Kea leboha ha u etetse Nature.com.Mofuta oa sebatli oo u o sebelisang o na le tšehetso e fokolang ea CSS.Bakeng sa boiphihlelo bo botle ka ho fetesisa, re khothaletsa hore o sebelise sebatli se ntlafalitsoeng (kapa o tima Compatibility Mode ho Internet Explorer).Khabareng, ho netefatsa ts'ehetso e tsoelang pele, re tla fana ka sebaka sa marang-rang ntle le mekhoa le JavaScript.
Ho na le tlhokahalo ea tsamaiso e ka tšeptjoang ea in vitro e ka hlahisang ka nepo tikoloho ea 'mele ea pelo bakeng sa tlhahlobo ea lithethefatsi.Ho fumaneha ho fokolang ha mekhoa ea setso sa lisele tsa pelo ea motho ho entse hore ho be le litlhaloso tse sa nepahalang tsa liphello tsa lithethefatsi tsa pelo.Mona, re thehile mohlala oa "cardiac tissue culture model" (CTCM) eo electromechanically e susumetsang lilae tsa pelo le ho otlolla 'mele nakong ea mekhahlelo ea systolic le diastolic ea potoloho ea pelo.Ka mor'a matsatsi a 12 a setso, mokhoa ona o ile oa ntlafatsa ka mokhoa o fokolang ho sebetsa ha likarolo tsa pelo, empa ha oa ka oa boloka botšepehi ba bona ba sebopeho ka botlalo.Ka hona, ka mor'a ho hlahloba molek'hule e nyenyane, re fumane hore ho eketsoa ha 100 nM triiodothyronine (T3) le 1 μM dexamethasone (Dex) ho ea bohareng ba rona ho bolokile microstructure ea likarolo bakeng sa matsatsi a 12.Ha e kopantsoe le phekolo ea T3 / Dex, tsamaiso ea CTCM e ile ea boloka litlaleho tsa transcriptal, ho sebetsa hantle, ts'ebetso ea metabolic, le botšepehi ba sebopeho boemong bo lekanang le lisele tse ncha tsa pelo bakeng sa matsatsi a 12.Ho phaella moo, ho otlolla ho feteletseng ha lisele tsa pelo moetlong ho etsa hore ho be le pontšo ea hypertrophic cardiac, ho fana ka bopaki ba bokhoni ba CTCM ho etsisa maemo a hypertrophic a bakoang ke ho otlolla pelo.Qetellong, CTCM e ka etsa mohlala oa physiology le pathophysiology ea pelo moetlong ka nako e telele, e nolofalletsang tlhahlobo e tšepahalang ea lithethefatsi.
Pele ho lipatlisiso tsa bongaka, ho hlokahala litsamaiso tse tšepahalang tsa in vitro tse ka hlahisang tikoloho ea 'mele ea pelo ea motho ka nepo.Litsamaiso tse joalo li lokela ho etsisa mokhoa o fetotsoeng oa ho otlolla, lebelo la pelo, le thepa ea electrophysiological.Hangata mehlala ea liphoofolo e sebelisoa e le sethala sa ho hlahloba physiology ea pelo e nang le botšepehi bo fokolang ho bonahatsa liphello tsa lithethefatsi pelong ea motho1,2.Qetellong, Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) ke mohlala o nang le kutloelo-bohloko haholo le o tobileng bakeng sa mehato e fapaneng ea phekolo le ea meriana, e hlahisang ka nepo physiology le pathophysiology ea pelo ea motho3.Ho ba sieo ha sistimi e joalo ho fokotsa ho sibolloa ha liphekolo tse ncha tsa ho hloleha ha pelo4,5 mme ho lebisitse ho lefu la pelo ea lithethefatsi e le lebaka le leholo la ho tsoa 'marakeng6.
Lilemong tse leshome tse fetileng, lithethefatsi tse robeli tse seng tsa pelo li tlositsoe ts'ebelisong ea bongaka hobane li baka nako ea nako ea QT e lebisang ho ventricular arrhythmias le lefu la tšohanyetso7.Ka hona, ho na le tlhokahalo e ntseng e eketseha ea mekhoa e tšepahalang ea tlhahlobo ea preclinical ho lekola katleho ea pelo le chefo.Tšebeliso ea morao-rao ea pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPS-CM) e entsoeng ke motho ka ho hlahloba lithethefatsi le tlhahlobo ea chefo e fana ka tharollo e sa fellang bothateng bona.Leha ho le joalo, tlhaho e sa tsitsang ea li-hiPS-CMs le ho hloka ho rarahana ha li-multicellular tsa lisele tsa pelo ke mefokolo e kholo ea mokhoa ona.Liphuputso tsa morao-rao li bontšitse hore moeli ona o ka hlōloa ka mokhoa o itseng ka ho sebelisa hiPS-CM ea pele ho etsa li-hydrogel tsa cardiac tissue nakoana ka mor'a ho qala ha li-contraction tse iketsahallang 'me butle-butle li eketsa matla a motlakase ha nako e ntse e feta.Leha ho le joalo, li-microtissues tsena tsa hiPS-CM ha li na matla a holileng a motlakase le a contractile a myocardium ea batho ba baholo.Ntle le moo, lisele tsa pelo ea motho li na le sebopeho se rarahaneng haholoanyane, se nang le motsoako o fapaneng oa mefuta e fapaneng ea lisele, ho kenyeletsoa lisele tsa endothelial, neurons, le stromal fibroblasts, tse hokahaneng ka lihlopha tse itseng tsa liprotheine tsa matrix tsa extracellular.Phapang ena ea batho bao e seng ba cardiomyocyte11,12,13 pelong ea mammalian e kholo ke tšitiso e kholo ea ho etsa mohlala oa lisele tsa pelo ho sebelisa mefuta ea lisele ka bomong.Mefokolo ena e meholo e totobatsa bohlokoa ba ho nts'etsapele mekhoa ea ho hlaolela lithane tsa myocardial tse tiileng tlasa maemo a 'mele le a pathological.
Likarolo tse tšesaane (300 µm) tsa pelo ea motho li ipakile e le mohlala o ts'episang oa myocardium ea motho.Mokhoa ona o fana ka phihlello ea sistimi e felletseng ea 3D multicellular e ts'oanang le lisele tsa pelo ea motho.Leha ho le joalo, ho fihlela ka 2019, ts'ebeliso ea likarolo tsa pelo ea setso e ne e lekanyelitsoe ke bophelo bo bokhutšoane ba (24 h) ba setso.Sena se bakoa ke lintlha tse 'maloa tse kenyelletsang khaello ea ho otlolla ha' mele, sebopeho sa metsi a moea, le tšebeliso ea mecha ea litaba e bonolo e sa tšehetseng litlhoko tsa lisele tsa pelo.Ka selemo sa 2019, lihlopha tse 'maloa tsa lipatlisiso li bonts'itse hore ho kenyelletsa lintlha tsa mochini lits'ebetsong tsa setso sa methapo ea pelo ho ka lelefatsa bophelo ba setso, ho ntlafatsa polelo ea pelo, le ho etsisa lefu la pelo.Lithuto tse peli tse khabane tsa 17 le 18 li bonts'a hore ho kenya mochine o sa sebetseng ho na le phello e ntle ho phenotype ea pelo nakong ea setso.Leha ho le joalo, liphuputso tsena ha lia ka tsa sebelisa matla a matla a mararo-dimensional physico-mechanical loading ea potoloho ea pelo, kaha likarolo tsa pelo li ne li laetsoe ka matla a isometric tensile 17 kapa linear auxotonic loading 18.Mekhoa ena ea ho otlolla lisele e ile ea fella ka ho hatelloa ha liphatsa tsa lefutso tse ngata tsa pelo kapa ho feteletsa ha liphatsa tsa lefutso tse amanang le likarabo tse sa tloaelehang tsa ho otlolla.Ka ho hlakileng, Pitoulis et al.19 e ile ea qapa bate e matla ea selae sa pelo bakeng sa kaho e ncha ea potoloho ea pelo e sebelisa maikutlo a transducer le li-drive tsa tsitsipano.Le hoja tsamaiso ena e lumella mokhoa o nepahetseng haholoanyane oa in vitro cardiac cycle modeling, ho rarahana le ho fokotseha ho fokolang ha mokhoa ona ho fokotsa tšebeliso ea tsamaiso ena.Laboratori ea rona e sa tsoa hlahisa mokhoa o bonolo oa setso o sebelisang matla a motlakase le mokhoa o ntlafalitsoeng oa ho boloka matla a likarolo tsa porcine le lisele tsa pelo ea motho ho fihlela matsatsi a 620,21.
Lengolong la hona joale, re hlalosa mohlala oa setso sa cardiac tissue (CTCM) ho sebelisa likarolo tsa pelo ea porcine e kenyelletsang lintlha tsa humoral ho tsosolosa physiology ea pelo ea likarolo tse tharo le phallo ea pathophysiological nakong ea potoloho ea pelo.CTCM ena e ka eketsa ho nepahala ha ponelopele ea lithethefatsi pele ho kliniki ho isa boemong boo ho seng mohla bo kileng ba finyelloa ka ho fana ka tsamaiso ea pelo e theko e boima, e bohareng ba bohareng e etsisang physiology/pathophysiology ea pelo ea mammalian bakeng sa tlhahlobo ea lithethefatsi pele ho tleliniki.
Matšoao a mechine ea Hemodynamic a phetha karolo ea bohlokoa ho boloka mosebetsi oa cardiomyocyte in vitro 22,23,24.Bukaneng e ngotsoeng ka letsoho ea hajoale, re thehile CTCM (Setšoantšo sa 1a) se ka etsisang tikoloho ea pelo ea batho ba baholo ka ho susumetsa matla a motlakase le a mochini ka maqhubu a fisioloji (1.2 Hz, 72 beats ka motsotso).E le ho qoba ho otlolla ha lisele tse feteletseng nakong ea diastole, mochine oa khatiso oa 3D o ne o sebelisetsoa ho eketsa boholo ba lisele ka 25% (setšoantšo sa 1b).Motlakase oa motlakase o bakoang ke tsamaiso ea C-PACE o ne o behiloe nako ea ho qala 100 ms pele systole e sebelisa mokhoa oa ho fumana boitsebiso ho hlahisa ka botlalo potoloho ea pelo.Sistimi ea setso sa lithane e sebelisa sesebelisoa sa pneumatic actuator (LB Engineering, Jeremane) ho holisa lesela la silicone le tenyetsehang ho baka katoloso ea lilae tsa pelo ka phaposing e kaholimo.Tsamaiso e ne e amana le mohala oa moea o ka ntle ka mochine oa khatello ea khatello, e leng se ileng sa etsa hore ho khonehe ho fetola ka nepo khatello (± 1 mmHg) le nako (± 1 ms) (setšoantšo sa 1c).
a Hokela karolo ea linama ho lesale la tšehetso la 7 mm, le bontšitsoeng ka boputsoa, ​​​​ka hare ho phaposi ea setso ea sesebelisoa.Kamore ea setso e arohane le kamore ea moea ka lesela le tšesaane la silicone le tenyetsehang.Beha gasket pakeng tsa kamore ka 'ngoe ho thibela ho lutla.Sekoahelo sa sesebelisoa se na le li-electrode tsa graphite tse fanang ka ts'usumetso ea motlakase.b Boemeli ba moralo oa sesebelisoa se seholo sa lisele, selikalikoe sa tataiso le selikalikoe sa tšehetso.Likarolo tsa linama (tse sootho) li behiloe holim'a sesebelisoa se nang le boholo bo feteletseng se nang le selikalikoe sa tataiso se behiloeng ka har'a groove moeling o ka ntle oa sesebelisoa.U sebelisa tataiso, beha ka hloko selikalikoe sa tšehetso se koahetsoeng ka sekhomaretsi sa acrylic holim'a karolo ea lisele tsa pelo.c Kerafo e bonts'ang nako ea ts'usumetso ea motlakase e le ts'ebetso ea khatello ea kamore ea moea e laoloang ke "programmable pneumatic actuator" (PPD).Ho ile ha sebelisoa sesebelisoa sa ho fumana lintlha ho hokahanya khothatso ea motlakase ho sebelisoa lisensara tsa khatello.Ha khatello ka kamoreng ea setso e fihla moeling o behiloeng, letšoao la pulse le romelloa ho C-PACE-EM ho etsa hore ho be le tšusumetso ea motlakase.d Setšoantšo sa li-CTCM tse 'nè tse behiloeng holim'a shelofo ea incubator.Lisebelisoa tse 'nè li hokahane le PPD e le' ngoe ka potoloho ea pneumatic, 'me li-sensor tsa khatello li kenngoa ka har'a valve ea hemostatic ho shebella khatello ea potoloho ea moea.Sesebediswa ka seng se na le dikarolo tse tsheletseng tsa dithishu.
