Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com. Anjeun nganggo versi browser kalayan dukungan CSS kawates. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer). Sajaba ti éta, pikeun mastikeun rojongan lumangsung, urang némbongkeun situs tanpa gaya na JavaScript.
Nampilkeun carousel tilu slide sakaligus. Pake tombol Saméméhna jeung Salajengna pikeun mindahkeun ngaliwatan tilu slides dina hiji waktu, atawa make tombol geseran di ahir pikeun mindahkeun ngaliwatan tilu slides dina hiji waktu.
Organél neural ngumpul diri ngagambarkeun platform in vitro anu ngajangjikeun pikeun modél pangwangunan sareng panyakit manusa. Tapi, organoid kurang konektipitas anu aya dina vivo, anu ngabatesan maturasi sareng nyegah integrasi sareng sirkuit sanés anu ngatur paripolah. Di dieu urang nunjukkeun yén organoids cortical turunan sél stém manusa transplanted kana cortex somatosensori beurit buligir neonatal ngamekarkeun tipe sél dewasa nu ngahijikeun kana sirkuit indrawi jeung motivasi patali. MRI ngungkabkeun pertumbuhan organoid pasca-cangkok dina sababaraha garis sél sirung sareng sato, sedengkeun analisis inti tunggal ngungkabkeun kamajuan kortisogenesis sareng munculna program transkripsi anu gumantung kana kagiatan. Mémang, neuron kortikal anu ditransplantasikeun nunjukkeun sipat morfologis, sinaptik, sareng mémbran internal anu langkung kompleks tibatan pasangan in vitro, ngamungkinkeun pikeun ngadeteksi defects neuronal dina penderita sindrom Timoteus. Nyukcruk anatomis sareng fungsional nunjukkeun yén organél anu ditransplantasikeun nampi input thalamocortical sareng corticocortical, sareng rekaman vivo kagiatan saraf nunjukkeun yén input ieu tiasa ngahasilkeun réspon indrawi dina sél manusa. Tungtungna, organoids cortical manjangkeun axons sakuliah otak beurit, sarta aktivasina optogenetic maranéhanana ngabalukarkeun kabiasaan-néang ganjaran. Ku kituna, neuron cortex manusa transplanted dewasa sarta ilubiung dina sirkuit host urang nu ngadalikeun kabiasaan. Kami ngarepkeun pendekatan ieu ngagampangkeun deteksi fénotip tingkat untaian dina sél turunan pasien anu teu tiasa dideteksi ku cara anu sanés.
Otak manusa anu ngembang nyaéta prosés ngatur diri anu luar biasa dimana sél-sél ngalobaan, ngabédakeun, migrasi, sareng nyambung pikeun ngabentuk sirkuit neuronal fungsional anu salajengna disampurnakeun ngaliwatan pangalaman indrawi. Masalah konci dina pamahaman ngembangkeun otak manusa, utamana dina konteks kasakit, nyaéta kurangna aksés ka jaringan otak. Organél anu ngatur diri, kalebet organoid korteks manusa (hCO; ogé katelah sphere cortex manusa), tiasa ngahasilkeun 2,3,4,5,6. Nanging, sababaraha watesan ngabatesan aplikasi anu langkung lega pikeun ngartos pamekaran sareng fungsi sirkuit saraf. Khususna, henteu écés naha maturasi hCO dibatesan ku henteuna input microenvironmental sareng indrawi anu aya dina vivo. Salaku tambahan, sabab hCOs henteu diintegrasikeun kana sirkuit anu tiasa ngahasilkeun hasil paripolah, utilitasna dina modeling gangguan neuropsychiatric sacara genetik sareng paripolah ayeuna terbatas.
Transplantasi hCO kana otak hirup gembleng tiasa ngatasi watesan ieu. Studi saméméhna geus ditémbongkeun yén neuron manusa transplanted kana cortex rodénsia anu bisa salamet, proyék, sarta komunikasi jeung sél rodénsia7,8,9,10,11,12. Sanajan kitu, percobaan ieu biasana dipigawé dina sato dewasa, nu bisa ngawatesan integrasi synaptic jeung axonal. Di dieu, urang ngajelaskeun paradigma cangkok dimana urang transplanted 3D hCO diturunkeun tina sél hiPS kana cortex somatosensory primér (S1) beurit immunodeficient dina tahap awal ngembangkeun plastik. Neuron hCO (t-hCO) anu ditransplantasi ngalaman maturasi anu ageung, nampi input thalamocortical sareng cortical-cortical anu nyababkeun réspon indrawi, sareng manjangkeun unjuran axonal kana otak beurit pikeun ngajalankeun paripolah milarian ganjaran. Ngalegaan maturation of t-hCO geus ngungkabkeun defects neuronal di penderita sindrom Timoteus (TS), gangguan genetik parna disababkeun ku mutasi dina tegangan-sénsitip L-tipe CaV1.2 saluran kalsium (disandi ku CACNA1C).
Pikeun diajar neuron cortical manusa dina sirkuit di vivo, urang stereotactically transplanted 3D hCO gembleng kana S1 beurit athymic postnatal mimiti (poé 3-7 postnatally) (Gbr. 1a jeung data dimekarkeun tina Gbr. 1a-c). Dina titik ieu, projections axonal thalamocortical na corticocortical teu acan réngsé innervation S1 maranéhanana (ref. 13). Ku kituna, pendekatan ieu dirancang pikeun maksimalkeun pungsi integrasi t-hCO bari ngaminimalkeun dampak dina sirkuit endogenous. Pikeun visualize lokasi t-hCO dina sato hirup, urang dipigawé T2-weighted rekonstruksi otak MRI beurit 2-3 bulan sanggeus cangkok (Gbr. 1b jeung data nambahan, Gbr. 1d). t-hCO gampang dititénan jeung pangukuran volume t-hCO sarua jeung nu diitung tina irisan maneuh (Extended Data Gbr. 1d,e; P > 0.05). t-hCO gampang dititénan jeung pangukuran volume t-hCO sarua jeung nu diitung tina irisan maneuh (Extended Data Gbr. 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (рассид срезов) 1d, e; P> 0,05). t-hCO gampang dititénan, sarta ukuran t-hCO volumetric sarua jeung nu diitung keur bagian tetep (data dimekarkeun, Gbr. 1d, e; P> 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d,e；P > 0.05）.很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (рассид срезов) 1d, e; P> 0,05). t-hCO gampang dititénan, sarta ukuran t-hCO volumetric sarua jeung nu diitung keur bagian tetep (data dimekarkeun, Gbr. 1d, e; P> 0,05).Kami nangtukeun t-hCO dina 81% sato anu dicangkokkeun sakitar 2 bulan saatos cangkok (n = 72 sato; hCO tina 10 garis sél hiPS; garis sél hiPS dina Tabel Tambahan 1). Tina ieu, 87% lokasina di cortex cerebral (Gbr. 1c). Ku ngajalankeun scan MRI serial dina sababaraha titik waktu dina beurit transplanted sarua, urang kapanggih ngaronjat salapan kali lipet dina volume t-hCO dina 3 bulan (Gbr. 1d jeung data dimekarkeun, Gbr. 1f). Sato anu ditransplantasikeun ngagaduhan tingkat kasalametan anu luhur (74%) dina 12 bulan saatos cangkok (data dimekarkeun, Gbr. 1g sareng Tabel Tambahan 2), sareng henteu aya gangguan motor atanapi mémori anu jelas, gliosis, atanapi electroencephalogram (EEG) anu kapendak. Data Gbr. 1g jeung tabel tambahan 2). 1h–m jeung 3e).
a, Skématik desain ékspérimén. hCO diturunkeun tina sél hiPS ieu transplanted kana S1 beurit buligir bayi dina poé 30-60 diferensiasi. b, T2-weighted coronal na horizontal gambar MRI némbongkeun t-hCO di S1 ​​2 bulan sanggeus cangkok. Skala bar, 2 mm. c, Quantification ongkos kasuksésan engraftment ditémbongkeun keur unggal garis sél hiPS (n = 108, angka dina bar nunjukkeun jumlah t-hCO per garis sél hIPS) jeung lokasi cortical atanapi subcortical (n = 88). d, gambar MRI tina arteri koronér (kénca; skala bar, 3 mm) jeung pakait rekonstruksi volumetric 3D (skala bar, 3 mm) némbongkeun paningkatan dina t-hCO leuwih 3 bulan. e, Tinjauan pola t-hCO dina cortex cerebral beurit. Skala bar, 1 mm. f, Gambar immunocytochemical wawakil t-hCO ditémbongkeun ti kénca luhur ka katuhu (salila diferensiasi): PPP1R17 (4 bulan heubeul), NeuN (8 bulan heubeul), SOX9 na GFAP (8 bulan heubeul), PDGFRα; (8 bulan), MAP2 (8 bulan) sareng IBA1 (8 bulan). Skala bar, 20 µm. Ko-ekspresi HNA nunjukkeun sél asal manusa. g, snRNA-seq: Unified manifold and projection (UMAP) dimensionality reduction Imaging of all-quality high t-hCO nuclei after Seurat integration (n = 3 t-hCO samples, n = 2 hiPS cell lines). Astrocytes, sél tina garis astrocyte; cyc prog, sirkulasi progenitors; GluN DL, neuron glutamatergic jero; GluN DL / SP, neuron glutamatergic jero sareng sublamellar; GluN UL, neuron glutamatergic lapisan luhur; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, sél progenitor oligodendrocyte; RELN, reelin neuron. h, Gene Ontology (GO) analisis pengayaan istilah gén nyata upregulated (disaluyukeun P <0.05, robah melu> 2, dinyatakeun dina sahanteuna 10% tina inti) dina t-hCO neuron glutamatergic dibandingkeun kalawan hCO neuron glutamatergic. h, Gene Ontology (GO) analisis pengayaan istilah gén nyata upregulated (disaluyukeun P <0.05, robah melu> 2, dinyatakeun dina sahanteuna 10% tina inti) dina t-hCO neuron glutamatergic dibandingkeun kalawan hCO neuron glutamatergic. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратмоснеть ить экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическийнам . h, Gene Ontology (GO) analisis pengayaan istilah pikeun gén kalawan aktivasina signifikan (disaluyukeun P <0.05, robah melu> 2, éksprési dina sahanteuna 10% inti) dina t-hCO neuron glutamatergic dibandingkeun hCO neuron glutamatergic. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P ， 嘾整后P 5. 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 后 后 .变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 。术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайне в 1% глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ тебяониа h, gén sacara signifikan upregulated (disaluyukeun P <0.05, robah melu> 2, dinyatakeun dina sahenteuna 10% tina inti) dina t-hCO neuron glutamatergic dibandingkeun hCO glutamatergic neuron Ontological (GO) analisis istilah pengayaan.Garis dotted nunjukkeun nilai aq 0,05. abdi, Imaging UMAP tina tipe sél GluN dina t-hCO ngagunakeun mindahkeun labél tina rujukan 22 snRNA-seq set data motor cortex sawawa. CT - sél corticothalamic, ET - sél extracerebral, IT - sél telencephalic internal, NP - deukeut proyéksi.
