Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Vérsi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan terbatas pikeun CSS. Kanggo pangalaman pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi mareuman modeu kasaluyuan dina Internet Explorer).
Morphogenesis Gut manusa ngadegkeun fitur crypt-villus of 3D épitél microarchitecture jeung spatial organization.This struktur unik diperlukeun pikeun ngajaga Gut homeostasis ku mayungan niche sél stém dina crypt basal tina antigén mikroba exogenous jeung métabolit maranéhanana. permukaan mukosa.Ku sabab kitu, nyiptakeun deui struktur épitél 3D penting pisan pikeun pangwangunan modél usus in vitro. Utamana, usus mimetik organik-on-a-chip tiasa nyababkeun morfogenesis 3D spontan tina épitél peujit kalayan fungsi fisiologis ditingkatkeun sareng biomekanik. Gut dina chip microfluidic ogé dina chip hibrid Transwell embedded. Kami ngajelaskeun metode lengkep pikeun fabrikasi alat, kultur Caco-2 atanapi sél épitél organoid peujit dina setélan konvensional ogé dina platform microfluidic, induksi morfogenesis 3D, sareng karakterisasi épitél 3D anu ditetepkeun pikeun ngahontal épitél 3D ku ngagunakeun sababaraha protokol pencitraan gut. ngadalikeun aliran cairan basolateral pikeun 5 d.Our métode morphogenesis in vitro employs physiologically relevan stress geser jeung gerak mékanis jeung teu merlukeun rékayasa sél kompléks atawa manipulasi, nu bisa outperform séjén aya techniques.We envision yén protokol diusulkeun urang bisa boga implikasi lega pikeun komunitas panalungtikan biomedis, nyadiakeun métode pikeun regenerasi 3D peujit epithelial, biomedical lapisan épitél, jeung lapisan biomedical pikeun vitroutical. aplikasi.
Ékspérimén nunjukkeun yén sél sél Caco-2 épitél peujit anu dibudidayakeun dina gut-on-a-chip1,2,3,4,5 atanapi alat microfluidic bilayer6,7 tiasa ngalaman morfogenesis 3D spontan in vitro tanpa pamahaman anu jelas ngeunaan mékanisme dasarna. morfogenesis épitél in vitro, nu geus ditémbongkeun ku Caco-2 jeung organoids peujit turunan sabar. Sél épitél divalidasi.Dina ulikan ieu, urang husus fokus kana produksi sél jeung distribusi konsentrasi hiji antagonis Wnt potent, Dickkopf-1 (DKK-1), dina Gut-on-a-chip jeung alat microfluidic dirobah ngandung inserts Transwell, disebut "Hybrid Chip". Urang demonstrate yén tambahan exogenous Wnt antagonis, Wntuch 1 salaku antagonis DKK-1 secreted. protéin nu patali frizzled 1, atawa Soggy-1) kana peujit on-chip ngahambat morphogenesis atawa disrupts prestructured lapisan épitél 3D , nunjukkeun yen stress antagonistic salila budaya jawab morphogenesis peujit in vitro. ku flushing aktip (misalna, dina Gut-on-a-chip atawa hibrid-on-a-chip platform) atawa difusi .media Basolateral (misalna tina inserts Transwell kana waduk basolateral badag dina sumur).
Dina protokol ieu, kami nyadiakeun métode detil keur fabricating Gut-on-a-chip microdevices jeung Transwell-insertable chip hibrid (léngkah 1-5) pikeun kultur sél épitél peujit dina polydimethylsiloxane (PDMS) -based mémbran porous (léngkah 6A, 7A, 8, 9) atawa polyester Bs, 8, 9) atawa polyester Bs, 7 mémbran Transwell. 9) jeung ngainduksi morphogenesis 3D in vitro (hambalan 10) .We ogé ngaidentipikasi fitur sélular jeung molekular indicative of histogenesis jaringan-spésifik jeung diferensiasi sélular gumantung katurunan ku cara nerapkeun sababaraha modalitas Imaging (léngkah 11-24) .We induce morphogenesis maké sél épitél peujit manusa, atawa dina dua detil kultur permukaan, atawa dina format dua permukaan kultur teknis, kayaning Cainaco-2. modifikasi mémbran porous, kreasi monolayers 2D, sarta biokimia peujit sarta Réproduksi tina biomechanical microenvironment.in vitro.Pikeun ngainduksi morphogenesis 3D tina monolayers épitél 2D, urang dipiceun antagonis morphogen dina duanana bentuk berbudaya ku ngalir medium kana kompartemen basolateral tina kultur. lapisan épitél nu bisa dipaké pikeun model tumuwuhna épitél gumantung morphogen, longitudinal host-microbiome co-kultur, inféksi patogén, tatu radang, disfungsi panghalang épitél, sarta terapi dumasar-probiotic Conto.pangaruh.
Protokol kami tiasa mangpaat pikeun sajumlah ageung élmuwan dina dasar (contona, biologi mukosa peujit, biologi sél sirung, sareng biologi perkembangan) sareng panalitian terapan (contona, uji ubar preclinical, modél panyakit, rékayasa jaringan, sareng gastroenterologi) dampak anu lega. bisa disebarkeun ka audiences diajar dinamika signalling sél salila ngembangkeun peujit, regenerasi atawa homeostasis .Sajaba ti éta, protokol kami mangpaat pikeun interogasi inféksi dina rupa-rupa agén tepa kayaning Norovirus 8, Sindrom Pernafasan Akut Parah Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhilae atanapi Salmonella Typhimu. Pamirsa patologi panyakit sareng pathogenesis ogé mangpaat.Pamakéan sistem mikrofisiologi peujit on-chip tiasa ngijinkeun ko-kultur longitudinal 10 sareng penilaian salajengna pertahanan host, réspon imun sareng perbaikan tatu anu aya hubunganana sareng patogén dina saluran cerna (GI) 11 .Gangguan GI sanés anu aya hubunganana sareng sindrom usus bocor, panyakit celiac, sindrom kolitis atanapi borok, sindrom Crohn, borok, borok, borok. Lapisan épitél peujit 3D disusun nganggo lapisan épitél peujit 3D pasien, panyakit ieu kalebet atrofi villous, pondok crypt, karusakan mukosa, atanapi halangan épitél gangguan. sél mononuclear getih periferal pasien (PBMCs), kana model anu ngandung microarchitectures villus-crypt peujit 3D. sél imun husus jaringan, 5.