Re sebelisa mochine o le mong oa pneumatic actuator, re ile ra khona ho laola lisebelisoa tsa 4 CTCM, tseo e 'ngoe le e' ngoe e neng e ka tšoara likarolo tsa lisele tsa 6 (setšoantšo sa 1d).Ka CTCM, khatello ea moea ka kamoreng ea moea e fetoloa khatello ea synchronous ka kamoreng ea mokelikeli 'me e etsa hore ho atolosoe physiological ea selae sa pelo (Figure 2a le Supplementary Movie 1).Tekanyetso ea mesifa e otlolla ho 80 mm Hg.Art.e bontšitse ho otlolla likarolo tsa lisele ka 25% (setšoantšo sa 2b).Karolo ena ea peresente e bontšitsoe hore e lumellana le bolelele ba sarcomere ea physiological ea 2.2-2.3 µm bakeng sa contractility e tloaelehileng ea karolo ea pelo17,19,25.Tsamaiso ea lithane e ile ea hlahlojoa ho sebelisoa litlhophiso tsa khamera tse tloaelehileng (Setšoantšo sa Tlatsetso 1).The amplitude le velocity ya dinama tse nyenyane tse motsamao (sa feiga. 2c, d) e ne e lumellana ho otlolla nakong ea potoloho ea pelo le nako nakong systole le diastole (sa feiga. 2b).Ho otlolla le ho potlaka ha lisele tsa pelo nakong ea ho fokotseha le ho phomola li ile tsa lula li le teng ka matsatsi a 12 setso (setšoantšo sa 2f).Ho lekola phello ea ts'usumetso ea motlakase mabapi le tumellano nakong ea setso, re ile ra theha mokhoa oa ho khetholla ho holofala ho sebetsang ho sebelisa algorithm ea shading (Supplementary Fig. 2a,b) mme re khonne ho khetholla pakeng tsa ho holofala le ntle le ts'usumetso ea motlakase.Karolo e tšoanang ea pelo (setšoantšo sa 2f).Sebakeng se ka tsamaisoang sa sehiloeng (R6-9), motlakase nakong ea ts'usumetso ea motlakase e ne e le 20% e phahameng ho feta ho ba sieo ha motlakase oa motlakase, e leng se bontšang monehelo oa ts'ebetso ea motlakase mosebetsing oa contractile.
Mesaletsa e emelang khatello ea kamore ea moea, khatello ea phaposi ea mokelikeli, le litekanyo tsa motsamao oa lisele li tiisa hore khatello ea kamore e fetola khatello ea phaposi ea mokelikeli, e bakang motsamao o lumellanang oa selae sa 'mele.b Mesaletsa ea liphesente tse otlollang (boputsoa) ea likarolo tsa lisele tse tsamaellanang le liperesente tse otlollang (lamunu).c Motsamao o lekantsoeng oa selae sa pelo o lumellana le lebelo le lekantsoeng la ho sisinyeha.(d) Litsela tse emetseng tsa motsamao oa cyclic (mola o moputsoa) le lebelo (mola o matheba oa lamunu) selaeteng sa pelo.e Tekanyetso ea nako ea potoloho (n = lilae tsa 19 ka sehlopha, ho tloha likolobe tse fapaneng), nako ea ho fokotsa (n = 19 lilae ka sehlopha), nako ea ho phomola (n = 19 lilae ka sehlopha, ho tloha likolobe tse fapaneng), ho sisinyeha ha lisele (n = 25).lilae)/sehlopha sa likolobe tse fapaneng), peak systolic velocity (n = 24(D0), 25(D12) lilae/sehlopha se tsoang likolobe tse fapaneng) le sekhahla sa ho phomola sehlohlolo (n=24(D0), 25(D12) lilae/sehlopha ho tsoa likolobe tse fapaneng).Teko ea t ea Seithuti se nang le mehatla e 'meli ha ea ka ea bontša phapang e kholo ho paramethara efe kapa efe.f Representative strain analysis mesaletsa ea likarolo tsa linama tse nang le (red) le ntle le (blue blue) stimulation ea motlakase, libaka tse leshome tsa libaka tsa likarolo tsa linama tse tsoang karolong e le 'ngoe.Liphanele tse ka tlase li bonts'a palo ea phapang ea liphesente tsa khatello ea likarolo tse nang le ts'usumetso ea motlakase le ntle le eona libakeng tse leshome ho tsoa likarolong tse fapaneng. (n = lilae tse 8 / sehlopha se tsoang likolobe tse fapaneng, Teko ea t ea Seithuti sa Mehatla e Mebeli e etsoa; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = lilae tse 8 / sehlopha se tsoang likolobe tse fapaneng, Teko ea t ea Seithuti sa Mehatla e Mebeli e etsoa; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 likarolo/sehlopha se tsoang likolobe tse fapaneng, teko ea t ea Moithuti ea mehatla e ’meli; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，來自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. （n = 8 片/组，來自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 likarolo/sehlopha, ho tsoa likolobe tse fapaneng, teko ea t ea Moithuti ea mehatla e ’meli; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Li-barbar tsa liphoso li emela moelelo oa ± kheloha e tloaelehileng.
Lenaneong la rona la pele la static biomimetic heart slice culture system [20, 21], re bolokile ts'ebetso, ts'ebetso, le ts'epo ea sebopeho sa lilae tsa pelo ka matsatsi a 6 ka ho sebelisa matla a motlakase le ho ntlafatsa sebopeho se mahareng.Leha ho le joalo, ka mor'a matsatsi a 10, lipalo tsena li ile tsa theoha haholo.Re tla bua ka likarolo tse hlahisitsoeng tsamaisong ea rona ea pele ea static biomimetic culture 20, 21 control conditions (Ctrl) 'me re tla sebelisa mokhoa oa rona o ntlafalitsoeng pele e le maemo le setso sa MC tlas'a ts'ebetso ea nako e le 'ngoe le motlakase (CTCM).bitsoa .Ntlha ea pele, re ile ra etsa qeto ea hore ho tsosoa ha mechine ntle le ho tsosoa ha motlakase ho ne ho sa lekana ho boloka ts'ebetso ea lisele bakeng sa matsatsi a 6 (Supplementary Fig. 3a,b).Hoa thahasellisa hore ka ho kenyelletsoa ha physio-mechanical le stimulation ea motlakase ho sebelisa STCM, ts'ebetso ea likarolo tsa pelo ea matsatsi a 12 e ile ea lula e tšoana le likarolong tse ncha tsa pelo tlas'a maemo a MS, empa eseng tlas'a maemo a Ctrl, joalokaha ho bontšoa ke tlhahlobo ea MTT (Setšoantšo sa 1).3a).Sena se fana ka maikutlo a hore ho tsosoa ha mechine le ho etsisa potoloho ea pelo ho ka boloka likarolo tsa lisele li sebetsa ka makhetlo a mabeli ho feta kamoo ho tlalehiloeng tsamaisong ea rona ea pele ea setso sa static.Leha ho le joalo, tlhahlobo ea boleng ba sebopeho sa likarolo tsa lisele ka immunolabeling ea cardiac troponin T le connexin 43 e bonts'itse hore polelo ea connexin 43 e ne e phahame haholo ho li-tissue tsa MC ka letsatsi la 12 ho feta taolong ka letsatsi le le leng.Leha ho le joalo, polelo ea junifomo ea connexin 43 le sebopeho sa Z-disc ha lia ka tsa hlokomeloa ka botlalo (setšoantšo sa 3b).Re sebelisa moralo oa bohlale ba maiketsetso (AI) ho lekanya bots'epehi ba sebopeho sa 'mele26, phaephe ea ho ithuta e tebileng e thehiloeng ho setšoantšo e thehiloeng ho troponin-T le connexin staining43 ho lekanya ka bohona botšepehi ba sebopeho le fluorescence ea lilae tsa pelo ho latela matla a ho aha sebaka.Mokhoa ona o sebelisa Convolutional Neural Network (CNN) le moralo o tebileng oa ho ithuta ho lekanya ka ts'epo botšepehi ba sebopeho sa lisele tsa pelo ka mokhoa o ikemetseng le o se nang leeme, joalo ka ha ho hlalositsoe bukeng.26. Li-tissue tsa MC li bontšitse ho tšoana ho ntlafetseng ha moralo ho letsatsi la 0 ha li bapisoa le likarolo tsa taolo ea static.Ho phaella moo, Masson's trichrome staining e ile ea senola karolo e tlaase haholo ea fibrosis tlas'a maemo a MS ha a bapisoa le maemo a taolo letsatsing la 12 la setso (setšoantšo sa 3c).Le hoja CTCM e ile ea eketsa ts'ebetso ea likarolo tsa lisele tsa pelo ka letsatsi la 12 ho ea boemong bo tšoanang le ba lisele tse ncha tsa pelo, ha ea ka ea ntlafatsa haholo botšepehi ba likarolo tsa pelo.
