Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Потребан је поуздан ин витро систем који може прецизно репродуковати физиолошко окружење срца за тестирање лекова. Ограничена доступност система за културу људског срчаног ткива довела је до нетачних тумачења ефеката лекова на срце. Овде смо развили модел културе срчаног ткива (КТКМ) који електромеханички стимулише кришке срца и подлеже физиолошком истезању током систоличке и дијастоличке фазе срчаног циклуса. Након 12 дана културе, овај приступ је делимично побољшао одрживост срчаних пресека, али није у потпуности сачувао њихов структурни интегритет. Стога, након скрининга малих молекула, открили смо да је додавање 100 nM тријодотиронина (Т3) и 1 μM дексаметазона (Декс) нашем медијуму одржало микроструктуру пресека током 12 дана. У комбинацији са третманом Т3/Декс, КТКМ систем је одржао транскрипционе профиле, одрживост, метаболичку активност и структурни интегритет на истом нивоу као и свеже срчано ткиво током 12 дана. Поред тога, прекомерно истезање срчаног ткива у култури индукује хипертрофичну срчану сигнализацију, пружајући доказ о способности КТКМ-а да имитира хипертрофична стања изазвана истезањем срца. Закључно, CTCM може да моделира физиологију и патофизиологију срца у култури током дужих временских периода, омогућавајући поуздан скрининг лекова.
Пре клиничких истраживања, потребни су поуздани in vitro системи који могу прецизно репродуковати физиолошко окружење људског срца. Такви системи треба да имитирају измењено механичко истезање, срчану фреквенцију и електрофизиолошка својства. Животињски модели се често користе као платформа за скрининг срчане физиологије са ограниченом поузданошћу у одражавању ефеката лекова у људском срцу1,2. На крају крајева, Идеални експериментални модел културе срчаног ткива (CTCM) је модел који је веома осетљив и специфичан за различите терапеутске и фармаколошке интервенције, прецизно репродукујући физиологију и патофизиологију људског срца3. Одсуство таквог система ограничава откривање нових третмана за срчану инсуфицијенцију4,5 и довело је до кардиотоксичности лекова као главног разлога за излазак са тржишта6.
Током протекле деценије, осам лекова који нису кардиоваскуларни повучено је из клиничке употребе јер изазивају продужење QT интервала што доводи до вентрикуларних аритмија и изненадне смрти7. Стога постоји све већа потреба за поузданим преклиничким стратегијама скрининга за процену кардиоваскуларне ефикасности и токсичности. Недавна употреба кардиомиоцита изведених из људских плурипотентних матичних ћелија (hiPS-CM) у скринингу лекова и тестирању токсичности пружа делимично решење за овај проблем. Међутим, незрела природа hiPS-CM и недостатак вишећелијске сложености срчаног ткива су главна ограничења ове методе. Недавне студије су показале да се ово ограничење може делимично превазићи коришћењем раних hiPS-CM за формирање хидрогелова срчаног ткива убрзо након почетка спонтаних контракција и постепеним повећањем електричне стимулације током времена. Међутим, овим hiPS-CM микроткивима недостају зрела електрофизиолошка и контрактилна својства одраслог миокарда. Поред тога, људско срчано ткиво има сложенију структуру, која се састоји од хетерогене мешавине различитих типова ћелија, укључујући ендотелне ћелије, неуроне и стромалне фибробласте, међусобно повезане специфичним скуповима протеина екстрацелуларног матрикса. Ова хетерогеност популација које нису кардиомиоцитне11,12,13 у срцу одраслих сисара представља главну препреку за моделирање срчаног ткива коришћењем појединачних типова ћелија. Ова главна ограничења наглашавају важност развоја метода за култивацију интактног миокардног ткива у физиолошким и патолошким условима.
Култивисани танки (300 µм) пресеци људског срца показали су се као обећавајући модел интактног људског миокарда. Ова метода пружа приступ комплетном 3Д вишећелијском систему сличном ткиву људског срца. Међутим, до 2019. године, употреба култивисаних пресека срца била је ограничена кратким (24 сата) преживљавањем културе. То је због низа фактора, укључујући недостатак физичко-механичког истезања, интерфејс ваздух-течност и употребу једноставних медијума који не подржавају потребе срчаног ткива. Године 2019, неколико истраживачких група је показало да укључивање механичких фактора у системе културе срчаног ткива може продужити век трајања културе, побољшати срчану експресију и имитирати срчану патологију. Две елегантне студије 17 и 18 показују да једноосно механичко оптерећење има позитиван ефекат на срчани фенотип током културе. Међутим, ове студије нису користиле динамичко тродимензионално физичко-механичко оптерећење срчаног циклуса, пошто су пресеци срца били оптерећени или изометријским силама затезања 17 или линеарним ауксотонским оптерећењем 18. Ове методе истезања ткива довеле су до супресије многих срчаних гена или прекомерне експресије гена повезаних са абнормалним одговорима истезања. Приметно је да су Питулис и др. 19 развили динамичко купатило за култивацију срчаних кришки за реконструкцију срчаног циклуса коришћењем повратне спреге претварача силе и погона затезања. Иако овај систем омогућава прецизније in vitro моделирање срчаног циклуса, сложеност и низак проток методе ограничавају примену овог система. Наша лабораторија је недавно развила поједностављени систем културе коришћењем електричне стимулације и оптимизованог медијума за одржавање одрживости пресека свињског и људског срчаног ткива до 6 дана 20,21.
У овом рукопису описујемо модел културе срчаног ткива (CTCM) користећи делове свињског срца који укључује хуморалне сигнале за рекапитулацију тродимензионалне срчане физиологије и патофизиолошке дистензије током срчаног циклуса. Овај CTCM може повећати тачност преклиничког предвиђања лекова на ниво који никада раније није постигнут пружањем исплативог, средње пропусног срчаног система који опонаша физиологију/патофизиологију срца сисара за преклиничко тестирање лекова.
Хемодинамски механички сигнали играју кључну улогу у одржавању функције кардиомиоцита in vitro 22,23,24. У овом рукопису, развили смо CTCM (слика 1а) који може да имитира срчано окружење одраслих индукујући и електричну и механичку стимулацију на физиолошким фреквенцијама (1,2 Hz, 72 откуцаја у минути). Да би се избегло прекомерно истезање ткива током дијастоле, коришћен је 3Д уређај за штампање да би се повећала величина ткива за 25% (слика 1б). Електрични пејсинг индукован C-PACE системом је темпиран да почне 100 ms пре систоле користећи систем за аквизицију података како би се у потпуности репродуковао срчани циклус. Систем за културу ткива користи програмабилни пнеуматски актуатор (LB Engineering, Немачка) за циклично ширење флексибилне силиконске мембране како би се изазвало ширење срчаних кришки у горњој комори. Систем је био повезан са спољном ваздушном линијом преко претварача притиска, што је омогућило прецизно подешавање притиска (± 1 mmHg) и времена (± 1 ms) (слика 1c).
а Причврстите пресек ткива на носећи прстен од 7 мм, приказан плавом бојом, унутар коморе за културу уређаја. Комора за културу је одвојена од ваздушне коморе танком флексибилном силиконском мембраном. Поставите заптивку између сваке коморе да бисте спречили цурење. Поклопац уређаја садржи графитне електроде које пружају електричну стимулацију. б Шематски приказ великог уређаја за ткиво, водилице и носећег прстена. Пресеци ткива (смеђи) су постављени на превелики уређај са водилицом постављеним у жлеб на спољашњој ивици уређаја. Користећи водилицу, пажљиво поставите носећи прстен премазан акрилним лепком за ткиво преко пресека срчаног ткива. ц График који приказује време електричне стимулације као функцију притиска у ваздушној комори којим управља програмабилни пнеуматски актуатор (ППД). Уређај за прикупљање података је коришћен за синхронизацију електричне стимулације помоћу сензора притиска. Када притисак у комори за културу достигне подешени праг, импулсни сигнал се шаље Ц-ПАЦЕ-ЕМ-у да би се покренула електрична стимулација. д Слика четири ЦТЦМ-а постављена на полицу инкубатора. Четири уређаја су повезана са једним ППД-ом преко пнеуматског кола, а сензори притиска су уметнути у хемостатски вентил да би се пратио притисак у пнеуматском колу. Сваки уређај садржи шест пресека ткива.
Користећи један пнеуматски актуатор, били смо у могућности да контролишемо 4 CTCM уређаја, од којих је сваки могао да држи 6 пресека ткива (Сл. 1д). У CTCM-у, притисак ваздуха у ваздушној комори се претвара у синхрони притисак у комори за флуид и индукује физиолошко ширење срчаног пресека (Слика 2а и Додатни филм 1). Евалуација истезања ткива на 80 mm Hg. Art. показала је истезање пресека ткива за 25% (Сл. 2б). Показало се да овај проценат истезања одговара физиолошкој дужини саркомера од 2,2–2,3 µm за нормалну контрактилност срчаног пресека17,19,25. Кретање ткива је процењено коришћењем прилагођених подешавања камере (Додатна слика 1). Амплитуда и брзина кретања ткива (Сл. 2ц, д) одговарали су истезању током срчаног циклуса и времену током систоле и дијастоле (Сл. 2б). Истезање и брзина срчаног ткива током контракције и релаксације остали су константни 12 дана у култури (Сл. 2ф). Да бисмо проценили ефекат електричне стимулације на контрактилност током културе, развили смо метод за одређивање активне деформације коришћењем алгоритма сенчења (Допунска слика 2а,б) и били смо у могућности да разликујемо деформације са и без електричне стимулације. Исти пресек срца (Слика 2ф). У покретном подручју реза (R6-9), напон током електричне стимулације био је 20% већи него у одсуству електричне стимулације, што указује на допринос електричне стимулације контрактилној функцији.
