Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngajantenkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) nyaéta tutuwuhan leguminous dipaké pikeun produksi pangan jeung perbaikan taneuh.Perluasan global NLL salaku pamotongan parantos narik seueur jamur patogén, kalebet antraknosa lupine, anu nyababkeun panyakit antraknosa anu dahsyat.Dua alél, Lanr1 sareng AnMan, anu nyababkeun paningkatan résistansi, parantos dianggo dina pembibitan NLL, tapi mékanisme molekular dasarna tetep teu dipikanyaho.Dina ulikan ieu, spidol Lanr1 sareng AnMan dianggo pikeun nyaring sampel NLL Éropa.Uji coba vaksin di lingkungan anu dikendalikeun mastikeun efficacy duanana donor tahan.Profil éksprési gén diferensial dilakukeun dina garis anu tahan sareng rentan.Résistansi anthracnose pakait sareng overexpression tina istilah ontologi gén "GO: 0006952 Tanggapan Pertahanan", "GO: 0055114 Prosés Rédoks", sareng "GO: 0015979 Fotosintésis".Sajaba ti éta, jalur Lanr1 (83A: 476) némbongkeun reprogramming transcriptome signifikan gancang sanggeus inokulasi, sedengkeun garis séjén némbongkeun reureuh di respon ieu ngeunaan 42 jam.Réspon pertahanan dikaitkeun sareng gén TIR-NBS, CC-NBS-LRR sareng NBS-LRR, 10 protéin aub dina pathogenesis, protéin transfer lipid, endoglucan-1,3-β-glucosidase, protéin témbok sél anu beunghar glisin, sareng gén tina jalur réaktif oksigén.Réspon awal pikeun 83A: 476, kalebet suprési ati-ati gén anu aya hubunganana sareng fotosintésis, coincided sareng panangtayungan suksés salami fase pertumbuhan vegetatif biologi jamur, nunjukkeun yén éféktor memicu kekebalan.Réaksi Mandeloop dilempengkeun, sakumaha ogé sered horizontal sakabéh.
Lupin berdaun heureut (NLL, Lupinus angustifolius L.) nyaéta sereal protéin luhur anu asalna di wewengkon Mediterania barat1,2.Ayeuna dipelak salaku pepelakan pangan pikeun sato sareng manusa.Hal ieu ogé dianggap kandang héjo dina sistem rotasi pamotongan alatan fiksasi nitrogén ku baktéri ngaropéa nitrogén simbiotik jeung perbaikan sakabéh struktur taneuh.NLL parantos ngalaman prosés doméstikasi anu gancang dina abad ka tukang sareng masih aya dina tekanan beternak anu luhur3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Kalayan budidaya NLL anu nyebar, suksesi jamur patogén ngembangkeun ceruk tatanén énggal sareng nyababkeun panyakit anu ngancurkeun pamotongan énggal. Anu paling luar biasa pikeun patani sareng peternak lupin nyaéta penampilan antraknosa, disababkeun ku jamur patogén, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Anu paling luar biasa pikeun patani sareng peternak lupin nyaéta penampilan antraknosa, disababkeun ku jamur patogén, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного паморгенгринборный , Feiler & Hagedorn13. Anu paling kasohor pikeun patani sareng peternak lupin nyaéta munculna antraknosa anu disababkeun ku jamur patogén Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真由病原真tric菌 & Feelernbergi (ondarhum) Lunenbergi Lung引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌菌病真菌 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемогего примармитор Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Anu paling pikaresepeun pikeun patani sareng peternak lupin nyaéta munculna antraknosa anu disababkeun ku jamur patogén Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Laporan pangheubeulna ngeunaan kasakit asalna ti Brazil jeung Amérika Serikat, kalayan gejala has muncul dina 1912 jeung 1929 mungguh.Nanging, saatos sakitar 30 taun, patogén ieu ditunjuk salaku Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph of Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dina Morfologi sasaran. & H. Schrenk,. & H. Schrenk,.jeung H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.jeung H. Schlenk,.Phenotyping kasakit awal dilakukeun dina pertengahan abad ka-20 némbongkeun sababaraha résistansi dina NLL na lupine konéng (L. luteus L.) accessions, tapi sakabéh lupin bodas (L. albus L.) accessions diuji éta kacida susceptible15,16.Studi geus ditémbongkeun yén ngembangkeun anthracnose pakait sareng ngaronjat présipitasi (kalembaban hawa) jeung suhu (dina rentang 12-28 ° C), ngarah kana palanggaran résistansi dina suhu nu leuwih luhur17, 18. Kanyataanna, waktu diperlukeun pikeun conidia berkecambah jeung kasakit dimimitian, éta opat kali pondok dina 24 ° C dina kaayaan 12 ° C (12 jam).Ku kituna, pamanasan global anu lumangsung parantos nyababkeun panyebaran anthracnose.Sanajan kitu, kasakit ieu dititénan di Perancis (1982) jeung Ukraina (1983) salaku harbinger tina ancaman impending, tapi ieu tétéla dipaliré ku industri lupine dina waktos20,21.Sababaraha taun ti harita, panyakit anu dahsyat ieu sumebar ka sakuliah dunya sareng ogé mangaruhan nagara-nagara anu ngahasilkeun lupin sapertos Australia, Polandia sareng Jerman22,23,24.Saatos wabah anthracnose dina pertengahan 1990-an, saringan éksténsif nyababkeun idéntifikasi sababaraha donor tahan dina sampel NLL19.Résistansi NLL ka antraknosa dikontrol ku dua alél dominan anu misah anu aya dina sumber plasma nutfah anu béda: Lanr1 dina kultivar Tanjil sareng Wonga sareng AnMan dina kultivar.Mandalay 25, 26. Alél ieu ngalengkepan spidol molekular nu ngarojong seleksi germplasm tahan dina program pembibitan25,26,27,28,29,30.Jalur beternak tahan 83A: 476 mawa alél Lanr1 ieu meuntas jeung garis liar susceptible P27255 pikeun ménta hiji populasi RIL segregating pikeun lalawanan anthracnose, nu ngamungkinkeun pikeun napelkeun locus Lanr1 kana kromosom NLL-1131, 32, 33. Alignment tina hiji résistansi beungkeutan NLL-1131, 32, 33. nembongkeun lokasi sakabeh tilu alél dina kromosom sarua (NLL-11), tapi dina posisi béda29,34,35.Sanajan kitu, alatan jumlah leutik RILs sarta jarak genetik badag antara spidol jeung alél pakait, euweuh conclusions dipercaya bisa ditarik ngeunaan gén kaayaan maranéhanana.Di sisi séjén, pamakéan genetik sabalikna dina lupins hésé alatan poténsi regenerasi pisan low maranéhanana, nu ngajadikeun manipulasi genetik pajeujeut37.
Ngembangkeun germplasm domestik mawa alél nu dipikahoyong dina kaayaan homozygous, kayaning 83A: 476 (Lanr1) jeung Mandelup (AnMan), geus muka panto pikeun nalungtik résistansi anthracnose dina nyanghareupan ayana kombinasi lawan tina alél dina populasi liar.Kamungkinan mékanisme molekular.Bandingkeun réspon pertahanan dihasilkeun ku genotypes husus.Ulikan ieu dievaluasi respon transcriptome awal NLL kana vaksinasi C. lupini.Mimiti, panel germplasma NLL Éropa anu ngandung 215 garis disaring nganggo spidol molekular anu nandaan alél Lanr1 sareng AnMan.Phenotyping anthracnose lajeng dilaksanakeun dina 50 garis NLL, saméméhna dipilih pikeun spidol molekular, dina kaayaan dikawasa.Dumasar kana ékspérimén ieu, opat garis anu béda dina résistansi anthracnose sareng komposisi alél Lanr1 / AnMan dipilih pikeun profil ekspresi gén pertahanan diferensial nganggo dua pendekatan pelengkap: sekuen RNA throughput tinggi sareng kuantifikasi PCR sacara real-time.
