Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat stöd för CSS. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller stänger av kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt stöd, kommer vi att visa webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Mänsklig tarmmorfogenes etablerar krypt-villus-funktioner i 3D-epitelial mikroarkitektur och rumslig organisation. Denna unika struktur krävs för att upprätthålla tarmhomeostas genom att skydda stamcellsnischen i basalkryptan från exogena mikrobiella antigener och deras metaboliter. Dessutom presenterar tarmtotter och utsöndrande slem funktionellt differentierade epitelceller med en skyddande barriär på tarmslemhinnans yta. Därför är det avgörande att återskapa 3D-epitelstrukturer för konstruktionen av in vitro-tarmmodeller. Det är värt att notera att den organiska mimetiska tarmen-på-ett-chip kan inducera spontan 3D-morfogenes av tarmepitelet med förbättrade fysiologiska funktioner och biomekanik. Här tillhandahåller vi ett reproducerbart protokoll för att robust inducera tarmmorfogenes i tarmen på ett mikrofluidiskt chip såväl som i ett Transwell-inbäddat hybridchip. Vi beskriver detaljerade metoder för tillverkning av enheter, odling av Caco-2 eller intestinala organoida epitelceller i konventionella miljöer såväl som på en mikrofluidisk plattform, induktion av 3D-morfogenes och karakterisering. av etablerade 3D-epitel med hjälp av flera avbildningsmodaliteter. Detta protokoll uppnår regenerering av funktionell tarmmikroarkitektur genom att kontrollera basolateralt vätskeflöde i 5 dagar. Vår in vitro-morfogenesmetod använder fysiologiskt relevant skjuvspänning och mekanisk rörelse och kräver inte komplex cellteknik eller manipulation, vilket kan överträffa andra befintliga tekniker. Vi föreställer oss att vårt föreslagna protokoll kan få breda konsekvenser för det biomedicinska forskningssamhället och tillhandahålla en metod för att regenerera 3D-tarmepiteletlager in vitro för biomedicinska, kliniska och farmaceutiska tillämpningar.
Experiment visar att intestinala epiteliala Caco-2-celler odlade i gut-on-a-chip1,2,3,4,5 eller tvåskiktade mikrofluidiska anordningar6,7 kan genomgå spontan 3D-morfogenes in vitro utan en tydlig förståelse av den underliggande mekanismen. I vår senaste studie fann vi att avlägsnande av basolateralt utsöndrade morfogenantagonister från odlingsanordningar är nödvändigt och tillräckligt för att inducera 3D-epitelial morfogenes in vitro, vilket har demonstrerats av Caco-2 och patient-deriverade intestinala organoider. Epitelceller validerades. I denna studie fokuserade vi specifikt på cellproduktionen och koncentrationsfördelningen av en potent Wnt-antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), i gut-on-a-chip och modifierade mikrofluidiska enheter innehållande Transwell-insatser, kallade "Hybrid Chip". Vi visar att tillsats av exogena Wnt-antagonister (såsom DKK-1, Wnt-repressor 1, utsöndrat frizzled-related protein 1 eller Soggy-1) till den on-chip-baserade tarmen hämmar morfogenes eller stör det förstrukturerade 3D-epitelskiktet, vilket tyder på att antagonistisk stress under odling är ansvarig för intestinal morfogenes in vitro. Därför är en praktisk metod för att uppnå robust morfogenes vid epitelgränssnittet att avlägsna eller minimalt bibehålla nivåerna av Wnt-antagonister i det basolaterala utrymmet genom aktiv spolning (t.ex. i gut-on-a-chip eller hybrid-on-a-chip-plattformar) eller diffusion. Basolaterala medier (t.ex. från Transwell-insatser till stora basolaterala reservoarer i brunnar).
I detta protokoll tillhandahåller vi en detaljerad metod för att tillverka gut-on-a-chip-mikroenheter och Transwell-insättningsbara hybridchips (steg 1-5) för att odla tarmepitelceller på polydimetylsiloxan (PDMS)-baserade porösa membran (steg 6A, 7A, 8, 9) eller polyestermembran av Transwell-insatser (steg 6B, 7B, 8, 9) och inducera 3D-morfogenes in vitro (steg 10). Vi identifierade också cellulära och molekylära egenskaper som indikerar vävnadsspecifik histogenes och härstamningsberoende celldifferentiering genom att tillämpa flera avbildningsmodaliteter (steg 11-24). Vi inducerar morfogenes med hjälp av humana tarmepitelceller, såsom Caco-2 eller tarmorganoider, i två odlingsformat med tekniska detaljer inklusive ytmodifiering av porösa membran, skapande av 2D-monolager och intestinal biokemisk och reproduktion av den biomekaniska mikromiljön in vitro. För att inducera 3D-morfogenes från 2D-epitelmonolager avlägsnade vi morfogen. antagonister i båda odlade formerna genom att mediet flödar in i kulturens basolaterala kompartment. Slutligen ger vi en representation av nyttan av ett regenererbart 3D-epitellager som kan användas för att modellera morfogenberoende epiteltillväxt, longitudinella värd-mikrobiom-samkulturer, patogeninfektion, inflammatorisk skada, epitelbarriärdysfunktion och probiotikabaserade terapier Exempel.påverkan.