graph ea Bar e bonts'a boleng ba MTT ea lilae tse ncha tsa pelo (D0) kapa setso sa lilae tsa pelo bakeng sa matsatsi a 12 ebang ke moetlong o tsitsitseng (D12 Ctrl) kapa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) lilae / sehlopha ka tsela e le 'ngoe ho tloha ho #0 ho ea ho D0VA; 0 le **p <0.01 bapisoa le D12 Ctrl). graph ea Bar e bonts'a quantification ea MTT e sebetsang ea lilae tse ncha tsa pelo (D0) kapa setso sa lilae tsa pelo bakeng sa matsatsi a 12 ebang ke moetlong o tsitsitseng (D12 Ctrl) kapa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) lilae / sehlopha se le seng ho tloha ho # 0 ho ea ho # 0 ho bapisoa le likolobe tse fapaneng # #0 D0 le **p <0.01 bapisoa le D12 Ctrl).histogram e bonts'a quantification ea ts'ebetso ea likarolo tsa pelo tse ncha tsa MTT (D0) kapa setso sa likarolo tsa pelo bakeng sa matsatsi a 12 ka setso sa static (D12 control) kapa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control) )), 12 (D12 MC) likarolo / sehlopha se fapaneng ho tloha pitseng e le 'ngoe;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 bapisoa le D0 le **p <0.01 bapisoa le D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 新鲜心脏切片(D0) 或片片(D0) 18 (D0) 新鲜心脏切片(D0) 18 戇片(D0) 18活力的量化)，來自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <0.0001, 与D0 相比，####p <0.0001} . a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 新鲜心脏切片(D0) 中 MC 12 (D0) ，组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p.)histogram e bontšang quantification ea MTT e sebetsang likarolong tse ncha tsa pelo (D0) kapa likarolo tsa pelo tse hlahisitsoeng ka matsatsi a 12 ka setso sa static (D12 control) kapa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control)), 12 (D12 MC) likarolo / sehlopha ho tloha likolobe tse fapaneng tsa ANOVA, tlhahlobo e le 'ngoe;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 bapisoa le D0, **p <0.01 bapisoa le D12 Ctrl).b Troponin-T (e tala), connexin 43 (e khubelu) le DAPI (e putsoa) likarolong tsa pelo tse sa tsoa aroloa (D0) kapa likarolo tsa pelo tse hlahisitsoeng tlas'a maemo a tsitsitseng (Ctrl) kapa maemo a CTCM (MC) bakeng sa matsatsi a 12) litšoantšo tsa moemeli oa immunofluorescence (sekala se se nang letho = 100 µm). Mahlale a maiketsetso a quantification ea sebopeho sa 'mele oa pelo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lilae / sehlopha ka seng ho tsoa ho kolobe e fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e etsoa; ####p <0.0001 bapisoa le D0 le ****p <0.000 Ctrl1 ha e bapisoa le D010). Maiketsetso a bohlale a quantification a thipa ea pelo ea sebopeho sa botšepehi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lilae / sehlopha ka seng ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e etsoa; Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/ ся однофакторный тест ANOVA; ####p <0,0001 по сравнению с D0 и ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Tekanyetso ea sebopeho sa sebopeho sa lisele tsa pelo ka bohlale ba maiketsetso (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) likarolo / lihlopha tse tsoang likolobe tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e entsoe; ####p <0.0001 vs. le D0 le ****0p <10 10 D0 le ****0 10 D0.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lilae/sehlopha e 'ngoe le e 'ngoe ea kolobe e fapaneng, teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe;##0#0D0D0 **** 篗. 0001 ho tsoa ho D12 Ctrl 相比).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lilae/sehlopha e 'ngoe le e 'ngoe ea likolobe tse fapaneng, teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe;##0#0D0D010. 001 Tlas'a D12 Ctrl 相比). Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC/грузей) сзрка ней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Bohlale ba maiketsetso ba ho lekanya boleng ba sebopeho sa lisele tsa pelo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) likarolo/sehlopha se seng le se seng sa likolobe tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe; ####p<0.0001 vs .D0 Bakeng sa papiso. ****0p . c Litšoantšo tse emetseng (ka ho le letšehali) le palo (ka ho le letona) bakeng sa lilae tsa pelo tse silafalitsoeng ka letheba la Masson's trichrome (Scale bare = 500 µm) (n = lilae tse 10/sehlopha se seng le se seng ho tsoa ho kolobe e fapaneng, teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e etsoa; <###p <0.0001 ha e bapisoa le D00 le D010 ***p). c Litšoantšo tse emetseng (ka ho le letšehali) le palo (ka ho le letona) bakeng sa lilae tsa pelo tse silafalitsoeng ka letheba la Masson's trichrome (Scale bare = 500 µm) (n = lilae tse 10/sehlopha se seng le se seng ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e etsoa; <### p <0.0001 ha e bapisoa le D00 le D*20). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масязкем красителем Масязом50 = (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и ***p <0,0001 по с Dравнению с D0 le ***p <0,0001 по Dрав. c Litšoantšo tse emetseng (ka ho le letšehali) le palo (ka ho le letona) ea likarolo tsa pelo tse silafalitsoeng ka letheba la Masson's trichrome (sekala se sa koaeloang = 500 µm) (n = likarolo tse 10/sehlopha sa likolobe tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e entsoe; #### p <0 .0001 ha e bapisoa le D0 le D0 . c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 100 µm） 500 µm） 500组，每组來自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比。 C 用 mason 三 色 染料的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度度 裸尺度 裸尺庰 裸尺庰 裸尺庰 裸尺庰 裸尺庰 裸尺尺庰 裸尺尺庰 裸尺尺庰 裸尺尺庰 左 左 0 µm） （n = 10 个 切片 组 每 來自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p <0.00001 Tobetsa konopo ea D12 Ctrl. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массон 1 =0 = срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа Ctrl). c Litšoantšo tse emelang (ka ho le letšehali) le palo (ka ho le letona) tsa likarolo tsa pelo tse silafalitsoeng ka letheba la Masson's trichrome (lepahla = 500 µm) (n = likarolo tse 10/sehlopha, se seng le se seng se tsoa ho kolobe e fapaneng, e lekoa ka tlhahlobo ea tsela e le 'ngoe ea phapang ;### # p <0.0001 <0.0001 ha e bapisoa le D010 ***p).Li-barbar tsa liphoso li emela moelelo oa ± kheloha e tloaelehileng.
Re ile ra nahana hore ka ho eketsa limolek'hule tse nyenyane ho setso sa setso, botšepehi ba cardiomyocyte bo ka ntlafatsoa 'me nts'etsopele ea fibrosis e fokotsehile nakong ea setso sa CTCM.Ka hona re ile ra hlahloba limolek'hule tse nyenyane ho sebelisa meetlo ea rona ea ho laola static20,21 ka lebaka la palo e nyenyane ea lintho tse ferekanyang.Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), le SB431542 (SB) li khethiloe skrineng sena.Limolek'hule tsena tse nyane li kile tsa sebelisoa litsong tsa hiPSC-CM ho khothaletsa kholo ea cardiomyocyte ka ho eketsa bolelele ba sarcomere, T-tubules, le lebelo la conduction.Ho phaella moo, ka bobeli Dex (glucocorticoid) le SB li tsejoa ho hatella ho ruruha29,30.Ka hona, re ile ra leka hore na ho kenyelletsa e le 'ngoe kapa motsoako oa limolek'hule tsena tse nyenyane ho tla ntlafatsa botšepehi ba likarolo tsa pelo.Bakeng sa tlhahlobo ea pele, tekanyo ea motsoako o mong le o mong o khethiloe ho latela likhakanyo tse atisang ho sebelisoa mefuteng ea setso sa lisele (1 μM Dex27, 100 nM T327, le 2.5 μM SB31).Ka mor'a matsatsi a 12 a setso, motsoako oa T3 le Dex o ile oa fella ka botšepehi bo botle ba sebopeho sa cardiomyocyte le ho lokisoa ho fokolang ha fibrous (Figures ea Tlatsetso 4 le 5).Ho phaella moo, tšebeliso ea makhetlo ana a mabeli kapa a mabeli a T3 le Dex e hlahisitse liphello tse senyang ha li bapisoa le maemo a tloaelehileng (Supplementary Fig. 6a,b).
Ka mor'a ho hlahloba ka lekhetlo la pele, re ile ra etsa papiso ea hlooho-hlooho ea maemo a setso sa 4 (Setšoantšo sa 4a): Ctrl: likarolo tsa pelo tse hlahisitsoeng moetlong oa rona o hlalositsoeng pele o sebelisa mokhoa oa rona o ntlafalitsoeng;20.21 TD: T3 le Ctrl s Added Dex ka Laboraro;MC: likarolo tsa pelo tse hlahisitsoeng ka har'a CTCM re sebelisa mokhoa oa rona o ntlafalitsoeng oa pele;le MT: CTCM e nang le T3 le Dex e kenyellelitsoeng bohareng.Ka mor'a matsatsi a 12 a ho lema, ts'ebetso ea li-tissue tsa MS le MT e ile ea lula e tšoana le ea lisele tse ncha tse hlahlojoang ke MTT assay (Fig. 4b).Hoa thahasellisa hore ho eketsoa ha T3 le Dex ho litloaelo tsa transwell (TD) ha lia ka tsa etsa hore ho be le ntlafatso e kholo ea ts'ebetso ha e bapisoa le maemo a Ctrl, e leng se bontšang karolo ea bohlokoa ea ts'ebetso ea mechine ho boloka matla a likarolo tsa pelo.
sets'oants'o sa moralo oa liteko se bonts'ang maemo a mane a setso a sebelisetsoang ho lekola litlamorao tsa ts'usumetso ea mochini le tlatsetso ea T3 / Dex ka nako e mahareng bakeng sa matsatsi a 12. b graph ea bar e bonts'a quantification ea ts'ebetso ea matsatsi a 12 kamora setso maemong ohle a setso sa 4 (Ctrl, TD, MC, le MT) ha e bapisoa le lilae tse ncha tsa pelo (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD le D12 MT), 12 (D12 MC) lilae / sehlopha se le seng ho tloha 00; ###p <0.001 ha e bapisoa le D0 le **p <0.01 ha e bapisoa le D12 Ctrl). b graph ea bar e bonts'a quantification ea ts'ebetso ea matsatsi a 12 kamora setso maemong ohle a setso sa 4 (Ctrl, TD, MC, le MT) ha e bapisoa le lilae tse ncha tsa pelo (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD le D12 MT), 12 (D12 MC) lilae / sehlopha se le seng ho tloha 00; ###p <0.001 ha e bapisoa le D0 le **p <0.01 ha e bapisoa le D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования во всех 4 ю со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней #0тей свиней #0сто#дисто#дисто#дисто#дисто#дисто#дисто#дисто#дися ,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Graph ea bar e bonts'a palo ea ts'ebetso ea matsatsi a 12 kamora setso maemong ohle a setso sa 4 (taolo, TD, MC, le MT) ha e bapisoa le likarolo tsa pelo tse ncha (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, le D12 MT), 12 (D12 MC) ho tloha #00p e le 'ngoe ho tsoa ho #0p; 1, ###p <0.001 vs. D0 le **p <0.01 ka ho bapisoa le D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)),15 (D12 Ctrl MT1,D12 自和2 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p <0.0001,###p <0.001 与D0 相比，**p <0.01 与D12）制。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D12), TD0) (n = 18 (D1) разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по песни 2). b Histogram e bontšang maemo ohle a setso a 4 (taolo, TD, MC le MT) ha e bapisoa le likarolo tsa pelo tse ncha (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD le D12 MT), ho tloha likolobe tse fapaneng 12 (D12 MC) likarolo / sehlopha, teko ea ANOVA e le 'ngoe; ##0#0 vs 0. 0.01 khahlanong le taolo ea D12). c Bar graph e bonts'a quantification ea glucose flux matsatsi a 12 kamora setso maemong ohle a setso sa 4 (Ctrl, TD, MC, le MT) ha e bapisoa le lilae tse ncha tsa pelo (D0) (n = lilae tse 6 / sehlopha ho tsoa likolobe tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e etsoa; ###p <0.001, ha e bapisoa le D0 le ***p Ctrl0 ha e bapisoa le D0. c Bar graph e bonts'a quantification ea glucose flux matsatsi a 12 kamora setso maemong ohle a setso sa 4 (Ctrl, TD, MC, le MT) ha e bapisoa le lilae tse ncha tsa pelo (D0) (n = lilae tse 6 / sehlopha ho tsoa likolobe tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e etsoa; ###p <0.001, ha e bapisoa le D0 le ***p Ctrl0 ha e bapisoa le D0. c ▲гистограмат поличесоле Количесо восл Ви Ования (фотония (фотония (фотротания Ся Тест anova; 0,001 По лв P, - 0,001 П с c Histogram e bonts'a quantification ea glucose flux matsatsi a 12 ka mor'a setso tlas'a maemo ohle a setso sa 4 (taolo, TD, MC le MT) ha e bapisoa le likarolo tsa pelo tse ncha (D0) (n = 6 likarolo / sehlopha se tsoang likolobe tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e entsoeng; ###p <0.001 bapisoa le D0 le ***p <0.00 Ctrl <0.00). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养养宇后12 培养6 片/组，來自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p <0.001，与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （ctrl 、 td 、 mc 、 mc 和 mt)的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 來自 猪 , , , , , , , 猪 猪单行向执ANOVA 测试；###p <0.0001 . Tobetsa konopo ea D12 Ctrl. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования ю со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p <0,000 p. 12 (контроль). c Histogram e bontšang quantification ea glucose flux matsatsing a 12 ka mor'a setso bakeng sa maemo ohle a setso sa 4 (taolo, TD, MC, le MT) ha e bapisoa le likarolo tse ncha tsa pelo (D0) (n = 6 likarolo / sehlopha, ho tloha likolobe tse fapaneng, unilateral Na liteko tsa ANOVA li ne li etsoa, ​​###p <0.001 bapisoa le D01. ***1 ho bapisoa le D01.d Lits'ebetso tsa tlhahlobo ea khatello ea li-tishu tse ncha (tse putsoa), letsatsi la 12 MC (tala), le letsatsi la 12 MT (khubelu) lintlheng tse leshome tsa likarolo tsa likaroloana (n = 4 lilae/sehlopha, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe; ho ne ho se na phapang e kholo lipakeng tsa lihlopha).Morero oa Volcano o bonts'a liphatsa tsa lefutso tse hlalositsoeng ka mokhoa o fapaneng likarolong tsa pelo tse ncha (D0) ha li bapisoa le likarolo tsa pelo tse hlahisitsoeng tlas'a maemo a tsitsitseng (Ctrl) kapa tlas'a maemo a MT (MT) bakeng sa matsatsi a 10-12.f 'Mapa oa mocheso oa liphatsa tsa lefutso tsa sarcomere bakeng sa likarolo tsa pelo tse hlahisitsoeng tlas'a maemo a setso.Li-barbar tsa liphoso li emela moelelo oa ± kheloha e tloaelehileng.
