Näringsupptagning och distribution integrerar insektssökning och livshistoria egenskaper. För att kompensera för brister i specifika näringsämnen i olika livsstadier kan insekter få dessa näringsämnen genom kompletterande utfodring, till exempel genom att livnära sig på sekret från ryggradsdjur i en process som kallas pölar. Myggan Anopheles kräver därför både malentrisk och arabisk metabolism. reproduktion. Syftet med denna studie var att bedöma om An.arabiensis agitation på kourin för näringsinsamling förbättrar livshistoriens egenskaper.
Se till att det är säkert.arabiensis attraherades av lukten av färsk, 24-timmars, 72-timmars och 168-timmars gammal ko-urin, och värdsökande och blodmatade (48 timmar efter blodmåltid) honor mättes i en Y-rörolfaktometer, och dräktiga kroppar användes sedan för att identifiera en kemisk kemisk förening för att identifiera en kemisk kroppsanalys och sedan utvärderades elektroaktiva kroppsanalyser. kourin i alla fyra åldersklasser. Syntetiska blandningar av bioaktiva föreningar utvärderades i Y-rör och fältförsök. För att undersöka kourin och dess huvudsakliga kvävehaltiga sammansättning urea som potentiella kompletterande dieter för malariavektorer, mättes utfodringsparametrar och livshistoria. Andelen kvinnliga myggor som absorberades av kvinnliga myggor och mängden kvinnliga myggor som absorberades av urin och mängden kvinnlig mygga bedömdes, och mängden kvinnliga myggor som absorberades och mängden kvinnlig urin. överlevnad, bunden flygning och reproduktion.
Sök efter värdens blod och näring. I laboratorie- och fältstudier drogs araberna till den naturliga och syntetiska doften av färsk och åldrad kourin. Gravida honor var likgiltiga för reaktioner från kourin vid lekplatser. Värdsökande och blodsugande honor absorberar aktivt kourin och histokarbamid i enlighet med dessa resurser och fysiologiska resurser för att byta ut, för allt liv, val, eller reproduktion.
Anopheles arabinis förvärv och distribution av kourin för förbättrade livshistoria egenskaper. Kompletterande utfodring av kourin påverkar vektorkapaciteten direkt genom att öka den dagliga överlevnaden och vektordensiteten, och indirekt genom att ändra flygaktiviteten och bör därför övervägas i framtida modeller.
Näringsupptagning och distribution integrerar insekternas födosök och livshistoria egenskaper [1,2,3]. Insekter kan välja och förvärva föda och utföra kompenserande utfodring baserat på födotillgänglighet och näringsbehov [1, 3]. Fördelningen av näringsämnen beror på den livshistoriska processen och kan leda till olika krav på dietkvalitet och -kvantitet i olika livsstadier i olika livsstadier [1]. När det gäller specifika näringsämnen kan insekter erhålla dessa näringsämnen genom kompletterande utfodring, såsom på lera, olika exkrementer och sekret från ryggradsdjur, och kadaver, en process som kallas vattenpölar [2]. Även om en mängd olika fjärils- och malarter i första hand beskrivs, förekommer vattenhål även i andra typer av insekter till liv och resurser och kan ha en betydande effekt på andra insektsorder och livsresurser, [2] 2, 4, 5, 6] ,7].Malariamyggan Anopheles gambiae sensu lato (sl) framträder som en "undernärd" vuxen [8], så vattning kan spela en viktig roll i dess livshistoria, men detta beteende har hittills försummats. Användningen av agitation som ett medel för att öka nutriologiska konsekvenser kan ha viktiga konsekvenser för detta.
Kväveintag hos vuxna kvinnliga Anopheles-myggor är begränsat på grund av låga kalorireserver som transporteras från larvstadiet och ineffektivt utnyttjande av blodmjöl [9]. Kvinna Ann.gambiae sl kompenserar vanligtvis för detta genom att komplettera med kompletterande blodmåltider [10, 11], vilket innebär att fler människor riskerar att drabbas av sjukdomen och utsätta mygganvändning i hög grad för att utfodra mygga. utsöndring av ryggradsdjur för att förvärva kvävehaltiga föreningar som förbättrar anpassning och flygmanövrerbarhet, vilket demonstreras av andra insekter [2]. I detta avseende är den starka och distinkta attraktionen hos en av syskonarterna inom An. Det gambiska sl-artkomplexet, Anopheles arabinis, färsk och åldrad kourin [12,13, är värd för dess företeelse] och är känd i värdtyp 4,13, är värd och förekomst. att umgås med och livnära nötkreatur. Kourin är en resurs rik på kvävehaltiga föreningar, med urea som står för 50-95 % av det totala kvävet i färsk urin [15, 16]. När kourin åldras, använder mikroorganismer dessa resurser för att minska komplexiteten hos kvävehaltiga föreningar inom 24 timmar, med en snabb ökning av nitrogenhalten på 24 timmar [15,c] de associerade organiska halterna. kalofila mikroorganismer (varav många producerar föreningar som är giftiga för myggor) trivs [15], vilket kan vara honan Ann.arabiensis är företrädesvis attraherad av urin som är 24 timmar eller mindre [13, 14].