Kusabab mikrostruktur épitél 3D tiasa dibenerkeun sareng ditingali tanpa prosés sectioning, pamirsa anu damel dina transkriptomi spasial sareng résolusi luhur atanapi pencitraan super-resolusi tiasa kabetot dina pemetaan kami ngeunaan dinamika spatiotemporal gén sareng protéin dina ceruk épitél. Kabetot dina téhnologi.Tanggapan kana mikroba atawa rangsangan imun.Salajengna, longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 nu koordinat homeostasis Gut bisa ngadegkeun dina lapisan mukosa peujit 3D ku co-culturing rupa spésiés mikroba, komunitas mikroba atawa microbiota fecal-on-a-gut. dina platform.Pendekatan ieu utamana pikaresepeun pikeun audiences diajar immunology mucosal, gastroenterology, microbiome manusa, culturomics jeung mikrobiologi klinis néangan pikeun ngokolakeun microbiota Gut saméméhna uncultured di laboratorium.Upami protokol morphogenesis in vitro kami bisa diadaptasi kana format budaya scalable, kayaning inserts multiwell dina 24, 496 kontinyu piring, 496 ogé piring komplek baso, 496. protokol ogé bisa disseminated ka maranéhanana ngembang farmasi, biomedis Atawa platform screening tinggi-throughput atawa validasi pikeun industri pangan. Salaku bukti-of-prinsip, urang nembe nunjukkeun feasibility tina sistem morphogenesis multiplex-throughput tinggi scalable ka format plat 24-sumur. Metoda morfogenesis in vitro urang tiasa digancangan sareng berpotensi diadopsi ku seueur laboratorium panalungtikan, industri atanapi pamaréntahan sareng lembaga pangaturan pikeun ngartos pemrograman ulang sélular morfogenesis usus in vitro dina tingkat transkriptomi pikeun nguji ubar atanapi bioterapeutik. prosés morfogenesis.
Sajumlah kawates model eksperimen manusa-relevan geus dipaké pikeun diajar morphogenesis épitél peujit, utamana alatan kurangna protokol implementable mun dipicuna morphogenesis 3D in vitro.In kanyataanna, loba pangaweruh ayeuna ngeunaan morphogenesis Gut dumasar kana studi sato (misalna, zebrafish20, mice21 atanapi chickens22). questionable, sarta paling importantly, teu persis nangtukeun prosés developmental manusa.Model ieu ogé pohara kawates dina kamampuhna pikeun diuji dina multi-jalan scalable manner.Therefore, protokol kami pikeun regenerating struktur jaringan 3D in vitro outperforms in vivo model sato ogé statik tradisional séjén 2D model budaya sél.Sakumaha struktur exam3D nu geus dijelaskeun saméméhna, nu diijinkeun. lokalisasi sél differentiated dina sumbu crypt-villus di respon kana rupa mucosal atawa imun stimuli.3D lapisan épitél bisa nyadiakeun rohangan pikeun diajar kumaha sél mikroba bersaing pikeun ngabentuk niches spasial jeung évolusi ékologis dina respon kana faktor host (misalna jero versus lapisan mukus luar, sékrési IgA jeung peptidetil morfologis ngawenangkeun antimikrobial 3. kumaha mikrobiota usus ngawangun komunitasna sareng sacara sinergis ngahasilkeun métabolit mikroba (contona, asam lemak ranté pondok) anu ngawangun organisasi sélulér sareng ceruk sél stém dina crypts basal. Fitur ieu ngan tiasa ditingali nalika lapisan épitél 3D diadegkeun sacara in vitro.
Salian métode urang nyieun struktur épitél peujit 3D, aya sababaraha métode in vitro.Budaya organoid peujit nyaéta téhnik rékayasa jaringan canggih dumasar kana budidaya sél stém peujit dina kaayaan morfogén husus23,24,25. Sanajan kitu, pamakéan 3D model organoid-kultivasi mindeng dipaké pikeun analisa challenging organoid atawa organoid pikeun transporting. lumen peujit diwengku dina organoid, ku kituna, bubuka komponén luminal kayaning sél mikroba atawa antigén exogenous diwatesan. Aksés ka lumén organoid bisa ditingkatkeun maké microinjector,26,27 tapi metoda ieu invasif jeung kuli-intensif sarta merlukeun pangaweruh husus pikeun ngalakukeun.Salajengna, budaya organoid tradisional dijaga dina scaffolds hidrogél dina kaayaan statik teu akurat ngagambarkeun aktip dina biomekanika vivo.
