Tack för att du besöker Nature.com.Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Utvecklingen av mikrobiella parasiter innebär en motverkan mellan naturligt urval, som gör att parasiter förbättras, och genetisk drift, som gör att parasiter förlorar gener och ackumulerar skadliga mutationer.Här, för att förstå hur denna motverkan sker på skalan av en enda makromolekyl, beskriver vi kryo-EM-strukturen av ribosomen av Encephalitozoon cuniculi, en eukaryot organism med ett av de minsta genomen i naturen.Den extrema minskningen av rRNA i E. cuniculi-ribosomer åtföljs av oöverträffade strukturella förändringar, såsom utvecklingen av tidigare okända fusionerade rRNA-linkers och rRNA utan utbuktningar.Dessutom överlevde E. cuniculi-ribosomen förlusten av rRNA-fragment och proteiner genom att utveckla förmågan att använda små molekyler som strukturella härmar av nedbrutna rRNA-fragment och proteiner.Sammantaget visar vi att molekylära strukturer som länge troddes vara reducerade, degenererade och utsatta för försvagande mutationer har ett antal kompensatoriska mekanismer som håller dem aktiva trots extrema molekylära sammandragningar.
Eftersom de flesta grupper av mikrobiella parasiter har unika molekylära verktyg för att utnyttja sina värdar, måste vi ofta utveckla olika terapier för olika grupper av parasiter1,2.Nya bevis tyder dock på att vissa aspekter av parasitutvecklingen är konvergenta och till stor del förutsägbara, vilket indikerar en potentiell grund för breda terapeutiska interventioner i mikrobiella parasiter3,4,5,6,7,8,9.
Tidigare arbete har identifierat en vanlig evolutionär trend i mikrobiella parasiter som kallas genomreduktion eller genomsönderfall10,11,12,13.Aktuell forskning visar att när mikroorganismer ger upp sin frilevande livsstil och blir intracellulära parasiter (eller endosymbionter), genomgår deras genom långsamma men fantastiska metamorfoser under miljontals år9,11.I en process som kallas genomsönderfall ackumulerar mikrobiella parasiter skadliga mutationer som förvandlar många tidigare viktiga gener till pseudogener, vilket leder till gradvis genförlust och mutationskollaps14,15.Denna kollaps kan förstöra upp till 95 % av generna i de äldsta intracellulära organismerna jämfört med närbesläktade frilevande arter.Således är utvecklingen av intracellulära parasiter en dragkamp mellan två motsatta krafter: Darwinistiskt naturligt urval, vilket leder till förbättring av parasiter, och genomets kollaps, vilket kastar parasiter i glömska.Hur parasiten lyckades ta sig ur denna dragkamp och behålla sin molekylära strukturs aktivitet är fortfarande oklart.
Även om mekanismen för genomsönderfall inte är helt klarlagd, verkar den uppstå huvudsakligen på grund av frekvent genetisk drift.Eftersom parasiter lever i små, asexuella och genetiskt begränsade populationer kan de inte effektivt eliminera skadliga mutationer som ibland uppstår under DNA-replikation.Detta leder till irreversibel ackumulering av skadliga mutationer och minskning av parasitgenomet.Som ett resultat förlorar parasiten inte bara gener som inte längre är nödvändiga för dess överlevnad i den intracellulära miljön.Det är oförmågan hos parasitpopulationer att effektivt eliminera sporadiska skadliga mutationer som gör att dessa mutationer ackumuleras i hela genomet, inklusive deras viktigaste gener.
Mycket av vår nuvarande förståelse av genomreduktion baseras enbart på jämförelser av genomsekvenser, med mindre uppmärksamhet på förändringar i faktiska molekyler som utför hushållsfunktioner och fungerar som potentiella läkemedelsmål.Jämförande studier har visat att bördan av skadliga intracellulära mikrobiella mutationer verkar predisponera proteiner och nukleinsyror för att felveckas och aggregera, vilket gör dem mer chaperonberoende och överkänsliga mot värme19,20,21,22,23.Dessutom upplevde olika parasiter – oberoende evolution ibland separerade med så mycket som 2,5 miljarder år – en liknande förlust av kvalitetskontrollcenter i deras proteinsyntes5,6 och DNA-reparationsmekanismer24.Lite är dock känt om effekten av intracellulär livsstil på alla andra egenskaper hos cellulära makromolekyler, inklusive molekylär anpassning till en ökande börda av skadliga mutationer.
I detta arbete, för att bättre förstå utvecklingen av proteiner och nukleinsyror i intracellulära mikroorganismer, bestämde vi strukturen av ribosomer av den intracellulära parasiten Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi är en svampliknande organism som tillhör en grupp parasitiska mikrosporidier som har ovanligt små eukaryota genom och som därför används som modellorganismer för att studera genomsönderfall25,26,27,28,29,30.Nyligen bestämdes cryo-EM-ribosomstruktur för måttligt reducerade genom av Microsporidia, Paranosema locustae och Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genom).Dessa strukturer tyder på att viss förlust av rRNA-amplifiering kompenseras av utvecklingen av nya kontakter mellan närliggande ribosomala proteiner eller förvärvet av nya msL131,32 ribosomala proteiner.Arter Encephalitozoon (genom ~2,5 miljoner bp), tillsammans med deras närmaste släkting Ordospora, visar den ultimata graden av genomreduktion i eukaryoter – de har mindre än 2000 proteinkodande gener, och det förväntas att deras ribosomer inte bara saknar rRNA-expansionsfragment (rRNA-bakterie-ribosomer) som också har fyra diskaryotingu-ribosomer från fragment av bakterier. ribosomala proteiner på grund av deras brist på homologer i E. cuniculi-genomet26,27,28.Därför drog vi slutsatsen att E. cuniculi-ribosomen kan avslöja tidigare okända strategier för molekylär anpassning till genomsönderfall.