Urang teras ditaksir cytoarchitecture sareng komposisi sélular sakabéh t-hCO. Antibodi staining sél endothelial beurit wangsit vascularization kalawan t-hCO, bari IBA1 staining wangsit ayana microglia beurit sapanjang tandur (Gbr. 1f jeung data dimekarkeun, Gbr. 3c, d). Immunostaining wangsit antigen nuklir manusa (HNA) sél positif ko-ekspresi PPP1R17 (kortikal progenitors), NeuN (neuron), SOX9 na GFAP (glial-turunan sél) atanapi PDGFRα (oligodendrocyte progenitors) (Gambar 1f). Pikeun ngulik komposisi sélulér t-hCO dina résolusi sél tunggal, urang ngalaksanakeun urutan RNA inti tunggal (snRNA-seq) saatos diferensiasi kirang langkung 8 bulan. filtration bulk sarta ngaleupaskeun inti beurit yielded 21.500 kualitas luhur peta mononuclear manusa (Gbr. 1g jeung data dimekarkeun, Gbr. 4a, b). Pola éksprési tina spidol tipe-sél has dicirikeun klaster kelas sél cortical utama, kaasup neuron glutamatergic jero tur deet, sirkulasi progenitors, oligodendrocytes, sarta nasab astrocyte (Gbr. 1g, data dimekarkeun, Gbr. 4c, sarta Table Tambahan 3). Immunostaining pikeun SATB2 na CTIP2 némbongkeun yén sanajan ayana subtypes cortical, t-hCO teu némbongkeun stratifikasi anatomis jelas (data dimekarkeun, Gbr. 3a). tahap-cocog snRNA-seq hCO dihasilkeun kelas sél lega sarupa, kalawan sababaraha iwal, kaasup henteuna oligodendrocytes jeung ayana neuron GABAergic, nu bisa ngagambarkeun saméméhna dilaporkeun nguntungkeun kaayaan vitro pikeun gurat cell15 progenitor (data dimekarkeun, Gbr. 4f - i jeung Table Tambahan 4). Analisis éksprési gén diferensial ngungkabkeun béda anu signifikan dina neuron glutamatergic antara t-hCO sareng hCO (Supplementary Table 5), kalebet aktivasina sét gén anu aya hubunganana sareng maturation neuronal sapertos signalling synaptic, lokalisasi déndritik, sareng kagiatan saluran tegangan-gated (Gambar 1h sareng Tabel Tambahan 5). tabél 6). Sasuai, neuron t-hCO glutamatergic cortical nunjukkeun maturasi transkripsi anu gancangan.
Pikeun ngajelaskeun naha parobihan transkripsi dina t-hCO ieu aya hubunganana sareng bédana morfologis antara hCO in vitro sareng t-hCO in vivo, kami ngarékonstruksi deui hCO sareng hCO anu dieusi biocytin anu cocog sareng hCO dina bagian akut saatos 7-8 bulan diferensiasi. neuron hCO (Gbr. 2a). neuron t-hCO nyata leuwih badag, miboga 1,5 kali diaméter soma, dua kali saloba dendrites, sarta sakabéh kanaékan genep kali ganda dina total panjang déndritik dibandingkeun in vitro hCO (Gbr. 2b). Sajaba ti éta, urang observasi dénsitas nyata luhur spines déndritik dina t-hCO neuron ti di hCO neuron (Gbr. 2c). Ieu nunjukkeun yén neuron t-hCO ngalaman elongation déndritik éksténsif jeung branching, nu, dina kombinasi kalayan proliferasi sél terus, bisa nyumbang kana tumuwuhna intensif t-hCO sanggeus cangkok (Gbr. 1d jeung Extended Data Gbr. 1f). Ieu ngajurung urang pikeun nalungtik sipat éléktrofisiologis. capacitance mémbran éta dalapan kali leuwih luhur (data dimekarkeun, Gbr. 8d), poténsi mémbran resting-kaayaan éta leuwih hyperpolarized (kira 20 mV), sarta suntik ayeuna ngainduksi laju éksitasi maksimum luhur di neuron t-hCO ti di neuron hCO. in vitro (Gbr. 2d), e), nu konsisten jeung fitur morfologis badag tur leuwih kompleks t-hCO. Sajaba ti éta, frékuénsi éksitatoris spontan kajadian postsynaptic ayeuna (EPSC) éta nyata luhur di neuron t-hCO (Gbr. 2f), suggesting yén ngaronjat dénsitas spines déndritik observasi dina neuron t-hCO ieu pakait sareng excitability hanca. sinaps seksual. Urang dikonfirmasi karakter immature tina neuron hCO in vitro ku ngarekam dilabélan neuron glutamatergic (data dimekarkeun, Gbr. 6a-c).
a, rekonstruksi 3D tina biocytin-kaeusi hCO jeung t-hCO neuron sanggeus 8 bulan diferensiasi. b, Kuantifikasi fitur morfologis (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 jeung *** P <0.0001). b, Kuantifikasi fitur morfologis (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 jeung *** P <0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,001). b, kuantifikasi fitur morfologis (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, sarta *** P <0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和 。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和 。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,001). b, kuantifikasi fitur morfologis (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, sarta *** P <0.0001).c, rekonstruksi 3D of hCO jeung t-hCO cabang déndritik sanggeus 8 bulan diferensiasi. Asterisk beureum nunjukkeun spines déndritik putative. Kuantifikasi dénsitas tulang tonggong déndritik (n = 8 neuron hCO, n = 6 neuron t-hCO; ** P = 0.0092). d, Kuantifikasi poténsi mémbran istirahat (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). d, Kuantifikasi poténsi mémbran istirahat (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0.0001). d, kuantitas poténsi mémbran istirahat (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0.0001). d, kuantitas poténsi mémbran istirahat (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). e, Potensi aksi repetitive tembak di hCO jeung t-hCO ngainduksi ku ngaronjatna injections ayeuna, sarta kuantifikasi tina laju firing maksimum (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). e, Potensi aksi repetitive tembak di hCO jeung t-hCO ngainduksi ku ngaronjatna injections ayeuna, sarta kuantifikasi tina laju firing maksimum (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия di hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка мальксим возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0.0001). e, potensi aksi ulang tembak di hCO jeung t-hCO ngainduksi ku kanaékan arus jeung kuantitas laju firing maksimum (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量区 = 5 CO2神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （n （n5（n ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） . e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественкамламольный скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0.0001). e, repetitive firing of hCO jeung t-hCO potentials Peta ngainduksi ku ngaronjat suplai ayeuna jeung kuantitas laju firing maksimum (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). f, Spontan EPSCs (sEPSCs) dina hCO sareng t-hCO neuron dina 8 bulan diferensiasi, sareng kuantifikasi frékuénsi kajadian sinaptik (n = 25 hCO neuron, n = 17 t-hCO neuron; *** P <0.0001). f, EPSCs spontan (sEPSCs) dina hCO jeung t-hCO neuron dina 8 bulan diferensiasi, sarta kuantifikasi frékuénsi kajadian synaptic (n = 25 hCO neuron, n = 17 t-hCO neuron; *** P <0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) dina нейронах hCO jeung t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частотыч синтич = 5 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; f, Spontan EPSCs (sEPSCs) dina hCO sareng t-hCO neuron dina 8 bulan diferensiasi sareng kuantifikasi tingkat kajadian sinaptik (n = 25 hCO neuron, n = 17 t-hCO neuron; *** P <0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n = 神频率的量化5（n 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼2（n神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) dina нейронах hCO jeung t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частотыч синтич = 5 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSCs spontan (sEPSCs) dina hCO jeung t-hCO neuron dina 8 bulan diferensiasi jeung kuantifikasi ongkos acara synaptic (n = 25 hCO neuron, n = 17 t-hCO neuron; *** P <0.0001).Pikeun bf, hCO jeung t-hCO dina garis 1208-2 dicokot tina bets diferensiasi sarua dijaga dina paralel. g, Gene set analisis pengayaan (tes pasti Fisher hiji sisi) gén nyata upregulated (disaluyukeun P <0.05, robah melu> 2, dinyatakeun dina sahanteuna 10% tina inti) dina t-hCO neuron glutamatergic dibandingkeun jeung hCO glutamatergic hCO kalawan set gén duanana mimiti-response-response (ERG) jeung gén telat-response gén (ERG) diidentifikasi ku neuron telat-respons (ERG). study16 mouse sareng LRGs khusus manusa tina neuron in vitro17. g, Gene set analisis pengayaan (tes pasti Fisher hiji sisi) gén nyata upregulated (disaluyukeun P <0.05, robah melu> 2, dinyatakeun dina sahanteuna 10% tina inti) dina t-hCO neuron glutamatergic dibandingkeun jeung hCO glutamatergic hCO kalawan set gén duanana mimiti-response-response (ERG) jeung gén telat-response gén (ERG) diidentifikasi ku neuron telat-respons (ERG). study16 mouse sareng LRGs khusus manusa tina neuron in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скор0рыть, ректироть) изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению стергимита стергимита hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в иванных в иснисла в иснисла 6 и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, analisa set pengayaan gen (uji pasti Fisher hiji-buntut) tina gén kalayan aktivasina anu signifikan (disaluyukeun P<0.05, robahan lipet> 2, éksprési sahenteuna 10% inti) dina neuron glutamatergic t-hCO dibandingkeun sareng hCO glutamatergic neuron sét duanana awal (ERG) sareng telat (LRG) aktivitas manusa diidentifikasi dina-genep-genep (LRG) 1. LRGs tina neuron in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 元 上调 0. ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因 的 基因 璌 16神经元 17 中 中 17 17 的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейскими нейронами hCO P<0,05, кратность изменения> 2, tanpa менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишетра) позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и in vivo16 и нейнефич для человека. g, t-hCO neuron glutamatergic nyata upregulated dibandingkeun hCO neuron glutamatergic (disaluyukeun P<0.05, melu robah> 2, sahenteuna 10% réspon awal (ERG) jeung telat respon analisis pengayaan gén (test Fisher urang pasti hiji-buntut) gén gumantung aktivitas respon (LRGs) dicirikeun dina vivo vitro LRG husus neuron16.Garis dotted nunjukkeun nilai P Bonferroni-dilereskeun 0,05. h, éksprési gén GluN (pseudo-pakét sareng skala unggal gén) sacara signifikan ditingkatkeun dina réplika snRNA-seq gén LRG dina neuron glutamatergic t-hCO. abdi, immunostaining némbongkeun éksprési SCG2 di t-hCO (luhur) jeung hCO (handap) neuron. Panah bodas nunjuk ka sél SCG2+. Skala bar, 25 µm. Data dikedalkeun salaku rata-rata ± simpangan baku.
Dumasar kanaékan kagiatan t-hCO dititénan dina irisan ex vivo, snRNA-seq ngungkabkeun hiji upregulation gumantung aktivitas transkrip gén dina t-hCO dibandingkeun hCO in vitro. Neuron t-hCO glutamatergic dikedalkeun tingkat luhur gén régulasi aktivitas respon telat (Gbr. 2g, h), nu kapanggih dina studi saméméhna dina mouse jeung neurons16,17 manusa. Contona, BDNF18, SCG2, sarta OSTN, gén régulasi aktivitas primata-spésifik, némbongkeun éksprési ngaronjat dina neuron t-hCO dibandingkeun neuron hCO (Gbr. 2g-i). Ku kituna, t-hCO neuron némbongkeun ciri maturation ditingkatkeun dibandingkeun neuron hCO ku transcriptional, morfologis, sarta analisis fungsional.