Vårt protokoll kan vara användbart för ett brett spektrum av forskare inom grundläggande (t.ex. tarmslemhinnebiologi, stamcellsbiologi och utvecklingsbiologi) och tillämpad forskning (t.ex. preklinisk läkemedelstestning, sjukdomsmodellering, vävnadsteknik och gastroenterologi) med bred genomslagskraft. På grund av reproducerbarheten och robustheten hos vårt protokoll för att inducera 3D-morfogenes av tarmepitelet in vitro, ser vi att vår tekniska strategi kan spridas till publik som studerar dynamiken i cellsignalering under tarmutveckling, regenerering eller homeostas. Dessutom är vårt protokoll användbart för att undersöka infektion under olika infektiösa agenser såsom norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 eller Vibrio cholerae. Målgrupper för sjukdomspatologi och patogenes är också användbara. Användningen av ett on-chip tarmmikrofysiologisystem kan möjliggöra longitudinell samodling 10 och efterföljande bedömning av värdens försvar, immunsvar och patogenrelaterad skadereparation i mag-tarmkanalen (GI) 11. Andra GI-sjukdomar associerade med läckande tarmsyndrom, celiaki, Crohns sjukdom, ulcerös kolit, pouchit eller irritabel tarm kan simuleras när 3D-tarmepiteletlager framställs med hjälp av patientens 3D-tarmepiteletlager. Dessa sjukdomar inkluderar villös atrofi, kryptförkortning, slemhinneskada eller nedsatt epitelbarriär. Biopsi eller stamcells-deriverade tarmorganoider 12,13. För att bättre modellera den högre komplexiteten i sjukdomsmiljön kan läsarna överväga att lägga till sjukdomsrelevanta celltyper, såsom patientens perifera blodmononukleära celler (PBMC), till modeller som innehåller 3D-tarmvillus-kryptmikroarkitekturer. vävnadsspecifika immunceller, 5.
Eftersom 3D-epitelial mikrostruktur kan fixeras och visualiseras utan sektioneringsprocessen, kan tittare som arbetar med spatial transkriptomik och högupplöst eller superupplöst avbildning vara intresserade av vår kartläggning av den spatiotemporala dynamiken hos gener och proteiner på epiteliala nischer. Intresserad av teknologi. Svar på mikrobiella eller immuna stimuli. Dessutom kan longitudinell värd-mikrobiom-överhörning 10, 14 som koordinerar tarmhomeostas etableras i det 3D-tarmslemhinnans lager genom att samodla olika mikrobiella arter, mikrobiella samhällen eller fekal mikrobiota, särskilt i gut-on-a-chip. i plattformen. Denna metod är särskilt attraktiv för publik som studerar mukosal immunologi, gastroenterologi, humant mikrobiom, kulturomik och klinisk mikrobiologi som vill odla tidigare oodlad tarmmikrobiota i laboratoriet. Om vårt in vitro-morfogenesprotokoll kan anpassas till skalbara odlingsformat, såsom flerbrunnsinsatser i 24-, 96- eller 384-brunnsplattor som kontinuerligt fyller på basolaterala kompartment, kan protokollet också spridas till de som utvecklar farmaceutiska, biomedicinska eller högkapacitetsscreenings- eller valideringsplattformar för livsmedelsindustrin. Som ett proof-of-principle demonstrerade vi nyligen genomförbarheten av ett multiplex högkapacitetsmorfogenessystem som är skalbart till ett 24-brunnsplattformat. Dessutom har flera organ-på-ett-chip-produkter kommersialiserats16,17,18. Därför kan valideringen av vår in vitro-morfogenesmetod accelereras och potentiellt antas av många forskningslaboratorier, industri eller myndigheter och tillsynsmyndigheter för att förstå cellulär omprogrammering av in vitro-tarmmorfogenes på transkriptomisk nivå för att testa läkemedel eller bioterapeutika. Absorptionen och Transport av läkemedelskandidater utvärderades med hjälp av 3D-tarmsurrogat eller med hjälp av anpassade eller kommersiella organ-på-ett-chip-modeller för att bedöma reproducerbarheten av tarmmorfogenesprocessen.
Ett begränsat antal experimentella modeller som är relevanta för människor har använts för att studera tarmepitelets morfogenes, främst på grund av bristen på implementerbara protokoll för att inducera 3D-morfogenes in vitro. Faktum är att mycket av den nuvarande kunskapen om tarmmorfogenes är baserad på djurstudier (t.ex. zebrafiskar20, möss21 eller kycklingar22). De är dock arbets- och kostnadsintensiva, kan vara etiskt tveksamma och, viktigast av allt, bestämmer inte exakt mänskliga utvecklingsprocesser. Dessa modeller är också mycket begränsade i sin förmåga att testas på ett skalbart sätt i flera vägar. Därför överträffar vårt protokoll för att regenerera 3D-vävnadsstrukturer in vitro in vivo-djurmodeller såväl som andra traditionella statiska 2D-cellodlingsmodeller. Som tidigare beskrivits tillät användningen av 3D-epitelstrukturer oss att undersöka den rumsliga lokaliseringen av differentierade celler i krypt-villusaxeln som svar på olika slemhinne- eller immunstimuli. 3D-epitellager kan ge ett utrymme för att studera hur mikrobiella celler konkurrerar om att bilda rumsliga nischer och ekologisk utveckling som svar på värdfaktorer (t.ex. inre kontra yttre slemlager, utsöndring av IgA och antimikrobiella peptider). Dessutom kan 3D-epitelmorfologi ge oss möjlighet att förstå hur tarmfloran strukturerar sina samhällen och synergistiskt producerar mikrobiella metaboliter (t.ex. kortkedjiga fettsyror) som formar cellorganisation och stamcellsnischer i basalkrypterna. Dessa egenskaper kan endast påvisas när 3D-epitellager etableras in vitro.
Utöver vår metod för att skapa 3D-intestinala epitelstrukturer finns det flera in vitro-metoder. Intestinal organoidkultur är en toppmodern vävnadsteknik baserad på odling av intestinala stamceller under specifika morfogenförhållanden23,24,25. Användningen av 3D-organoidmodeller för transportanalys eller samkulturer mellan värd och mikrobiom är dock ofta utmanande eftersom tarmlumen är innesluten i organoiden och därför är införandet av luminala komponenter såsom mikrobiella celler eller exogena antigener begränsat. Tillgången till organoidlumen kan förbättras med hjälp av en mikroinjektor,26,27 men denna metod är invasiv och arbetsintensiv och kräver specialiserad kunskap för att utföras. Dessutom återspeglar traditionella organoidkulturer som upprätthålls i hydrogelställningar under statiska förhållanden inte korrekt aktiv in vivo-biomekanik.
