Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngajantenkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Biopsi cair (LB) mangrupikeun konsép anu gancang popularitasna dina widang biomedis.Konsep ieu utamana dumasar kana deteksi fragmen sirkulasi DNA ekstrasélular (ccfDNA), nu utamana dileupaskeun salaku fragmen leutik sanggeus maot sél dina sagala rupa jaringan.Sajumlah leutik fragmen ieu asalna tina jaringan atanapi organisme asing (asing).Dina karya ayeuna, kami geus dilarapkeun konsep ieu mussels, spésiés sentinel dipikawanoh pikeun kapasitas filtration cai laut tinggi maranéhanana.Kami ngagunakeun kamampuan kerang pikeun ngalaksanakeun saringan alami pikeun nangkep fragmen DNA lingkungan tina sababaraha sumber pikeun masihan inpormasi ngeunaan biodiversiti ékosistem basisir laut.Hasil kami nunjukkeun yén hemolymph mussel ngandung fragmen DNA anu béda-béda ukuranana, ti 1 dugi ka 5 kb.Sequencing shotgun nunjukkeun yén sajumlah ageung fragmen DNA asalna tina mikroba asing.Di antarana, urang manggihan fragmen DNA tina baktéri, archaea, jeung virus, kaasup virus dipikawanoh pikeun nginféksi rupa-rupa sarwa ilahar kapanggih dina ékosistem laut basisir.Dina kacindekan, ulikan urang nunjukkeun yén konsép LB dilarapkeun ka mussels ngagambarkeun euyeub tapi masih unexplored sumber pangaweruh ngeunaan diversity mikroba dina ekosistem basisir laut.
Dampak parobahan iklim (CC) kana biodiversiti ékosistem laut mangrupikeun daérah panalungtikan anu ngembang pesat.Pemanasan global henteu ngan ukur nyababkeun setrés fisiologis anu penting, tapi ogé ngadorong wates évolusionér stabilitas termal organisme laut, mangaruhan habitat sajumlah spésiés, nyababkeun aranjeunna milarian kaayaan anu langkung nguntungkeun [1, 2].Salian mangaruhan biodiversiti metazoans, CC ngaganggu kasaimbangan hipu interaksi host-mikroba.Dysbacteriosis mikroba ieu nyababkeun ancaman serius pikeun ékosistem laut sabab ngajadikeun organisme laut langkung rentan ka patogén tepa [3, 4].Hal ieu dipercaya yén SS maénkeun peran anu penting dina maotna massal, anu mangrupikeun masalah anu serius pikeun ngokolakeun ékosistem laut global [5, 6].Ieu mangrupikeun masalah anu penting kumargi dampak ékonomi, ékologis sareng nutrisi tina seueur spésiés laut.Ieu hususna leres pikeun bivalves anu hirup di daérah kutub, dimana épék CK langkung langsung sareng parah [6, 7].Kanyataanna, bivalves kayaning Mytilus spp.loba dipaké pikeun ngawas pangaruh CC dina ékosistem laut.Henteu anéh, sajumlah biomarker anu kawilang ageung dikembangkeun pikeun ngawas kaséhatanna, sering ngagunakeun pendekatan dua tingkat anu ngalibetkeun biomarker fungsional dumasar kana kagiatan énzimatik atanapi fungsi sélular sapertos viability sél sareng kagiatan fagositik [8].Métode ieu ogé kalebet pangukuran konsentrasi indikator tekanan khusus anu akumulasi dina jaringan lemes saatos nyerep cai laut anu ageung.Nanging, kapasitas filtrasi anu luhur sareng sistem sirkulasi semi-buka bivalves masihan kasempetan pikeun ngembangkeun biomarker hemolymph anyar nganggo konsép biopsi cair (LB), pendekatan anu sederhana sareng minimally invasif pikeun manajemén pasien.sampel getih [9, 10].Sanajan sababaraha jenis molekul sirkulasi bisa kapanggih dina LB manusa, konsep ieu utamana dumasar kana analisis DNA sequencing tina sirkulasi fragmén DNA ekstrasélular (ccfDNA) dina plasma.Kanyataanna, ayana sirkulasi DNA dina plasma manusa geus dipikawanoh saprak pertengahan abad ka-20 [11], tapi ngan dina taun panganyarna yén advent sahiji metodeu sequencing throughput tinggi geus ngarah ka diagnosis klinis dumasar kana ccfDNA.Ayana fragmen DNA sirkulasi ieu téh alatan sékrési pasif DNA génomik (nuklir jeung mitokondria) sanggeus maot sél. Dina individu séhat, konsentrasi ccfDNA normalna handap (<10 ng/mL) tapi bisa ngaronjat ku 5-10 kali dina penderita nalangsara ti sagala rupa pathologies atawa subjected ka stress, hasilna karuksakan jaringan. Dina individu séhat, konsentrasi ccfDNA normalna handap (<10 ng/mL) tapi bisa ngaronjat ku 5-10 kali dina penderita nalangsara ti sagala rupa pathologies atawa subjected ka stress, hasilna karuksakan jaringan. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз ухленой atanapi подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Dina jalma séhat, konsentrasi cccDNA biasana rendah (<10 ng/mL), tapi tiasa ningkat ku 5-10 kali dina pasien kalayan sagala rupa patologi atanapi dina kaayaan setrés anu nyababkeun karusakan jaringan.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压受受压劀加1倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承叛 或 承叛加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увелично низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увелично низкие в 5-10 раз умлица ями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Konsentrasi ccfDNA biasana rendah (<10 ng/ml) dina jalma anu séhat, tapi tiasa ningkat 5-10 kali lipet dina pasien anu ngagaduhan rupa-rupa patologi atanapi setrés, nyababkeun karusakan jaringan.Ukuran fragmen ccfDNA rupa-rupa, tapi biasana antara 150 nepi ka 200 bp.[12].Analisis ccfDNA timer diturunkeun, nyaéta, ccfDNA tina sél host normal atawa robah, bisa dipaké pikeun ngadeteksi parobahan genetik na epigenetic hadir dina génom nuklir jeung / atawa mitokondria, kukituna nulungan clinicians milih therapies molekular-sasaran husus [13].Sanajan kitu, ccfDNA tiasa didapet tina sumber asing kayaning ccfDNA tina sél fétal nalika kakandungan atawa tina organ transplanted [14,15,16,17].ccfDNA ogé mangrupa sumber informasi penting pikeun ngadeteksi ayana asam nukléat tina agén tepa (asing), anu ngamungkinkeun deteksi non-invasif inféksi nyebar teu dicirikeun ku budaya getih, Ngahindarkeun biopsy invasif jaringan kainféksi [18].Panaliti anyar parantos nunjukkeun yén getih manusa ngandung sumber inpormasi anu beunghar anu tiasa dianggo pikeun ngaidentipikasi patogén virus sareng baktéri, sareng sakitar 1% tina ccfDNA anu aya dina plasma manusa asalna asing [19].Panaliti ieu nunjukkeun yén kaanekaragaman hayati mikrobioma sirkulasi hiji organisme tiasa ditaksir nganggo analisis ccfDNA.Sanajan kitu, nepi ka ayeuna, konsep ieu dipaké sacara éksklusif di manusa jeung, ka extent Lesser, dina vertebrata séjén [20, 21].
