Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngajantenkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Aya peryogi sistem in vitro anu tiasa dipercaya anu akurat tiasa ngahasilkeun deui lingkungan fisiologis jantung pikeun uji ubar.Kasadiaan kawates sistem kultur jaringan jantung manusa nyababkeun interpretasi anu teu akurat ngeunaan épék ubar jantung.Di dieu, urang geus ngembangkeun model kultur jaringan cardiac (CTCM) nu electromechanically ngarangsang keureut jantung sarta ngalaman manteng fisiologis salila fase systolic na diastolic tina siklus cardiac.Saatos 12 dinten budaya, pendekatan ieu sawaréh ningkatkeun viability bagian jantung, tapi henteu pinuh ngajaga integritas strukturna.Ku alatan éta, sanggeus screening molekul leutik, urang manggihan yén tambahan 100 nM triiodothyronine (T3) jeung 1 μM dexamethasone (Dex) kana medium urang ngajaga mikrostruktur tina bagian pikeun 12 poé.Dina kombinasi kalayan perlakuan T3 / Dex, sistem CTCM ngajaga propil transcriptional, viability, aktivitas métabolik, sarta integritas struktural dina tingkat sarua salaku jaringan jantung seger pikeun 12 poé.Sajaba ti éta, kaleuleuwihan manjang jaringan cardiac dina budaya induces hypertrophic cardiac signalling, nyadiakeun bukti kamampuhan CTCM mun meniru kaayaan hypertrophic ngainduksi ku manteng cardiac.Kasimpulanana, CTCM tiasa ngamodelkeun fisiologi sareng patofisiologi jantung dina budaya dina waktos anu lami, ngamungkinkeun saringan ubar anu dipercaya.
Saacanna panalungtikan klinis, sistem in vitro dipercaya diperlukeun anu bisa akurat baranahan lingkungan fisiologis jantung manusa.Sistem sapertos kitu kedah meniru manteng mékanis anu dirobih, denyut jantung, sareng sipat éléktrofisiologis.Modél sato ilaharna dipaké salaku platform screening pikeun fisiologi cardiac kalawan reliabiliti kawates dina reflecting épék ubar dina haté manusa1,2.Pamustunganana, Modél Ékspérimén Budaya Jaringan Jantung Idéal (CTCM) nyaéta modél anu sénsitip pisan sareng spésifik pikeun sagala rupa intervensi terapi sareng farmakologis, sacara akurat ngahasilkeun deui fisiologi sareng patofisiologi jantung manusa3.Henteuna sistem sapertos kitu ngabatesan panemuan pangobatan anyar pikeun gagal jantung4,5 sareng nyababkeun kardiotoksik obat salaku alesan utama pikeun kaluar tina pasar6.
Sapanjang dasawarsa katukang, dalapan ubar non-kardiovaskular parantos ditarik tina panggunaan klinis sabab nyababkeun perpanjangan interval QT ngarah kana aritmia ventrikular sareng maot ngadadak7.Ku kituna, aya kabutuhan ngaronjat pikeun strategi screening preclinical dipercaya pikeun assess efficacy cardiovascular jeung karacunan.Pamakéan panganyarna tina cardiomyocytes turunan sél stém pluripotent manusa-ngainduksi (hiPS-CM) dina screening ubar jeung tés karacunan nyadiakeun solusi parsial pikeun masalah ieu.Sanajan kitu, alam immature of hiPS-CMs jeung kurangna pajeulitna multisélular jaringan cardiac mangrupakeun watesan utama metoda ieu.Panaliti anyar nunjukkeun yén watesan ieu tiasa diatasi ku ngagunakeun awal hiPS-CM pikeun ngabentuk hydrogels jaringan jantung teu lami saatos kontraksi spontan sareng laun-laun ningkatkeun stimulasi listrik kana waktosna.Tapi, microtissues hiPS-CM ieu kakurangan tina sipat éléktrofisiologis sareng kontraktil dewasa tina miokardium sawawa.Sajaba ti éta, jaringan jantung manusa boga struktur nu leuwih kompleks, diwangun ku campuran hétérogén tipe sél béda, kaasup sél endothelial, neuron, jeung fibroblasts stromal, interconnected ku susunan husus protéin matrix extracellular.Hétérogénitas ieu populasi non-cardiomyocyte11,12,13 dina haté mamalia sawawa mangrupa panghalang utama pikeun modeling jaringan cardiac ngagunakeun tipe sél individu.Watesan utama ieu nekenkeun pentingna ngembangkeun metode pikeun ngabudayakeun jaringan miokard anu utuh dina kaayaan fisiologis sareng patologis.
Bagian ipis (300 µm) anu dibudidayakeun tina jantung manusa parantos kabuktosan janten modél anu ngajangjikeun pikeun miokardium manusa anu utuh.Metoda ieu nyadiakeun aksés ka sistem multisélular 3D lengkep sarupa jaringan jantung manusa.Nanging, dugi ka 2019, panggunaan bagian jantung berbudaya diwatesan ku kasalametan budaya pondok (24 jam).Ieu alatan sababaraha faktor kaasup kurangna fisik-mékanis manteng, panganteur hawa-cair, sarta pamakéan média basajan nu teu ngarojong kaperluan jaringan cardiac.Dina 2019, sababaraha kelompok panaliti nunjukkeun yén ngalebetkeun faktor mékanis kana sistem kultur jaringan jantung tiasa manjangkeun umur budaya, ningkatkeun ekspresi jantung, sareng meniru patologi jantung.Dua studi elegan 17 jeung 18 némbongkeun yén uniaxial loading mékanis boga pangaruh positif kana phenotype cardiac salila budaya.Sanajan kitu, studi ieu teu ngagunakeun dinamis tilu diménsi physico-mékanis loading tina siklus cardiac, saprak bagian jantung anu dieusian ku boh gaya tensile isometric 17 atawa loading auxotonic linier 18.Métode manjang jaringan ieu nyababkeun suprési seueur gén jantung atanapi overexpression gén anu aya hubunganana sareng réspon manteng anu teu normal.Utamana, Pitoulis et al.19 dimekarkeun mandi budaya nyiksikan haté dinamis pikeun rekonstruksi siklus cardiac ngagunakeun eupan balik transduser gaya jeung tegangan drive.Sanajan sistem ieu ngamungkinkeun pikeun modeling siklus cardiac in vitro leuwih akurat, pajeulitna sarta throughput low sahiji metodeu ngawatesan aplikasi sistem ieu.Laboratorium kami nembe ngembangkeun sistem kultur saderhana nganggo stimulasi listrik sareng medium anu dioptimalkeun pikeun ngajaga daya tahan bagian tina babi sareng jaringan jantung manusa dugi ka 6 dinten20,21.
Dina naskah ayeuna, urang ngajelaskeun model kultur jaringan cardiac (CTCM) ngagunakeun bagian tina jantung babi nu incorporates cues humoral mun recapitulate fisiologi cardiac tilu diménsi sarta distensi pathophysiological salila siklus cardiac.CTCM Ieu bisa ningkatkeun akurasi prediksi ubar pre-klinis ka tingkat pernah saméméh kahontal ku nyadiakeun ongkos-éféktif, pertengahan throughput Sistim cardiac nu mimics fisiologi / patofisiologi jantung mamalia pikeun nguji ubar pre-klinis.
Sinyal mékanis hemodinamik maénkeun peran kritis dina ngajaga fungsi cardiomyocyte in vitro 22,23,24.Dina naskah ayeuna, urang geus ngembangkeun hiji CTCM (Gambar 1a) nu bisa meniru lingkungan cardiac sawawa ku inducing duanana stimulasi listrik jeung mékanis dina frékuénsi fisiologis (1.2 Hz, 72 ketukan per menit).Pikeun nyingkahan manteng jaringan kaleuleuwihan salila diastole, hiji alat percetakan 3D ieu dipaké pikeun ngaronjatkeun ukuran jaringan ku 25% (Gbr. 1b).Pacing listrik diinduksi ku sistem C-PACE ieu timed dimimitian 100 mdet saméméh systole ngagunakeun sistem akuisisi data pikeun pinuh baranahan siklus cardiac.Sistem kultur jaringan ngagunakeun aktuator pneumatik anu tiasa diprogram (LB Téknik, Jérman) pikeun sacara siklik ngalegaan mémbran silikon anu fleksibel pikeun nyababkeun ékspansi irisan jantung dina rohangan luhur.Sistim ieu disambungkeun ka garis hawa éksternal ngaliwatan transduser tekanan, nu ngamungkinkeun pikeun akurat ngaluyukeun tekanan (± 1 mmHg) jeung waktu (± 1 mdet) (Gbr. 1c).
a Ngagantelkeun bagian jaringan kana cingcin rojongan 7 mm, ditémbongkeun dina bulao, jero chamber budaya alat.The chamber budaya dipisahkeun tina chamber hawa ku mémbran silicone fléksibel ipis.Teundeun gasket antara unggal chamber pikeun nyegah leaks.Tutup alat ngandung éléktroda grafit nu nyadiakeun stimulasi listrik.b Répréséntasi skéma tina alat jaringan badag, ring pituduh na ring rojongan.Bagian jaringan (coklat) disimpen dina alat oversized jeung cingcin pituduh disimpen dina alur dina ujung luar alat.Ngagunakeun pituduh, taliti nempatkeun ring rojongan coated ku napel akrilik jaringan dina bagian jaringan cardiac.c Grafik némbongkeun waktu stimulasi listrik salaku fungsi tina tekanan chamber hawa dikawasa ku actuator pneumatic programmable (PPD).Alat akuisisi data digunakeun pikeun nyinkronkeun stimulasi listrik nganggo sensor tekanan.Nalika tekanan dina chamber budaya ngahontal bangbarung set, sinyal pulsa dikirim ka C-PACE-EM pikeun memicu stimulasi listrik.d Gambar opat CTCMs disimpen dina rak incubator.Opat alat disambungkeun ka hiji PPD via sirkuit pneumatic, sarta sensor tekanan diselapkeun kana klep hemostatic ngawas tekanan dina sirkuit pneumatic.Unggal alat ngandung genep bagian jaringan.