Jang meberkeun evaluate pakaitna t-hCO maturation kalawan ngembangkeun otak manusa, urang ngalakukeun babandinganana transcriptomic of fétus jeung sawawa sél cortical types19,20 na adult21,22 ogé data éksténsif dina gén cortical expression23 salila ngembangkeun (data dimekarkeun, Gbr. 5). ). kalawan gawé saméméhna 24, status maturation transcriptome hCO jeung t-hCO global dina 7-8 bulan diferensiasi sacara lega konsisten kalayan dina waktos ngembangkeun vivo sarta paling sarua jeung kahirupan fétal telat (Data Extended Gbr. 5a). Utamana, urang katalungtik ngaronjat kematangan transcriptome di t-hCO dibandingkeun umur-cocog hCO, kitu ogé aktivasina transcriptome pakait sareng synaptogenesis, astrogenesis, sarta myelination (data dimekarkeun, Gbr. 5b-d). Dina tingkat sélulér, urang mendakan bukti subtipe korteks anu langkung ipis dina t-hCO, kalayan klaster neuron glutamatergic tumpang tindih sareng subtipe neuron L2 / 3, L5, sareng L6 sawawa (Gambar 1i). Kontras, tumpang tindihna klaster antara neuron t-hCO glutamatergic sareng neuron kortikal fétal langkung kawates dina pertengahan kakandungan (data dimekarkeun, Gambar 5e-j). Pikeun nangtukeun naha t-hCO neuron fungsional sarua jeung neuron neocortical postnatal manusa, urang ngalakukeun rekaman electrophysiological sarta rekonstruksi anatomis tina L2 / 3 neuron pyramidal manusa dina bagian seukeut tina cortex postnatal manusa (data dimekarkeun, Gbr. 7a). Sipat electrophysiological of L2 / 3 neuron pyramidal éta sarupa pamadegan neuron pyramidal t-hCO (data dimekarkeun, Gbr. 7e). Morphologically, L2 / 3 neuron tina sampel manusa postnatal éta leuwih sarupa t-hCO ti hCO, sanajan L2 / 3 sél leuwih panjang, ngandung leuwih cabang sakabéh, sarta miboga dénsitas tulang tonggong luhur (Gbr. 3g jeung data dimekarkeun, Gbr. 7b-). G).
a, cangkok hCO dihasilkeun ku kontrol jeung TS hiPS garis sél kana beurit neonatal. b, rekonstruksi 3D tina biocytin-kaeusi t-hCO neuron sanggeus 8 bulan diferensiasi. c, kuantifikasi mean panjang déndritik (n = 19 kontrol neuron, n = 21 TS neuron; ** P = 0.0041). d, 3D-rekonstruksi cabang déndritik tina kontrol jeung TS t-hCO di 8 bulan diferensiasi, sarta kuantifikasi dénsitas tulang tonggong déndritik (n = 16 kontrol neuron, n = 21 TS neuron, *** P <0.0001). d, 3D-rekonstruksi cabang déndritik tina kontrol jeung TS t-hCO di 8 bulan diferensiasi, sarta kuantifikasi dénsitas tulang tonggong déndritik (n = 16 kontrol neuron, n = 21 TS neuron, *** P <0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественнка стонка дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0.0001). d, rekonstruksi 3D cabang déndritik tina kontrol jeung t-hCO TS dina 8 bulan diferensiasi jeung déndritik tulang tonggong kuantifikasi dénsitas (n = 16 kontrol neuron, n = 21 TS neuron, *** P <0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 个女21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 ／化 6元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001）. d, 3D-rekonsistensi дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная отнхисти шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0.0001). d, rekonstruksi 3D kontrol cabang déndritik jeung TS t-hCO di 8 bulan diferensiasi jeung déndritik tulang tonggong kuantifikasi dénsitas (n = 16 kontrol neuron, n = 21 TS neuron, *** P <0.0001).Asterisk beureum nunjukkeun spines déndritik putative. e, EPSCs spontan dina kontrol jeung TS t-hCO neuron sanggeus 8 bulan diferensiasi. f, plot frékuénsi kumulatif jeung kuantifikasi frékuénsi sarta amplitudo kajadian synaptic (n = 32 neuron kontrol, n = 26 TS neuron; ** P = 0.0076 jeung P = 0.8102). g, Analisis Scholl of TS jeung kontrol neuron di hCO jeung t-hCO. Garis putus-putus nunjukkeun neuron pyramidal postnatal L2 / 3 manusa pikeun babandingan (n = 24 kontrol t-hCO neuron, n = 21 TS t-hCO neuron, n = 8 kontrol hCO neuron, sareng n = 7 TS hCO neuron). Data dikedalkeun salaku rata-rata ± simpangan baku
Kamampuhan t-hCO pikeun ngayakeun réplikasi fitur morfologis sareng fungsional neuron cortex manusa dina tingkat anu luhur ngajurung urang pikeun ngajalajah naha t-hCO tiasa dianggo pikeun ngadeteksi phenotypes panyakit. Urang difokuskeun TS, gangguan neurodevelopmental parna disababkeun ku mutasi gain-of-fungsi dina gén encoding CaV1.2, nu initiates transkripsi gén gumantung aktivitas dina neuron. Kami nampi hCO tina tilu pasien TS mawa substitusi anu paling umum (p.G406R) sareng tilu kontrol (Gbr. 3a). Saatos cangkok, urang manggihan yén morfologi déndritik ieu dirobah dina neuron TS dibandingkeun kadali (Gbr. 3b jeung data dimekarkeun, Gbr. 8a, b), kalawan kanaékan dua kali lipet dina jumlah dendrites primér sarta paningkatan sakabéh mean jeung sakabéh panurunan dina panjang déndritik (Gbr. 3c jeung data nambahan, Gbr. 8c). Ieu pakait sareng ngaronjat dénsitas spines sarta ngaronjat frékuénsi EPSCs spontan dina TS dibandingkeun kontrol neuron (Gbr. 3d-f jeung data dimekarkeun, Gbr. 8g). Analisis salajengna ngungkabkeun pola branching déndritik abnormal dina t-hCO TS dibandingkeun kontrol, tapi teu in vitro TS hCO dina tahap sarupa diferensiasi (Gbr. 3g). Ieu konsisten sareng laporan saméméhna kami ngeunaan shrinkage dendritik anu gumantung kana kagiatan di TS sareng nyorot kamampuan platform cangkok ieu pikeun ngadeteksi phenotypes panyakit dina vivo.
Urang teras naroskeun kana naon sél t-hCO sacara fungsional diintegrasikeun kana beurit S1. S1 dina rodénsia narima inputs synaptic kuat ti ipsilateral véntral basal jeung posterior inti thalamic, kitu ogé motor ipsilateral jeung sékundér somatosensory cortices, sarta contralateral S1 (Gbr. 4a). Pikeun mulangkeun pola innervation, urang kainféksi hCO ku virus rabies-dG-GFP/AAV-G jeung transplanted hCO kana beurit S1 3 poé sanggeusna. Urang observasi éksprési GFP padet dina neuron tina S1 ipsilateral jeung véntral basal ganglia 7-14 poé sanggeus cangkok (Gbr. 4b, c). Salaku tambahan, pewarnaan antibodi tina spidol talamus netrin G1 ngungkabkeun ayana tungtung thalamic dina t-hCO (Gbr. 4d, e). Pikeun meunteun naha unjuran afferent ieu tiasa nyababkeun réspon sinaptik dina sél t-hCO, kami ngalaksanakeun rékaman sél sadayana tina sél manusa dina bagian anu seukeut tina lapisan thalamocortical. Stimulasi listrik beurit S1, kapsul internal, zat bodas, serat caket t-hCO atanapi aktivasina optogenetik tina opsin-ekspresi thalamic thalamic dina t-hCO ngainduksi short-latency EPSCs dina neuron t-hCO kakeunaan antagonis reséptor AMPA NBQX. (Gbr. 4f, g jeung data nambahan, Gbr. 9a-g). Data ieu nunjukkeun yén t-hCO sacara anatomis terpadu kana otak beurit sareng tiasa diaktipkeun ku jaringan host beurit.
a, diagram Schematic tina percobaan nyukcruk rabies. b, GFP sareng ekspresi STEM121 khusus manusa antara t-hCO sareng cortex cerebral beurit (panel luhur). Ogé ditémbongkeun téh ekspresi GFP dina beurit ipsilateral véntral basal inti (VB) (handap kénca) jeung ipsilateral S1 (handap katuhu). Skala bar, 50 µm. Kuadrat beureum ngalambangkeun daérah otak dimana gambar dicandak. c, kuantifikasi sél nganyatakeun GFP (n = 4 beurit). d, e - Netrin G1 + terminal thalamic dina t-hCO. d nembongkeun bagian koronal ngandung inti t-hCO jeung VB. Skala bar, 2 mm. e nunjukkeun ekspresi Netrin G1 sareng STEM121 dina neuron t-hCO (kénca) sareng VB (katuhu). Skala bar, 50 µm. Garis dotted oranyeu nunjukkeun wates t-hCO. f, g, ngambah ayeuna t-hCO neuron sanggeus stimulasi listrik dina beurit S1 (f) atawa kapsul internal (g), kalawan (ungu) atawa tanpa (hideung) NBQX (kénca). Amplitudo EPSC sareng sareng tanpa NBQX (n = 6 neuron S1, * P = 0.0119; sareng n = 6 neuron kapsul internal, ** P = 0.0022) (puseur). Persentase neuron t-hCO nunjukkeun EPSC pikeun ngaréspon stimulasi listrik beurit S1 (f) atanapi kapsul internal (g) (katuhu). aCSF, cairan cerebrospinal jieunan. h, diagram skéma tina percobaan pencitraan 2P (kénca). Ekspresi GCaMP6s dina t-hCO (tengah). Skala bar, 100 µm. Selang waktos fluoresensi GCaMP6s (katuhu). abdi, Z-skor aktivitas spontan fluoresensi. j, ilustrasi skéma tina stimulasi kumis. k, lintasan fluoresensi 2P skor z dina hiji percobaan, saluyu sareng simpangan kumis dina waktos nol (garis putus-putus) dina sél conto. l, réspon z-skor rata-rata populasi sadaya sél saluyu sareng simpangan kumis dina waktos enol (garis putus-putus) (beureum) atanapi cap waktos anu dihasilkeun sacara acak (abu). m. Skéma diagram percobaan dina nyirian optik. n, kurva tegangan atah tina conto sél t-hCO salila stimulasi laser biru atawa deflection kumis. Panah beureum nunjukkeun paku mimiti disababkeun ku cahaya (luhureun) atawa disababkeun ku deflection kumis (handap). Shading abu nunjukkeun période defleksi kumis. o, Bentuk gelombang cahaya puncak sareng réspon defleksi kumis. p, paku tina usaha tunggal, Blok jeung simpangan tina kumis dina sél conto. 0 nunjukkeun simpangan kumis (garis putus-putus). q, rata-rata populasi laju tembak z-skor pikeun sakabéh sél photosensitive, dijajarkeun jeung simpangan kumis dina waktu enol (garis putus-putus) (beureum) atawa timestamp dihasilkeun acak (abu). r, Proporsi unit photosensitive nyata dimodulasi ku simpangan kumis (n = 3 beurit) (kénca). Puncak latensi z-skor (n = 3 beurit; n = 5 (héjo lampu), n = 4 (héjo poék), sareng n = 4 (cyan) unit modulasi defleksi kumis per beurit) (katuhu). Data dikedalkeun salaku rata-rata ± simpangan baku
Kami teras naroskeun naha t-hCO tiasa diaktipkeun ku rangsangan indrawi in vivo. Urang transplanted hCO nganyatakeun indikator kalsium disandikeun genetik GCaMP6 kana beurit S1. Saatos 150 dinten, urang ngalaksanakeun serat fotometri atanapi dua-foton kalsium Imaging (Gbr. 4h jeung data dimekarkeun, Gbr. 10a). Kami mendakan yén sél t-hCO nunjukkeun kagiatan ritmik anu disingkronkeun (Gambar 4i, Data Dilegaan, Gambar 10b sareng Video Suplemén 1). Pikeun characterize aktivitas t-hCO puncak, urang ngalakukeun rekaman electrophysiological extracellular di beurit cangkok anesthetized (data dimekarkeun, Gbr. 10c-f). Kami geus dihasilkeun koordinat stereotaxic tina gambar MRI; sahingga, unit kacatet ieu ngagambarkeun neuron manusa putative, najan electrophysiology nyalira teu ngidinan hiji spésiés asalna ditangtukeun. Urang observasi bursts nyingkronkeun tina aktivitas (data dimekarkeun, Gbr. 10d). The bursts lumangsung ngeunaan 460 mdet sarta dipisahkeun ku période tiiseun ngeunaan 2 s (data dimekarkeun, Gbr. 10d, e). Unit individu dipecat rata-rata ngeunaan tilu rounds per burst, nu kira 73% tina unit didaptarkeun per burst. Kagiatan unit individu anu kacida correlated, sarta correlations ieu leuwih luhur ti pamadegan unit dicirikeun dina sato unvaccinated dirékam dina kaayaan anu sarua (data dimekarkeun, Gbr. 10f). Jang meberkeun ciri réspon spike tina neuron anu diturunkeun manusa anu diidentifikasi, urang ngalaksanakeun percobaan tagging lampu dina beurit anesthetized transplanted kalawan hCO nganyatakeun saluran kation rhodopsin 2 (hChR2 sénsitip-cahaya), ngaliwatan nu t-hCO neuron short-latency pangakuan (kirang ti 10 ms) dina respon kana stimulasi cahaya biru (Fig.4im-Fi). neuron t-hCO exhibited bursts tina aktivitas spontan dina frékuénsi sarupa nu observasi dina kalsium Imaging, kitu ogé rékaman electrophysiological dipigawé dina t-hCO dina henteuna lampu nyirian (data dimekarkeun, Gbr. 10c-g). Henteu aya kagiatan spontan anu dititénan dina tahap saluyu hCO dirékam in vitro. Pikeun assess naha t-hCO bisa diaktipkeun ku rangsangan indrawi, urang sakeudeung deflected kumis beurit jauh ti t-hCO (Gbr. 4j, m jeung data nambahan, Gbr. 10h, k). Numutkeun studi saméméhna8,10, sawaréh sél t-hCO némbongkeun ngaronjat aktivitas dina respon kana deflection kumis, nu teu katalungtik lamun data dibandingkeun jeung perangko waktu acak (Gbr. 4k-q jeung data dimekarkeun, Gbr. 10h-q). Mémang, sakitar 54% tina unit tunggal anu dilabélan opto nunjukkeun tingkat gairah anu ningkat sacara signifikan saatos stimulasi kumis, puncakna sakitar 650 mdet (Gbr. 4r). Dihijikeun, data ieu nunjukkeun yén t-hCO nampi input fungsional anu pas sareng tiasa diaktipkeun ku rangsangan lingkungan.