Dina makalah ayeuna, urang ngagunakeun potensi LB pikeun nganalisis ccfDNA of Aulacomya atra, spésiés kidul ilahar kapanggih di subantarctic Kapuloan Kerguelen, grup pulo di luhur hiji dataran badag nu kabentuk 35 juta taun ka tukang.bituna vulkanik.Nganggo sistem ékspérimén in vitro, kami mendakan yén fragmen DNA dina cai laut gancang dicandak ku kerang sareng lebet kana kompartemen hemolymph.Sequencing shotgun geus ditémbongkeun yén ccfDNA hemolymph mussel ngandung fragmen DNA sorangan jeung non-diri, kaasup baktéri simbiotik jeung fragmen DNA tina biomes has ékosistem basisir laut vulkanik tiis.Hemolymph ccfDNA ogé ngandung sekuen virus anu diturunkeun tina virus sareng rentang host anu béda.Kami ogé mendakan fragmen DNA tina sato multisélular sapertos lauk tulang, anemon laut, ganggang sareng serangga.Dina kacindekan, ulikan kami nunjukkeun yén konsép LB tiasa suksés dilarapkeun ka invertebrata laut pikeun ngahasilkeun répertoire génomik anu beunghar dina ékosistem laut.
Dewasa (55-70 mm panjang) Mytilus platensis (M. platensis) jeung Aulacomya atra (A. atra) dikumpulkeun ti shores taringgul intertidal of Port-au-France (049 ° 21.235 S, 070 ° 13.490 E.).Kapuloan Kerguelen dina bulan Désémber 2018. Mussel biru sawawa séjén (Mytilus spp.) Dimeunangkeun ti supplier komérsial (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) jeung disimpen dina hawa dikawasa (4 ° C) tank aerated ngandung 10-20 L 32‰ brine jieunan.(Uyah laut jieunan Karang Kristal, Instant Ocean, Virginia, AS).Pikeun unggal percobaan, panjang sareng beurat cangkang individu diukur.
Protokol aksés kabuka gratis pikeun program ieu sayogi online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Sakeudeung, hemolymph LB dikumpulkeun tina otot abductor sakumaha ditétélakeun [22].Hemolymph ieu clarified ku sentrifugasi dina 1200 × g salila 3 menit, supernatant ieu beku (-20 ° C) nepi ka dipaké.Pikeun isolasi sareng purifikasi cfDNA, conto (1.5-2.0 ml) dilebur sareng diolah nganggo kit cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) numutkeun petunjuk produsén.ccfDNA disimpen dina -80 ° C dugi analisis salajengna.Dina sababaraha percobaan, ccfDNA diisolasi sareng dimurnikeun nganggo Kit Penyidik ​​DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).DNA anu dimurnikeun diukur nganggo uji PicoGreen standar.Distribusi sempalan tina ccfDNA terasing dianalisis ku éléktroforésis kapilér nganggo bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) nganggo Kit DNA Sensitipitas Tinggi.Uji ieu dilakukeun nganggo 1 µl sampel ccfDNA numutkeun parentah produsén.
Pikeun urutan fragmen hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) nyiapkeun perpustakaan shotgun ngagunakeun kit Campuran DNA Illumina tina kit Illumina MiSeq PE75.A adaptor baku (BioO) dipaké.File data atah sayogi tina NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 sareng SRR8924809).Kualitas bacaan dasar ditaksir nganggo FastQC [23].Trimmomatic [24] geus dipaké pikeun clipping adapters jeung kualitas goréng dibaca.Shotgun berbunyi sareng tungtung dipasangkeun éta FLASH dihijikeun kana bacaan tunggal anu langkung panjang kalayan tumpang tindihna minimum 20 bp pikeun ngahindarkeun mismatches [25]. Bacaan anu dihijikeun dijelaskeun sareng BLASTN nganggo pangkalan data Taksonomi NCBI bivalve (nilai e <1e−3 sareng 90% homology), sareng masking tina sekuen pajeulitna rendah dilaksanakeun nganggo DEBU [26]. Bacaan anu dihijikeun dijelaskeun sareng BLASTN nganggo pangkalan data Taksonomi NCBI bivalve (nilai e <1e−3 sareng 90% homology), sareng masking tina sekuen pajeulitna rendah dilaksanakeun nganggo DEBU [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчорчозлылюм 3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DEBU [26]. Bacaan pooled dijelaskeun sareng BLASTN nganggo pangkalan data taksonomi bivalve NCBI (nilai e <1e-3 sareng 90% homologi), sareng masking sekuen pajeulitna rendah dilaksanakeun nganggo DEBU [26].使用双壳类 NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读敽的读敽，广广使使用 6复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 使并 读数 ， 使用复杂度 序列 的。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двуствочникмчат <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DEBU [26]. Bacaan pooled dijelaskeun sareng BLASTN nganggo pangkalan data taksonomi bivalve NCBI (nilai e <1e-3 sareng 90% homologi), sareng masking sekuen pajeulitna rendah dilaksanakeun nganggo DEBU [26].Bacaan dibagi jadi dua kelompok: patali jeung runtuyan bivalve (di dieu disebut self-reads) jeung teu patali (non-self-reads).Dua grup anu misah dirakit ngagunakeun MEGAHIT ngahasilkeun contigs [27].Samentara éta, sebaran taksonomi microbiome alien maca ieu digolongkeun maké Kraken2 [28] sarta grafis digambarkeun ku grafik pai Krona on Galaxy [29, 30].Kmers optimal ditangtukeun janten kmers-59 tina percobaan awal urang. Contigs diri teras diidentipikasi ku alignment sareng BLASTN (database NCBI bivalve, nilai e <1e−10 sareng 60% homologi) pikeun anotasi ahir. Contigs diri teras diidentipikasi ku alignment sareng BLASTN (database NCBI bivalve, nilai e <1e−10 sareng 60% homologi) pikeun anotasi ahir. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюбиски, 1 мозлюбиск, em 1 ология 60%) для окончательной аннотации. Timer contigs lajeng dicirikeun ku cocog ngalawan BLASTN (NCBI bivalve database, e nilai <1e-10 jeung 60% homology) pikeun annotation final.