I den här studien letade man efter värd- och blodmatade Ans. Under sin första gonadotropincykel utvärderades arabiensis för förvärv av kvävehaltiga föreningar, inklusive urea, genom urinblandning. Därefter genomfördes en serie experiment för att bedöma hur mygghonor allokerar denna potentiella näringsresurs för förbättrad överlevnad, återskapande av urin och ytterligare lukt. e utvärderades för att avgöra om dessa gav tillförlitliga ledtrådar för värd- och blodmatade An. I deras sökande efter denna potentiella näringsresurs upptäckte arabiensis kemiska korrelationer bakom den observerade differentiella attraktionskraften. Syntetiska luktblandningar av flyktiga organiska föreningar (VOC) identifierade i 24-timmars åldrad urin utvärderades ytterligare under laboratorie- och luktförhållandena under urinens förhållanden, utvärderades ytterligare under laboratorie- och luktförhållanden på urin. olika fysiologiska tillstånd.Myggattraktion. De erhållna resultaten bekräftar att An.arabiensis förvärvar och distribuerar kvävehaltiga föreningar som finns i urin från ryggradsdjur för att påverka livshistoriens egenskaper. Dessa resultat diskuteras i samband med potentiella epidemiologiska konsekvenser och hur de kan användas för vektorövervakning och kontroll.
Anopheles arabicans (Dongola-stam) hölls vid 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % relativ luftfuktighet och en 12:12 timmars ljus/mörkercykel. Larver föds upp i plasttråg (20 cm × 18 cm × 7 cm) fyllda med destillerat vatten och matades med Tetramin®-fisk, och matades med Tetramin®-fisk i WerkeP, DE. 0 ml koppar (Nolato Hertila, Åstorp, SE) och överfördes sedan till Bugdorm-burar (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) för att tillåta uppkomst av vuxna. Vuxna försågs med en 10 % sackaroslösning ad libitum fram till 4 dagar efter uppkomsten, varvid honan erbjöds värddödpunkten för natten eller döptes omedelbart (dpe- eller natt). bearbetat vatten före experimentet, enligt beskrivningen nedan. Honor som användes för flygrörsexperiment svaltades i endast 4-6 timmar med vatten ad libitum. För att förbereda blodsugande myggor för efterföljande bioanalyser försågs 4 dpe-honor med defibrotiskt fårblod (Håtunalab, Bro, SE) med hjälp av ett membranmatningssystem (Hemotekycc, UK) blev honan överförd till Workshop, A/S. individuella burar och gav diet direkt, enligt beskrivningen nedan, eller 10 % sackaros ad libitum i 3 dagar före experimenten som beskrivs nedan. De senare honorna användes för flygrörsbioanalyser och överfördes till laboratoriet och fick sedan destillerat vatten ad libitum i 4-6 timmar före experimentet.
Utfodringsanalyser användes för att kvantifiera urin- och ureakonsumtion hos vuxna anarabiska honor. Värdsökande och blodmatade honor fick en diet innehållande 1 % utspädd färsk och åldrad kourin, olika koncentrationer av urea och två kontroller (10 % sackaros och vatten) under 48 timmar. Dessutom 5 mg mlanicy-12 xylen 12 xylen 12 xylen 12 xylen; -1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) sattes till kosten och tillhandahölls i en 4 × 4 matris i 250 µl mikrocentrifugrör (Axygen Scientific, Union City, CA, USA; Figur 1A) Fyll till kanten (~300 µl). För att undvika konkurrens mellan myggor och potentiella färger på 1 cm i diameter av myggor och 1 cm av färg på 1 cm 6 cm i höjd; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figur 1A) i fullständigt mörker vid 25 ± 2 cm °C och 65 ± 5 % relativ luftfuktighet. Dessa experiment upprepades 5 till 10 gånger. Efter exponering för diet placerades myggor vid -20 °C tills vidare analys.
Leta efter bovint urin och urea som absorberas av värden och den blodsugande honan Anopheles arabianus. I utfodringsförsök (A) försågs mygghonor med en diet bestående av färsk och åldrad kourin, olika koncentrationer av urea, sackaros (10 %) och destillerat vatten (H2O). Värd-sökte blod som absorberades (B) inget annat blod från honan (B) som sökte mer av honan (B). te att värdsökande honor absorberade 72-timmars ko-urin mindre än 168-timmars ko-urin (B).Den genomsnittliga totala kvävehalten (± standardavvikelse) i urinen är representerad i insättningen.Värdsökande (D, F) och blodsugande (E, G) honor tar upp urea i en dosberoende volym från var och en annan (D-andras olika volymer (D-andra) olika (D-andra). sätt ANOVA med Tukeys post hoc-analys; p < 0,05). Felstaplar representerar standardfel för medelvärdet (BE). Den raka streckade linjen representerar den loglinjära regressionslinjen (F, G)
För att frigöra absorberad föda placerades myggor individuellt i 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 230 µl destillerat vatten och vävnaden bröts sönder med en engångsstöt och sladdlös motor (VWR International, Lund, SE), följt av centrifugering vid 10 krpm under 10 min. Supernatanten överfördes till a-µl-90 mikrobrunn (200 mikrobrunn) rik) och absorbans (λ620) bestämdes med användning av en spektrofotometerbaserad mikroplattläsare (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternativt maldes myggorna i 1 ml destillerat vatten, varav 900 µl överfördes till en kyvettanalys för kyvett2 spec (1,0m 0,0m; , Kista, SE). För att kvantifiera kostintaget, framställdes en standardkurva genom serieutspädning för att ge 0,2 µl till 2,4 µl 1 mg ml-1 xylencyanid. Sedan användes den optiska densiteten för kända färgämneskoncentrationer för att bestämma mängden mat varje mygga intog.