Ngagunakeun actuator pneumatic tunggal, kami bisa ngadalikeun 4 alat CTCM, nu masing-masing bisa nahan 6 bagian jaringan (Gbr. 1d).Dina CTCM, tekanan hawa dina chamber hawa dirobah jadi tekanan sinkron dina chamber cairan sarta induces ékspansi fisiologis nyiksikan jantung (Gambar 2a jeung Suplemén Movie 1).Evaluasi manteng jaringan dina 80 mm Hg.Seni.némbongkeun manjang tina bagian jaringan ku 25% (Gbr. 2b).Persentase manteng ieu ditingalikeun pakait sareng panjang sarkomer fisiologis 2.2-2.3 µm pikeun kontraktilitas bagian jantung normal17,19,25.Gerakan jaringan ditaksir nganggo setélan kaméra khusus (Suplemén Gambar 1).Amplitudo jeung laju gerak jaringan (Gbr. 2c, d) corresponded mun manteng salila siklus cardiac jeung waktu salila systole na diastole (Gbr. 2b).Manteng jeung laju jaringan cardiac salila kontraksi jeung rélaxasi tetep konstan pikeun 12 poé dina budaya (Gbr. 2f).Pikeun evaluate efek stimulasi listrik dina contractility salila budaya, urang ngembangkeun hiji metodeu pikeun nangtukeun deformity aktif ngagunakeun algoritma shading (Suplemén Gbr. 2a, b) tur éta bisa ngabedakeun antara deformities kalawan jeung tanpa stimulasi listrik.Bagian jantung anu sami (Gbr. 2f).Di wewengkon movable of cut (R6-9), tegangan salila stimulasi listrik éta 20% leuwih luhur ti dina henteuna stimulasi listrik, nu nunjukkeun kontribusi stimulasi listrik kana fungsi contractile.
Ngambah tekanan chamber hawa, tekanan chamber cairan, sarta ukuran gerakan jaringan mastikeun yén tekanan chamber robah tekanan chamber cairan, ngabalukarkeun gerakan pakait tina nyiksikan jaringan.b Ngawakilan regangan persen (biru) bagian jaringan pakait jeung persen regangan (oranyeu).c Gerak anu diukur tina irisan jantung konsisten sareng laju gerak anu diukur.(d) Ngawakilan lintasan gerak siklik (garis biru) sareng laju (garis titik-titik oranyeu) dina nyiksikan jantung.e Kuantitas waktu siklus (n = 19 keureut per grup, ti babi béda), waktu kontraksi (n = 19 keureut per grup), waktu rélaxasi (n = 19 keureut per grup, ti babi béda), gerakan jaringan (n = 25).keureut) / grup tina babi béda), laju systolic puncak (n = 24 (D0), 25 (D12) keureut / grup ti babi béda) jeung laju rélaxasi puncak (n = 24 (D0), 25 (D12) keureut / grup tina babi béda).Uji-t Siswa dua-buntut henteu nunjukkeun béda anu signifikan dina parameter naon waé.f Wawakil analisis galur ngambah bagian jaringan kalawan (beureum) jeung tanpa (biru) stimulasi listrik, sapuluh wewengkon régional bagian jaringan ti bagian anu sarua.Panel handap nunjukkeun kuantifikasi persentase bédana dina galur dina bagian jaringan sareng sareng tanpa stimulasi listrik dina sapuluh daérah tina bagian anu béda. (n = 8 keureut / grup tina babi béda, Dua-buntut Mahasiswa t-test dipigawé; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). (n = 8 keureut / grup tina babi béda, Dua-buntut Mahasiswa t-test dipigawé; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 bagian / grup tina babi béda, dua-buntut murid t-test; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bagian / grup, ti babi béda, dua-buntut murid t-test; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05).Bar kasalahan ngagambarkeun mean ± simpangan baku.
Dina sistem budaya nyiksikan jantung biomimetic statik saméméhna kami [20, 21], kami ngajaga viability, fungsi, jeung integritas struktural keureut jantung salila 6 poé ku nerapkeun stimulasi listrik sarta optimizing komposisi sedeng.Sanajan kitu, sanggeus 10 poé, angka ieu turun sharply.Kami bakal ngarujuk kana bagian anu dibudidayakeun dina sistem kultur biomimetik statik sateuacana 20, 21 kaayaan kontrol (Ctrl) sareng kami bakal ngagunakeun médium anu dioptimalkeun sateuacana salaku kaayaan MC sareng budaya dina stimulasi mékanis sareng listrik sakaligus (CTCM).disebut .Kahiji, urang ditangtukeun yén stimulasi mékanis tanpa stimulasi listrik éta cukup pikeun ngajaga viability jaringan pikeun 6 poé (Suplemén Gbr. 3a, b).Narikna, ku bubuka stimulasi physio-mékanis jeung listrik maké STCM, viability sahiji bagian jantung 12 poé tetep sarua dina bagian jantung seger dina kaayaan MS, tapi teu dina kaayaan Ctrl, sakumaha ditémbongkeun ku analisis MTT (Gbr. 1).3a).Ieu nunjukkeun yén stimulasi mékanis jeung simulasi tina siklus cardiac bisa ngajaga bagian jaringan giat pikeun dua kali salami dilaporkeun dina sistem budaya statik saméméhna urang.Sanajan kitu, assessment tina integritas struktural bagian jaringan ku immunolabeling of cardiac troponin T na connexin 43 némbongkeun yén connexin 43 éksprési nyata leuwih luhur dina jaringan MC dina dinten 12 ti dina kadali dina dinten anu sami.Sanajan kitu, ekspresi connexin 43 seragam jeung formasi Z-disc teu pinuh dijaga (Gbr. 3b).Kami nganggo kerangka intelijen buatan (AI) pikeun ngitung integritas struktur jaringan26, pipa pembelajaran jero dumasar-gambar dumasar kana troponin-T sareng pewarnaan connexin43 pikeun otomatis ngitung integritas struktural sareng fluoresensi irisan jantung dina hal kakuatan lokalisasi.Metoda ieu ngagunakeun Convolutional Neural Network (CNN) jeung kerangka learning jero pikeun reliably ngitung integritas struktural jaringan cardiac dina ragam otomatis tur unbiased, sakumaha ditétélakeun dina rujukan.26. MC jaringan némbongkeun ningkat kasaruaan struktural dinten 0 dibandingkeun bagian kontrol statik.Salaku tambahan, pewarnaan trichrome Masson ngungkabkeun persentase fibrosis anu langkung handap dina kaayaan MS dibandingkeun kaayaan kontrol dina dinten 12 budaya (Gbr. 3c).Bari CTCM ngaronjat viability bagian jaringan jantung dina dinten 12 ka tingkat nu sarupa jeung jaringan jantung seger, éta teu nyata ngaronjatkeun integritas struktural tina bagian jantung.
