од различитих свиња, изведена једносмерна АНОВА. 1 или ****п < 0,0001 у односу на Д12 Цтрл). б 用Массон 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化 (比例尺= 500 µД) = 1（ДЦтрл =）1（н和Д12 МЦ），来自不同猪的9 个 (Д12 МТ)）切片/组，进行单因素方差分的；#0#0***0Д 丛#0#0п < 0,001，或****п < 0,0001 与Д12 Цтрл 相比）。 б 用 массон 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µм цтрл 、 д12 тд 和 д12 мц） 来自 不同 的 9 个 д12 мт 切 片 切 片 切 片 切 片 切 片 切 片 切 片 切 燇 片 切 切 片 切 片 切 切 片 切 片 切 片 切 片片 切片 ​​切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素曛因素曹差分析， ，***п < 0,001,或****п < 0,0001 与Д12 Цтрл 相比）。 б Репрезентативние изображениа и количественнаа оценка срезов сердца, украшенних трихромом Массона (масштабнаа линејка = 500 мкм) (н = 10 (Д0, Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МЦ), 9 (Д12 МТ) срезов от разних свинеј / группи, один- способ АНп0 < # ***01 АНп0 ,001 или ****п < 0,0001 по сравнениу с Д12 Цтрл). б Репрезентативне слике и квантификација пресека срца обојених Массоновим трихромом (скала бар = 500 µм) (н = 10 (Д0, Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МЦ), 9 (Д12 МТ) секција различитих свиња/групе, једна АНОВА метода; ##.****0п <0.****,0п <0. < 0,0001 у поређењу са Д12 Цтрл).Траке грешке представљају средњу вредност ± стандардну девијацију.
Коначно, способност ЦТЦМ-а да опонаша срчану хипертрофију процењена је повећањем истезања срчаног ткива.У ЦТЦМ-у, вршни притисак у ваздушној комори порастао је са 80 ммХг на 80 ммХг.Уметност.(нормално истезање) до 140 ммХг Арт.(слика 6а).Ово одговара повећању растезања од 32% (слика 6б), што је раније приказано као одговарајући проценат истезања који је потребан да би секције срца постигле дужину саркомера сличне оној која се види код хипертрофије.Истезање и брзина срчаног ткива током контракције и опуштања остали су константни током шест дана културе (Сл. 6Ц).Срчано ткиво из МТ услова подвргнуто је нормалној итегри (МТ (нормално)) или овертретцх стања (МТ (ОС)) шест дана.Већ после четири дана у култури, хипертрофични биомаркер НТ-ПроБНП је значајно повишен у медијуму под МТ (ОС) условима у поређењу са МТ (нормалним) условима (слика 7а).Поред тога, након шест дана култури, величина ћелије у МТ (ОС) (Сл. 7б) значајно је порасла у поређењу са одељцима МТ Срца (нормално).Поред тога, НФАТЦ4 нуклеарна транслокација је значајно повећана у преоптерећеним ткивима (Сл. 7ц).Ови резултати показују прогресивни развој патолошког ремоделирања након хипердистензије и подржавају концепт да се ЦТЦМ уређај може користити као платформа за проучавање сигнализације срчане хипертрофије изазване истезањем.
Репрезентативни трагови притиска у ваздушној комори, притиска у комори за течност и мерења кретања ткива потврђују да притисак у комори мења притисак у комори течности, изазивајући одговарајуће померање пресека ткива.б Репрезентативни проценат истезања и криве брзине истезања за нормално растегнуте (наранџасте) и преоптерећене (плаве) делове ткива.ц Тракасти графикон који приказује време циклуса (н = 19 кришки по групи, од различитих свиња), време контракције (н = 18-19 кришки по групи, од различитих свиња), време релаксације (н = 19 кришки по групи, од различитих свиња) ), амплитуду кретања ткива (н = 14 кришки/групи, од различитих свиња), велоцити пеак систол пиллс) и пеак систол пигс стопа (н = 14 (Д0), 15 (Д6) ) секције/групе) од различитих свиња), двострани Студентов т-тест није показао значајну разлику ни у једном параметру, што указује да су ови параметри остали константни током 6 дана културе са пренапоном.Траке грешке представљају средњу вредност ± стандардну девијацију.