Vår kryo-EM-struktur representerar den minsta eukaryota cytoplasmatiska ribosom som ska karakteriseras och ger insikt i hur den ultimata graden av genomreduktion påverkar strukturen, sammansättningen och utvecklingen av det molekylära maskineriet som är integrerat med cellen.Vi fann att E. cuniculi-ribosomen bryter mot många av de allmänt bevarade principerna för RNA-veckning och ribosomsammansättning, och upptäckte ett nytt, tidigare okänt ribosomalt protein.Helt oväntat visar vi att mikrosporidieribosomer har utvecklat förmågan att binda små molekyler och antar att trunkationer i rRNA och proteiner utlöser evolutionära innovationer som i slutändan kan ge användbara egenskaper till ribosomen.
För att förbättra vår förståelse av utvecklingen av proteiner och nukleinsyror i intracellulära organismer, beslutade vi att isolera E. cuniculi-sporer från kulturer av infekterade däggdjursceller för att rena deras ribosomer och bestämma strukturen av dessa ribosomer.Det är svårt att få fram ett stort antal parasitiska mikrosporidier eftersom mikrosporidier inte kan odlas i ett näringsmedium.Istället växer och reproducerar de bara inuti värdcellen.Därför, för att erhålla E. cuniculi-biomassa för ribosomrening, infekterade vi däggdjursnjurcellinjen RK13 med E. cuniculi-sporer och odlade dessa infekterade celler i flera veckor för att tillåta E. cuniculi att växa och föröka sig.Med hjälp av ett infekterat cellmonoskikt på cirka en halv kvadratmeter kunde vi rena cirka 300 mg Microsporidia-sporer och använda dem för att isolera ribosomer.Vi förstörde sedan de renade sporerna med glaspärlor och isolerade de råa ribosomerna med användning av stegvis polyetylenglykolfraktionering av lysaten.Detta gjorde det möjligt för oss att erhålla cirka 300 µg råa E. cuniculi-ribosomer för strukturanalys.
Vi samlade sedan in kryo-EM-bilder med hjälp av de resulterande ribosomproverna och bearbetade dessa bilder med masker som motsvarar den stora ribosomala subenheten, liten subenhetshuvud och liten subenhet.Under denna process samlade vi in ​​bilder av cirka 108 000 ribosomala partiklar och beräknade kryo-EM-bilder med en upplösning på 2,7 Å (kompletterande figurer 1-3).Vi använde sedan cryoEM-bilder för att modellera rRNA, ribosomalt protein och vilolägesfaktor Mdf1 associerad med E. cuniculi-ribosomer (Fig. 1a, b).
a Struktur av E. cuniculi-ribosomen i komplex med vilolägesfaktorn Mdf1 (pdb id 7QEP).b Karta över vilolägesfaktor Mdf1 associerad med E. cuniculi-ribosomen.c Sekundär strukturkarta som jämför återvunnet rRNA i mikrosporidiska arter med kända ribosomala strukturer.Panelerna visar placeringen av de amplifierade rRNA-fragmenten (ES) och ribosomaktiva ställen, inklusive avkodningsstället (DC), sarcinicinslingan (SRL) och peptidyltransferascentret (PTC).d Elektrondensiteten som motsvarar peptidyltransferascentrumet i E. cuniculi-ribosomen antyder att detta katalytiska ställe har samma struktur i E. cuniculi-parasiten och dess värdar, inklusive H. sapiens.e, f Den motsvarande elektrontätheten för avkodningscentret (e) och den schematiska strukturen för avkodningscentret (f) indikerar att E. cuniculi har rester U1491 istället för A1491 (E. coli-numrering) i många andra eukaryoter.Denna förändring tyder på att E. cuniculi kan vara känslig för antibiotika som riktar sig mot denna aktiva plats.
I motsats till de tidigare etablerade strukturerna av V. necatrix- och P. locustae-ribosomer (båda strukturerna representerar samma microsporidia-familj Nosematidae och är mycket lika varandra), genomgår 31,32 E. cuniculi-ribosomer många processer av rRNA- och proteinfragmentering.Ytterligare denaturering (kompletterande figurer 4-6).I rRNA inkluderade de mest slående förändringarna fullständig förlust av det amplifierade 25S rRNA-fragmentet ES12L och partiell degenerering av h39-, h41- och H18-helixar (Fig. 1c, Kompletterande Fig. 4).Bland ribosomala proteiner inkluderade de mest slående förändringarna fullständig förlust av eS30-proteinet och förkortning av eL8-, eL13-, eL18-, eL22-, eL29-, eL40-, uS3-, uS9-, uS14-, uS17- och eS7-proteinerna (supplerande 5).