Репрезентативни трагови мерења притиска у ваздушној комори, притиска у флуидној комори и кретања ткива потврђују да притисак у комори мења притисак у флуидној комори, узрокујући одговарајуће кретање пресека ткива. б Репрезентативни трагови процентуалног истезања (плаво) пресека ткива који одговарају процентуалном истезању (наранџасто). ц Измерено кретање срчаног пресека је у складу са измереном брзином кретања. (д) Репрезентативне путање цикличног кретања (плава линија) и брзине (наранџаста испрекидана линија) у пресеку срца. е Квантификација времена циклуса (н = 19 пресека по групи, од различитих свиња), времена контракције (н = 19 пресека по групи), времена релаксације (н = 19 пресека по групи, од различитих свиња), кретања ткива (н = 25 пресека)/групи од различитих свиња), вршне систоличке брзине (н = 24(Д0), 25(Д12) пресека/групи од различитих свиња) и вршне брзине релаксације (н = 24(Д0), 25(Д12) пресека/групи од различитих свиња). Двострани Студентов t-тест није показао значајну разлику ни у једном параметру. f Репрезентативни трагови анализе напрезања пресека ткива са (црвена) и без (плава) електричне стимулације, десет регионалних области пресека ткива из истог пресека. Доњи панели приказују квантификацију процентуалне разлике у напрезању у пресецима ткива са и без електричне стимулације у десет области из различитих пресека. (n = 8 кришки/група од различитих свиња, извршен је двострани Студентов t-тест; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 кришки/група од различитих свиња, извршен је двострани Студентов t-тест; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (н = 8 срезов/групу от разних свинеј, проводитса двусторонниј т-критериј Стьудента; ****п<0,0001, **п<0,01, *п<0,05). (n = 8 пресека/група од различитих свиња, двострани Студентов t-тест; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （н = 8 片/组, 来自不同的猪,进行双尾学生т 检验；****п < 0,0001,**п < 0,01，*п <0,01，。 （н = 8 片/组, 来自不同的猪,进行双尾学生т 检验；****п < 0,0001,**п < 0,01，*п <0,01，。 (н = 8 срезов/група, от разних свинеј, двусторонниј критеријум Стьудента; ****п <0,0001, **п <0,01, *п <0,05). (n = 8 пресека/група, од различитих свиња, двострани Студентов t-тест; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Грешке представљају средњу вредност ± стандардну девијацију.
У нашем претходном статичком биомиметичком систему за култивацију срчаних резова [20, 21], одржавали смо виталност, функцију и структурни интегритет срчаних резова током 6 дана применом електричне стимулације и оптимизацијом састава медијума. Међутим, након 10 дана, ове бројке су нагло опеле. Позваћемо се на пресеке култивисане у нашем претходном статичком биомиметичком систему за култивацију 20, 21 контролним условима (Ctrl) и користићемо наш претходно оптимизовани медијум као MC услове и култивацију под истовременом механичком и електричном стимулацијом (CTCM). Прво, утврдили смо да механичка стимулација без електричне стимулације није била довољна да одржи виталност ткива током 6 дана (Допунска слика 3а,б). Занимљиво је да је, увођењем физико-механичке и електричне стимулације коришћењем STCM, виталност срчаних резова старих 12 дана остала иста као у свежим срчаним резовима под MS условима, али не и под Ctrl условима, као што је показала MTT анализа (Слика 1). 3а). Ово сугерише да механичка стимулација и симулација срчаног циклуса могу одржати пресеке ткива виталним двоструко дуже него што је пријављено у нашем претходном статичком систему за култивацију. Међутим, процена структурног интегритета пресека ткива имунообележавањем срчаног тропонина Т и конексина 43 показала је да је експресија конексина 43 била значајно већа у ткивима срчаног мишића (МС) 12. дана него у контролама истог дана. Међутим, уједначена експресија конексина 43 и формирање Z-дискова нису у потпуности одржани (Сл. 3б). Користимо оквир вештачке интелигенције (ВИ) за квантификацију структурног интегритета ткива26, процес дубоког учења заснован на сликама, бојењу тропонина-Т и конексина43, за аутоматску квантификацију структурног интегритета и флуоресценције пресека срца у смислу јачине локализације. Ова метода користи конволуциону неуронску мрежу (CNN) и оквир дубоког учења за поуздану квантификацију структурног интегритета срчаног ткива на аутоматизован и непристрасан начин, као што је описано у референци.26. МС ткиво је показало побољшану структурну сличност са даном 0 у поређењу са статичким контролним пресецима. Поред тога, Масоново трихромно бојење открило је значајно нижи проценат фиброзе у условима МС у поређењу са контролним условима 12. дана културе (Сл. 3ц). Иако је CTCM повећао одрживост пресека срчаног ткива 12. дана до нивоа сличног оном код свежег срчаног ткива, није значајно побољшао структурни интегритет срчаних пресека.
Стубичасти графикон приказује квантификацију MTT виталности свежих срчаних кришки (D0) или културе срчаних кришки током 12 дана, било у статичкој култури (D12 Ctrl) или у CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) кришки/група од различитих свиња, извршен је једносмерни ANOVA тест; ####p < 0,0001 у поређењу са D0 и **p < 0,01 у поређењу са D12 Ctrl). Стубичасти графикон приказује квантификацију МТТ виталности свежих срчаних кришки (D0) или културе срчаних кришки током 12 дана, било у статичкој култури (D12 Ctrl) или у CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) кришки/група од различитих свиња, извршен је једносмерни ANOVA тест; ####p < 0,0001 у поређењу са D0 и **p < 0,01 у поређењу са D12 Ctrl).Хистограм приказује квантификацију виталности МТТ свежих пресека срца (Д0) или културе пресека срца током 12 дана у статичкој култури (Д12 контрола) или ЦТЦМ (Д12 МЦ) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 контрола).) ), 12 (Д12 МЦ) пресека/група од различитих свиња, извршен је једнофакторски ANOVA тест;####п < 0,0001 по сравнениу с Д0 и **п ​​< 0,01 по сравнениу с Д12 Цтрл). ####p < 0,0001 у поређењу са D0 и **p < 0,01 у поређењу са D12 (контрола). а 条形图显示在静态培养 (Д12 Цтрл) 或ЦТЦМ (Д12 МЦ) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл) 中新鲜心脏切片 (Д0)或心脏切片培养12 天的МТТ 活力的量化)，来自不同的12 (Д12 МЦ) 切片/组, АН蕿测试；与Д0 相比,####п < 0,0001, 与Д12 Цтрл 相比,**п < 0,01). а 条形图显示在静态培养 (Д12 Цтрл) 或ЦТЦМ (Д12 МЦ) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл) 中新鲜心脏切片 (Д0) ，来自不同猪的12 (Д12 МЦ) 切片/组,进行单向АНОВА 测试；与Д0 相比，####п < 0,0001相比，**п。)хистограм који приказује квантификацију виталности МТТ у свежим пресецима срца (Д0) или пресецима срца култивисаним 12 дана у статичкој култури (Д12 контрола) или ЦТЦМ (Д12 МЦ) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 контрола)), 12 (Д12 МЦ) пресека/група од различитих свиња, једнофакторски ANOVA тест;####п < 0,0001 по сравнениу с Д0, **п < 0,01 по сравнени с Д12 Цтрл). ####p < 0,0001 у поређењу са D0, **p < 0,01 у поређењу са D12 (контрола).б Тропонин-Т (зелени), конексин 43 (црвени) и DAPI (плави) у свеже изолованим пресецима срца (D0) или пресецима срца култивисаним под статичким условима (Ctrl) или CTCM условима (MC) током 12 дана) репрезентативних имунофлуоресцентних слика (празна скала = 100 µм). Квантификација структурног интегритета срчаног ткива помоћу вештачке интелигенције (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) пресека/групе сваки од различите свиње, извршен је једнофакторски ANOVA тест; ####p < 0,0001 у поређењу са D0 и ****p < 0,0001 у поређењу са D12 Ctrl). Квантификација структурног интегритета срчаног ткива помоћу вештачке интелигенције (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) пресека/групе од различитих свиња, извршен је једнофакторски ANOVA тест; ####p < 0,0001 у поређењу са D0 и ****p < 0,0001 у поређењу са D12 Ctrl). Количественнаа оценка структурној целостности сердечној ткани искусственним интелектом (н = 7 (Д0), 7 (Д12 Цтрл), 5 (Д12 МЦ) срезов/група от разних свинеј, проводи се однофакторниј тест АНОВА; ####п < 0,0001 по сравнениу с Д0 и ****1 < 0, сравнено с Д0 и ****1 < 0,). Квантификација структурног интегритета срчаног ткива помоћу вештачке интелигенције (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) пресека/група од различитих свиња, извршен једнофакторски ANOVA тест; ####p < 0,0001 у односу на D0 и ****p < 0,0001 у поређењу са D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（н = 7 (Д0), 7 (Д12 Цтрл), 5 (Д12 МЦ) резова/група свака од различитих свиња, једносмерни АНОВА тест;0##00;0##00相比，****п <0,0001 与Д12 Цтрл 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（н = 7 (Д0), 7 (Д12 Цтрл), 5 (Д12 МЦ) пресека/група свака од различитих свиња, једносмерни АНОВА тест;1##00;与Д0相比，****п <0,0001 与Д12 Цтрл 相比）。 Искусственниј интеллект дла количественној оценки структурној целостности сердечној ткани (н = 7 (Д0), 7 (Д12 Цтрл), 5 (Д12 МЦ) срезов/група из разних свинеј, односторонниј тест АНОВА; ####п <0,0001 вс. Д0 Дла сравнениа ****п < 0, сравнениа ****п < 0, сЦтрл). Вештачка интелигенција за квантификацију структурног интегритета срчаног ткива (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) пресека/групе сваке од различитих свиња, једносмерни ANOVA тест; ####p<0,0001 у односу на .D0 За поређење ****p < 0,0001 у поређењу са D12 Ctrl). ц Репрезентативне слике (лево) и квантификација (десно) за кришке срца обојене Масоновим трихромним бојењем (Scale gole = 500 µm) (n = 10 кришки/група свака од различите свиње, извршен је једносмерни ANOVA тест; ####p < 0,0001 у поређењу са D0 и ***p < 0,001 у поређењу са D12 Ctrl). ц Репрезентативне слике (лево) и квантификација (десно) за кришке срца обојене Масоновим трихромним бојењем (Scale gole = 500 µm) (n = 10 кришки/група свака од различитих свиња, извршен је једносмерни ANOVA тест; #### p < 0,0001 у поређењу са D0 и ***p < 0,001 у поређењу са D12 Ctrl). ц Репрезентативние изображениа (слева) и количественнаа оценка (справа) срезов сердца, украшених трихромним красителем Массона (масштаб без покритиа = 500 мкм) (н = 10 срезов/група од различитих свинеј, виполнаетса односсторонниј тест АНОВА; #### п < 0,0001 и 1 *** п < 0,0001 по сравнениу с Д по сравнениу Цтрл). ц Репрезентативне слике (лево) и квантификација (десно) пресека срца обојених Масоновим трихромним бојењем (необложена скала = 500 µм) (н = 10 пресека/група од различитих свиња, извршен једносмерни ANOVA тест; #### p < 0,0001 у поређењу са D0 и ***p < 0,001 у поређењу са D12 Ctrl). ц 用Массон 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=庺弈裸=序（左）和量化（右）（裸=庺度µ 10 个切片/组,每组来自不同的猪,进行单向АНОВА 测试；#### п < 0,0001 与Д0 相012相比）. Ц 用 массон 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸度 裸尺度 度裸尺度 = 500 µм） （н = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单单 向 单单 <## 浐0,0001 与Д0 相比,***п <0,001 与Д12 Цтрл 相比）。 ц Репрезентативние изображениа (слева) и количественниј анализ (справа) срезов сердца, украшенних трихромним красителем Массона (чистаа скала = 500 мкм) (н = 10 срезов/група, каждиј от свиньи, протестировано с помосьу однофакторного дисперсионного анализе ;###000, сравнение по сравнениу с ;###0001 < 0 ***п по сравнениу с Д12 Цтрл). ц Репрезентативне слике (лево) и квантификација (десно) пресека срца обојених Масоновим трихромним бојењем (слепа проба = 500 µm) (n = 10 пресека/група, сваки од различите свиње, тестирано једносмерном анализом варијансе;### # p < 0,0001 у поређењу са D0, ***p < 0,001 у поређењу са D12 Ctrl).Грешке представљају средњу вредност ± стандардну девијацију.