Pendekatan séjén anu dianggo ku sababaraha kelompok panilitian ngagunakeun parancah hidrogél 3D anu direncanakeun pikeun meniru struktur épitél usus ku cara ngabudayakeun sél peujit manusa terasing dina permukaan gél. gradients morphogen, ngadegkeun rasio aspék tinggi struktur épitél jeung stroma-épitél crosstalk ku kaasup sél stromal dina scaffold.However, sifat scaffolds prestructured bisa nyegah tampilan tina prosés morphogenetic spontan sorangan.Model ieu ogé teu nyadiakeun luminal dinamis atawa interstitial scaffolds merlukeun aliran stéress, morphogenetic dina aliran cairan interstitial dina shelgogenetic. sarta mangtaun fungsi fisiologis.Ulikan panganyarna séjénna ngagunakeun scaffolds hidrogél dina platform microfluidic jeung patterned struktur épitél peujit ngagunakeun téhnik laser-etching. Organoids peujit mouse nuturkeun pola etched pikeun ngabentuk struktur tubular peujit, sarta aliran cairan intraluminal bisa recapitulated maké microfluidics modél kieu.Najan kitu, euweuh morfologis model. gerakan mekanobiologis. Téhnik percetakan 3D ti grup anu sarua éta bisa nyieun tabung Gut miniatur kalawan prosés morphogenetic spontan.Sanajan fabrikasi kompléks ruas Gut béda dina tabung, modél ieu ogé lacks aliran cairan luminal jeung deformasi mékanis.Tambihkeunana, operability model bisa jadi diwatesan, utamana sanggeus prosés bioprinting geus réngsé, Protocols.Dina kaayaan ékspériméntal-sél, perturbings. morfogenesis peujit, stress geser fisiologis relevan, biomechanics nu meniru motilitas Gut, diakses tina kompartemen apical na basolateral bebas, sarta ulang kreasi microenvironments biologis kompléks modularity.Therefore, kami in vitro 3D morphogenesis protokol bisa nyadiakeun pendekatan pelengkap pikeun nungkulan tantangan métode aya.
Protokol kami sapinuhna difokuskeun kana morphogenesis épitél 3D, ngan ukur sél épitél dina budaya sareng henteu aya jinis sél anu sanés sapertos sél mesenchymal, sél endothelial, sareng sél imun. Sakumaha anu dijelaskeun sateuacana, inti protokol urang nyaéta induksi morfogenesis épitél ku ngaleungitkeun sambetan morphogen anu disékrésikeun dina sisi basolateral tina modulus médium anu diwanohkeun. Gut-on-a-chip jeung hybrid-on-a-chip ngamungkinkeun urang pikeun nyieun deui lapisan épitél 3D undulating, complexities biologis tambahan kayaning interaksi épitél-mesenchymal33,34, extracellular Matrix (ECM) déposisi 35 jeung, dina model urang, fitur crypt-villus nu nepikeun niches sél stém . mesenchyme maénkeun peran konci dina produksi protéin ECM jeung régulasi morphogenesis peujit dina vivo35,37,38.Tambahan sél mesenchymal kana model urang ditingkatkeun prosés morphogenetic jeung kantétan sél efficiency.The lapisan endothelial (ie, kapiler atawa limfatik) muterkeun hiji peran penting dina régulasi recruitment sél molekular 9 sarta rekrutmen sél33. microenvironment.Salajengna, komponén vasculature nu bisa disambungkeun antara model jaringan mangrupakeun prerequisite nalika model jaringan dirancang pikeun demonstrate interaksi multi-organ.Ku kituna, sél endothelial mungkin perlu kaasup kana model fitur fisiologis leuwih akurat jeung organ-tingkat résolusi.Sél imun turunan sabar ogé penting pikeun mintonkeun leuleuy, réspon imun cross-imun, antigen, adaptif presentasi imun, sarta antigen. kekebalan dina konteks meniru panyakit peujit.
Pamakéan chip hibrid leuwih lugas ti Gut-on-a-chip sabab setelan alat leuwih basajan tur pamakéan inserts Transwell ngamungkinkeun pikeun scalable budaya peujit épitél. Sanajan kitu, inserts Transwell sadia komersil kalawan mémbran poliéster henteu elastis sarta teu bisa simulate gerakan peristaltic-kawas. dina sisi apical.Jelas, sipat statik dina kompartemen apical jarang ngaktifkeun ko-kultur baktéri jangka panjang dina chip hibrid.Sementara urang tiasa kuat ngainduksi morphogenesis 3D dina sisipan Transwell nalika nganggo chip hibrid, kakurangan biomekanika fisiologis anu relevan sareng aliran cairan apical tiasa ngabatesan feasibility tina platform aplikasi hibrida.
Rekonstruksi skala pinuh tina sumbu crypt-villus manusa dina kultur usus-on-a-chip sareng hibrid-on-a-chip teu acan didirikeun sapinuhna. Kusabab morfogenesis dimimitian tina monolayer épitél, microarchitectures 3D teu merta nyadiakeun kasaruaan morfologis kana crypts dina vivo. Épitél 3D, crypt jeung wewengkon villous teu jelas demarcated. Sanajan saluran luhur luhur dina chip ngakibatkeun ngaronjat jangkungna épitél microengineered, jangkungna maksimum masih dugi ka ~ 300-400 µm. Jero sabenerna crypts peujit manusa dina crypts peujit leutik jeung 5µµm masing-masing nyaéta ~ 1 jeung 5µm, masing-masing ~ 1 m3 jeung badag. jangkungna villi peujit leutik nyaéta ~600 µm41.
Ti hiji sudut pandang Imaging, in situ super-resolusi Imaging of 3D microarchitectures bisa jadi diwatesan ka Gut on chip a, saprak jarak gawé diperlukeun ti lénsa obyektif ka lapisan épitél dina urutan sababaraha milimeter. Pikeun nungkulan masalah ieu, obyektif jauh bisa jadi diperlukeun. PDMS.Saterusna, saprak lapisan-demi-lapisan microfabrication tina Gut on chip a ngalibatkeun adhesion permanén antara unggal lapisan, éta pisan nangtang pikeun muka atawa nyabut lapisan luhur pikeun nalungtik struktur permukaan lapisan épitél.Contona, ku ngagunakeun mikroskop éléktron scanning (SEM).