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识庫美自终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (базал хдмун оллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Self-contigs lajeng dicirikeun pikeun annotation final ku cocog ngalawan BLASTN (NCBI bivalve database, e nilai <1e-10 jeung 60% homology). Dina paralel, nonself group contigs anu annotated kalawan BLASTN (nt database NCBI, e nilai <1e-10 na 60% homology). Dina paralel, nonself group contigs anu annotated kalawan BLASTN (nt database NCBI, e nilai <1e-10 na 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 м. Dina paralel, contigs grup asing anu annotated kalawan BLASTN (NT NCBI database, e nilai <1e-10 jeung 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данныгих nt 1 60%). Dina paralel, contigs grup non-diri anu annotated kalawan BLASTN (nt database NCBI, e nilai <1e-10 jeung 60% homology). BLASTX ogé dilaksanakeun dina nonself contigs ngagunakeun nr na RefSeq protéin basis data NCBI (e nilai <1e-10 na 60% homology). BLASTX ogé dilaksanakeun dina nonself contigs ngagunakeun nr na RefSeq protéin basis data NCBI (e nilai <1e-10 na 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значовие лиолет 6%)-10 e <1e. BLASTX ogé dipigawé dina contigs non-diri ngagunakeun nr na RefSeq NCBI basis data protéin (e nilai <1e-10 jeung 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 怌 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 怌 。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 % BLASTX ogé dipigawé dina non-diri contigs ngagunakeun nr na RefSeq NCBI database protéin (e nilai <1e-10 jeung 60% homology).Kolam BLASTN sareng BLASTX tina non-self-contigs ngagambarkeun contigs ahir (tingali file Suplemén).
Primer dipaké pikeun PCR didaptarkeun dina Table S1.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) dipaké pikeun ngagedékeun gén target ccfDNA.Kaayaan réaksi ieu dipaké: denaturasi dina 95 ° C salila 3 menit, 95 ° C pikeun 1 menit, set suhu annealing pikeun 1 menit, elongation dina 72 ° C salila 1 menit, 35 siklus, sarta tungtungna 72 ° C dina 10 menit..Produk PCR dipisahkeun ku éléktroforésis dina gél agarose (1,5%) anu ngandung SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) dina 95 V.
Kerang (Mytilus spp.) diaklimatisasi dina 500 ml cai laut beroksigén (32 PSU) salila 24 jam dina suhu 4°C.DNA plasmid ngandung insert encoding runtuyan cDNA galectin-7 manusa (nomer digentos NCBI L07769) ditambahkeun kana vial dina konsentrasi ahir 190 μg / μl.Kerang anu diinkubasi dina kaayaan anu sami tanpa tambahan DNA mangrupikeun kontrol.Tangki kontrol katilu ngandung DNA tanpa kerang.Pikeun ngawas kualitas DNA dina cai laut, sampel cai laut (20 μl; tilu pangulangan) dicandak ti unggal tank dina waktos anu dituduhkeun.Pikeun traceability DNA plasmid, LB mussels dipanén dina waktu dituduhkeun sarta dianalisis ku qPCR na ddPCR.Kusabab kandungan uyah anu luhur dina cai laut, alikuot diencerkeun dina cai kualitas PCR (1:10) sateuacan sadaya uji PCR.
Digital droplet PCR (ddPCR) dilaksanakeun nganggo protokol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada).Paké profil hawa pikeun nangtukeun suhu optimum (Table S1).Tetes dihasilkeun ngagunakeun generator serelek QX200 (BioRad).ddPCR dilaksanakeun saperti kieu: 95 ° C salila 5 mnt, 50 siklus 95 ° C salila 30 s sarta suhu annealing dibikeun pikeun 1 mnt jeung 72 ° C salila 30 s, 4 ° C pikeun 5 mnt jeung 90 ° C dina 5 menit.Jumlah tetes sareng réaksi positip (jumlah salinan / µl) diukur nganggo pamaca serelek QX200 (BioRad).Sampel anu kirang ti 10,000 tetes ditolak.Kontrol pola henteu dilaksanakeun unggal waktos ddPCR dijalankeun.
qPCR dilakukeun nganggo Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) sareng primer khusus LGALS7.Sadaya PCR kuantitatif dilakukeun dina 20 µl nganggo Kit PCR Green SYBR QuantiFast (QIAGEN).qPCR dimimitian ku inkubasi 15 mnt dina 95 ° C dituturkeun ku 40 siklus dina 95 ° C salila 10 detik sarta dina 60 ° C salila 60 detik kalayan hiji pendataan.Kurva lebur dihasilkeun ngagunakeun pangukuran berturut-turut dina 95 ° C salami 5 detik, 65 ° C salami 60 detik, sareng 97 ° C dina tungtung qPCR.Unggal qPCR dipigawé dina rangkep tilu, iwal sampel kontrol.
Kusabab kerang dipikanyaho pikeun laju filtrasi anu luhur, urang mimiti nalungtik naha éta tiasa nyaring sareng nahan fragmen DNA anu aya dina cai laut.Kami ogé kabetot naha fragmen ieu ngumpulkeun dina sistem limfatik semi-buka na.Urang ngumbar masalah ieu sacara ékspériméntal ku cara ngalacak nasib fragmen DNA larut anu ditambahkeun kana bak kerang biru.Pikeun mempermudah nyukcruk fragmen DNA, kami nganggo DNA plasmid asing (sanés diri) anu ngandung gén galectin-7 manusa.ddPCR ngalacak fragmen DNA plasmid dina cai laut sareng kerang.Hasil kami nunjukkeun yén lamun jumlah fragmen DNA dina cai laut tetep rélatif konstan kana waktu (nepi ka 7 poé) dina henteuna mussels, lajeng ku ayana mussels tingkat ieu ampir sakabéhna ngiles dina 8 jam (Gbr. 1a,b).Fragmen DNA exogenous gampang dideteksi dina 15 mnt dina cairan intravalvular jeung hemolymph (Gbr. 1c).fragmen ieu masih bisa dideteksi nepi ka 4 jam sanggeus paparan.Aktivitas nyaring ieu ngeunaan fragmen DNA sabanding sareng kagiatan nyaring baktéri sareng ganggang [31].Hasil ieu nunjukkeun yén kerang tiasa nyaring sareng ngumpulkeun DNA asing dina kompartemen cairanana.