Andra metoder som används av flera forskargrupper använder förstrukturerade 3D-hydrogelställningar för att efterlikna tarmens epitelstruktur genom att odla isolerade mänskliga tarmceller på gelytan. Tillverka hydrogelställningar med hjälp av 3D-printade, mikrofrästa eller litografiskt tillverkade formar. Denna metod visar det självorganiserade arrangemanget av isolerade epitelceller in vitro med fysiologiskt relevanta morfogengradienter, vilket etablerar en epitelstruktur med högt aspektförhållande och stroma-epitelial överhörning genom att inkludera stromala celler i ställningen. Emellertid kan naturen hos förstrukturerade ställningar förhindra uppvisningen av själva den spontana morfogenetiska processen. Dessa modeller ger inte heller dynamiskt luminalt eller interstitiellt flöde, och saknar den vätskeskjuvspänning som tarmceller behöver för att genomgå morfogenes och få fysiologisk funktion. En annan nyligen genomförd studie använde hydrogelställningar i en mikrofluidisk plattform och mönstrade tarmepitelstrukturer med hjälp av laseretsningstekniker. Mus-tarmorganoider följer etsade mönster för att bilda tubulära tarmstrukturer, och intraluminalt vätskeflöde kan rekapituleras med hjälp av en mikrofluidikmodul. Denna modell uppvisar dock varken spontana morfogenetiska processer eller inkluderar tarmmekanobiologiska rörelser. 3D-utskriftstekniker från samma grupp kunde skapa miniatyrtarmrör med spontana morfogenetiska processer. Trots den komplexa tillverkningen av olika tarmsegment i röret saknar denna modell också luminalt vätskeflöde och mekanisk deformation. Dessutom kan modellens funktionsduglighet vara begränsad, särskilt efter att bioprintingprocessen är klar, vilket stör experimentella förhållanden eller cell-till-cell-interaktioner. Istället tillhandahåller vårt föreslagna protokoll spontan tarmmorfogenes, fysiologiskt relevant skjuvspänning, biomekanik som efterliknar tarmmotilitet, tillgänglighet till oberoende apikala och basolaterala fack och återskapande av komplexa biologiska mikromiljöer med modularitet. Därför kan vårt in vitro 3D-morfogenesprotokoll ge en kompletterande metod för att övervinna utmaningarna med befintliga metoder.
Vårt protokoll är helt fokuserat på 3D-epitelial morfogenes, med endast epitelceller i kultur och inga andra typer av omgivande celler såsom mesenkymala celler, endotelceller och immunceller. Som tidigare beskrivits är kärnan i vårt protokoll induktionen av epitelial morfogenes genom att avlägsna morfogeninhibitorer som utsöndras på den basolaterala sidan av det introducerade mediet. Medan den robusta modulariteten hos vår gut-on-a-chip och hybrid-on-a-chip tillåter oss att återskapa det böljande 3D-epitelskiktet, återstår ytterligare biologiska komplexiteter såsom epitelial-mesenkymala interaktioner33,34, extracellulär matrix (ECM) deponering35 och, i vår modell, krypt-villusfunktioner som förmedlar stamcellsnischer i basala krypter att beaktas ytterligare. Stromala celler (t.ex. fibroblaster) i mesenkymet spelar en nyckelroll i produktionen av ECM-proteiner och reglering av intestinal morfogenes in vivo35,37,38. Tillsatsen av mesenkymala celler Till vår modell förbättrades den morfogenetiska processen och cellvidhäftningseffektiviteten. Endotelskiktet (dvs. kapillärer eller lymfkärl) spelar en viktig roll i regleringen av molekylär transport39 och immuncellsrekrytering40 i tarmmikromiljön. Dessutom är kärlkomponenter som kan kopplas mellan vävnadsmodeller en förutsättning när vävnadsmodeller utformas för att demonstrera interaktioner mellan flera organ. Därför kan endotelceller behöva inkluderas för att modellera mer exakta fysiologiska egenskaper med upplösning på organnivå. Patient-deriverade immunceller är också viktiga för att visa medfödda immunsvar, antigenpresentation, medfödd adaptiv immunöverhörning och vävnadsspecifik immunitet i samband med att härma tarmsjukdomar.
Användningen av hybridchips är enklare än tarm-på-chip eftersom enhetens installation är enklare och användningen av Transwell-insatser möjliggör skalbar odling av tarmepitelet. Kommersiellt tillgängliga Transwell-insatser med polyestermembran är dock inte elastiska och kan inte simulera peristaltiska rörelser. Dessutom förblev den apikala delen av Transwell-insatsen placerad i hybridchipet stationär utan skjuvspänning på den apikala sidan. Det är tydligt att de statiska egenskaperna i den apikala delen sällan möjliggör långvarig bakteriell samodling i hybridchips. Även om vi robust kan inducera 3D-morfogenes i Transwell-insatser när vi använder hybridchips, kan bristen på fysiologiskt relevant biomekanik och apikalt vätskeflöde begränsa genomförbarheten av hybridchipplattformar för potentiella tillämpningar.