Saringan sakumpulan plasma nutfah NLL (N = 215) kalayan spidol Lanr1 (Anseq3 sareng Anseq4) sareng AnMan (Anseq4) sareng AnMan (AnManM1) nunjukkeun yén ngan ukur hiji garis (95726, caket Salamanca-b) ngagedékeun "résisténsi" alél pikeun sadaya spidol, sedengkeun "Kapanggihna 8 ~ 7 préparasi 1" tina sadaya préparasi 5 .5%) garis.Tilu belas garis ngahasilkeun dua alél "tahan" tina spidol Lanr1, sareng 8 garis ngahasilkeun alél "tahan" tina Lanr1.spidol.Alél "lalawanan" tina spidol AnMan (Tabel Tambahan S1).Dua garis éta heterozigot pikeun pananda Anseq3 sareng hiji heterozigot pikeun pananda AnManM1.42 garis (19,5%) mawa fase sabalikna tina alél Anseq3 jeung Anseq4, nunjukkeun frékuénsi luhur rekombinasi antara dua loci ieu.Fenotipe anthracnose dina kaayaan anu dikendali (Tabel Tambahan S2) ngungkabkeun variabilitas dina résistansi genotip anu diuji, anu ditingali dina parah anthracnose.Béda dina skor rata-rata dibasajankeun 1.8 (sedeng tahan) nepi ka 6.9 (susceptible) jeung béda beurat tutuwuhan ranged ti 0.62 (susceptible) nepi ka 4.45 g (tahan). Aya korelasi signifikan antara nilai observasi dina dua réplikasi percobaan (0.51 pikeun skor severity kasakit, P = 0.00017 jeung 0.61 pikeun beurat tutuwuhan, P <0.0001) kitu ogé antara dua parameter ieu (- 0.59 jeung - 0.77, P <0.000). Aya korelasi anu signifikan antara nilai-nilai anu dititénan dina dua réplikasi percobaan (0.51 pikeun skor parah panyakit, P = 0.00017 sareng 0.61 pikeun beurat tutuwuhan, P <0.0001) ogé antara dua parameter ieu (- 0.59 sareng - 0.77, P <0.77, P <0.77). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для 0, ля бля бля, 0 0017 и 0,61 для массы растения, P <0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001). Korélasi anu signifikan kapanggih antara nilai anu dititénan dina dua pangulangan percobaan (0.51 pikeun skor severity kasakit, P = 0.00017 jeung 0.61 pikeun beurat tutuwuhan, P <0.0001), kitu ogé antara dua parameter ieu (- 0.59 jeung -0.77, P <0.0001) .在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分不程度评分不，0示分0，P0.量为 0.61，P <0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P <0.0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 了 评 度 了 1 . ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（（- 0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0.5–5. 9 jeung 0.77, P <0.0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести видео, 1 за 0, 5 P , 0 , 0, 0, 0, 0 сса растения 0,61, P <0,0001), sarta между этими двумя параметрами (-0,59 jeung -0,0001) 0,77, P <0,0001. Aya korelasi anu signifikan antara nilai-nilai anu dititénan dina duplikat (skor parah panyakit 0.51, P = 0.00017 sareng beurat tutuwuhan 0.61, P <0.0001) sareng antara dua parameter ieu (-0.59 sareng -0.0001) 0.77, P<0.0001. ).Gejala has katingal dina tutuwuhan rentan kaasup kinking na twisting tina bobot resembling a "shepherd's bow" struktur, dituturkeun ku lesions oval kalawan sporozoites oranyeu / pink (Suplemén Gbr. 1).aksési Australia mawa gén Lanr1 (83A: 476 sarta Tanjil) jeung AnMan (Mandelup) anu tahan sedeng, 0,0331 jeung 0,0036).Sababaraha jalur anu ogé mawa "tahan" Lanr1 sareng / atanapi alél AnMan nunjukkeun gejala panyakit.
Narikna, sababaraha garis NLL kakurangan alél spidol "tahan" ngungkabkeun tingkat résistansi anthracnose anu luhur (sabanding atanapi langkung luhur tibatan genotip Lanr1 atanapi AnMan), sapertos Boregine (Nilai P <0.0001 pikeun duanana parameter), Bojar (Nilai P <0.0001 kanggo skor sareng 0.001 pikeun nilai Populasi B9-5) sareng 0.001 pikeun B9-5. skor na non-signifikan pikeun beurat). Narikna, sababaraha garis NLL kakurangan alél spidol "tahan" ngungkabkeun tingkat résistansi anthracnose anu luhur (sabanding atanapi langkung luhur tibatan genotip Lanr1 atanapi AnMan), sapertos Boregine (Nilai P <0.0001 pikeun duanana parameter), Bojar (Nilai P <0.0001 kanggo skor sareng 0.001 pikeun nilai Populasi B9-5) sareng 0.001 pikeun B9-5. skor na non-signifikan pikeun beurat). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий костраного у (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0.0001 для обои обои (х пар, 0ч), Boregine оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо длыя массыя). Narikna, sababaraha garis NLL kakurangan alél spidol 'tahan' némbongkeun tingkat luhur résistansi ka anthracnose (comparable atawa leuwih luhur ti keur Lanr1 atanapi AnMan genotypes), kayaning Boregine (Nilai P <0.0001 pikeun duanana parameter), Bojar (nilai P <0.0001 pikeun evaluasi jeung 0.0001 pikeun beurat tutuwuhan jeung 0.0001 P < 0.0001 jeung 0.001 B5 tutuwuhan) pikeun evaluasi sareng henteu signifikan pikeun beurat).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗中施病抗怡型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，侍礍片B-549/79b（得分P ‼< 0,0001，重量不显着）. Narikna yén sababaraha sistem NLL anu henteu ngagaduhan spidol "antigenik" nunjukkeun résistansi horizontal anu luhur (sarua sareng gén Lanr1 atanapi AnMan atanapi langkung luhur), sapertos Boregine (duanana parameter P <0,0001), Bojar (nilai P <0,0001, beurat tutuwuhan 0,001) sareng galur B-549 / 70b, henteu signifikan (P). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уротники уротник внимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P 1,0,0) популяция B-549/79b (оценка P-значение <0.0001, масса незначительна). Narikna, sababaraha garis NLL kakurangan sagala alél spidol 'résisténsi' némbongkeun tingkat luhur résistansi anthracnose (comparable atawa leuwih luhur ti Lanr1 atanapi AnMan genotypes), kayaning Boregine (Nilai P pikeun duanana parameter <0,0001), Bojar (P-nilai <0,0001, beurat tutuwuhan 0,000-0,001) jeung populasi 0,000-0,001 (populasi) beurat teu signifikan).Fenomena ieu nunjukkeun kamungkinan sumber résistansi genetik novél, ngécéskeun kakurangan korelasi antara genotip pananda sareng fenotip panyakit (nilai P tina ~ 0.42 dugi ka 0.98).Ku kituna, uji Kolmogorov-Smirnov nunjukkeun yén data ngeunaan résistansi antraknosa kira-kira sebaran normal pikeun skor (nilai-P 0,25 sareng 0,11) sareng massa pepelakan (nilai-P 0,47 sareng 0,55), nunjukkeun yén kuring hipotésis yén langkung seueur alél tibatan Lanr1 sareng AnMan.
Dumasar kana hasil screening résistansi anthracnose, 4 garis dipilih pikeun analisis transcriptome: 83A: 476, Boregine, Mandelup, sarta Populasi 22660. Garis ieu retested pikeun résistansi anthrax dina percobaan inokulasi ku RNA sequencing, disadiakeun yén maranéhanana éta sarua jeung dina test saméméhna.Nilai skorna nyaéta kieu: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) jeung populasi 22660 (6.11 ± 1.29 ).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 ngahontal rata-rata 40.5 pasang Mread per sampel (29.7 ka 54.4 Mreads) (Tabel Tambahan S3).Skor alignment dina sekuen rujukan dibasajankeun 75,5% nepi ka 88,6%.Korélasi rata-rata data cacah baca antara varian ékspérimén antara réplika biologis dibasajankeun 0.812 ka 0.997 (rata-rata 0.959). Tina 35.170 gén anu dianalisis, 2917 henteu ngungkabkeun éksprési, sareng 4785 gén sanésna dikedalkeun dina tingkat anu teu diabaikan (rata-rata dasar <5). Tina 35.170 gén anu dianalisis, 2917 henteu ngungkabkeun éksprési, sareng 4785 gén sanésna dikedalkeun dina tingkat anu teu diabaikan (rata-rata dasar <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на мулон е среднее <5). Tina 35,170 gén anu dianalisis, 2917 henteu nunjukkeun éksprési, sareng sésana 4785 gén dikedalkeun dina tingkat anu teu pati penting (basa rata-rata <5).在分析的35.170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略不埡。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительнсудюбил значение <5). Tina 35,170 gén anu dianalisis, 2917 henteu dikedalkeun sareng 4785 gén sésana ngagaduhan éksprési anu teu kaétang (rata-rata dasar <5).Ku kituna, jumlah gén dianggap dinyatakeun (basa mean ≥ 5) salila percobaan éta 27.468 (78.1%) (Tabel Tambahan S4).