The hydrophobicity of PDMS geus faktor ngawatesan dina studi microfluidic-based kaayaan molekul leutik hidrofobik, saprak PDMS bisa nonspecifically adsorb molekul hidrofobik misalna. Alternatif pikeun PDMS bisa dianggap jeung bahan polymeric lianna. ngaminimalkeun adsorpsi molekul hidrofobik.
Tungtungna, métode kami teu acan ogé dicirikeun dina watesan nyadiakeun screening tinggi-throughput atawa "hiji-ukuran-fits-sadayana" platform eksperimen ramah-pamaké. Protokol ayeuna merlukeun pompa jarum suntik per microdevice, nu nyokot up spasi dina incubator CO2 sarta nyegah ékspérimén badag skala. Watesan ieu bisa nyata ningkat ku scalability of-well, 92 formats (ogé, 92 budaya). 384-sumur porous inserts nu ngidinan replenishment kontinyu sarta ngaleupaskeun média basolateral).
Pikeun ngainduksi morfogenesis 3D épitél peujit manusa sacara in vitro, kami nganggo alat peujit chip microfluidic anu ngandung dua saluran mikro paralel sareng mémbran porous elastis di antawisna pikeun nyiptakeun antarmuka kapilér-lumen. Kami ogé nunjukkeun panggunaan alat microfluidic saluran tunggal (chip hibrida) anu nyayogikeun aliran basolarisasi kontinyu dina lapisan epithelial anu terus-terusan dina lapisan epithelial Transswell. platforms, morphogenesis rupa sél épitél peujit manusa bisa nunjukkeun ku nerapkeun manipulasi arah aliran ngaleupaskeun antagonis morphogen tina kompartemen basolateral.Sakabeh prosedur eksperimen (Gambar 1) diwangun ku lima bagian: (i) microfabrication tina chip Gut atawa Transwell insertable chip hibrid (léngkah 1-5; préparasi epitél Box) tina (iii) Box epitél préparasi (i. (Sél Caco-2) atawa organoid peujit manusa; kotak 2-5), (iii) kultur sél épitél peujit dina chip peujit atawa chip hibrid (léngkah 6-9), (iv) induksi morphogenesis 3D in vitro (lengkah 10) jeung (v)) pikeun characterize mikrostruktur épitél 3D (léngkah 11-24) . vitro morphogenesis ku ngabandingkeun morphogenesis épitél jeung spasial, temporal, kondisional, atawa kadali prosedural.
Kami nganggo dua platform budaya anu béda: gut-on-a-chip kalayan saluran lempeng atanapi saluran berbelit nonlinier, atanapi chip hibrid anu ngandung sisipan Transwell (TW) dina alat mikrofluida, didamel sapertos anu dijelaskeun dina Kotak 1, sareng lengkah 1 -5. organoids peujit manusa) jeung prosedur kultur dipaké dina protokol ieu. "In vitro morphogenesis" nembongkeun léngkah sakabéh nu Caco-2 atawa sél épitél turunan organoid anu berbudaya dina chip peujit atawa dina inserts Transwell tina chip hibrid, dituturkeun ku induksi morphogenesis 3D jeung formasi hiji ciri épitél struktural, conto program di handap ieu nyadiakeun unggal struktur aplikasi. lapisan épitél peujit bisa dipaké, contona, dina characterization diferensiasi sél, studi fisiologi peujit, ngadegna ékosistem host-mikrobiom, sarta modeling kasakit. Gambar Immunofluorescence dina "Sél diferensiasi" némbongkeun inti, F-aktin jeung MUC2 dinyatakeun dina 3D Caco-2 sinyal nu dihasilkeun tina chip usus MUC2. sél goblet jeung mukus disékrésikeun tina surfaces mucosal. Gambar fluoresensi dina Fisiologi Gut némbongkeun mukus dihasilkeun ku staining pikeun asam sialic jeung résidu N-acetylglucosamine maké fluoresensi gandum germ agglutinin.The dua gambar tumpang tindihna dina "Host-Microbe Co-Cultures" némbongkeun wawakil host-mikrobiome co-kultur dina panel kénca ko-kultur E. coli nganyatakeun protéin fluoresensi héjo (GFP) kalawan microengineered 3D Caco-2 sél épitél.The panel katuhu nembongkeun lokalisasi GFP E. coli ko-budaya jeung 3D Caco-2 sél épitél, dituturkeun ku immunofluorescence staining kalawan F-aktin (beureum) jeung inti (biru). kalawan antigén baktéri (misalna lipopolysaccharide, LPS) jeung sél imun (misalna, PBMC; héjo) .Caco-2 Sél anu berbudaya pikeun ngadegkeun lapisan épitél 3D. Skala bar, 50 µm.Gambar dina baris handap: "Diferensiasi sél" diadaptasi kalawan idin ti reference.2. Oxford Universitas Pencét; Dihasilkeun kalawan idin ti Ref.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" diadaptasi kalayan idin ti ref.3. NAS; “Pemodelan Panyakit” diluyukeun kalayan idin ti référénsi.5. NAS.