а Квантификација ступчастог графикона концентрације НТ-ПроБНП у медијумима за културу из резова срца култивисаних у условима нормалног растезања МТ (Норм) или прекомерног истезања (ОС) (н = 4 (Д2 МТНорм), 3 (Д2 МТОС, Д4 МТНорм и Д4 МТОС) кришке/групе од различитих свиња, упоређено је у два смера АН1. а Барграфска квантификација концентрације НТ-ПроБНП у медијуму за културу из резова срца култивисаних у условима нормалног растезања МТ (Норм) или прекомерног истезања (ОС) (н = 4 (Д2 МТНорм), 3 (Д2 МТОС, Д4 МТНорм и Д4 МТОС) кришке/група од различитих свиња, упоређено је два пута 2-стретцх 1 са 2-0;Квантитативни хистограм концентрације НТ-ПроБНП у медијуму културе из срчаних кришки култивисаних у условима нормалног МТ растезања (норма) или прекомерног растезања (ОС) (н = 4 (Д2 МТНорм), 3 (Д2 МТОС, Д4 МТНорм и Д4).МТОС) кришке/групе из различитих свиња, вршена је двофакторна анализа;**п < 0,01 по сравнениу с нормальним растажением). **п < 0,01 у поређењу са нормалним истезањем). а 在МТ 正常拉伸(Норм) 或过度拉伸(ОС) 条件下培养的心脏切片培养基中 НТ-ПроБНП 浓度拉伸(ОС). 4 (Д2 МТНорм)、3（Д2 МТОС、Д4 МТНорм 和Д4 МТОС)比, п < 0,01). а Квантификација концентрације НТ-ПроБНП у срчаним кришкама култивисаним у условима нормалног растезања МТ (Норм) или прекомерног растезања (ОС) (н = 4 (Д2 МТНорм), 3 (Д2 МТОС, Д4 МТНорм和Д4 МТОС) из различитих 猪的切片片，叐发动; **у поређењу са нормалним истезањем, п < 0,01).хистограм Квантификација концентрација НТ-ПроБНП у срчаним кришкама узгајаним у условима нормалног МТ растезања (норма) или прекомерног растезања (ОС) (н = 4 (Д2 МТНорм), 3 (Д2 МТОС, Д4 МТНорм) и Д4 МТОС) кришке/групе од различитих свиња, двосмерна анализа варијансе;**п < 0,01 по сравнениу с нормальним растажением). **п < 0,01 у поређењу са нормалним истезањем). б Репрезентативне слике за срчане кришке обојене тропонином-Т и ВГА (лево) и квантификацију величине ћелије (десно) (н = 330 (Д6 МТОС), 369 (Д6 МТНорм) ћелија/група од 10 различитих резова различитих свиња, извршен је Двострани Студент т-тест 0. ****0п01 < ). б Репрезентативне слике за срчане кришке обојене тропонином-Т и ВГА (лево) и квантификацију величине ћелија (десно) (н = 330 (Д6 МТОС), 369 (Д6 МТНорм) ћелија/група од 10 различитих резова различитих свиња, Дворепи Студентов т-тест је упоређен; 0. 0п0 < 0. стретцх < нормално). б Репрезентативние изображениа срезов сердца, украшених тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определениа размера ћелија (справа) (н = 330 (Д6 МТОС), 369 (Д6 МТНорм) клетки/групе из 10 различитих срезов от разних свињ, два- проводи хвостовиј т-денением, два- проводи хвостовиј т-денением; ). б Репрезентативне слике срчаних пресека обојених тропонином-Т и АЗП (лево) и квантификацијом величине ћелије (десно) (н = 330 (Д6 МТОС), 369 (Д6 МТНорм) ћелија/групи од 10 различитих пресека различитих свиња, урађен је дворепи Студентов т-тест <0****п10). Б 用 肌钙 蛋白 -Т 和 ВГА (左) 和 细胞 细胞 细胞 细胞 染色 染色 染色 的 染色 心脏 心脏 心脏 的 心脏 心脏 图像 心脏 心脏 心脏 图像 (н = 330 (д6 мтос), 来自 不同 猪 的 10 个 不同 切片 的 369 (Д6 мтнорм) 细胞 / 组, 两 进行 有尾 学生 т 检验; 与 正常 有尾 学生 т 检验; б Репрезентативне слике резова срца обојених калкареином-Т и ВГА (лево) и величине ћелије (десно) (н = 330 (Д6 МТОС), 369 из 10 различитих резова (Д6 МТНорм)) Ћелије/组,两方法漌****птретцх цомпаринг 0 .0001). б Репрезентативние изображениа срезов сердца, украшених тропонином-Т и АЗП (слева) и количественнаа оценка размера клетки (справе) (н = 330 (Д6 МТОС), 369 (Д6 МТНорм) из 10 различитих срезова от разних свињ Клетки/групе, двусторонние **** сравнение <бр><бр><бр><бр><бр><бр><бр><бр> б Репрезентативне слике пресека срца обојених тропонином-Т и АЗП (лево) и квантификација величине ћелије (десно) (н = 330 (Д6 МТОС), 369 (Д6 МТНорм) из 10 различитих пресека различитих свиња) Ћелије/група, двострани критеријум Студентов т;****п < 0,0001 у поређењу са нормалним напрезањем). ц Репрезентативне слике за дан 0 и дан 6 МТОС кришке срца имуно обележене за тропонин-Т и НФАТЦ4 и квантификацију транслокације НФАТЦ4 у језгра ЦМ (н = 4 (Д0), 3 (Д6 МТОС) кришке/групе од различитих свиња, Изведен је двострани студент 0. *п <тест). ц Репрезентативне слике за дан 0 и дан 6 МТОС срчане кришке имуно обележене за тропонин-Т и НФАТЦ4 и квантификацију транслокације НФАТЦ4 у језгра ЦМ (н = 4 (Д0), 3 (Д6 МТОС) кришке/групе од различитих свиња, Изведен је двострани студент 0 * тп-тест). ц Репрезентативне слике за срезове срца 0 и 6 дана МТОС, имуномечених за тропонина-Т и НФАТЦ4, и количествена оценка транслокације НФАТЦ4 у јадра кавернозних ћелија (н = 4 (Д0), 3 (Д6 МТОС) срезов/група виполнаутьса от различних свинеј , двусторониј, 0 ст.). ц Репрезентативне слике за срчане пресеке на МТОС од 0 и 6 дана, имуно обележене за тропонин-Т и НФАТЦ4, и квантификацију транслокације НФАТЦ4 у језгру