Fullskaliga rekonstruktioner av den mänskliga krypt-villusaxeln i gut-on-a-chip- och hybrid-on-a-chip-kulturer har inte fastställts helt. Eftersom morfogenes börjar från ett epitelialt monolager, ger 3D-mikroarkitekturer inte nödvändigtvis morfologisk likhet med krypter in vivo. Även om vi karakteriserade den prolifererande cellpopulationen nära den basala kryptdomänen i det mikroenginerade 3D-epitelet, var krypt- och villiregionerna inte tydligt avgränsade. Även om högre övre kanaler på chipet leder till ökad höjd på det mikroenginerade epitelet, är den maximala höjden fortfarande begränsad till ~300–400 µm. Det faktiska djupet av mänskliga tarmkrypter i tunntarmen och tjocktarmen är ~135 µm respektive ~400 µm, och höjden på tunntarmsvilli är ~600 µm41.
Ur ett avbildningsperspektiv kan in situ-avbildning med superupplösning av 3D-mikroarkitekturer vara begränsad till tarmen på ett chip, eftersom det erforderliga arbetsavståndet från objektivlinsen till epitelskiktet är i storleksordningen några millimeter. För att övervinna detta problem kan ett avlägset objektiv krävas. Dessutom är det utmanande att tillverka tunna sektioner för avbildningsproverberedning på grund av PDMS höga elasticitet. Eftersom lager-för-lager-mikrofabrikation av tarmen på ett chip innebär permanent vidhäftning mellan varje lager, är det extremt utmanande att öppna eller ta bort det övre lagret för att undersöka ytstrukturen på epitelskiktet. Till exempel genom att använda ett svepelektronmikroskop (SEM).
Hydrofobiciteten hos PDMS har varit en begränsande faktor i mikrofluidikbaserade studier som behandlar hydrofoba små molekyler, eftersom PDMS kan adsorbera sådana hydrofoba molekyler ospecifikt. Alternativ till PDMS kan övervägas med andra polymera material. Alternativt kan ytmodifiering av PDMS (t.ex. beläggning med lipofila material 42 eller poly(etylenglykol) 43) övervägas för att minimera adsorptionen av hydrofoba molekyler.
Slutligen har vår metod inte karaktäriserats väl när det gäller att tillhandahålla en högkapacitetsscreening eller en användarvänlig experimentell plattform som passar alla. Det nuvarande protokollet kräver en sprutpump per mikroenhet, vilket tar upp plats i en CO2-inkubator och förhindrar storskaliga experiment. Denna begränsning kan förbättras avsevärt genom skalbarheten hos innovativa odlingsformat (t.ex. porösa insatser med 24 brunnar, 96 brunnar eller 384 brunnar som möjliggör kontinuerlig påfyllning och borttagning av basolaterala medier).
För att inducera 3D-morfogenes av mänskligt tarmepitel in vitro, använde vi en mikrofluidisk chip-intestinalanordning innehållande två parallella mikrokanaler och ett elastiskt poröst membran däremellan för att skapa ett lumen-kapillärt gränssnitt. Vi demonstrerar också användningen av en enkanalig mikrofluidisk anordning (ett hybridchip) som ger kontinuerligt basolateralt flöde under polariserade epitellager odlade på Transwell-insatser. I båda plattformarna kan morfogenes av olika mänskliga tarmepitelceller demonstreras genom att tillämpa riktad manipulation av flödet för att avlägsna morfogenantagonister från det basolaterala utrymmet. Hela den experimentella proceduren (Figur 1) består av fem delar: (i) mikrotillverkning av tarmchipet eller Transwell-insättningsbara hybridchip (steg 1-5; Ruta 1), (ii) beredning av tarmepitelceller (Caco-2-celler) eller mänskliga tarmorganoider; rutor 2-5), (iii) odling av tarmepitelceller på tarmchips eller hybridchips (steg 6-9), (iv) induktion av 3D-morfogenes in vitro (steg 10) och (v)) för att karakterisera den 3D-epiteliala mikrostrukturen (steg 11-24). Slutligen utformades en lämplig kontrollgrupp (diskuteras vidare nedan) för att validera effektiviteten av in vitro-morfogenes genom att jämföra epitelial morfogenes med rumsliga, temporala, villkorliga eller procedurmässiga kontroller.
Vi använde två olika odlingsplattformar: tarm-på-ett-chip med raka kanaler eller icke-linjära, konvoluterade kanaler, eller hybridchips innehållande Transwell (TW)-insatser i en mikrofluidisk anordning, tillverkad enligt beskrivningen i ruta 1, och steg 1-5. ”Anordningstillverkning” visar huvudstegen för att tillverka ett enda chip eller ett hybridchip. ”Odling av mänskliga tarmepitelceller” förklarar cellkällan (Caco-2 eller mänskliga tarmorganoider) och odlingsproceduren som används i detta protokoll. ”In vitro-morfogenes” visar de övergripande stegen där Caco-2 eller organoid-deriverade epitelceller odlas på ett tarmchip eller på Transwell-insatser i ett hybridchip, följt av induktion av 3D-morfogenes och bildandet av en karakteriserad epitelstruktur. Programstegsnumret eller rutanumret visas under varje pil. Applikationen ger exempel på hur etablerade tarmepitellager kan användas, till exempel vid celldifferentieringskarakterisering, tarmfysiologiska studier, etablering av värd-mikrobiomekosystem och sjukdomsmodellering. Immunofluorescens Bilder i "Cell Differentiation" som visar cellkärnor, F-aktin och MUC2 uttryckta i det 3D Caco-2 epitelskiktet som genereras på tarmchipet. MUC2-signalering finns i bägarceller och slem som utsöndras från slemhinnorytor. Fluorescerande bilder i Gut Physiology visar slem som produceras genom färgning för sialinsyra och N-acetylglukosaminrester med fluorescerande vetegroddsagglutinin. De två överlappande bilderna i "Host-Microbe Co-Cultures" visar representativa värd-mikrobiom-samkulturer i tarmen på ett chip. Den vänstra panelen visar samkulturen av E. coli som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) med mikrokonstruerade 3D Caco-2 epitelceller. Den högra panelen visar lokaliseringen av GFP E. coli samodlad med 3D Caco-2 epitelceller, följt av immunofluorescensfärgning med F-aktin (rött) och cellkärnor (blått). Sjukdomsmodellering illustrerar frisk kontra läckande tarm i tarminflammationschips under fysiologisk utmaning med bakteriella antigener (t.ex. lipopolysackarid, LPS) och immunceller (t.ex. PBMC; grön). Caco-2-celler odlades för att etablera ett 3D-epitellager. Skalstreck, 50 µm. Bilder i nedre raden: "Differentiering av celler" anpassad med tillstånd från referens.2. Oxford University Press; Återgiven med tillstånd från Ref.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" anpassad med tillstånd från ref.3. NAS; "Disease Modeling" anpassad med tillstånd från referens.5. NAS.