Duanana chip usus-on-chip sareng hibrida didamel nganggo réplika PDMS anu dibongkar tina kapang silikon ku litografi lemes1,44 sareng dipolakeun ku SU-8. Desain saluran mikro dina unggal chip ditangtukeun ku nimbangkeun hidrodinamika sapertos tegangan geser sareng tekanan hidrodinamik1,4,12. The Gut-on-a-chip aslina diwangun ku dua Fig. microchannels lempeng paralel juxtaposed, geus mekar jadi Gut-on-a-chip kompléks (Data Extended Gbr. 1b) nu ngawengku sapasang microchannels melengkung pikeun ngainduksi Ngaronjatna waktu tinggal cairan, pola aliran nonlinier, sarta deformasi multiaxial sél kultur (Gbr. 2a-f) , jadi biomechanics kompléks jadi recomplexed 12. Gut-on-a-chips tiasa dipilih. Kami parantos nunjukkeun yén Gut-Chip anu berbelit-belit ogé nyababkeun morfogenesis 3D dina jangka waktu anu sami sareng tingkat pertumbuhan épitél anu sami dibandingkeun sareng Gut-Chip asli, henteu paduli jinis sél berbudaya. pola SU-8 disadiakeun fitur négatip sanggeus demolding (Gbr. 2a) .Pikeun fabricate peujit dina chip a, lapisan PDMS luhur disiapkeun ieu sequentially kabeungkeut kana pilem PDMS porous lajeng Blok jeung lapisan PDMS handap ku beungkeutan teu bisa balik maké treater corona (Gbr. 2b-f) . Pikeun fabricate chip hibrida kaca replicas kapok kana PDMS replicas tunggal, kapok PDMS kaca replicas kapok. nu bisa nampung inserts Transwell (Gbr. 2h jeung Extended Data Gbr. 2) .Prosés beungkeutan dipigawé ku nyampurkeun surfaces tina replica PDMS na kaca jeung plasma oksigén atawa treatment korona.Saatos sterilization sahiji alat microfabricated napel tabung silicone, setelan alat éta siap pikeun ngalakukeun 3D morphlogenesis epithelium2glogenesis (epithelium morphogenesise 3D).
a, Ilustrasi skéma tina persiapan bagian PDMS ti SU-8 patterned silikon molds.The uncured solusi PDMS ieu dituang onto a silikon kapang (kénca), kapok dina 60 °C (tengah) jeung demolded (katuhu) .The demolded PDMS ieu potong buah jeung cleaned pikeun use.b salajengna, Photograph tina kapang silikon PDMS dipaké pikeun nyiapkeun kapang silikon Photography dipaké pikeun nyiapkeun. fabricate nu PDMS porous membrane.d, A runtuyan foto tina luhur jeung handap komponén PDMS jeung dirakit on-chip alat peujit.e, Schematic of alignment sahiji luhur, mémbran, jeung komponén PDMS handap.Each lapisan ieu irreversibly kabeungkeut ku plasma atawa treatment.f coronas, Schematic of the fabricated gut-on-a-chinneling alat jeung vaskular microcuum-aimposed. chambers.g, Setup of Gut-on-a-chip pikeun sél microfluidic culture.The Gut fabricated on chip dirakit ku tube silicone jeung jarum suntik ieu disimpen dina coverslip.The alat chip ieu disimpen dina tutup a 150 mm Petri piring pikeun processing.The binder dipaké pikeun nutup tube.h silicone, Visual snapshots of 3D hybrids chip morphs. mun monolayers 2D budaya sél épitél peujit diselapkeun kana chip hibrid pikeun ngainduksi peujit 3D morphogenesis.Medium ieu perfused ngaliwatan microchannels handapeun lapisan sél ngadegkeun dina Transwell insert.Scale bar, 1 cm.h Reprinted kalawan idin ti reference.4. Lain deui.
Dina protokol ieu, garis sél Caco-2 jeung organoids peujit dipaké salaku sumber épitél (Gbr. 3a).Kadua jenis sél anu berbudaya mandiri (Box 2 jeung Box 5) sarta dipaké pikeun siki microchannels ECM-coated tina on-chip Gut atawa Transwell inserts.When sél anu confluent (> 95% liputan kultur flaxed), rutin ngaliwatan kultur sél (> 95% liputan kultur flaxed). 10 jeung 50) dina T-flasks dipanén pikeun nyiapkeun gantung sél dissociated ku cairan trypsinization (kotak 2). Organoids peujit manusa tina biopsies peujit atawa resections bedah anu dibudidayakan di Matrigel scaffold domes dina 24-sumur pelat pikeun ngarojong struktural microenviront. R-spondin, sarta Noggin) jeung faktor pertumbuhan disiapkeun sakumaha ditétélakeun dina Box 3 ieu supplemented unggal poé lianna nepi ka organoids tumuwuh nepi ka ~ 500 μm diaméterna. Organoids pinuh dipelak dipanén sarta disosiasi kana sél tunggal pikeun seeding onto peujit atawa inserts Transwell dina chip (Box 5) .Sakumaha ieu kami geus tipena béda 12, nurutkeun 12 kasakit saméméhna. colitis, kasakit Crohn, kanker kolorektal, atawa donor normal), situs lesion (misalna, lesion versus wewengkon non-lesioned) jeung lokasi cerna dina saluran (misalna duodenum, jejunum, ileum, sekum, kolon, atawa réktum). organoid.