кавернозних ћелија (н = 4 (Д0), 3 (Д6 МТОС) кришке/група од различитих свиња) обављен је двострани Студент тест;*п < 0,05). Ц 用 于 蛋白 -т 和 нфатц4 免疫 标记 的 的 0 天 和 第 6 天 和 和 天 МТОС 心脏 切片 的 代表性 以及 以及 以及 猪 的 以及 以及 以及 不同 猪 的 以及 以及 来自 不同 易位 至 цм 细胞 核 易位 至 цм (н = 4 (д0), 3 (д6 мтос) 切片 / 组, 进行 双尾 学生 т 检验; * п <0,05). ц Репрезентативне слике калканин-Т и НФАТЦ4 имунообележавања 第0天和第6天МТОС срчаних кришки и НФАТЦ4 из различитих количина НФАТЦ4 易位至ЦМ ћелијског језгра的化 (н = 4 (Д0), 闻组 (Д6), 餻组 (Д6) 餻双尾学生ет 电影；*п < 0,05). ц Репрезентативние изображениа срезов сердца МТОС на 0 и 6 ден дла имуномаркировки тропонином-Т и НФАТЦ4 и количественнаа оценка транслокации НФАТЦ4 в адра ЦМ от разнообразних свинеј (н = 4 (Д0), 3 (Д6 МТОС) срез/група, два-хвостатиј т-критериј, *00 Стьудента; ц Репрезентативне слике МТОС срчаних кришки на дан 0 и 6 за имуно-обележавање тропонин-Т и НФАТЦ4 и квантификацију транслокације НФАТЦ4 у језгру ЦМ од различитих свиња (н = 4 (Д0), 3 (Д6 МТОС) кришке/група, двострани т'-критеријум 5 *5).Траке грешке представљају средњу вредност ± стандардну девијацију.
Транслационо кардиоваскуларно истраживање захтева мобилне моделе који тачно репродукују срчани окружење.У овој студији је развијен и окарактерисан цтцм уређај који може подстаћи ултрахонским деловима срца.ЦТЦМ систем укључује физиолошки синхронизована електромеханичка стимулација и обогаћивање течности Т3 и Дек.Када су секције свињског срца биле изложене овим факторима, њихова одрживост, структурни интегритет, метаболичка активност и експресија транскрипције остали су исти као у свежем срчаном ткиву након 12 дана културе.Поред тога, прекомерно истезање срчаног ткива може проузроковати хипертрофију срца изазваног хиперекстензијом.Све у свему, ови резултати подржавају критичну улогу услова физиолошке културе у одржавању нормалног срчаног фенотипа и пружају платформу за скрининг лекова.
Многи фактори доприносе стварању оптималног окружења за функционисање и опстанак кардиомиоцита.Најочигледнији од ових фактора се односе на (1) међућелијске интеракције, (2) електромеханичку стимулацију, (3) хуморалне факторе и (4) метаболичке супстрате.Физиолошке интеракције ћелија ћелија захтијевају сложене тродимензионалне мреже више врста ћелија које подржавају ванћелијска матрица.Такве сложене ћелијске интеракције је тешко реконструисати ин витро ко-културом појединачних типова ћелија, али се лако могу постићи коришћењем органотипске природе срчаних пресека.
Механичко истезање и електрична стимулација кардиомиоцита су критични за одржавање срчаног фенотипа33,34,35.Док се механичка стимулација нашироко користи за хиПСЦ-ЦМ кондиционирање и сазревање, неколико елегантних студија је недавно покушало механичку стимулацију срчаних кришки у култури коришћењем једноосног оптерећења.Ове студије показују да 2Д једноосно механичко оптерећење има позитиван ефекат на фенотип срца током културе.У овим студијама, делови срца су били или оптерећени изометријским затезним силама17, линеарним ауксотонским оптерећењем18, или је срчани циклус поново креиран коришћењем повратне спреге трансдуктора силе и погона напетости.Међутим, ове методе користе једноосно истезање ткива без оптимизације животне средине, што доводи до супресије многих срчаних гена или прекомерне експресије гена повезаних са абнормалним одговорима на истезање.Овде описани ЦТЦМ пружа 3Д електромеханички стимулус који опонаша природни срчани циклус у смислу времена циклуса и физиолошког истезања (25% истезања, 40% систоле, 60% дијастоле и 72 откуцаја у минути).Иако ова тродимензионална механичка стимулација сама по себи није довољна за одржавање интегритета ткива, потребна је комбинација хуморалне и механичке стимулације помоћу Т3/Дек да би се адекватно одржала виталност, функција и интегритет ткива.
Хуморални фактори играју важну улогу у модулацији фенотипа срца код одраслих.Ово је истакнуто у ХиПС-ЦМ студијама у којима су Т3 и Дек додавани у медијум за културу да би се убрзало сазревање ћелија.Т3 може утицати на транспорт аминокиселина, шећера и калцијума кроз ћелијске мембране36.Поред тога, Т3 промовише експресију МХЦ-α и смањење МХЦ-β, промовишући формирање брзо трзајућих миофибрила у зрелим кардиомиоцитима у поређењу са миофибрилима који се споро трзају у феталном ЦМ.Недостатак Т3 код хипотиреоидних пацијената доводи до губитка миофибриларних трака и смањене стопе развоја тонуса37.Дек делује на глукокортикоидне рецепторе и показало се да повећава контрактилност миокарда у изолованим перфузираним срцима;38 сматра се да је ово побољшање повезано са ефектом на улазак вођен депозитом калцијума (СОЦЕ) 39,40.Поред тога, Дек се везује за своје рецепторе, изазивајући широк интрацелуларни одговор који потискује имунолошку функцију и упалу30.