Både tarm-på-chip och hybridchip tillverkades med hjälp av PDMS-replikor som avformades från kiselformar med mjuklitografi1,44 och mönstrades med SU-8. Utformningen av mikrokanalerna i varje chip bestäms genom att beakta hydrodynamik såsom skjuvspänning och hydrodynamiskt tryck1,4,12. Den ursprungliga tarm-på-chip-designen (Extended Data Fig. 1a), som bestod av två intill varandra placerade parallella raka mikrokanaler, har utvecklats till en komplex tarm-på-chip (Extended Data Fig. 1b) som inkluderar ett par böjda mikrokanaler för att inducera ökad vätskeuppehållstid, icke-linjära flödesmönster och multiaxiell deformation av odlade celler (Fig. 2a–f)12. När mer komplex tarmbiomekanik behöver återskapas kan komplex tarm-på-chip väljas. Vi har visat att det komplicerade tarmchipet också starkt inducerar 3D-morfogenes inom en liknande tidsram med en liknande grad av epiteltillväxt jämfört med originalet. Gut-Chip, oavsett odlad celltyp. För att inducera 3D-morfogenes är därför linjära och komplexa tarmdesigner på chip utbytbara. PDMS-replikor härdade på kiselformar med SU-8-mönster gav negativa egenskaper efter urgjutning (Fig. 2a). För att tillverka tarmen på ett chip bands det förberedda övre PDMS-skiktet sekventiellt till en porös PDMS-film och justerades sedan med det nedre PDMS-skiktet genom irreversibel bindning med hjälp av en koronabehandlingsanordning (Fig. 2b–f). För att tillverka hybridchips bands härdade PDMS-replikor till glasskivor för att skapa enkanaliga mikrofluidiska enheter som kunde rymma Transwell-insatser (Fig. 2h och utökade data Fig. 2). Bindningsprocessen utförs genom att behandla ytorna på PDMS-replikan och glaset med syreplasma eller koronabehandling. Efter sterilisering av den mikrofabricerade enheten fäst vid silikonröret var enheten redo att utföra 3D-morfogenes av tarmepitelet (Figur 2g).
a, Schematisk illustration av framställningen av PDMS-delar från SU-8-mönstrade kiselformar. Den ohärdade PDMS-lösningen hälldes på en kiselform (vänster), härdades vid 60 °C (mitten) och urformades (höger). Den urformade PDMS skars i bitar och rengjordes för vidare användning. b, Fotografi av kiselformen som användes för att framställa PDMS övre lager. c, Fotografi av kiselformen som användes för att tillverka PDMS porösa membran. d, En serie fotografier av de övre och nedre PDMS-komponenterna och den monterade on-chip-tarmanordningen. e, Schematisk bild av inriktningen av de övre, membran- och nedre PDMS-komponenterna. Varje lager är irreversibelt bundet genom plasma- eller koronabehandling. f, Schematisk bild av den tillverkade tarm-på-ett-chip-anordningen med överlagrade veckade mikrokanaler och vakuumkammare. g, Uppställning av tarm-på-ett-chip för mikrofluidisk cellodling. Den tillverkade tarmen på ett chip monterad med ett silikonrör och en spruta placerades på ett täckglas. Chipanordningen placerades på Locket på en 150 mm petriskål för bearbetning. Bindemedlet används för att försluta silikonröret.h, Visuella ögonblicksbilder av hybridchiptillverkning och 3D-morfogenes med hybridchips. Transwell-insatser framställda oberoende för att odla 2D-monolager av tarmepitelceller insattes i hybridchipet för att inducera tarm 3D-morfogenes. Mediet perfunderas genom mikrokanaler under cellskiktet som är etablerat på Transwell-insatsen. Skalstång, 1 cm.h Återtryckt med tillstånd från referens.4. Elsevier.
I detta protokoll användes Caco-2-cellinjen och intestinala organoider som epitelkällor (Fig. 3a). Båda celltyperna odlades oberoende av varandra (Ruta 2 och Ruta 5) och användes för att så de ECM-belagda mikrokanalerna i on-chip-tarm eller Transwell-insatser. När cellerna är konfluenta (>95 % täckning i kolvarna) skördas rutinmässigt odlade Caco-2-celler (mellan passager 10 och 50) i T-kolvar för att framställa dissocierade cellsuspensioner med trypsiniseringsvätska (ruta 2). Humana intestinala organoider från intestinala biopsier eller kirurgiska resektioner odlades i Matrigel-scaffoldkupoler i 24-brunnsplattor för att stödja den strukturella mikromiljön. Medium innehållande essentiella morfogener (såsom Wnt, R-spondin och Noggin) och tillväxtfaktorer framställda enligt beskrivningen i Ruta 3 kompletterades varannan dag tills organoiderna växte till ~500 µm i diameter. Fullvuxna organoider skördas och dissocieras till enskilda celler för sådd på tarm eller Transwell-insatser på ett chip (ruta 5). Som vi tidigare har rapporterat kan det differentieras enligt sjukdomstyp12,13 (t.ex. ulcerös kolit, Crohns sjukdom, kolorektal cancer eller normal donator), lesionsställe (t.ex. lesion kontra icke-lesionerat område) och gastrointestinal plats i trakten (t.ex. tolvfingertarm, jejunum, ileum, blindtarm, kolon eller ändtarm). Vi tillhandahåller ett optimerat protokoll i ruta 5 för odling av kolonorganoider (koloider) som vanligtvis kräver högre koncentrationer av morfogener än tunntarmorganoider.