a Bar grafik nembongkeun kuantifikasi tina viability MTT keureut jantung seger (D0) atawa keureut jantung budaya keur 12 poé boh dina kultur statik (D12 Ctrl) atawa dina CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) keureut / group dilakukeun dina hiji cara D## 0, ANOVA ka babi; **p <0.01 dibandingkeun D12 Ctrl). a Bar grafik nembongkeun kuantifikasi tina viability MTT keureut jantung seger (D0) atawa keureut jantung budaya keur 12 poé boh dina kultur statik (D12 Ctrl) atawa dina CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) keureutan / group dipigawé ANOVA ka ##0; tés / group ti ##0. jeung **p <0.01 dibandingkeun D12 Ctrl).histogram nembongkeun kuantifikasi tina viability sahiji bagian jantung seger MTT (D0) atawa budaya bagian jantung pikeun 12 poé dina boh budaya statik (kontrol D12) atanapi CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12) ), 12 (D12 MC) bagian / grup anu dipigawé hiji-way ANOVA babi;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 dibandingkeun D0 jeung **p <0.01 dibandingkeun D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 幇(D12 MC) 幇(D0) 幇12.相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 猇(D12 MC) 猇(D0) 12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histogram némbongkeun kuantifikasi viability MTT dina bagian jantung seger (D0) atawa bagian jantung berbudaya salila 12 poé dina budaya statik (kontrol D12) atanapi CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12)), 12 (D12 MC) bagian / grup tina babi béda ANOVA, hiji arah test ANOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0,0001 dibandingkeun D0, **p <0,01 dibandingkeun D12 Ctrl).b Troponin-T (héjo), connexin 43 (beureum) sareng DAPI (biru) dina bagian jantung anu nembé terasing (D0) atanapi bagian jantung anu dibudayakeun dina kaayaan statik (Ctrl) atanapi kaayaan CTCM (MC) salami 12 dinten) tina gambar immunofluorescence wawakil (skala kosong = 100 µm). Kuantifikasi kecerdasan jieunan tina integritas struktur jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) keureut / grup masing-masing tina babi béda, test ANOVA hiji arah dipigawé; ####p <0.0001 dibandingkeun D0 na **** p <0.0001 dibandingkeun D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan jieunan tina integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) keureut / grup masing-masing tina babi béda, test ANOVA hiji arah dipigawé; #### p <0.0001 dibandingkeun D0 na **** p <0.0001 dibandingkeun D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl урт), 7 (D12 Ctrl 2) зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12). Quantification tina integritas struktural jaringan cardiac ku kecerdasan jieunan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagian / grup tina babi béda, test ANOVA hiji arah dipigawé; ####p <0.0001 vs kalawan D0 na ****p <0.0001 dibandingkeun D012 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) keureutan/grup masing-masing babi anu béda, uji ANOVA saarah;##p00 < 玸0##p 0. 001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) keureutan/grup masing-masing babi anu béda, uji ANOVA saarah;##p 0.0.00. 001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), 7 (D12) Ctrl (D12) Ctrl (D12) у каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12). kecerdasan jieunan keur ngitung integritas struktural jaringan cardiac (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagian / grup unggal babi béda, test ANOVA hiji arah; ###p<0.0001 vs .D0 Pikeun babandingan ****p <0.0001 Ctrl dibandingkeun D). c Gambar wawakil (kénca) jeung kuantifikasi (katuhu) keur keureut jantung diwarnaan ku noda trichrome Masson urang (Skala bulistir = 500 µm) (n = 10 keureut / grup masing-masing tina babi béda, tés ANOVA hiji arah dipigawé; ####p <0.0001 dibandingkeun D0 na *** p <0.0001 dibandingkeun D0 na *** p <0.00 trl C). c Gambar wawakil (kénca) jeung kuantifikasi (katuhu) keur keureut jantung diwarnaan ku noda trichrome Masson urang (Skala bulistir = 500 µm) (n = 10 keureut / grup masing-masing tina babi béda, test ANOVA hiji arah dipigawé; #### p <0.0001 dibandingkeun D0 jeung *** ptr <0.001 dibandingkeun D0 na *** ptr <0.0). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным смрасимлак ытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных посвиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0.0001 по свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0.0001 по синвер < 0,0001 по сювран нию с D12 Ctrl). c Gambar wawakil (kénca) jeung kuantifikasi (katuhu) tina bagian jantung diwarnaan ku noda trichrome Masson urang (skala uncoated = 500 µm) (n = 10 bagian / grup ti babi béda, test ANOVA hiji arah dipigawé; #### p <0 .0001 dibandingkeun D0 na *** p <0.001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（裸尺度 （裸尺度 5片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与缔 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试 ，0.##试 ，0.##**0；猪 ， 进行 单向 单向 Anova <0.##**0；0.## p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихроямным краситель 5 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсиов;## 0 ного дисперсио ;## нению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Gambar wawakil (kénca) jeung quantitation (katuhu) tina bagian jantung patri ku noda trichrome Masson urang (kosong = 500 µm) (n = 10 bagian / grup, masing-masing ti babi béda, diuji ku analisis hiji arah varians ;### # p <0.0001 dibandingkeun D0, *** ptr <0.1).Bar kasalahan ngagambarkeun mean ± simpangan baku.
Urang hipotésis yén ku nambahkeun molekul leutik kana medium budaya, integritas cardiomyocyte bisa ningkat jeung ngembangkeun fibrosis ngurangan salila budaya CTCM.Ku kituna kami disaring pikeun molekul leutik ngagunakeun budaya kontrol statik kami20,21 alatan jumlah leutik faktor confounding.Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), sareng SB431542 (SB) dipilih pikeun layar ieu.Molekul-molekul leutik ieu sateuacana dianggo dina kultur hiPSC-CM pikeun ngainduksi maturasi kardiomiosit ku cara ningkatkeun panjang sarkomer, T-tubulus, sareng laju konduksi.Salaku tambahan, duanana Dex (glukokortikoid) sareng SB dipikanyaho ngirangan peradangan29,30.Ku alatan éta, urang nguji naha citakan hiji atawa kombinasi molekul leutik ieu bakal ngaronjatkeun integritas struktural bagian jantung.Pikeun saringan awal, dosis unggal sanyawa dipilih dumasar kana konsentrasi anu biasa dianggo dina modél kultur sél (1 μM Dex27, 100 nM T327, sareng 2.5 μM SB31).Saatos 12 dinten budaya, kombinasi T3 sareng Dex nyababkeun integritas struktural kardiomiosit optimal sareng remodeling serat minimal (Gambar Tambahan 4 sareng 5).Sajaba ti éta, pamakéan ganda atawa ganda konsentrasi ieu T3 na Dex ngahasilkeun épék deleterious dibandingkeun konsentrasi normal (Suplemén Gbr. 6a, b).
Saatos screening awal, urang ngalakukeun ngabandingkeun sirah-to-sirah tina 4 kaayaan budaya (Gambar 4a): Ctrl: bagian jantung berbudaya dina budaya statik urang digambarkeun saméméhna ngagunakeun medium kami dioptimalkeun;20.21 TD: T3 jeung Ctrl s Ditambahkeun Dex Rebo;MC: bagian jantung dibudidayakan di CTCM ngagunakeun sedeng kami dioptimalkeun saméméhna;sarta MT: CTCM kalawan T3 na Dex ditambahkeun kana sedeng.Sanggeus 12 poé budidaya, viability jaringan MS sarta MT tetep sarua dina jaringan seger ditaksir ku MTT assay (Gbr. 4b).Narikna, tambihan T3 sareng Dex kana budaya transwell (TD) henteu nyababkeun paningkatan anu signifikan dina viability dibandingkeun kaayaan Ctrl, nunjukkeun peran penting tina stimulasi mékanis dina ngajaga viability tina bagian jantung.
a diagram desain ékspériméntal ngagambarkeun opat kaayaan budaya dipaké pikeun evaluate efek tina stimulasi mékanis jeung supplementation T3 / Dex on medium pikeun 12 poé. b Bar grafik nembongkeun kuantitas viability 12 poé pos budaya dina sakabéh 4 kaayaan budaya (Ctrl, TD, MC, sarta MT) dibandingkeun keureut jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), 12 (D12 MC) keureut / ###0, test / group 12 (D12 MC) <##0, AN##0, AN##0, AN ###0. p <0.001 dibandingkeun D0 jeung **p <0.01 dibandingkeun D12 Ctrl). b Bar grafik nembongkeun kuantitas viability 12 poé pos budaya dina sakabéh 4 kaayaan budaya (Ctrl, TD, MC, sarta MT) dibandingkeun keureut jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), 12 (D12 MC) keureut / ###0, test / group 12 (D12 MC) <##0, AN##0, AN##0, AN ###0. p <0.001 dibandingkeun D0 jeung **p <0.01 dibandingkeun D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во вселоникровия 4 роль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) усвра й, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ##p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b The bar grafik nembongkeun kuantitas viability dina 12 poé pos budaya dina sakabéh 4 kaayaan budaya (kontrol, TD, MC, sarta MT) dibandingkeun jeung bagian jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, sarta D12 MT), 12 (D12 MC, MC) bagian / grup 12 (D12 MC, ##0 OVA, ##0, ###0 babi béda, ###0. p <0,001 vs D0 jeung ** p <0,01 ku dibandingkeun D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl1) 、 TD0 12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与比 与 与 D0 ， D0 . ）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими серди сердин (сежими сирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими серди сердим (сежими среди серди) (8 D) 12 Ctrl, D12 TD jeung D12 MT), tina разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0.0001, ####p <0,001 по внению с контролем D12). b Histogram némbongkeun sakabéh 4 kaayaan budaya (kontrol, TD, MC jeung MT) dibandingkeun jeung bagian jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), ti babi béda 12 (D12 MC) bagian / grup, test ANOVA hiji arah; ###0<0.0,00 p<0. 1 vs kontrol D12). c Bar grafik nembongkeun kuantifikasi fluks glukosa 12 poé pos budaya dina sakabéh 4 kaayaan budaya (Ctrl, TD, MC, sarta MT) dibandingkeun keureut jantung seger (D0) (n = 6 keureut / grup ti babi béda, test ANOVA hiji arah dipigawé; ###p <0.001, dibandingkeun D0 na *** p <0.001). c Bar grafik nembongkeun kuantifikasi fluks glukosa 12 poé pos budaya dina sakabéh 4 kaayaan budaya (Ctrl, TD, MC, sarta MT) dibandingkeun keureut jantung seger (D0) (n = 6 keureut / grup ti babi béda, test ANOVA hiji arah dipigawé; ###p <0.001, dibandingkeun D0 na *** p <0.001). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 лухник ь, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, одностотялнний, одностостолннински, одностотянний, одностотяннин 0 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram nembongkeun kuantifikasi fluks glukosa 12 poé pos-budaya dina sakabéh 4 kaayaan budaya (kontrol, TD, MC jeung MT) dibandingkeun jeung bagian jantung seger (D0) (n = 6 bagian / grup ti babi béda, test ANOVA hiji arah dipigawé; ###p <0.001 dibandingkeun D0 na *** p <0.001 Ctrl dibandingkeun D1). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比 的吹城通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比， 0**p 1.***p 。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切 切片 切片 ， 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执 猪单向执 ，丌向0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмама, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования дло4 вселькорования нтроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, тендиностро ; ##p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram némbongkeun kuantitas fluks glukosa dina 12 poé pos-budaya pikeun sakabéh 4 kaayaan budaya (kontrol, TD, MC, sarta MT) dibandingkeun jeung bagian jantung seger (D0) (n = 6 bagian / grup, ti babi béda, unilateral Dupi tés ANOVA anu dipigawé, ###p <0.001 dibandingkeun D0, *** p <0.001 dibandingkeun D0, *** p <0.001).d Analisis galur plot jaringan seger (biru), dinten 12 MC (héjo), sareng dinten 12 MT (beureum) dina sapuluh titik bagian jaringan régional (n = 4 keureut / grup, uji ANOVA saarah; henteu aya béda anu signifikan antara grup).e Plot gunung seuneuan némbongkeun gén béda dikedalkeun dina bagian jantung seger (D0) dibandingkeun jeung bagian jantung berbudaya dina kaayaan statik (Ctrl) atawa dina kaayaan MT (MT) salila 10-12 poé.f Peta panas gén sarkomer pikeun bagian jantung anu dibudidaya dina unggal kaayaan kultur.Bar kasalahan ngagambarkeun mean ± simpangan baku.