Ho itšetleha ka metabolism ho tloha ho oxidation ea mafura a mafura ho ea ho glycolysis ke letšoao le khethollang cardiomyocyte dedifferentiation.Li-cardiomyocyte tse sa hōlang li sebelisa glucose haholo-holo bakeng sa tlhahiso ea ATP 'me li na le mitochondria ea hypoplastic e nang le li-cristae5,32 tse seng kae.Litlhahlobo tsa tšebeliso ea glucose li bonts'itse hore tlasa maemo a MC le MT, ts'ebeliso ea tsoekere e ts'oana le ea li-tissue tsa 0 tsa letsatsi (Setšoantšo sa 4c).Leha ho le joalo, lisampole tsa Ctrl li bontšitse keketseho e kholo ea tšebeliso ea tsoekere ha e bapisoa le lisele tse ncha.Sena se bontša hore motsoako oa CTCM le T3 / Dex o matlafatsa ts'ebetso ea lisele le ho boloka phenotype ea metabolic ea likarolo tsa pelo tsa matsatsi a 12.Ho phaella moo, tlhahlobo ea khatello e bontšitse hore maemo a khatello a ne a lula a tšoana le lisele tse ncha tsa pelo bakeng sa matsatsi a 12 tlas'a maemo a MT le MS (Fig. 4d).
Ho sekaseka tšusumetso e akaretsang ea CTCM le T3/Dex tikolohong ea lefats'e ea transcriptal ea selae sa pelo, re entse RNAseq ka lilae tsa pelo ho tsoa maemong ohle a mane a fapaneng a setso (Supplementary Data 1).Hoa thahasellisa hore likarolo tsa MT li bonts'itse ho tšoana ho phahameng ho ngotsoeng le lisele tse ncha tsa pelo, tse nang le 16 feela e hlalositsoeng ka mokhoa o fapaneng ho tsoa ho liphatsa tsa lefutso tsa 13,642.Leha ho le joalo, joalokaha re bontšitse pejana, lilae tsa Ctrl li bonts'a 1229 liphatsa tsa lefutso tse fapaneng ka mor'a matsatsi a 10-12 setso (setšoantšo sa 4e).Lintlha tsena li tiisitsoe ke qRT-PCR ea liphatsa tsa lefutso tsa pelo le fibroblast (Supplementary Fig. 7a-c).Hoa thahasellisa hore likarolo tsa Ctrl li bontšitse ho fokotseha ha liphatsa tsa lefutso tsa pelo le lisele le ho kenya tšebetsong mananeo a liphatsa tsa lefutso.Lintlha tsena li fana ka maikutlo a hore ho arohana, ho tloaelehileng ho etsahala ka mor'a nako e telele ea ho hlaolela nako e telele, e fokotsehile ka ho feletseng tlas'a maemo a MT (Supplementary Fig. 8a,b).Ho ithuta ka hloko ka liphatsa tsa lefutso tsa sarcomere ho bontšitse hore feela tlas'a maemo a MT ke liphatsa tsa lefutso tse kenyang sarcomere (setšoantšo sa 4f) le mocha oa ion (Supplementary Fig. 9) o bolokiloe, o ba sireletsa ho tloha khatellong tlas'a maemo a Ctrl, TD, le MC.Lintlha tsena li bonts'a hore ka motsoako oa ts'usumetso ea mochini le ea humoral (T3 / Dex), selae sa pelo se ka lula se tšoana le lilae tse ncha tsa pelo kamora matsatsi a 12 moetlong.
Liphuputso tsena tsa transcriptional li tšehetsoa ke taba ea hore botšepehi ba sebopeho sa cardiomyocyte likarolong tsa pelo bo bolokiloe ka ho fetisisa tlas'a maemo a MT bakeng sa matsatsi a 12, joalokaha ho bontšoa ke connexin e tsitsitseng le ea sebakeng sa heno 43 (Setšoantšo sa 5a).Ho phaella moo, fibrosis likarolong tsa pelo tlas'a maemo a MT e fokotsehile haholo ha e bapisoa le Ctrl le e tšoanang le likarolo tse ncha tsa pelo (setšoantšo sa 5b).Lintlha tsena li bonts'a hore motsoako oa ts'usumetso ea mochini le kalafo ea T3 / Dex e boloka hantle sebopeho sa pelo likarolong tsa pelo moetlong.
a Representative immunofluorescence litšoantšo tsa troponin-T (e tala), connexin 43 (khubelu), le DAPI (putsoa) likarolong tse sa tsoa aroloa tsa pelo (D0) kapa tse hlahisitsoeng ka matsatsi a 12 maemong ohle a setso a likarolo tse 'nè tsa pelo (scale bar = 100 µm).). Artificial intelligence quantification of the heart tissue of structural integrity (n = 7 (D0 le D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC le D12 MT) lilae/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e etsoa; <###p <0.0001 ha e bapisoa le D0p **** 1 kapa D0 **** 1                                                                                                                ]]]] ambacho] fumana teko  ea ANOVA Ctrl). Artificial intelligence quantification of the heart tissue of structural integrity (n = 7 (D0 le D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC le D12 MT) lilae/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e etsoa; <### p <0.0001 ha e bapisoa le D0p **** 1 kapa D0 **** 5. Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC/ D12 MC/ D12 MC/ D12 MT) le ых свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Khothatso ea ho tšepahala ha maikutlo a pelo ea pelo e sebelisang bohlale ba maiketsetso (n = 7 (D0 le D12 CT, D12 cert对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组会切片/组行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 和*p <0.05 相比，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl)化 进行 单向 单向 单向 测试; ############ p <0.0001 与D0 和*p <0.05 相比，或****p <0.0001 .Tekanyetso ea botšepehi ba sebopeho sa lisele tsa pelo tse sebelisang bohlale ba maiketsetso likolobeng tse fapaneng (n = 7 (D0 le D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC le D12 MT) likarolo / sehlopha) ka teko ea tsela e le 'ngoe ea ANOVA;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 bapisoa le D0 le *p <0.05 kapa ****p <0.0001 bapisoa le D12 Ctrl). b litšoantšo tse emetseng le palo ea lilae tsa pelo tse silafalitsoeng ka letheba la Masson's trichrome (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, and D12 MC), 9 (D12 MT) lilae/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, ho etsoa tlhahlobo ea tsela e le 'ngoe #0#0 ho ea ho D0. 0.001, kapa ****p <0.0001 ha e bapisoa le D12 Ctrl). b litšoantšo tse emetseng le palo ea lilae tsa pelo tse silafalitsoeng ka letheba la Masson's trichrome (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, and D12 MC), 9 (D12 MT) lilae/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, ho etsoa tlhahlobo ea tsela e le 'ngoe #0#0 ho ea ho D0. 0.001, kapa ****p <0.0001 ha e bapisoa le D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная 10D млине) = 10D = D10 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001                1 bakeng sa ho kopanya le D12 Ctrl). b Lits'oants'o tse emetseng le palo ea likarolo tsa pelo tse silafalitsoeng ka letheba la Masson's trichrome (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD and D12 MC), 9 (D12 MT) likarolo/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, se sebelitse ka tsela e le 'ngoe.#001 le ANOVA. 1 kapa ****p <0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D2D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（2）同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p <0.0001 与D0 相比，***p <0.00D爱比，***p <0.00D爱1成1001比）. b 用 masson 三 色 染料 的心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例尺 尺 尺 = 500 µm） （ d 1 d 2, d 1 d 2, d 1 d 1 = d 1 d 1 d 1 d 1和 d12 mc） 來自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片片 片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p <0.0001 与D0 相毛 10 <0.0001 与D0 相毁，*0D0 相毁， *0D0 <0. 2 Ctrl Setšoantšo). b реппезенезенезенезентативнтивнтия (N = 10 (D0, D12 CTRL, D12 TD и D12 MC12 MT) резо 0,0001 или **** по п О равнини с D D12 CTRL). b Litšoantšo tse emelang le palo ea likarolo tsa pelo tse silafalitsoeng ke Masson's trichrome (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD le D12 MC), 9 (D12 MT) likarolo ho tsoa likolobe/sehlopheng se fapaneng, mokhoa o le mong oa ANOVA; #0. #0 kapa D****0 ** 1                                                                             D]                 D ANOVA -       mokhoa oa  0 p <0.0001 bapisoa le D12 Ctrl).Li-barbar tsa liphoso li emela moelelo oa ± kheloha e tloaelehileng.
Qetellong, bokhoni ba CTCM ba ho etsisa hypertrophy ea pelo bo ile ba hlahlojoa ka ho eketseha ha lisele tsa pelo.Ho CTCM, khatello e phahameng ea kamore ea moea e eketsehile ho tloha ho 80 mmHg ho ea ho 80 mmHg.Art.(ho otlolla ho tloaelehileng) ho fihlela ho 140 mmHg Art.(Setšoantšo sa 6a).Sena se lumellana le keketseho ea 32% ea ho otlolla (setšoantšo sa 6b), se neng se bontšitsoe pele e le palo e lekanang ea peresente e hlokahalang bakeng sa likarolo tsa pelo ho finyella bolelele ba sarcomere bo tšoanang le bo bonoang ka hypertrophy.Ho otlolla le ho potlaka ha lisele tsa pelo nakong ea ho fokotseha le ho phomola li ile tsa lula li le teng matsatsing a tšeletseng a setso (setšoantšo sa 6c).Lisele tsa pelo tse tsoang maemong a MT li ne li le tlas'a maemo a tloaelehileng a ho otlolla (MT (Tloaelo)) kapa maemo a feteletseng (MT (OS)) ka matsatsi a tšeletseng.E se e ntse e le ka mor'a matsatsi a mane ka setso, hypertrophic biomarker NT-ProBNP e ne e phahame haholo ka har'a maemo a tlas'a maemo a MT (OS) ha a bapisoa le maemo a MT (a tloaelehileng) (Setšoantšo sa 7a).Ho phaella moo, ka mor'a matsatsi a tšeletseng a ho hlaolela, boholo ba sele ho MT (OS) (setšoantšo sa 7b) se ile sa eketseha haholo ha se bapisoa le likarolo tsa MT pelo (e tloaelehileng).Ho phaella moo, phetisetso ea nyutlelie ea NFATC4 e ile ea eketseha haholo ka lisele tse otlolohileng (Setšoantšo sa 7c).Liphetho tsena li bonts'a tsoelo-pele e tsoelang pele ea ntlafatso ea pathological ka mor'a hyperdistension le ho tšehetsa khopolo ea hore sesebelisoa sa CTCM se ka sebelisoa e le sethala sa ho ithuta pontšo ea hypertrophy ea pelo e otlolohileng.