Således återspeglas den extrema minskningen av genomen av Encephalotozoon/Ordospora-arter i deras ribosomstruktur: E. cuniculi-ribosomer upplever den mest dramatiska förlusten av proteininnehåll i eukaryota cytoplasmatiska ribosomer som är föremål för strukturell karaktärisering, och de har inte ens de rRNA- och proteinfragmenten som inte bara finns i de tre domoterna, utan även de är mycket konserverade i livet.Strukturen av E. cuniculi-ribosomen tillhandahåller den första molekylära modellen för dessa förändringar och avslöjar evolutionära händelser som har förbisetts av både jämförande genomik och studier av intracellulär biomolekylär struktur (kompletterande fig. 7).Nedan beskriver vi var och en av dessa händelser tillsammans med deras troliga evolutionära ursprung och deras potentiella inverkan på ribosomfunktionen.
Vi fann sedan att, förutom stora rRNA-trunkeringar, har E. cuniculi-ribosomer rRNA-variationer på en av sina aktiva platser.Även om peptidyltransferascentret i E. cuniculi-ribosomen har samma struktur som andra eukaryota ribosomer (Fig. Id), skiljer sig avkodningscentret på grund av sekvensvariation vid nukleotid 1491 (E. coli-numrering, Fig. 1e, f).Denna observation är viktig eftersom avkodningsstället för eukaryota ribosomer vanligtvis innehåller resterna G1408 och A1491 jämfört med resterna A1408 och G1491 av bakterietyp.Denna variation ligger till grund för den olika känsligheten hos bakteriella och eukaryota ribosomer för aminoglykosidfamiljen av ribosomala antibiotika och andra små molekyler som riktar sig mot avkodningsstället.Vid avkodningsstället för E. cuniculi-ribosomen ersattes rest A1491 med U1491, vilket potentiellt skapar ett unikt bindningsgränssnitt för små molekyler som riktar sig mot detta aktiva ställe.Samma A14901-variant finns också i andra mikrosporidier såsom P. locustae och V. necatrix, vilket tyder på att den är utbredd bland mikrosporidierarter (Fig. 1f).
Eftersom våra E. cuniculi-ribosomprover isolerades från metaboliskt inaktiva sporer, testade vi cryo-EM-kartan av E. cuniculi för tidigare beskrivna ribosombindning under stress- eller svältförhållanden.Hibernationsfaktorer 31,32,36,37, 38. Vi matchade den tidigare etablerade strukturen för den övervintrade ribosomen med cryo-EM-kartan för E. cuniculi-ribosomen.För dockning användes S. cerevisiae-ribosomer i komplex med vilolägesfaktor Stm138, gräshoppsribosomer i komplex med Lso232-faktor och V. necatrix-ribosomer i komplex med Mdf1- och Mdf231-faktorer.Samtidigt hittade vi kryo-EM-densiteten motsvarande vilofaktorn Mdf1.I likhet med Mdf1-bindning till V. necatrix-ribosomen, binder Mdf1 också till E. cuniculi-ribosomen, där den blockerar ribosomens E-ställe, vilket möjligen hjälper till att göra ribosomer tillgängliga när parasitsporer blir metaboliskt inaktiva vid inaktivering av kroppen (Figur 2).).
Mdf1 blockerar E-stället i ribosomen, vilket verkar hjälpa till att inaktivera ribosomen när parasitsporer blir metaboliskt inaktiva.I strukturen av E. cuniculi-ribosomen fann vi att Mdf1 bildar en tidigare okänd kontakt med L1-ribosomstammen, den del av ribosomen som underlättar frisättningen av deacylerat tRNA från ribosomen under proteinsyntesen.Dessa kontakter tyder på att Mdf1 dissocierar från ribosomen med samma mekanism som deacetylerat tRNA, vilket ger en möjlig förklaring till hur ribosomen tar bort Mdf1 för att återaktivera proteinsyntesen.
Men vår struktur avslöjade en okänd kontakt mellan Mdf1 och L1-ribosombenet (den del av ribosomen som hjälper till att frigöra deacylerat tRNA från ribosomen under proteinsyntesen).I synnerhet använder Mdf1 samma kontakter som armbågssegmentet av den deacylerade tRNA-molekylen (Fig. 2).Denna tidigare okända molekylära modellering visade att Mdf1 dissocierar från ribosomen med samma mekanism som deacetylerat tRNA, vilket förklarar hur ribosomen tar bort denna vilolägesfaktor för att återaktivera proteinsyntesen.
När vi konstruerade rRNA-modellen fann vi att E. cuniculi-ribosomen har onormalt vikta rRNA-fragment, som vi kallade fusionerat rRNA (Fig. 3).I ribosomer som sträcker sig över livets tre domäner, viks rRNA till strukturer där de flesta rRNA-baser antingen baspar och viker sig med varandra eller interagerar med ribosomala proteiner38,39,40.Men i E. cuniculi-ribosomer verkar rRNA bryta mot denna vikningsprincip genom att omvandla några av deras spiraler till ovikta rRNA-regioner.
Struktur av H18 25S rRNA helix i S. cerevisiae, V. necatrix och E. cuniculi.I ribosomer som sträcker sig över de tre livsdomänerna, lindas denna linker vanligtvis ihop till en RNA-spiral som innehåller 24 till 34 rester.I Microsporidia, däremot, reduceras denna rRNA-linker gradvis till två enkelsträngade uridinrika linkers innehållande endast 12 rester.De flesta av dessa rester utsätts för lösningsmedel.Figuren visar att parasitiska mikrosporidier verkar bryta mot de allmänna principerna för rRNA-veckning, där rRNA-baser vanligtvis är kopplade till andra baser eller involverade i rRNA-proteininteraktioner.I mikrosporidier tar vissa rRNA-fragment en ogynnsam veckning, där den tidigare rRNA-helixen blir ett enkelsträngat fragment som är förlängt nästan i en rak linje.Närvaron av dessa ovanliga regioner tillåter mikrosporidia-rRNA att binda avlägsna rRNA-fragment med användning av ett minimalt antal RNA-baser.
