Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngajantenkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Évolusi parasit mikroba ngalibatkeun counteraction antara seléksi alam, nu ngabalukarkeun parasit ngaronjatkeun, sarta drift genetik, nu ngabalukarkeun parasit leungit gén jeung ngumpulkeun mutasi deleterious.Di dieu, dina raraga ngartos kumaha counteraction ieu lumangsung dina skala makromolekul tunggal, urang ngajelaskeun struktur cryo-EM tina ribosom Encephalitozoon cuniculi, hiji organisme eukariot jeung salah sahiji génom pangleutikna di alam.Réduksi ekstrim rRNA dina ribosom E. cuniculi dibarengan ku parobahan struktural unprecedented, kayaning évolusi linkers rRNA lebur saméméhna kanyahoan sarta rRNA tanpa bulges.Sajaba ti éta, ribosom E. cuniculi salamet leungitna fragmen rRNA jeung protéin ku ngamekarkeun kamampuh ngagunakeun molekul leutik salaku mimics struktural fragmen rRNA didegradasi jeung protéin.Gemblengna, kami nunjukkeun yén struktur molekul anu lami panginten bakal diréduksi, degenerasi, sareng tunduk kana mutasi anu ngaruksak gaduh sababaraha mékanisme kompensasi anu tetep aktip sanajan kontraksi molekular ekstrim.
Kusabab sabagéan ageung grup parasit mikroba gaduh alat molekular unik pikeun mangpaatkeun host maranéhanana, urang mindeng kudu ngamekarkeun therapeutics béda pikeun grup béda parasit1,2.Sanajan kitu, bukti anyar nunjukkeun yén sababaraha aspék évolusi parasit anu konvergen jeung sakitu legana bisa diprediksi, nunjukkeun dasar poténsi pikeun interventions terapi lega di parasites3,4,5,6,7,8,9 mikroba.
Karya saméméhna geus ngaidentifikasi trend évolusionér umum dina parasit mikroba disebut réduksi génom atawa buruk génom10,11,12,13.Panaliti ayeuna nunjukkeun yén nalika mikroorganisme nyerah gaya hirup anu hirup bébas sareng janten parasit intrasélular (atanapi endosymbionts), génomna ngalaman métamorfosis anu laun tapi luar biasa salami jutaan taun9,11.Dina prosés nu katelah buruk génom, parasit mikroba ngumpulkeun mutasi deleterious nu ngarobah loba gén saméméhna penting jadi pseudogenes, ngarah kana leungitna gén bertahap jeung collapse mutational14,15.Runtuhna ieu bisa ngancurkeun nepi ka 95% gén dina organisme intrasélular pangkolotna dibandingkeun jeung spésiés hirup bébas patali raket.Ku kituna, évolusi parasit intrasélular nyaéta tug-of-perang antara dua gaya lawan: Seleksi alam Darwinian, ngarah kana perbaikan parasit, sarta runtuhna génom, ngalungkeun parasit kana oblivion.Kumaha parasit junun muncul tina tug-of-perang ieu jeung nahan aktivitas struktur molekul na tetep can écés.
Sanajan mékanisme buruk génom teu dipikaharti sapinuhna, sigana lumangsung utamana alatan drift genetik sering.Kusabab parasit hirup dina populasi leutik, aséksual, jeung genetik kawates, aranjeunna moal bisa éféktif ngaleungitkeun mutasi deleterious nu kadang lumangsung salila réplikasi DNA.Ieu ngakibatkeun akumulasi teu bisa balik mutasi ngabahayakeun sarta ngurangan génom parasit.Hasilna, parasit teu ngan leungit gén nu geus euweuh dipikabutuh pikeun survival na di lingkungan intrasélular.Éta henteu mampuh populasi parasit pikeun ngaleungitkeun mutasi sporadis sacara efektif anu nyababkeun mutasi ieu ngumpulkeun sapanjang génom, kalebet gen anu paling penting.
Seueur pamahaman urang ayeuna ngeunaan réduksi génom ngan ukur dumasar kana babandingan sekuen génom, kalayan kirang perhatian kana parobahan molekul saleresna anu ngalaksanakeun fungsi rumah tangga sareng janten target ubar poténsial.Panaliti komparatif nunjukkeun yén beban mutasi mikroba intrasélular anu ngabahayakeun sigana predispose protéin sareng asam nukléat pikeun misfold sareng agrégat, ngajantenkeun aranjeunna langkung gumantung kana chaperone sareng hipersensitif kana panas19,20,21,22,23.Sajaba ti éta, rupa-rupa parasit - évolusi bebas kadang dipisahkeun ku saloba 2,5 miliar taun - ngalaman leungitna sarupa puseur kontrol kualitas dina sintésis protéin maranéhna5,6 jeung mékanisme perbaikan DNA24.Tapi, saeutik anu dipikanyaho ngeunaan dampak gaya hirup intrasélular kana sadaya pasipatan makromolekul sélulér anu sanés, kalebet adaptasi molekular kana paningkatan beban mutasi anu ngabahayakeun.
Dina karya ieu, dina raraga leuwih hadé ngartos évolusi protéin jeung asam nukléat mikroorganisme intrasélular, urang nangtukeun struktur ribosom tina parasit intrasélular Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi nyaéta organisme kawas jamur milik grup microsporidia parasit nu boga génom eukariot unusually leutik sahingga dipaké salaku organisme model pikeun nalungtik buruk génom25,26,27,28,29,30.Anyar-anyar ieu, struktur ribosom cryo-EM ditetepkeun pikeun génom anu ngirangan sedeng Microsporidia, Paranosema locustae, sareng Vairimorpha necatrix31,32 (~3.2 Mb génom).Struktur ieu nunjukkeun yén sababaraha leungitna amplifikasi rRNA dikompensasi ku ngembangkeun kontak anyar antara protéin ribosom tatangga atanapi akuisisi protéin msL131,32 ribosom anyar.Spésiés Encephalitozoon (genom ~2,5 juta bp), babarengan jeung Ordospora relatif pangdeukeutna maranéhanana, nunjukkeun tingkat pamungkas réduksi génom dina eukariota - maranéhna boga kirang ti 2000 gén protéin-coding, sarta diperkirakeun yén ribosom maranéhna teu ngan tanpa fragmen ékspansi rRNA (fragmen rRNA nu ngabedakeun ribosom ribosom baktéri jeung opat baktéri ribosom). homolog dina génom E. cuniculi26,27,28.Kituna, urang menyimpulkan yén E. cuniculi ribosom bisa nembongkeun strategi saméméhna kanyahoan pikeun adaptasi molekular kana buruk génom.