Наши резултати показују да је физичка механичка стимулација (МС) побољшала укупну перформансу културе у поређењу са ЦТРЛ-ом, али нису успеле да одржи одрживост, структурни интегритет и срчани израз у култури у односу на 12 дана у култури.У поређењу са ЦТРЛ-ом, додавањем Т3 и ДЕКС-а за ЦТЦМ (МТ) културе побољшали су одрживост и одржавали сличне профиле транскрипције, структурни интегритет и метаболичку активност са свежим срчаним ткивом током 12 дана.Поред тога, контролом степена ткива, срчани хипертрофијски модел створен је коришћењем СТЦМ-а илуструјући свестраност СТЦМ система.Треба напоменути да иако срчани преградња и фиброза обично укључују нетакнуте органе чије циркулирајуће ћелије могу пружити одговарајуће цитокине, као и фагоцитозу и друге факторе за преграђивање, део срца и даље могу да опонашају фибротички процес као одговор на стрес и траума.у миофибробласте.Ово је претходно процењено у овом моделу срчаног пресека.Треба напоменути да се параметри ЦТЦМ могу модулирати променом притиска / електричне амплитуде и учесталости да симулирају много стања, као што су тахикардија, брадикардија и механичка циркулациона подршка (механичко истоварно срце).Ово чини систем средњим протоком за тестирање на лекове.Способност ЦТЦМ-а да моделира хипертрофију срца изазвану прекомерним напором отвара пут за тестирање овог система за персонализовану терапију.Закључно, ова студија показује да су механичка протекција и хулорална подстицајна за одржавање културе одсека срчаног ткива.
Иако овде представљени подаци сугеришу да је ЦТЦМ веома обећавајућа платформа за моделирање интактног миокарда, овај метод културе има нека ограничења.Главно ограничење ЦТЦМ културе је то што она намеће континуиране динамичке механичке напрезања на резове, што онемогућава активно праћење контракција срчаног пресека током сваког циклуса.Поред тога, због мале величине срчаних одсека (7 мм), могућност процене систоличке функције изван система културе који користе традиционалне сензоре силе је ограничена.У тренутном рукопису, делимично смо превазишли ово ограничење проценом оптичког напона као индикатора контрактилне функције.Међутим, ово ограничење ће захтевати даљи рад и може се решити у будућности увођењем метода за оптичко праћење функције срчаних резова у култури, као што је оптичко мапирање коришћењем боја које су осетљиве на калцијум и напон.Још једно ограничење ЦТЦМ-а је то што радни модел не манипулише физиолошким стресом (предоптерећење и накнадно оптерећење).У ЦТЦМ-у, притисак је индукован у супротним смеровима да би се репродуковало 25% физиолошког истезања у дијастоли (пуно истезање) и систоли (дужина контракције током електричне стимулације) у веома великим ткивима.Ово ограничење би требало да буде уклоњено у будућим ЦТЦМ дизајнима адекватним притиском на срчано ткиво са обе стране и применом тачних односа притисак-волумен који се јављају у коморама срца.
Ремоделирање изазвано прекомерним растезањем о коме се говори у овом рукопису ограничено је на опонашање сигнала хипертрофичног хиперистезања.Дакле, овај модел може помоћи у проучавању хипертрофичне сигнализације изазване истезањем без потребе за хуморалним или неуралним факторима (који не постоје у овом систему).Потребне су даље студије да би се повећала бројност ЦТЦМ-а, на пример, ко-култура са имуним ћелијама, циркулишући хуморални фактори плазме и инервација при заједничкој култури са неуронским ћелијама ће побољшати могућности моделирања болести са ЦТЦМ-ом.
У овој студији коришћено је тринаест свиња.Све процедуре на животињама спроведене су у складу са институционалним смерницама и одобрене су од стране Одбора за институционалну негу и употребу животиња Универзитета у Луисвилу.Лук аорте је стегнут и срце је перфузирано са 1 Л стерилне кардиоплегије (110 мМ НаЦл, 1,2 мМ ЦаЦл2, 16 мМ КЦл, 16 мМ МгЦл2, 10 мМ НаХЦО3, 5 У/мЛ до 7 хепарина, пХ 4); Срца су сачувана у леденом кардиоплегијском раствору све док се не транспортује у лабораторију на леду који је обично <10 мин. Срца су сачувана у леденом кардиоплегијском раствору све док се не транспортује у лабораторију на леду који је обично <10 мин. сердца хранили в леданом кардиоплегическом раствору до транспортировки в лабораторији на льду, что обично занимает <10 мин. срца су чувана у ледено хладном кардиоплегичном раствору до транспорта у лабораторију на леду, што обично траје <10 мин.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室, 通常<10。钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室, 通常<10。钟 Држите сердца в леданој кардиоплегии до транспортировки в лабораторији на льду, обично <10 мин. Држите срца на леду кардиоплегија до транспорта у лабораторију на леду, обично <10 мин.