Det mest slående exemplet på denna evolutionära övergång kan observeras i H18 25S rRNA-helixen (Fig. 3).Hos arter från E. coli till människor innehåller baserna i denna rRNA-helix 24-32 nukleotider, vilket bildar en något oregelbunden helix.I tidigare identifierade ribosomala strukturer från V. necatrix och P. locustae,31,32 är baserna i H18-helixen delvis upprullade, men nukleotidbasparning bevaras.I E. cuniculi blir dock detta rRNA-fragment de kortaste länkarna 228UUUGU232 och 301UUUUUUUUUU307.Till skillnad från typiska rRNA-fragment, lindar dessa uridinrika linkers inte ihop eller kommer i omfattande kontakt med ribosomala proteiner.Istället antar de lösningsmedelsöppna och helt ovikta strukturer där rRNA-strängarna förlängs nästan rakt.Denna sträckta konformation förklarar hur E. cuniculi endast använder 12 RNA-baser för att fylla gapet på 33 Å mellan H16- och H18-rRNA-spiralerna, medan andra arter kräver minst dubbelt så många rRNA-baser för att fylla gapet.
Således kan vi visa att parasitiska mikrosporidier genom energetiskt ogynnsam veckning har utvecklat en strategi för att dra ihop till och med de rRNA-segment som förblir i stort sett bevarade över arter i livets tre domäner.Uppenbarligen, genom att ackumulera mutationer som transformerar rRNA-helixar till korta poly-U-linkers, kan E. cuniculi bilda ovanliga rRNA-fragment som innehåller så få nukleotider som möjligt för ligering av distala rRNA-fragment.Detta hjälper till att förklara hur mikrosporidier uppnådde en dramatisk minskning av sin grundläggande molekylära struktur utan att förlora sin strukturella och funktionella integritet.
En annan ovanlig egenskap hos E. cuniculi rRNA är utseendet av rRNA utan förtjockningar (Fig. 4).Bulgar är nukleotider utan baspar som vrider sig ut ur RNA-helixen istället för att gömma sig i den.De flesta rRNA-utsprång fungerar som molekylära bindemedel och hjälper till att binda intilliggande ribosomala proteiner eller andra rRNA-fragment.Några av utbuktningarna fungerar som gångjärn, vilket gör att rRNA-spiralen kan böjas och vikas optimalt för produktiv proteinsyntes 41 .
a Ett rRNA-utsprång (S. cerevisiae-numrering) saknas i E. cuniculi-ribosomstrukturen, men finns i de flesta andra eukaryoter av E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens och E. cuniculi interna ribosomer.parasiter saknar många av de gamla, mycket konserverade rRNA-utbuktningarna.Dessa förtjockningar stabiliserar ribosomstrukturen;därför indikerar deras frånvaro i mikrosporidier en minskad stabilitet av rRNA-veckning i mikrosporidiaparasiter.Jämförelse med P-stammar (L7/L12-stamlar i bakterier) visar att förlusten av rRNA-knölar ibland sammanfaller med uppkomsten av nya knölar bredvid de förlorade knölarna.H42-helixen i 23S/28S rRNA har en uråldrig utbuktning (U1206 i Saccharomyces cerevisiae) som uppskattas vara minst 3,5 miljarder år gammal på grund av dess skydd i tre livsområden.I mikrosporidier elimineras denna utbuktning.En ny bula dök dock upp bredvid den förlorade bulan (A1306 i E. cuniculi).
Påfallande nog fann vi att E. cuniculi-ribosomer saknar de flesta rRNA-utbuktningar som finns i andra arter, inklusive mer än 30 utbuktningar bevarade i andra eukaryoter (Fig. 4a).Denna förlust eliminerar många kontakter mellan ribosomala subenheter och intilliggande rRNA-spiraler, vilket ibland skapar stora ihåliga tomrum i ribosomen, vilket gör E. cuniculi-ribosomen mer porös jämfört med mer traditionella ribosomer (Fig. 4b).Noterbart fann vi att de flesta av dessa utbuktningar också gick förlorade i de tidigare identifierade V. necatrix- och P. locustae-ribosomstrukturerna, som förbises av tidigare strukturella analyser31,32.
Ibland åtföljs förlusten av rRNA-utbuktningar av utvecklingen av nya utbuktningar bredvid den förlorade utbuktningen.Till exempel innehåller den ribosomala P-stammen en U1208 utbuktning (i Saccharomyces cerevisiae) som överlevde från E. coli till människor och därför uppskattas vara 3,5 miljarder år gammal.Under proteinsyntesen hjälper denna utbuktning P-stammen att röra sig mellan öppna och slutna konformationer så att ribosomen kan rekrytera translationsfaktorer och leverera dem till den aktiva platsen.Hos E. cuniculi-ribosomer saknas denna förtjockning;dock kan en ny förtjockning (G883) placerad endast i tre baspar bidra till att återställa den optimala flexibiliteten hos P-stammen (fig. 4c).
Våra data om rRNA utan utbuktningar tyder på att rRNA-minimering inte är begränsad till förlusten av rRNA-element på ribosomens yta, utan kan också involvera ribosomkärnan, vilket skapar en parasitspecifik molekylär defekt som inte har beskrivits i fritt levande celler.levande arter observeras.