Struktur cryo-EM kami ngagambarkeun ribosom sitoplasma eukariot pangleutikna pikeun dicirian sareng masihan wawasan kumaha darajat pangurangan génom mangaruhan struktur, rakitan, sareng évolusi mesin molekular anu integral kana sél.Urang kapanggih yén E. cuniculi ribosom ngalanggar loba prinsip lega conserved of tilepan RNA jeung rakitan ribosom, sarta manggihan hiji anyar, protéin ribosom saméméhna kanyahoan.Teu disangka-sangka, kami nunjukkeun yén ribosom microsporidia parantos mekar kamampuan pikeun ngabeungkeut molekul-molekul leutik, sareng hipotésis yén pemotongan dina rRNA sareng protéin memicu inovasi évolusionér anu pamustunganana tiasa masihan kualitas anu mangpaat dina ribosom.
Pikeun ngaronjatkeun pamahaman kami ngeunaan évolusi protéin jeung asam nukléat dina organisme intrasélular, urang mutuskeun pikeun ngasingkeun spora E. cuniculi tina budaya sél mamalia kainféksi guna purify ribosom maranéhanana sarta nangtukeun struktur ribosom ieu.Hese pikeun meunangkeun sajumlah badag microsporidia parasit sabab microsporidia teu bisa dibudidayakan dina medium gizi.Gantina, aranjeunna tumuwuh sarta baranahan ngan di jero sél host.Ku alatan éta, pikeun ménta biomassa E. cuniculi pikeun purifikasi ribosom, urang kainféksi garis sél ginjal mamalia RK13 kalawan spora E. cuniculi sarta berbudaya sél kainféksi ieu sababaraha minggu pikeun ngidinan E. cuniculi tumuwuh sarta kalikeun.Ngagunakeun monolayer sél kainféksi ngeunaan satengah méter pasagi, urang bisa purify ngeunaan 300 mg spora Microsporidia sarta ngagunakeun eta pikeun ngasingkeun ribosom.Urang teras ngaganggu spora anu dimurnikeun sareng manik kaca sareng ngasingkeun ribosom kasar nganggo fraksinasi poliétilén glikol léngkah tina lisat.Hal ieu ngamungkinkeun urang pikeun ménta kira 300 µg ribosom E. cuniculi atah pikeun analisis struktural.
Urang teras ngumpulkeun gambar cryo-EM ngagunakeun sampel ribosom anu dihasilkeun sarta ngolah gambar ieu ngagunakeun masker pakait jeung subunit ribosom badag, sirah subunit leutik, sarta subunit leutik.Salila prosés ieu, kami ngumpulkeun gambar ngeunaan 108,000 partikel ribosom sareng ngitung gambar cryo-EM kalayan resolusi 2.7 Å (Gambar Tambahan 1-3).Urang lajeng dipaké gambar cryoEM kana model rRNA, protéin ribosom, sarta faktor hibernasi Mdf1 pakait sareng E. ribosom cuniculi (Gbr. 1a, b).
a Struktur ribosom E. cuniculi dina kompléks nu mibanda faktor hibernasi Mdf1 (pdb id 7QEP).b Peta faktor hibernasi Mdf1 pakait sareng ribosom E. cuniculi.c Peta struktur sekundér ngabandingkeun rRNA pulih dina spésiés Microsporidian jeung struktur ribosom dipikawanoh.Panel nunjukkeun lokasi fragmen rRNA anu diamplifikasi (ES) sareng situs aktip ribosom, kalebet situs decoding (DC), loop sarcinicin (SRL), sareng pusat transferase peptidyl (PTC).d Dénsitas éléktron pakait jeung puseur peptidyl transferase tina ribosom E. cuniculi nunjukkeun yén situs katalitik ieu struktur sarua dina parasit E. cuniculi jeung host na, kaasup H. sapiens.e, f Kapadetan éléktron pakait tina puseur decoding (e) jeung struktur skéma tina puseur decoding (f) nunjukkeun yén E. cuniculi boga résidu U1491 tinimbang A1491 (E. coli panomeran) dina loba eukariota séjén.Parobihan ieu nunjukkeun yén E. cuniculi tiasa peka kana antibiotik anu nargétkeun situs aktip ieu.
Kontras jeung struktur ribosom V. necatrix jeung P. locustae nu geus diadegkeun saméméhna (duanana struktur ngagambarkeun kulawarga microsporidia Nosematidae nu sarua jeung nu sarupa pisan jeung silih), 31,32 E. cuniculi ribosom ngalaman sababaraha prosés rRNA jeung fragméntasi protéin.denaturasi salajengna (Suplemén Gambar 4-6).Dina rRNA, parobahan paling keuna kaasup leungitna lengkep tina amplified 25S rRNA fragmén ES12L sarta degeneration parsial h39, h41, sarta H18 helices (Gbr. 1c, Suplemén Gbr. 4).Diantara protéin ribosom, parobihan anu paling keuna kalebet leungitna lengkep protéin eS30 sareng pondok tina protéin eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, sareng eS7 (Gambar Tambahan 5).