Ti titik kahiji waktos, sadaya garis NLL ngabales inokulasi tina C. lupini (galur Col-08) ku reprogramming transcriptome nu (Tabel 1), kumaha oge, béda anu signifikan anu observasi antara garis.Ku kituna, garis lalawanan 83A: 476 (mawa gén Lanr1) némbongkeun reprogramming transcriptome signifikan dina titik waktu kahiji (6 hpi) kalawan kanaékan 31-69-melu dina jumlah terasing up- jeung handap-gén dibandingkeun titik waktu séjén dina titik waktu ieu.Sajaba ti éta, puncak ieu pondok-cicing, sakumaha éksprési ngan sababaraha gén tetep nyata dirobah dina titik kadua kalina (12 hpi).Narikna, Boregine, anu ogé nunjukkeun tingkat résistansi anu luhur dina uji tandur, henteu ngalaman pemrograman ulang transkripsi anu masif nalika percobaan.Tapi, jumlah gén anu diébréhkeun sacara béda (DEG) sami pikeun Boregine sareng 83A: 476 dina 12 HPI.Duanana Mandelup jeung populasi 22660 némbongkeun puncak DEG dina titik panungtungan waktu (48 l / s), nunjukkeun reureuh relatif dina réspon pertahanan.
Kusabab 83A: 476 underwent masif transcriptome reprogramming di respon kana C. lupini di 6 HPI dibandingkeun sakabeh garis sejenna, ~ 91% tina DEGs observasi dina titik waktos ieu nasab-spésifik (Gbr. 1).Sanajan kitu, aya sababaraha tumpang tindihna dina réspon awal antara garis ulikan, sakumaha 68,5%, 50,9%, jeung 52,6% DEG di Boregine, Mandelup, sarta populasi 22660, masing-masing, tumpang tindih jeung nu kapanggih dina 83A: 476 dina titik nu tangtu dina jangka waktu.Tapi, DEG ieu ngan ukur sabagian leutik (0.97–1.70%) tina sadaya DEG anu ayeuna dideteksi nganggo 83A: 476.Salaku tambahan, 11 DEGs tina sadaya garis anu koheren dina waktos ayeuna (Tabel Tambahan S4-S6), kalebet komponén umum tina réspon pertahanan tutuwuhan: protéin transfer lipid (TanjilG_32225), énzim endoglucan-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), dua protéin anu tiasa diinduksi stres sapertos SAM22 (TanjilG_331, TanjilG_3225) 32352), sareng dua protéin témbok sél struktur anu beunghar glisin (TanjilG_19701 sareng TanjilG_19702).Aya ogé tumpang tindihna rélatif luhur dina réspon transcriptome antara 83A: 476 jeung Boregine di 24 HPI (total 16-38% DEG) jeung antara Mandelup jeung Populasi 22660 dina 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagram Venn nunjukkeun jumlah gén anu dibédakeun (DEG) dina garis lupin berdaun sempit (NLL) anu diinokulasi sareng Colletotrichum lupini (galur Col-08 dicandak tina sawah lupin di Wierzhenice, Polandia, 1999).Garis NLL dianalisis nyaéta: 83A: 476 (tahan, mawa alél Lanr1), Boregine (tahan, kasang tukang genetik kanyahoan), Mandelup (sedeng tahan, mawa alél AnMan) jeung populasi 22660 (pisan rentan).Singketan hpi nangtung pikeun sababaraha jam saatos vaksinasi.Nilai nol parantos dipiceun pikeun nyederhanakeun grafik.
Susunan gén overexpressed dina 6 hpi dianalisis pikeun ayana domain gén R canonical (Tabel Tambahan S7).Panaliti ieu ngungkabkeun induksi transkrip gén résistansi panyakit klasik sareng domain NBS-LRR ngan ukur dina 83A: 476.Set ieu diwangun ku hiji gén TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), lima gén CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, sarta tanjilg_16162), sarta Four NBS-LR16jilg2 (NBS-16162) jeung Four NBS-LR16jilg2 ) ogé Opat NBS-Lrr (tanjilg_16162) jeung Opat NBS-LRR (TANJILG_16162).Sakabéh gén ieu boga domain kanonik disusun dina runtuyan conserved.Salian gén domain NBS-LRR, sababaraha kinase RLL diaktipkeun dina 6 hpi, nyaéta hiji di Boregine (TanjilG_19877), dua di Mandelup (TanjilG_07141 jeung TanjilG_19877) jeung populasi 22660 (TanjilG_09014 jeung TanjilG_14: 72 dina 6877).
Gén kalawan éksprési nyata dirobah dina respon kana inokulasi kalawan C. lupini (galur Col-08) anu subjected kana Gene Ontology (GO) analisis pengayaan (Suplemén Table S8). Istilah prosés biologis anu paling sering diwakilan nyaéta "GO: 0006952 réspon pertahanan" anu muncul dina 6 tina 16 (waktos × garis) kombinasi kalayan signifikansi anu luhur (nilai P <0.001) (Gbr. 2). Istilah prosés biologis anu paling sering diwakilan nyaéta "GO: 0006952 réspon pertahanan" anu muncul dina 6 tina 16 (waktos × garis) kombinasi kalayan signifikansi anu luhur (nilai P <0.001) (Gbr. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный отверный отверт» 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0.001) (рис. 2). Istilah prosés biologis anu paling sering diwakilan nyaéta 'GO: 0006952 réspon pertahanan', anu muncul dina 6 tina 16 (waktos × nasab) kombinasi kalayan signifikansi anu luhur (nilai P <0.001) (Gbr. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间（时间）一一一一一一一一一一一一一一上具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. Istilah prosés biologis anu paling representatif nyaéta "GO: 0006952 réspon pertahanan", anu muncul dina 6 tina 16 kombinasi (时间×线), kalayan signifikansi luhur (nilai P <0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», которыры 6 поского процесса был ий (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah prosés biologis anu paling sering diwakilan nyaéta 'GO: 0006952 Tanggapan Pertahanan', anu muncul dina 6 tina 16 kombinasi (waktos × garis) kalayan signifikansi anu luhur (nilai P <0.001) (Gbr. 2).Istilah ieu overrepresented dina dua titik waktu dina 83A: 476 jeung Boregine (6 jeung 24 hpi) jeung dina hiji titik waktu di Mandelup jeung Populasi 22660 (masing-masing 12 jeung 6 hpi).Ieu mangrupikeun hasil anu dipiharep, nyorot réspon antijamur tina garis tahan.Sajaba ti éta, 83A: 476 ngabales C. lupini ku gancang inducing gén patali burst oksidatif digambarkeun ku istilah "GO: 0055114 prosés rédoks", nunjukkeun respon pertahanan husus, bari Boregine wangsit réspon pertahanan husus, patali jeung istilah 'GO'.: 0006950 Tanggapan Stress”.Populasi 22660 diaktipkeun réspon lalawanan horizontal ngalibetkeun métabolit sekundér, panyorot jumlah kaleuleuwihan istilah "GO: 0016104 Prosés biosintésis triterpene" jeung "GO: 0006722 Prosés métabolisme triterpene" (duanana istilah milik set sarua gén ), nyokot kana akun hasil tina réaksi Populasi 0016104 sarta Enrichulasi 2. Sajaba ti éta, réaksi mimiti 83A: 476 (6 hpi) jeung réaksi nyangsang Mandelup sarta Populasi 22660 kaasup istilah GO: 0015979 'fotosintésis' jeung prosés biologis séjén patali.
Istilah ontologi gén bioprosés dipilih dina anotasi gén anu dibédakeun nalika réspon transkriptom tina lupin berdaun sempit (NLL) anu disuntik sareng lupin antraks (galur Col-08 dicandak tina widang lupin di Wierzhenice, Polandia, taun 1999) digedekeun pisan.Garis NLL anu dianalisis nyaéta: 83A: 476 (tahan, mawa alél Lanr1 homozygous), Boregine (tahan, kasang tukang genetik kanyahoan), Mandelup (tahan sedeng, mawa alél AnMan homozygous) jeung populasi 22660 (susceptible).