Mesaletsa e emelang khatello ea kamore ea moea, khatello ea phaposi ea mokelikeli, le litekanyo tsa motsamao oa lisele li tiisa hore khatello ea kamore e fetola khatello ea phaposi ea mokelikeli, e bakang motsamao o lumellanang oa selae sa 'mele.b Liphesente tse emelang tse otlollang le li-curve tsa sekhahla bakeng sa likarolo tse tloaelehileng tse otlolohileng (lamunu) le tse otlolohileng (tse putsoa).c Kerafo ea bar e bontšang nako ea potoloho (n = 19 lilae ka sehlopha, ho tloha likolobe tse fapaneng), nako ea contraction (n = 18-19 lilae ka sehlopha, ho tloha likolobe tse fapaneng), nako ea ho phomola (n = 19 lilae ka sehlopha, ho tloha likolobe tse fapaneng)), amplitude ea motsamao oa linama (n = 14 lilae / sehlopha, ho tloha likolobe tse fapaneng), tlhōrō ea lilae tsa systolic = 1, tlhōrō ea systolic le sehlopha sa 1. n = 14 (D0), 15 (D6) ) likarolo / lihlopha) ho tloha likolobe tse fapaneng), tlhahlobo ea t ea Moithuti ea nang le mehatla e 'meli ha ea ka ea bontša phapang e khōlō ho parameter leha e le efe, e bontšang hore litekanyetso tsena li ile tsa lula li le teng nakong ea matsatsi a 6 a setso le ho feta.Li-barbar tsa liphoso li emela moelelo oa ± kheloha e tloaelehileng.
a Bar graph quantification ea NT-ProBNP concentration mecheng ea litaba tsa setso ho tloha ho lilae tsa pelo tse hlahisitsoeng tlas'a MT normal stretch (Norm) kapa overstretching (OS) maemo (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, le D4 MTOS) lilae / sehlopha ho tloha likolobe tse fapaneng, ANOVA ea litsela tse peli ho ea ho e tloaelehileng e bapisoa le ANOVA e tloaelehileng. a Bar graph quantification ea NT-ProBNP concentration mecheng ea litaba tsa setso ho tloha ho lilae tsa pelo tse hlahisitsoeng tlas'a MT normal stretch (Norm) kapa overstretching (OS) maemo (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, le D4 MTOS) lilae / sehlopha ho tloha likolobe tse fapaneng, ANOVA ea litsela tse peli ho ea ho e tloaelehileng e etsoa.Palo histogram ea NT-ProBNP concentration ka setso medium ho tloha lilae tsa pelo tse hlahisitsoeng tlas'a maemo a tloaelehileng a MT stretch (normal) kapa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, le D4) .MTOS) lilae / sehlopha ho tloha likolobe tse fapaneng, tlhahlobo ea lintlha tse peli tsa phapang e etsoa;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 ha e bapisoa le mokhoa o tloaelehileng oa ho otlolla). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓麦的条彈3, 浓度的条彈3 （D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）來自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比；**与正常拉伸相比，p. Quantification ea NT-ProBNP mahloriso ka lilae tsa pelo tse hlahisitsoeng tlas'a maemo a tloaelehileng a MT (Norm) kapa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm andD4 MTOS) ho tloha ho fapaneng 猪的切片 / 组，可以双向 双双， p <0.01).histogram Quantification ea NT-ProBNP concentrations ka lilae tsa pelo tse hlahisitsoeng tlas'a maemo a tloaelehileng a MT otlolla (tloaelehileng) kapa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) le D4 MTOS) lilae / sehlopha ho tloha likolobe tse fapaneng, tlhahlobo ea litsela tse peli tsa ho fapana;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 ha e bapisoa le mokhoa o tloaelehileng oa ho otlolla). b litšoantšo tse emetseng bakeng sa lilae tsa pelo tse silafalitsoeng ka troponin-T le WGA (ka ho le letšehali) le selefouno ea boholo ba sele (ka ho le letona) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) lisele / sehlopha ho tloha ho lilae tse fapaneng tsa 10 ho tloha likolobe tse fapaneng, Tlhahlobo ea t-teko ea Seithuti se nang le mehatla e 'meli e etsoa. b litšoantšo tse emetseng bakeng sa lilae tsa pelo tse silafalitsoeng ka troponin-T le WGA (ka ho le letšehali) le tekanyo ea boholo ba sele (ka ho le letona) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) lisele / sehlopha ho tloha ho lilae tse fapaneng tsa 10 tse tsoang likolobe tse fapaneng, Teko ea t-test ea Seithuti sa Mehatla e 'meli e etsoa. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (6), 6D размера клеток (6) = 6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p <0,00001 проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; b Litšoantšo tse emelang likarolo tsa pelo tse silafalitsoeng ka troponin-T le AZP (ka ho le letšehali) le tekanyo ea boholo ba sele (ka ho le letona) (n = 330 (D6 MTOS), lisele / sehlopha sa 369 (D6 MTNorm) ho tloha likarolong tse fapaneng tsa 10 tse tsoang likolobe tse fapaneng, tlhahlobo ea t-tailed ea Seithuti se nang le mehatla e 'meli e ile ea etsoa 0 ha e bapisoa le 0.****p 0. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图自像化)个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p <1）0. b litšoantšo tse emelang lilae tsa pelo tse silafalitsoeng ka calcarein-T le WGA (ka ho le letšehali) le boholo ba sele (ka ho le letona) (n = 330 (D6 MTOS), 369 ho tloha ho lilae tse fapaneng tsa 10 (D6 MTNorm)) Lisele / 组，两方法有尾学 生0 otlolla 1. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (сD6 MT3) rm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с номнимые номнимы). b Litšoantšo tse emelang likarolo tsa pelo tse silafalitsoeng ka troponin-T le AZP (ka ho le letšehali) le quantification ea boholo ba sele (ka ho le letona) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ho tloha likarolong tse fapaneng tsa 10 tse tsoang likolobe tse fapaneng) Lisele / sehlopha, criterion ea mehatla e 'meli;****p <0.0001 ha e bapisoa le khatello e tloaelehileng). c Moemeli oa litšoantšo bakeng sa letsatsi la 0 le letsatsi la 6 MTOS lilae tsa pelo tse immunolabeled bakeng sa troponin-T le NFATC4 le quantification ea translocation ea NFATC4 ho nuclei ea CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lilae / sehlopha ho tloha likolobe tse fapaneng, tse peli-mohatla ke Seithuti 0. c Moemeli oa litšoantšo bakeng sa letsatsi la 0 le letsatsi la 6 MTOS lilae tsa pelo tse immunolabeled bakeng sa troponin-T le NFATC4 le quantification ea ho fetisetsoa ha NFATC4 ho nuclei ea CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lilae / sehlopha ho tloha likolobe tse fapaneng , Ho etsoa tlhahlobo e 'meli ea 0 . c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, ммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и коликаственная оценска зных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента, *5 <p. c Litšoantšo tse emelang likarolo tsa pelo ho 0 le matsatsi a 6 MTOS, immunolabeled bakeng sa troponin-T le NFATC4, le quantification ea NFATC4 translocation khubung ea lisele tse cavernous (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lilae / sehlopha ho tloha likolobe tse fapaneng) ho etsoa liithuti tse nang le mehatla e 'meli;*p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及來自第TC-CM4的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c Lits'oants'o tse emelang calcanin-T le NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS lilae tsa pelo, le NFATC4 ho tsoa ho NFATC4 e fapaneng 易位至CM cell nucleus的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS), 3 (D6 MTOS) / 切 切 切切生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценспенка зных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p <0,05). c Litšoantšo tse emetseng tsa lilae tsa pelo tsa MTOS ka letsatsi la 0 le 6 bakeng sa troponin-T le NFATC4 immunolabeling le quantification ea NFATC4 translocation khubung ea CM ho tloha likolobe tse fapaneng (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lilae / sehlopha, tse peli-tailed t -criterion <0p.Melallo ea liphoso e emela moelelo ± kheloha e tloaelehileng.
Phetolelo ea lipatlisiso tsa pelo le methapo e hloka mefuta ea cellular e hlahisang tikoloho ea pelo ka nepo.Thutong ena, ho ile ha etsoa sesebelisoa sa CTCM 'me sa khetholloa se ka susumetsang likarolo tse ngata tsa pelo.Sistimi ea CTCM e kenyelletsa stimulation ea physiologically synchronized electromechanical stimulation le T3 le Dex fluid e matlafatsang.Ha likarolo tsa pelo ea nama ea kolobe li ne li pepesehetse lintlha tsena, ts'ebetso ea tsona, ts'ebetso ea sebopeho, ts'ebetso ea metabolic, le polelo ea transcriptal e ile ea lula e ts'oana le liseleng tse ncha tsa pelo kamora matsatsi a 12 a setso.Ho feta moo, ho otlolla ho feteletseng ha lisele tsa pelo ho ka baka hypertrophy ea pelo e bakoang ke hyperextension.Ka kakaretso, liphetho tsena li tšehetsa karolo ea bohlokoa ea maemo a setso sa fisioloji ho boloka phenotype e tloaelehileng ea pelo le ho fana ka sethala sa tlhahlobo ea lithethefatsi.
Lintlha tse ngata li kenya letsoho ho theheng tikoloho e nepahetseng bakeng sa ho sebetsa le ho phela ha cardiomyocyte.Lintho tse totobetseng ka ho fetisisa tsa lintlha tsena li amana le (1) ho sebelisana ha li-intercellular, (2) ho tsosoa ha motlakase, (3) mabaka a monate, le (4) metsoako ea metsoako.Tšebelisano ea fisioloji ea lisele le lisele e hloka marang-rang a rarahaneng a mahlakore a mararo a mefuta e mengata ea lisele tse tšehetsoeng ke matrix a extracellular.Litšebelisano tse joalo tse rarahaneng tsa lisele ho thata ho tsosolosa in vitro ka mekhoa e kopanetsoeng ea mefuta ea lisele ka bomong, empa e ka finyelloa habonolo ka ho sebelisa sebopeho sa organotypic sa likarolo tsa pelo.
Ho otlolla mechine le ho susumetsa motlakase oa li-cardiomyocyte ke tsa bohlokoa bakeng sa ho boloka phenotype ea pelo33,34,35.Le ha ts'usumetso ea mochini e ntse e sebelisoa haholo bakeng sa boemo ba hiPSC-CM le kholo, liphuputso tse 'maloa tse ntle li sa tsoa leka ho susumetsa lilae tsa pelo moetlong li sebelisa uniaxial loading.Lithuto tsena li bonts'a hore 2D uniaxial mechanical loading e na le phello e ntle ho phenotype ea pelo nakong ea setso.Lithutong tsena, likarolo tsa pelo li ne li laetsoe ka matla a isometric tensile17, linear auxotonic loading18, kapa potoloho ea pelo e ile ea tsosolosoa ho sebelisoa maikutlo a transducer le khatello ea khatello.Leha ho le joalo, mekhoa ena e sebelisa uniaxial tissue stretch ntle le ho ntlafatsa tikoloho, e leng se bakang ho hatelloa ha liphatsa tsa lefutso tse ngata tsa pelo kapa ho feteletsa ha liphatsa tsa lefutso tse amanang le likarabo tse sa tloaelehang tsa ho otlolla.CTCM e hlalositsoeng mona e fana ka 3D electromechanical stimulus e etsisang potoloho ea tlhaho ea pelo ho latela nako ea potoloho le ho otlolla 'mele (25% otlolla, 40% systole, 60% diastole, le 72 beats ka motsotso).Le hoja ts'usumetso ena ea mekhoa e meraro e le 'ngoe e sa lekana ho boloka botšepehi ba lisele, ho kopanngoa ha metlae le ts'ebetso ea mechine e sebelisang T3 / Dex hoa hlokahala ho boloka ts'ebetso ea lisele, ts'ebetso le botšepehi ka ho lekaneng.