a, Workflow pikeun induksi morfogenesis Gut dina chip Gut.Caco-2 épitél peujit manusa jeung organoids peujit dipaké dina protokol ieu demonstrate morphogenesis 3D. Sél épitél terasing ieu seeded dina alat Gut-on-a-chip disusun (persiapan chip) .Sakali sél nu seeded (poé PD0 napel) jeung mémbran nu napel (PD0) mémbran. (D0), apical (AP) aliran ieu ngagagas tur dijaga pikeun 2 poé kahiji (aliran, AP, D0-D2). Basolateral (BL) aliran ogé ngagagas babarengan jeung gerakan manjang siklik (stretch, aliran, AP na bl) nalika monolayer 2D lengkep kabentuk. Intestinal 3D morphogenesis Gambar lumangsung micromorphogenes morfogenesis 5 poé sanggeus 5 poé budaya contraidic. morfologi wawakil sél Caco-2 dina unggal hambalan ékspérimén atawa titik waktu (grafik bar, 100 µm). Opat diagram schematic illustrating cascades pakait tina morfogenesis Gut (katuhu luhur).The panah dashed dina schematic ngagambarkeun arah aliran cairan.b, gambar SEM némbongkeun topologi permukaan wewengkon epithelium 3D nu ngadegkeun (katuhu luhur). (kotak dashed bodas) nembongkeun microvilli regenerasi dina lapisan 3D Caco-2 (katuhu) .c, Horizontal view frontal ngadegkeun Caco-2 3D, claudin (ZO-1, beureum) jeung mémbran wates sikat kontinyu dilabélan F-aktin (héjo) jeung inti (biru) Immunofluorescence confocal sél visualisasi tina epithelial titik tengah visualisasi tina epithelial titik tengah chip epithelial. Ngaliwatan lokasi pesawat fokus pikeun tiap view confocal.d, Tangtu waktu parobahan morfologis dina organoids dibudidayakan dina chip diala ku mikroskop fase kontras dina poé 3, 7, 9, 11, jeung 13. Inset (katuhu luhur) nembongkeun magnification tinggi tina gambar disadiakeun. gambar immunofluorescence némbongkeun spidol pikeun sél stém (LGR5; magénta), sél goblet (MUC2; héjo), F-aktin (abu) jeung inti (cyan) tumuwuh dina chip peujit salila 3 poé, masing-masing (Kénca) jeung 13 poé (tengah) organoids dina lapisan épitél. Tingali ogé tanpa ngalegaan LG3R5 Sinyal Data Figure. signalling.Gambar fluoresensi némbongkeun mikrostruktur épitél (katuhu) épitél organoid 3D diadegkeun dina peujit dina chip ku staining mémbran plasma jeung CellMask ngalelep (katuhu) dina dinten 13 of culture.Skala bar nyaeta 50 μm iwal disebutkeun béda.b Reprinted kalawan idin ti reference.2. Oxford Universitas Pencét; c Diluyukeun kalawan idin ti Rujukan.2. Oxford Universitas Pencét; e jeung f diadaptasi kalawan idin ku rujukan.12 Dina Lisensi Creative Commons CC BY 4.0.
Dina peujit dina chip, perlu pikeun ngaropea permukaan hidrofobik tina mémbran porous PDMS pikeun suksés ECM coating.In protokol ieu, urang nerapkeun dua métode béda pikeun ngaropéa nu hydrophobicity of PDMS membranes.For culturing sél Caco-2, aktivasina permukaan ku perlakuan UV / ozon nyalira éta cukup pikeun ngurangan hydrophobicity tina PDMS nu EPDMS na ngagantelkeun sél sél na permukaan. Tapi, kultur microfluidic épitél organoid merlukeun functionalization permukaan dumasar-kimiawi pikeun ngahontal déposisi efisien protéin ECM ku sequentially nerapkeun polyethyleneimine (PEI) jeung glutaraldehyde kana PDMS microchannels.After modifikasi permukaan, protéin ECM disimpen pikeun nutupan functionalized PDMS permukaan epilium nu lajeng diwanohkeun kana sél organ PDMS epilium lajeng diwanohkeun. napel, budaya sél microfluidic dimimitian ku perfusing ukur sedeng kana microchannel luhur nepi ka sél ngabentuk monolayer lengkep, sedengkeun microchannel handap mertahankeun kaayaan statik.Metoda ieu dioptimalkeun pikeun aktivasina permukaan jeung palapis ECM nyandak kantétan épitél organoid mun dipicuna morphogenesis 3D dina beungeut PDMS.
Budaya Transwell ogé merlukeun palapis ECM saméméh seeding sél; kumaha oge, budaya Transwell teu merlukeun léngkah pretreatment kompléks pikeun ngaktipkeun beungeut inserts porous. Pikeun tumuwuh sél Caco-2 on inserts Transwell, palapis ECM on inserts porous accelerates kantétan sél Caco-2 disosiasi (<1 jam) jeung formasi halangan simpang ketat (<1-2 poé). inserts ECM-coated, napel na beungeut mémbran (<3 h) jeung dijaga nepi ka organoids ngabentuk monolayer lengkep jeung integritas panghalang .Transwell budaya anu dipigawé dina piring 24-sumur tanpa pamakéan chip hibrid.
In vitro 3D morphogenesis bisa diprakarsai ku nerapkeun aliran cairan kana aspék basolateral tina lapisan épitél ngadegkeun. Dina peujit on chip a, morphogenesis épitél dimimitian nalika sedeng ieu perfused kana microchannels luhur jeung handap (Gbr. 3a) .Sakumaha ditétélakeun saméméhna, éta kritis pikeun ngawanohkeun aliran cairan dina kontinyu kompartemen kompartemen kompartemen kompartemen (basolateral) arah removalgen rusiah. Pikeun nyadiakeun gizi cukup jeung sérum ka sél kabeungkeut dina mémbran porous sarta ngahasilkeun stress geser luminal, urang ilaharna nerapkeun aliran ganda dina peujit dina chip hibrid a chip.Dina, inserts Transwell ngandung monolayers épitél anu diselapkeun kana chip hibrid. Lajeng, sedeng ieu dilarapkeun dina sisi basolateral tina sisipan Transwell porous intested ngaliwatan microchannel3tivation poé ngaliwatan microchannel3tivation. aliran basolateral dina duanana platform kultur.