Ku kituna, réduksi ekstrim tina génom spésiés Encephalotozoon / Ordospora reflected dina struktur ribosom maranéhanana: E. cuniculi ribosomes ngalaman leungitna paling dramatis eusi protéin dina ribosom sitoplasma eukariot tunduk kana karakterisasi struktural, sarta aranjeunna malah teu mibanda rRNA na fragmen protéin nu loba dilestarikan dina tilu domain, tapi ogé dina eukariota hirup.Struktur ribosom E. cuniculi nyadiakeun modél molekular munggaran pikeun parobahan ieu sarta nembongkeun kajadian évolusionér nu geus overlooked ku duanana génomics komparatif jeung studi struktur biomolecular intrasélular (Suplemén Gbr. 7).Di handap, urang ngajelaskeun unggal kajadian ieu babarengan jeung kamungkinan asal évolusionér maranéhanana sarta dampak poténsi maranéhanana dina fungsi ribosom.
Urang lajeng manggihan yén, sajaba truncations rRNA badag, E. cuniculi ribosom boga variasi rRNA di salah sahiji situs aktip maranéhanana.Sanajan puseur peptidyl transferase tina ribosom E. cuniculi boga struktur sarua jeung ribosom eukariot séjén (Gbr. 1d), puseur decoding béda alatan variasi runtuyan nukléotida 1491 (E. coli panomeran, Gbr. 1e, f).Observasi ieu penting sabab situs decoding ribosom eukariot ilaharna ngandung résidu G1408 jeung A1491 dibandingkeun résidu tipe baktéri A1408 jeung G1491.Variasi ieu ngadasarkeun sensitipitas anu béda tina ribosom baktéri sareng eukariot kana kulawarga aminoglikosida antibiotik ribosom sareng molekul leutik sanés anu nargétkeun situs decoding.Dina situs decoding tina ribosom E. cuniculi, résidu A1491 diganti ku U1491, berpotensi nyieun panganteur mengikat unik pikeun molekul leutik targeting situs aktip ieu.Varian A14901 anu sami ogé aya dina microsporidia sanés sapertos P. locustae sareng V. necatrix, nunjukkeun yén éta nyebar diantara spésiés microsporidia (Gbr. 1f).
Kusabab sampel ribosom E. cuniculi kami diisolasi tina spora métabolik anu teu aktif, kami nguji peta cryo-EM E. cuniculi pikeun beungkeutan ribosom anu dijelaskeun sateuacana dina kaayaan setrés atanapi kalaparan.Faktor hibernasi 31,32,36,37, 38. Urang cocog struktur saméméhna ngadegkeun tina ribosom hibernating jeung peta cryo-EM tina ribosom E. cuniculi.Pikeun docking, ribosom S. cerevisiae dipaké dina kompléks nu mibanda faktor hibernasi Stm138, ribosom locust dina kompléks nu mibanda faktor Lso232, sarta V. necatrix ribosom dina kompléks nu mibanda faktor Mdf1 jeung Mdf231.Dina waktos anu sami, urang mendakan dénsitas cryo-EM pakait sareng faktor sésana Mdf1.Sarupa jeung Mdf1 ngariung jeung ribosom V. necatrix, Mdf1 ogé ngiket kana ribosom E. cuniculi, dimana eta meungpeuk situs E ribosom nu, jigana mantuan nyieun ribosom sadia nalika spora parasit jadi métabolik inactivation on inactivation awak (Gambar 2).).
Mdf1 ngablokir situs E ribosom, anu katingali ngabantosan nganonaktipkeun ribosom nalika spora parasit janten teu aktip sacara métabolik.Dina struktur ribosom E. cuniculi, urang manggihan yén Mdf1 ngabentuk kontak saméméhna kanyahoan jeung batang ribosom L1, bagian tina ribosom nu facilitates sékrési tRNA deacylated tina ribosom salila sintésis protéin.Kontak ieu nunjukkeun yén Mdf1 dissociates tina ribosom ngagunakeun mékanisme sarua jeung tRNA deacetylated, nyadiakeun mungkin katerangan kumaha ribosom ngaluarkeun Mdf1 pikeun ngaktifkeun deui sintésis protéin.
Sanajan kitu, struktur urang nembongkeun hiji kontak kanyahoan antara Mdf1 jeung leg ribosom L1 (bagian tina ribosom nu mantuan ngaleupaskeun tRNA deacylated tina ribosom salila sintésis protéin).Khususna, Mdf1 nganggo kontak anu sami sareng ruas siku tina molekul tRNA deacylated (Gbr. 2).Modél molekular anu teu dipikanyaho saméméhna ieu nunjukkeun yén Mdf1 dipisahkeun tina ribosom ngagunakeun mékanisme anu sami sareng tRNA deacetylated, anu ngajelaskeun kumaha ribosom ngaleungitkeun faktor hibernasi ieu pikeun ngaktifkeun deui sintésis protéin.
Nalika ngawangun modél rRNA, urang manggihan yén ribosom E. cuniculi geus abnormally narilep fragmen rRNA, nu urang disebut rRNA ngahiji (Gbr. 3).Dina ribosom nu ngawengku tilu domain kahirupan, rRNA ngalipet kana struktur nu paling rRNA basa boh pasangan basa jeung ngalipet saling atawa interaksi jeung protéin ribosom38,39,40.Sanajan kitu, dina ribosom E. cuniculi, rRNA sigana ngalanggar prinsip tilepan ieu ku cara ngarobah sababaraha héliks maranéhna kana wewengkon rRNA unfolded.
Struktur héliks rRNA H18 25S dina S. cerevisiae, V. necatrix, jeung E. cuniculi.Ilaharna, dina ribosom nu ngawengku tilu domain kahirupan, linker ieu gulungan jadi RNA héliks nu ngandung 24 nepi ka 34 résidu.Dina Microsporidia, sabalikna, linker rRNA ieu laun-laun diréduksi jadi dua linker-euyeub uridine tunggal-stranded ngan ngandung 12 résidu.Kalolobaan résidu ieu kakeunaan pangleyur.Gambar nunjukkeun yén microsporidia parasit kaciri ngalanggar prinsip umum tina tilepan rRNA, dimana basa rRNA biasana gandeng kana basa séjén atawa aub dina interaksi rRNA-protéin.Dina microsporidia, sababaraha fragmen rRNA nyandak lipatan anu henteu nguntungkeun, dimana tilas héliks rRNA janten sempalan untaian tunggal anu manjang ampir dina garis lempeng.Ayana daérah anu teu biasa ieu ngamungkinkeun microsporidia rRNA ngabeungkeut fragmén rRNA anu jauh nganggo jumlah basa RNA minimal.