Kusabab ulikan ieu ditujukeun pikeun ngaidentipikasi gén anu nyumbang kana résistansi anthracnose, gén anu ditugaskeun kana istilah GO "GO: 0006952 réspon Defensif" sareng "GO: 0055114 Prosés Redox" dianalisis kalayan cut-off sabab dasarna hartosna ≥ 30 kalayan sahenteuna hiji garis.× titik dina waktos ngagabungkeun nilai statistik signifikan tina log2 (robah melu).Jumlah gén anu nyumponan kriteria ieu nyaéta 65 pikeun GO: 0006952 sareng 524 pikeun GO: 0055114.
83A: 476 ngungkabkeun dua puncak DEG anu dijelaskeun nganggo istilah GO: 0006952, anu kahiji dina 6 gén per inci (64 gén, régulasi luhur sareng ka handap) sareng anu kadua dina 24 gén per inci (15 gén, ngan ukur régulasi).Boregine ogé nunjukkeun yén GO: 0006952 puncak dina waktos anu sami, tapi kalayan kirang DEG (11 sareng 8) sareng aktivasina preferensial.Mandeloop nunjukkeun dua puncak GO: 0006952 dina 12 sareng 48 HPI, duanana mawa 12 gén (kahiji kalayan gén aktivasina, sareng anu kadua kalayan ngan ukur gén suppressive), sedengkeun populasi 22660 dina 6 HPI (13 gén) gaduh dominasi anu langkung ageung tina puncak paningkatan.aturan.Perlu dicatet yén 96,4% tina GO: 0006952 DEG di puncak ieu ngagaduhan jinis réspon anu sami (kaluhur atanapi kahandap), nunjukkeun tumpang tindihna anu signifikan dina réspon pertahanan sanaos bédana jumlah gén anu aub.Grup panggedena tina runtuyan patali istilah GO: 0006952 encode nu Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-kawas), nu kagolong kana kelas 10 patogénesis-patali protéin (PR-10) clade protéin jeung inti lateks protéin.sarupa (MLP-kawas) protéin) protéin (Gbr. 3).Dua kelompok éta béda dina sifat éksprési sareng arah réspon.Gén encoding protéin SAM22-kawas némbongkeun induksi konsisten tur signifikan dina titik waktu mimiti (6 atawa 12 hpi) jeung éta umumna unresponsive di ahir percobaan (48 hpi), sedengkeun protéin MLP-kawas némbongkeun koordinasi dina 6 hpi.hpi.83A: 476 sarta Mandelup di 48 hp / di, ampir sakabéh titik data sejenna éta unresponsive.Sajaba ti éta, béda dina propil éksprési gén protéin SAM22-kawas dituturkeun variability observasi dina résistansi anthracnose, sakumaha garis leuwih tahan miboga leuwih titik waktu nyata inducing gén ieu ti gén leuwih rentan.Gén LlR18A/B-kawas PR-10 anu sanés nunjukkeun pola éksprési anu sami sareng gén protéin sapertos SAM22.
Komponén utama istilah prosés biologis "GO: 0006952 Tanggapan Pertahanan" sareng pola ekspresi gén calon tina alél Lanr1 sareng AnMan diidentifikasi.Skala Log2 ngagambarkeun nilai log2 (robah melu) antara inoculated (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dicandak ti widang lupine, Wizhenica, Polandia, 1999) jeung kontrol (sham-inoculated) tutuwuhan dina titik waktu nu sarua.Garis lupine daun sempit ieu dianalisis: 83A: 476 (tahan, mawa alél Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik teu dipikanyaho), Mandelup (tahan sedeng, mawa alél AnMan homozigot), sareng Populasi 22660 (rentan).
Sajaba ti éta, propil éksprési RNA-seq calon gén Lanr1 (TanjilG_05042) sarta AnMan (TanjilG_12861) dievaluasi (Gbr. 3).Gén TanjilG_05042 némbongkeun réspon signifikan (aktivasina) dina 83A: 476 ngan dina titik waktu kahiji (6 hpi), sedengkeun TanjilG_12861 signifikan dina Mandeloop ngan dina dua titik waktu: 6 hpi (regulasi handap) jeung 24 hpi (6 hpi).Jeung.).adjustable)).
Gén paling overexpressed dina istilah GO: 0055114 "prosés rédoks" éta gén encoding protéin sitokrom P450 jeung peroksidase (Gbr. 4).Pikeun sampel anu diisolasi tina 83A: 476 dina 6 HPI, nilai log2 maksimum atawa minimum (pikeun 86,6% gén) umumna dititénan antara tutuwuhan inokulasi jeung kontrol, nyorot réspon luhur genotip ieu pikeun inokulasi kelamin.83A: 476 némbongkeun GO paling signifikan: 0055114 DEG di 6 hpi (503 gén), sedengkeun sesa garis dina 48 hpi (Boregine, 31 gén; Mandelup, 85 gén; jeung Populasi 22660, 78 gén)).Dina kalolobaan gén kulawarga GO: 0055114, dua jinis réspon kana vaksinasi (aktivasina sareng inhibisi) dititénan.Narikna, nepi ka 97.6% tina DEGs diidentifikasi pikeun istilah GO: 0055114 di Mandelupe dina 48 hp Observasi ieu nunjukkeun yén, sanajan skala nyata leutik (ie, jumlah gén rédoks mutated, 85 versus 503), pola réspon transcriptome nyangsang tina mandeloup 8 sarua jeung 8.3 mandeloup mimiti: 6.Dina Boregine sareng Populasi 22660, konvergénsi ieu langkung handap masing-masing 51,6% sareng 75,6%.
Pola ekspresi komponén utama istilah prosés biologis "GO: 0055114 prosés rédoks" diungkabkeun.Skala Log2 ngagambarkeun nilai log2 (robah melu) antara inoculated (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dicandak ti widang lupine, Wizhenica, Polandia, 1999) jeung kontrol (sham-inoculated) tutuwuhan dina titik waktu nu sarua.Garis lupine daun sempit ieu dianalisis: 83A: 476 (tahan, mawa alél Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik teu dipikanyaho), Mandelup (tahan sedeng, mawa alél AnMan homozigot), sareng Populasi 22660 (rentan).
83A: 476 Réspon transkriptomik kana inokulasi sareng C. lupini (galur Col-08) ogé kalebet panyenyapan koordinat gén anu dikaitkeun kana istilah GO: 0015979 "fotosintésis" sareng prosés biologis anu aya hubunganana (Gbr. 5).GO ieu: 0015979 DEG set ngandung 105 gén nu nyata repressed dina 6 hpi dina 83A: 476.Dina subset ieu, 37 gén ogé diturunkeun dina Mandelup dina 48 HPI sareng 35 dina waktos anu sami dina populasi 22660, kalebet 19 DEG anu umum pikeun duanana genotip.Henteu aya DEG anu aya hubunganana sareng istilah GO: 0015979 diaktipkeun sacara signifikan dina kombinasi naon waé (garis x waktos).
Pola ekspresi komponén utama istilah prosés biologis "GO: 0015979 Fotosintésis" diungkabkeun.Skala Log2 ngagambarkeun nilai log2 (robah melu) antara inoculated (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dicandak ti widang lupine, Wizhenica, Polandia, 1999) jeung kontrol (sham-inoculated) tutuwuhan dina titik waktu nu sarua.Garis lupine daun sempit ieu dianalisis: 83A: 476 (tahan, mawa alél Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik teu dipikanyaho), Mandelup (tahan sedeng, mawa alél AnMan homozigot), sareng Populasi 22660 (rentan).
Dumasar kana hasil analisis éksprési diferensial sareng sigana kalibet dina réspon pertahanan ngalawan fungi patogén, set tujuh gén ieu dipilih pikeun kuantifikasi propil éksprési ku PCR waktos nyata (Tabel Tambahan S9).