Konsentrasi relatif DNA plasmid dina cai laut dina ayana (A) atanapi henteuna (B) mussels, diukur ku ddPCR.Dina A, hasilna dinyatakeun salaku persentase, kalayan wates kotak-kotak ngalambangkeun persentil ka-75 sareng ka-25.Kurva logaritmik anu dipasang dipidangkeun dina warna beureum, sareng daérah anu diwarnaan ku abu ngagambarkeun interval kapercayaan 95%.Dina B, garis beureum ngagambarkeun mean jeung garis biru ngagambarkeun interval kapercayaan 95% keur konsentrasi.C Akumulasi DNA plasmid dina hemolymph jeung cairan valvular mussels dina waktu nu beda sanggeus tambahan DNA plasmid.Hasilna dibere salaku salinan mutlak dideteksi/mL (± SE).
Salajengna, urang nalungtik asal usul ccfDNA dina mussels dikumpulkeun tina ranjang mussel di Kapuloan Kerguelen, grup terpencil pulo kalawan pangaruh anthropogenic kawates.Pikeun tujuan ieu, cccDNA tina hemolymphs mussel diisolasi sareng dimurnikeun ku cara anu biasa dianggo pikeun ngamurnikeun cccDNA manusa [32, 33].Urang manggihan yén rata-rata konsentrasi hemolymph ccfDNA dina mussels aya dina micrograms low per ml rentang hemolymph (tingali Table S2, Émbaran Suplemén).Kisaran konsentrasi ieu langkung ageung tibatan jalma séhat (nanogram rendah per mililiter), tapi dina kasus anu jarang, dina penderita kanker, tingkat ccfDNA tiasa ngahontal sababaraha mikrogram per mililiter [34, 35].Analisis tina distribusi ukuran hemolymph ccfDNA némbongkeun yén fragmen ieu greatly rupa-rupa ukuranana, mimitian ti 1000 bp nepi ka 1000 bp.nepi ka 5000 bp (Gbr. 2).Hasil anu sami dicandak nganggo Kit Penyidik ​​​​QIAamp basis silika, metode anu biasa dianggo dina élmu forensik pikeun gancang ngasingkeun sareng ngamurnikeun DNA génomik tina conto DNA konsentrasi rendah, kalebet ccfDNA [36].
Perwakilan ccfDNA electrophoregram of mussel hemolymph.Diekstrak sareng Kit Plasma NucleoSnap (luhureun) sareng Kit Investigator DNA QIAamp.B Biola plot némbongkeun distribusi konsentrasi hemolymph ccfDNA (± SE) dina mussels.Garis hideung sareng beureum ngawakilan median sareng kuartil kahiji sareng katilu, masing-masing.
Kira-kira 1% ccfDNA dina manusa sareng primata ngagaduhan sumber asing [21, 37].Kusabab sistem sirkulasi semi-kabuka bivalves, cai laut anu beunghar ku mikroba, sareng distribusi ukuran ccfDNA kerang, kami hipotésis yén ccfDNA hemolymph mussel tiasa ngandung kumpulan DNA mikroba anu beunghar sareng rupa-rupa.Pikeun nguji hipotésis ieu, urang sequenced hemolymph ccfDNA tina sampel Aulacomya atra dikumpulkeun ti Kapuloan Kerguelen, ngahasilkeun leuwih 10 juta dibaca, 97,6% diantarana lulus kadali kualitas.Bacaan teras digolongkeun dumasar kana sumber diri sareng non-diri ngagunakeun BLASTN sareng NCBI bivalve database (Gbr. S1, Émbaran Suplemén).
Dina manusa, DNA nuklir sareng mitokondria tiasa dileupaskeun kana aliran getih [38].Sanajan kitu, dina ulikan ayeuna, éta teu mungkin pikeun ngajelaskeun sacara rinci DNA génomik nuklir tina mussels, nunjukkeun yen génom A. atra teu acan sequenced atanapi digambarkeun.Najan kitu, urang bisa ngaidentipikasi sababaraha fragmen ccfDNA asal urang sorangan ngagunakeun perpustakaan bivalve (Gbr. S2, Émbaran Suplemén).Urang ogé dikonfirmasi ayana fragmen DNA asal urang sorangan ku diarahkeun PCR Gedekeun maranéhanana A. gén atra nu sequenced (Gbr. 3).Nya kitu, nunjukkeun yen génom mitokondria A. atra sadia dina database umum, hiji bisa manggihan bukti ayana fragmen ccfDNA mitokondria dina hemolymph of A. atra.Ayana fragmen DNA mitokondria dikonfirmasi ku amplifikasi PCR (Gbr. 3).
Rupa-rupa gén mitokondria éta hadir dina hemolymph of A. atra (titik beureum - jumlah stock: SRX5705969) jeung M. platensis (titik biru - jumlah stock: SRX5705968) amplified ku PCR.Gambar diadaptasi tina Breton et al., 2011 B amplifikasi supernatant hemolymph ti A. atra Disimpen dina kertas FTA.Anggo punch 3 mm pikeun nambihan langsung kana tabung PCR anu ngandung campuran PCR.