Conto paling keuna tina transisi évolusionér ieu bisa dititénan dina H18 25S rRNA héliks (Gbr. 3).Dina spésiés ti E. coli ka manusa, dasar héliks rRNA ieu ngandung 24-32 nukléotida, ngabentuk héliks anu rada henteu teratur.Dina struktur ribosom anu diidentipikasi saméméhna ti V. necatrix jeung P. locustae, 31,32 basa héliks H18 sawaréh uncoiled, tapi papasangan basa nukléotida dilestarikan.Tapi, dina E. cuniculi sempalan rRNA ieu jadi linkers shortest 228UUUGU232 jeung 301UUUUUUUUU307.Teu kawas fragmen rRNA has, linkers-euyeub uridine ieu teu coil atawa nyieun kontak éksténsif jeung protéin ribosom.Gantina, aranjeunna ngadopsi struktur pangleyur-kabuka sarta pinuh unfolded nu untaian rRNA nu ngalegaan ampir lempeng.Konformasi manteng ieu ngajelaskeun kumaha E. cuniculi ngan ngagunakeun 12 basa RNA pikeun ngeusian celah 33 Å antara H16 jeung H18 rRNA héliks, sedengkeun spésiés séjén merlukeun sahenteuna dua kali loba basa rRNA pikeun ngeusian lolongkrang.
Ku kituna, urang tiasa nunjukkeun yén, ngaliwatan tilepan energetically unfavorable, microsporidia parasit geus ngembangkeun hiji strategi pikeun kontrak malah maranéhanana bagéan rRNA nu tetep sacara lega conserved sakuliah spésiés dina tilu domain kahirupan.Tétéla, ku accumulating mutations nu transformasi rRNA helices kana linkers poli-U pondok, E. cuniculi bisa ngabentuk fragmen rRNA mahiwal ngandung saloba mungkin nukléotida pikeun ligation fragmen rRNA distal.Ieu ngabantuan ngajelaskeun kumaha microsporidia ngahontal pangurangan dramatis dina struktur molekul dasarna tanpa kaleungitan integritas struktural sareng fungsionalna.
fitur mahiwal sejen tina E. cuniculi rRNA nyaéta penampilan rRNA tanpa thickenings (Gbr. 4).Tonjolan nyaéta nukléotida tanpa pasangan basa anu pulas kaluar tina héliks RNA tinimbang nyumput di jerona.Seuseueurna tonjolan rRNA bertindak salaku perekat molekular, ngabantosan ngabeungkeut protéin ribosom anu padeukeut atanapi fragmen rRNA anu sanés.Sababaraha bulges bertindak salaku hinges, ngamungkinkeun rRNA héliks pikeun flex jeung ngalipet optimal pikeun sintésis protéin produktif 41 .
a Tonjolan rRNA (penomoran S. cerevisiae) teu aya dina struktur ribosom E. cuniculi, tapi aya dina kalolobaan eukariota b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, jeung E. cuniculi ribosom internal.parasit kakurangan loba bulges rRNA kuna, kacida conserved.thickenings ieu nyaimbangkeun struktur ribosom;kituna, henteuna maranéhanana di microsporidia nunjukkeun ngurangan stabilitas rRNA tilepan dina parasit microsporidia.Babandingan jeung P batang (L7 / L12 batang dina baktéri) nunjukeun yen leungitna rRNA nabrak kadang coincides jeung penampilan nabrak anyar gigireun nabrak leungit.H42 héliks dina 23S/28S rRNA ngabogaan tonjolan kuna (U1206 dina Saccharomyces cerevisiae) diperkirakeun heubeul sahenteuna 3,5 milyar taun alatan panyalindungan dina tilu domain kahirupan.Dina microsporidia, tonjolan ieu dileungitkeun.Sanajan kitu, hiji Tonjolan anyar mucunghul gigireun Tonjolan leungit (A1306 di E. cuniculi).
Anehna, urang manggihan yén E. cuniculi ribosom kakurangan lolobana rRNA bulges kapanggih dina spésiés séjén, kaasup leuwih ti 30 bulges conserved dina eukariota séjén (Gbr. 4a).Kaleungitan ieu ngaleungitkeun seueur kontak antara subunit ribosom sareng hélik rRNA anu padeukeut, sakapeung nyiptakeun rongga anu ageung dina ribosom, ngajantenkeun ribosom E. cuniculi langkung porous dibandingkeun sareng ribosom anu langkung tradisional (Gbr. 4b).Utamana, urang manggihan yén lolobana bulges ieu ogé leungit dina V. necatrix jeung P. locustae struktur ribosom saméméhna dicirikeun, nu overlooked ku analisis struktural saméméhna31,32.
Kadang-kadang leungitna rRNA bulges dibarengan ku ngembangkeun bulges anyar gigireun bulges leungit.Contona, dina ribosom P-batang ngandung hiji bulge U1208 (dina Saccharomyces cerevisiae) nu salamet ti E. coli ka manusa sahingga diperkirakeun heubeul 3,5 milyar taun.Salila sintésis protéin, tonjolan ieu mantuan batang P pindah antara konformasi kabuka jeung katutup ku kituna ribosom bisa recruit faktor tarjamahan sarta nganteurkeun aranjeunna ka situs aktip.Dina ribosom E. cuniculi, penebalan ieu henteu aya;kumaha oge, a thickening anyar (G883) lokasina ngan dina tilu pasang basa bisa nyumbang kana restorasi tina kalenturan optimal tina bobot P (Gbr. 4c).
Data kami ngeunaan rRNA tanpa bulges nunjukkeun yén ngaminimalkeun rRNA henteu dugi ka leungitna unsur rRNA dina permukaan ribosom, tapi ogé tiasa ngalibetkeun inti ribosom, nyiptakeun cacad molekular khusus parasit anu teu acan dijelaskeun dina sél hirup bébas.spésiés hirup dititénan.