Претпоставили смо да се додавањем малих молекула у подлогу за култивацију може побољшати интегритет кардиомиоцита и смањити развој фиброзе током CTCM културе. Стога смо скрининговали мале молекуле користећи наше статичке контролне културе20,21 због малог броја збуњујућих фактора. Дексаметазон (Dex), тријодотиронин (T3) и SB431542 (SB) су изабрани за овај скрининг. Ови мали молекули су претходно коришћени у hiPSC-CM културама за индуковање сазревања кардиомиоцита повећањем дужине саркомера, Т-тубула и брзине проводљивости. Поред тога, познато је да и Dex (глукокортикоид) и SB сузбијају упалу29,30. Стога смо тестирали да ли би укључивање једног или комбинације ових малих молекула побољшало структурни интегритет срчаних пресека. За почетни скрининг, доза сваког једињења је изабрана на основу концентрација које се обично користе у моделима ћелијске културе (1 μM Dex27, 100 nM T327 и 2,5 μM SB31). Након 12 дана културе, комбинација Т3 и Декс-а је резултирала оптималним структурним интегритетом кардиомиоцита и минималним фиброзним ремоделирањем (додатне слике 4 и 5). Поред тога, употреба двоструких или удвостручених концентрација Т3 и Декс-а је произвела штетне ефекте у поређењу са нормалним концентрацијама (додатна слика 6а,б).
Након почетног скрининга, извршили смо директно поређење 4 услова културе (Слика 4а): Ctrl: пресеци срца култивисани у нашој претходно описаној статичкој култури користећи наш оптимизовани медијум; 20.21 TD: T3 и Ctrl s Додати Dex у среду; MC: пресеци срца култивисани у CTCM користећи наш претходно оптимизовани медијум; и MT: CTCM са T3 и Dex додатим у медијум. Након 12 дана култивације, вијабилност MS и MT ткива остала је иста као у свежим ткивима процењеним MTT тестом (Слика 4б). Занимљиво је да додавање T3 и Dex у трансулеларне културе (TD) није резултирало значајним побољшањем вијабилности у поређењу са Ctrl условима, што указује на важну улогу механичке стимулације у одржавању вијабилности пресека срца.
Дијаграм експерименталног дизајна који приказује четири услова културе који се користе за процену ефеката механичке стимулације и суплементације Т3/Декс на медијуму током 12 дана. б Стубичасти графикон приказује квантификацију вијабилности 12 дана након културе у сва 4 услова културе (Ctrl, TD, MC и MT) у поређењу са свежим кришкама срца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) кришки/група од различитих свиња, извршен је једносмерни ANOVA тест; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 у поређењу са D0 и **p < 0,01 у поређењу са D12 Ctrl). б Стубичасти графикон приказује квантификацију вијабилности 12 дана након културе у сва 4 услова културе (Ctrl, TD, MC и MT) у поређењу са свежим кришкама срца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) кришки/група од различитих свиња, извршен је једносмерни ANOVA тест; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 у поређењу са D0 и **p < 0,01 у поређењу са D12 ctrl). б Гистограмма показује количествену оценку жизнеспособности кроз 12 дана после култивисања свих 4 услова култивисања (контроль, ТД, МЦ и МТ) по сравњењу са свежим срезама сердца (Д0) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 ТД и Д12 МТ12, 12 свиньа сводитса (Д12 МТ12, 12) прорезује разноразних) односторонниј тест АНОВА ####п < 0,0001, ###п < 0,001 по сравњењу с Д0 и **п ​​< 0,01 по сравњењу с Д12 Цтрл). б Стубичасти графикон приказује квантификацију вијабилности 12 дана након културе у сва 4 услова културе (контрола, TD, MC и MT) у поређењу са свежим пресецима срца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) пресека/група од различитих свиња, једносмерни ANOVA тест; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 у односу на D0 и **p < 0,01 у поређењу са D12 Ctrl). б 条形图显示所有4 种培养条件 (Цтрл、ТД、МЦ 和МТ)）与新鲜心脏切片(Д0) (н = 18 (Д15)、ТД1、和Д12 МТ)，来自不同猪的12 (Д12 МЦ) 切片/组，进行单向АНОВА 测试；####п < 0.0001，0##0.0001，0##0.相比，**п < 0,01 与Д12控制）.б 4 12 (Д12 МЦ) б Гистограмма, показиваусаа все 4 условиа култиварованиа (контроль, ТД, МЦ и МТ) по сравнениу со свежими срезами сердца (Д0) (н = 18 (Д0), 15 (Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МТ), от разних свинеј 12 (Д12 МЦ) ссторониј/группа# ## тест ##; <0,0001, ###п <0,001 по сравнениу с Д0, **п <0,01 по сравнениу с контролем Д12). б Хистограм који приказује сва 4 услова културе (контролни, TD, MC и MT) у поређењу са свежим пресецима срца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), од различитих свиња 12 (D12 MC) пресека/група, једнофакторски ANOVA тест; ####p<0,0001, ###p<0,001 у односу на D0, **p<0,01 у односу на контролни D12). c Стубичасти графикон приказује квантификацију флукса глукозе 12 дана након културе у сва 4 услова културе (Ctrl, TD, MC и MT) у поређењу са свежим кришкама срца (D0) (n = 6 кришки/група од различитих свиња, извршен је једносмерни ANOVA тест; ###p < 0,001, у поређењу са D0 и ***p < 0,001 у поређењу са D12 Ctrl). c Стубичасти графикон приказује квантификацију флукса глукозе 12 дана након културе у сва 4 услова културе (Ctrl, TD, MC и MT) у поређењу са свежим кришкама срца (D0) (n = 6 кришки/група од различитих свиња, извршен је једносмерни ANOVA тест; ###p < 0,001, у поређењу са D0 и ***p < 0,001 у поређењу са D12 Ctrl). ц Гистограмма показује количествену оцену потока глукози через 12 дана после култивисања во всех 4 условиа култиварованиа (контроль, ТД, МЦ и МТ) по сравнениу со свежими срезами сердца (Д0) (н = 6 срезов/група от разних свинеј, односторонниј Виполнаетса < тест АНОВА; ##00 и ***п < 0 по сравнениу с Д12 Цтрл). ц Хистограм приказује квантификацију флукса глукозе 12 дана након културе под сва 4 услова културе (контрола, ТД, МЦ и МТ) у поређењу са свежим пресецима срца (Д0) (н = 6 пресека/група од различитих свиња, извршен једносмерни ANOVA тест; ###p < 0,001 у поређењу са Д0 и ***p < 0,001 у поређењу са Д12 контролом). ц 条形图显示所有4 种培养条件 (Цтрл、ТД、МЦ 和МТ) 与新鲜心脏切片 (Д0) 相湔, 12养原比，天的葡萄糖通量定量 (н = 6 片/组), 来自不同猪, 单向执行АНОВА 测试；##01； 0伌0.相比,***п < 0,001 与Д12 Цтрл 相比）. Ц 条形图 显示 所有 4 种 条件 （ (цтрл 、 тд 、 мц 和 мт)培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （н = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ，猪单向执行АНОВА 测试；###п < 0,001,与Д0 相比,***п <0,001 与Д12 Цтрл 相比）。 ц Гистограмма, показиваусаа количественнуу оценку потока глукози через 12 днеј после култиварованиа дла всех 4 услова култиварованиа (контроль, ТД, МЦ и МТ) по сравнениу со свежими срезами сердца (Д0) (н = 6 срезов/група, от разних свинеј, односторонниј Били ## тести п1, <# сравнение АНОВА; 0,001 по сравнениу с Д12 (контроль). ц Хистограм који приказује квантификацију флукса глукозе 12 дана након културе за сва 4 услова културе (контрола, ТД, МЦ и МТ) у поређењу са свежим пресецима срца (Д0) (н = 6 пресека/група, од различитих свиња, унилатерално). Где су извршени ANOVA тестови, ###p < 0,001 у поређењу са Д0, ***p < 0,001 у поређењу са Д12 (контрола).д Дијаграми анализе соја свежег (плаво), ткива средњег крвног притиска (зелено) на 12. дан и ткива средњег крвног притиска (црвено) на 12. дан на десет регионалних пресека ткива (н = 4 пресека/група, једносмерни ANOVA тест; није било значајне разлике између група). е Вулкан дијаграм који приказује диференцијално експресоване гене у свежим пресецима срца (Д0) у поређењу са пресецима срца култивисаним под статичким условима (Контрола) или под МТ условима (МТ) током 10-12 дана. ф Топлотна мапа гена саркомера за пресеке срца култивисане под сваким од услова културе. Грешке представљају средњу вредност ± стандардну девијацију.