Urang lajeng nalungtik naha t-hCO bisa ngaktipkeun sirkuit di beurit pikeun ngadalikeun kabiasaan. Urang mimiti nalungtik naha axons tina t-hCO neuron proyék kana jaringan sabudeureun beurit. Urang kainféksi hCO ku lentivirus encoding hChR2 ngahiji jeung EYFP (hChR2-EYFP). Sanggeus 110 poé, urang observasi ekspresi EYFP di wewengkon cortical ipsilateral, kaasup auditory, motor, sarta cortices somatosensori, kitu ogé di wewengkon subcortical, kaasup striatum, hippocampus, sarta thalamus (Gbr. 5a). Pikeun meunteun naha unjuran efferent ieu tiasa nyababkeun réspon sinaptik dina sél beurit, urang sacara optik ngaktifkeun sél t-hCO anu nyatakeun hChR2-EYFP ku ngarékam sél cortex cerebral beurit dina bagian otak anu seukeut. Aktivasina tina t-hCO axons kalawan lampu biru ngainduksi pondok-latency EPSCs di beurit pyramidal cortex neuron, nu diblokir ku NBQX (Gbr. 5b-g). Salaku tambahan, réspon ieu tiasa diblokir ku tetrodotoxin (TTX) sareng dibalikeun ku 4-aminopyridine (4-AP), nunjukkeun yén aranjeunna disababkeun ku sambungan monosynaptic (Gbr. 5e).
a, diagram Schematic tracking axon (kénca). ekspresi t-hCO EYFP (katuhu). Skala bar, 100 µm. A1, korteks auditory, ACC, cortex cingulate anterior, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diafragma, septum gurat, mPFC, cortex prefrontal medial, piri, cortex piriform, v. striatum, striatum véntral, VPM, inti ventropostomedial thalamus, VTA, wewengkon tegmental véntral. Kuadrat beureum ngalambangkeun daérah otak dimana gambar dicandak. b, diagram skéma tina percobaan stimulasi. c, d, Conto respon bulao cahaya-ngainduksi photocurrent (luhureun) jeung tegangan (handap) dina manusa (c) EYFP + t-hCO atawa beurit (d) EYFP- sél. e, f, Ngambah ayeuna neuron beurit sanggeus stimulasi lampu biru tina t-hCO axons kalawan TTX na 4-AR (héjo), TTX (abu) atanapi aCSF (hideung) (e), kalawan (Violet) atawa tanpa (hideung) ) ) NBQX (e). g, latency tina réspon ngainduksi ku lampu biru dina sél beurit (n = 16 sél); bar horizontal nunjukkeun latency rata (7,13 ms) (kénca). Amplitudo EPSCs anu dibangkitkeun cahaya dirékam nganggo atanapi tanpa NBQX (n = 7 sél; *** P <0.0001) (tengah). Amplitudo EPSCs anu dibangkitkeun cahaya dirékam nganggo atanapi tanpa NBQX (n = 7 sél; *** P <0.0001) (tengah). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (sa центре). Amplitudo EPSC anu ngainduksi cahaya dirékam nganggo atanapi tanpa NBQX (n = 7 sél; *** P <0.0001) (puseur).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）. Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (sa центре). Amplitudo EPSC anu ngainduksi cahaya dirékam nganggo atanapi tanpa NBQX (n = 7 sél; *** P <0.0001) (puseur).Persentase sél beurit anu nunjukkeun EPSC anu ngabales cahaya biru (katuhu). h, diagram Schematic tina tugas behavioral. d0, dinten 0. abdi. Performance sato exemplary dina poé 1 (kénca) atawa poé 15 (katuhu) latihan. Jumlah rata-rata licks dilakukeun dina dinten 1 (kénca) atanapi dinten 15 (tengah katuhu) (n = 150 percobaan lampu biru, n = 150 percobaan lampu beureum; *** P <0.0001). Jumlah rata-rata licks dilakukeun dina dinten 1 (kénca) atanapi dinten 15 (tengah katuhu) (n = 150 percobaan lampu biru, n = 150 percobaan lampu beureum; *** P <0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) atawa день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с = сито5ми, n с испытаний с = сито5ми испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Rata-rata jumlah licks anu dilakukeun dina dinten 1 (kénca) atanapi dinten 15 (tengah katuhu) (n = 150 percobaan lampu biru, n = 150 percobaan lampu beureum; *** P <0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) atawa день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с = сито5ми, n с испытаний с = сито5ми испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Rata-rata jumlah licks anu dilakukeun dina dinten 1 (kénca) atanapi dinten 15 (tengah katuhu) (n = 150 percobaan lampu biru, n = 150 percobaan lampu beureum; *** P <0.0001).Licks kumulatif pikeun percobaan lampu beureum jeung biru dina poé 1 (tengah kénca) atawa poé 15 (katuhu). NS, teu signifikan. j, k, Ciri paripolah sakabeh sato transplanted kalawan t-hCO keu hChR2-EYFP (j) atawa kontrol fluorophore (k) dina dinten 1 atanapi 15 (hChR2-EYFP: n = 9 beurit, ** P = 0.0049; kontrol: n = 9, P = 0.1497). l, Évolusi skor leuwih sering dipake tinimbang (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; ** P <0.001, *** P <0.0001). l, Évolusi skor leuwih sering dipake tinimbang (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; ** P <0.001, *** P <0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Évolusi skor leuwih sering dipake tinimbang (n = 9 hChR2, n = 9 kadali; ** P <0.001, *** P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Évolusi skor leuwih sering dipake tinimbang (n = 9 hChR2, n = 9 kadali; ** P <0.001, *** P <0.0001).m, éksprési FOS dina respon kana aktivasina optogenetic of t-hCO di S1. Gambar ekspresi FOS (kénca), jeung kuantifikasi (n = 3 per grup; * P <0.05, ** P <0.01 jeung *** P <0.001) (katuhu) ditémbongkeun. Gambar ekspresi FOS (kénca), jeung kuantifikasi (n = 3 per grup; * P <0.05, ** P <0.01 jeung *** P <0.001) (katuhu) ditémbongkeun. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) jeung количественного определения (n = 3 группу; * P <0,05, ** P <0,01, и *** P <0,01,001) (0,01,00) Gambar ekspresi FOS (kénca) jeung kuantifikasi (n = 3 per grup; * P <0.05, ** P <0.01, jeung *** P <0.001) ditémbongkeun (katuhu).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001））的叾）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001））的叾） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) jeung количественного определения (n = 3 группу; * P <0,05, ** P <0,01, и *** P <0,01,001) (0,01,00) Gambar ekspresi FOS (kénca) jeung kuantifikasi (n = 3 per grup; * P <0.05, ** P <0.01, jeung *** P <0.001) ditémbongkeun (katuhu).Skala bar, 100 µm. Data dinyatakeun salaku mean ± kasalahan standar BLA, basolateral amandel, MDT, dorsomedial thalamic inti, PAG, periaqueductal abu.
Tungtungna, urang naros upami t-hCO tiasa ngamodulasi paripolah beurit. Pikeun nguji ieu, urang transplanted hChR2-EYFP-ekspresi hCO kana S1, sarta 90 poé sanggeusna, urang implanted serat optik kana t-hCO pikeun pangiriman lampu. Urang lajeng ngalatih beurit ku paradigma udar operant dirobah (Gbr. 5h). Kami nempatkeun sato dina kamar uji paripolah sareng sacara acak nerapkeun stimulasi laser 5 detik biru (473 nm) sareng beureum (635 nm). Sato nampi ganjaran cai upami aranjeunna ngaletak nalika stimulasi lampu biru tapi henteu ngaletak nalika stimulasi lampu beureum. Dina dinten kahiji latihan, sato némbongkeun euweuh bédana dina licking lamun dirangsang ku lampu bulao atawa beureum. Sanajan kitu, dina dinten 15, sato transplanted kalawan hCO nganyatakeun hChR2-EYFP némbongkeun licking leuwih aktif nalika dirangsang ku lampu biru dibandingkeun stimulasi lampu beureum. Parobihan dina paripolah ngaletak ieu henteu dititénan dina sato kontrol anu ditransplantasikeun ku hCO nganyatakeun fluorophore kontrol (laju kasuksésan diajar: hChR2 89%, EYFP 0%, Gambar 5i-1 sareng Video Suplemén 2). Data ieu nunjukkeun yén sél t-hCO tiasa ngaktipkeun neuron beurit pikeun merangsang paripolah milarian ganjaran. Pikeun milari sirkuit saraf t-hCO beurit mana anu tiasa kalibet dina parobihan paripolah ieu, kami sacara optogenetik ngaktifkeun t-hCO dina sato terlatih sareng jaringan panén 90 menit engké. Imunohistokimia ngungkabkeun éksprési protéin FOS anu gumantung kana kagiatan di sababaraha daérah otak anu kalibet dina paripolah anu ngamotivasi, kalebet korteks prefrontal medial, thalamus medial, sareng zat abu periaqueductal, anu dinyatakeun dina sato kontrol anu teu dirangsang atanapi sato. béas. 5m). Dicokot babarengan, data ieu nunjukkeun yén t-hCO tiasa modulasi aktivitas neuronal beurit pikeun ngajalankeun kabiasaan.