Lintlha tsa bosoasoi li phetha karolo ea bohlokoa ho fetoleng phenotype ea pelo ea batho ba baholo.Sena se ile sa totobatsoa lithutong tsa HiPS-CM tseo ho tsona T3 le Dex li kentsoeng mecheng ea litaba tsa setso ho potlakisa kholo ea lisele.T3 e ka susumetsa ho tsamaisoa ha li-amino acid, tsoekere le calcium ho pholletsa le lisele36.Ho phaella moo, T3 e khothalletsa MHC-α polelo le MHC-β ho fokotseha, ho khothalletsa ho thehoa ha li-myofibrils tse potlakileng ho li-cardiomyocyte tse hōlileng ha li bapisoa le li-slow twitch myofibrils ho fetal CM.Ho haella ha T3 ho bakuli ba hypothyroid ho fella ka ho lahleheloa ke lihlopha tsa myofibrillar le tekanyo e fokotsehileng ea ntlafatso ea molumo37.Dex e sebetsa ho li-receptor tsa glucocorticoid mme e bonts'itsoe hore e eketsa contractility ea myocardial lipelong tse ka thoko tse nkhang hamonate;38 ntlafatso ena ho nahanoa hore e amana le phello ea ho kena ka calcium deposit-driven entry (SOCE) 39,40.Ho feta moo, Dex e tlamella li-receptor tsa eona, e baka karabelo e pharaletseng ea intracellular e hatellang ts'ebetso ea 'mele ea ho itšireletsa mafung le ho ruruha30.
Liphetho tsa rona li bonts'a hore stimulation mechanical stimulation (MS) e ntlafalitse ts'ebetso ea setso ka kakaretso ha e bapisoa le Ctrl, empa e ile ea hloleha ho boloka ts'ebetso, bots'epehi ba sebopeho, le polelo ea pelo ho feta matsatsi a 12 moetlong.Ha ho bapisoa le Ctrl, ho eketsoa ha litloaelo tsa T3 le Dex ho CTCM (MT) ho ntlafalitse ts'ebetso le ho boloka litlaleho tse tšoanang tsa mongolo, botšepehi ba sebopeho, le ts'ebetso ea metabolic ka lisele tse ncha tsa pelo bakeng sa matsatsi a 12.Ho phaella moo, ka ho laola tekanyo ea lisele tse otlolohileng, mohlala oa hyperextension-induced cardiac hypertrophy o ile oa bōptjoa ho sebelisoa STCM, e bontšang ho feto-fetoha ha mokhoa oa STCM.Hoa lokela ho hlokomeloa hore le hoja ho lokisoa ha pelo le fibrosis hangata ho kenyelletsa litho tse tsitsitseng tseo lisele tsa tsona tse potolohang li ka fanang ka li-cytokine tse loketseng hammoho le phagocytosis le lintlha tse ling tse nchafatsang, likarolo tsa pelo li ntse li ka etsisa mokhoa oa fibrotic ho arabela khatello ea kelello le khatello ea maikutlo.ka myofibroblasts.Sena se 'nile sa hlahlojoa pele moetsong ona oa selae sa pelo.Hoa lokela ho hlokomeloa hore li-parameter tsa CTCM li ka fetoloa ka ho fetola khatello / amplitude ea motlakase le makhetlo a mangata ho etsisa maemo a mangata a kang tachycardia, bradycardia, le ts'ehetso ea ho potoloha ha mechine (pelo e sa laoleheng ea mechine).Sena se etsa hore tsamaiso e be ea mahareng bakeng sa tlhahlobo ea lithethefatsi.Bokhoni ba CTCM ba ho etsa mohlala oa hypertrophy ea pelo e bakoang ke ho sebetsa ka matla ho feta tekano bo bula tsela ea ho lekola sistimi ena bakeng sa kalafo ea motho ka mong.Qetellong, phuputso ea hona joale e bonts'a hore ho otlolla ha mochini le ho hlohlelletsa li-humoral ho bohlokoa bakeng sa ho boloka moetlo oa likarolo tsa lisele tsa pelo.
Leha lintlha tse hlahisitsoeng mona li fana ka maikutlo a hore CTCM ke sethala se ts'episang haholo sa ho etsa mohlala oa myocardium e tiileng, mokhoa ona oa setso o na le mefokolo e itseng.Moeli o ka sehloohong oa setso sa CTCM ke hore e beha likhatello tse sa khaotseng tsa mochini holim'a lilae, tse thibelang bokhoni ba ho lekola likheo tsa pelo nakong ea potoloho ka 'ngoe.Ho phaella moo, ka lebaka la likarolo tse nyenyane tsa likarolo tsa pelo (7 mm), bokhoni ba ho hlahloba ts'ebetso ea systolic ka ntle ho mekhoa ea setso ho sebelisa li-sensor tsa matla a setso ho lekanyelitsoe.Sengoliloeng sa hajoale, re hlola moeli ona hanyane ka ho lekola motlakase oa optical e le sesupo sa ts'ebetso ea contractile.Leha ho le joalo, moedi ona o tla hloka mosebetsi o eketsehileng 'me o ka rarolloa nakong e tlang ka ho hlahisa mekhoa ea ho lekola tšebetso ea lilae tsa pelo moetlong, joalo ka 'mapa oa optical o sebelisang calcium le lidae tse se nang motlakase.Moeli o mong oa CTCM ke hore mohlala o sebetsang ha o sebetse khatello ea kelello ea 'mele (ho jara pele le ka morao).Ho CTCM, khatello e ile ea susumelletseha ka litsela tse fapaneng ho hlahisa 25% ea 'mele o otlolohileng ka diastole (ho otlolla ka ho feletseng) le systole (bolelele ba ho thibela motlakase nakong ea ho tsosoa ha motlakase) ka har'a lisele tse kholo haholo.Moeli ona o lokela ho tlosoa meralo ea CTCM e tlang ka khatello e lekaneng ea lisele tsa pelo tse tsoang mahlakoreng ka bobeli le ka ho sebelisa likamano tse tobileng tsa khatello ea molumo tse hlahang likamoreng tsa pelo.
Phetoho e fetelletseng e tlalehiloeng bukeng ena e ngotsoeng ka letsoho e lekanyelitsoe ho etsisa matšoao a hypertrophic hyperstretch.Ka hona, mohlala ona o ka thusa thutong ea matšoao a hypertrophic a otlollang ntle le tlhokahalo ea lintho tse monate kapa tsa methapo (tse seng teng tsamaisong ena).Liphuputso tse ling li hlokahala ho eketsa bongata ba CTCM, ka mohlala, ho sebelisana le lisele tsa 'mele tsa ho itšireletsa mafung, ho potoloha plasma humoral factor, le ho innervation ha ho sebelisana le lisele tsa neuronal ho tla ntlafatsa menyetla ea ho ba le lefu lena le CTCM.
Ho sebelisitsoe likolobe tse leshome le metso e meraro thutong ena.Mekhoa eohle ea liphoofolo e ile ea etsoa ho latela litataiso tsa mekhatlo 'me ea amoheloa ke Komiti ea Tlhokomelo ea Liphoofolo le Tšebeliso ea Univesithi ea Louisville Institutional Animal Care.The aortic arch e ile ea hatelloa 'me pelo ea tšeloa ka 1 L ea sterile cardioplegia (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH ho fihla ho 7.4); lipelo li ne li bolokiloe ka leqhoa le batang la cardioplegic solution ho fihlela li isoa lab ka leqhoa leo hangata le leng <10 min. lipelo li ne li bolokiloe ka leqhoa le batang la cardioplegic solution ho fihlela li isoa lab ka leqhoa leo hangata le leng <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. lipelo li ne li bolokiloe ka leqhoa le batang la cardioplegic solution ho fihlela lipalangoang ho ea laboratoring ka leqhoa, leo hangata le nkang <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию льду, обычно <10 мин. Boloka lipelo tsa ice cardioplegia ho fihlela lipalangoang ho ea laboratoring ka leqhoa, hangata <10 min.
Sesebelisoa sa CTCM se entsoe ka software e thusang komporo ea SolidWorks (CAD).Likamore tsa setso, likarohano le likamore tsa moea li entsoe ka polasetiki e hlakileng ea acrylic ea CNC.Lesale la mokokotlo la bophara ba 7mm le entsoe ka polyethylene e phahameng haholo (HDPE) bohareng 'me e na le o-ring groove ho amohela silicone o-ring e sebelisetsoang ho tiisa mecha ea litaba ka tlase.Lera le lesesaane la silika le arola kamore ea setso ho tloha poleiting ea karohano.Lera la silicone le khaotsoe ka laser ho 0.02 ″ letlapa le teteaneng la silicone 'me le na le boima ba 35A.Li-gasket tsa silicone tse tlase le tse holimo li khaotsoe ka laser ho tloha 1/16 ″ lakane e teteaneng ea silicone 'me li na le boima ba 50A.Li-screw tsa 316L tsa tšepe le linate tsa mapheo li sebelisetsoa ho tiisa boloko le ho etsa tiiso e thibelang moea.
Boto ea potoloho e hatisitsoeng e inehetseng (PCB) e etselitsoe ho hokahana le sistimi ea C-PACE-EM.Li-sockets tsa sehokelo sa mochini oa swiss ho PCB li hokahantsoe le li-electrode tsa graphite ka lithapo tsa koporo tse entsoeng ka silevera le li-screw tsa bronze tse 0-60 tse kentsoeng ka har'a li-electrode.Boto ea potoloho e hatisitsoeng e behiloe sekoahelong sa printa ea 3D.
Sesebelisoa sa CTCM se laoloa ke programmable pneumatic actuator (PPD) e etsang hore ho be le khatello e laoloang ea potoloho e tšoanang le potoloho ea pelo.Ha khatello e ka hare ho kamore ea moea e ntse e eketseha, lesela la silicone le tenyetsehang le atoloha ho ea holimo, le qobella sebaka se ka tlas'a sebaka sa lisele.Sebaka sa mesifa se tla atolosoa ke ho lelekoa hona ha mokelikeli, ho etsisa katoloso ea 'mele ea pelo nakong ea diastole.Ha ho le tlhōrōng ea ho phomola, ho ile ha sebelisoa matla a motlakase ka li-electrode tsa graphite, tse ileng tsa fokotsa khatello ka kamoreng ea moea le ho baka ho fokotseha ha likarolo tsa lisele.Ka hare ho phala ho na le valve ea hemostatic e nang le sensor ea khatello ea ho lemoha khatello ea tsamaiso ea moea.Khatello e utloiloeng ke sensor ea khatello e sebelisoa ho pokello ea data e hokahaneng le laptop.Sena se lumella ho beha leihlo ho tsoelang pele ha khatello ka hare ho kamore ea khase.Ha khatello e phahameng ea kamore e fihlile (e tloaelehileng 80 mmHg, 140 mmHg OS), sesebelisoa sa ho fumana lintlha se ile sa laeloa hore se romele letšoao ho tsamaiso ea C-PACE-EM ho hlahisa lets'oao la motlakase la biphasic bakeng sa 2 ms, le behiloeng ho 4 V.
Likarolo tsa pelo li ile tsa fumanoa 'me maemo a setso lilibeng tsa 6 a ile a etsoa ka tsela e latelang: Fetisetsa lipelo tse kotutsoeng ho tloha sekepeng sa ho fetisa ho ea ho tray e nang le serame (4 ° C.) cardioplegia.Ventricle e ka letsohong le letšehali e ne e arotsoe ka lehare le hloekisitsoeng mme e khaotsoe likotoana tsa 1-2 cm3.Li-thish blocks li ne li khomaretsoe ho litšehetso tsa linama tse nang le sekhomaretsi sa linama 'me li kenngoa ka har'a bateng ea "microtome" e sisinyehang e nang le tharollo ea Tyrode 'me e lula e na le oksijene (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.10 mPE) DG-Glucose (0.10) DG-Glukome (0.41) (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M tharollo), 1.8 mM CaCl2 ( 1.8 ml 1 M tharollo), ho fihlela ho 1 L ddH2O).Microtome e sisinyehang e ne e behiloe hore e sehe lilae tse tenya tse 300 µm ka lebelo la 80 Hz, amplitude e tšekaletseng ea vibration ea 2 mm, le sekhahla sa pele sa 0.03 mm/s.Sebaka sa ho hlapa ka linama se ne se pota-potiloe ke leqhoa ho boloka tharollo e pholile 'me mocheso o ne o bolokiloe ho 4°C.Fetisetsa likarolo tsa 'mele ho tloha ka bateng ea microtome ho ea bateng ea incubation e nang le tharollo ea Tyrode e lulang e tšeloa oksijene holim'a leqhoa ho fihlela ho fumanoa likarolo tse lekaneng bakeng sa poleiti e le 'ngoe ea setso.Bakeng sa litloaelo tsa transwell, likarolo tsa lisele li ne li khomaretsoe ho litšehetso tsa polyurethane tse 6 mm ka bophara 'me tsa kenngoa ka 6 ml ea optimized medium (199 medium, 1x ITS supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline le 2X antifungal-antifungal).Ho tsosoa ha motlakase (10 V, frequency 1.2 Hz) ho ne ho sebelisoa likarolong tsa lisele ka C-Pace.Bakeng sa maemo a TD, T3 e ncha le Dex li kentsoe ho 100 nM le 1 μM phetohong e 'ngoe le e' ngoe ea mahareng.Mokelikeli o na le oksijene pele o nkeloa sebaka makhetlo a 3 ka letsatsi.Likarolo tsa mahlahahlaha li ile tsa hlahisoa ka har'a incubator ho 37 ° C le 5% CO2.