Gén protéin putative TanjilG_10657 sacara signifikan ngainduksi dina sadaya garis anu ditalungtik sareng titik waktos dibandingkeun sareng kontrol (mimik) pepelakan (Tabel Tambahan S10, S11).Salaku tambahan, profil éksprési TanjilG_10657 nunjukkeun tren anu ningkat salami percobaan pikeun sadaya jalur.Populasi 22660 némbongkeun sensitipitas pangluhurna TanjilG_10657 mun inokulasi kalawan aktivasina 114-melu jeung tingkat ekspresi relatif pangluhurna (4.4 ± 0.4) dina 24 HPI (Gbr. 6a).Gén protéin PR10 LlR18A TanjilG_27015 ogé nunjukkeun aktivasina dina sadaya garis sareng titik waktos, kalayan signifikan statistik dina kalolobaan titik data (Gbr. 6b).Sarupa jeung TanjilG_10657, tingkat ekspresi relatif pangluhurna TanjilG_27015 dititénan dina 22660 populasi inokulasi dina 24 HPI (19,5 ± 2,4).Gén asam endochitinase TanjilG_04706 ieu nyata upregulated dina sakabéh garis tur dina sagala titik waktu iwal Boregine 6 hpi (Gbr. 6c).Ieu niatna ngainduksi dina titik waktu kahiji (6 HPI) dina 83A: 476 (ku 10,5 kali) jeung moderately ngaronjat dina garis séjén (ku 6,6-7,5 kali).Salila ékspérimén, éksprési TanjilG_04706 tetep dina tingkat anu sami dina 83A:476 sareng Boregine, sedengkeun di Mandelup sareng Populasi 22660 ningkat sacara signifikan, ngahontal nilai anu kawilang luhur (5.9 ± 1.5 sareng 6.2 ± 1.5, masing-masing).Gén endoglucan-1,3-β-glucosidase-kawas TanjilG_23384 némbongkeun aktivasina tinggi dina dua titik waktu munggaran (6 jeung 12 hpi) dina sakabéh garis iwal populasi 22660 (Gbr. 6d).Tingkat ekspresi relatif pangluhurna TanjilG_23384 dititénan dina titik waktu kadua (12 hpi) dina Mandelup (2.7 ± 0.3) jeung 83A: 476 (1.5 ± 0.1).Dina 24 HPI, ekspresi TanjilG_23384 kawilang rendah dina sadaya garis anu ditalungtik (tina 0,04 ± 0,009 dugi ka 0,44 ± 0,12).
Profil éksprési gén anu dipilih (ag) diungkabkeun ku PCR kuantitatif.Angka 6, 12 sareng 24 ngagambarkeun jam saatos vaksinasi.Gen LanDExH7 sareng LanTUB6 dianggo pikeun normalisasi sareng LanTUB6 dianggo pikeun kalibrasi antar-seri.Bar kasalahan ngagambarkeun simpangan baku dumasar kana tilu ulangan biologis, nu masing-masing mangrupakeun rata-rata tilu ulangan teknis. Signifikansi statistik tina béda dina tingkat éksprési antara inokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dicandak dina 1999 ti widang lupine di Wierzenica, Polandia) jeung kontrol (mock-inoculated) tutuwuhan anu ditandaan luhureun titik data (* P nilai <0.05, ** P nilai ≤ 0.01, *** P 0.01, *** P 0.01). Signifikansi statistik tina béda dina tingkat éksprési antara inokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dicandak dina 1999 ti widang lupine di Wierzenica, Polandia) jeung kontrol (mock-inoculated) tutuwuhan anu ditandaan luhureun titik data (* P nilai <0.05, ** P nilai ≤ 0.01, *** P 0.01, *** P 0.01). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в гля 1999 г. женице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P, **, значение P < 0,005 P < 0,05 P ≤ 0,001). Statistik béda anu signifikan dina tingkat éksprési antara inoculated (Colletotrichum lupini, galur Col-08, diala dina 1999 ti widang lupine di Wierzhenice, Polandia) jeung kontrol (sham-inoculated) tutuwuhan anu nyatet luhur titik data (* P nilai <0.05, ** P-nilai ≤ 0.01, ≤ 0.00 P-0.).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种義行差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （ 接紗差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный спо, полученный спод Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* з, ч-0, ниех (* з, ч0,ниех 5 ***P-значение ≤ 0,001). Beda statistik signifikan dina tingkat ekspresi antara inokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dicandak ti widang lupine di Verzhenice, Polandia, dina 1999) jeung kontrol (sham-inoculated) tutuwuhan anu nyatet luhur titik data (* P nilai <0.05 , ** P-nilai ≤ 0.01, ≤ 0.0-1).Garis NLL anu dianalisis nyaéta: 83A: 476 (tahan, mawa alél Lanr1 homozygous), Mandelup (tahan sedeng, mawa alél AnMan homozygous), Boregine (tahan, kasang tukang genetik kanyahoan) jeung populasi 22660 (susceptible).
Gén calon TanjilG_05042 di lokus Lanr1 nunjukkeun pola éksprési anu nyata béda tina profil anu dicandak tina studi RNA-seq (Gbr. 6e).Aktivasina signifikan tina gén ieu dititénan dina Mandelup jeung populasi 22660 (nepi ka 39,7 jeung 11,7 kali, masing-masing), hasilna tingkat ekspresi rélatif luhur (nepi ka 1,4 ± 0,14 jeung 7,2 ± 1,3, masing-masing).83A: 476 ogé ngungkabkeun sababaraha upregulasi gén TanjilG_05042 (nepi ka 3,8 kali lipat), kumaha oge, tingkat ekspresi relatif anu dihontal (0,044 ± 0,002) langkung ti 30 kali langkung handap tibatan anu dititénan di Mandelup sareng populasi 22660.dianalisis ku qPCR némbongkeun béda anu signifikan dina tingkat éksprési antara genotypes dina varian bohongan-divaksinasi (kontrol), ngahontal bédana 58-melu antara populasi 22660 na 83A: 476, kitu ogé antara populasi 22660 na 22660. A bédana dua-melu kahontal antara Boregine na Mandalup.
Gén calon di locus AnMan, TanjilG_12861, diaktipkeun dina respon kana vaksinasi di 83A: 476 sarta Mandelup, éta nétral dina populasi 22660, sarta ieu downregulated di Boregine (Gbr. 6f).Éksprési relatif gén TanjilG_12861 éta pangluhurna dina 83A inokulasi: 476 (0.14±0.01).The 17,4 kDa kelas I panas shock protéin gén TanjilG_05080 HSP17.4 némbongkeun tingkat ekspresi relatif handap dina sakabéh galur ditalungtik sarta titik waktu (Gbr. 6g).Nilai pangluhurna dititénan dina 24 HPI dina populasi 22660 (0.14 ± 0.02, paningkatan dalapan kali lipet dina respon kana vaksinasi).
Babandingan propil éksprési gén (Gbr. 7) ngungkabkeun korelasi anu luhur antara TanjilG_10657 sareng opat gén sanésna: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80), sareng TanjilG6_9.Hasil sapertos kitu tiasa nunjukkeun ko-pangaturan gén ieu salami réspon pertahanan.Gén TanjilG_12861 sareng TanjilG_23384 nunjukkeun profil ekspresi anu béda kalayan nilai koefisien korelasi Pearson anu langkung handap (tina 0,08 dugi ka 0,43 sareng -0,19 dugi ka 0,28, masing-masing) dibandingkeun sareng gén sanés.
Korélasi antara profil éksprési gén dideteksi nganggo PCR kuantitatif.Garis lupine daun sempit ieu dianalisis: 83A: 476 (tahan, mawa alél Lanr1 homozigot), Mandelup (tahan sedeng, mawa alél AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik teu dipikanyaho), sareng Populasi 22660 (rentan).Tilu titik waktu diitung (6, 12 jeung 24 jam sanggeus inokulasi), kaasup inokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, dicandak ti widang lupine di Wierzhenice, Polandia, dina 1999) jeung kontrol (sham-inoculated) tutuwuhan.Skala nembongkeun nilai koefisien korelasi Pearson.