a, Arbetsflöde för induktion av tarmmorfogenes i tarmchipet. Caco-2 humant tarmepitel och tarmorganoider används i detta protokoll för att demonstrera 3D-morfogenes. De isolerade epitelcellerna såddes i den förberedda tarm-på-ett-chip-enheten (chipberedning). När cellerna är sådda (sådda) och fästa (anslutna) till det porösa PDMS-membranet på dag 0 (D0), initieras och upprätthålls apikalt (AP) flöde under de första 2 dagarna (flöde, AP, D0-D2). Basolateralt (BL) flöde initieras också tillsammans med cykliska sträckningsrörelser (sträckning, flöde, AP och BL) när ett komplett 2D-monolager bildas. Intestinal 3D-morfogenes inträffade spontant efter 5 dagars mikrofluidisk odling (morfogenes, D5). Faskontrastbilder visar representativ morfologi för Caco-2-celler vid varje experimentellt steg eller tidpunkt (stapeldiagram, 100 µm). Fyra schematiska diagram som illustrerar motsvarande kaskader av tarmmorfogenes (överst till höger). Den streckade Pilarna i schemat representerar vätskeflödets riktning.b, SEM-bild som visar yttopologin för det etablerade 3D Caco-2-epitelet (vänster). Infällningen som markerar det förstorade området (vit streckad ruta) visar de regenererade mikrovilli på 3D Caco-2-lagret (höger).c, Horisontell frontvy av etablerade Caco-2 3D, claudin (ZO-1, röd) och kontinuerliga borstkantmembran märkta F-aktin (grön) och kärnor (blå). Immunofluorescenskonfokalvisualisering av epitelceller på tarmchips. Pilar som pekar mot schemat i mitten indikerar fokusplanets placering för varje konfokalvy.d, Tidsförlopp för morfologiska förändringar i organoider odlade på ett chip erhållet med faskontrastmikroskopi på dag 3, 7, 9, 11 och 13. Infällningen (uppe till höger) visar den höga förstoringsgraden av den bifogade bilden.e, DIC-fotomikrografi av organoid 3D-epitel etablerat i tarmen på skiva taget på dag 7.f, Överlagrade immunofluorescensbilder visar markörer för stamceller (LGR5; magenta), bägarceller (MUC2; grön), F-aktin (grå) och cellkärnor (cyan) odlade på tarmchips i 3 dagar, respektive 13 dagar (mitten) organoider på epitelskiktet. Se även utökade data figur 3, som belyser LGR5-signalering utan MUC2-signalering. Fluorescensbilder som visar epitelmikrostrukturen (höger) av 3D-organoidepitel etablerat i tarmen på ett chip genom färgning av plasmamembranet med CellMask-färgämne (höger) på dag 13 av odlingen. Skalstrecket är 50 μm om inget annat anges. b Omtryckt med tillstånd från referens. 2. Oxford University Press; c Anpassad med tillstånd från referens. 2. Oxford University Press; e och f anpassade med tillstånd genom referens. 12 Under Creative Commons-licens CC BY 4.0.
I tarmen på ett chip är det nödvändigt att modifiera den hydrofoba ytan på det porösa PDMS-membranet för framgångsrik ECM-beläggning. I detta protokoll tillämpar vi två olika metoder för att modifiera hydrofobiciteten hos PDMS-membran. För odling av Caco-2-celler var ytaktivering med enbart UV/ozonbehandling tillräcklig för att minska hydrofobiciteten hos PDMS-ytan, belägga ECM och fästa Caco-2-celler vid PDMS-membranet. Mikrofluidisk kultur av organoidepitel kräver dock kemiskt baserad ytfunktionalisering för att uppnå effektiv deponering av ECM-proteiner genom att sekventiellt applicera polyetylenimin (PEI) och glutaraldehyd på PDMS-mikrokanaler. Efter ytmodifiering deponerades ECM-proteiner för att täcka den funktionaliserade PDMS-ytan och introducerades sedan i det isolerade organoidepitelet. Efter att cellerna har fästs börjar den mikrofluidiska cellkulturen genom att endast perfundera mediet i den övre mikrokanalen tills cellerna bildar ett komplett monolager, medan den nedre mikrokanalen upprätthåller statiska förhållanden. Denna optimerade metod för ytaktivering och ECM-beläggning möjliggör fästning av organoider. epitel för att inducera 3D-morfogenes på PDMS-ytan.
Transwell-kulturer kräver också ECM-beläggning före cellsådd; Transwell-kulturer kräver dock inte komplexa förbehandlingssteg för att aktivera ytan på porösa insatser. För odling av Caco-2-celler på Transwell-insatser accelererar ECM-beläggning på porösa insatser vidhäftningen av dissocierade Caco-2-celler (<1 timme) och bildning av täta förbindelser (<1-2 dagar). För att odla organoider på Transwell-insatser sås isolerade organoider på ECM-belagda insatser, fästs på membranytan (<3 timmar) och bibehålls tills organoiderna bildar ett komplett monolager med barriärintegritet. Transwell-kulturer utförs i 24-brunnsplattor utan användning av hybridchips.