Katergantungan métabolik kana peralihan tina oksidasi asam lemak ka glikolisis mangrupikeun ciri tina dediferensiasi kardiomiosit.Cardiomyocytes immature utamana ngagunakeun glukosa pikeun produksi ATP sarta mibanda mitokondria hypoplastic kalawan sababaraha cristae5,32.Analisis pamakean glukosa nunjukkeun yén dina kaayaan MC sareng MT, panggunaan glukosa sami sareng dina jaringan 0 dinten (Gambar 4c).Nanging, conto Ctrl nunjukkeun paningkatan anu signifikan dina panggunaan glukosa dibandingkeun sareng jaringan seger.Ieu nunjukkeun yén kombinasi CTCM na T3 / Dex ngaronjatkeun viability jaringan sarta preserves nu phenotype métabolik 12 poé bagian jantung berbudaya.Salaku tambahan, analisa galur nunjukkeun yén tingkat galur tetep sami sareng jaringan jantung seger salami 12 dinten dina kaayaan MT sareng MS (Gbr. 4d).
Pikeun nganalisis dampak sakabéh CTCM sareng T3 / Dex dina bentang transkripsi global jaringan irisan jantung, kami ngalaksanakeun RNAseq dina irisan jantung tina sadaya opat kaayaan budaya anu béda (Data Tambahan 1).Narikna, bagian MT némbongkeun kasaruaan transcriptional tinggi kana jaringan jantung seger, kalawan ngan 16 differentially dikedalkeun kaluar tina 13.642 gén.Sanajan kitu, sakumaha urang némbongkeun saméméhna, keureut Ctrl ditampilkeun 1229 differentially dikedalkeun gén sanggeus 10-12 poé dina budaya (Gbr. 4e).Data ieu dikonfirmasi ku qRT-PCR gén jantung sareng fibroblast (Suplemén Gbr. 7a-c).Narikna, bagian Ctrl némbongkeun downregulation of cardiac jeung gén siklus sél jeung aktivasina program gén radang.Data ieu nunjukkeun yén dedifferentiation, nu ilaharna lumangsung sanggeus culturing jangka panjang, sagemblengna attenuated dina kaayaan MT (Suplemén Gbr. 8a, b).Ulikan ati gén sarcomere némbongkeun yén ngan dina kaayaan MT anu gén encoding sarcomere (Gbr. 4f) jeung saluran ion (Suplemén Gbr. 9) dilestarikan, ngajaga aranjeunna tina suprési dina kaayaan Ctrl, TD, jeung MC.Data ieu nunjukkeun yén kalayan kombinasi stimulasi mékanis sareng humoral (T3 / Dex), transkriptom nyiksikan jantung tiasa tetep sami sareng irisan jantung seger saatos 12 dinten dina budaya.
Papanggihan transkripsi ieu dirojong ku kanyataan yén integritas struktural cardiomyocytes dina bagian jantung pangalusna dilestarikan dina kaayaan MT salila 12 poé, sakumaha ditémbongkeun ku connexin gembleng tur localized 43 (Gbr. 5a).Sajaba ti éta, fibrosis di bagian jantung dina kaayaan MT ieu nyata ngurangan dibandingkeun Ctrl tur sarupa jeung bagian jantung seger (Gbr. 5b).Data ieu nunjukkeun yén kombinasi stimulasi mékanis sareng perlakuan T3 / Dex sacara efektif ngajaga struktur jantung dina bagian jantung dina budaya.
a Gambar immunofluorescence Perwakilan tina troponin-T (héjo), connexin 43 (beureum), sarta DAPI (biru) dina bagian jantung Freshly terasing (D0) atawa dibudidayakan salila 12 poé dina sakabéh opat kaayaan budaya bagian jantung (skala bar = 100 µm).). Kuantifikasi kecerdasan jieunan tina integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC jeung D12 MT) keureut / grup tina babi béda, test ANOVA hiji arah dipigawé; ####p <0.0001 dibandingkeun D0 na * p <0.000tr <1.0005, atawa D0. Kuantifikasi kecerdasan jieunan tina integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC jeung D12 MT) keureut / grup tina babi béda, test ANOVA hiji arah dipigawé; #### p <0.0001 dibandingkeun D0 na * p <0.00tr <0.05, atawa . Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 2 и TD15) D0 2 MC (D0 2 D15) MT срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,005 или ли, 0,005 или 2 Ctrl). Quantification tina integritas struktural jaringan jantung ngagunakeun kecerdasan jieunan (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) bagian / grup ti babi béda, test ANOVA hiji arah dipigawé; #### p <0.0001 dibandingkeun D0 na * p <0.0000 trl atawa D0 jeung *p <0.005.对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和人/廇至）智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与缔） Ctr.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 癄和 d1量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或**** p < 2.Quantification tina integritas struktural jaringan cardiac maké kecerdasan jieunan dina babi béda (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) bagian / grup) kalawan test ANOVA hiji arah;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 atawa ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 dibandingkeun D0 jeung *p <0.05 atawa ****p <0.0001 dibandingkeun D12 Ctrl). b Gambar wawakil jeung kuantifikasi keur irisan jantung diwarnaan ku noda trichrome Masson urang (Skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, sarta D12 MC), 9 (D12 MT) keureutan / grup ti babi béda, hiji arah ANOVA test dipigawé <1##0##0 ;***0. 1, atawa ****p <0.0001 dibandingkeun D12 Ctrl). b Gambar wawakil jeung kuantifikasi keur irisan jantung diwarnaan ku noda trichrome Masson urang (Skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, sarta D12 MC), 9 (D12 MT) keureutan / grup ti babi béda, hiji arah ANOVA test dipigawé <1##0##0 ;***0. 1, atawa ****p <0.0001 dibandingkeun D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (массона 5) массона (массона) = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA 0,## расский тест ANOVA; ## ***p < 0,001 atanapi ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Gambar wawakil jeung kuantifikasi bagian jantung diwarnaan ku noda trichrome Masson urang (skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD na D12 MC), 9 (D12 MT) bagian / grup ti babi béda, dipigawé <1-arah ANOVA. ####0. p <0,0001 vs D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！n = 2（D 10）！D = 10（D 10） MC D12 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） ） 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 爇片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 ， 不所 ， 不所 ， 万 0. ****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная = лим50 (масштабная = 50) 2 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнен0, и юp <1 ,0,0,0 ли сравне, 0**** по сравнению с D12 Ctrl). b Gambar wawakil sareng kuantifikasi bagian jantung anu diwarnaan ku trichrome Masson (skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD sareng D12 MC), 9 (D12 MT) bagian tina babi / grup anu béda, hiji metode ANOVA; ####p <0. .0001 dibandingkeun D12 Ctrl).Bar kasalahan ngagambarkeun mean ± simpangan baku.
Tungtungna, kamampuh CTCM pikeun meniru hypertrophy cardiac ieu ditaksir ku ngaronjatna jaringan cardiac manteng.Dina CTCM, tekanan chamber hawa puncak ngaronjat tina 80 mmHg ka 80 mmHg.Seni.(reggangan normal) nepi ka 140 mmHg Art.(Gbr. 6a).Ieu pakait jeung 32% kanaékan manteng (Gbr. 6b), nu saméméhna ditémbongkeun salaku persentase manteng pakait diperlukeun pikeun bagian jantung pikeun ngahontal panjang sarcomere sarupa nu ditempo dina hypertrophy.Manteng jeung laju jaringan cardiac salila kontraksi jeung rélaxasi tetep konstan salila genep poé budaya (Gbr. 6c).Jaringan cardiac tina kaayaan MT ieu subjected kana manteng normal (MT (Normal)) atawa kaayaan overstretch (MT (OS)) salila genep poé.Geus sanggeus opat poé dina budaya, anu biomarker hypertrophic NT-ProBNP ieu nyata elevated dina sedeng dina kaayaan MT (OS) dibandingkeun MT (normal) kaayaan (Gbr. 7a).Sajaba ti éta, sanggeus genep poé culturing, ukuran sél dina MT (OS) (Gbr. 7b) nyata ngaronjat dibandingkeun bagian tina jantung MT (normal).Sajaba ti éta, translocation nuklir NFATC4 ieu nyata ngaronjat dina jaringan overstretched (Gbr. 7c).Hasil ieu nunjukkeun pamekaran kutang tina remodeling patologis saatos hyperdistension sareng ngadukung konsép yén alat CTCM tiasa dianggo salaku platform pikeun diajar sinyal hipertropi jantung anu disababkeun ku manteng.