Organoid saraf ngagambarkeun sistem anu ngajangjikeun pikeun ngulik kamekaran sareng panyakit manusa sacara in vitro, tapi aranjeunna diwatesan ku kurangna sambungan antara sirkuit anu aya dina vivo. Kami parantos ngembangkeun platform novél dimana kami mindahkeun hCO kana S1 beurit postnatal awal immunocompromised pikeun diajar ngembangkeun sél manusa sareng fungsina dina vivo. Kami parantos nunjukkeun yén t-hCO ngamekarkeun jinis sél dewasa anu henteu dititénan dina vitro28 sareng t-hCO sacara anatomis sareng fungsional terpadu kana otak rodénsia. Integrasi t-hCO kana sirkuit saraf rodénsia ngamungkinkeun urang pikeun ngadegkeun hubungan antara kagiatan sélular manusa sareng diajar paripolah sato, nunjukkeun yén neuron t-hCO tiasa ngamodulasi kagiatan neuronal beurit pikeun ngajalankeun réspon paripolah.
Platform anu kami jelaskeun ngagaduhan sababaraha kaunggulan dibandingkeun panilitian sateuacana ngeunaan transplanting sél manusa kana otak rodénsia. Kahiji, urang transplanted hCO kana cortex ngembang beurit postnatal mimiti, nu bisa mempermudah integrasi anatomis jeung fungsional. Kadua, ngawaskeun t-hCO MRI ngamungkinkeun urang pikeun diajar posisi tandur sareng kamekaran sato hirup, ngamungkinkeun urang ngalaksanakeun studi multi-sato jangka panjang sareng netepkeun réliabilitas sababaraha garis sél hiPS. Tungtungna, urang transplanted organoids gembleng, tinimbang gantung sél tunggal terasing, nu kirang ngaruksak kana sél manusa sarta bisa ngamajukeun integrasi jeung generasi neuron cortex manusa dina brains beurit.
Urang ngaku yén sanajan kamajuan dina platform ieu, temporal, spasial, sarta cross-spésiés konstrain nyegah formasi sirkuit neural manusa kalawan kasatiaan tinggi, sanajan sanggeus cangkok dina tahap awal ngembangkeun. Contona, teu jelas naha kagiatan spontan dititénan dina t-hCO ngagambarkeun phenotype developmental sarupa aktivitas rhythmic observasi salila ngembangkeun cortical, atawa naha éta alatan henteuna tipe sél suppressive hadir dina t-hCO. Nya kitu, teu jelas naon extent henteuna lamination dina t-hCO mangaruhan konektipitas ranté30. Karya hareup bakal difokuskeun ngahijikeun tipe sél lianna kayaning microglia manusa, sél endothelial manusa, sarta varying babandingan interneurons GABAergic sakumaha ditémbongkeun maké assembly 6 in vitro, kitu ogé pamahaman kumaha integrasi neural jeung ngolah bisa lumangsung dina dirobah t-hCO. tingkat transkripsi, sinaptik sareng paripolah dina sél anu dicandak ti pasien.
Gemblengna, platform in vivo ieu ngagambarkeun sumber daya anu kuat anu tiasa ngalengkepan pangwangunan otak manusa in vitro sareng panalungtikan panyakit. Kami ngarepkeun yén platform ieu bakal ngamungkinkeun urang mendakan fénotip tingkat strand novel dina sél turunan pasien anu hese dihartikeun sareng nguji strategi terapi anyar.
Kami ngahasilkeun hCO2.5 tina sél HiPS sakumaha anu dijelaskeun sateuacana. Pikeun ngamimitian produksi hCO tina sél hiPS anu dibudidayakeun dina lapisan feeder, koloni sél hiPS anu utuh dipiceun tina piring budaya nganggo dispase (0.35 mg / mL) sareng ditransfer kana kultur plastik kantétan ultra-rendah anu ngandung piring kalayan medium kultur sél hiPS. (Corning) supplemented kalawan dua SMAD sambetan dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) jeung SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) jeung ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Salila 5 dinten anu munggaran, médium sél hiPS dirobih unggal dinten sareng dorsomorphine sareng SB-431542 ditambah. Dina dinten kagenep di gantung, spheroids neural ditransferkeun ka médium neural anu ngandung neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), pénisilin sareng streptomycin (1: 100, Life Technologies) sareng ditambah ku faktor pertumbuhan e (1:100, Epidermal; 2 ml). R & D Systems) jeung faktor pertumbuhan fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R & D Systems) nepi ka poé 24. Ti poé 25 nepi ka poé 42, sedeng ieu supplemented jeung faktor neurotrophic turunan otak (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) jeung neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml). Dina dinten kagenep di gantung, spheroids neural ditransferkeun ka médium neural anu ngandung neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), pénisilin sareng streptomycin (1: 100, Life Technologies) sareng ditambah ku faktor pertumbuhan e (1:100, Epidermal; 2 ml). R & D Systems) jeung faktor pertumbuhan fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R & D Systems) nepi ka poé 24. Ti poé 25 nepi ka poé 42, sedeng ieu supplemented jeung faktor neurotrophic turunan otak (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) jeung neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml).Dina dinten kagenep dina gantung, spheroids saraf ditransferkeun ka médium saraf anu ngandung Neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), pénisilin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и фактором роста фиб; 2мбро R&D Systems) dugi ka 24-taun. sareng streptomycin (1: 100, Life Technologies) sareng ditambah ku faktor pertumbuhan épidermis (EGF; 20 ng / ml; Sistem R&D) sareng faktor pertumbuhan fibroblast 2 (FGF2; 20 ng / ml; Sistem R&D) dugi ka dinten 24.Ti poé 25 nepi ka 42, faktor neurotrophic turunan otak (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) jeung neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ditambahkeun kana sedeng, ngarobah médium unggal poé lianna.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:10 Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF ngR；；20 Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 的紀 2 b.补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （1）素 （1）素 （1）素 （1）素 （1）素 （1）素 （1）素 （1）素 （1）素生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems＇4至＇ Dina 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), домавав7 А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермальакото (GF2; нг мл-1; R & D Systems) jeung фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Dina dinten 6, suspensi neurosfer dialihkeun kana suplemén anu ngandung neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), pénisilin-nétralkeun streptomycin (1: 100, Life Technologies) ditambah ku faktor pertumbuhan épidermal 1-2; faktor pertumbuhan fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) dugi ka 24-taun. R&D Systems) dugi ka dinten 24.Ti poé 25 nepi ka 42, faktor neurotrophic turunan otak (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) jeung faktor neurotrophic 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ditambahkeun kana medium budaya unggal poé lianna. Sedeng robah sakali.Dimimitian ti dinten 43, hCO dijaga dina médium neurobasal-A anu teu ditambahan (NM; 1088022, Thermo Fisher) kalayan parobahan sedeng unggal 4-6 dinten. Pikeun kéngingkeun hCO tina sél hiPS anu dibudidayakeun dina kaayaan anu teu aya feeder, sél hiPS diinkubasi ku Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) dina 37 ° C salami 7 menit, dipisahkeun kana sél tunggal, sareng dilapis dina piring AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) dina kapadetan sél 3 × 106 STEMCELL kalayan kapadetan sél tunggal 3 × 106. Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Saatos 24 jam, média dina sumur dipipet ka luhur sareng ka handap kana média anu ngandung média Essential 6 (A1516401, Life Technologies) ditambah ku dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) sareng SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Ti dinten 2 dugi ka 6, sedeng ésénsial 6 diganti unggal dinten ku dorsomorphine sareng suplement SB-431542. Ti dinten kagenep, suspénsi neurosphere ditransferkeun kana médium neurobasal sareng dijaga sapertos anu dijelaskeun di luhur.
Sadaya prosedur sato dilaksanakeun saluyu sareng pedoman perawatan sato anu disatujuan ku Komite Administratif Perawatan Sato Laboratorium Universitas Stanford (APLAC). Hamil euthymic RNU (rnu/+) beurit dibeuli (Charles River Laboratories) atawa housed. Sato dijaga dina siklus cahaya-poék 12 jam kalayan tuangeun sareng cai ad libitum. Anak beurit buligir (FOXN1–/–) umur tilu dugi ka tujuh dinten diidentipikasi ku tumuwuhna kumis anu teu dewasa sateuacan dipupus. Puppies (jalu jeung bikang) anu anesthetized kalawan 2-3% isoflurane sarta disimpen dina pigura stereotaxic. A trepanation tina tangkorak kalayan diaméter kurang leuwih 2-3 mm luhureun S1 dipigawé bari ngajaga integritas dura mater. Teras nganggo jarum 30-G (kira-kira 0,3 mm) di luar kraniotomi pikeun nembus dura. Lajeng nerapkeun HCO ka ipis 3 × 3 cm parafilm jeung cabut kaleuwihan sedeng. Ngagunakeun jarum suntik Hamilton napel jarum 23 G, 45 °, gently tarik hCO kana tungtung paling distal tina jarum. Teras pasang jarum suntik dina pompa jarum suntik anu disambungkeun ka alat stereotaxic. Lajeng nempatkeun ujung jarum dina liang tusukan lega 0,3 mm saméméhna dijieun dina dura (z = 0 mm) jeung sempit jarum suntik 1-2 mm (z = kurang leuwih -1,5 mm) nepi ka jarum aya di antara dura mater A. segel padet kabentuk. Teras angkat jarum suntik ka tengah permukaan kortikal dina z = -0,5 mm sareng nyuntik hCO dina laju 1-2 µl per menit. Saatos parantosan suntikan hCO, jarum ditarik dina laju 0.2-0.5 mm per menit, kulit dijahit, sareng anak anjing langsung disimpen dina pad pemanasan anu haneut dugi ka pulih lengkep. Sababaraha sato anu transplanted bilaterally.
Sadaya prosedur sato dilaksanakeun saluyu sareng pedoman perawatan sato anu disatujuan ku Stanford University APLAC. Beurit (leuwih ti 60 poé sanggeus cangkok) anu ngainduksi ku 5% isoflurane anesthesia jeung anesthetized kalawan 1-3% isoflurane salila Imaging. Pikeun visualisasi, 7 Tesla aktip shielded horizontal borehole scanner Bruker (Bruker Corp.) kalawan International Electric Company (IECO) gradién drive, a sisipan gradién shielded kalawan diaméter internal 120 mm (600 mT / m, 1000 T / m / s) dipaké maké AVANCE. III, dalapan saluran multi-coil RF jeung kamampuhan multi-inti, sarta ngalengkepan platform Paravision 6.0.1. Ngarékam dipigawé maké coil RF volumetric decoupled aktip kalawan diaméter internal 86 mm sarta opat-kanal cryo-tiis RF coil pikeun nampa wungkul. Axial 2D Turbo-LANGKA (waktu pengulangan = 2500 mdet, waktos gema = 33 mdet, 2 rata-rata) kalawan 16 keureutan nyiksikan, ketebalan nyiksikan 0.6-0.8 mm, ngandung 256 × 256 sampel. Sinyal ditampi nganggo coil RF volumetrik transceiver kuadrat kalayan diaméter internal 2 cm (Rapid MR International, LLC). Tungtungna, ngagunakeun diwangun-di Imaris (BitPlane) fungsi estimasi permukaan pikeun 3D Rendering jeung analisis volume. Transplantasi anu suksés didefinisikeun salaku daérah anu kontinyu T2-weighted sinyal MRI kabentuk dina hémisfér transplanted. Panolakan graft diartikeun salaku tandur anu henteu ngahasilkeun daérah sinyal MRI T2-weighted kontinyu dina hémisfér transplanted. Subcortical t-hCO dikaluarkeun tina analisa salajengna.