Dibikeun eusi mikroba loba pisan dina cai laut, urang mimitina fokus kana characterization runtuyan DNA mikroba dina hemolymph.Jang ngalampahkeun ieu, urang ngagunakeun dua strategi béda.Strategi munggaran ngagunakeun Kraken2, program klasifikasi urutan dumasar-algoritma anu tiasa ngaidentipikasi sekuen mikroba kalayan akurasi anu dibandingkeun sareng BLAST sareng alat-alat sanés [28].Leuwih ti 6719 dibaca ditangtukeun asalna baktéri, sedengkeun 124 jeung 64 ti archaea jeung virus, masing-masing (Gbr. 4).Fragmén DNA baktéri anu paling seueur nyaéta Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), sareng Bacteroidetes (17%) (Gbr. 4a).Sebaran ieu konsisten sareng studi saméméhna tina microbiome mussel biru laut [39, 40].Gammaproteobacteria éta kelas utama Proteobacteria (44%), kaasup loba Vibrionales (Gbr. 4b).Metodeu ddPCR dikonfirmasi ayana fragmen DNA Vibrio dina ccfDNA of A. atra hemolymph (Gbr. 4c) [41].Pikeun ménta inpo nu langkung lengkep ihwal asal baktéri ccfDNA, hiji pendekatan tambahan dicokot (Gbr. S2, Émbaran Suplemén). Dina hal ieu, bacaan anu tumpang tindih dirakit salaku bacaan anu dipasangkeun-tungtung sareng digolongkeun kana diri (bivalves) atanapi asal nonself nganggo BLASTN sareng nilai e 1e-3 sareng cutoff kalayan> 90% homologi. Dina hal ieu, bacaan anu tumpang tindih dirakit salaku bacaan anu dipasangkeun-tungtung sareng digolongkeun kana diri (bivalves) atanapi asal nonself nganggo BLASTN sareng nilai e 1e-3 sareng cutoff kalayan> 90% homologi. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированыесторный какдлунба юски) atanapi чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. Dina hal ieu, bacaan anu tumpang tindih dikumpulkeun salaku bacaan anu dipasangkeun sareng digolongkeun salaku asli (bivalve) atanapi henteu asli nganggo BLASTN sareng nilai e 1e-3 sareng cutoff kalayan> 90% homologi.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 会和>90% 我家为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的9 和 的 9 和 的 和 和 9 %同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身………..……….. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собстолостверный и) atanapi несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Dina hal ieu, bacaan anu tumpang tindih dikumpulkeun salaku bacaan anu dipasangkeun sareng digolongkeun kana sorangan (bivalves) atanapi henteu asli nganggo nilai BLASTN sareng 1e-3 sareng ambang homologi> 90%.Kusabab génom A. atra henteu acan diurutkeun, kami nganggo strategi assembly de novo tina assembler MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Jumlahna aya 147.188 contigs geus diidentifikasi minangka gumantung (bivalves) asalna.Contigs ieu teras ngabeledug kalayan nilai-e 1e-10 nganggo BLASTN sareng BLASTX.Strategi ieu ngamungkinkeun urang pikeun ngaidentipikasi 482 fragmen non-bivalve anu aya dina A. atra ccfDNA.Leuwih ti satengah (57%) tina fragmen DNA ieu dicandak ti baktéri, utamana tina simbion gill, kaasup symbionts sulfotrophic, sarta tina simbionts gill Solemya velum (Gbr. 5).
Kelimpahan relatif dina tingkat tipe.B Karagaman mikroba tina dua filum utama (Firmicutes sareng Proteobacteria).Gedekeun wawakil ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmen gén rRNA 16S (biru) dina tilu hemolymphs atra.
Jumlahna aya 482 contigs dikumpulkeun dianalisis.Profil umum distribusi taksonomi anotasi contig metagenomik (prokariot sareng eukariot).B Distribusi lengkep fragmen DNA baktéri anu diidentipikasi ku BLASTN sareng BLASTX.
Analisis Kraken2 ogé némbongkeun yén mussel ccfDNA ngandung fragmen DNA archaeal, kaasup fragmen DNA Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), sarta Thaurmarcheota (11%) (Gbr. 6a).Ayana fragmen DNA diturunkeun tina Euryarchaeota jeung Crenarchaeota, saméméhna kapanggih dina komunitas mikroba mussels Californian, teu matak heran [42].Sanaos Euryarchaeota sering dipatalikeun sareng kaayaan anu ekstrim, ayeuna dipikanyaho yén Euryarchaeota sareng Crenarcheota mangrupikeun prokariot anu paling umum dina lingkungan cryogenic laut [43, 44].Ayana mikroorganisme métanogén dina mussels teu heran, dibere laporan panganyarna ngeunaan leaks métana éksténsif ti leaks handap dina Kerguelen Plateau [45] sarta mungkin produksi métana mikroba dititénan kaluar basisir Kapuloan Kerguelen [46].
Perhatian urang teras ngalih ka bacaan tina virus DNA.Kanggo pangaweruh anu saé, ieu mangrupikeun panilitian anu teu sasar munggaran ngeunaan eusi virus kerang.Saperti nu diharapkeun, urang kapanggih fragmen DNA tina bacteriophages (Caudovirales) (Gbr. 6b).Sanajan kitu, DNA virus nu paling umum asalna tina filum nucleocytoviruses, ogé katelah nuclear cytoplasmic large DNA virus (NCLDV), nu boga génom pangbadagna ti sagala virus.Dina filum ieu, lolobana runtuyan DNA milik kulawarga Mimimidoviridae (58%) jeung Poxviridae (21%), nu host alam ngawengku vertebrata jeung artropoda, sedengkeun proporsi leutik runtuyan DNA ieu milik ganggang virologis dipikawanoh.Menginféksi alga eukariota laut.Runtuyanna ogé dicandak tina virus Pandora, virus raksasa kalayan ukuran génom panggedena tina sagala genera virus anu dipikanyaho.Narikna, rentang sarwa dipikawanoh kainfeksi virus, sakumaha ditangtukeun ku sequencing hemolymph ccfDNA, éta kawilang badag (Gambar S3, Émbaran Suplemén).Éta kalebet virus anu nginféksi serangga sapertos Baculoviridae sareng Iridoviridae, ogé virus anu nginféksi amoeba, ganggang sareng vertebrata.Kami ogé mendakan sekuen anu cocog sareng génom Pithovirus sibericum.Pitoviruses (ogé katelah "virus zombie") munggaran diisolasi tina permafrost heubeul 30.000 taun di Siberia [47].Ku kituna, hasil urang saluyu jeung laporan saméméhna némbongkeun yén teu sakabéh spésiés modern tina virus ieu punah [48] sarta yén virus ieu bisa aya dina ékosistem laut subarctic jauh.
Tungtungna, urang diuji pikeun ningali naha urang tiasa mendakan fragmen DNA tina sato multisélular sanés.Jumlahna aya 482 contigs asing dicirikeun ku BLASTN na BLASTX kalawan perpustakaan nt, nr na RefSeq (génomik jeung protéin).Hasil kami nunjukkeun yén diantara fragmen asing ccfDNA sato multisélular DNA tulang bony predominates (Gbr. 5).fragmen DNA tina serangga jeung spésiés séjén ogé geus kapanggih.Bagian anu kawilang ageung tina fragmen DNA teu acan diidentifikasi, sigana kusabab underrepresentation sajumlah ageung spésiés laut dina database génomik dibandingkeun sareng spésiés terestrial [49].