Ngambah tekanan chamber hawa, tekanan chamber cairan, sarta ukuran gerakan jaringan mastikeun yén tekanan chamber robah tekanan chamber cairan, ngabalukarkeun gerakan pakait tina nyiksikan jaringan.b Perwakilan persentase manteng jeung kurva laju manteng pikeun normal stretched (oranyeu) jeung overstretched (biru) bagian jaringan.c Bar grafik némbongkeun waktu siklus (n = 19 keureut per grup, ti babi béda), waktos kontraksi (n = 18-19 keureut per grup, ti babi béda), waktu rélaxasi (n = 19 keureut per grup, ti babi béda) ), amplitudo gerakan jaringan (n = 14 keureut / grup, ti babi béda), keureut puncak (n = 1 group béda), laju relaksasi (n = 19 keureut per grup) n = 14 (D0), 15 (D6) ) bagian / grup) ti babi béda), dua-buntut Mahasiswa t-test némbongkeun euweuh béda anu signifikan dina parameter wae, nunjukkeun yén parameter ieu tetep konstan salila 6 poé budaya kalawan overvoltage.Bar kasalahan ngagambarkeun mean ± simpangan baku.
a grafik Bar kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP dina média budaya tina keureut jantung berbudaya dina MT normal manteng (Norm) atanapi overstretching (OS) kaayaan (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, sarta D4 MTOS) keureut / grup ti babi béda, ANOVA dua arah dipigawé; ** p <0.01 a grafik Bar kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP dina média kultur tina keureut jantung dibudidayakan dina MT normal manteng (Norm) atanapi overstretching (OS) kaayaan (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, sarta D4 MTOS) keureut / grup ti babi béda, ANOVA dua arah dipigawé; ** p <0.01 regangan normal).Histogram kuantitatif konsentrasi NT-ProBNP dina medium budaya ti keureut jantung berbudaya dina kaayaan normal MT manteng (norma) atanapi overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, sarta D4) .MTOS) keureut / group ti babi béda, analisis dua-faktor varian dipigawé;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 dibandingkeun manteng normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的培养基中NT-ProBNP 浓度的浓度的浓度的浓度的在Norm)、3（D2 MTOS,D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片的切片/组，进行双向方差分析；**与正伉，与正帯片一与与正帉。 a Kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP dina irisan jantung dibudidayakeun dina kaayaan MT normal stretch (Norm) atanapi overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) ti béda 猪的切片/组，可以双双合 normal; , p <0,01).histogram Quantification of konsentrasi NT-ProBNP dina keureut jantung berbudaya dina kaayaan MT normal manteng (norma) atanapi overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) jeung D4 MTOS) keureut / grup ti babi béda, analisis dua arah varian;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 dibandingkeun manteng normal). b Gambar wawakil pikeun keureut jantung patri ku troponin-T jeung WGA (kénca) jeung ukuran sél quantification (katuhu) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sél / grup ti 10 keureut béda ti babi béda, Dua-buntut Mahasiswa t-test dipigawé; **** p <0.0001 dibandingkeun manteng normal). b Gambar wawakil pikeun keureut jantung patri ku troponin-T jeung WGA (kénca) jeung ukuran sél quantification (katuhu) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sél / grup ti 10 keureut béda ti babi béda, Two-tailed Student t-test dipigawé; **** p <0.0001 dibandingkeun manteng normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного оплякред (слева) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-крид **** хвостовой t-крид ****; сравнению с нормальным растяжением). b Gambar wawakil bagian jantung patri ku troponin-T jeung AZP (kénca) jeung ukuran sél quantification (katuhu) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sél / grup ti 10 bagian béda ti babi béda, two-tailed Student t-test ieu dipigawé; **** p <0.001 dibandingkeun galur normal). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性片的代表性（右）染色的心脏切片的代表性图（D（）表性图（D3自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与曉学生t 检验；与曉正0. ）. b Gambar wawakil keureut jantung diwarnaan ku calcarein-T jeung WGA (kénca) jeung ukuran sél (katuhu) (n = 330 (D6 MTOS), 369 ti 10 keureut béda (D6 MTNorm)) Sél/组，两方法有尾学生t test ；0 normal. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оцленка (разменных) 3 6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sareng 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента0, ****0, **** льным растяжением). b Gambar wawakil bagian jantung patri ku troponin-T jeung AZP (kénca) jeung kuantifikasi ukuran sél (katuhu) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ti 10 bagian béda ti babi béda) Sél / grup, dua-buntut kriteria murid t;****p <0,0001 dibandingkeun galur normal). c Gambar wawakil pikeun poé 0 jeung poé 6 keureut jantung MTOS immunolabeled pikeun troponin-T jeung NFATC4 jeung kuantitas translokasi NFATC4 kana inti CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) keureut / grup ti babi béda, Dua-buntut Mahasiswa t-test dipigawé; * p <0.05). c Gambar wawakil pikeun poé 0 jeung poé 6 keureut jantung MTOS immunolabeled pikeun troponin-T jeung NFATC4 jeung kuantifikasi translocation of NFATC4 kana inti CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) keureut / grup ti babi béda , Dua-buntut Mahasiswa t-test dipigawé; * p <0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и котинцич FATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двустононей , выполняется двустонюнид * Терют двустононсий клюд. c Gambar wawakil pikeun bagian jantung di 0 na 6 poé MTOS, immunolabeled pikeun troponin-T na NFATC4, sarta quantification of translocation NFATC4 dina inti sél cavernous (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) keureut / grup tina babi béda) dipigawé dua-buntut murid t-test;*p <0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，中文出于于易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.0. c Gambar wawakil calcanin-T sareng immunolabeling NFATC4 第0天和第6天MTOS keureut jantung, sareng NFATC4 tina béda NFATC4 易位至CM inti sél 的 quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 制生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS dina 0 jeung 6 poé pikeun иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и котинрацик FATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Gambar wawakil keureut jantung MTOS dina dinten 0 na 6 pikeun troponin-T na NFATC4 immunolabeling na quantification of NFATC4 translocation dina inti CM ti babi béda (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) keureut / grup, dua-buntut t -kriteria Mahasiswa urang; * p <0.05).Bar kasalahan ngagambarkeun mean ± simpangan baku.
Panaliti kardiovaskuler tarjamahan butuh modél sélulér anu akurat ngahasilkeun lingkungan jantung.Dina ulikan ieu, hiji alat CTCM dimekarkeun tur dicirikeun nu bisa merangsang bagian ultrathin jantung.Sistem CTCM kalebet stimulasi éléktromékanik anu disingkronkeun sacara fisiologis sareng pengayaan cairan T3 sareng Dex.Nalika bagian jantung babi anu kakeunaan faktor ieu, viability maranéhanana, integritas struktural, aktivitas métabolik, sarta éksprési transcriptional tetep sarua dina jaringan jantung seger sanggeus 12 poé budaya.Sajaba ti éta, manjang kaleuleuwihan jaringan cardiac bisa ngabalukarkeun hypertrophy jantung disababkeun ku hyperextension.Gemblengna, hasil ieu ngarojong peran kritis kaayaan budaya fisiologis dina ngajaga phenotype cardiac normal sarta nyadiakeun platform keur screening ubar.
Seueur faktor nyumbang kana nyiptakeun lingkungan anu optimal pikeun fungsi sareng kasalametan kardiomiosit.Anu paling atra tina faktor ieu aya hubunganana sareng (1) interaksi antarsélular, (2) stimulasi éléktromékanis, (3) faktor humoral, sareng (4) substrat métabolik.Interaksi sél-sél fisiologis merlukeun jaringan tilu diménsi kompléks tina sababaraha tipe sél nu dirojong ku matriks ekstrasélular.Interaksi sélulér anu kompleks sapertos kitu hese direkonstruksikeun sacara in vitro ku kultur ko-kultur tina jinis sél individu, tapi tiasa gampang dihontal nganggo sifat organotip tina bagian jantung.
Manteng mékanis jeung stimulasi listrik tina cardiomyocytes anu kritis pikeun ngajaga phenotype cardiac33,34,35.Bari stimulasi mékanis geus loba dipaké pikeun udar hiPSC-CM sarta maturation, sababaraha studi elegan nembe diusahakeun stimulasi mékanis tina keureut jantung dina budaya ngagunakeun loading uniaxial.Panaliti ieu nunjukkeun yén beban mékanis uniaxial 2D gaduh pangaruh anu positif kana phenotype jantung nalika budaya.Dina studi ieu, bagian jantung boh dieusian ku gaya tensile isometric17, beban auxotonic linier18, atawa siklus cardiac dijieun deui maké eupan balik gaya transduser jeung tegangan drive.Sanajan kitu, métode ieu ngagunakeun uniaxial jaringan manteng tanpa optimasi lingkungan, hasilna suprési loba gén cardiac atawa overexpression gén pakait sareng réspon manteng abnormal.CTCM anu dijelaskeun di dieu nyayogikeun stimulus éléktromékanis 3D anu niru siklus jantung alami tina segi waktos siklus sareng manteng fisiologis (25% manteng, 40% systole, 60% diastole, sareng 72 ketukan per menit).Sanajan stimulasi mékanis tilu diménsi ieu nyalira teu cukup pikeun ngajaga integritas jaringan, kombinasi humoral jeung stimulasi mékanis maké T3 / Dex diperlukeun pikeun adequately ngajaga viability jaringan, fungsi, jeung integritas.
Faktor humoral maénkeun peran penting dina modulasi phenotype jantung sawawa.Ieu disorot dina studi HiPS-CM dimana T3 sareng Dex ditambahkeun kana média budaya pikeun ngagancangkeun maturasi sél.T3 tiasa mangaruhan transportasi asam amino, gula sareng kalsium ngalangkungan mémbran sél36.Sajaba ti éta, T3 promotes ekspresi MHC-α jeung downregulation MHC-β, promosi formasi myofibrils kedutan gancang dina cardiomyocytes dewasa dibandingkeun myofibrils kedutan slow dina CM boh.Kakurangan T3 dina penderita hypothyroid ngakibatkeun leungitna pita myofibrillar sarta laju ngurangan tina ngembangkeun nada37.Dex tindakan dina reséptor glucocorticoid sarta geus ditémbongkeun ngaronjatkeun contractility myocardial dina hate perfused terasing;38 perbaikan ieu diduga aya hubunganana sareng pangaruh kana asupan anu didorong ku deposit kalsium (SOCE) 39,40.Sajaba ti éta, Dex ngiket ka reséptor na, ngabalukarkeun respon intrasélular lega nu suppresses fungsi imun jeung inflammation30.