Saatos modeling protéin ribosom canonical jeung rRNA, urang manggihan yén komponén ribosom konvensional teu bisa ngajelaskeun tilu bagian tina gambar cryo-EM.Dua fragmen ieu ukuran molekul leutik (Gbr. 5, Gbr. 8 Tambahan).Bagéan kahiji diapit antara protéin ribosom uL15 jeung eL18 dina posisi biasana ditempatan ku C-terminus eL18, nu disingget dina E. cuniculi.Sanajan urang teu bisa nangtukeun identitas molekul ieu, ukuran jeung wangun pulo dénsitas ieu ogé dijelaskeun ku ayana molekul spermidine.Beungkeutna kana ribosom distabilkeun ku mutasi spésifik microsporidia dina protéin uL15 (Asp51 sareng Arg56), anu sigana ningkatkeun afinitas ribosom pikeun molekul leutik ieu, sabab ngamungkinkeun uL15 mungkus molekul leutik kana struktur ribosom.Gambar tambahan 2).8, data tambahan 1, 2).
Cryo-EM pencitraan némbongkeun ayana nukléotida luar ribosa kabeungkeut kana ribosom E. cuniculi.Dina ribosom E. cuniculi, nukléotida ieu nempatan tempat nu sarua jeung nukléotida 25S rRNA A3186 (panomeran Saccharomyces cerevisiae) dina kalolobaan ribosom eukariot lianna.b Dina struktur ribosom E. cuniculi, nukléotida ieu ayana di antara protéin ribosom uL9 jeung eL20, sahingga nyaimbangkeun kontak antara dua protéin.analisis konservasi runtuyan cd eL20 diantara spésiés microsporidia.Tangkal filogenetik spésiés Microsporidia (c) jeung sababaraha urutan alignment protéin eL20 (d) némbongkeun yén résidu nukléotida-ngariung F170 jeung K172 dilestarikan di paling Microsporidia has, iwal S. lophii, iwal Microsporidia branching mimiti, nu nahan rRNA ES39L extension nu.e Angka ieu nunjukkeun yén résidu beungkeutan nukléotida F170 sareng K172 ngan aya dina eL20 tina génom microsporidia anu réduksi pisan, tapi henteu dina eukariota sanés.Gemblengna, data ieu nunjukkeun yén ribosom Microsporidian parantos ngembangkeun situs beungkeutan nukléotida anu sigana ngabeungkeut molekul AMP sareng dianggo pikeun nyaimbangkeun interaksi protéin-protéin dina struktur ribosom.Konservasi luhur situs mengikat ieu dina Microsporidia sarta henteuna dina eukariota séjén nunjukkeun yén situs ieu bisa nyadiakeun kaunggulan selektif survival pikeun Microsporidia.Ku kituna, saku nukléotida-ngariung dina ribosom microsporidia teu kaciri mangrupa fitur degenerate atawa bentuk ahir degradasi rRNA sakumaha ditétélakeun saméméhna, tapi rada inovasi évolusionér mangpaat anu ngamungkinkeun microsporidia ribosome mun langsung ngabeungkeut molekul leutik, ngagunakeun eta salaku blok wangunan molekular.blok wangunan pikeun ribosom.Papanggihan ieu ngajadikeun ribosom microsporidia hiji-hijina ribosom anu dipikawanoh ngagunakeun hiji nukléotida salaku blok wangunan struktural na.f Jalur évolusionér hipotétis diturunkeun tina beungkeutan nukléotida.
Dénsitas beurat molekul low kadua perenahna di panganteur antara protéin ribosom uL9 jeung eL30 (Gbr. 5a).Antarbeungeut ieu saméméhna dijelaskeun dina struktur ribosom Saccharomyces cerevisiae salaku situs beungkeutan nukléotida 25S rRNA A3186 (bagian tina extension ES39L rRNA)38.Ieu ditémbongkeun yén dina ribosom P. locustae ES39L degenerate, panganteur ieu ngiket hiji nukléotida tunggal kanyahoan 31, sarta dianggap yén nukléotida ieu mangrupa bentuk ahir rRNA ngurangan, nu panjang rRNA nyaeta ~ 130-230 basa.ES39L diréduksi jadi nukléotida tunggal 32,43.Gambar cryo-EM kami ngadukung ideu yén dénsitas tiasa dijelaskeun ku nukléotida.Sanajan kitu, résolusi luhur struktur urang némbongkeun yén nukléotida ieu mangrupa molekul extraribosomal, jigana AMP (Gbr. 5a, b).
Urang teras naroskeun naha situs beungkeutan nukléotida muncul dina ribosom E. cuniculi atanapi naha éta aya sateuacana.Kusabab beungkeutan nukléotida utamana dimédiasi ku résidu Phe170 jeung Lys172 dina protéin ribosom eL30, urang ngira-ngira konservasi résidu ieu dina 4396 eukariota perwakilan.Saperti dina kasus uL15 di luhur, urang manggihan yén résidu Phe170 na Lys172 anu kacida conserved ngan dina Microsporidia has, tapi teu aya dina eukariota séjén, kaasup atypical Microsporidia Mitosporidium na Amphiamblys, nu ES39L rRNA sempalan teu ngurangan 44, 45, 45.-e).
Dihijikeun, data ieu ngarojong pamanggih yén E. cuniculi jeung kamungkinan microsporidia canonical séjén geus mekar kamampuhan pikeun éfisién nangkep angka nu gede ngarupakeun métabolit leutik dina struktur ribosom pikeun ngimbangan turunna dina rRNA jeung tingkat protéin.Dina ngalakukeunana, aranjeunna parantos ngembangkeun kamampuan unik pikeun ngabeungkeut nukléotida di luar ribosom, nunjukkeun yén struktur molekul parasit ngimbangan ku néwak métabolit leutik anu seueur pisan sareng ngagunakeunana salaku mimik struktur RNA sareng fragmén protéin anu terdegradasi..