Bakeng sa litso tsa CTCM, likarolo tsa lisele li ile tsa behoa mochineng oa khatiso oa 3D o entsoeng ka tloaelo ka sejana sa Petri se nang le tharollo ea Tyrode e fetotsoeng.Sesebelisoa se etselitsoe ho eketsa boholo ba selae sa pelo ka 25% ea sebaka sa selikalikoe sa tšehetso.Sena se etsoa e le hore likarolo tsa pelo li se ke tsa otlolla ka mor'a hore li tlosoe tharollong ea Tyrode ho ea ho seaplane le nakong ea diastole.Ho sebelisoa sekhomaretsi sa histoacrylic, likarolo tse 300 µm tse botenya li ne li behiloe holim'a selikalikoe sa tšehetso sa 7 mm ka bophara.Ka mor'a ho hokela likaroloana tsa linama lesale la tšehetso, khaola likaroloana tsa linama tse feteletseng 'me u behe likaroloana tsa linama tse khomaretsoeng hape ka bateng ea Tyrode solution holim'a leqhoa (4 ° C) ho fihlela ho lokiselitsoe likarolo tse lekaneng bakeng sa sesebelisoa se le seng.Nako eohle ea ts'ebetso ea lisebelisoa tsohle ha ea lokela ho feta lihora tse peli.Ka mor'a hore likarolo tsa 6 tsa lisele li kenngoe meheleng ea bona ea tšehetso, sesebelisoa sa CTCM se ile sa bokelloa.Kamore ea setso ea CTCM e tlatsitsoe esale pele ka 21 ml pre-oxygenated medium.Fetisetsa likarolo tsa lisele ho kamoreng ea setso 'me u tlose ka hloko li-bubble leha e le life tsa moea ka pipette.Ka mor'a moo, karolo ea lisele e kenngoa ka har'a sekoti ebe e kenngoa ka bonolo.Qetellong, beha sekoahelo sa electrode ho sesebelisoa ebe u fetisetsa sesebelisoa ho incubator.Ebe o kopanya CTCM ho tube ea moea le tsamaiso ea C-PACE-EM.The actuator pneumatic ea bula 'me valve ea moea e bula CTCM.Lenaneo la C-PACE-EM le ile la lokisetsoa ho fana ka 4 V ho 1.2 Hz nakong ea biphasic pacing bakeng sa 2 ms.Mochini o ne o fetoloa habeli ka letsatsi 'me li-electrode li fetoloa hang ka letsatsi ho qoba ho bokellana ha graphite holim'a li-electrode.Haeba ho hlokahala, likaroloana tsa linama li ka ntšoa lilibeng tsa bona tsa setso ho ntša lipululana leha e le life tse ka ’nang tsa oela tlas’a tsona.Bakeng sa maemo a kalafo a MT, T3/Dex e ile ea eketsoa e ncha ka phetoho e 'ngoe le e' ngoe ea mahareng ka 100 nM T3 le 1 μM Dex.Lisebelisoa tsa CTCM li ile tsa hlahisoa ka har'a incubator ho 37°C le 5% CO2.
Ho fumana litsela tse otlolohileng tsa lilae tsa pelo, ho ile ha etsoa mochine o khethehileng oa lik'hamera.Khamera ea SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) e ne e sebelisoa ka Navitar Zoom 7000 18-108mm macro lens (Navitar, San Francisco, CA).Pono ea pono e ne e etsoa ka mocheso oa kamore ka mor'a hore ho nkeloe sebaka se secha.Khamera e eme ka lehlakoreng la 51 ° 'me video e rekotoa ka liforeimi tse 30 motsotsoana.Taba ea pele, software e bulehileng ea mohloli (MUSCLEMOTION43) e sebelisitsoe le Image-J ho lekanya ho sisinyeha ha lilae tsa pelo.Maske a entsoe ho sebelisoa MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) ho hlalosa libaka tse khahlang bakeng sa ho otla lilae tsa pelo ho qoba lerata.Li-mask tse arotsoeng ka letsoho li sebelisoa litšoantšong tsohle ka tatellano ea foreimi ebe li fetisetsoa ho plug-in ea MUSCLEMOTION.Muscle Motion e sebelisa boholo bo tloaelehileng ba lipikselse ho foreimi ka 'ngoe ho lekanya motsamao oa eona ho latela foreimi ea litšupiso.Lintlha li ile tsa tlalehoa, tsa hloekisoa 'me tsa sebelisoa ho lekanya nako ea potoloho le ho hlahloba lisele tse otlolohileng nakong ea potoloho ea pelo.Video e rekotiloeng e ile ea sebetsoa ka morao ho sebelisoa filthara ea pele ea zero-mohato oa pele.Ho lekanya mesifa e otlolohileng (tlhōrō-ho-tlhōrō), ho ile ha etsoa tlhahlobo ea tlhōrō-to-tlhōrō ho khetholla pakeng tsa litlhōrō le likoti ho letšoao le rekotiloeng.Ntle le moo, detrending e etsoa ho sebelisoa polynomial ea 6 ho felisa ho hoholeha ha lets'oao.Khoutu ea lenaneo e entsoe ho MATLAB ho tseba ho sisinyeha ha lisele tsa lefats'e, nako ea potoloho, nako ea ho phomola, le nako ea konteraka (Khoutu ea Tlatsetso ea 44).
Bakeng sa tlhahlobo ea khatello, re sebelisa livideo tse tšoanang tse etselitsoeng tlhahlobo ea mochini, re ile ra latela pele litšoantšo tse peli tse emelang litlhoro tsa motsamao (lintlha tse phahameng ka ho fetisisa (tse holimo) le tse tlase (tse tlase) ho latela software ea MUSCLEMOTION.Ka mor'a moo re ile ra arola libaka tsa mahlaseli 'me ra sebelisa mofuta oa algorithm ea shading ho lihlopha tse arohaneng (Supplementary Fig. 2a).Lithane tse arohaneng li ile tsa aroloa ka likarolo tse leshome, 'me khatello ea maikutlo holim'a e' ngoe le e 'ngoe e ne e baloa ho sebelisoa equation e latelang: Strain = (Sup-Sdown) / Sdown, moo Sup le Sdown e leng libaka tsa sebopeho ho tloha holimo le tlase meriti ea lesela, ka ho latellana (Supplementary Fig. .2b).
Likarolo tsa pelo li behiloe ka 4% paraformaldehyde bakeng sa lihora tse 48.Li-tissue tse tsitsitseng li ile tsa felloa ke metsi ka 10% le 20% sucrose bakeng sa 1 h, ebe ka 30% sucrose bosiu bo le bong.Likarolo li ile tsa kenngoa ka har'a motsoako oa mocheso o motle oa ho itšeha (motsoako oa OCT) 'me butle-butle li leqhoa ka har'a bate ea isopentane / e omeletseng ea leqhoa.Boloka li-block tsa OCT ho -80 °C ho fihlela karohano.Li-slide li ne li lokisitsoe e le likarolo tse nang le botenya ba 8 μm.
Ho tlosa OCT likarolong tsa pelo, futhumatsa li-slide sebakeng se futhumatsang ka 95 °C bakeng sa metsotso e 5.Eketsa 1 ml PBS selaeteng se seng le se seng mme o e etsetse metsotso e 30 mochesong wa kamore, ebe o kenella dikarolong ka ho beha 0.1% Triton-X ho PBS metsotso e 15 mochesong wa kamore.Ho thibela li-antibodies tse sa tobang ho tlama sampole, eketsa 1 ml ea 3% ea tharollo ea BSA ho li-slide 'me u e kenye hora e le 1 mocheso oa kamore.Joale BSA e ile ea tlosoa 'me li-slide tsa hlatsuoa ka PBS.Tšoaea mohlala o mong le o mong ka pentšele.Li-antibodies tsa mantlha (li-diluted 1:200 ho 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) le troponin-T (Thermo F Scientific; #MA5-12960) li ile tsa kenyelletsoa ka metsotso e fetang 90, kapa li-antibodies tsa 4% tsa 12% tsa "2" li kenyelelitsoe 8 (Thermo Scientific; #A16079), khahlano le mmutla Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) bakeng sa metsotso e meng e 90 Ke hlatsoitsoe ka makhetlo a 3 ka PBS Ho khetholla letheba la sepheo ho tloha mokokotlong, re sebelisitse antibody ea bobeli e le taolo. -x magnification) le microscope ea Keyence e nang le 40x kgolo.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ho 5 μg/ml ho PBS e ne e sebelisetsoa ho silafatsa WGA le ho sebelisoa likarolong tse tsitsitseng bakeng sa metsotso ea 30 mocheso oa kamore.Joale li-slide li ile tsa hlatsuoa ka PBS 'me Sudan black ea kenngoa selaeteng se seng le se seng 'me sa kenngoa metsotso e 30.Li-slide li ile tsa hlatsuoa ka PBS 'me ho eketsoa mokhoa oa ho kenya vectashield.Li-slide li ile tsa bonoa ka microscope ea Keyence ka 40x magnification.
OCT e ile ea tlosoa lisampoleng tse hlalositsoeng ka holimo.Kamora ho tlosa OCT, qoelisa li-slide ka har'a tharollo ea Bouin ka bosiu bo le bong.Li-slide li ne li hlatsuoa ka metsi a qhibilihisitsoeng ka hora e le 'ngoe ebe li kenngoa ka har'a motsoako oa Bibrich aloe acid fuchsin ka metsotso e 10.Ebe li-slide li hlatsuoa ka metsi a silafetseng ebe li kenngoa ka tharollo ea 5% phosphomolybdenum / 5% phosphotungstic acid ka metsotso e 10.Ntle le ho hlatsoa, ​​fetisetsa li-slide ka ho toba ka har'a tharollo e putsoa ea aniline bakeng sa metsotso e 15.Ebe li-slide li hlatsuoa ka metsi a hloekisitsoeng ebe li kenngoa ka 1% ea acetic acid ka metsotso e 2.Li-slide li ile tsa omisoa ka 200 N ethanol 'me tsa fetisetsoa ho xylene.Li-slide tse silafetseng li ile tsa bonoa ho sebelisoa microscope ea Keyence ka sepheo sa 10x.Peresente ea sebaka sa Fibrosis e ile ea lekanyetsoa ho sebelisoa software ea Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), lethathamo la nomoro ea V13154, ho latela protocol ea moetsi e nang le liphetoho tse ling.Haholo-holo, ho buuoa ka sekhahla se nang le bophara ba 6 mm ho ne ho sebelisoa ho netefatsa boholo ba lisele tse ts'oanang nakong ea tlhahlobo ea MTT.Li-tissues li ne li kenngoa ka bonngoe ka har'a liliba tsa seliba sa 12 se nang le MTT substrate ho latela protocol ea moetsi.Likarolo li kenngoa ka 37 ° C. bakeng sa lihora tse 3 'me lisele tse phelang li senya karoloana ea MTT ho etsa motsoako oa formazan o pherese.Tlosa tharollo ea MTT ka 1 ml DMSO 'me u e emise ka 37 °C metsotso e 15 ho ntša formazan e pherese likarolong tsa pelo.Mehlala e ile ea hlapolloa 1:10 ho DMSO ka lipoleiti tse tlase tse hlakileng tse 96 le matla a 'mala o pherese a lekantsoeng ho 570 nm ho sebelisoa sebali sa poleiti ea Cytation (BioTek).Ho bala ho ne ho tloaeleha ho latela boima ba sekhechana ka seng sa pelo.