Hasilna nunjukkeun yén stimulasi mékanis fisik (MS) ningkatkeun kinerja budaya sakabéh dibandingkeun Ctrl, tapi gagal pikeun ngajaga viability, integritas struktural, sarta éksprési cardiac leuwih 12 poé dina budaya.Dibandingkeun Ctrl, tambihan T3 sareng Dex kana budaya CTCM (MT) ningkatkeun viability sareng ngajaga profil transkripsi anu sami, integritas struktural, sareng kagiatan métabolik kalayan jaringan jantung seger salami 12 dinten.Sajaba ti éta, ku ngadalikeun darajat manteng jaringan, model hypertrophy cardiac hyperextension-ngainduksi dijieun maké STCM, illustrating nu versatility tina sistem STCM.Ieu kudu dicatet yén sanajan remodeling cardiac na fibrosis biasana ngalibetkeun organ gembleng anu sél sirkulasi bisa nyadiakeun cytokines luyu ogé fagositosis jeung faktor remodeling séjén, bagian jantung masih bisa meniru prosés fibrotic dina respon kana setrés, jeung trauma.kana myofibroblasts.Ieu parantos dievaluasi sateuacana dina modél irisan jantung ieu.Ieu kudu dicatet yén parameter CTCM bisa dimodulasi ku ngarobah tekanan / amplitudo listrik jeung frékuénsi pikeun simulate loba kaayaan kayaning tachycardia, bradycardia, sarta rojongan sirkulasi mékanis (mechanical unloaded jantung).Hal ieu ngajadikeun sistem throughput sedeng pikeun nguji ubar.Kamampuhan CTCM pikeun modél hipertrofi jantung anu disababkeun ku overexertion nyayogikeun jalan pikeun nguji sistem ieu pikeun terapi pribadi.Dina kacindekan, ulikan ayeuna nunjukkeun yén manteng mékanis sareng stimulasi humoral penting pikeun ngajaga budaya bagian jaringan jantung.
Sanajan data dibere dieu nunjukkeun yén CTCM mangrupakeun platform pisan ngajangjikeun pikeun modeling myocardium gembleng, metoda budaya ieu sababaraha watesan.Watesan utama budaya CTCM téh nya éta imposes stresses mékanis dinamis kontinyu dina keureut, nu precludes kamampuhan pikeun aktip ngawas kontraksi nyiksikan cardiac salila unggal siklus.Sajaba ti éta, alatan ukuran leutik bagian cardiac (7 mm), kamampuhan pikeun evaluate fungsi systolic luar sistem budaya ngagunakeun sensor gaya tradisional diwatesan.Dina naskah ayeuna, urang sawaréh nungkulan watesan ieu ku evaluating tegangan optik salaku indikator fungsi contractile.Tapi, watesan ieu bakal merlukeun gawé salajengna jeung bisa jadi kajawab dina mangsa nu bakal datang ku ngawanohkeun métode pikeun ngawas optik tina fungsi keureut jantung dina budaya, kayaning pemetaan optik ngagunakeun kalsium jeung dyes sénsitip tegangan.Watesan séjén tina CTCM nyaéta modél kerja henteu ngamanipulasi setrés fisiologis (preload sareng afterload).Dina CTCM, tekanan ieu ngainduksi dina arah nu lalawanan pikeun baranahan 25% manteng fisiologis di diastole (manteng pinuh) jeung systole (panjang kontraksi salila stimulasi listrik) dina jaringan anu kacida gedéna.Watesan ieu kudu dihapus dina desain CTCM kahareup ku tekanan nyukupan dina jaringan cardiac ti dua sisi sarta ku nerapkeun hubungan tekanan-volume pasti anu lumangsung dina kamar jantung.
Remodeling overstretch-induced dilaporkeun dina naskah ieu dugi ka mimicking sinyal hyperstretch hypertrophic.Ku kituna, modél ieu bisa mantuan dina ulikan ngeunaan manteng-ngainduksi hypertrophic signalling tanpa butuh faktor humoral atanapi neural (anu teu aya dina sistem ieu).Panaliti salajengna diperyogikeun pikeun ningkatkeun multiplicity CTCM, contona, co-culturing sareng sél imun, sirkulasi faktor humoral plasma, sareng innervation nalika co-culturing sareng sél neuronal bakal ningkatkeun kamungkinan modeling panyakit sareng CTCM.
Tilu belas babi dipaké dina ulikan ieu.Sadaya prosedur sato dilaksanakeun saluyu sareng pedoman institusional sareng disatujuan ku Komite Perawatan sareng Pamakéan Sato Institusi Universitas Louisville.Arch aortic ieu clamped na jantung ieu perfused kalawan 1 L cardioplegia steril (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U / mL heparin, pH nepi ka 7,4); Jantung diawetkeun dina larutan kardioplégi és-tiis dugi ka diangkut ka laboratorium dina és anu biasana <10 mnt. Jantung diawetkeun dina larutan kardioplégi és-tiis dugi ka diangkut ka laboratorium dina és anu biasana <10 mnt. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимат <. jantung disimpen dina leyuran cardioplegi és-tiis nepi ka diangkut ka laboratorium dina és, nu biasana nyokot <10 mnt.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Tetep jantung dina és cardioplegia nepi ka diangkut ka laboratorium dina és, biasana <10 mnt.
Alat CTCM dikembangkeun dina software SolidWorks computer-aided design (CAD).The chambers budaya, dividers jeung kamar hawa dijieunna tina CNC plastik acrylic jelas.Diaméter 7mm ring-up dijieunna tina poliétilén dénsitas luhur (HDPE) di tengah jeung boga alur o-ring pikeun nampung silicone o-ring dipaké pikeun ngégél média underneath.Mémbran silika ipis misahkeun chamber budaya ti piring separation.Mémbran silikon dipotong laser tina 0.02″ lambaran silikon kandel sareng karasa 35A.Gaskets silikon handap sareng luhur dipotong laser tina 1/16 "lambar silikon kandel sareng gaduh karasa 50A.316L screws stainless steel sarta kacang jangjang dipaké pikeun fastening blok jeung nyieun hiji segel airtight.
Papan sirkuit cetak khusus (PCB) dirancang pikeun dihijikeun sareng sistem C-PACE-EM.Sockets konektor mesin Swiss dina PCB disambungkeun ka éléktroda grafit ku kawat tambaga pérak-plated jeung perunggu 0-60 screws ngaco kana éléktroda.Papan sirkuit anu dicitak disimpen dina panutup printer 3D.
Alat CTCM dikawasa ku aktuator pneumatik anu tiasa diprogram (PPD) anu nyiptakeun tekanan sirkulasi anu dikontrol sami sareng siklus jantung.Salaku tekanan jero chamber hawa naek, mémbran silicone fléksibel expands ka luhur, forcing sedeng handapeun situs jaringan.Wewengkon jaringan lajeng bakal stretched ku expulsion cairan ieu, meniru ékspansi fisiologis jantung salila diastole.Dina puncak rélaxasi, stimulasi listrik diterapkeun ngaliwatan éléktroda grafit, anu ngirangan tekanan dina kamar hawa sareng nyababkeun kontraksi bagian jaringan.Di jero pipa aya klep hemostatik kalayan sensor tekanan pikeun ngadeteksi tekanan dina sistem hawa.Tekanan anu dirasakeun ku sénsor tekanan diterapkeun ka pangumpul data anu nyambung ka laptop.Hal ieu ngamungkinkeun ngawaskeun kontinyu tekanan dina chamber gas.Nalika tekanan kamar maksimum ngahontal (standar 80 mmHg, 140 mmHg OS), alat akuisisi data maréntahkeun pikeun ngirim sinyal ka sistem C-PACE-EM pikeun ngahasilkeun sinyal tegangan biphasic pikeun 2 mdet, disetel ka 4 V.
Bagian jantung dicandak sareng kaayaan kultur dina 6 sumur dilaksanakeun sapertos kieu: Mindahkeun jantung anu dipanén tina wadah transfer kana baki anu ngandung kardioplegia tiis (4 ° C.).Ventrikel kénca diisolasi ku sabeulah steril sarta potong potongan 1-2 cm3.Blok jaringan ieu napel na ngarojong jaringan kalayan napel jaringan sarta disimpen dina mandi jaringan microtome ngageter ngandung solusi Tyrode sarta terus oxygenated (3 g / L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447 mM KCl (0.447 m) , 6 mM KCl (0.447 m. PES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solusi), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M solusi), nepi ka 1 L ddH2O).Mikrotom geter disetel pikeun motong irisan kandel 300 µm dina frékuénsi 80 Hz, amplitudo geter horizontal 2 mm, sareng laju maju 0,03 mm/s.Mandi jaringan dikurilingan ku és pikeun ngajaga solusi tiis sareng suhu dijaga dina 4 ° C.Mindahkeun bagian jaringan tina mandi microtome ka mandi inkubasi ngandung larutan Tyrode terus oxygenated dina és nepi bagian cukup diala pikeun hiji piring budaya.Pikeun budaya transwell, bagian jaringan napel na steril 6 mm ngarojong polyurethane lega tur disimpen dina 6 ml medium dioptimalkeun (199 sedeng, 1x suplement ITS, 10% FBS, 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml FGF-basa jeung 2X antibiotik-antifungal).Stimulasi listrik (10 V, frékuénsi 1.2 Hz) diterapkeun kana bagian jaringan ngaliwatan C-Pace.Pikeun kondisi TD, T3 seger jeung Dex ditambahkeun dina 100 nM jeung 1 μM dina unggal robah sedeng.Médiumna jenuh ku oksigén sateuacan diganti 3 kali sadinten.Bagian jaringan dibudidayakeun dina incubator dina suhu 37 ° C sareng 5% CO2.