Dumasar data diala dina 6 horsepower per inci, WGCNA ieu dipigawé dina 9981 DEG diidentipikasi ku ngabandingkeun inoculated jeung tutuwuhan kontrol fokus kana réspon pertahanan mimiti (Tabel Tambahan S12).Dua puluh dua modul gén (cluster) kapanggih kalawan correlated (positip atawa négatip) propil ekspresi antara genotypes jeung varian eksperimen. Rata-rata, tingkat ekspresi gén turun dina urutan 83A: 476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (dina duanana varian, kumaha oge, trend ieu leuwih kuat dina tutuwuhan kontrol). Rata-rata, tingkat ekspresi gén turun dina urutan 83A: 476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (dina duanana varian, kumaha oge, trend ieu leuwih kuat dina tutuwuhan kontrol). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (в обоих вариантах, одытако, бельный контрольных растений). Rata-rata, tingkat éksprési gén turun dina urutan 83A: 476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (dina duanana varian, kumaha oge, trend ieu leuwih kuat dina tutuwuhan kontrol).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 的顺序下降（然而，在两种变作在两种变体照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populasi 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 眨 在 种 中中 更） . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 рольных растений). Rata-rata, tingkat éksprési gén turun dina séri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (tapi, dina duanana varian, tren ieu leuwih kuat dina tutuwuhan kontrol).Vaksinasi nyababkeun upregulation éksprési gén, utamana dina modul 18, 19, 14, 6 jeung 1 (dina urutan nurun tina pangaruh), régulasi négatip (misalna modul 9 jeung 20) atawa kalawan épék nétral (misalna modul 11, 22, 8 jeung 13).Kalebet analisis pangleterasi termernian (tabel suplemén s13) wangsit ": I0006952 000primes" pikeun modul inoclus, Tanijil_278.2087, Tanijil_27017 sareng seueur aktivas_270. es (9).modul 18 concentrator (Gbr. 8) ieu diidentifikasi minangka TanjilG_26536 gén encoding protéin PR-10-kawas LlR18B, sarta modul 9 concentrator ieu diidentifikasi minangka TanjilG_28955 gén encoding protéin photosystem II PsbQ.A gén lalawanan anthracnose calon Lanr1, TanjilG_05042, kapanggih dina modul 22 (Gbr. 9) sarta pakait jeung istilah "GO: 0044260 Sélular prosés métabolik macromolecular" jeung "GO: 0006355 régulasi Transcriptional, DNA templating" mawa hub TanjilG_01212.gen nangkodkeun faktor transkripsi stress panas A-4a (HSFA4a).
Analisis jaringan beurat gén ko-ekspresi modul kalawan overrepresented istilah prosés biologis "GO: 0006952 réspon Pertahanan".Ligation disederhanakeun pikeun nyorot opat gén anu dianalisis ku qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 sareng TanjilG_27015).
Analisis jaringan beurat tina éksprési gén tina modul kalayan istilah prosés biologis anu overrepresented "GO: 0006355: régulasi Transkripsional, templating DNA" sareng mawa calon résistansi anthracnose gén Lanr1 TanjilG_05042.Ligasi disederhanakeun pikeun ngaisolasi gen TanjilG_05042 sareng gen TanjilG_01212 sentral.
Saringan résistansi Anthracnose anu dikumpulkeun di Australia nunjukkeun yén kalolobaan kultivar anu dileupaskeun awal rentan;Kalya, Coromup sareng Mandelup didadarkeun salaku tahan sedeng, sedengkeun Wonga, Tanjil sareng 83A: 476 didadarkeun salaku tahan pisan26,27,31.kagungan alél lalawanan sarua, ditunjuk Lanr1, sarta Coromup na Mandelup miboga alél béda, ditunjuk AnMan10, 26, 39, bari Kalya lulus dina alél béda., Lanr2.Saringan pikeun résistansi anthracnose di Jerman nyababkeun idéntifikasi garis tahan Bo7212 sareng alél calon sanés Lanr1, anu ditunjuk LanrBo36.
Ulikan kami ngungkabkeun frékuénsi anu rendah pisan (sakitar 6%) tina alél Lanr1 dina plasma nutfah anu diuji.Observasi ieu konsisten jeung hasil screening germplasm Éropa Wétan ngagunakeun spidol Anseq3 na Anseq4, nu némbongkeun yén alél Lanr1 ngan aya dina dua garis Belarusian.Ieu nunjukkeun yén alél Lanr1 henteu acan seueur dianggo ku program pembibitan lokal, teu sapertos di Australia, dimana éta mangrupikeun alél konci pikeun pembibitan anu dibantuan ku pananda.Ieu bisa jadi alatan tingkat handap lalawanan disadiakeun ku alél Lanr1 dina kondisi widang Éropa dibandingkeun laporan Australia.Sajaba ti éta, studi anthracnose di wewengkon curah hujan luhur di Australia geus ditémbongkeun yén réspon lalawanan dimédiasi ku alél Lanr1 bisa jadi teu éféktif dina kondisi cuaca nu ni'mat tumuwuhna gancang tina pathogen19,42.Kanyataanna, dina ulikan ayeuna, sababaraha gejala anthracnose ogé dititénan dina genotypes mawa alél Lanr1, suggesting yén lalawanan bisa ngaleungit dina kaayaan optimal pikeun ngembangkeun C. lupini.Salaku tambahan, interpretasi positip palsu ngeunaan ayana spidol Anseq3 sareng Anseq4, anu kirang langkung 1 cM ti lokus Lanr1, mungkin 28,30,43.
Ulikan urang némbongkeun yén 83A: 476, mawa alél Lanr1, ngabales inokulasi C. lupini kalawan reprogramming transcriptome skala badag dina titik waktu dianalisis munggaran (6 hpi), bari di Mandelup, mawa alél AnMan, réspon transcriptomic anu katalungtik teuing engké.(tina 24 nepi ka 48 hp).Variasi temporal dina réspon pertahanan ieu pakait sareng bédana gejala panyakit, nyorot pentingna pangakuan patogén awal pikeun réspon anu suksés pikeun résistansi.Pikeun nginféksi jaringan tutuwuhan, spora anthrax kudu ngaliwatan sababaraha tahap ngembangkeun dina beungeut host, kaasup pengecambahan, division sél, sarta formasi hiji appressorium.Appendage mangrupikeun struktur inféktif anu nempel kana permukaan host sareng ngagampangkeun penetrasi kana jaringan host.Ku kituna, spora C. gloeosporioides dina ekstrak kacang polong némbongkeun division munggaran tina inti sanggeus 75-90 menit inkubasi, formasi tube germ sanggeus 90-120 menit, sarta suprési sanggeus 4 jam 45 .Mangga C. gloeosporioides némbongkeun leuwih ti 40% pengecambahan conidial sanggeus 3 jam inkubasi sarta ngeunaan 20% formasi apppressors sanggeus 4 jam.The virulence-pakait gén CAP20 of C. gloeosporioides némbongkeun aktivitas transcriptional dina epiphyte-ngabentuk conidia sanggeus 3,5 h inkubasi dina lilin permukaan alpukat kalawan konsentrasi luhur protéin CAP20 sanggeus 4 h 46 mnt.Nya kitu, aktivitas gén biosintésis melanin dina C. trifolii ieu ngainduksi salila inkubasi 2-jam dituturkeun ku formasi hiji appressorium sanggeus 1 jam.Studi jaringan daun nunjukkeun yén strawberries anu diinokulasi sareng C. acutatum gaduh suprési munggaran dina 8 hpi, sedengkeun tomat anu diinokulasi sareng C. coccodes gaduh suprési munggaran dina 4 hpi48,49.lolobana konsisten jeung skala waktu Colletotrichum spp.prosés inféksi.Réspon pertahanan gancang ka 83A: 476 nyarankeun kalibet résistansi tutuwuhan sareng gén kekebalan (ETI) anu dipicu ku éféktor dina jalur ieu, sedengkeun réspon anu ditunda Mandelup ngadukung hipotésis kekebalan anu dipicu pola molekular mikro-dipicu (MTI) 50. réspon awal kana 83A: 476.Tumpang tindih parsial antara gén luhur atawa handap-diatur dina respon nyangsang ogé ngarojong konsép ieu, sabab ETI mindeng dianggap respon MTI gancangan tur ditingkatkeun nu culminates dina maot sél diprogram dina situs inféksi, katelah shock anaphylactic 51,52.
Seuseueurna gén anu dikaitkeun kana istilah anu overrepresented Gene Ontology GO: 0006952 "Tanggapan Pertahanan" nyaéta 11 homolog pesen puasa anu disababkeun ku setrés 22 protéin (sarupa sareng SAM22) sareng tujuh anu resep protéin lateks (MLPs).protéin -kawas 31, 34, 43 jeung 423 némbongkeun kamiripan runtuyan.Gén kawas SAM22 némbongkeun aktivasina signifikan nu lumangsung leuwih lila, némbongkeun ngaronjat tingkat résistansi anthracnose (83A: 476 jeung Boregine).Sanajan kitu, gén MLP-kawas ieu downregulated ngan dina garis mawa alél résistansi calon (83A: 476 / Lanr1 dina 6 hpi sarta Mandelup / AnMan di 24 hpi).Perlu diémutan yén sadaya homolog sapertos SAM22 anu diidentifikasi asalna tina gugusan gén anu panjangna kirang langkung 105 kb, sedengkeun gén sapertos MLP asalna tina daérah anu misah tina génom.Aktivasina koordinat tina gén sapertos SAM22 ogé kapanggih dina ulikan kami saméméhna ngeunaan résistansi NLL kana inokulasi Diaporthetoxica, nunjukkeun yén aranjeunna aub dina komponén horizontal tina réspon pertahanan.Kacindekan ieu ogé dirojong ku laporan réspon positif gén kawas SAM22 kana tatu atawa perlakuan jeung asam salisilat, inducers jamur, atawa hidrogén péroxida.