Pikeun stably nganyatakeun GCaMP6s di hCO pikeun dua-foton kalsium Imaging, sél hiPS kainfeksi pLV [Exp] -EF1a :: GcaMP6s-WPRE-Puro dituturkeun ku pilihan antibiotik. Sakeudeung, sél dipisahkeun sareng EDTA sareng ditunda dina 1 ml medium Essential 8 kalayan kapadetan kira-kira 300,000 sél ku ayana polybrene (5 μg / ml) sareng 15 μl virus. Sél-sél éta teras diinkubasi dina gantung salami 60 menit sareng dibibita dina kapadetan 50.000 sél per sumur. Saatos confluence, sél dirawat kalayan 5-10 μg ml-1 puromycin pikeun 5-10 dinten atanapi dugi koloni stabil muncul. Inféksi hCO akut dilaksanakeun sakumaha anu dijelaskeun saméméhna5 kalayan sababaraha modifikasi. Sakeudeung, mindahkeun dinten 30-45 hCO kana 1,5 ml Eppendorf tabung microcentrifuge ngandung 100 µl medium saraf. Saterusna kira-kira 90 µl medium dipiceun, 3-6 µl high titer lentivirus (tina 0,5 x 108 ka 1,2 x 109) ditambahkeun kana tabung, sarta hCO ditransferkeun ka incubator salila 30 menit. Teras tambahkeun 90-100 µl medium ka unggal tabung sareng balikkeun tabung ka inkubator sapeuting. Poé saterusna, mindahkeun hCO ka sedeng saraf seger dina pelat kantétan low. Saatos 7 dinten, hCO ditransferkeun kana piring handap kaca 24-sumur pikeun visualisasi sareng evaluasi kualitas inféksi. pLV [Exp] -SYN1 :: EYFP-WPRE na pLV [Exp] -SYN1 :: hChR2-EYFP-WPRE dihasilkeun ku VectorBuilder. Lentivirus dipaké dina kalolobaan percobaan sabab geus terpadu kana génom host, sahingga reporter ekspresi gén dina garis sél kainféksi. Pikeun rabies follow-up, dinten 30-45 hCO ieu ko-inféksi ku rabies-ΔG-eGFP na AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), dikumbah tuntas pikeun 3 poé, sarta transplanted kana beurit di S1 ​​pikeun 7-14 poé.
Pikeun immunocytochemistry, sato dibius sareng transcardially perfused sareng PBS dituturkeun ku 4% paraformaldehyde (PFA dina PBS; Élmu Mikroskopi Éléktron). Otak dibereskeun dina 4% PFA pikeun 2 jam atanapi sapeuting dina 4 ° C, cryopreserved dina 30% sukrosa dina PBS pikeun 48-72 jam, sarta embedded dina 1: 1, 30% sukrosa: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) jeung coronal µs cryostat (Cryostat) dijieun dina bagian coronal30s. Pikeun immunohistochemistry tina bagian kandel, sato anu perfused kalawan PBS, sarta otak ieu dibedah jeung sectioned coronally dina 300-400 μm maké vibratome (Leica) jeung bagian anu dibereskeun ku 4% PFA salila 30 menit. Teras cryosections atanapi bagian kandel dikumbah sareng PBS, diblokir salami 1 jam dina suhu kamar (10% sérum kalde normal (NDS) sareng 0,3% Triton X-100 éncér dina PBS) sareng diblokir ku solusi blocking dina 4 ° C. - Cryosections Inkubasi diinkubasi sapeuting sareng bagian anu kandel diinkubasi salami 5 dinten. Antibodi primér dipaké nyaéta: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (beurit, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kelinci, 1: 1,000; Z0334, Dako), anti-GFP: 1, Tex, Genep, 1000, GTX 1000; anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kelinci, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kelinci, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kelinci, 1:2478; HP1:2008; anti RECA-1 (beurit, 1:50; ab9774, abcam), anti SCG2 (kelenci, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti SOX9 (embe, 1:500; AF3075, Urang Sunda & D Systems), Netrin G1A: 100; 16 D, Sistem Netrin G1a: 100; 6 D. anti STEM121 (mouse, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti SAB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti GAD65/67 (kelinci, 1:400; ABN904, Millipore) jeung anti-IBA1 (embe, a1: ab5). Antibodi primér dipaké nyaéta: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (beurit, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kelinci, 1: 1,000; Z0334, Dako), anti -GFP: 1,Tex, Genex, 1000, GTX 1000 (Hayam, 1000 Genep, 1,000), anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kelinci, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kelinci, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kelinci, 1:2478; HP1:2008; anti RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kelenci, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti SOX9 (embe, 1:500; AF3075, Urang Sunda & D Systems), Netrin G1a: 10,6 D, Netrin AF: 10,6 D; anti STEM121 (mouse, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti SAB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kelinci, 1:400; ABN904, Millipore) jeung anti-IBA1 : 107; a107; a107; Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 51b: 304; 6; анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, нкроклик), 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas1, Круз, анти-PPP1R17 ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a, нетрин G1a (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, AF10) анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:404, анти-SATB2, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:404, анти, 1:404, анти 9; (koza, 1:100; ab5076, abkam). Antibodi primér anu dipaké nyaéta: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (beurit, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kelinci, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP109, GTX1000 (hayam, 07-01) anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kelinci, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kelenci, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kelinci, 1:2478; HPA, Atlas9078; HPA, Atlas9078; anti RECA-1 (beurit, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (kelenci, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti SOX9 (embe, 1:500; AF3075, Urang Sunda & D Systems), netrin G1A: 106, R & D, anti G1A (embe, 106; R & D) STEM121 (mouse, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kelinci, 1:400; ABN904, Millipore) jeung anti-IBA1 (embe, 1:50).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GFP（1:1,000；GTX13970，GeneTex），HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；Millipo，7 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，ab9774，2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D1:Sistem R&D1:Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kelinci, 1:400; ABN904, Millipore) jeung anti-IBA1 (embe, 1:100; ab5076, abcam).Antibodi primér anu dianggo nyaéta: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (beurit, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kelinci, 1:1000; Z0334, Dako). , anti GFP (hayam, 1: 1000; GTX13970, GeneTex), anti HNA (mouse, 1: 200; ab191181, abcam), anti NeuN (kelinci, 1: 500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kelenci, 1: 2308) (kelenci, 1:200; HPA047819, antibodi Atlas), anti RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (kelenci), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (1:40, Tax) анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) jeung анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, аб5076). 20357-1-AP, Proteintech), anti SOX9 (embe, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (embe, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti STEM121 (mouse, 1:200; Takara Bio, 500; Takara Bio, 500; Takara Bio, 500; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kelinci, 1:400; ABN904, Millipore), jeung anti-IBA1 (embe, 1:100; ab5076, abkam).Bagian teras dikumbah nganggo PBS sareng diinkubasi ku antibodi sekundér salami 1 jam dina suhu kamar (bagian beku) atanapi sapeuting dina 4 ° C (bagian kandel). Alexa Fluor antibodi sékundér (Life Technologies) éncér 1:1000 dina solusi blocking dipaké. Saatos ngumbah sareng PBS, inti ditingali ku Hoechst 33258 (Life Technologies). Tungtungna, slides disimpen dina mikroskop jeung coverslips (Fisher Scientific) ngagunakeun Aquamount (Polysciences) jeung dianalisis dina mikroskop fluoresensi Keyence (BZ-X analyzer) atawa Leica TCS SP8 mikroskop confocal (Las-X) dina gambar. Gambar diolah nganggo program ImageJ (Fiji). Pikeun ngitung proporsi neuron manusa dina t-hCO jeung cortex beurit, 387.5 μm gambar rectangular lega dicandak di puseur t-hCO, dina atawa deukeut ujung cortex beurit. Margin cangkok ditangtukeun ku assessing parobahan transparansi jaringan, inti HNA +, jeung / atawa ayana autofluorescence jaringan. Dina unggal gambar, jumlah total sél NeuN+ jeung HNA+ dibagi ku jumlah total sél NeuN+ dina wewengkon nu sarua. Pikeun mastikeun yén ukur sél jeung inti dina pesawat gambar diitung, ngan sél anu ogé Hoechst + kaasup kana itungan. Dua gambar dipisahkeun ku sahanteuna 1 mm rata-rata pikeun ngurangan kasalahan statistik.
Saminggu saméméh ngumpulkeun sampel, nempatkeun sato cangkok hCO (kira-kira 8 bulan diferensiasi) dina kamar poék jeung kumis dipangkas pikeun ngaleutikan stimulasi indrawi. Isolasi inti dilaksanakeun sakumaha anu dijelaskeun sateuacana, kalayan sababaraha modifikasi. Sakeudeung, t-hCO jeung hCO ancur maké lysis sél detergent-mékanis jeung coét jaringan kaca 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich / KIMBLE). Inti kasar teras disaring nganggo saringan 40 µm sareng disentrifugasi dina 320 g salami 10 menit dina suhu 4 ° C sateuacan ngalaksanakeun gradién dénsitas sukrosa. Sanggeus léngkah centrifugation (320 g pikeun 20 mnt dina 4 ° C), sampel anu resuspended dina 0.04% BSA / PBS ditambah 0.2 unit µl-1 RNase inhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) jeung ngaliwatan filter aliran 40 µm. Inti dissociated lajeng resuspended dina PBS ngandung 0.02% BSA sarta dimuat kana hiji Chromium Single Cell 3 'chip (diperkirakeun recovery 8.000 sél per jalur). Perpustakaan snRNA-seq disiapkeun sareng Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Perpustakaan snRNA-seq disiapkeun sareng Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium sél Tunggal 3′ GEM, Perpustakaan & Gél Bead Kit v3 (10x Genomics). Perpustakaan snRNA-seq disiapkeun nganggo Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Sel Tunggal 3′ GEM, Perpustakaan & Kit Manik Gel v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Sel Tunggal 3′ GEM, Perpustakaan & Kit Manik Gel v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Tunggal Sél 3′ GEM, Perpustakaan & Gél Bead Kit v3 (10x Genomics). Perpustakaan snRNA-seq disiapkeun nganggo Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Perpustakaan tina conto anu béda-béda dikumpulkeun sareng diurutkeun ku Admera Health dina NovaSeq S4 (Illumina).
Tingkat éksprési gén pikeun tiap barkod nuklir putative diukur nganggo pakét software analisis 10x Genomics CellRanger (versi 6.1.2). Husus, bacaan anu cocog sareng kombinasi manusa (GRCh38, Ensemble, versi 98) jeung beurit (Rnor_6.0, Ensemble, versi 100) génom rujukan dijieun ku paréntah mkref sarta ngagunakeun count kalawan paréntah -include-introns = TRUE mun quantitation kaasup bacaan dipetakeun ka wewengkon intron. Pikeun conto t-hCO, inti manusa diidentifikasi dumasar kana sarat konservatif yén sahenteuna 95% tina sadaya bacaan anu dipetakeun cocog sareng génom manusa. Kabéh analisa saterusna dipigawé dina kaluaran Asép Sunandar Sunarya barkod disaring ti CellRanger ngagunakeun pakét Sunda (versi 4.1.2) Seurat (versi 4.1.1)32.
Pikeun mastikeun yén ngan ukur inti kualitas luhur anu kalebet dina analisis anu salajengna, prosés nyaring iteratif dilaksanakeun pikeun unggal sampel. Kahiji, inti-kualitas low kalawan kirang ti 1000 gén unik kapanggih sarta leuwih ti 20% tina total mitokondria diidentifikasi jeung dihapus. Salajengna, matriks angka gén atah ieu dinormalisasi ku régrési binomial négatip regularized ngagunakeun sctransform (vst.flavor = "v2″) fungsi, nu ogé ngaidentipikasi 3000 gén paling variabel ngagunakeun parameter standar. Pangurangan diménsi dipigawé dina gén variabel luhur maké Principal Component Analysis (PCA) kalawan parameter diménsi standar ngagunakeun 30 data set (diménsi standar dipilih ngagunakeun set data 30). inspeksi situs dengkul sarta dipaké pikeun sakabéh sampel sarta nganalisa ensemble). (maksudna skor DoubletFinder luhureun persentil 95th sampel t-hCO (n = 3) jeung sampel hCO (n = 3) anu terpadu misah ngagunakeun fungsi IntegrateData kalawan parameter di luhur.