Efter modellering av kanoniska ribosomala proteiner och rRNA fann vi att konventionella ribosomala komponenter inte kan förklara de tre delarna av kryo-EM-bilden.Två av dessa fragment är små molekyler i storlek (fig. 5, kompletterande fig. 8).Det första segmentet är inklämt mellan de ribosomala proteinerna uL15 och eL18 i en position som vanligtvis upptas av C-terminalen av eL18, som är förkortad i E. cuniculi.Även om vi inte kan fastställa identiteten för denna molekyl, är storleken och formen på denna densitetsö väl förklarad av närvaron av spermidinmolekyler.Dess bindning till ribosomen stabiliseras av mikrosporidispecifika mutationer i uL15-proteinerna (Asp51 och Arg56), vilket verkar öka ribosomens affinitet för denna lilla molekyl, eftersom de tillåter uL15 att linda in den lilla molekylen i en ribosomal struktur.Kompletterande figur 2).8, ytterligare uppgifter 1, 2).
Cryo-EM-avbildning som visar närvaron av nukleotider utanför ribosen bunden till E. cuniculi-ribosomen.I E. cuniculi-ribosomen upptar denna nukleotid samma plats som 25S rRNA A3186-nukleotiden (Saccharomyces cerevisiae-numrering) i de flesta andra eukaryota ribosomer.b I den ribosomala strukturen hos E. cuniculi är denna nukleotid belägen mellan de ribosomala proteinerna uL9 och eL20, vilket stabiliserar kontakten mellan de två proteinerna.cd eL20-sekvenskonserveringsanalys bland mikrosporidierarter.Det fylogenetiska trädet för Microsporidia-arter (c) och multipelsekvensanpassning av eL20-proteinet (d) visar att nukleotidbindande rester F170 och K172 är bevarade i de flesta typiska Microsporidia, med undantag för S. lophii, med undantag för tidigt förgrenade Microsporidia, som behöll ES39L-förlängningen.e Denna figur visar att nukleotidbindande rester F170 och K172 endast finns i eL20 i det kraftigt reducerade mikrosporidiagenomet, men inte i andra eukaryoter.Sammantaget tyder dessa data på att mikrosporidiska ribosomer har utvecklat ett nukleotidbindningsställe som verkar binda AMP-molekyler och använda dem för att stabilisera protein-proteininteraktioner i den ribosomala strukturen.Det höga bevarandet av detta bindningsställe i Microsporidia och dess frånvaro i andra eukaryoter antyder att detta ställe kan ge en selektiv överlevnadsfördel för Microsporidia.Den nukleotidbindande fickan i mikrosporidieribosomen verkar alltså inte vara en degenererad egenskap eller slutform av rRNA-nedbrytning som tidigare beskrivits, utan snarare en användbar evolutionär innovation som gör att mikrosporidieribosomen direkt kan binda små molekyler och använda dem som molekylära byggstenar.byggstenar för ribosomer.Denna upptäckt gör mikrosporidieribosomen till den enda ribosomen som är känd för att använda en enda nukleotid som dess strukturella byggsten.f Hypotetisk evolutionär väg härledd från nukleotidbindning.
Den andra lågmolekylära densiteten är belägen vid gränsytan mellan ribosomala proteiner uL9 och eL30 (Fig. 5a).Detta gränssnitt har tidigare beskrivits i strukturen av Saccharomyces cerevisiae-ribosomen som ett bindningsställe för 25S-nukleotiden av rRNA A3186 (en del av ES39L rRNA-förlängningen)38.Det visades att i degenererade P. locustae ES39L-ribosomer binder detta gränssnitt en okänd enkel nukleotid 31, och det antas att denna nukleotid är en reducerad slutlig form av rRNA, i vilken längden på rRNA är ~130-230 baser.ES39L reduceras till en enda nukleotid 32.43.Våra kryo-EM-bilder stödjer tanken att densitet kan förklaras av nukleotider.Den högre upplösningen av vår struktur visade emellertid att denna nukleotid är en extraribosomal molekyl, möjligen AMP (Fig. 5a, b).
Vi frågade sedan om nukleotidbindningsstället förekom i E. cuniculi-ribosomen eller om det existerade tidigare.Eftersom nukleotidbindning huvudsakligen medieras av Phe170- och Lys172-resterna i eL30-ribosomproteinet, utvärderade vi bevarandet av dessa rester i 4396 representativa eukaryoter.Liksom i fallet med uL15 ovan, fann vi att Phe170- och Lys172-resterna är mycket konserverade endast i typiska Microsporidier, men frånvarande i andra eukaryoter, inklusive atypiska Microsporidia Mitosporidium och Amphiamblys, i vilka ES39L rRNA-fragmentet inte är reducerat 44, 45, 45, 45, 45).-e).
Sammantaget stödjer dessa data idén att E. cuniculi och möjligen andra kanoniska mikrosporidier har utvecklat förmågan att effektivt fånga upp ett stort antal små metaboliter i ribosomstrukturen för att kompensera för nedgången i rRNA- och proteinnivåer.Genom att göra det har de utvecklat en unik förmåga att binda nukleotider utanför ribosomen, vilket visar att parasitiska molekylära strukturer kompenserar genom att fånga rikligt med små metaboliter och använda dem som strukturella efterliknande av nedbrutet RNA och proteinfragment..