Gén kawas MLP geus ditémbongkeun pikeun ngabales sagala rupa stresses abiotik jeung biotik, kaasup inféksi jamur baktéri, viral jeung patogén dina loba spésiés tutuwuhan55.Arah réspon kana interaksi tangtu antara tutuwuhan jeung patogén dibasajankeun ngaronjat pisan (ie, salila infestasi kapas jeung Verticillium dahliae) mun nyata turunna (ie, sanggeus inféksi tangkal apel jeung Alternaria spp.)56,57.Downregulation signifikan tina gén MLP-kawas 423 geus katalungtik salila defenses alpukat ka inféksi F. niger jeung salila inféksi tangkal apel Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola sareng Alternaria alternata mangrupikeun patotipe apel58,59.Sajaba ti éta, apel calli overexpressing gén MLP-kawas 423 miboga ekspresi handap gén résistansi-pakait jeung éta leuwih rentan ka inféksi jamur59.Saatos Fusarium oxysporum f, gén 423 sapertos MLP ogé diteken dina plasma nutfah kacang umum anu tahan.cn.Inféksi kacang 60.
Anggota kulawarga PR-10 anu sanés anu diidentifikasi dina ulikan RNA-seq kami nyaéta gén LlR18A sareng LlR18B pikeun ngaréspon kana régulasi, ogé gén anu dirégulasi (1 gén) atanapi dirégulasi (3 gén) pikeun protéin transfer lipid DIR1..Salaku tambahan, WGCNA nyorot gén LlR18B salaku hub dina modul ieu, anu rentan pisan kana vaksinasi sareng mawa sababaraha gén réspon pelindung.Gén LlR18A sareng LlR18B diinduksi dina daun lupin konéng pikeun ngaréspon baktéri patogén, ogé dina batang NLL saatos inokulasi D. toxica, sedengkeun homolog béas tina gén ieu, RSOsPR10, gancang dipangaruhan ku inféksi jamur anu diduga kalibet dina jalur pensinyalan asam jasmonic non-lipid gén 1,62, transpor gén 63 lipid. anu dipikabutuh pikeun awal résistansi kaala sistemik (SAR).Kalayan ngembangkeun réaksi pelindung, protéin DIR1 diangkut tina fokus inféksi ngaliwatan phloem pikeun ngainduksi SAR dina organ anu jauh.Narikna, gén TanjilG_02313 DIR1 sacara signifikan ngainduksi dina titik waktos munggaran dina garis 84A: 476 sareng Populasi 22660, tapi résistansi antraknosa ngan ukur suksés dina jalur 84A: 476.Ieu bisa nunjukkeun sababaraha subfunctionalization tina gén DIR1 di NLL, saprak sésana tilu homologues ngabales inokulasi ngan dina 83A: 476 garis dina 6 hpi, sarta respon ieu diarahkeun ka handap.
Dina ulikan urang, komponén paling umum pakait jeung prosés biologis disebut "GO: 0055114 prosés Rédoks" éta sitokrom P450 protéin, peroksidase, asam linoleat 9S-/13S-lipoxygenase, sarta 1-aminocyclopropane-1-karboksilat asam oksidase.Salaku tambahan, WGCNA kami ngahartikeun homolog HSFA4a salaku hub mawa modul sapertos calon gén résistansi Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a mangrupakeun komponén régulasi rédoks transkripsi nuklir dina tutuwuhan.
Protéin sitokrom P450 nyaéta oksidoréduktase anu ngatalisan réaksi hidroksilasi NADPH jeung/atawa O2-gumantung dina métabolisme primér jeung sekundér, kaasup métabolisme xenobiotics, kitu ogé hormon, asam lemak, stérol, komponén témbok sél, biopolymers, sarta biosintésis sanyawa pelindung 69. Dina kami P450d. robah melu) ka 5,7 alatan sajumlah badag homologs dirobah (37) jeung béda dina pola respon antara gén husus, reflecting hiji révisi luhur..Ngan ngagunakeun data RNA-seq pikeun ngajelaskeun fungsi biologis putative tina gén NLL dina superfamili protéin anu ageung bakal janten spekulatif pisan.Sanajan kitu, eta sia noting yén sababaraha gén sitokrom P450 pakait sareng ngaronjat lalawanan ka fungi pathogenic atawa baktéri, kaasup kontribusi kana réaksi alérgi69,70,71.
Kelas III péroxidases nyaéta énzim tutuwuhan multifungsi aub dina rupa-rupa prosés métabolik salila tumuwuhna tumuwuhna tutuwuhan, kitu ogé dina respon kana stresses lingkungan kayaning salinitas, halodo, inténsitas cahaya tinggi, sarta serangan patogén72.Péroxidases aub dina interaksi sababaraha spésiés tutuwuhan jeung Anthracis, kaasup Stylosanthes humilis jeung C. gloeosporioides, Lens culinaris jeung C. truncatum, Phaseolus vulgaris jeung C. lindemuthianum, Cucumis sativus jeung C. lagenarium73,74,75,76.Résponna gancang pisan, sok sanajan dina 4 HPI, saméméh jamur nembus jaringan tutuwuhan73.Gén peroksidase ogé ngaréspon kana inokulasi D. toxica NLL.Sajaba ti fungsi has maranéhna pikeun ngatur burst oksidatif atawa ngaleungitkeun setrés oksidatif, péroxidases bisa ngaganggu tumuwuhna patogén ku nyieun halangan fisik dumasar kana tulangan témbok sél salila lignification, subunit atawa cross-linking sanyawa husus.Fungsi ieu tiasa dikaitkeun dina silico kana gen TanjilG_03329 encoding a putative lignin-ngabentuk anion péroxidase anu sacara signifikan upregulated dina ulikan urang dina 83A: 476 garis tahan dina 6 HPI, tapi teu di galur sejen tur titik waktu nu teu ngabales.
9S-/13S-lipoxygénase asam linoleat nyaéta léngkah munggaran dina jalur oksidatif biosintésis lipid78.Produk jalur ieu ngagaduhan sababaraha fungsi dina pertahanan pepelakan, kalebet nguatkeun témbok sél ngaliwatan pembentukan deposit callose sareng pektin, sareng pangaturan setrés oksidatif ngaliwatan produksi spésiés oksigén réaktif79,80,81,82,83.Dina ulikan ayeuna, éksprési asam linoleat 9S-/13S-lipoxygenase dirobah dina sakabéh galur, tapi dina populasi rentan 22660, upregulation prevailed dina titik waktu béda, sedengkeun dina galur mawa Lanr1 tahan jeung alél AnMan, eta nekenkeun diversifikasi tina lapisan pelindung anthratypes ieu.
The 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) homolog ieu nyata upregulated (9 gén) atawa downregulated (2 gén) nalika inokulasi jeung lupin.Kalayan dua pangecualian, sadaya réspon ieu lumangsung dina 6 hp.di 83A: 476.Réaksi énzimatik anu dimédiasi ku protéin ACO nyaéta léngkah ngawatesan laju dina produksi étiléna sahingga diatur pisan84.Étiléna nyaéta hormon tutuwuhan anu maénkeun rupa-rupa peran dina ngatur kamekaran tutuwuhan sareng réspon kana kaayaan setrés abiotik sareng biotik.Induksi transkripsi ACO sareng aktivasina jalur sinyal étiléna kalibet dina ningkatkeun daya tahan béas ka jamur hemibiotrophic oryzae oryzae ku ngatur produksi spésiés oksigén réaktif sareng phytoalexins.Prosés inféksi daun pisan sarupa kapanggih antara M. oryzae jeung C. lupini88,89, ngalawan backdrop of a upregulation signifikan tina homologues ACO dina 83A: 476 garis dilaporkeun dina ulikan ieu, shifts kamungkinan conferring lalawanan ka NLL anthracnose Étiléna a signalling hambalan sentral dina jalur molekular.