Fitur morfologis lapisan épitél 3D microengineered bisa dianalisis ku cara nerapkeun rupa-rupa modalitas Imaging, kaasup fase kontras mikroskop, diferensial interference kontras (DIC) mikroskop, SEM, atawa immunofluorescence confocal mikroskop (Angka 3 jeung 4) .Fase kontras atawa DIC Imaging bisa kalayan gampang dipigawé dina sagala kultur epitheld dina waktos protrusion kultur epithel. layers.Due ka transparansi optik tina PDMS jeung film poliéster, boh Gut-on-a-chip jeung platform chip hibrid bisa nyadiakeun real-time di situ Imaging tanpa merlukeun sectioning atawa disassembly of the device.When ngajalankeun immunofluorescence Imaging (Angka 1, 3c, f jeung 4b, c), sél nu % paratypically dibereskeun (paratypically dibereskeun). (PFA), dituturkeun ku Triton X-100 jeung 2% (wt / vol) ) bovine sérum albumin (BSA), dina urutan. Gumantung kana jenis sél, fixatives béda, permeabilizers, sarta agén blocking bisa dipaké. Antibodi primér nargétkeun garis-gumantung sél atawa spidol wewengkon anu dipaké pikeun nyorot sél immobilized boh antibodi sékundér nu diturutan nu staining on chip. (Contona, 4', 6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) atanapi F-aktin (misalna, fluoresensi dilabélan phalloidin) .Fluorescence basis Imaging live ogé bisa dipigawé di situ pikeun ngadeteksi produksi mukus (Gbr. 1, "Sél diferensiasi" jeung "Fisiologi Gut"), randomization sél mikrobial, "Fig mikroorganisme". ko-budaya"), rekrutmen sél imun (Gbr. 1, 'Modeling Kasakit') atanapi kontur morfologi épitél 3D (Gbr. 3c, f na 4b, c) . Nalika ngaropea peujit dina chip pikeun misahkeun lapisan luhur ti lapisan microchannel handap, sakumaha ditétélakeun dina ref.As ditémbongkeun dina morfologi 3D evilli 2. wates sikat apical bisa visualized ku SEM (Gbr. 3b) .The ekspresi spidol diferensiasi bisa ditaksir ku ngajalankeun PCR5 kuantitatif atawa single-sél RNA sequencing.Dina hal ieu, lapisan 3D sél épitél tumuwuh di chip Gut atawa chip hibrid dipanén ku trypsinization lajeng dipaké pikeun analisis molekular atawa genetik.
a, Workflow pikeun induksi morphogenesis peujit dina chip hibrida.Caco-2 jeung organoids peujit dipaké dina protokol ieu demonstrate morphogenesis 3D dina platform chip hibrid.Sél épitél Dissociated anu seeded dina inserts Transwell disiapkeun (TW prep; tingali gambar di handap) .Sakali sél anu seeded (seeded) jeung napel dina sél polyester di handapeun kultur Transwell. kaayaan (kultur TW).Saatos 7 poé, hiji sisipan Transwell tunggal ngandung monolayer 2D sél épitél ieu terpadu kana chip hibrid pikeun ngawanohkeun aliran basolateral (Aliran, BL), nu pamustunganana ngabalukarkeun generasi lapisan épitél 3D (morphogenesis). léngkah ékspérimén atawa titik waktu.Skéma dina lapisan luhur ngagambarkeun konfigurasi ékspérimén pikeun tiap step.b, chip Hybrid (skématik kénca) bisa ngakibatkeun morfogenesis 3D sél épitél organoid kalawan pintonan mikroskop confocal luhur-handap dicokot dina posisi Z béda (luhureun, tengah, jeung handap; tingali skéma katuhu jeung garis dotted pakait). némbongkeun ciri morfologis atra.F-aktin (cyan), inti (abu).c, Fluoresensi confocal micrographs (3D sudut pandang) sél épitél turunan organoid dibudidayakan dina Transwell statik (TW; inset dina kotak bodas dashed) versus chip hibrid (shot pinuh pangbadagna) ngabandingkeun 2D versus 3D morfologi crossset, masing-masing dina cut morfologi 3D, masing-masing tina cut-cut morfologi. pojok katuhu; "XZ") ogé némbongkeun fitur 2D jeung 3D. Bar skala, 100 µm.c Dicitak ulang kalawan idin ti rujukan.4. Lain deui.
Kontrol tiasa disusun ku cara ngabudayakeun sél anu sami (Caco-2 atanapi sél épitél organoid peujit) kana lapisan tunggal dua diménsi dina kaayaan kultur statik konvensional. Utamana, kakurangan gizi tiasa disababkeun kusabab kapasitas volume kawates saluran mikro (nyaéta ~ 4 µL dina saluran luhur dina aplikasi gut-chip asli, desain épitél baso ogé saatosna. dibandingkeun.
Prosés lithography lemes kudu dipigawé di kamar beresih. Pikeun unggal lapisan dina chip (lapisan luhur jeung handap sarta mémbran) jeung chip hibrid, photomasks béda dipaké tur fabricated on wafers silikon misah sabab jangkungna tina microchannels éta béda. The jangkungna target tina microchannels luhur jeung handap peujit dina chip anu 500 µm. 200 µm.
Teundeun wafer silikon 3 inci dina piring kalayan acetone.Gently swirl piring pikeun 30 detik, lajeng hawa garing wafer nu.Transfer wafer kana piring kalawan IPA, teras spin piring pikeun 30 s pikeun ngabersihan.
Solusi piranha (campuran hidrogén péroxida sareng asam sulfat pekat, 1:3 (vol/vol)) tiasa dianggo pikeun maksimalkeun miceun résidu organik tina permukaan wafer silikon.