Saatos miceun kernels kualitas low, dataset terpadu ieu dikelompokkeun (resolusi = 0.5) jeung embedded pikeun tujuan visualisasi UMAP34. Gén pananda pikeun tiap klaster ditangtukeun ngagunakeun fungsi FindMarkers kalawan parameter standar diitung tina data éksprési gén dinormalisasi. Urang ngaidentipikasi sareng ngagolongkeun kelas sél utama ku ngagabungkeun set data rujukan kortikal fétus sareng déwasa sareng éksprési gén pananda 19,20,21,35 sareng anotasi. Khususna, prékursor sirkulasi diidentipikasi ku éksprési MKI67 sareng TOP2A. Klaster progenitor ditetepkeun ku henteuna transkrip mitotik, tumpang tindihna tinggi sareng klaster progenitor glial multipotent anu dijelaskeun dina korteks fétal metaphase telat, sareng ekspresi EGFR sareng OLIG1. Urang ngagunakeun istilah astrocyte pikeun ngawengku sababaraha kaayaan diferensiasi astrocyte, ti glia radial ahir nepi ka maturation of astrocytes. Kluster astrocyte nganyatakeun tingkat luhur SLC1A3 sareng AQP4 sareng parantos nunjukkeun peta sareng subtipe glia radial fétal sareng / atanapi astrocytes dewasa. OPCs nganyatakeun PDGFRA sareng SOX10 bari oligodendrocytes nganyatakeun spidol myelination (MOG sareng MYRF). Neuron glutamatergic diidentipikasi ku ayana transkrip neuronal (SYT1 sareng SNAP25), henteuna spidol GABAergic (GAD2), sareng ekspresi NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, atanapi SATB2. Neuron GluN dibagi deui kana subclasses luhur (ekspresi SAB2 sareng leungitna BCL11B) sareng jero (ekspresi BCL11B). Neuron subplate Putative (SP) nganyatakeun spidol SP18 anu dikenal sapertos ST18 sareng SORCS1 salian spidol GluN jero. Sél sapertos plexus Choroid diidentipikasi ku éksprési TTR, sareng sél sapertos meningeal nyatakeun gén anu aya hubunganana fibroblast sareng dipetakeun sél pial / vaskular tina set data rujukan.
Analisis diferensial éksprési gén antara t-hCO jeung hCO subclasses dipigawé ngagunakeun métode pseudo-angkatan karek dimekarkeun dihasilkeun dina sampel dilaksanakeun ngagunakeun pakét Libra R (versi 1.0.0). Husus, tés kamungkinan log EdgeR (versi 3.36.0, pakét R) dilakukeun pikeun grup ku cara nyimpulkeun jumlah gén dina sél pikeun kelas sél anu dipasihkeun pikeun unggal réplikasi sampel. Pikeun visualisasi peta panas, nilai normalisasi per juta (CPM) diitung nganggo fungsi edgeR (cpm()) sareng diskalakeun (pikeun ngahontal rata-rata = 0, simpangan baku = 1). Analisis pengayaan Gene Ontology (GO) gén t-hCO GluN anu dirégulasi sacara signifikan (Benjamini-Hochberg ngabenerkeun nilai P kirang ti 0.05 anu dinyatakeun dina sahenteuna 10% sél t-hCO GluN sareng paningkatan lipet dina parobahan sahenteuna 2 kali). dipigawé maké ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Kami nganggo aplikasi ToppFun sareng parameter standar sareng ngalaporkeun nilai-P anu dilereskeun Benjamini-Hochberg anu diitung tina tés hypergeometric anu ditandaan GO.
Pikeun cocog klaster snRNA-seq urang jeung klaster sél annotated tina studi rujukan primér RNA-seq sél tunggal atawa sawawa snRNA-seq19,20,21,22, urang nerapkeun pendekatan integrasi dataset dipasangkeun. Kami nganggo alur kerja normalisasi SCTransform (v2) di Seurat pikeun ngahijikeun sareng ngabandingkeun tumpang tindih klaster antara set data (ngagunakeun parameter anu sami sareng di luhur). Dataset individu sacara acak disubset nepi ka 500 sél atanapi inti per klaster asli pikeun efisiensi komputasi. Ngagunakeun pendekatan sarupa sakumaha ditétélakeun saméméhna, klaster tumpang tindihna dihartikeun salaku proporsi sél atawa inti dina unggal pooled klaster nu tumpang tindih jeung labél tina klaster rujukan. Pikeun ngagolongkeun GluNs salajengna, kami nganggo alur kerja TransferData Seurat pikeun data subset GluN pikeun napelkeun labél set data rujukan ka sél GluN kami.
Pikeun meunteun status maturation tina transcriptome global tina t-hCO jeung hCO sampel, urang ngabandingkeun sampel pseudo-bulk kami kalawan BrainSpan / psychENCODE23, nu diwangun ku runtuyan RNA badag Manjang ngembangkeun otak manusa. Kami ngalaksanakeun PCA dina matriks éksprési gén pola-dinormalisasi gabungan tina sampel kortikal 10 minggu saatos konsepsi sareng engké, dina gén 5567 (sareng data kami) anu saacanna diidentifikasi minangka aktip dina conto kortikal BrainSpan (ditetepkeun langkung ageung tibatan 50% dina varian pangembangan dipedar ku umur nganggo modél kubik)38. Sajaba ti éta, urang diturunkeun gén pakait sareng tanda tangan transcriptome utama neurodevelopment ngagunakeun faktorisasi matrix non-négatip sakumaha ditétélakeun saméméhna. Beurat sampel diitung ngagunakeun prosedur faktorisasi matriks non-négatip anu plotted dina Gbr. 5b kalawan data dimekarkeun pikeun tiap tina lima tanda tangan digambarkeun ku Zhu et al.38. Deui, spidol transkripsional gumantung aktivitas diturunkeun tina studi anu diterbitkeun samemehna. Khususna, ERG sareng LRG sacara signifikan ningkat dina neuron glutamatergic anu diidentipikasi ku koléksi visual cortex snRNA-seq beurit saatos stimulasi visual tina Tabel Tambahan 3 Hrvatin et al.16. LRGs anu diperkaya ku manusa dicandak tina budaya otak fétal KCl-diaktipkeun sareng dipanén 6 jam saatos stimulasi, sareng gén anu disaring sacara signifikan ningkat dina manusa tapi henteu dina rodénsia (Tabel Tambahan 4). Analisis pengayaan set gén ngagunakeun sét gén ieu dilakukeun nganggo uji pasti Fisher hiji arah.
Anesthetize beurit kalawan isoflurane, piceun brains sarta nempatkeun dina tiis (kurang leuwih 4 ° C) oxygenated (95% O2 jeung 5% CO2) solusi sukrosa pikeun bagian ngandung: 234 mM sukrosa, 11 mM glukosa, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 sareng 0,5 mM CaCl2 (kira-kira 310 mOsm). Bagian koronal otak beurit (300-400 µm) anu ngandung t-hCO didamel nganggo vibratom Leica VT1200 sapertos anu dijelaskeun sateuacana39. Bagéan-bagéan éta lajeng dialihkeun ka chamber sectioning kalawan oxygenation suhu kamar kontinyu ngandung aCSF disiapkeun ti: 10 mM glukosa, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 jeung 126 mM NaCl (298 mO). sahenteuna 45 menit sateuacan ngarékam. Bagian kacatet dina chamber immersed dimana aranjeunna terus perfused kalawan aCSF (95% O2 na 5% CO2 vial). Sadaya data kacatet dina suhu kamar. neuron t-hCO terminated ku pipette kaca borosilikat ngeusi leyuran ngandung 127 mM kalium glukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnésium ATP, 0.3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES, sarta 0.6 mM EGTA, pH 7.2, solusi internal disaluyukeun jeung KOHs (290 mM). Dina raraga cageur, biocytin (0,2%) ditambahkeun kana solusi rekaman.
Data dicandak nganggo amplifier MultiClamp 700B (Alat Molekul) sareng digitizer Digidata 1550B (Alat Molekul), low-pass disaring dina 2 kHz, didigitalkeun dina 20 kHz, sareng dianalisis nganggo Clampfit (Alat Molekul), Asal (OriginPro). 2021b, OriginLab). jeung fungsi MATLAB custom (Mathworks). Potensi simpang diitung maké JPCalc jeung éntri disaluyukeun jeung nilai diitung -14 mV. Operasi IV diwangun ku runtuyan hambalan ayeuna dina 10-25 pA léngkah, ti -250 nepi ka 750 pA.
Talamus, zat bodas, sareng afferents S1 dirangsang sacara listrik dina irisan thalamocortical nalika ngarékam patch-clamp neuron hCO, sakumaha anu dijelaskeun sateuacana. Sakeudeung, otak ieu disimpen dina tabel percetakan 3D tilted dina sudut 10 °, sarta hareup otak dipotong dina sudut 35 °. Otak ieu lajeng glued kana beungeut cut na sectioned, preserving axons protruding thalamocortical. Éléktroda tungsten bipolar (0.5 MΩ) dipasang dina micromanipulator kadua sareng diposisikan sacara strategis pikeun merangsang opat daérah per sél (kapsul jero, zat bodas, S1 sareng hCO). Rékam réspon sinaptik saatos 300 µA stimulasi phasic dina 0.03-0.1 Hz.
Neuron hCO-expressing hChR2 diaktipkeun dina 480 nm sareng pulsa cahaya anu dihasilkeun ku LED (Prizmatix) diterapkeun ngaliwatan obyektif × 40 (0.9 NA; Olympus) pikeun ngarékam éksprési hChR2 caket sél. Diaméter médan bercahya kira-kira 0,5 mm sareng kakuatan total 10-20 mW. Lebar pulsa disetel ka 10 mdet, nu pakait jeung pulsa dibikeun salila percobaan learning behavioral. Rupa-rupa frékuénsi stimulasi dipaké, ti 1 nepi ka 20 Hz, tapi ngan pulsa mimiti runtuyan ieu dipaké pikeun quantification. Interval antara karéta biasana leuwih panjang batan 30 s pikeun ngaleutikan pangaruh dina inhibitory sinaptik atawa facilitating jalur. Pikeun nguji naha réspon hChR2 éta monosynaptic, kami nerapkeun TTX (1 μM) kana mandi dugi réaksi EPSC ngaleungit, teras nerapkeun 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). Ilaharna, réspon dipulangkeun dina sababaraha menit, kalayan jeda anu rada panjang antara tembakan LED sareng generasi EPSC. NBQX (10 μM) dianggo pikeun nguji naha réspon didorong ku reséptor AMPA.
Bagian hCO seukeut dijieun sakumaha ditétélakeun saméméhna. Sakeudeung, bagian hCO dilebetkeun dina 4% agarose sareng ditransferkeun ka sél anu ngandung 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 sareng 10 mM d-(+) -0glukosa dipotong kana Bagian µm dina suhu kamar nganggo vibrator Leica VT1200 sareng disimpen dina ASF dina suhu kamar. Lajeng, rekaman patch-camp sakabeh sél ieu dipigawé dina bagian hCO handapeun mikroskop SliceScope langsung (Scientifica). Bagian anu perfused kalawan aCSF (95% O2 na 5% CO2) jeung sinyal sél anu dirékam dina suhu kamar. Neuron hCO diterapkeun nganggo pipet kaca borosilikat anu dieusian ku larutan anu ngandung 127 mM kalium glukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES, sareng 0.6 mM EGTA, pH internal 7, 2, disaluyukeun sareng KOH (osmolaritas). Pikeun tujuan recovery, tambahkeun 0,2% Biocytin kana solusi internal.