In vitro 3D-morfogenes kan initieras genom att applicera vätskeflöde på den basolaterala aspekten av ett etablerat epitellager. I tarmen på ett chip började epitelmorfogenesen när mediet perfunderades i de övre och nedre mikrokanalerna (Fig. 3a). Som tidigare beskrivits är det avgörande att introducera vätskeflöde i det nedre (basolaterala) utrymmet för kontinuerligt avlägsnande av riktningsutsöndrade morfogenhämmare. För att ge tillräckligt med näringsämnen och serum till celler bundna på porösa membran och generera luminal skjuvspänning, applicerar vi vanligtvis dubbelt flöde i tarmen på ett chip. I hybridchips infogades Transwell-insatser innehållande epitelmonolager i hybridchipsen. Därefter applicerades mediet under den basolaterala sidan av det porösa Transwell-insatsen genom mikrokanalen. Intestinal morfogenes inträffade 3-5 dagar efter initiering av basolateralt flöde i båda odlingsplattformarna.
De morfologiska egenskaperna hos mikrokonstruerade 3D-epitellager kan analyseras genom att tillämpa olika avbildningsmetoder, inklusive faskontrastmikroskopi, differentiell interferenskontrast (DIC) mikroskopi, SEM eller immunofluorescenskonfokalmikroskopi (Figur 3 och 4). Faskontrast- eller DIC-avbildning kan enkelt utföras när som helst under odlingen för att övervaka formen och utskjutningen av 3D-epitellager. På grund av den optiska transparensen hos PDMS- och polyesterfilmer kan både gut-on-a-chip- och hybridchipplattformarna ge realtidsavbildning in situ utan behov av sektionering eller demontering av enheten. Vid immunofluorescensavbildning (Figur 1, 3c, f och 4b, c) fixeras celler vanligtvis med 4 % (vikt/volym) paraformaldehyd (PFA), följt av Triton X-100 och 2 % (vikt/volym) bovint serumalbumin (BSA), i ordning. Beroende på celltyp kan olika fixeringsmedel, permeabilisatorer och blockeringsmedel användas. Primära antikroppar som riktar sig mot Härstamningsberoende cell- eller regionmarkörer används för att markera celler som immobiliserats in situ på chipet, följt av sekundära antikroppar tillsammans med ett motfärgningsfärgämne som riktar sig mot antingen kärnan (t.ex. 4',6-diamidino-2-fenylen) indol, DAPI) eller F-aktin (t.ex. fluorescensmärkt falloidin). Fluorescensbaserad live-avbildning kan också utföras in situ för att detektera slemproduktion (Fig. 1, "Celldifferentiering" och "Tarmfysiologi"), slumpmässig kolonisering av mikrobiella celler (Fig. 1, "Värd-mikrob-samkultur"), rekrytering av immunceller (Fig. 1, "Sjukdomsmodellering") eller konturerna av 3D-epitelmorfologi (Fig. 3c, f och 4b, c). När tarmen på chipet modifieras för att separera det övre lagret från det nedre mikrokanallagret, såsom beskrivs i ref. Som visas i Fig. 2 kan 3D-epitelmorfologin såväl som mikrovilli på den apikala penselgränsen visualiseras med SEM. (Fig. 3b). Uttrycket av differentieringsmarkörer kan bedömas genom att utföra kvantitativ PCR5- eller encells-RNA-sekvensering. I detta fall skördas 3D-lager av epitelceller odlade i tarmchips eller hybridchips genom trypsinisering och används sedan för molekylär eller genetisk analys.
a, Arbetsflöde för induktion av intestinal morfogenes i ett hybridchip. Caco-2 och intestinala organoider används i detta protokoll för att demonstrera 3D-morfogenes i en hybridchipplattform. Dissocierade epitelceller såddes i förberedda Transwell-insatser (TW-förberedelse; se figur nedan). När cellerna hade såtts (såtts) och fästs vid polyestermembran i Transwell-insatser odlades alla celler under statiska förhållanden (TW-kultur). Efter 7 dagar integrerades ett enda Transwell-insats innehållande ett 2D-monolager av epitelceller i ett hybridchip för att introducera ett basolateralt flöde (Flow, BL), vilket slutligen ledde till genereringen av ett 3D-epitellager (morfogenes). Faskontrastmikrografer som visar morfologiska egenskaper hos epitelceller från mänskliga organ härledda från normal donator (C103-linje) ascendens colon vid varje experimentellt steg eller tidpunkt. Schemat i de övre lagren illustrerar den experimentella konfigurationen för varje steg. b, Hybridchips (vänster schema) kan leda till 3D-morfogenes av organoida epitelceller med Konfokalmikroskopibilder uppifrån och ner tagna vid olika Z-positioner (övre, mellersta och nedre; se höger schematiska bild och motsvarande prickade linjer). visade tydliga morfologiska egenskaper. F-aktin (cyan), kärna (grå). c, Fluorescenskonfokalmikrografer (3D-vinklad vy) av organoid-deriverade epitelceller odlade i statisk Transwell (TW; infälld bild i vit streckad ruta) kontra hybridchip (största helbilden) som jämför 2D- respektive 3D-morfologi. Ett par vertikala 2D-tvärsnittsvyer (infälld bild i det övre högra hörnet; "XZ") visar också 2D- och 3D-funktioner. Skalstreck, 100 µm. c Återtryckt med tillstånd från referens. 4. Elsevier.
Kontroller kan framställas genom att odla samma celler (Caco-2 eller intestinala organoida epitelceller) i tvådimensionella monolager under konventionella statiska odlingsförhållanden. Det är värt att notera att näringsbrist kan uppstå på grund av mikrokanalernas begränsade volymkapacitet (dvs. ~4 µL i den övre kanalen på den ursprungliga gut-chip-designen). Därför kan epitelmorfologin före och efter applicering av basolateralt flöde också jämföras.
Mjuklitografiprocessen bör utföras i ett renrum. För varje lager på chipet (övre och nedre lager och membran) och hybridchips användes olika fotomasker och tillverkades på separata kiselskivor eftersom mikrokanalernas höjder var olika. Målhöjderna för de övre och nedre mikrokanalerna i tarmen på chipet är 500 µm respektive 200 µm. Kanalmålhöjden för hybridchipet är 200 µm.