Mecha ea litaba ea pelo e ile ea nkeloa sebaka ke mecha ea litaba e nang le 1 μCi/ml [5-3H] -glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) bakeng sa tlhahlobo ea tšebeliso ea tsoekere joalokaha ho hlalositsoe pele.Ka mor'a lihora tse 4 tsa incubation, eketsa 100 µl ea mahareng ho ea ho microcentrifuge tube e bulehileng e nang le 100 µl ea 0.2 N HCl.Eaba tšupu e kenngoa ka har'a tšupu ea scintillation e nang le 500 μl ea dH2O hore e fetohe mouoane [3H]2O ka lihora tse 72 ho 37°C.Ebe u tlosa tube ea microcentrifuge ho tswa ho scintillation tube 'me u kenye 10 ml ea scintillation fluid.Lipalo tsa scintillation li ile tsa etsoa ho sebelisoa Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Tšebeliso ea glucose e ile ea baloa ho shebiloe [5-3H] -tšebetso e khethehileng ea tsoekere, tekano e sa fellang le semelo, phokotso ea [5-3H] -ho ea ho tsoekere e sa ngolisoang, le katleho ea scintillation counter.Lintlha li tloaelehile ho boima ba likarolo tsa pelo.
Ka mor'a hore li-tissue homogenization li be teng Trizol, RNA e ile ea aroloa likarolong tsa pelo ho sebelisa Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 ho latela protocol ea moetsi.Litokiso tsa laeborari ea RNAsec, tatellano le tlhahlobo ea data li entsoe ka tsela e latelang:
1 μg ea RNA sampole ka 'ngoe e sebelisitsoe e le lisebelisoa tsa ho qala ho lokisa laeborari ea RNA.Lilaebrari tsa tatellano li entsoe ho sebelisoa NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit bakeng sa Illumina (NEB, USA) ho latela likhothaletso tsa moetsi, 'me likhoutu tsa index li ile tsa eketsoa ho tatellano ea litšobotsi bakeng sa sampole ka' ngoe.Ka bokhuts'oane, mRNA e ile ea hloekisoa ho tsoa ho RNA kaofela ho sebelisoa lifaha tsa makenete tse hoketsoeng le poly-T oligonucleotides.Karohano e etsoa ka li-cations tsa divalent mocheso o phahameng ho NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).CDNA ea pele ea strand e ile ea etsoa ka ho sebelisa li-primer tsa hexamer le M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-).CDNA ea bobeli ea strand e ntan'o kopanngoa ho sebelisoa DNA polymerase I le RNase H. Li-overhangs tse setseng li fetoloa lipheletsong tse lerootho ka mosebetsi oa exonuclease / polymerase.Ka mor'a ho hanoa ha karolo ea 3' ea sekhechana sa DNA, Adapter ea NEBNext e nang le sebopeho sa loop ea hairpin e khomareloa ho eona ho e lokisetsa bakeng sa ho kopanya.Bakeng sa khetho ea likaroloana tsa cDNA tsa bolelele bo khethiloeng 150-200 bp.likhechana tsa laebrari li ile tsa hloekisoa ho sebelisoa sistimi ea AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).Joale, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) e nang le cDNA e khethiloeng ka boholo e hokahaneng le adaptara e sebelisitsoe metsotso e 15 ho 37 ° C ebe metsotso e 5 ho 95 ° C pele ho PCR.Ka nako eo PCR e ne e etsoa ho sebelisoa Phusion High-Fidelity DNA polymerase, li-primer tsa PCR tsa bokahohleng, le li-primer tsa Index (X).Qetellong, lihlahisoa tsa PCR li ile tsa hloekisoa (sistimi ea AMPure XP) mme boleng ba laebrari bo hlahlojoa ho sistimi ea Agilent Bioanalyzer 2100.Laeborari ea cDNA e ile ea hlophisoa ho sebelisoa sequencer ea Novaseq.Lifaele tsa litšoantšo tse tala tse tsoang ho Illumina li fetotsoe ho baloa ho sebelisoa CASAVA Base Calling.Lintlha tse tala li bolokoa ka mokhoa oa FASTQ(fq) oa lifaele tse nang le tatellano ea ho bala le litšoaneleho tsa motheo tse tsamaellanang.Khetha HISAT2 ho bapisa tatellano e tlhotliloeng e baloa le genome ea referense ea Sscrofa11.1.Ka kakaretso, HISAT2 e ts'ehetsa liphatsa tsa lefutso tsa boholo bofe kapa bofe, ho kenyeletsoa liphatsa tsa lefutso tse kholo ho feta li-base tse limilione tse likete tse 4, 'me boleng ba kamehla bo behiloe bakeng sa liparamente tse ngata.Splicing e baloa ho tsoa ho data ea RNA Seq e ka tsamaellana ka nepo ho sebelisa HISAT2, sistimi e potlakileng e fumanehang hona joale, ka ho nepahala ho ts'oanang kapa ho betere ho feta mokhoa ofe kapa ofe.
Bongata ba lingoliloeng bo bontša ka kotloloho boemo ba polelo ea lefutso.Maemo a polelo ea liphatsa tsa lefutso a hlahlojoa ke bongata ba lingoliloeng (palo ea tatellano) e amanang le genome kapa exons.Palo ea ho baloa e baloa ho maemo a polelo ea lefutso, bolelele ba lefutso, le botebo ba tatellano.FPKM (likaroloana ka lipara tse sekete tsa sengoloa tse hlophisitsoeng ka lipara tse milione) li ile tsa baloa 'me litekanyetso tsa P tsa polelo e fapaneng li ile tsa khethoa ho sebelisoa sephutheloana sa DESeq2.Ka mor'a moo re ile ra bala sekhahla sa ho sibolloa ha bohata (FDR) bakeng sa boleng bo bong le bo bong ba P re sebelisa mokhoa oa Benjamini-Hochberg9 ho latela "p.adjust" e hahiloeng ho R.
RNA e arohaneng le likarolo tsa pelo e ile ea fetoloa ho cDNA ka bongata ba 200 ng / μl ho sebelisa motsoako oa SuperScript IV Vilo Master ho tloha Thermo (Thermo, cat. no. 11756050).Quantitative RT-PCR e ne e etsoa ka ho sebelisa Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-hantle transparent reaction plate (Thermo, cat. no. 4483319) le microamp optical adhesive (Thermo, cat. no. 4311971).Motsoako oa karabelo e ne e le 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer le 3.5 µl H2O e tsoakiloeng selibeng.Lipotoloho tse tloaelehileng tsa qPCR li ile tsa tsamaisoa 'me litekanyetso tsa CT li ile tsa lekanyetsoa ho sebelisoa sesebelisoa sa Applied Biosystems Quantstudio 5 sa nako ea sebele sa PCR (384-well module; sehlahisoa # A28135).Taqman primers were purchased from Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) The CT values ​​​​of all samples were normalized to the housekeeping gene GAPDH.
Phatlalatso ea mecha ea phatlalatso ea NT-ProBNP e ile ea hlahlojoa ho sebelisoa NT-ProBNP kit (kolobe) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) ho latela protocol ea moetsi.Ka bokhutšoanyane, 250 µl ea sampole e 'ngoe le e 'ngoe le maemo a ile a kenyelletsoa ka bobeli selibeng ka seng.Hang ka mor'a ho eketsa sampole, eketsa 50 µl ea Assay Reagent A selibeng ka seng.Ka bonolo sisinya poleiti 'me u tiise ka sealant.Ebe matlapa a kenngoa ka 37 ° C bakeng sa hora e le 'ngoe.Ebe u hahamalla tharollo 'me u hlatsoe liliba ka makhetlo a 4 ka 350 µl ea 1X wash solution, u kenya motsoako oa ho hlatsoa metsotso e 1-2 nako le nako.Ebe u eketsa 100 µl ea Assay Reagent B ka seliba 'me u tiise ka plate sealant.Letlapa le ile la sisinyeha ka bonolo 'me la kenngoa ka 37 ° C metsotso e 30.Aspirate tharollo 'me u hlatsoe liliba ka makhetlo a 5 ka 350 µl ea 1X wash solution.Kenya 90 µl ea tharollo ea substrate selibeng ka seng ebe u tiisa poleiti.Eketsa poleiti ka 37 ° C bakeng sa metsotso e 10-20.Kenya 50 µl Stop Solution selibeng ka seng.Letlapa le ile la lekanyetsoa hang-hang ho sebelisoa sebali sa poleiti sa Cytation (BioTek) se behiloeng ho 450 nm.
Litlhahlobo tsa matla li ile tsa etsoa ho khetha boholo ba sehlopha se tla fana ka> 80% matla a ho lemoha phetoho e feletseng ea 10% parameter ka tekanyo ea phoso ea 5% ea Mofuta oa I. Litlhahlobo tsa matla li ile tsa etsoa ho khetha boholo ba sehlopha se tla fana ka> 80% matla a ho lemoha phetoho e feletseng ea 10% parameter ka tekanyo ea phoso ea 5% ea Mofuta oa I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% mohono для обнаружения 10% беспечат той ошибок типа I. Ho ile ha etsoa tlhahlobo ea matla ho khetha boholo ba sehlopha se neng se tla fana ka > 80% matla a ho lemoha 10% phetoho e feletseng ea parameter ka tekanyo ea 5% ea phoso ea Mofuta oa I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% беспечил бы астоты ошибок типа I. Ho ile ha etsoa tlhahlobo ea matla ho khetha boholo ba sehlopha se tla fana ka > 80% matla a ho lemoha 10% phetoho e feletseng ea parameter le 5% ea mofuta oa phoso ea mofuta oa I.Likarolo tsa mahlahahlaha li ile tsa khethoa ka mokhoa o sa reroang pele ho teko.Litlhahlobo tsohle li ne li foufetse, 'me lisampole li ile tsa khethoa feela ka mor'a hore data eohle e hlahlojoe.Software ea GraphPad Prism (San Diego, CA) e ne e sebelisetsoa ho etsa litlhahlobo tsohle tsa lipalo. Bakeng sa lipalo-palo tsohle, boleng ba p bo ne bo nkoa e le ba bohlokoa ho boleng <0.05. Bakeng sa lipalo-palo tsohle, litekanyetso tsa p li ne li nkuoa li le bohlokoa ho boleng <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Bakeng sa lipalo-palo tsohle, litekanyetso tsa p li ne li nkuoa li le bohlokoa ho boleng <0.05.對于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认為是显着的。對于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认為是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Bakeng sa lipalo-palo tsohle, litekanyetso tsa p li ne li nkuoa li le bohlokoa ho boleng <0.05.Teko ea t ea Moithuti ea nang le mehatla e 'meli e entsoe ho data ka lipapiso tse 2 feela.ANOVA ea tsela e le 'ngoe kapa tse peli e sebelisitsoe ho fumana bohlokoa lipakeng tsa lihlopha tse ngata.Ha ho etsoa liteko tsa post hoc, khalemelo ea Tukey e ile ea sebelisoa tlalehong ea lipapiso tse ngata.Lintlha tsa RNAsec li na le lintlha tse khethehileng tsa lipalo-palo ha ho baloa FDR le p.adjust joalokaha ho hlalositsoe karolong ea Mekhoa.
Bakeng sa tlhaiso-leseling e batsi mabapi le moralo oa thuto, bona Tlaleho ea Patlisiso ea Tlhaho e hokahaneng le sengoloa sena.