Data dicandak ku Clampex (Clampex 11.1, Alat Molekul) ngagunakeun amplifier MultiClamp 700B (Alat Molekul) sareng digitizer Digidata 1550B (Alat Molekul), low-pass disaring dina 2 kHz, didigitalkeun dina 20 kHz, sareng dianalisis ngagunakeun alat Clampfit (versi 10, MAT) sareng alat molecular. (MATLAB 2019b, Mathworks). Potensi simpang diitung maké JPCalc jeung éntri disaluyukeun jeung poténsi simpang diitung tina -14 mV. Operasi IV diwangun ku runtuyan hambalan ayeuna dina 5-10 pA léngkah tina -50 nepi ka 250 pA.
Pikeun rekonstruksi morfologis neuron pinched, 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) ditambahkeun kana solusi internal. Sél anu primed salila sahenteuna 15 menit sanggeus Hacking. Pipet teras ditarik lalaunan salami 1-2 mnt dugi ka mémbran anu kadaptar parantos disegel. Handap prosedur fisiologi bagian, bagian dibereskeun sapeuting di 4 ° C. dina 4% PFA, dikumbah ku PBS X3, sarta diluted 1: 1000 kalawan streptavidin-conjugated DyLight 549 atanapi DyLight 405 (Véktor Labs). Sél ngeusi biocytin (2%; Sigma-Aldrich) dilabélan nalika ngarékam patch clamp dina suhu kamar salami 2 jam. Bagian-bagian éta teras dipasang dina slide mikroskop nganggo Aquamount (Thermo Scientific) sareng dibayangkeun énjingna dina mikroskop confocal Leica TCS SP8 nganggo tujuan immersion minyak kalayan aperture numerik × 40 1.3, pembesaran × 0.9-1.0, xy. Laju sampling kira-kira 7 piksel per micron. Z-tumpukan dina interval 1 μm dicandak sacara séri, sareng z-tumpukan mosaik sareng jahitan otomatis basis Leica dilakukeun pikeun nutupan sakabéh tangkal déndritik unggal neuron. Neuron teras dilacak semi-manual nganggo antarmuka neuTube 40 sareng file SWC dibangkitkeun. Berkas-berkas éta teras diunggah ka plugin SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, versi 2.1.0; NIH).
Jaringan cortical manusa dicandak ku idin informed nurutkeun protokol disatujuan ku Institusi Review Board of Stanford University. Dua sampel jaringan postpartum manusa (3 jeung 18 taun heubeul) dicandak ku resection of cortex frontal (gyrus frontal tengah) salaku bagian tina bedah pikeun epilepsy refractory. Saatos reseksi, panén jaringan dina NMDG-aCSF és-tiis anu ngandung: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukosa, 2 mM thiourea, 5 mM tiourea, natrium astéroid, 5 mM. 0,5 mM CaCl2 4H2O jeung 10 mM MgSO4 7H2O. Titrate ka pH 7.3-7.4 kalayan asam hidroklorat kentel. Tisu dikirimkeun ka laboratorium dina 30 menit sareng bagian koronal dicandak dumasar kana prosedur anu dijelaskeun di luhur.
Sadaya prosedur sato dilaksanakeun saluyu sareng pedoman perawatan sato anu disatujuan ku Stanford University APLAC. Beurit (leuwih ti 140 poé post-transplantasi) anu ngainduksi ku 5% isoflurane anesthesia sarta anesthetized kalawan 1-3% isoflurane intraoperatively. Sato ditempatkeun dina pigura stereotaxic (Kopf) jeung sustained release buprenorphine (SR) ieu nyuntik subcutaneously. Tangkorak kakeunaan, dibersihkeun sareng 3-5 sekrup tulang diselapkeun. Pikeun nargétkeun t-hCO, kami ngahasilkeun koordinat stereotaxic tina gambar MRI. Liang burr dibor di tempat anu dipikaresep sareng serat (diameter 400 µm, NA 0.48, Doric) diturunkeun 100 µm di handap permukaan hCO sareng diamankeun kana tangkorak kalayan semén dental anu tiasa diubaran UV (Relyx).
Rekaman fotometri serat dilaksanakeun sakumaha anu ditétélakeun saméméhna42. Pikeun ngarékam kagiatan spontan, beurit disimpen dina kandang beresih sareng kabel patch serat optik diaméterna 400 µm (Doric) disambungkeun ka sistem akuisisi data fotometri serat optik disambungkeun kana kabel serat optik anu dipasang. Salila 10 menit ngarekam aktivitas motor, sato bébas ngajajah kandang. Pikeun ngarekam aktivitas evoked, beurit (leuwih ti 140 poé sanggeus cangkok) anu anesthetized kalawan 5% isoflurane pikeun induksi jeung 1-3% isoflurane pikeun pangropéa. Teundeun sato dina pigura stereotactic (Kopf) jeung kumis di sisi sabalikna ti t-hCO dipangkas nepi ka kira 2 cm sarta ngaliwatan bolong disambungkeun ka actuator piezoelektrik (PI). Kabel patch serat optik 400 µm (Doric) dihubungkeun sareng serat anu dipasang sareng dihubungkeun ka sistem akuisisi data. Kumis di sisi sabalikna ti t-hCO lajeng deflected 50 kali (2 mm dina 20 Hz, 2 s per presentasi) di kali acak ku drive piezoelektrik ngaliwatan 20 periode rekaman menit. Paké Arduino MATLAB Rojongan Paket pikeun ngadalikeun waktos deflection kalawan kode MATLAB custom. Kajadian disingkronkeun kana parangkat lunak akuisisi data nganggo pulsa transistor-transistor logic (TTL).
Beurit (leuwih ti 140 poé post-transplantasi) anu ngainduksi ku 5% isoflurane anesthesia sarta anesthetized kalawan 1-3% isoflurane intraoperatively. Sasatoan disimpen dina pigura stereotaxic (Kopf) sareng buprenorphine SR sareng dexamethasone disuntik sacara subkutan. Tangkorak kakeunaan, dibersihkeun sareng 3-5 sekrup tulang diselapkeun. Pikeun nargétkeun t-hCO, kami ngahasilkeun koordinat stereotaxic tina gambar MRI. A craniotomy sirkular (kira-kira 1 cm diaméterna) dipigawé ku bor speed tinggi langsung ngaliwatan hCO transplanted. Sakali tulang ipis sabisa, tapi saméméh pangeboran ngaliwatan sakabéh tulang, make forceps ngaleupaskeun disc pelvic gembleng sésana pikeun nembongkeun t-hCO kaayaan. Craniotomy ieu ngeusi saline steril, sarta coverslip sarta pin sirah husus napel tangkorak kalawan UV-kapok dental semén (Relyx).
Pencitraan dua foton dilakukeun nganggo mikroskop multifoton Bruker kalayan tujuan Nikon LWD (× 16, 0.8 NA). Pencitraan GCaMP6 dilakukeun dina 920 nm kalayan pembesaran z-pesawat tunggal 1.4x sareng rata-rata 8x 7.5 fps. Beurit diinduksi ku anestesi isoflurane 5% sareng dipertahankeun ku isoflurane 1-3%. Beurit ieu disimpen dina fixture sirah custom dijieun tur diposisikan handapeun lensa. A 3-menit rekaman latar tukang aktivitas motor dicandak. Ngaliwatan 20 menit ngarekam, 50 puffs (unggal presentasi 100 ms panjang) dikirimkeun sacara acak ka kumis pad sabalikna t-hCO ngagunakeun picospricer a. Anggo Paket Rojongan Arduino MATLAB pikeun ngontrol waktos burst kalayan kode MATLAB khusus. Nyingkronkeun acara jeung software akuisisi data (PrairieView 5.5) ngagunakeun pulsa TTL. Pikeun analisa, gambar dilereskeun pikeun gerak xy nganggo koreksi affine dina program MoCo anu diluncurkeun di Fiji. Ékstraksi ngambah fluoresensi tina sél individu ngagunakeun CNMF-E43. Fluoresensi ieu sasari pikeun tiap wewengkon dipikaresep, dirobah jadi dF / F kurva, lajeng dirobah jadi z-skor.
Beurit (leuwih ti 140 poé post-transplantasi) anu ngainduksi ku 5% isoflurane anesthesia sarta anesthetized kalawan 1-3% isoflurane intraoperatively. Sasatoan disimpen dina pigura stereotaxic (Kopf) sareng buprenorphine SR sareng dexamethasone disuntik sacara subkutan. Kumis di sisi sabalikna ti t-hCO dipotong kira-kira 2 cm sarta threaded ngaliwatan bolong disambungkeun ka actuator piezoelektrik. Tangkorak kakeunaan sareng dibersihkeun. A screw taneuh stainless steel napel tangkorak. Pikeun nargétkeun t-hCO, kami ngahasilkeun koordinat stereotaxic tina gambar MRI. Ngalakukeun craniotomy sirkular (kira-kira 1 cm diaméterna) kalayan bor speed tinggi ngan luhureun t-hCO. Sakali tulang ipis sabisa, tapi saméméh pangeboran ngaliwatan sakabéh tulang, make forceps ngaleupaskeun disc pelvic gembleng sésana pikeun nembongkeun t-hCO kaayaan. Sél individu dirékam nganggo panyilidikan silikon dénsitas tinggi 32-kanal atanapi 64-kanal (Cambridge Neurotech) didasarkeun kana sekrup taneuh sareng tos diamplifikasi ku amplifier RHD (Intan). Paké manipulator pikeun nurunkeun éléktroda ka situs target ngaliwatan craniotomy, nu ngeusi saline steril. Ngumpulkeun data dilaksanakeun dina frékuénsi 30 kHz ngagunakeun sistem akuisisi data Open Ephys. Rekaman dituluykeun ngan lamun urang ngadeteksi aktivitas spontan rhythmic kacida correlated dina leuwih ti 10 saluran, suggesting yén éléktroda anu lokasina di tandur (dumasar kana dua-foton kalsium data Imaging). A 10-menit rekaman latar tukang aktivitas motor dicandak. Kumis di sisi sabalikna ti t-hCO lajeng deflected 50 kali (2 mm dina 20 Hz, 2 s per presentasi) di kali acak ku drive piezoelektrik ngaliwatan 20 periode rekaman menit. Ngagunakeun Paket Rojongan MATLAB pikeun Arduino (MATLAB 2019b), ngadalikeun waktos deflection kalawan kode MATLAB custom. Anggo pulsa TTL pikeun nyingkronkeun acara sareng parangkat lunak akuisisi data.
Pikeun percobaan nyirian optik, kabel patch optik 200 µm (Doric) disambungkeun ka laser 473 nm (Omicron) disambungkeun ka serat optik 200 µm disimpen dina craniotomy nu. Langsung sateuacan ieu, saluyukeun kakuatan jumper ka 20 mW. Paké manipulator pikeun nurunkeun éléktroda ka situs target ngaliwatan craniotomy, nu ngeusi saline steril. Dina awal ngarékam, sapuluh pulsa cahaya 473 nm (frékuénsi 2 Hz, durasi pulsa 10 mdet) dipancarkeun. Sél fotosensitif diartikeun salaku sél anu nunjukkeun réspon spike dina 10 ms cahaya dina 70% atanapi langkung tina uji coba.