Dina ulikan ayeuna, suprési skala ageung seueur gen anu aya hubunganana sareng fotosintésis dititénan dina 6 hpi dina 83A: 476 sareng dina 48 hpi di Mandeloop sareng populasi 22660.Legana jeung kamajuan parobahan ieu sabanding jeung tingkat.Résistansi anthracnose dititénan dina percobaan ieu.Anyar-anyar ieu, represi anu kuat sareng awal tina transkrip anu aya hubunganana sareng fotosintésis parantos dilaporkeun dina sababaraha modél interaksi patogén tutuwuhan, kalebet baktéri patogén sareng jamur.Rurusuhan (tina 2 HPI dina sababaraha interaksi) sareng suprési global gén anu aya hubunganana sareng fotosintésis pikeun ngaréspon inféksi tiasa memicu kekebalan pepelakan dumasar kana panyebaran spésiés oksigén réaktif sareng interaksina sareng jalur asam salisilat pikeun nyapih réaksi alérgi 90,94.
Kasimpulanana, mékanisme réspon pertahanan anu diusulkeun pikeun turunan anu paling tahan (83A: 476) kalebet pangakuan patogén anu gancang ku gén R (sigana TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) sareng asam salisilat anu dimédiasi ku réaksi alérgi sareng sinyal étiléna, dituturkeun ku ngadegna SAR jarak jauh.aksi dirojong ku protéin DIR-1.Perlu dicatet yén periode biotrophic pikeun inféksi C. lupini pondok pisan (kira-kira 2 poé), dituturkeun ku tumuwuhna necrotic95.Transisi antara tahapan ieu tiasa dikaitkeun sareng nekrosis sareng ekspresi protéin anu tiasa diinduksi étiléna anu bertindak salaku pemicu réaksi hipersensitivitas dina pepelakan inang.Ku alatan éta, jandela waktu pikeun suksés newak C. lupini dina tahap biotrophic pisan sempit.Pemrograman ulang gén anu aya hubunganana sareng rédoks sareng fotosintésis anu dititénan dina 83A: 476 dina 6 hpi konsisten sareng kamajuan hifa jamur sareng nunjukkeun pangembangan réspon pelindung anu suksés dina tahap biotrofik.Réspon transcriptomic of Mandelup jeung populasi 22660 bisa jadi teuing nyangsang pikeun néwak jamur saméméh pindah ka tumuwuhna necrotic, kumaha oge, Mandelup bisa jadi leuwih éféktif batan populasi 22660 sabab régulasi rélatif gancang protéin PR-10 promotes résistansi horizontal.
ETI, didorong ku gén R canonical, sigana janten mékanisme umum pikeun résistansi kacang kana antraknosa.Ku kituna, dina model legume Medicago truncatula, résistansi ka anthracnose dipasihan ku gén RCT1, anggota kelas gén tutuwuhan R TIR-NBS-LRR97.Gén ieu ogé masihan résistansi anthracnose spéktrum lega dina alfalfa nalika ditransfer ka pepelakan anu rentan.Dina kacang umum (P. vulgaris), leuwih ti dua belasan gén résistansi anthracnose geus diidentifikasi nepi ka ayeuna.Sababaraha gén ieu aya di daérah anu teu aya gén R kanonik, tapi seueur deui anu aya di sisi kromosom anu mawa gugus gén NBS-LRR, kalebet TIR-NBS-LRRs99.Ulikan SSR génom-lega ogé dikonfirmasi pakaitna gén NBS-LRR kalawan lalawanan anthracnose dina kacang umum.Gén R kanonik ogé kapanggih di wewengkon génomik mawa lokus résistansi antraknosa utama dina lupin bodas 101.
Karya urang nunjukkeun yén réaksi résistansi saharita, diaktipkeun dina tahap awal inféksi tutuwuhan (preferably no saterusna ti 12 hpi), éféktif ngajaga sempit-leaved lupine tina anthracnose disababkeun ku jamur pathogenic Collelotrichum lupini.Ngagunakeun sequencing throughput tinggi, kami nunjukkeun propil éksprési diferensial gén résistansi anthracnose dina tutuwuhan NLL dimédiasi ku gén lalawanan Lanr1 na AnMan.Pertahanan suksés ngalibatkeun sacara saksama ngarancang gén pikeun protéin anu kalibet dina rédoks, fotosintésis, sareng patogenesis dina sababaraha jam saatos kontak munggaran pepelakan sareng patogén.Réaksi pelindung anu sami, tapi ditunda dina waktosna, langkung efektif pikeun ngajagi pepelakan tina panyakit.Résistansi anthrax anu dimédiasi ku gén Lanr1 nyarupaan réspon gancang khas gén R (kekebalan anu dipicu éféktor), sedengkeun gén AnMan paling dipikaresep nyayogikeun réspon horisontal (kekebalan anu dipicu ku pola molekular anu aya hubunganana ku mikroba), nyayogikeun tingkat kelestarian anu sedeng.
215 garis NLL dipaké pikeun layar pikeun spidol anthracnose diwangun ku 74 kultivar, 60 garis diala ku nyebrang atawa beternak, 5 mutan, sarta 76 germplasms liar atawa aslina.Jalurna asalna ti 17 nagara, utamina ti Polandia (58), Spanyol (47), Jérman (27), Australia (26), Rusia (19), Bélarus (7), Italia (5) sareng jalur sanés.ti 10 nagara.Set ogé ngawengku garis tahan rujukan: 83A: 476, Tanjil, Wonga mawa alél Lanr1, sarta Mandelup mawa alél AnMan.Garis-garisna dicandak tina Database Sumber Daya Genetik Lupin Éropa anu dikelola ku Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polandia (Tabel Tambahan S1).
Tutuwuhan dipelak dina kaayaan anu dikendali (photoperiod 16 jam, suhu 25 ° C siang sareng 18 ° C wengi).Dua réplikasi biologis dianalisis.DNA ieu diisolasi tina daun heubeul tilu minggu ngagunakeun DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jérman) nurutkeun protokol.Kualitas sareng konsentrasi DNA anu terasing ditaksir ku metode spéktrofotometri (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS).The AnManM1 spidol nyirian gén lalawanan anthracnose AnMan (diturunkeun tina cv. Mandelup) jeung spidol Anseq3 na Anseq4 flanking gén Lanr1 (diturunkeun tina cv. Tanjil) dianalisis 11,26,28.Homozigot pikeun alél tahan dibéré skor "1", rentan - salaku "0", sareng heterozigot - salaku 0,5.
Dumasar kana hasil saringan pikeun spidol AnManM1, AnSeq3 sareng AnSeq4 sareng kasadiaan siki pikeun percobaan nurutan ahir, 50 garis NLL dipilih pikeun phenotyping résistansi anthracnose.Analisis dilaksanakeun dina duplikat di rumah kaca anu dikontrol komputer kalayan période 14 jam kalayan suhu hawa 22 ° C siang sareng 19 ° C wengi.Sikina digores (memotong kulit siki dina sisi sabalikna tina cikal kalawan sabeulah seukeut) saméméh sowing pikeun nyegah dormancy siki alatan kulit siki teuas teuing jeung pikeun mastikeun pengecambahan seragam.Tutuwuhan dipelak dina pot (11 × 11 × 21 cm) kalayan taneuh steril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsawa, Polandia).Inokulasi dilaksanakeun ku galur Colletotrichum lupini Col-08, tumuwuh dina taun 1999 tina batang tutuwuhan lupine daun sempit anu tumuwuh di sawah di Verzhenitsa, Greater Poland (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Kéngingkeun daérah.Isolat dibudidayakan dina medium SNA dina 20 ° C. dina lampu hideung salila 21 poé pikeun ngainduksi sporulasi.Opat minggu saatos penanaman, nalika pepelakan parantos ngahontal tahap 4-6 daun, inokulasi dilaksanakeun ku nyemprot kalayan suspénsi konidia dina konsentrasi 0,5 x 106 konidia per ml.Saatos inokulasi, pepelakan disimpen di tempat poék salami 24 jam dina kalembaban sakitar 98% sareng suhu 25 ° C pikeun ngagampangkeun pengecambahan konidia sareng prosés inféksi.Tutuwuhan ieu lajeng dipelak dina photoperiod 14-jam dina 22 ° C beurang / 19 ° C peuting jeung kalembaban 70%.Skor panyakit dilakukeun 22 dinten saatos inokulasi sareng berkisar antara 0 (imun) dugi ka 9 (rentan pisan) gumantung kana ayana atanapi henteuna lesi necrotic dina batang sareng daun.Salaku tambahan, saatos nyetak, beurat pepelakan diukur.Hubungan antara genotip spidol sareng fénotip panyakit diitung salaku korélasi dua-sekuen titik (henteuna spidol hétérozigot dina susunan garis pikeun analisa fénotip résistansi antraknosa).