Placera en 7,5 cm kiselskiva i en skål med aceton. Snurra försiktigt plattan i 30 sekunder och lufttorka sedan skivan. Överför skivan till en platta med IPA och snurra sedan plattan i 30 sekunder för att rengöra den.
En piranhalösning (blandning av väteperoxid och koncentrerad svavelsyra, 1:3 (vol/vol)) kan eventuellt användas för att maximera avlägsnandet av organiska rester från kiselskivans yta.
Piranha-lösning är extremt frätande och genererar värme. Ytterligare säkerhetsåtgärder är nödvändiga. För avfallshantering, låt lösningen svalna och överför den till en ren, torr avfallsbehållare. Använd sekundära behållare och märk avfallsbehållare korrekt. Följ anläggningens säkerhetsriktlinjer för mer detaljerade procedurer.
Torka skivorna genom att placera dem på en 200 °C varm platta i 10 minuter. Efter torkning skakades skivan fem gånger i luft för att svalna.
Häll cirka 10 g fotoresist SU-8 2100 i mitten av den rengjorda kiselskivan. Använd pincett för att fördela fotoresisten jämnt över skivan. Placera skivan då och då på en 65 °C varm platta för att göra fotoresisten mindre klibbig och lättare att sprida ut. Placera inte skivan direkt på den varma plattan.
SU-8 fördelades jämnt på wafern genom att köra spinnbeläggning. Programmera en inkommande rotation av SU-8 i 5–10 sekunder för att fortplanta sig vid 500 rpm med en acceleration av 100 rpm/s. Ställ in huvudspinn för 200 µm tjockleksmönster vid 1 500 rpm, eller uppnå en tjocklek på 250 µm (vilket ger en höjd på 500 µm för det övre lagret av tarmen på chipet; se "Kritiska steg" nedan) inställt på en acceleration på 300 rpm/s 30 sekunder vid 1 200 rpm.
Huvudrotationshastigheten kan justeras enligt måltjockleken på SU-8-mönstret på kiselskivan.
För att tillverka SU-8-mönster med en höjd på 500 µm för det övre lagret av tarmen på chipet, upprepades spinnbeläggnings- och mjukbakningsstegen i denna låda (steg 7 och 8) i tur och ordning (se steg 9) för att producera två lager av 250 µm tjockt SU-8, vilket kan läggs i lager och sammanfogas genom UV-exponering i steg 12 i denna låda, vilket skapar ett lager som är 500 µm högt.
Mjukgrädda de SU-8-belagda skivorna genom att försiktigt placera skivorna på en varm platta vid 65 °C i 5 minuter, ställ sedan in inställningen till 95 °C och inkubera i ytterligare 40 minuter.
För att uppnå en 500 μm höjd av SU-8-mönstret i den övre mikrokanalen, upprepa steg 7 och 8 för att generera två 250 μm tjocka SU-8-lager.
Använd UV-maskjusteringen och utför ett lamptest enligt tillverkarens instruktioner för att beräkna waferns exponeringstid. (exponeringstid, ms) = (exponeringsdos, mJ/cm2)/(lampeffekt, mW/cm2).
Efter att exponeringstiden har bestämts, placera fotomasken på maskhållaren på UV-maskalignern och placera fotomasken på den SU-8-belagda wafern.
Placera den tryckta ytan av fotomasken direkt på den SU-8-belagda sidan av kiselskivan för att minimera UV-spridning.
Exponera den SU-8-belagda wafern och fotomasken vertikalt för 260 mJ/cm2 UV-ljus under den förutbestämda exponeringstiden (se steg 10 i denna ruta).
Efter UV-exponering bakades SU-8-belagda kiselskivor vid 65 °C i 5 minuter och 95 °C i 15 minuter på varje värmeplatta för att tillverka mönster med en höjd av 200 μm. Förläng efterbakningstiden vid 95 °C till 30 minuter för att tillverka mönster med en höjd av 500 μm.
Framkallaren hälls i en glasskål och den bakade rånet placeras i skålen. Volymen SU-8-framkallare kan variera beroende på glasplattans storlek. Se till att använda tillräckligt med SU-8-framkallare för att helt avlägsna oexponerad SU-8. Till exempel, när du använder en glasskål med 150 mm diameter och en kapacitet på 1 liter, använd ~300 ml SU-8-framkallare. Framkalla formen i 25 minuter med försiktig rotation då och då.
Skölj den framkallade formen med ~10 mL färsk utvecklare följt av IPA genom att spraya lösningen med en pipett.
Placera wafern i en plasmarengörare och exponera den för syreplasma (atmosfärisk gas, måltryck 1 × 10−5 Torr, effekt 125 W) i 1,5 minuter.
Placera wafern i en vakuumexsickator med ett objektglas inuti. Wafers och objektglas kan placeras sida vid sida. Om vakuumexsickatorn är uppdelad i flera lager med en platta, placera objektglasen i den nedre kammaren och wafers i den övre kammaren. Droppa 100 μL trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktyl)silanlösning på ett objektglas och applicera vakuum för silanisering.
Tina en ampull med frysta Caco-2-celler i ett 37 °C vattenbad och överför sedan de tinade cellerna till en T75-kolv innehållande 15 ml 37 °C förvärmt Caco-2-medium.
För att låta Caco-2-celler passera vid ~90 % konfluens, värm först Caco-2-medium, PBS och 0,25 % trypsin/1 mM EDTA i ett 37 °C vattenbad.
Aspirera mediet genom vakuumaspiration. Tvätta cellerna två gånger med 5 ml varm PBS genom att upprepa vakuumaspirationen och tillsätta färsk PBS.