Pikeun budaya CTCM, bagian jaringan disimpen dina printer 3D custom-dijieun dina piring Petri ngandung solusi Tyrode dirobah.Alatna dirancang pikeun ningkatkeun ukuran nyiksikan jantung ku 25% tina daérah ring dukungan.Hal ieu dilakukeun supados bagian-bagian jantung henteu manteng saatos ditransfer tina solusi Tyrode kana médium sareng nalika diastole.Ngagunakeun lem histoacrylic, bagian 300 µm kandel dipasang dina ring rojongan 7 mm diaméterna.Saatos ngagantelkeun bagian jaringan kana ring rojongan, potong bagian jaringan kaleuwihan sarta nempatkeun bagian jaringan napel deui kana mandi solusi Tyrode dina és (4 ° C) dugi cukup bagian geus disiapkeun pikeun hiji alat.Total waktu ngolah pikeun sakabéh alat teu kudu ngaleuwihan 2 jam.Saatos 6 bagian jaringan napel cingcin rojongan maranéhanana, alat CTCM ieu dirakit.Kamar budaya CTCM tos dieusi ku 21 ml médium pre-oksigén.Mindahkeun bagian jaringan kana kamar kultur sareng taliti miceun gelembung hawa kalayan pipette.Bagian jaringan lajeng dipandu kana liang sarta gently dipencet kana tempat.Tungtungna, nempatkeun cap éléktroda dina alat jeung mindahkeun alat ka incubator nu.Teras sambungkeun CTCM kana tabung hawa sareng sistem C-PACE-EM.Aktuator pneumatik dibuka sareng klep hawa muka CTCM.Sistem C-PACE-EM dikonpigurasi pikeun nganteurkeun 4 V dina 1,2 Hz salami pacing biphasic salami 2 mdet.Médium dirobih dua kali sadinten sareng éléktroda dirobih sakali sadinten pikeun nyegah akumulasi grafit dina éléktroda.Upami diperlukeun, bagian jaringan bisa dipiceun tina sumur budaya maranéhna pikeun ngaluarkeun sagala gelembung hawa nu mungkin geus fallen handapeun aranjeunna.Pikeun kondisi perlakuan MT, T3 / Dex ditambahkeun seger kalawan unggal robah sedeng kalawan 100 nM T3 jeung 1 μM Dex.Alat CTCM dibudidayakeun dina incubator dina suhu 37 ° C sareng 5% CO2.
Pikeun ménta lintasan manjang tina keureut jantung, sistem kaméra husus dikembangkeun.Kaméra SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Jepang) dipaké ku lénsa makro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Fransisco, CA).Visualisasi dilaksanakeun dina suhu kamar saatos ngagentos medium sareng medium seger.Kaméra diposisikan dina sudut 51° sareng pidéo dirékam dina 30 pigura per detik.Mimiti, parangkat lunak open source (MUSCLEMOTION43) dianggo sareng Image-J pikeun ngitung gerak irisan jantung.Topeng dijieun maké MATLAB (MathWorks, Natick, MA, AS) pikeun nangtukeun wewengkon dipikaresep pikeun ngéléhkeun keureut jantung pikeun nyegah noise.Topeng anu dibagi sacara manual diterapkeun ka sadaya gambar dina urutan pigura teras dialihkeun kana plug-in MUSCLEMOTION.Otot Gerak ngagunakeun inténsitas rata-rata piksel dina unggal pigura pikeun ngitung gerakan na relatif ka pigura rujukan.Data dirékam, disaring sareng dianggo pikeun ngitung waktos siklus sareng meunteun jaringan jaringan salami siklus jantung.Video anu dirékam diolah saatos nganggo saringan digital fase enol urutan kahiji.Pikeun ngitung manteng jaringan (puncak-ka-puncak), analisis puncak-ka-puncak dipigawé pikeun ngabedakeun antara puncak jeung troughs dina sinyal dirékam.Salaku tambahan, detrending dilakukeun nganggo polinomial orde 6 pikeun ngaleungitkeun drift sinyal.Kode program dikembangkeun dina MATLAB pikeun nangtukeun gerak jaringan global, waktos siklus, waktos rélaxasi, sareng waktos kontraksi (Supplementary Program Code 44).
Pikeun analisa galur, nganggo pidéo anu sami anu diciptakeun pikeun penilaian manteng mékanis, urang mimiti ngalacak dua gambar anu ngagambarkeun puncak gerak (titik gerak anu pangluhurna (luhur) sareng panghandapna (handap) dumasar kana parangkat lunak MUSCLEMOTION.Urang teras ngabagi daérah jaringan sareng nerapkeun bentuk algoritma shading kana jaringan anu dibagi (Suplemén Gbr. 2a).Jaringan segmented ieu lajeng dibagi kana sapuluh subsurfaces, sarta stress dina unggal beungeut diitung ngagunakeun persamaan di handap ieu: Galur = (Sup-Sdown) / Sdown, dimana Sup na Sdown mangrupakeun jarak bentukna ti luhur jeung handap bayangan lawon, mungguh (Suplemén Gbr. 2b).
Bagian jantung dilereskeun dina paraformaldehida 4% salami 48 jam.Jaringan tetep didehidrasi dina 10% sareng 20% ​​sukrosa salami 1 jam, teras dina 30% sukrosa sapeuting.Bagian-bagian éta teras diasupkeun dina sanyawa suhu motong optimum (sanyawa OCT) sareng laun-laun beku dina mandi és isopéntana / garing.Nyimpen blok embedding OCT dina -80 °C dugi separation.Slides disiapkeun salaku bagian kalayan ketebalan 8 μm.
Pikeun miceun OCT tina bagian jantung, panas slides dina blok pemanasan dina 95 °C salila 5 mnt.Tambahkeun 1 ml PBS ka unggal slide na incubate pikeun 30 menit dina suhu kamar, lajeng permeate bagian ku netepkeun 0,1% Triton-X dina PBS pikeun 15 menit dina suhu kamar.Pikeun nyegah antibodi non-spésifik ngariung kana sampel, tambahkeun 1 ml larutan BSA 3% kana slides sarta inkubasi salila 1 jam dina suhu kamar.BSA lajeng dihapus sarta slides dikumbah ku PBS.Cirian unggal sampel ku pensil.Antibodi primér (diluted 1: 200 dina 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) jeung troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ditambahkeun leuwih 90 menit, lajeng antibodi sekundér 1 (2000) Fluid 1 (Alexa 8 atanapi B8) Thermo Scientific; #A16079), ngalawan kelenci Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; # T6391) pikeun tambahan 90 menit Dikumbah 3 kali kalawan PBS Pikeun ngabedakeun target staining ti tukang, urang dipaké ukur antibodi sekundér salaku kontrol a. Tungtungna, DAPI noda nuklir ieu ditambahkeun jeung sliding na stéroid ditempatkeun dina sliding na sector. magnification) jeung mikroskop Keyence kalawan magnification 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) dina 5 μg / ml dina PBS ieu dipaké pikeun WGA staining sarta dilarapkeun ka bagian dibereskeun pikeun 30 menit dina suhu kamar.The slides anu lajeng dikumbah ku PBS sarta Sudan hideung ieu ditambahkeun kana unggal slide na incubated salila 30 menit.The slides lajeng dikumbah ku PBS na vectashield embedding sedeng ieu ditambahkeun.Slides divisualisasikeun dina mikroskop Keyence dina pembesaran 40x.
OCT dikaluarkeun tina conto sapertos anu dijelaskeun di luhur.Saatos nyoplokkeun Oct, neuleumkeun slides dina solusi Bouin urang sapeuting.Slides lajeng dikumbah ku cai sulingan salila 1 jam lajeng disimpen dina larutan asam fuchsin Bibrich lidah buaya salila 10 menit.Lajeng slides dikumbah ku cai sulingan jeung disimpen dina leyuran 5% phosphomolybdenum / 5% asam phosphotungstic salila 10 menit.Tanpa rinsing, mindahkeun slides langsung kana solusi biru aniline salila 15 menit.Teras slides dikumbah ku cai sulingan sareng disimpen dina larutan asam asétat 1% salami 2 menit.Slides dikeringkeun dina étanol 200 N sarta dipindahkeun kana xylene.Slides patri anu visualized maké mikroskop Keyence kalawan obyektif 10x.Persentase aréa fibrosis diukur nganggo parangkat lunak Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), nomer katalog V13154, numutkeun protokol produsén sareng sababaraha modifikasi.Khususna, punch bedah kalayan diaméter 6 mm dianggo pikeun mastikeun ukuran jaringan seragam nalika analisa MTT.Tissue anu individual plated kana sumur tina 12-sumur plat ngandung substrat MTT nurutkeun protokol produsén urang.Bagianna diinkubasi dina suhu 37 ° C salami 3 jam sareng jaringan hirup ngametabolisme substrat MTT pikeun ngabentuk sanyawa formazan ungu.Ganti solusi MTT sareng 1 ml DMSO sareng inkubasi dina suhu 37 °C salami 15 menit pikeun nimba formazan ungu tina bagian jantung.Sampel éncér 1:10 dina DMSO dina pelat handap 96-sumur sareng inténsitas warna ungu diukur dina 570 nm nganggo pamaca plat Cytation (BioTek).Bacaan dinormalisasi kana beurat unggal nyiksikan jantung.