ЦТЦМ уређај је развијен у СолидВоркс софтверу за компјутерско пројектовање (ЦАД).Коморе за културу, преграде и ваздушне коморе су направљене од ЦНЦ прозирне акрилне пластике.Помоћни прстен пречника 7 мм је направљен од полиетилена високе густине (ХДПЕ) у средини и има жлеб за о-прстен за смештај силиконског о-прстена који се користи за заптивање медија испод.Танка силика мембрана одваја комору за културу од плоче за раздвајање.Силиконска мембрана је ласерски исечена од силиконског лима дебљине 0,02 инча и има тврдоћу од 35А.Доња и горња силиконска заптивка су ласерски исечена од силиконског лима дебљине 1/16″ и имају тврдоћу од 50А.За причвршћивање блока и стварање херметичке заптивке користе се вијци и крилне матице од нерђајућег челика 316Л.
Наменска штампана плоча (ПЦБ) је дизајнирана да се интегрише са Ц-ПАЦЕ-ЕМ системом.Швајцарске утичнице са машинама на ПЦБ-у повезане су са графитним електродама сребрно плетеним бакреним жицама и бронзаним 0-60 вијцима вијцима се у електроде.Штампана плоча се поставља у поклопац 3Д штампача.
ЦТЦМ уређај управља програмибилним пнеуматским актуатором (ППД) који ствара контролисан притисак циркулације сличан срчаном циклусу.Како се притисак унутар ваздушне коморе повећава, флексибилна силиконска мембрана се шири према горе, гурајући медијум испод места ткива.Подручје ткива ће се тада истегнути овим избацивањем течности, опонашајући физиолошку експанзију срца током дијастоле.На врхунцу опуштања, електрична стимулација је примењена кроз графитне електроде, што је смањило притисак у ваздушном комору и проузроковало смањење сектора ткива.Унутар цеви је хемостатски вентил са сензором притиска за детекцију притиска у ваздушном систему.Притисак који детектује сензор притиска примењује се на колектор података повезан са лаптопом.Када је постигнут притисак максималне коморе (стандардни 80 ммХг, 140 ммХГ ОС), наређено је да уређај за стицање података пошаље сигнал на Ц-ПАЦЕ-ЕМ систем да би се створила бифазни сигнал напона за 2 мс, постављен на 4 В.
Добијени су пресеци срца и услови културе у 6 бунарчића су изведени на следећи начин: Пренесите сакупљена срца из посуде за трансфер у посуду која садржи хладну (4°Ц) кардиоплегију.Лева комора је изолована стерилном оштрицом и исечена на комаде од 1-2 цм3.Ови блокови ткива су причвршћени за подлоге за ткиво лепком за ткиво и стављени у вибрирајућу микротомску купку за ткиво која садржи Тиродов раствор и континуирано је оксигенисана (3 г/Л 2,3-бутандион монооксима (БДМ), 140 мМ НаЦл (8,18 г). ), 6 мМ КЦл (0,104 г), 1,84 г (0,104 г), 1,4 м лм цос. 0 мМ ХЕПЕС (2,38 г), 1 мМ МгЦл2 (1 мл 1 М раствора), 1,8 мМ ЦаЦл2 (1,8 мл 1 М раствора), до 1 Л ддХ2О).Вибрациони микротом је подешен да сече резове дебљине 300 µм на фреквенцији од 80 Хз, хоризонталној амплитуди вибрације од 2 мм и брзини напредовања од 0,03 мм/с.Купатило за ткиво је окружено ледом да би раствор био хладан, а температура је одржавана на 4°Ц.Пребаците делове ткива из купатила са микротомом у купатило за инкубацију које садржи континуирано оксигенизован Тироде раствор на леду док се не добије довољно делова за једну плочу за културу.За трансвелл културе, пресеци ткива су причвршћени на стерилне полиуретанске носаче ширине 6 мм и стављени у 6 мл оптимизованог медијума (199 медијум, 1к ИТС додатак, 10% ФБС, 5 нг/мл ВЕГФ, 10 нг/мл ФГФ-алкални и 2Кс антибиотик-антифунгални).Електрична стимулација (10 В, фреквенција 1,2 Хз) је примењена на пресеке ткива кроз Ц-Паце.За ТД услове, свежи Т3 и Дек су додати на 100 нМ и 1 μМ при свакој промени медијума.Медијум је засићен кисеоником пре замене 3 пута дневно.Секције ткива су култивисане у инкубатору на 37°Ц и 5% ЦО2.