Dina makalah ayeuna, urang nerapkeun konsép LB mun mussels, arguing yén hemolymph ccfDNA shot sequencing bisa nyadiakeun wawasan komposisi ekosistem basisir laut.Hususna, urang manggihan yén 1) hemolymph mussel ngandung konsentrasi rélatif luhur (tingkat mikrogram) tina rélatif badag (~ 1-5 kb) sirkulasi fragmen DNA;2) fragmen DNA ieu duanana bebas jeung non-bebas 3) Diantara sumber asing tina fragmen DNA ieu, urang kapanggih baktéri, archaeal jeung DNA viral, kitu ogé DNA sato multisélular séjén;4) Akumulasi fragmen ccfDNA asing ieu dina hemolymph lumangsung gancang sarta nyumbang kana aktivitas nyaring internal tina mussels.Dina kacindekan, ulikan kami nunjukkeun yén konsép LB, anu sajauh ieu diterapkeun utamana dina widang biomedis, ngodekeun sumber pangaweruh anu beunghar tapi teu dijelajah anu tiasa dianggo pikeun langkung ngartos interaksi antara spésiés sentinel sareng lingkunganana.
Salian primata, isolasi ccfDNA parantos dilaporkeun dina mamalia, kalebet beurit, anjing, ucing, sareng kuda [50, 51, 52].Najan kitu, pikeun pangaweruh urang, ulikan urang téh kahiji ngalaporkeun deteksi na sequencing of ccfDNA dina spésiés laut kalawan sistem sirkulasi kabuka.Fitur anatomis ieu sareng kamampuan nyaring mussels, sahenteuna sabagian, ngajelaskeun karakteristik ukuran anu béda tina fragmen DNA anu ngiderkeun dibandingkeun spésiés séjén.Dina manusa, seuseueurna fragmen DNA anu beredar dina getih mangrupikeun fragmen leutik ukuranana ti 150 dugi ka 200 bp.kalawan puncak maksimum 167 bp [34, 53].Sabagian leutik tapi signifikan tina fragmen DNA ukuranana antara 300 jeung 500 bp, sarta ngeunaan 5% leuwih panjang batan 900 bp.[54].Alesan pikeun distribusi ukuran ieu nyaéta yén sumber utama ccfDNA dina plasma lumangsung salaku hasil tina maotna sél, boh alatan maot sél atawa alatan necrosis sirkulasi sél hematopoietic dina individu cageur atawa alatan apoptosis sél tumor dina penderita kanker (katelah sirkulasi tumor DNA)., ctDNA).Sebaran ukuran ccfDNA hemolymph nu urang kapanggih dina mussels ranged ti 1000 nepi ka 5000 bp, suggesting nu mussel ccfDNA boga asal béda.Ieu hipotésis logis, sabab mussels boga sistem vaskular semi-kabuka sarta hirup di lingkungan akuatik laut ngandung konsentrasi luhur DNA génomik mikroba.Kanyataanna, percobaan laboratorium urang ngagunakeun DNA exogenous geus ditémbongkeun yén mussels ngumpulkeun fragmen DNA dina cai laut, sahenteuna sanggeus sababaraha jam aranjeunna didegradasi sanggeus uptake sélular jeung/atawa dileupaskeun jeung/atawa disimpen di sagala rupa organisasi.Kusabab langkana sél (boh prokariot sareng eukariot), panggunaan kompartemen intravalvular bakal ngirangan jumlah ccfDNA tina sumber diri ogé tina sumber asing.Mertimbangkeun pentingna kekebalan bawaan bivalve jeung jumlah badag fagosit sirkulasi, urang salajengna hipotésis yén sanajan ccfDNA asing ieu enriched dina sirkulasi fagosit nu ngumpulkeun DNA asing kana asupan mikroorganisme jeung / atawa lebu sélular.Dihijikeun, hasil kami nunjukkeun yén bivalve hemolymph ccfDNA mangrupikeun gudang unik inpormasi molekular sareng nguatkeun statusna salaku spésiés sentinel.
Data kami nunjukkeun yén sequencing sareng analisa fragmen hemolymph ccfDNA turunan baktéri tiasa masihan inpormasi konci ngeunaan flora baktéri host sareng baktéri anu aya dina ekosistem laut sakurilingna.Téhnik sequencing shot geus wangsit sekuen commensal baktéri A. atra gill nu bakal geus lasut lamun métode idéntifikasi 16S rRNA konvensional geus dipaké, alatan sabagian bias perpustakaan rujukan.Kanyataanna, pamakéan kami data LB dikumpulkeun ti M. platensis dina lapisan mussel sarua di Kerguelen némbongkeun yén komposisi symbionts baktéri pakait gill éta sami pikeun duanana spésiés mussel (Gbr. S4, Émbaran tambahan).Kasaruaan ieu dua mussels genetik béda bisa ngagambarkeun komposisi komunitas baktéri dina tiis, sulfurous, jeung deposit vulkanik Kerguelen [55, 56, 57, 58].Tingkat luhur mikroorganisme pangurangan walirang parantos dijelaskeun saé nalika panén kerang ti daérah basisir bioturbated [59], sapertos basisir Port-au-France.Kamungkinan sanésna nyaéta flora mussel commensal tiasa kapangaruhan ku transmisi horizontal [60, 61].Panaliti langkung seueur diperyogikeun pikeun nangtukeun korélasi antara lingkungan laut, permukaan dasar laut, sareng komposisi baktéri simbiotik dina kerang.Studi ieu ayeuna nuju lumangsung.