Метаболичка зависност од преласка са оксидације масних киселина на гликолизу је обележје дедиференцијације кардиомиоцита. Незрели кардиомиоцити првенствено користе глукозу за производњу АТП-а и имају хипопластичне митохондрије са мало криста5,32. Анализе искоришћења глукозе показале су да је под условима МЦ и МТ, искоришћење глукозе било слично оном у ткивима 0. дана (Слика 4ц). Међутим, Ctrl узорци су показали значајно повећање искоришћења глукозе у поређењу са свежим ткивом. Ово указује да комбинација CTCM и T3/Dex побољшава виталност ткива и чува метаболички фенотип срчаних пресека култивисаних 12 дана. Поред тога, анализа соја је показала да су нивои соја остали исти као у свежем срчаном ткиву током 12 дана под условима МТ и МС (Слика 4д).
Да бисмо анализирали укупни утицај CTCM и T3/Dex на глобални транскрипциони пејзаж ткива срчаних пресека, извршили смо RNAseq на срчаним пресецима из сва четири различита услова културе (Додатни подаци 1). Занимљиво је да су MT пресеци показали високу транскрипциону сличност са свежим ткивом срца, са само 16 диференцијално експресованих од 13.642 гена. Међутим, као што смо раније показали, Ctrl пресеци су показали 1229 диференцијално експресованих гена након 10–12 дана у култури (Слика 4е). Ови подаци су потврђени qRT-PCR-ом гена срца и фибробласта (Додатна слика 7а-ц). Занимљиво је да су Ctrl пресеци показали смањену регулацију срчаних и ћелијских гена и активацију инфламаторних генских програма. Ови подаци сугеришу да је дедиференцијација, која се нормално јавља након дуготрајног култивисања, потпуно ослабљена под MT условима (Додатна слика 8а,б). Пажљиво проучавање гена саркомера показало је да су само под МТ условима очувани гени који кодирају саркомер (Сл. 4ф) и јонски канал (Допунска слика 9), штитећи их од супресије под Ctrl, TD и MC условима. Ови подаци показују да комбинацијом механичке и хуморалне стимулације (T3/Dex), транскриптом срчаног кришке може остати сличан свежим срчаним кришкама након 12 дана у култури.
Ове транскрипционе налазе поткрепљује чињеница да се структурни интегритет кардиомиоцита у срчаним пресецима најбоље очува под МТ условима током 12 дана, што показује интактни и локализовани конексин 43 (Сл. 5а). Поред тога, фиброза у срчаним пресецима под МТ условима је значајно смањена у поређењу са Ctrl и слична је свежим пресецима срца (Сл. 5б). Ови подаци показују да комбинација механичке стимулације и Т3/Декс третмана ефикасно чува срчану структуру у срчаним пресецима у култури.
Репрезентативне имунофлуоресцентне слике тропонина-Т (зелено), конексина 43 (црвено) и DAPI (плаво) у свеже изолованим пресецима срца (D0) или култивисаним 12 дана у сва четири услова културе пресека срца (скала = 100 µм). Квантификација структурног интегритета срчаног ткива помоћу вештачке интелигенције (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) пресека/групе од различитих свиња, извршен је једнофакторски ANOVA тест; ####p < 0,0001 у поређењу са D0 и *p < 0,05, или ****p < 0,0001 у поређењу са D12 Ctrl). Квантификација структурног интегритета срчаног ткива помоћу вештачке интелигенције (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) пресека/групе од различитих свиња, извршен је једнофакторски ANOVA тест; #### p < 0,0001 у поређењу са D0 и *p < 0,05, или ****p < 0,0001 у поређењу са D12 Ctrl). Количественнаа оценка структурној целостности ткани сердца помоћу искусног интелекта (н = 7 (Д0 и Д12 Цтрл), 5 (Д12 ТД, Д12 МЦ и Д12 МТ) срезов/група от разних свинеј, спроведен однофакторниј тест АНОВА; ### п < 0,0001 по < 0,0001 по <0,0001 по <0,00 п *п по сравнениу сравнение с Д12 Цтрл). Квантификација структурног интегритета срчаног ткива коришћењем вештачке интелигенције (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) пресека/групе од различитих свиња, извршен једнофакторски ANOVA тест; #### p < 0,0001 у поређењу са D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 у поређењу са D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性(н = 7(Д0 和Д12 Цтрл)、5(Д12 ТД、Д12 МЦ 和Д12) МТ）切片/组)）进行人工智能量化,进行单向АНОВА 测试；#### п < 0,0001 与Д0 和*п <0. 0,0001 与Д12 Цтрл 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （н = 7 (д0 和 д12 цтрл) （5 (д12 тд 、 д12 мц ） ） ） ） ） ） ） ） ）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## п < 0,0001 与Д0 和*п < 0,05 ； 斈п < 0.05 0,0001 与Д12 Цтрл 相比）.Квантификација структурног интегритета срчаног ткива коришћењем вештачке интелигенције код различитих свиња (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) пресеци/група) једнофакторским ANOVA тестом;#### п < 0,0001 по сравнениу с Д0 и *п < 0,05 или ****п < 0,0001 по сравнениу с Д12 Цтрл). #### p < 0,0001 у поређењу са D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 у поређењу са D12 (контрола). б Репрезентативне слике и квантификација за кришке срца обојене Масоновим трихромним бојењем (скала = 500 µм) (н = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) кришки/група од различитих свиња, извршен је једносмерни ANOVA тест; ####p < 0,0001 у поређењу са D0 и ***p < 0,001, или ****p < 0,0001 у поређењу са D12 Ctrl). б Репрезентативне слике и квантификација за кришке срца обојене Масоновим трихромним бојењем (скала = 500 µм) (н = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) кришки/група од различитих свиња, извршен је једносмерни ANOVA тест; ####p < 0,0001 у поређењу са D0 и ***p < 0,001, или ****p < 0,0001 у поређењу са D12 Ctrl). б Репрезентативние изображениа и количественнаа оценка срезов сердца, украшених трихромним красителем Массона (масштабнаа линејка = 500 мкм) (н = 10 (Д0, Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МЦ), 9 (Д12 МТ) срезов/группа отсторонниј тест, АН виполнаетса <## #группу отсторонниј тест,АНп виполнаетса; 0,0001 по сравнениу с Д0 и ***п < 0,001 или ****п < 0,0001 по сравнени с Д12 Цтрл). б Репрезентативне слике и квантификација пресека срца обојених Масоновим трихромним бојењем (скала = 500 µм) (н = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) пресека/групе од различитих свиња, извршена једносмерна ANOVA; ####p < 0,0001 у односу на D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 у односу на D12 Ctrl). б 用Массон 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化 (比例尺= 500 µм =）1（н)）1（н Цтрл、Д12 ТД 和Д12 МЦ）, 来自不同猪的9 个 (Д12 МТ) 切片/组,进行单因素方差，进行单因素##方差，与Д0 相比,***п < 0,001，或****п < 0,0001 与Д12 Цтрл 相比）。 б 用 массон 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µм ） （ （ （ 、 д12 цтрл 、 д12 тд 和 д12 мц） 来自 不同 的 9 个 д12 мт 切片 切片 切片 切片 凇片 切片 切片 切片 切切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分 <п#0.与Д0 相比，***п < 0,001,或****п < 0,0001 与Д12 Цтрл 相比）。 б Репрезентативние изображениа и количественнаа оценка срезов сердца, украшених трихромом Массона (масштабнаа линејка = 500 мкм) (н = 10 (Д0, Д12 Цтрл, Д12 ТД и Д12 МЦ), 9 (Д12 МТ) срезов от различних свинеј / группи, один- способ АНп0 < # 01, по# с01; ***п < 0,001 или ****п < 0,0001 по сравнениу с Д12 Цтрл). б Репрезентативне слике и квантификација пресека срца обојених Масоновим трихромом (скала = 500 µм) (н = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) пресека од различитих свиња/групе, једна ANOVA метода; ####p < 0,0001 у поређењу са D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 у поређењу са D12 Ctrl).Грешке представљају средњу вредност ± стандардну девијацију.