Уређај је дизајниран да повећа величину кришке срца за 25% површине потпорног прстена.Ово се ради тако да се делови срца не растежу након преношења из Тиродовог раствора у медијум и током дијастоле.Коришћењем хистоакрилног лепка, делови дебљине 300 µм су причвршћени на носећи прстен пречника 7 мм.Након причвршћивања делова ткива на потпорни прстен, одрежите вишак делова ткива и ставите причвршћене делове ткива назад у каду са раствором Тироде на леду (4°Ц) док се не припреми довољно делова за један уређај.Укупно време обраде за све уређаје не би требало да прелази 2 сата.Након што је 6 делова ткива причвршћено на њихове потпорне прстенове, ЦТЦМ уређај је састављен.ЦТЦМ комора за културу је претходно напуњена са 21 мл претходно оксигенисане средине.Пренесите делове ткива у комору за културу и пажљиво уклоните све мехуриће ваздуха помоћу пипете.Део ткива се затим води у рупу и нежно притиска на место.На крају, поставите поклопац електроде на уређај и пренесите уређај у инкубатор.Затим повежите ЦТЦМ на ваздушну цев и Ц-ПАЦЕ-ЕМ систем.Пнеуматски актуатор се отвара, а ваздушни вентил отвара ЦТЦМ.Ц-ПАЦЕ-ЕМ систем је конфигурисан да испоручује 4 В на 1,2 Хз током двофазног пејсинга у трајању од 2 мс.Медијум се мењао два пута дневно, а електроде су мењане једном дневно да би се избегло накупљање графита на електродама.Ако је потребно, делови ткива се могу уклонити из њихових бунара за културу да би се избацили сви мехурићи ваздуха који су можда пали испод њих.За услове МТ третмана, Т3/Дек је додат свеж са сваком променом медијума са 100 нМ Т3 и 1 μМ Дек.ЦТЦМ уређаји су култивисани у инкубатору на 37°Ц и 5% ЦО2.
Да би се добиле истегнуте путање срчаних кришки, развијен је посебан систем камера.Коришћен је СЛР фотоапарат (Цанон Ребел Т7и, Цанон, Токио, Јапан) са макро објективом Навитар Зоом 7000 18-108 мм (Навитар, Сан Франциско, Калифорнија).Визуелизација је изведена на собној температури након замене медијума свежим медијумом.Камера је постављена под углом од 51° и видео се снима брзином од 30 кадрова у секунди.Прво, софтвер отвореног кода (МУСЦЛЕМОТИОН43) је коришћен са Имаге-Ј за квантификацију кретања срчаних кришки.Маска је креирана коришћењем МАТЛАБ-а (МатхВоркс, Натицк, МА, САД) за дефинисање региона од интереса за откуцаје срчаних кришки како би се избегла бука.Ручно сегментиране маске се примењују на све слике у низу кадрова, а затим се прослеђују додатку МУСЦЛЕМОТИОН.Мусцле Мотион користи просечан интензитет пиксела у сваком кадру да квантификује његово кретање у односу на референтни оквир.Подаци су снимљени, филтрирани и коришћени за квантификацију времена циклуса и процену истезања ткива током срчаног циклуса.Снимљени видео је накнадно обрађен коришћењем дигиталног филтера нулте фазе првог реда.Да би се квантификовало растезање ткива (од врха до врха), извршена је анализа од врха до врха да би се разликовали врхови и падови у снимљеном сигналу.Поред тога, детрендовање се врши коришћењем полинома 6. реда да би се елиминисао померање сигнала.Програмски код је развијен у МАТЛАБ-у да одреди глобално кретање ткива, време циклуса, време релаксације и време контракције (Допунски програмски код 44).
За анализу напрезања, коришћење истих видео записа креираних за механичку процјену стрелице, прво смо пратили две слике које представљају врхове кретања (највиши (горњи (горњи) и најнижи (доњи) тачке кретања) према софтверу за мишиће.Сегментирани ткиво је затим подељено на десет подземних меса, а стрес на свакој површини израчунат је помоћу следеће једначине: сој = (суп-Свовн) / Своју, где су СУП и САВПОР, даљине су растојања облика са горњих и доњих сјене тканине, односно (додатна сл. .2б).
Срчани пресеци су фиксирани у 4% параформалдехиду током 48 сати.
Додати 1 мл ПБС у свако стакло и инкубирати 30 минута на собној температури, а затим прожимати секције постављањем 0,1% Тритон-Кс у ПБС 15 минута на собној температури.Да бисте спречили везивање неспецифичних антитела за узорак, додајте 1 мл 3% раствора БСА у стакалце и инкубирајте 1 сат на собној температури.БСА је затим уклоњен и плочице су испране са ПБС.Означите сваки узорак оловком.Примарна антитела (разређена 1:200 у 1% БСА) (конексин 43 (Абцам; #АБ11370), НФАТЦ4 (Абцам; #АБ99431) и тропонин-Т (Тхермо Сциентифиц; #МА5-12960) додата су током 90 минута, а затим 10% антитела против Алекса 10 коришћена за 10 минута. а Флуор 488 (Тхермо Сциентифиц; #А16079), против зеца Алека Флуор 594 ​​(Тхермо Сциентифиц; #Т6391) додатних 90 минута Опран 3 пута са ПБС Да бисмо разликовали циљно бојење од позадине, користили смо само секундарно антитело као контролу. запечаћена лаком за нокте.-к увећање) и Кејенс микроскоп са увећањем од 40к.
ВГА-Алека Флуор 555 (Тхермо Сциентифиц; #В32464) у 5 μг/мл у ПБС-у је коришћен за ВГА бојење и примењен на фиксне пресеке 30 минута на собној температури.Стакалца су затим испрана са ПБС-ом и суданска црна је додата у свако стакло и инкубирана 30 минута.Плоче су затим испране са ПБС и додат је медијум за уградњу вецтасхиелд.Слајдови су визуелизовани на Кеиенце микроскопу при увећању од 40к.