Panjang jeung konsentrasi hemolymph ccfDNA, betah na purifikasi, sarta kualitas luhur pikeun ngidinan shotgun sequencing gancang sababaraha kaunggulan tina ngagunakeun mussel ccfDNA pikeun assess biodiversity dina ekosistem basisir laut.Pendekatan ieu hususna efektif pikeun ngacirian komunitas virus (viromes) dina ékosistem anu dipasihkeun [62, 63].Teu kawas baktéri, archaea, jeung eukariota, génom viral teu ngandung gén phylogenetically conserved kayaning runtuyan 16S.Hasil kami nunjukkeun yén biopsi cair tina spésiés indikator sapertos mussels tiasa dianggo pikeun ngaidentipikasi jumlah fragmen virus ccfDNA anu kawilang ageung anu dipikanyaho nginféksi host anu biasana nyicingan ékosistem laut basisir.Ieu kalebet virus anu dipikanyaho nginféksi protozoa, artropoda, serangga, pepelakan, sareng virus baktéri (contona, bakteriofag).Sebaran sarupa kapanggih nalika urang nalungtik hemolymph ccfDNA virome of mussels biru (M. platensis) dikumpulkeun dina lapisan mussel sarua di Kerguelen (Table S2, Émbaran tambahan).Shotgun sequencing of ccfDNA memang pendekatan anyar gaining moméntum dina ulikan ngeunaan virome manusa atawa spésiés séjén [21, 37, 64].Pendekatan ieu hususna kapaké pikeun ngulik virus DNA untai ganda, sabab henteu aya gen tunggal anu dilestarikan diantara sadaya virus DNA untai ganda, ngagambarkeun kelas virus anu paling beragam sareng lega di Baltimore [65].Sanajan lolobana virus ieu tetep unclassified sarta bisa ngawengku virus ti bagian lengkep kanyahoan tina dunya viral [66], kami manggihan yén viromes jeung rentang host tina mussels A. atra jeung M. platensis ragrag antara dua spésiés.sarua (tingali gambar S3, inpo tambahan).Kasaruaan ieu teu héran, sabab tiasa nunjukkeun kurangna selektivitas dina nyerep DNA anu aya di lingkungan.Studi kahareup ngagunakeun RNA dimurnikeun ayeuna diperlukeun pikeun characterize RNA virome.
Dina ulikan urang, urang ngagunakeun pipa pisan rigorous diadaptasi tina karya Kowarski sareng kolega [37], anu ngagunakeun dua-hambalan ngahapus pooled maos jeung contigs saméméh jeung sanggeus assembly of ccfDNA asli, hasilna proporsi luhur unmapped maca.Ku alatan éta, urang teu bisa nolak yén sababaraha bacaan nu teu dipetakan ieu bisa kénéh boga asal sorangan, utamana kusabab urang teu boga génom rujukan pikeun spésiés mussel ieu.Kami ogé ngagunakeun pipa ieu kusabab kami prihatin ngeunaan chimeras antara bacaan diri sareng non-diri sareng panjang bacaan anu dihasilkeun ku Illumina MiSeq PE75.Alesan sejen pikeun mayoritas bacaan uncharted nyaeta loba mikroba laut, utamana di wewengkon terpencil kayaning Kerguelen, teu acan annotated.Kami nganggo Illumina MiSeq PE75, nganggap panjang fragmen ccfDNA sami sareng ccfDNA manusa.Pikeun panilitian anu bakal datang, upami hasil kami nunjukkeun yén hemolymph ccfDNA gaduh bacaan anu langkung lami tibatan manusa sareng / atanapi mamalia, kami nyarankeun ngagunakeun platform sequencing anu langkung cocog pikeun fragmen ccfDNA anu langkung panjang.Prakték ieu bakal ngagampangkeun pikeun ngaidentipikasi langkung seueur indikasi pikeun analisa anu langkung jero.Meunangkeun runtuyan génom nuklir A. atra lengkep ayeuna teu sadia ogé bakal greatly mempermudah diskriminasi ccfDNA ti sumber diri jeung non-diri.Nunjukkeun yen panalungtikan urang geus fokus kana kamungkinan nerapkeun konsép biopsy cair mun mussels, urang miharep yén salaku konsép ieu dipaké dina panalungtikan kahareup, parabot anyar jeung pipelines bakal dimekarkeun pikeun ngaronjatkeun potensi metoda ieu diajar diversity mikroba mussels.ékosistem laut.
Salaku biomarker klinis non-invasif, tingkat plasma manusa elevated of ccfDNA pakait sareng sagala rupa panyakit, karuksakan jaringan, jeung kaayaan stress [67,68,69].Kanaékan ieu pakait sareng sékrési fragmen DNA asal sorangan saatos karusakan jaringan.Urang kajawab masalah ieu ngagunakeun stress panas akut, nu mussels anu sakeudeung kakeunaan suhu 30 °C.Urang ngalaksanakeun analisis ieu dina tilu tipena béda mussels dina tilu percobaan bebas.Tapi, kami henteu mendakan parobahan dina tingkat ccfDNA saatos setrés panas akut (tingali Gambar S5, inpormasi tambahan).Papanggihan ieu bisa ngajelaskeun, sahenteuna sabagian, kanyataan yén mussels boga sistem sirkulasi semi-kabuka sarta ngumpulkeun jumlah badag DNA asing alatan aktivitas nyaring tinggi maranéhanana.Di sisi séjén, mussels, kawas loba invertebrata, bisa jadi leuwih tahan ka karuksakan jaringan stress-ngainduksi, kukituna ngawatesan sékrési ccfDNA dina hemolymph maranéhanana [70, 71].