Коначно, способност ЦТЦМ да имитира срчану хипертрофију процењена је повећањем истезања срчаног ткива. Код ЦТЦМ, вршни притисак у ваздушној комори повећао се са 80 mmHg на 80 mmHg. артикул (нормално истезање) до 140 mmHg. артикул (слика 6а). Ово одговара повећању истезања од 32% (слика 6б), што је претходно приказано као одговарајући проценат истезања потребан срчаним пресецима да би се постигла дужина саркомера слична оној која се види код хипертрофије. Истезање и брзина срчаног ткива током контракције и релаксације остали су константни током шест дана културе (слика 6ц). Срчано ткиво из МТ услова је подвргнуто нормалном истезању (МТ (нормално)) или условима претераног истезања (МТ (ОС)) током шест дана. Већ након четири дана у култури, хипертрофични биомаркер NT-ProBNP је био значајно повишен у медијуму под МТ (ОС) условима у поређењу са МТ (нормалним) условима (слика 7а). Поред тога, након шест дана култивације, величина ћелија у МТ (ОС) (Сл. 7б) се значајно повећала у поређењу са пресецима МТ срца (нормално). Поред тога, нуклеарна транслокација NFATC4 је значајно повећана у прерастежним ткивима (Сл. 7ц). Ови резултати показују прогресиван развој патолошког ремоделирања након хипердистензије и подржавају концепт да се CTCM уређај може користити као платформа за проучавање сигнализације срчане хипертрофије изазване истезањем.
Репрезентативни трагови мерења притиска у ваздушној комори, притиска у флуидној комори и кретања ткива потврђују да притисак у комори мења притисак у флуидној комори, узрокујући одговарајуће кретање пресека ткива. б Репрезентативне криве процента истезања и брзине истезања за нормално истегнуте (наранџасте) и претерано истегнуте (плаве) пресеке ткива. ц Стубичасти графикон који приказује време циклуса (n = 19 пресека по групи, од различитих свиња), време контракције (n = 18-19 пресека по групи, од различитих свиња), време релаксације (n = 19 пресека по групи, од различитих свиња)), амплитуду кретања ткива (n = 14 пресека/група, од различитих свиња), максималну систоличку брзину (n = 14 пресека/група, од различитих свиња) и максималну брзину релаксације (n = 14 (D0), 15 (D6) пресека/група) од различитих свиња), двострани Студентов t-тест није показао значајну разлику ни у једном параметру, што указује да су ови параметри остали константни током 6 дана културе са пренапоном. Грешке представљају средњу вредност ± стандардну девијацију.
Стубичасти графикон квантификације концентрације NT-ProBNP у медијуму за култивацију из срчаних кришки култивисаних под условима нормалног истезања MT (Norm) или прекомерног истезања (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4 MTOS) кришке/група од различитих свиња, извршена је двосмерна ANOVA; **p < 0,01 у поређењу са нормалним истезањем). Стубичасти графикон квантификације концентрације NT-ProBNP у медијуму за култивацију из срчаних кришки култивисаних под условима нормалног истезања MT (Norm) или прекомерног истезања (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4 MTOS) кришке/група од различитих свиња, извршена је двосмерна ANOVA; **p < 0,01 у поређењу са нормалним истезањем).Квантитативни хистограм концентрације NT-ProBNP у подлози за култивацију из срчаних кришки култивисаних под условима нормалног МТ истезања (норма) или претераног истезања (ОС) (n = 4 (D2 МТнорм), 3 (D2 МТОС, D4 МТнорм и D4 МТОС) кришке/група од различитих свиња, извршена је двофакторска анализа варијансе;**п < 0,01 по сравнениу с нормалним растажением). **p < 0,01 у поређењу са нормалним истезањем). а 在МТ 正常拉伸(Норм) 或过度拉伸(ОС) 条件下培养的心脏切片培养基中НТ-ПроБНП浓度的条形图量化（н = 4 (Д2 МТНорм)、3 (Д2 МТОС、Д4 МТНорм 和Д4 МТОС）来自不同猪的切片/组,进行双向方差分析；**与正常拉伸相比, п < 0,01). а Квантификација концентрације НТ-ПроБНП у срчаним кришкама узгајаним у условима нормалног растезања МТ (Норм) или прекомерног растезања (ОС) (н = 4 (Д2 МТНорм), 3 (Д2 МТОС, Д4 МТНорм和Д4 МТОС) из различитих猪的切片/组，可以双向方方发发动 **у поређењу са нормалним истезањем, п < 0,01);хистограм Квантификација концентрација NT-ProBNP у срчаним кришкама култивисаним под условима нормалног МТ истезања (норма) или претераног истезања (ОС) (n = 4 (D2 МТнорм), 3 (D2 МТОС, D4 МТнорм) и D4 МТОС) кришке/група од различитих свиња, двофакторска анализа варијансе;**п < 0,01 по сравнениу с нормалним растажением). **p < 0,01 у поређењу са нормалним истезањем). б Репрезентативне слике за кришке срца обојене тропонином-Т и WGA (лево) и квантификација величине ћелија (десно) (н = 330 (Д6 МТОС), 369 (Д6 МТНорм) ћелија/група из 10 различитих кришки од различитих свиња, извршен је двострани Студентов t-тест; ****п < 0,0001 у поређењу са нормалним истезањем). б Репрезентативне слике за кришке срца обојене тропонином-Т и WGA (лево) и квантификација величине ћелија (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ћелија/група из 10 различитих кришки од различитих свиња, извршен је двострани Студентов t-тест; ****p < 0,0001 у поређењу са нормалним истезањем). б Репрезентативние изображениа срезов сердца, окрашених тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определениа размера ћелија (справа) (н = 330 (Д6 МТОС), 369 (Д6 МТНорм) клетки/групе из 10 различитих срезов от разноразних свинеј, два- проводи хвостовој т-критер, два- проводи хвостовој т-критер; нормальним растажением). б Репрезентативне слике пресека срца обојених тропонином-Т и AZP (лево) и квантификација величине ћелија (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ћелија/група из 10 различитих пресека од различитих свиња, извршен је двострани Студентов t-тест; ****p < 0,0001 у поређењу са нормалним сојем). б 用肌钙蛋白-Т 和ВГА（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的仼30惇 = Д63表МТОС）, 的10 的 369 (Д6 МТНорм) 细胞/组, 两进行有尾学 检验；与正常拉伸相比，****п < 0,0001). б Репрезентативне слике кришки срца обојених калкареином-Т и WGA (лево) и величина ћелија (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 из 10 различитих кришки (D6 MTNorm)) Ћелије/组, t-тест у поређењу са нормалним истезањем, ****p < 0,0001). б Репрезентативние изображениа срезов сердца, украшених тропонином-Т и АЗП (слева) и количественнаа оценка размера клетки (справе) (н = 330 (Д6 МТОС), 369 (Д6 МТНорм) из 10 различитих срезова от разних свињ Клетки/групе, двусторонние **** сравнение <бр><бр><бр><бр><бр><бр><бр><бр> б Репрезентативне слике пресека срца обојених тропонином-Т и AZP (лево) и квантификација величине ћелија (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различитих пресека од различитих свиња) Ћелије/група, двострани критеријум Студентовог t; ****p < 0,0001 у поређењу са нормалним сојем). ц Репрезентативне слике за срчане кришке МТОС срца имунообележене за тропонин-Т и НФАТЦ4 дана 0 и 6 и квантификација транслокације НФАТЦ4 у језгра ЦМ (н = 4 (Д0), 3 (Д6 МТОС) кришке/група од различитих свиња, извршен је двострани Студентов t-тест; *п < 0,05). ц Репрезентативне слике за срчане кришке МТОС срца имунообележене за тропонин-Т и НФАТЦ4 на дан 0 и дан 6 и квантификација транслокације НФАТЦ4 у језгра ЦМ (н = 4 (Д0), 3 (Д6 МТОС) кришке/група од различитих свиња, извршен је двострани Студентов t-тест; *п < 0,05). ц Репрезентативне слике за срезове срца 0 и 6 дана МТОС, имуномечених за тропонина-Т и НФАТЦ4, и количествена оценка транслокације НФАТЦ4 у јадра кавернозних ћелија (н = 4 (Д0), 3 (Д6 МТОС) срезов/група виполнаутьса от различних свинеј , двусторониј, 0 ст.). ц Репрезентативне слике за пресеке срца на 0 и 6 дана МТОС, имунообележене за тропонин-Т и НФАТЦ4, и квантификација транслокације НФАТЦ4 у једру кавернозних ћелија (н = 4 (Д0), 3 (Д6 МТОС) пресеци/група од различитих свиња) извршена двостраним Студентовим t-тестом; *п < 0,05). ц 用于肌钙蛋白-Т 和НФАТЦ4 免疫标记的第0 天和第6 天МТОС心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的НФАТЦ4 易位至 ЦМ 细胞核的量化 (ОСД ​​н) (ОС 3 = ㌖4（Дн)切片/组, 进行双尾学生т 检验；*п < 0,05). ц Репрезентативне слике калканин-Т и НФАТЦ4 имунообележавања 第0天和第6天МТОС срчаних кришки и НФАТЦ4 из различитих количина НФАТЦ4 易位至ЦМ ћелијског језгра的化 (н = 4 (Д6) 组弄/Д0, МТОС 3时间双尾学生ет 电影；*п < 0,05). ц Репрезентативние изображениа срезов сердца МТОС на 0 и 6 ден дла имуномаркировки тропонином-Т и НФАТЦ4 и количественнаа оценка транслокации НФАТЦ4 в адра ЦМ от разнообразних свинеј (н = 4 (Д0), 3 (Д6 МТОС) срез/група, два-хвостатиј т-критериј, *00 Стьудента; ц Репрезентативне слике МТОС срчаних резова на дан 0 и 6 за имунообележавање тропонина-Т и НФАТЦ4 и квантификацију НФАТЦ4 транслокације у једру ЦМ код различитих свиња (н = 4 (Д0), 3 (Д6 МТОС) резова/група, двострани т-критеријум Студентов; *п < 0,05).Грешке представљају средњу вредност ± стандардну девијацију.