Плоче су затим испиране дестилованом водом 1 сат, а затим стављене у раствор фуксина Бибрицх алое киселине на 10 минута.Затим су предмети испрани дестилованом водом и стављени у раствор 5% фосфомолибдена/5% фосфоволфрамне киселине на 10 минута.Без испирања, пренесите плочице директно у раствор анилин плаве боје на 15 минута.Затим су плочице испране дестилованом водом и стављене у 1% раствор сирћетне киселине на 2 минута.Плоче су осушене у 200 Н етанолу и пребачене у ксилен.Обојени дијапозитиви су визуелизовани коришћењем Кеиенце микроскопа са 10к објективом.Проценат површине фиброзе је квантификован коришћењем софтвера Кеиенце Анализер.
ЦиКУАНТ™ МТТ тест виталности ћелија (Инвитроген, Царлсбад, ЦА), каталошки број В13154, према протоколу произвођача са неким модификацијама.Конкретно, коришћен је хируршки ударац пречника 6 мм да би се обезбедила уједначена величина ткива током МТТ анализе.Ткива су појединачно постављена у јажице плоче са 12 јажица која садржи МТТ супстрат у складу са протоколом произвођача.Секције се инкубирају на 37°Ц током 3 сата и живо ткиво метаболише МТТ супстрат да би се формирало љубичасто једињење формазана.Замените МТТ раствор са 1 мл ДМСО и инкубирајте на 37 °Ц 15 минута да бисте екстраховали љубичасти формазан из пресека срца.Узорци су разблажени 1:10 у ДМСО у плочама са чистим дном са 96 бунарчића, а интензитет љубичасте боје је измерен на 570 нм коришћењем читача плоча Цитатион (БиоТек).Очитавања су нормализована на тежину сваког дела срца.
Медији срца су замењени медијима који садрже 1 μЦи / мл [5-3Х] -глукозе (моравки биохемикалије, Бреа, ЦА, САД) за испитивање употребе глукозе како је раније описано.Искоришћење глукозе је затим израчунато узимајући у обзир специфичну активност [5-3Х]-глукозе, непотпуну равнотежу и позадину, разблаживање [5-3Х]- до необележене глукозе и ефикасност сцинтилационог бројача.
После хомогенизације ткива у Тризолу, РНА је изолована од срчаних одељења користећи Киаген Мирнеаси Мицро Кит # 210874 према протоколу произвођача.
1 μг РНК по узорку је коришћен као почетни материјал за припрему РНК библиотеке.Библиотеке секвенцирања су генерисане коришћењем НЕБНект УлтраТМ РНА Либрари Препаратион Кит за Иллумина (НЕБ, САД) према препорукама произвођача, а индексни кодови су додати секвенцама атрибута за сваки узорак.Укратко, мРНА је пречишћена од укупне РНК коришћењем магнетних перли повезаних са поли-Т олигонуклеотидима.Фрагментација се врши коришћењем двовалентних катјона на високој температури у НЕБНект Фирст Странд Синтхесис Реацтион пуферу (5Кс).Први ланац цДНК је синтетизован коришћењем насумичних хексамерних прајмера и М-МуЛВ реверзне транскриптазе (РНасе Х-).Други ланац цДНК се затим синтетише коришћењем ДНК полимеразе И и РНазе Х. Преостале преграде се конвертују у тупе крајеве активношћу егзонуклеазе/полимеразе.Након аденилације 3′ краја фрагмента ДНК, на њега је причвршћен НЕБНект адаптер са структуром укосне петље да би се припремио за хибридизацију.За селекцију цДНК фрагмената пожељне дужине 150-200 бп.фрагменти библиотеке су пречишћени коришћењем АМПуре КСП система (Бецкман Цоултер, Беверли, САД).Затим је 3 μл УСЕР ензима (НЕБ, САД) са цДНК одабраном по величини лигираном помоћу адаптера коришћено 15 минута на 37 ° Ц, а затим 5 минута на 95 ° Ц пре ПЦР-а.ПЦР је затим изведен коришћењем Пхусион Хигх-Фиделити ДНК полимеразе, универзалних ПЦР прајмера и Индек (Кс) прајмера.На крају, ПЦР производи су пречишћени (АМПуре КСП систем) и квалитет библиотеке је процењен на Агилент Биоанализер 2100 систему.Библиотека цДНК је затим секвенционирана коришћењем Новасек секвенцера.Датотеке необрађених слика из Иллумина су конвертоване у необрађено читање помоћу ЦАСАВА Басе Цаллинг.Необрађени подаци се чувају у датотекама формата ФАСТК(фк) које садрже секвенце читања и одговарајуће основне квалитете.Изаберите ХИСАТ2 да бисте упарили читања филтрираног секвенцирања са референтним геномом Ссцрофа11.1.Генерално, ХИСАТ2 подржава геноме било које величине, укључујући геноме веће од 4 милијарде база, а подразумеване вредности су постављене за већину параметара.Читања спајања из РНА Сек података могу се ефикасно ускладити коришћењем ХИСАТ2, најбржег тренутно доступног система, са истом или бољом прецизношћу од било које друге методе.
Обиље транскрипата директно одражава ниво експресије гена.Нивои експресије гена се процењују на основу обиља транскрипата (број секвенцирања) повезаних са геномом или егзонима.Број читања је пропорционалан нивоима експресије гена, дужини гена и дубини секвенцирања.ФПКМ (фрагменти на хиљаду базних парова транскрипта секвенцираних на милион парова база) су израчунати и П-вредности диференцијалне експресије су одређене коришћењем ДЕСек2 пакета.Затим смо израчунали стопу лажног откривања (ФДР) за сваку П вредност користећи Бењамини-Хохбергов метод9 на основу уграђене Р-функције „п.адјуст“.