Den tredje osimulerade delen av vår kryo-EM-karta, som finns i den stora ribosomala subenheten.Den relativt höga upplösningen (2,6 Å) på vår karta antyder att denna densitet tillhör proteiner med unika kombinationer av stora sidokedjerester, vilket gjorde att vi kunde identifiera denna densitet som ett tidigare okänt ribosomalt protein som vi identifierade som det hette msL2 (Microsporidia-specifikt protein L2) (metoder, figur 6).Vår homologisökning visade att msL2 är bevarad i Microsporidia clade av släktet Encephaliter och Orosporidium, men frånvarande i andra arter, inklusive andra Microsporidia.I den ribosomala strukturen upptar msL2 ett gap som bildas av förlusten av det utökade ES31L-rRNA:t.I detta tomrum hjälper msL2 till att stabilisera rRNA-veckning och kan kompensera för förlusten av ES31L (Figur 6).
en elektrondensitet och modell av det Microsporidia-specifika ribosomala proteinet msL2 som finns i E. cuniculi-ribosomer.b De flesta eukaryota ribosomer, inklusive 80S-ribosomen av Saccharomyces cerevisiae, har förlorat ES19L rRNA-amplifiering i de flesta mikrosporidiska arter.Den tidigare etablerade strukturen av V. necatrix microsporidia-ribosomen tyder på att förlusten av ES19L i dessa parasiter kompenseras av utvecklingen av det nya ribosomala msL1-proteinet.I denna studie fann vi att E. cuniculi-ribosomen också utvecklade ett ytterligare ribosomalt RNA-härmande protein som en uppenbar kompensation för förlusten av ES19L.Emellertid har msL2 (för närvarande annoterat som det hypotetiska ECU06_1135-proteinet) och msL1 olika strukturella och evolutionära ursprung.c Denna upptäckt av genereringen av evolutionärt obesläktade msL1- och msL2-ribosomala proteiner tyder på att om ribosomer ackumulerar skadliga mutationer i deras rRNA, kan de uppnå oöverträffade nivåer av sammansättningsmångfald även i en liten delmängd av närbesläktade arter.Denna upptäckt kan hjälpa till att klargöra ursprunget och utvecklingen av den mitokondriella ribosomen, som är känd för sin kraftigt reducerade rRNA och onormala variationer i proteinsammansättning mellan arter.
Vi jämförde sedan msL2-proteinet med det tidigare beskrivna msL1-proteinet, det enda kända mikrosporidia-specifika ribosomala proteinet som finns i V. necatrix-ribosomen.Vi ville testa om msL1 och msL2 är evolutionärt relaterade.Vår analys visade att msL1 och msL2 upptar samma hålighet i den ribosomala strukturen, men har olika primära och tertiära strukturer, vilket indikerar deras oberoende evolutionära ursprung (Fig. 6).Således ger vår upptäckt av msL2 bevis för att grupper av kompakta eukaryota arter oberoende kan utveckla strukturellt distinkta ribosomala proteiner för att kompensera för förlusten av rRNA-fragment.Detta fynd är anmärkningsvärt genom att de flesta cytoplasmatiska eukaryota ribosomer innehåller ett invariant protein, inklusive samma familj av 81 ribosomala proteiner.Uppkomsten av msL1 och msL2 i olika klader av mikrosporidier som svar på förlusten av utökade rRNA-segment tyder på att nedbrytning av parasitens molekylära arkitektur gör att parasiter söker kompensatoriska mutationer, vilket så småningom kan leda till att de förvärvas i olika parasitpopulationer.strukturer.
Slutligen, när vår modell var klar jämförde vi sammansättningen av E. cuniculi-ribosomen med den som förutspåddes från genomsekvensen.Flera ribosomala proteiner, inklusive eL14, eL38, eL41 och eS30, ansågs tidigare saknas från E. cuniculi-genomet på grund av den uppenbara frånvaron av deras homologer från E. cuniculi-genomet.Förlust av många ribosomala proteiner förutsägs också i de flesta andra kraftigt reducerade intracellulära parasiter och endosymbionter.Till exempel, även om de flesta frilevande bakterier innehåller samma familj av 54 ribosomala proteiner, har endast 11 av dessa proteinfamiljer detekterbara homologer i varje analyserat genom av värdbegränsade bakterier.Till stöd för denna uppfattning har en förlust av ribosomala proteiner experimentellt observerats i V. necatrix och P. locustae microsporidia, som saknar eL38- och eL4131,32-proteinerna.
Våra strukturer visar dock att endast eL38, eL41 och eS30 faktiskt går förlorade i E. cuniculi-ribosomen.eL14-proteinet konserverades och vår struktur visade varför detta protein inte kunde hittas i homologisökningen (Fig. 7).I E. cuniculi-ribosomer går det mesta av eL14-bindningsstället förlorat på grund av nedbrytning av den rRNA-förstärkta ES39L.I frånvaro av ES39L förlorade eL14 det mesta av sin sekundära struktur, och endast 18 % av eL14-sekvensen var identisk i E. cuniculi och S. cerevisiae.Detta dåliga sekvensbevarande är anmärkningsvärt eftersom till och med Saccharomyces cerevisiae och Homo sapiens – organismer som utvecklats med 1,5 miljarder års mellanrum – delar mer än 51 % av samma rester i eL14.Denna onormala förlust av konservering förklarar varför E. cuniculi eL14 för närvarande annoteras som det förmodade M970_061160-proteinet och inte som det ribosomala proteinet eL1427.