Bagian katilu unsimulated peta cryo-EM kami, kapanggih dina subunit ribosom badag.Résolusi anu kawilang luhur (2.6 Å) tina peta kami nunjukkeun yén dénsitas ieu milik protéin kalayan kombinasi unik tina résidu ranté samping anu ageung, anu ngamungkinkeun urang pikeun ngaidentipikasi dénsitas ieu salaku protéin ribosom anu teu dipikanyaho saacanna anu diidentifikasi salaku msL2.Paluruh homologi urang némbongkeun yén msL2 dilestarikan dina klad Microsporidia tina genus Encephaliter jeung Orosporidium, tapi teu aya dina spésiés séjén, kaasup Microsporidia lianna.Dina struktur ribosom, msL2 ngeusian celah anu dibentuk ku leungitna rRNA ES31L anu diperpanjang.Dina kekosongan ieu, msL2 mantuan nyaimbangkeun rRNA tilepan sarta bisa ngimbangan leungitna ES31L (Gambar 6).
dénsitas éléktron sareng modél protéin ribosom khusus Microsporidia msL2 kapanggih dina ribosom E. cuniculi.b Seuseueurna ribosom eukariot, kalebet ribosom 80S Saccharomyces cerevisiae, gaduh amplifikasi ES19L rRNA anu leungit dina kalolobaan spésiés Microsporidian.Struktur saméméhna tina V. necatrix microsporidia ribosom nunjukkeun yén leungitna ES19L dina parasit ieu katembong ku évolusi protéin ribosom msL1 anyar.Dina ulikan ieu, urang manggihan yén E. cuniculi ribosom ogé ngembangkeun hiji RNA ribosom tambahan mimik protéin salaku santunan katempo pikeun leungitna ES19L.Sanajan kitu, msL2 (ayeuna annotated salaku protéin ECU06_1135 hypothetical) jeung msL1 boga asal struktural jeung évolusionér béda.c Panemuan ieu generasi protéin msL1 jeung msL2 ribosom nu teu patali évolusionér nunjukkeun yén lamun ribosom ngumpulkeun mutasi ngarugikeun dina rRNA maranéhna, maranéhna bisa ngahontal tingkat unprecedented tina diversity komposisi sanajan sabagian leutik spésiés nu patali raket.Papanggihan ieu bisa mantuan netelakeun asal jeung évolusi ribosom mitokondria, nu dipikawanoh pikeun rRNA kacida ngurangan sarta variability abnormal dina komposisi protéin sakuliah spésiés.
Urang lajeng ngabandingkeun protéin msL2 jeung protéin msL1 saméméhna digambarkeun, hiji-hijina protéin ribosom microsporidia-spésifik dipikawanoh kapanggih dina V. necatrix ribosom.Kami hoyong nguji naha msL1 sareng msL2 aya hubungan évolusionér.Analisis kami nunjukkeun yén msL1 sareng msL2 ngeusian rohangan anu sami dina struktur ribosom, tapi gaduh struktur primér sareng tersiér anu béda, anu nunjukkeun asal évolusionér anu mandiri (Gbr. 6).Ku kituna, kapanggihna msL2 kami nyadiakeun bukti yén grup spésiés eukariot kompak bisa mandiri mekar protéin ribosom struktural béda pikeun ngimbangan leungitna fragmén rRNA.Papanggihan ieu kasohor yén kalolobaan ribosom eukariot sitoplasma ngandung protéin invarian, kalebet kulawarga anu sami tina 81 protéin ribosom.Munculna msL1 jeung msL2 dina rupa-rupa clades of microsporidia salaku respon kana leungitna bagéan rRNA nambahan nunjukkeun yen degradasi arsitektur molekular parasit ngabalukarkeun parasit neangan mutasi compensatory, nu antukna bisa ngakibatkeun akuisisi maranéhanana dina populasi parasit béda.struktur.
Tungtungna, nalika model urang geus réngsé, urang ngabandingkeun komposisi ribosom E. cuniculi jeung nu diprediksi tina sekuen génom.Sababaraha protéin ribosom, kaasup eL14, eL38, eL41, jeung eS30, saméméhna dianggap leungit tina génom E. cuniculi alatan henteuna katempona homolog maranéhanana ti génom E. cuniculi.Leungitna seueur protéin ribosom ogé diprediksi dina kalolobaan parasit intrasélular sareng éndosimbion anu ngirangan pisan.Contona, sanajan lolobana baktéri hirup bébas ngandung kulawarga sarua 54 protéin ribosom, ngan 11 kulawarga protéin ieu boga homologs didéteksi dina unggal génom dianalisis baktéri host-diwatesan.Ngadukung anggapan ieu, leungitna protéin ribosom parantos dititénan sacara ékspériméntal dina V. necatrix sareng P. locustae microsporidia, anu kakurangan protéin eL38 sareng eL4131,32.
Sanajan kitu, struktur urang némbongkeun yén ngan eL38, eL41, sarta eS30 sabenerna leungit dina ribosom E. cuniculi.Protéin eL14 ieu dilestarikan jeung struktur urang némbongkeun naha protéin ieu teu bisa kapanggih dina pilarian homology (Gbr. 7).Dina ribosom E. cuniculi, lolobana situs beungkeutan eL14 leungit alatan degradasi rRNA-amplified ES39L.Dina henteuna ES39L, eL14 leungit lolobana struktur sekundér na, sarta ngan 18% tina sekuen eL14 éta idéntik dina E. cuniculi na S. cerevisiae.Pelestarian runtuyan goréng ieu luar biasa sabab sanajan Saccharomyces cerevisiae jeung Homo sapiens-organisme nu mekar 1,5 milyar taun kapisah-bagi leuwih ti 51% résidu sarua dina eL14.Leungitna konservasi anomali ieu ngécéskeun naon pangna E. cuniculi eL14 ayeuna annotated salaku putative M970_061160 protéin teu salaku eL1427 protéin ribosom.