РНК изолована из срчаних делова је конвертована у цДНК у концентрацији од 200 нг/μл коришћењем мешавине СуперСцрипт ИВ Вило Мастер компаније Тхермо (Тхермо, кат. бр. 11756050).Квантитативна РТ-ПЦР је изведена коришћењем Апплиед Биосистемс Ендура Плате Мицроамп провидне реакционе плоче са 384 бунара (Тхермо, кат. бр. 4483319) и микроамп оптичког лепка (Тхермо, кат. бр. 4311971).Реакциона смеша се састојала од 5 µл Такман Фаст Адванцед Мастер мешавине (Тхермо, кат. бр. 4444557), 0,5 µл Такман Примера и 3,5 µл Х2О помешаних по бунарчићу.Стандардни кПЦР циклуси су вођени и ЦТ вредности су мерене коришћењем Апплиед Биосистемс Куантстудио 5 ПЦР инструмента у реалном времену (модул са 384 бунара; производ # А28135).Такман прајмери ​​су купљени од Тхермо (ГАПДХ (Сс03375629_у1), ПАРП12 (Сс06908795_м1), ПКДЦЦ (Сс06903874_м1), ЦИГБ (Сс06900188_м1), РГЛ1 (Сс06900188_м1), РГЛ1 (Сс06908795_м1), АГЛ1 (Сс06908795_м1) Х), ГАТА4 (Сс03383805_у1), ГЈА1 (Сс03374839_у1), ЦОЛ1А2 (Сс03375009_у1), ЦОЛ3А1 (Сс04323794_м1), АЦТА2 (Сс04245588 гена су нормализоване на вредности ГАП-а у кући).
Ослобађање НТ-ПроБНП у медијима је процењено коришћењем НТ-ПроБНП комплета (свиња) (кат. бр. МБС2086979, МиБиоСоурце) према протоколу произвођача.Укратко, 250 µл сваког узорка и стандарда је додато у дупликату у сваки бунар.Одмах након додавања узорка, додајте 50 µл реагенса за анализу А у сваки бунар.Лагано протресите плочу и затворите заптивачем.Затим су таблете инкубиране на 37°Ц 1 сат.Затим аспирирајте раствор и исперите јажице 4 пута са 350 µл 1Кс раствора за испирање, сваки пут инкубирајући раствор за испирање 1-2 минута.Затим додајте 100 µл реагенса за анализу Б по бунарчићу и затворите заптивачем за плоче.Таблета је лагано протресена и инкубирана на 37°Ц током 30 минута.Аспирирајте раствор и исперите јажице 5 пута са 350 µл 1Кс раствора за испирање.Додајте 90 µл раствора супстрата у сваки бунар и затворите плочу.Инкубирајте плочу на 37°Ц 10-20 минута.Додајте 50 µл Стоп раствора у сваки бунар.Плоча је одмах измерена коришћењем читача плоча Цитатион (БиоТек) постављеног на 450 нм.
Извршене су анализе електричне енергије да бирају величине групе које ће обезбедити> 80% снаге да открије 10% апсолутне промене у параметри са 5% типом И брзином грешке. Анализе снаге су извршене да би се одабрале величине група које ће обезбедити >80% снаге за детекцију апсолутне промене параметра од 10% са стопом грешке типа И од 5%. Анализ мосности виполнен дла вибора размеров групп, которие обеспечить >80% мосности дла откриниа 10% абсолутно изменениа параметров с 5% частотној ошибок типа И. Анализа снаге је извршена да би се одабрале величине група које би обезбедиле >80% снаге за откривање апсолутне промене параметара од 10% са стопом грешке типа И од 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和甙、进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和甙、 Проведена анализа мосности за вибор размера группи, коториј обеспечил би > 80% мосности дла откривениа 10% абсолутно изменениа параметров и 5% частоти ошибок типа И. Извршена је анализа снаге да би се изабрала величина групе која би обезбедила >80% снаге за откривање 10% апсолутне промене параметара и 5% стопе грешке типа И.Секције ткива су насумично одабране пре експеримента.Све анализе су биле условно слепе и узорци су декодирани тек након што су сви подаци анализирани.За све статистичке анализе коришћен је софтвер ГрапхПад Присм (Сан Диего, ЦА). За све статистике, п-вредности су сматране значајним при вредностима <0,05. За све статистике, п-вредности су сматране значајним при вредностима <0,05. Дла всеј статистики п-значениа сматрались значајними при значениах <0,05. За све статистике, п-вредности су сматране значајним при вредностима <0,05.对于所有统计数据，п 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，п 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Дла всеј статистики п-значениа сматрались значајними при значениах <0,05. За све статистике, п-вредности су сматране значајним при вредностима <0,05.Двострани Студентов т-тест је изведен на подацима са само 2 поређења.Једносмерна или двосмерна АНОВА је коришћена за одређивање значаја између више група.Приликом извођења пост хоц тестова, Тукеиева корекција је примењена да би се урачунала вишеструка поређења.РНАсец подаци имају посебна статистичка разматрања када се израчунавају ФДР и п.прилагођавање као што је описано у одељку Методе.
За више информација о дизајну студије, погледајте сажетак Извештаја о истраживању природе повезан са овим чланком.