och Microsporidia-ribosomen förlorade ES39L rRNA-förlängningen, vilket delvis eliminerade det ribosomala proteinbindningsstället för eL14.I frånvaro av ES39L genomgår mikrosporproteinet eL14 en förlust av sekundär struktur, där den tidigare rRNA-bindande α-helixen degenererar till en loop med minimal längd.b Multipelsekvensanpassning visar att eL14-proteinet är mycket konserverat i eukaryota arter (57 % sekvensidentitet mellan jäst- och humanhomologer), men dåligt konserverat och divergerande i mikrosporidier (där inte mer än 24 % av resterna är identiska med eL14-homologen).från S. cerevisiae eller H. sapiens).Denna dåliga sekvenskonservering och sekundära strukturvariabilitet förklarar varför eL14-homologen aldrig har hittats i E. cuniculi och varför detta protein tros ha gått förlorat i E. cuniculi.Däremot annoterades E. cuniculi eL14 tidigare som ett förmodat M970_061160-protein.Denna observation tyder på att mikrosporidernas genommångfald för närvarande är överskattad: vissa gener som för närvarande tros vara förlorade i mikrosporidier är faktiskt bevarade, om än i mycket differentierade former;i stället tros vissa koda för mikrosporidiergener för maskspecifika proteiner (t.ex. det hypotetiska proteinet M970_061160) som faktiskt kodar för de mycket olika proteiner som finns i andra eukaryoter.
Detta fynd tyder på att rRNA-denaturering kan leda till en dramatisk förlust av sekvenskonservering i intilliggande ribosomala proteiner, vilket gör dessa proteiner omöjliga att upptäcka för homologisökningar.Således kan vi överskatta den faktiska graden av molekylär nedbrytning i små genomorganismer, eftersom vissa proteiner som tros vara förlorade faktiskt kvarstår, om än i mycket förändrade former.
Hur kan parasiter behålla funktionen hos sina molekylära maskiner under förhållanden med extrem genomreduktion?Vår studie besvarar denna fråga genom att beskriva den komplexa molekylstrukturen (ribosom) hos E. cuniculi, en organism med ett av de minsta eukaryota genomen.
Det har varit känt i nästan två decennier att protein- och RNA-molekyler i mikrobiella parasiter ofta skiljer sig från sina homologa molekyler i frilevande arter eftersom de saknar kvalitetskontrollcenter, reduceras till 50 % av sin storlek i frilevande mikrober, etc. .många försvagande mutationer som försämrar veckning och funktion.Till exempel förväntas ribosomerna från små genomorganismer, inklusive många intracellulära parasiter och endosymbionter, sakna flera ribosomala proteiner och upp till en tredjedel av rRNA-nukleotiderna jämfört med frilevande arter 27, 29, 30, 49. Men hur dessa molekyler fungerar i huvudsak i en mystery, studerade dock en stor genomik.
Vår studie visar att strukturen hos makromolekyler kan avslöja många aspekter av evolutionen som är svåra att extrahera från traditionella jämförande genomiska studier av intracellulära parasiter och andra värdbegränsade organismer (kompletterande fig. 7).Exempelvis visar exemplet med eL14-proteinet att vi kan överskatta den faktiska graden av nedbrytning av den molekylära apparaten hos parasitiska arter.Encefalitparasiter tros nu ha hundratals mikrosporidierspecifika gener.Men våra resultat visar att några av dessa till synes specifika gener faktiskt bara är väldigt olika varianter av gener som är vanliga i andra eukaryoter.Dessutom visar exemplet med msL2-proteinet hur vi förbiser nya ribosomala proteiner och underskattar innehållet i parasitiska molekylära maskiner.Exemplet med små molekyler visar hur vi kan förbise de mest geniala innovationerna i parasitiska molekylära strukturer som kan ge dem ny biologisk aktivitet.
Sammantaget förbättrar dessa resultat vår förståelse av skillnaderna mellan molekylstrukturerna hos värdbegränsade organismer och deras motsvarigheter i frilevande organismer.Vi visar att molekylära maskiner, som länge troddes vara reducerade, degenererade och utsatta för olika försvagande mutationer, istället har en uppsättning systematiskt förbisedda ovanliga strukturella egenskaper.
Å andra sidan tyder de icke skrymmande rRNA-fragmenten och sammansmälta fragmenten som vi hittade i ribosomer av E. cuniculi att genomreduktion kan förändra även de delar av det grundläggande molekylära maskineriet som finns bevarade i livets tre domäner – efter nästan 3,5 miljarder år .oberoende arternas utveckling.
De utbuktningsfria och sammansmälta rRNA-fragmenten i E. cuniculi-ribosomer är av särskilt intresse i ljuset av tidigare studier av RNA-molekyler i endosymbiotiska bakterier.Till exempel, i bladlössendosymbiont Buchnera aphidicola, har rRNA- och tRNA-molekyler visat sig ha temperaturkänsliga strukturer på grund av A+T-sammansättningsbias och en hög andel icke-kanoniska baspar20,50.Dessa förändringar i RNA, såväl som förändringar i proteinmolekyler, tros nu vara ansvariga för endosymbionters överberoende av partners och oförmågan hos endosymbionter att överföra värme 21, 23 .Även om parasitiska mikrosporidier rRNA har strukturellt distinkta förändringar, tyder naturen på dessa förändringar på att minskad termisk stabilitet och högre beroende av chaperoneproteiner kan vara vanliga egenskaper hos RNA-molekyler i organismer med reducerade genom.