Nepi ka ayeuna, analisis DNA biodiversiti dina ékosistem akuatik utamana fokus kana DNA lingkungan (eDNA) metabarcoding.Sanajan kitu, métode ieu biasana diwatesan dina analisis biodiversity lamun primers dipaké.Pamakéan sequencing shotgun circumvents watesan PCR sarta seleksi bias set primer.Ku kituna, dina harti, métode kami leuwih deukeut kana metodeu sequencing eDNA Shotgun-throughput tinggi anu nembe dianggo, anu tiasa langsung ngaruntuykeun DNA fragméntasi sareng nganalisis ampir sadaya organisme [72, 73].Nanging, aya sababaraha masalah dasar anu ngabédakeun LB tina metode eDNA standar.Tangtosna, bédana utama antara eDNA sareng LB nyaéta panggunaan host filter alami.Pamakéan spésiés laut kayaning spons jeung bivalves (Dresseina spp.) Salaku filter alam pikeun diajar eDNA geus dilaporkeun [74, 75].Sanajan kitu, ulikan Dreissena ngagunakeun biopsies jaringan ti mana DNA ieu sasari.Analisis ccfDNA ti LB teu merlukeun biopsy jaringan, parabot husus sarta kadangkala mahal jeung logistik pakait sareng eDNA atawa biopsy jaringan.Nyatana, urang nembe ngalaporkeun yén ccfDNA ti LB tiasa disimpen sareng dianalisis kalayan dukungan FTA tanpa ngajaga ranté tiis, anu mangrupikeun tantangan utama pikeun panalungtikan di daérah terpencil [76].Ékstraksi ccfDNA tina biopsi cair ogé saderhana sareng nyayogikeun DNA kualitas luhur pikeun sekuen shotgun sareng analisa PCR.Ieu mangrupikeun kauntungan anu ageung tina sababaraha watesan téknis anu aya hubunganana sareng analisis eDNA [77].Kesederhanaan sareng biaya anu murah tina metode sampling ogé cocog pikeun program ngawaskeun jangka panjang.Salian kamampuan panyaring anu luhur, ciri bivalves anu kasohor sanésna nyaéta komposisi mucopolysaccharide kimia tina mukusna, anu ngamajukeun nyerep virus [78, 79].Hal ieu ngajadikeun bivalves saringan alam idéal pikeun ngacirian kaanekaragaman hayati sareng dampak parobahan iklim dina ékosistem akuatik anu tangtu.Sanaos ayana fragmén DNA turunan host tiasa ditingali salaku watesan metode dibandingkeun sareng eDNA, biaya anu aya hubunganana sareng gaduh ccfDNA asli sapertos dibandingkeun sareng eDNA sacara sakaligus kaharti pikeun seueur inpormasi anu sayogi pikeun studi kaséhatan.host offset.Ieu ngawengku ayana runtuyan viral terpadu kana génom host host.Ieu hususna penting pikeun mussels, nunjukkeun ayana retroviruses leukemia horisontal dikirimkeun dina bivalves [80, 81].Kauntungan sejen tina LB leuwih eDNA nya éta mangpaatkeun aktivitas fagositik sél getih sirkulasi dina hemolymph nu engulfs mikroorganisme (jeung génom maranéhanana).Fagositosis nyaéta fungsi utama sél getih dina bivalves [82].Tungtungna, métode nyokot kauntungan tina kapasitas nyaring luhur mussels (rata-rata 1,5 l / h tina seawater) jeung sirkulasi dua poé, nu ngaronjatkeun pergaulan lapisan béda tina seawater, sahingga newak eDNA heterologous.[83, 84].Ku kituna, analisa ccfDNA remis mangrupikeun jalan anu pikaresepeun tina pangaruh gizi, ékonomi, sareng lingkungan tina kerang.Sarupa jeung analisis LB dikumpulkeun ti manusa, metoda ieu ogé muka kamungkinan ngukur parobahan genetik na epigenetic DNA host dina respon kana zat exogenous.Contona, téknologi urutan generasi katilu tiasa dibayangkeun pikeun ngalakukeun analisis métilasi génom-lega dina ccfDNA asli nganggo urutan nanopore.Prosés ieu kedah difasilitasi ku kanyataan yén panjang fragmén ccfDNA mussel cocog sareng platform sequencing anu dibaca panjang anu ngamungkinkeun analisa methylation DNA génom-lega tina sekuensing tunggal tanpa butuh transformasi kimia.85,86] Ieu mangrupikeun kamungkinan anu pikaresepeun, sabab parantos nunjukkeun yén pola métilasi DNA sareng ngeunteung réspon kana gén stres lingkungan.Ku alatan éta, éta tiasa masihan wawasan anu berharga kana mékanisme anu ngatur réspon saatos paparan ka perubahan iklim atanapi polutan [87].Sanajan kitu, pamakéan LB teu tanpa watesan.Gunana pikeun nyebutkeun, ieu merlukeun ayana spésiés indikator dina ékosistem.Sakumaha didadarkeun di luhur, ngagunakeun LB pikeun meunteun kaanekaragaman hayati hiji ékosistem anu tangtu ogé merlukeun pipa bioinformatika anu ketat anu merhatikeun ayana fragmen DNA tina sumberna.Masalah utama sanésna nyaéta kasadiaan génom rujukan pikeun spésiés laut.Diharapkeun yén inisiatif sapertos Marine Mammal Genomes Project sareng proyék Fish10k anu nembé diadegkeun [88] bakal ngagampangkeun analisa sapertos kitu di hareup.Aplikasi tina konsép LB kana organisme filter-dahar laut oge cocog jeung kamajuan panganyarna dina téhnologi sequencing, sahingga ogé cocog pikeun ngembangkeun multi-ohm biomarkers nyadiakeun informasi penting ngeunaan kaséhatan habitat laut dina respon kana stress lingkungan.
Data sequencing génom geus disimpen dina NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 handapeun Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Dampak parobahan iklim dina kahirupan laut jeung ékosistem.Cole Biologi.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Mertimbangkeun dampak gabungan parobahan iklim jeung stressors lokal lianna dina lingkungan laut.lingkungan ilmiah umum.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Élmu mimiti Maret.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Ngurangan kasabaran panas dina kaayaan stress panas repetitive ngécéskeun mortality usum panas luhur mussels biru.Laporan ilmiah 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Parobahan panganyarna dina frékuénsi, sabab jeung extent maotna sato.Proc Natl Acad Sci AS.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugheti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Sababaraha patogén non-spésifik-spésifik mungkin geus ngabalukarkeun mortality massa Pinna nobilis.Hirup.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Poténsi dampak parobahan iklim dina kasakit zoonotic Arktik.Kaséhatan Int J Circumpolar.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Kerang biru (Mytilus edulis spp.) salaku organisme sinyal dina ngawaskeun polusi basisir: ulasan.Mar Lingkungan Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Pamaduan biopsy cair dina pengobatan kanker.Nat Rev Bersih Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.maturation biopsy cair: Ngidinan DNA tumor pikeun ngiderkeun.Nat Rev Kangker.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. asam nukléat dina plasma manusa.Notulen rapat anak perusahaan Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Peran anyar pikeun DNA bébas sél salaku spidol molekular pikeun pengobatan kanker.Kuantifikasi analisis biomolar.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy asup ka klinik - isu palaksanaan jeung tantangan hareup.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW jeung sajabana.DNA fétal aya dina plasma sareng sérum maternal.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Gempa SR Study tina kursus kakandungan jeung komplikasi na ngagunakeun sirkulasi RNA extracellular dina getih awéwé nalika kakandungan.Dopediatrics.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsi cair: DNA bébas sél donor dipaké pikeun ngadeteksi lesi alogén dina tandur ginjal.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovasi dina diagnostics prenatal: maternal plasma génom sequencing.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Deteksi patogén gancang kalayan urutan metagénomik generasi salajengna tina cairan awak anu kainféksi.Nat Kedokteran.2021;27:115-24.