Solusi Piranha pisan korosif sarta ngahasilkeun panas.Pacegahan kaamanan tambahan diperlukeun.Pikeun pembuangan runtah, ngidinan solusi pikeun niiskeun sarta mindahkeun ka beresih, wadahna runtah garing.Paké wadah sekundér tur leres labél containers runtah.Please turutan tungtunan kaamanan fasilitas pikeun prosedur nu leuwih lengkep.
Dehidrasi wafers ku cara nempatkeun aranjeunna dina piring panas 200 °C salila 10 mnt.Saatos dehidrasi, wafer ieu shaken lima kali dina hawa pikeun niiskeun.
Tuang ~10 g photoresist SU-8 2100 onto puseur wafer silikon cleaned.Use pinset ka nyebarkeun photoresist nu merata dina wafer nu.Occasionally nempatkeun wafer dina 65 °C hotplate sangkan photoresist nu kirang caket jeung gampang spread.Ulah nempatkeun wafer nu langsung dina piring panas.
SU-8 disebarkeun merata dina wafer ku ngajalankeun spin coating. Programkeun hiji rotasi asup SU-8 salila 5-10 detik pikeun rambatan dina 500 rpm dina akselerasi 100 rpm/s. Setel spin utama pikeun pola ketebalan 200 µm dina ketebalan 1.500 rpm 50 (mak500 rpm, atawa 500 rpm). Jangkungna µm pikeun lapisan luhur peujit dina chip; tingali "Lengkah kritis" di handap) disetel dina akselerasi 300 rpm/s 30 detik dina 1.200 rpm.
Laju spin utama tiasa disaluyukeun dumasar kana ketebalan target pola SU-8 dina wafer silikon.
Pikeun nyieun pola SU-8 tina jangkungna 500 µm pikeun lapisan luhur peujit dina chip, palapis spin sareng léngkah-léngkah panggang lemes tina Kotak ieu (léngkah 7 sareng 8) diulang sacara berurutan (tingali lengkah 9) pikeun ngahasilkeun dua lapisan 250 µm Lapisan kandel SU-8, anu tiasa dilapis sareng dihijikeun ku 10 µm dina kotak paparan UV ieu. luhur.
Panggang lemes wafers anu dilapis SU-8 ku cara nempatkeun wafers dina piring panas dina suhu 65 °C salami 5 mnt, teras gentos suhuna ka 95 °C sareng inkubasi salami 40 menit tambahan.
Pikeun ngahontal jangkungna 500 μm tina pola SU-8 dina microchannel luhur, ulang léngkah 7 jeung 8 pikeun ngahasilkeun dua 250 μm kandel SU-8 lapisan.
Ngagunakeun UV Mask Aligner, laksanakeun tes lampu nurutkeun parentah produsén urang keur ngitung waktu paparan wafer.(waktu paparan, ms) = (dosis paparan, mJ/cm2)/(daya lampu, mW/cm2).
Sanggeus nangtukeun waktu paparan, nempatkeun photomask dina wadah topeng tina aligner topeng UV jeung nempatkeun photomask dina wafer coated SU-8.
Teundeun permukaan dicitak tina photomask langsung dina sisi coated SU-8 wafer silikon pikeun ngaleutikan dispersi UV.
Paparan wafer sareng photomask anu dilapis SU-8 sacara vertikal ka 260 mJ/cm2 sinar UV pikeun waktos paparan anu tos ditangtukeun (tingali lengkah 10 tina kotak ieu).
Saatos paparan UV, wafer silikon anu dilapis SU-8 dipanggang dina suhu 65 ° C salami 5 mnt sareng 95 ° C salami 15 mnt dina unggal pelat panas pikeun ngarang pola kalayan jangkungna 200 μm. Manjangkeun waktos pas-panggang dina 95 ° C dugi ka 30 mnt pikeun nyiptakeun pola kalayan jangkungna 500 µm.
Pamekar dituang kana piring kaca, sarta wafer dipanggang disimpen dina piring.Volume pamekar SU-8 bisa rupa-rupa gumantung kana ukuran piring kaca. Pastikeun ngagunakeun cukup pamekar SU-8 pikeun sakabéhna miceun unexposed SU-8.Contona, lamun maké piring kaca 150 mm diaméterna kalawan kapasitas 1 L, make ~ 300 ml 5 menit pamekar rotasi pikeun puteran 5 menit.
Bilas kapang anu dikembangkeun ku ~10 mL pamekar seger diteruskeun ku IPA ku nyemprot solusina nganggo pipette.
Teundeun wafer dina cleaner plasma jeung ngalaan plasma oksigén (gas atmosfir, tekanan target 1 × 10−5 Torr, kakuatan 125 W) salila 1,5 mnt.
Teundeun wafer dina desiccator vakum jeung kaca slide inside.Wafers na slides bisa ditempatkeun samping ku side.If vakum desiccator dibagi kana sababaraha lapisan ku piring, nempatkeun slides di chamber handap jeung wafers dina chamber luhur. Teundeun 100 μL trichloro(1H, 1H, 2H) leyuran geseran jeung geseran kaca. vakum pikeun silanisasi.
Ngalembereh vial sél Caco-2 beku dina mandi cai 37 ° C, lajeng mindahkeun sél thawed kana flask T75 ngandung 15 mL 37 ° C prewarmed sedeng Caco-2.
Pikeun lulus sél Caco-2 dina ~ 90% confluency, mimiti haneut Caco-2 sedeng, PBS, jeung 0,25% tripsin / 1 mM EDTA dina 37 ° C cai mandi.
Aspirasi médium ku aspirasi vakum. Cuci sél dua kali nganggo 5 mL PBS haneut ku cara ngulang aspirasi vakum sareng nambihan PBS seger.