sarta The Microsporidia ribosom leungit extension ES39L rRNA, nu sawaréh ngaleungitkeun situs beungkeutan protéin ribosom eL14.Dina henteuna ES39L, protéin microspore eL14 ngalaman leungitna struktur sekundér, dimana urut rRNA-mengikat α-helix degenerates kana loop panjang minimal.b Multiple sequence alignment nunjukkeun yén protéin eL14 dikonservasi pisan dina spésiés eukariot (57% identitas runtuyan antara ragi jeung homolog manusa), tapi kurang dilestarikan jeung divergen dina microsporidia (nu henteu leuwih ti 24% résidu idéntik jeung homolog eL14).ti S. cerevisiae atawa H. sapiens).Ieu konservasi runtuyan goréng jeung variability struktur sekundér ngécéskeun naon pangna homolog eL14 teu kungsi kapanggih dina E. cuniculi jeung naha protéin ieu disangka geus leungit dina E. cuniculi.Kontras, E. cuniculi eL14 saméméhna annotated salaku putative M970_061160 protéin.Observasi ieu nunjukkeun yén diversity génom microsporidia ayeuna overestimated: sababaraha gén ayeuna dianggap leungit dina microsporidia sabenerna dilestarikan, sanajan dina bentuk kacida differentiated;Sabalikna, sababaraha anu dianggap kode pikeun gén microsporidia pikeun protéin husus cacing (misalna, protéin hipotétis M970_061160) sabenerna kode pikeun protéin pisan rupa-rupa kapanggih dina eukariota lianna.
Pananjung ieu nunjukkeun yén denaturasi rRNA bisa ngakibatkeun leungitna dramatis konservasi runtuyan dina protéin ribosom padeukeut, ngajadikeun protéin ieu undetectable pikeun maluruh homologi.Ku kituna, urang bisa overestimate darajat sabenerna degradasi molekular dina organisme génom leutik, sabab sababaraha protéin dianggap leungit sabenerna persist, sanajan dina bentuk kacida dirobah.
Kumaha parasit bisa nahan fungsi mesin molekular maranéhanana dina kaayaan réduksi génom ekstrim?Ulikan kami ngajawab patarosan ieu ku ngajéntrékeun struktur molekul kompléks (ribosom) E. cuniculi, hiji organisme jeung salah sahiji génom eukariot pangleutikna.
Geus dipikawanoh pikeun ampir dua puluh taun yén molekul protéin jeung RNA dina parasit mikroba mindeng béda ti molekul homolog maranéhanana dina spésiés hirup bébas sabab kakurangan puseur kontrol kualitas, diréduksi jadi 50% tina ukuranana dina mikroba hirup bébas, jsb.loba mutasi debilitating nu ngaruksak tilepan jeung fungsi.Contona, dina ribosom organisme génom leutik, kaasup loba parasit intrasélular jeung endosymbionts, diperkirakeun kakurangan sababaraha protéin ribosom jeung nepi ka sapertilu nukléotida rRNA dibandingkeun jeung spésiés hirup bébas 27, 29, 30, 49. Sanajan kitu, cara molekul ieu fungsi dina parasit tetep lolobana mangrupa misteri génomics ngaliwatan.
Ulikan urang nunjukeun yen struktur makromolekul bisa nembongkeun loba aspék évolusi nu hese nimba tina studi génomik komparatif tradisional parasit intrasélular jeung organisme host-diwatesan séjén (Suplemén Gbr. 7).Contona, conto protéin eL14 nunjukeun yen urang bisa overestimate darajat sabenerna degradasi aparat molekular dina spésiés parasit.Parasit encephalitic ayeuna dipercaya boga ratusan gén microsporidia-spésifik.Tapi, hasil kami nunjukkeun yén sababaraha gen anu sigana spésifik ieu saleresna ngan ukur varian gen anu béda pisan anu umum dina eukariota sanés.Leuwih ti éta, conto protéin msL2 nembongkeun kumaha urang mopohokeun protéin ribosom anyar jeung underestimate eusi mesin molekular parasit.Conto molekul leutik nunjukkeun kumaha urang tiasa mopohokeun inovasi anu paling pinter dina struktur molekul parasit anu tiasa masihan aranjeunna kagiatan biologis anyar.
Kalawan babarengan, hasil ieu ngaronjatkeun pamahaman urang ngeunaan béda antara struktur molekul organisme host-diwatesan jeung counterparts maranéhanana dina organisme hirup bébas.Urang némbongkeun yén mesin molekular, lila panginten bakal ngurangan, degenerate, sarta tunduk kana rupa mutasi debilitating, tinimbang boga susunan sistimatis overlooked fitur struktural mahiwal.
Di sisi séjén, fragmen rRNA non-bulky jeung fragmen ngahiji nu urang kapanggih dina ribosom of E. cuniculi nunjukkeun yén réduksi génom bisa ngarobah malah eta bagian tina mesin molekular dasar nu dilestarikan dina tilu domain kahirupan - sanggeus ampir 3,5 milyar taun.évolusi bebas spésiés.
Fragmén rRNA anu henteu bonjolan sareng ngahiji dina ribosom E. cuniculi anu dipikaresep hususna dina terang tina studi saméméhna ngeunaan molekul RNA dina baktéri éndosimbiotik.Contona, dina aphid endosymbiont Buchnera aphidicola, rRNA jeung tRNA molekul geus ditémbongkeun mibanda struktur sénsitip suhu alatan bias komposisi A + T jeung proporsi tinggi pasangan basa non-kanonical20,50.Parobahan RNA ieu, kitu ogé parobahan molekul protéin, ayeuna dianggap tanggung jawab overdependence of endosymbionts on mitra sarta henteu mampuh endosymbionts mindahkeun panas 21, 23 .Sanajan microsporidia rRNA parasit boga parobahan struktural béda, sipat parobahan ieu nunjukkeun yén ngurangan stabilitas termal jeung gumantungna luhur protéin chaperone bisa jadi ciri umum molekul RNA dina organisme kalawan génom ngurangan.