Транслациона кардиоваскуларна истраживања захтевају ћелијске моделе који прецизно репродукују срчано окружење. У овој студији, развијен је и окарактерисан CTCM уређај који може да стимулише ултратанке пресеке срца. CTCM систем укључује физиолошки синхронизовану електромеханичку стимулацију и обогаћивање T3 и Dex течностима. Када су пресеци свињског срца били изложени овим факторима, њихова виталност, структурни интегритет, метаболичка активност и транскрипциона експресија остали су исти као у свежем срчаном ткиву након 12 дана културе. Поред тога, прекомерно истезање срчаног ткива може изазвати хипертрофију срца узроковану хиперекстензијом. Генерално, ови резултати подржавају критичну улогу физиолошких услова културе у одржавању нормалног срчаног фенотипа и пружају платформу за скрининг лекова.
Много фактора доприноси стварању оптималног окружења за функционисање и опстанак кардиомиоцита. Најочигледнији од ових фактора повезани су са (1) међућелијским интеракцијама, (2) електромеханичком стимулацијом, (3) хуморалним факторима и (4) метаболичким супстратима. Физиолошке ћелијске интеракције захтевају сложене тродимензионалне мреже вишеструких типова ћелија које подржава екстрацелуларни матрикс. Такве сложене ћелијске интеракције је тешко реконструисати in vitro кокултуром појединачних типова ћелија, али се могу лако постићи коришћењем органотипске природе срчаних пресека.
Механичко истезање и електрична стимулација кардиомиоцита су кључни за одржавање срчаног фенотипа33,34,35. Иако се механичка стимулација широко користи за кондиционирање и сазревање hiPSC-CM, неколико елегантних студија је недавно покушало механичку стимулацију срчаних кришки у култури коришћењем једноосног оптерећења. Ове студије показују да 2Д једноосно механичко оптерећење има позитиван ефекат на фенотип срца током културе. У овим студијама, пресеци срца су или оптерећени изометријским силама затезања17, линеарним ауксотонским оптерећењем18, или је срчани циклус рекреиран коришћењем повратне спреге претварача силе и погона затезања. Међутим, ове методе користе једноосно истезање ткива без оптимизације околине, што резултира супресијом многих срчаних гена или прекомерном експресијом гена повезаних са абнормалним одговорима истезања. CTCM описан овде пружа 3Д електромеханички стимулус који опонаша природни срчани циклус у смислу времена циклуса и физиолошког истезања (25% истезања, 40% систоле, 60% дијастоле и 72 откуцаја у минути). Иако ова тродимензионална механичка стимулација сама по себи није довољна за одржавање интегритета ткива, потребна је комбинација хуморалне и механичке стимулације коришћењем Т3/Декс-а да би се адекватно одржала виталност, функција и интегритет ткива.
Хуморални фактори играју важну улогу у модулацији фенотипа срца код одраслих. Ово је истакнуто у HiPS-CM студијама у којима су Т3 и Dex додати у подлоге за култивацију како би се убрзало сазревање ћелија. Т3 може утицати на транспорт аминокиселина, шећера и калцијума преко ћелијских мембрана36. Поред тога, Т3 промовише експресију MHC-α и смањење регулације MHC-β, подстичући формирање брзих миофибрила у зрелим кардиомиоцитима у поређењу са спорим миофибрилима код феталног CM. Недостатак Т3 код хипотиреозних пацијената доводи до губитка миофибриларних трака и смањене стопе развоја тонуса37. Dex делује на глукокортикоидне рецепторе и показано је да повећава контрактилност миокарда у изолованим перфузованим срцима;38 сматра се да је ово побољшање повезано са ефектом на улазак изазван депозитима калцијума (SOCE)39,40. Поред тога, Dex се везује за своје рецепторе, узрокујући широк интрацелуларни одговор који сузбија имунолошку функцију и упалу30.
Наши резултати указују да је физичко-механичка стимулација (МС) побољшала укупне перформансе културе у поређењу са Цтрл, али није успела да одржи виталност, структурни интегритет и срчану експресију током 12 дана у култури. У поређењу са Цтрл, додавање Т3 и Декс у ЦТЦМ (МТ) културе побољшало је виталност и одржало сличне транскрипционе профиле, структурни интегритет и метаболичку активност са свежим срчаним ткивом током 12 дана. Поред тога, контролисањем степена истезања ткива, креиран је модел срчане хипертрофије изазване хиперекстензијом коришћењем СТЦМ-а, што илуструје свестраност СТЦМ система. Треба напоменути да иако ремоделирање срца и фиброза обично укључују нетакнуте органе чије циркулишуће ћелије могу да обезбеде одговарајуће цитокине, као и фагоцитозу и друге факторе ремоделирања, делови срца и даље могу да имитирају фиброзни процес као одговор на стрес и трауму. у миофибробласте. Ово је претходно процењено у овом моделу срчаног пресека. Треба напоменути да се параметри ЦТЦМ-а могу модулирати променом притиска/електричне амплитуде и фреквенције како би се симулирала многа стања као што су тахикардија, брадикардија и механичка циркулаторна подршка (механичко растерећено срце). Ово чини систем средњим пропусним оптерећењем за тестирање лекова. Способност CTCM-а да моделира срчану хипертрофију изазвану прекомерним напрезањем отвара пут за тестирање овог система за персонализовану терапију. Закључно, ова студија показује да су механичко истезање и хуморална стимулација кључни за одржавање културе пресека срчаног ткива.
Иако подаци представљени овде указују на то да је CTCM веома перспективна платформа за моделирање интактног миокарда, ова метода културе има нека ограничења. Главно ограничење CTCM културе је то што намеће континуирана динамичка механичка напрезања на пресеке, што онемогућава активно праћење контракција срчаних пресека током сваког циклуса. Поред тога, због мале величине срчаних пресека (7 мм), могућност процене систоличке функције ван система културе коришћењем традиционалних сензора силе је ограничена. У овом рукопису делимично превазилазимо ово ограничење проценом оптичког напона као индикатора контрактилне функције. Међутим, ово ограничење ће захтевати даљи рад и може се решити у будућности увођењем метода за оптичко праћење функције срчаних пресека у култури, као што је оптичко мапирање коришћењем калцијума и боја осетљивих на напон. Још једно ограничење CTCM-а је то што радни модел не манипулише физиолошким стресом (претходно и пост-лоадинг). У CTCM-у, притисак је индукован у супротним смеровима да би се репродуковало 25% физиолошког истезања у дијастоли (пуно истезање) и систоли (дужина контракције током електричне стимулације) у веома великим ткивима. Ово ограничење треба уклонити у будућим дизајнима ЦТЦМ адекватним притиском на срчано ткиво са обе стране и применом тачних односа притиска и запремине који се јављају у коморама срца.
Ремоделирање изазвано прекомерним истезањем о коме се извештава у овом рукопису ограничено је на имитирање хипертрофичних хиперистезних сигнала. Стога, овај модел може помоћи у проучавању хипертрофичне сигнализације изазване истезањем без потребе за хуморалним или неуронским факторима (који не постоје у овом систему). Потребна су даља истраживања како би се повећала мултиплицитет ЦТЦМ-а, на пример, кокултивација са имуним ћелијама, циркулишући хуморални фактори плазме и инервација при кокултивацији са неуронским ћелијама побољшаће могућности моделирања болести са ЦТЦМ-ом.
У овој студији је коришћено тринаест свиња. Све процедуре на животињама су спроведене у складу са институционалним смерницама и одобрене су од стране Комитета за негу и коришћење животиња Универзитета у Луисвилу. Аортни лук је стегнут стегнут, а срце је перфузирано са 1 л стерилне кардиоплегије (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL хепарина, pH до 7,4); Срца су чувана у ледено хладном кардиоплегичном раствору све док нису транспортована у лабораторију на леду, што је обично <10 минута. Срца су чувана у ледено хладном кардиоплегичном раствору све док нису транспортована у лабораторију на леду, што је обично <10 минута. сердца хранили в леданом кардиоплегическом раствору до транспортировки в лабораторији на льду, что обично занимает <10 мин. срца су чувана у ледено хладном кардиоплегичном раствору до транспорта у лабораторију на леду, што обично траје <10 минута.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室, 通常<10。钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室, 通常<10。钟 Држите сердца в леданој кардиоплегии до транспортировки в лабораторији на льду, обично <10 мин. Држите срца на леденој кардиоплегији до транспорта у лабораторију на леду, обично <10 минута.
CTCM уређај је развијен у SolidWorks софтверу за рачунарски потпомогнуто пројектовање (CAD). Коморе за култивацију, преграде и ваздушне коморе су направљене од CNC провидне акрилне пластике. Заштитни прстен пречника 7 мм је направљен од полиетилена високе густине (HDPE) у средини и има жлеб за о-прстен за смештај силиконског о-прстена који се користи за заптивање подлоге испод. Танка силицијумска мембрана одваја комору за култивацију од плоче за раздвајање. Силиконска мембрана је ласерски исечена од силиконског лима дебљине 0,02 инча и има тврдоћу од 35A. Доња и горња силиконска заптивка су ласерски исечене од силиконског лима дебљине 1/16 инча и имају тврдоћу од 50A. За причвршћивање блока и стварање херметичког заптивања користе се вијци и навртке са крилцима од нерђајућег челика 316L.
Наменска штампана плоча (PCB) је дизајнирана за интеграцију са C-PACE-EM системом. Швајцарски машински конектори на PCB-у су повезани са графитним електродама помоћу посребрених бакарних жица и бронзаних 0-60 завртњи у електроде. Штампана плоча је смештена у поклопац 3D штампача.