Média nyiksikan haté diganti ku média ngandung 1 μCi / ml [5-3H] -glukosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, AS) pikeun assay utilization glukosa sakumaha ditétélakeun saméméhna.Saatos 4 jam inkubasi, tambahkeun 100 µl medium kana tabung microcentrifuge kabuka anu ngandung 100 µl HCl 0,2 N.Lajeng tabung disimpen dina tabung scintillation ngandung 500 μl dH2O pikeun nguap [3H] 2O salila 72 jam dina 37 ° C.Teras cabut tabung microcentrifuge tina tabung scintillation sareng tambahkeun 10 ml cairan scintillation.Jumlah scintillation dipigawé maké Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, AS).Pemanfaatan glukosa teras diitung dumasar kana kagiatan spésifik [5-3H]-glukosa, kasatimbangan teu lengkep sareng latar tukang, éncér glukosa [5-3H]-kana anu teu dilabélan, sareng efisiensi counter scintillation.Data dinormalisasi kana massa bagian jantung.
Saatos homogenisasi jaringan dina Trizol, RNA diisolasi tina bagian jantung nganggo Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 numutkeun protokol produsén.Persiapan perpustakaan RNAsec, sequencing sareng analisis data dilaksanakeun sapertos kieu:
1 μg RNA per sampel dipaké salaku bahan awal pikeun persiapan perpustakaan RNA.Sequencing perpustakaan dihasilkeun maké NEBNext Ultra TM RNA Perpustakaan Persiapan Kit pikeun Illumina (NEB, AS) nuturkeun saran produsén urang, sarta Konci indéks ditambahkeun kana urutan atribut pikeun tiap sampel.Sakeudeung, mRNA dimurnikeun tina total RNA ngagunakeun manik-manik magnét napel jeung poly-T oligonucleotides.Fragméntasi dilaksanakeun ngagunakeun kation divalén dina suhu luhur dina NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).CDNA untaian munggaran disintésis ngagunakeun primer hexamer acak sareng M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-).Untaian cDNA kadua teras disintésis nganggo DNA polimérase I sareng RNase H. Sésana overhangs dirobih kana tungtung tumpul ku kagiatan exonuclease/polimérase.Saatos adenilasi tina tungtung 3' tina sempalan DNA, Adaptor NEBNext sareng struktur loop jepit rambut dipasang dina éta pikeun nyiapkeun hibridisasi.Pikeun pilihan fragmen cDNA tina panjangna pikaresep 150-200 bp.fragmen perpustakaan dimurnikeun ngagunakeun sistem AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, AS).Saterusna, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) kalawan cDNA ukuran-dipilih ligated kalawan adaptor dipaké pikeun 15 menit dina 37 ° C lajeng pikeun 5 menit dina 95 ° C saméméh PCR.PCR lajeng dipigawé maké Phusion High-Fidelity DNA polymerase, primers PCR universal, jeung Primer Index (X).Tungtungna, produk PCR dimurnikeun (sistem AMPure XP) sareng kualitas perpustakaan ditaksir dina sistem Agilent Bioanalyzer 2100.Perpustakaan cDNA teras diurutkeun nganggo sequencer Novaseq.File gambar atah ti Illumina dirobih janten bacaan atah nganggo Calling Base CASAVA.Data atah disimpen dina file format FASTQ(fq) anu ngandung urutan baca sareng kualitas dasar anu saluyu.Pilih HISAT2 pikeun nyocogkeun sequencing disaring maca kana génom rujukan Sscrofa11.1.Sacara umum, HISAT2 ngadukung génom tina ukuran naon waé, kalebet génom anu langkung ageung ti 4 milyar basa, sareng nilai standar diatur pikeun kalolobaan parameter.Splicing maca tina data RNA Seq tiasa épisién dijajarkeun nganggo HISAT2, sistem panggancangna anu sayogi ayeuna, kalayan akurasi anu sami atanapi langkung saé tibatan metode anu sanés.
Kelimpahan transkrip langsung ngagambarkeun tingkat ekspresi gen.Tingkat ekspresi gen ditaksir ku seueurna transkrip (sequencing count) pakait sareng génom atanapi exon.Jumlah bacaan sabanding jeung tingkat éksprési gén, panjang gén, sarta jero runtuyan.FPKM (fragmen per sarébu pasangan basa transkrip diurutkeun per juta pasangan basa) diitung sarta P-nilai ekspresi diferensial ditangtukeun ngagunakeun pakét DESeq2.Urang lajeng diitung laju kapanggihna palsu (FDR) pikeun tiap nilai P ngagunakeun method9 Benjamini-Hochberg dumasar kana diwangun-di R-fungsi "p.adjust".
RNA diisolasi tina bagian jantung dirobah jadi cDNA dina konsentrasi 200 ng / μl ngagunakeun SuperScript IV Vilo Master campuran ti Thermo (Thermo, ucing. No. 11756050).Kuantitatif RT-PCR ieu dipigawé maké Applied Biosystems Endura Lempeng Microamp 384-sumur plat réaksi transparan (Thermo, ucing. No. 4483319) jeung napel optik microamp (Thermo, ucing. No. 4311971).Campuran réaksi diwangun ku 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer sareng 3,5 µl H2O dicampur per sumur.Siklus qPCR standar dijalankeun sareng nilai CT diukur nganggo Applied Biosystems Quantstudio 5 instrumen PCR real-time (modul 384-sumur; produk # A28135).Primer Taqman dipésér tina Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06908795_m1) ), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) COL1A2 (Ss04245588_m1) tina gén sampel dinormalisasi.
Pelepasan média NT-ProBNP ditaksir nganggo kit NT-ProBNP (babi) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) nurutkeun protokol produsén.Sakeudeung, 250 µl unggal sampel sarta standar ditambahkeun dina duplikat ka unggal sumur.Langsung saatos nambihan sampel, tambahkeun 50 µl Assay Reagent A ka unggal sumur.Gently ngocok piring jeung segel kalawan sealant.Saterusna tablet diinkubasi dina 37 ° C salila 1 jam.Teras aspirasi larutan sareng cuci sumur 4 kali nganggo 350 µl larutan cuci 1X, inkubasi larutan cuci salami 1-2 menit unggal waktos.Teras tambahkeun 100 µl Assay Reagent B per sumur sareng segel ku piring sealant.Tablet dikocok lembut sareng diinkubasi dina suhu 37 ° C salami 30 menit.Aspirasi larutan sareng cuci sumur 5 kali nganggo 350 µl larutan cuci 1X.Tambahkeun 90 µl larutan substrat ka unggal sumur jeung nutup piring.Inkubasi piring dina 37 ° C pikeun 10-20 menit.Tambahkeun 50 µl Stop Solution ka unggal sumur.Pelatna langsung diukur nganggo pamaca piring Cytation (BioTek) anu dipasang dina 450 nm.
Analisis kakuatan dilakukeun pikeun milih ukuran grup anu bakal nyayogikeun> 80% kakuatan pikeun ngadeteksi parobahan mutlak 10% dina parameter kalayan tingkat kasalahan Tipe I 5%. Analisis kakuatan dilakukeun pikeun milih ukuran grup anu bakal nyayogikeun> 80% kakuatan pikeun ngadeteksi parobahan mutlak 10% dina parameter kalayan tingkat kasalahan Tipe I 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% раметра с 5% частотой ошибок типа I. Analisis kakuatan dilakukeun pikeun milih ukuran grup anu bakal nyayogikeun> 80% kakuatan pikeun ngadeteksi 10% parobahan parameter mutlak sareng tingkat kasalahan Tipe I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I寎田用。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I寎田用。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнарузлежнибня я параметров и 5% частоты ошибок типа I. Analisis kakuatan dilakukeun pikeun milih ukuran grup anu bakal nyayogikeun> 80% kakuatan pikeun ngadeteksi 10% parobahan parameter mutlak sareng 5% tingkat kasalahan tipe I.Bagian jaringan dipilih sacara acak sateuacan ékspérimén.Kabéh analisa éta kaayaan buta sarta sampel anu decoded ngan sanggeus kabeh data geus dianalisis.Parangkat lunak GraphPad Prism (San Diego, CA) dianggo pikeun ngalakukeun sadaya analisa statistik. Pikeun sakabéh statistik, p-nilai dianggap signifikan dina nilai <0.05. Pikeun sakabéh statistik, p-nilai dianggap signifikan dina nilai <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pikeun sakabéh statistik, p-nilai dianggap signifikan dina nilai <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pikeun sakabéh statistik, p-nilai dianggap signifikan dina nilai <0.05.Uji-t Dua-buntut Siswa dilaksanakeun kana data kalayan ngan 2 babandingan.Hiji-arah atawa dua arah ANOVA ieu dipaké pikeun nangtukeun significance antara sababaraha grup.Nalika ngalakukeun tés post hoc, koreksi Tukey diterapkeun kana akun sababaraha babandingan.Data RNAsec gaduh pertimbangan statistik khusus nalika ngitung FDR sareng p.adjust sakumaha anu dijelaskeun dina bagian Métode.
Kanggo inpo nu langkung lengkep ihwal desain ulikan, tingali abstrak Laporan Panalungtikan Alam numbu ka artikel ieu.