Å andra sidan visar våra strukturer att parasitmikrosporidier har utvecklat en unik förmåga att motstå brett konserverade rRNA- och proteinfragment, och utvecklar förmågan att använda rikliga och lättillgängliga små metaboliter som strukturella efterliknande av degenererade rRNA- och proteinfragment.Nedbrytning av molekylär struktur..Denna åsikt stöds av det faktum att små molekyler som kompenserar för förlusten av proteinfragment i rRNA och ribosomer av E. cuniculi binder till mikrosporidispecifika rester i proteinerna uL15 och eL30.Detta tyder på att bindning av små molekyler till ribosomer kan vara en produkt av positiv selektion, där Microsporidia-specifika mutationer i ribosomala proteiner har valts ut för deras förmåga att öka ribosomernas affinitet för små molekyler, vilket kan leda till effektivare ribosomala organismer.Upptäckten avslöjar en smart innovation i mikrobiella parasiters molekylära struktur och ger oss en bättre förståelse för hur parasitmolekylära strukturer bibehåller sin funktion trots reduktiv evolution.
För närvarande är identifieringen av dessa små molekyler oklart.Det är inte klart varför utseendet av dessa små molekyler i den ribosomala strukturen skiljer sig åt mellan mikrosporidierarter.I synnerhet är det inte klart varför nukleotidbindning observeras i ribosomerna av E. cuniculi och P. locustae, och inte i ribosomerna av V. necatrix, trots närvaron av F170-resten i eL20- och K172-proteinerna i V. necatrix.Denna deletion kan orsakas av rest 43 uL6 (belägen intill nukleotidbindningsfickan), som är tyrosin i V. necatrix och inte treonin i E. cuniculi och P. locustae.Den skrymmande aromatiska sidokedjan av Tyr43 kan störa nukleotidbindning på grund av sterisk överlappning.Alternativt kan den uppenbara nukleotiddeletionen bero på den låga upplösningen av kryo-EM-avbildning, vilket hindrar modelleringen av V. necatrix ribosomala fragment.
Å andra sidan tyder vårt arbete på att processen med genomsönderfall kan vara en uppfinningsrik kraft.I synnerhet antyder strukturen av E. cuniculi-ribosomen att förlusten av rRNA och proteinfragment i mikrosporidieribosomen skapar evolutionärt tryck som främjar förändringar i ribosomstrukturen.Dessa varianter förekommer långt från det aktiva stället för ribosomen och verkar hjälpa till att upprätthålla (eller återställa) optimal ribosomsammansättning som annars skulle störas av reducerat rRNA.Detta tyder på att en stor innovation av mikrosporidieribosomen verkar ha utvecklats till ett behov av att buffra gendrift.
Kanske illustreras detta bäst av nukleotidbindning, som hittills aldrig har observerats i andra organismer.Det faktum att nukleotidbindande rester finns i typiska mikrosporidier, men inte i andra eukaryoter, tyder på att nukleotidbindande platser inte bara är reliker som väntar på att försvinna, eller det slutliga stället för rRNA att återställas till formen av individuella nukleotider.Istället verkar den här webbplatsen vara en användbar funktion som kunde ha utvecklats under flera omgångar av positivt urval.Nukleotidbindningsställen kan vara en biprodukt av naturligt urval: när ES39L väl bryts ned tvingas mikrosporidier att söka kompensation för att återställa optimal ribosombiogenes i frånvaro av ES39L.Eftersom denna nukleotid kan efterlikna de molekylära kontakterna av A3186-nukleotiden i ES39L, blir nukleotidmolekylen en byggsten i ribosomen, vars bindning förbättras ytterligare genom mutation av eL30-sekvensen.
När det gäller den molekylära utvecklingen av intracellulära parasiter, visar vår studie att krafterna från det darwinistiska naturliga urvalet och genetisk drift av genomsönderfall inte fungerar parallellt, utan oscillerar.För det första eliminerar genetisk drift viktiga egenskaper hos biomolekyler, vilket gör kompensation i hög grad nödvändig.Först när parasiter tillfredsställer detta behov genom darwinistiskt naturligt urval kommer deras makromolekyler att ha en chans att utveckla sina mest imponerande och innovativa egenskaper.Viktigt är att utvecklingen av nukleotidbindningsställen i E. cuniculi-ribosomen tyder på att detta förlust-till-vinst-mönster av molekylär evolution inte bara amorterar skadliga mutationer, utan ibland ger helt nya funktioner åt parasitära makromolekyler.
Denna idé överensstämmer med Sewell Wrights rörliga jämviktsteori, som säger att ett strikt system av naturligt urval begränsar organismernas förmåga att förnya51,52,53.Men om genetisk drift stör det naturliga urvalet kan dessa drifter producera förändringar som i sig inte är adaptiva (eller till och med skadliga) utan leder till ytterligare förändringar som ger högre kondition eller ny biologisk aktivitet.Vårt ramverk stödjer denna idé genom att illustrera att samma typ av mutation som minskar veckningen och funktionen hos en biomolekyl verkar vara den främsta utlösaren för dess förbättring.I linje med den vinn-vinn-evolutionära modellen visar vår studie att genomsönderfall, traditionellt sett som en degenerativ process, också är en viktig drivkraft för innovation, och ibland och kanske till och med ofta tillåter makromolekyler att förvärva nya parasitiska aktiviteter.kan använda dem.