Уређај CTCM контролише програмабилни пнеуматски актуатор (PPD) који ствара контролисани циркулаторни притисак сличан срчаном циклусу. Како се притисак унутар ваздушне коморе повећава, флексибилна силиконска мембрана се шири навише, потискујући медијум испод места ткива. Подручје ткива ће се затим растегнути овим избацивањем течности, опонашајући физиолошко ширење срца током дијастоле. На врхунцу релаксације, примењена је електрична стимулација преко графитних електрода, што је смањило притисак у ваздушној комори и изазвало контракцију делова ткива. Унутар цеви се налази хемостатски вентил са сензором притиска за детекцију притиска у ваздушном систему. Притисак који детектује сензор притиска примењује се на колектор података повезан са лаптопом. Ово омогућава континуирано праћење притиска унутар гасне коморе. Када се достигне максимални притисак у комори (стандардних 80 mmHg, 140 mmHg OS), уређају за прикупљање података је наређено да пошаље сигнал C-PACE-EM систему да генерише двофазни напонски сигнал током 2 ms, подешен на 4 V.
Пресеци срца су добијени и услови културе у 6 бунарића су спроведени на следећи начин: сакупљена срца су пребачена из посуде за пренос у послужавник који садржи хладну (4°C) кардиоплегију. Лева комора је изолована стерилним сечивом и исечена на комаде од 1-2 цм3. Ови блокови ткива су причвршћени за носаче ткива помоћу лепка за ткиво и стављени у вибрирајуће микротомско купатило за ткиво које садржи Тиродов раствор и континуирано оксигенисано (3 г/Л 2,3-бутандион монооксима (BDM), 140 mM NaCl (8,18 г), 6 mM KCl (0,447 г), 10 mM D-глукозе (1,86 г), 10 mM HEPES (2,38 г), 1 mM MgCl2 (1 мл 1 М раствора), 1,8 mM CaCl2 (1,8 мл 1 М раствора), до 1 Л ddH2O). Вибрирајући микротом је подешен да сече кришке дебљине 300 µм на фреквенцији од 80 Hz, хоризонталној амплитуди вибрација од 2 mm и брзини померања од 0,03 mm/s. Купатило за ткиво је било окружено ледом да би раствор остао хладан, а температура је одржавана на 4°C. Пресеци ткива су пребачени из купке за микротом у инкубационо купатило које садржи континуирано оксигенисани раствор Тироде на леду док се не добије довољно пресека за једну плочу за културу. За трансудуларне културе, пресеци ткива су причвршћени за стерилне полиуретанске носаче ширине 6 mm и стављени у 6 ml оптимизоване подлоге (199 медијум, 1x ITS додатак, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-алкални и 2X антибиотик-антифунгални). Електрична стимулација (10 V, фреквенција 1,2 Hz) је примењена на пресеке ткива преко C-Pace-а. За TD услове, свежи T3 и Dex су додавани у концентрацијама од 100 nM и 1 μM при свакој промени подлоге. Медијум је засићен кисеоником пре замене 3 пута дневно. Пресеци ткива су култивисани у инкубатору на 37°C и 5% CO2.
За CTCM културе, пресеци ткива су постављени на прилагођени 3D штампач у Петријевој шољи која садржи модификовани Тиродов раствор. Уређај је дизајниран да повећа величину пресека срца за 25% површине прстена за подршку. Ово се ради тако да се пресеци срца не растежу након преношења из Тиродовог раствора у медијум и током дијастоле. Користећи хистоакрилни лепак, пресеци дебљине 300 µm су фиксирани на прстен за подршку пречника 7 mm. Након причвршћивања пресека ткива на прстен за подршку, одсеците вишак пресека ткива и вратите причвршћене пресеке ткива у каду са Тиродовим раствором на леду (4°C) док се не припреми довољно пресека за један уређај. Укупно време обраде за све уређаје не би требало да прелази 2 сата. Након што је 6 пресека ткива причвршћено на њихове прстенове за подршку, CTCM уређај је састављен. Комора за CTCM културу је претходно напуњена са 21 ml претходно оксигенисане подлоге. Пребаците пресеке ткива у комору за културу и пажљиво уклоните све мехуриће ваздуха пипетом. Пресек ткива се затим убацује у отвор и нежно притиска на место. На крају, поставите поклопац електроде на уређај и пренесите уређај у инкубатор. Затим повежите CTCM са ваздушном цевчицом и C-PACE-EM системом. Пнеуматски актуатор се отвара, а ваздушни вентил отвара CTCM. C-PACE-EM систем је конфигурисан да испоручује 4 V на 1,2 Hz током двофазног пејсинга у трајању од 2 ms. Медијум је мењан два пута дневно, а електроде су мењане једном дневно како би се избегло накупљање графита на електродама. Ако је потребно, пресеци ткива се могу уклонити из њихових бунара за култивацију како би се избацили сви мехурићи ваздуха који су можда пали испод њих. За услове МТ третмана, T3/Dex је додат свеж са сваком променом медијума са 100 nM T3 и 1 μM Dex. CTCM уређаји су култивисани у инкубатору на 37°C и 5% CO2.
Да би се добиле истегнуте трајекторије срчаних кришки, развијен је посебан систем камера. Коришћена је SLR камера (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Јапан) са Navitar Zoom 7000 18-108mm макро објективом (Navitar, Сан Франциско, Калифорнија). Визуелизација је извршена на собној температури након замене медијума свежим медијумом. Камера је постављена под углом од 51°, а видео се снима брзином од 30 кадрова у секунди. Прво, коришћен је софтвер отвореног кода (MUSCLEMOTION43) са Image-J за квантификацију кретања срчаних кришки. Маска је креирана помоћу MATLAB-а (MathWorks, Natick, MA, САД) да би се дефинисали региони од интереса за кришке срца које куцају и избегла бука. Ручно сегментиране маске се примењују на све слике у низу кадрова, а затим се прослеђују MUSCLEMOTION додатку. Muscle Motion користи просечан интензитет пиксела у сваком кадру да квантификује своје кретање у односу на референтни оквир. Подаци су снимљени, филтрирани и коришћени за квантификацију времена циклуса и процену истезања ткива током срчаног циклуса. Снимљени видео је накнадно обрађен коришћењем дигиталног филтера нулте фазе првог реда. Да би се квантификовало истезање ткива (од врха до врха), извршена је анализа од врха до врха како би се разликовали врхови и долине у снимљеном сигналу. Поред тога, врши се уклањање тренда коришћењем полинома 6. реда како би се елиминисао помак сигнала. Програмски код је развијен у MATLAB-у за одређивање глобалног кретања ткива, времена циклуса, времена релаксације и времена контракције (Допунски програмски код 44).
За анализу напрезања, користећи исте видео записе креиране за процену механичког истезања, прво смо пратили две слике које представљају врхове кретања (највишу (горњу) и најнижу (доњу) тачку кретања) према софтверу MUSCLEMOTION. Затим смо сегментирали регионе ткива и применили облик алгоритма сенчења на сегментирано ткиво (Допунска слика 2а). Сегментирано ткиво је затим подељено на десет подповршина, а напон на свакој површини је израчунат помоћу следеће једначине: Напрезање = (Sup-Sdown)/Sdown, где су Sup и Sdown удаљености облика од горње и доње сенке тканине, респективно (Допунска слика 2б).
Пресеци срца су фиксирани у 4% параформалдехиду током 48 сати. Фиксирана ткива су дехидрирана у 10% и 20% сахарози током 1 сата, а затим у 30% сахарози преко ноћи. Пресеци су затим уграђени у једињење за оптималну температуру сечења (OCT једињење) и постепено замрзнути у купатилу изопентан/суви лед. OCT блокове за уградњу чувати на -80 °C до раздвајања. Слајдови су припремљени као пресеци дебљине 8 μm.
Да бисте уклонили OCT из пресека срца, загрејте препарате на грејном блоку на 95 °C током 5 минута. Додајте 1 ml PBS-а на сваки препарат и инкубирајте 30 минута на собној температури, затим пермеатирајте пресеке постављањем 0,1% Triton-X у PBS током 15 минута на собној температури. Да бисте спречили везивање неспецифичних антитела за узорак, додајте 1 ml 3% раствора BSA на препарате и инкубирајте 1 сат на собној температури. BSA је затим уклоњен, а препарати су испрани PBS-ом. Означите сваки узорак оловком. Примарна антитела (разблажена 1:200 у 1% BSA) (конексин 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) и тропонин-Т (Thermo Scientific; #MA5-12960) су додата током 90 минута, затим секундарна антитела (разблажена 1:200 у 1% BSA) против мишјег Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), против зечјег Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) током додатних 90 минута. Испрано 3 пута са PBS-ом. Да бисмо разликовали циљно бојење од позадине, користили смо само секундарно антитело као контролу. Коначно, додата је DAPI нуклеарна боја, а плочице су стављене у vectashield (Vector Laboratories) и запечаћене лаком за нокте. -x увећање) и Keyence микроскоп са увећањем од 40x.
За WGA бојење коришћен је WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) у концентрацији од 5 μг/мл у PBS-у и нанет на фиксиране пресеке током 30 минута на собној температури. Слајдови су затим испрани PBS-ом и додат је Судан црни на сваки препарат и инкубирани 30 минута. Слајдови су затим испрани PBS-ом и додат је vectashield медијум за уградњу. Слајдови су визуализовани на Keyence микроскопу при увећању од 40 пута.
ОКТ је уклоњен из узорака као што је горе описано. Након уклањања ОКТ-а, плочице су потопљене у Буенов раствор преко ноћи. Плочице су затим испране дестилованом водом 1 сат, а затим стављене у Бибрихов раствор алое киселине фуксина на 10 минута. Затим су плочице испране дестилованом водом и стављене у раствор 5% фосфомолибдена/5% фосфоволфрамове киселине на 10 минута. Без испирања, плочице су директно пребачене у раствор анилин плаве на 15 минута. Затим су плочице испране дестилованом водом и стављене у 1% раствор сирћетне киселине на 2 минута. Плочице су осушене у 200 N етанолу и пребачене у ксилен. Обојене плочице су визуализоване помоћу Keyence микроскопа са објективом од 10x. Проценат површине фиброзе је квантификован помоћу Keyence Analyzer софтвера.