Di sisi anu sanés, struktur urang nunjukkeun yén microsporidia parasit parantos mekarkeun kamampuan unik pikeun nolak rRNA sareng fragmen protéin anu dilestarikan sacara lega, ngembangkeun kamampuan ngagunakeun métabolit leutik anu loba pisan sareng sayogi salaku mimik struktural rRNA degenerasi sareng fragmen protéin.Degradasi struktur molekular..Pendapat ieu dirojong ku kanyataan yén molekul leutik anu ngimbangan leungitna fragmen protéin dina rRNA sareng ribosom E. cuniculi ngabeungkeut résidu spésifik microsporidia dina protéin uL15 sareng eL30.Ieu nunjukkeun yén beungkeutan molekul leutik kana ribosom bisa jadi produk tina seleksi positif, nu mutasi husus Microsporidia dina protéin ribosom geus dipilih pikeun kamampuhan maranéhna pikeun ngaronjatkeun afinitas ribosom pikeun molekul leutik, nu bisa ngakibatkeun organisme ribosom leuwih efisien.Papanggihan ieu ngungkabkeun inovasi pinter dina struktur molekular parasit mikroba sareng masihan urang pamahaman anu langkung saé ngeunaan kumaha struktur molekular parasit ngajaga fungsina sanaos évolusi réduktif.
Ayeuna, idéntifikasi molekul leutik ieu tetep can écés.Teu jelas naha penampilan molekul leutik ieu dina struktur ribosom béda antara spésiés microsporidia.Dina sababaraha hal, teu jelas naha beungkeutan nukléotida dititénan dina ribosom of E. cuniculi na P. locustae, sarta henteu dina ribosom of V. necatrix, sanajan ayana résidu F170 dina eL20 na K172 protéin V. necatrix.Hapusan ieu bisa jadi dibalukarkeun ku résidu 43 uL6 (lokasina padeukeut jeung saku nukléotida mengikat), nu tirosin dina V. necatrix teu threonine dina E. cuniculi jeung P. locustae.Ranté samping aromatik Tyr43 anu ageung tiasa ngaganggu beungkeutan nukléotida kusabab tumpang tindihna sterik.Alternatipna, ngahapus nukléotida katempo bisa jadi alatan resolusi low tina cryo-EM Imaging, nu hinders modeling V. necatrix fragmen ribosom.
Di sisi séjén, karya urang nunjukkeun yén prosés buruk génom bisa jadi hiji kakuatan inventive.Khususna, struktur ribosom E. cuniculi nunjukkeun yén leungitna rRNA sareng fragmen protéin dina ribosom microsporidia nyiptakeun tekanan évolusionér anu nyababkeun parobahan dina struktur ribosom.Varian ieu lumangsung jauh ti situs aktif ribosom jeung muncul pikeun mantuan ngajaga (atawa mulangkeun) rakitan ribosom optimal nu disebutkeun bakal kaganggu ku rRNA ngurangan.Ieu nunjukkeun yén hiji inovasi utama ribosom microsporidia sigana geus mekar jadi kabutuhan panyangga gén drift.
Panginten ieu paling saé digambarkeun ku beungkeutan nukléotida, anu teu acan kantos dititénan dina organisme sanés dugi ka ayeuna.Kanyataan yén résidu nukléotida-ngariung aya dina microsporidia has, tapi teu di eukariota séjén, nunjukkeun yén situs nukléotida-ngariung lain ngan titilar ngantosan leungit, atawa situs ahir rRNA disimpen deui kana wangun nukléotida individu.Gantina, situs ieu sigana kawas fitur mangpaat anu bisa geus mekar ngaliwatan sababaraha rounds pilihan positif.Situs beungkeutan nukléotida bisa jadi hasil samping tina seléksi alam: sakali ES39L didegradasi, microsporidia kapaksa neangan santunan pikeun mulangkeun biogenesis ribosom optimal dina henteuna ES39L.Kusabab nukléotida ieu bisa meniru kontak molekul nukléotida A3186 dina ES39L, molekul nukléotida jadi blok wangunan ribosom, nu beungkeutan nu salajengna ningkat ku mutasi runtuyan eL30.
Kalawan hal ka évolusi molekular parasit intrasélular, ulikan urang némbongkeun yén gaya seleksi alam Darwinian jeung drift genetik buruk génom teu beroperasi dina paralel, tapi osilasi.Kahiji, drift genetik ngaleungitkeun fitur penting biomolekul, sahingga santunan kacida diperlukeun.Ngan nalika parasit nyugemakeun kabutuhan ieu ngaliwatan seléksi alam Darwinian, makromolekul maranéhanana boga kasempetan pikeun ngamekarkeun sipat paling impressive tur inovatif maranéhanana.Anu penting, évolusi situs beungkeutan nukléotida dina ribosom E. cuniculi nunjukkeun yén pola évolusi molekular leungitna-ka-keuntungan ieu sanés ngan ukur amortize mutasi anu ngabahayakeun, tapi sakapeung masihan fungsi anu énggal dina makromolekul parasit.
Pamanggih ieu saluyu sareng téori kasatimbangan gerak Sewell Wright, anu nyatakeun yén sistem seléksi alam anu ketat ngabatesan kamampuan organisme pikeun berinovasi51,52,53.Sanajan kitu, lamun drift genetik disrupts seléksi alam, drifts ieu bisa ngahasilkeun parobahan nu sorangan teu adaptif (atawa malah detrimental) tapi ngakibatkeun parobahan salajengna nu nyadiakeun kabugaran luhur atawa aktivitas biologis anyar.Kerangka kami ngadukung ide ieu ku ngagambarkeun yén jinis mutasi anu sami anu ngirangan lipatan sareng fungsi biomolekul sigana mangrupikeun pemicu utama pikeun perbaikanna.Saluyu sareng modél évolusionér win-win, panilitian kami nunjukkeun yén buruk génom, sacara tradisional ditingali salaku prosés degeneratif, ogé mangrupikeun panggerak utama inovasi, sakapeung sareng bahkan sering ngamungkinkeun makromolekul nyandak kagiatan parasit anyar.tiasa nganggo aranjeunna.