CyQUANT™ MTT тест виталности ћелија (Invitrogen, Карлсбад, Калифорнија), каталошки број V13154, према протоколу произвођача са неким модификацијама. Конкретно, коришћен је хируршки бушилица пречника 6 mm да би се осигурала уједначена величина ткива током MTT анализе. Ткива су појединачно стављена у бунариће плоче са 12 бунарића која садржи MTT супстрат према протоколу произвођача. Пресеци се инкубирају на 37°C током 3 сата, а живо ткиво метаболише MTT супстрат да би се формирало љубичасто формазан једињење. Замените MTT раствор са 1 ml DMSO и инкубирајте на 37°C током 15 минута да бисте извукли љубичасти формазан из пресека срца. Узорци су разблажени 1:10 у DMSO у плочама са 96 бунарића са провидним дном, а интензитет љубичасте боје је мерен на 570 nm помоћу Cytation читача плоча (BioTek). Очитавања су нормализована на тежину сваког пресека срца.
Медијум за срчане кришке је замењен медијумом који садржи 1 μCi/ml [5-3H]-глукозе (Moravek Biochemicals, Brea, CA, САД) за тест искоришћења глукозе као што је претходно описано. Након 4 сата инкубације, додајте 100 µl медијума у ​​отворену микроцентрифужну епрувету која садржи 100 µl 0,2 N HCl. Затим је епрувета стављена у сцинтилациону епрувету која садржи 500 μl dH2O да би се испарио [3H]2O током 72 сата на 37°C. Затим уклоните микроцентрифужну епрувету из сцинтилационе епрувете и додајте 10 ml сцинтилационе течности. Бројање сцинтилација је извршено помоћу анализатора течности за сцинтилацију Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, САД). Искоришћење глукозе је затим израчунато узимајући у обзир специфичну активност [5-3H]-глукозе, непотпуну равнотежу и позадину, разблажење [5-3H]-необележеном глукозом и ефикасност сцинтилационог бројача. Подаци су нормализовани на масу пресека срца.
Након хомогенизације ткива у Тризолу, РНК је изолована из срчаних пресека коришћењем Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 према протоколу произвођача. Припрема RNAsec библиотеке, секвенцирање и анализа података су извршени на следећи начин:
1 μг РНК по узорку коришћено је као почетни материјал за припрему РНК библиотеке. Библиотеке за секвенцирање генерисане су коришћењем NEBNext UltraTM комплета за припрему РНК библиотека за Illumina (NEB, САД) пратећи препоруке произвођача, а индексни кодови су додати атрибутним секвенцама за сваки узорак. Укратко, мРНК је пречишћена из укупне РНК коришћењем магнетних перли причвршћених поли-Т олигонуклеотидима. Фрагментација је спроведена коришћењем двовалентних катјона на високој температури у NEBNext пуферу за реакцију синтезе првог ланца (5X). Први ланац цДНК је синтетисан коришћењем случајних хексамерних прајмера и M-MuLV реверзне транскриптазе (RNase H-). Други ланац цДНК је затим синтетисан коришћењем ДНК полимеразе I и RNase H. Преостали препусти се претварају у тупе крајеве егзонуклеазном/полимеразном активношћу. Након аденилације 3′ краја ДНК фрагмента, на њега је причвршћен NEBNext адаптер са структуром у облику укоснице како би се припремио за хибридизацију. За селекцију фрагмената цДНК пожељне дужине 150-200 bp. Фрагменти библиотеке су пречишћени коришћењем AMPure XP система (Beckman Coulter, Беверли, САД). Затим је 3 μl USER ензима (NEB, САД) са цДНК одабраном по величини, лигираним адаптером, коришћено 15 минута на 37°C, а затим 5 минута на 95°C пре PCR. PCR је затим извршен коришћењем Phusion High-Fidelity ДНК полимеразе, универзалних PCR прајмера и Index (X) прајмера. Коначно, PCR производи су пречишћени (AMPure XP систем) и квалитет библиотеке је процењен на Agilent Bioanalyzer 2100 систему. Библиотека цДНК је затим секвенционирана коришћењем Novaseq секвенцера. Сирове датотеке слика из Illumina су конвертоване у сирове очитавања коришћењем CASAVA Base Calling-а. Сирови подаци се чувају у датотекама формата FASTQ(fq) које садрже секвенце очитавања и одговарајуће базне квалитете. Изаберите HISAT2 да бисте упарили филтрирана очитавања секвенцирања са референтним геномом Sscrofa11.1. Генерално, HISAT2 подржава геноме било које величине, укључујући геноме веће од 4 милијарде база, а за већину параметара су подешене подразумеване вредности. Очитавања сплајсинга из RNA Seq података могу се ефикасно поравнати коришћењем HISAT2, најбржег система који је тренутно доступан, са истом или бољом тачношћу од било које друге методе.
Обиље транскрипата директно одражава ниво експресије гена. Нивои експресије гена процењују се обиљем транскрипата (бројем секвенцирања) повезаних са геномом или ексонима. Број очитавања је пропорционалан нивоима експресије гена, дужини гена и дубини секвенцирања. FPKM (фрагменти на хиљаду парова база секвенцираних транскрипата на милион парова база) су израчунати и P-вредности диференцијалне експресије су одређене коришћењем DESeq2 пакета. Затим смо израчунали стопу лажних открића (FDR) за сваку P вредност користећи Бенџамини-Хохбергову методу9 на основу уграђене R-функције „p.adjust“.
РНК изолована из срчаних пресека је конвертована у цДНК у концентрацији од 200 нг/μл коришћењем SuperScript IV Vilo Master микса од компаније Thermo (Thermo, кат. бр. 11756050). Квантитативна RT-PCR је извршена коришћењем Applied Biosystems Endura Plate Microamp транспарентне реакционе плоче са 384 бунарића (Thermo, кат. бр. 4483319) и microamp оптичког адхезива (Thermo, кат. бр. 4311971). Реакциона смеша се састојала од 5 µl Taqman Fast Advanced Master микса (Thermo, кат. бр. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer-а и 3,5 µl H2O помешаних по бунарићу. Стандардни qPCR циклуси су извршени, а CT вредности су мерене коришћењем Applied Biosystems Quantstudio 5 инструмента за PCR у реалном времену (модул са 384 бунарића; производ бр. A28135). Taqman прајмери ​​су купљени од Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). CT вредности свих узорака су нормализоване на контролни ген GAPDH.
Ослобађање NT-ProBNP из медијума је процењено коришћењем NT-ProBNP комплета (pig) (кат. бр. MBS2086979, MyBioSource) према протоколу произвођача. Укратко, 250 µl сваког узорка и стандарда је додато у дупликату у сваки бунар. Одмах након додавања узорка, додајте 50 µl реагенса за испитивање А у сваки бунар. Пажљиво промућкајте плочу и затворите је заптивачем. Затим су таблете инкубиране на 37°C током 1 сата. Затим аспирирајте раствор и исперите бунаре 4 пута са 350 µl 1X раствора за прање, инкубирајући раствор за испирање 1-2 минута сваки пут. Затим додајте 100 µl реагенса за испитивање Б по бунару и затворите је заптивачем плоче. Таблета је пажљиво промућкана и инкубирана на 37°C током 30 минута. Аспирирајте раствор и исперите бунаре 5 пута са 350 µl 1X раствора за прање. Додати 90 µl раствора супстрата у сваки бунарчић и затворити плочу. Инкубирати плочу на 37°C током 10-20 минута. Додати 50 µl стоп раствора у сваки бунарчић. Плоча је одмах мерена помоћу Cytation (BioTek) читача плоча подешеног на 450 nm.
Анализе снаге су спроведене како би се изабрале величине група које ће обезбедити снагу >80% за детекцију апсолутне промене параметра од 10% са стопом грешке типа I од 5%. Анализе снаге су спроведене како би се изабрале величине група које ће обезбедити снагу >80% за детекцију апсолутне промене параметра од 10% са стопом грешке типа I од 5%. Анализ мосности виполнен дла вибора размеров групп, которие обеспечить >80% мосности дла откриниа 10% абсолутно изменениа параметров с 5% частотној ошибок типа И. Анализа снаге је спроведена како би се одабрале величине група које би обезбедиле снагу >80% за детекцију апсолутне промене параметра од 10% са стопом грешке типа I од 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10%绝对变化和5％И型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10%绝对变化和5％И型错误率的组大小。 Проведена анализа мосности за вибор размера группи, коториј обеспечил би > 80% мосности дла откривениа 10% абсолутно изменениа параметров и 5% частоти ошибок типа И. Анализа снаге је спроведена како би се изабрала величина групе која би обезбедила снагу >80% за детекцију апсолутне промене параметра од 10% и стопе грешке типа I од 5%.Пресеци ткива су насумично одабрани пре експеримента. Све анализе су биле условно слепе, а узорци су декодирани тек након што су сви подаци анализирани. За све статистичке анализе коришћен је софтвер GraphPad Prism (Сан Дијего, Калифорнија). За све статистике, p-вредности су сматране значајним при вредностима <0,05. За све статистике, p-вредности су сматране значајним при вредностима <0,05. Дла всеј статистики п-значениа сматрались значајними при значениах <0,05. За све статистике, p-вредности су сматране значајним при вредностима <0,05.对于所有统计数据，п 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，п 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Дла всеј статистики п-значениа сматрались значајними при значениах <0,05. За све статистике, p-вредности су сматране значајним при вредностима <0,05.Двострани Студентов t-тест је спроведен на подацима са само 2 поређења. Једнофакторска или двофакторска ANOVA је коришћена за одређивање значајности између више група. Приликом извођења post hoc тестова, примењена је Тјукијева корекција како би се узела у обзир вишеструка поређења. RNAsec подаци имају посебна статистичка разматрања при израчунавању FDR и p.adjust као што је описано у одељку Методе.
За више информација о дизајну студије, погледајте апстракт Извештаја о истраживању природе (Nature Research Report) који је повезан са овим чланком.