Volymdata analyserades med användning av envägsvariansanalys (ANOVA) följt av Tukeys post hoc parvisa jämförelser (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). Linjära regressionsanalyser beskrev koncentrationsberoende ureaintag och jämförde mygg-värds-sucking respons mellan Prism-hosts. 0 för Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Ungefär 20 µl urinprover från varje åldersgrupp bands på Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) och inkapslades i tennkapslar (8 mm × 5 mm). Kapslar sattes in i förbränningskammaren i en CHNS/O-analysator Fish0, MA20 Fish0, MA, Scientificer , USA) för att bestämma kvävehalten i färsk och åldrad urin enligt tillverkarens protokoll. Totalt kväve (g N l-1) kvantifierades baserat på kända ureakoncentrationer som används som standard.
För att bedöma effekten av kosten på värdsökande och blodsugande kvinnlig överlevnad placerades myggor individuellt i stora petriskålar (12 cm i diameter och 6 cm på höjden; Semadeni) med ett nättäckt hål i locket (3 cm i diameter) med För ventilation och matförsörjning. Dieter tillhandahölls direkt efter 4 dpe och inkluderade 1% utspädd koncentration av urin, 1 utspädd urin, 1 1 0 % sackaros och vatten. Varje diet pipetterades på en tandtampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) som sattes in i en 5 ml spruta (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), kolven togs bort och placerades ovanpå en petriskål (figur 1).1A). två gånger om dagen, medan döda myggor kasserades tills den sista myggan dog (n = 40 per behandling). Överlevnad av myggor som matats på olika dieter analyserades statistiskt med hjälp av Kaplan-Meyers överlevnadskurvor och log-rank tester för att jämföra överlevnadsfördelning mellan dieter (IBM SPSS Statistics 0.04).
En skräddarsydd myggkvarn baserad på Attisano et al.[17], gjord av 5 mm tjocka klara akrylpaneler (10 cm breda x 10 cm långa x 10 cm höga) utan främre och bakre paneler (Fig. 3: topp). En svängningsenhet med ett vertikalt rör tillverkat av en gaskromatografikolonn (0,275 mm hänger upp en ända till L). ett par neodymmagneter med 9 cm mellanrum. Ett horisontellt rör tillverkat av samma material (6,5 cm L) delade det vertikala röret för att bilda en förankrad arm och en arm som bar en liten bit aluminiumfolie som en ljusavbrytande signal.
24-timmarssvältade honor gavs ovanstående diet i 30 minuter före fasthållning. Fullmatade mygghonor sövdes sedan individuellt på is i 2-3 minuter och fästes på insektsnålar med bivax (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) och bands sedan till armarna på en horisontellt bruks-revolution. r, lagrades och visades sedan med PC-Lab 2000™-mjukvaran (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Flygkvarnen placerades i ett klimatreglerat rum (12 h:12 h, ljus: mörkt, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
För att visualisera mönstret för flygaktivitet, beräknades den totala flygsträckan (m) och det totala antalet på varandra följande flygaktiviteter per timme under en 24-timmarsperiod. Dessutom jämfördes de genomsnittliga sträckorna som flugits av individuella kvinnor över behandlingar och analyserades med envägs ANOVA och Tukeys post hoc-analys (JMP Pro, v14.0.0), där SAS var beroende av institutet som en varierande faktor, medan den var beroende av institutets behandling. , det genomsnittliga antalet omgångar beräknas i 10-minuterssteg.
För att bedöma effekten av kosten på reproduktionsförmågan hos An.arabiensis överfördes sex honor (4 dpe) direkt till Bugdorm-burar (30 cm × 30 cm × 30 cm) efter blodinsamling och gav sedan den experimentella dieten i 48 timmar enligt beskrivningen ovan. Dieter togs sedan bort och lekkoppar (30 ml; Nolato destillerades med vatten under 8 timmar under 8 timmar) , byts var 24:e timme. Upprepa varje kostregim 20-50 gånger. Ägg räknades och registrerades för varje experimentbur. Delprover av ägg användes för att bedöma genomsnittlig storlek och längdvariation av individuella ägg (n ≥ 200 per diet) med hjälp av ett Dialux-20 mikroskop (WeFC Camera, DM1000; 20 R2;Leica Microsystems Ltd., DE). De återstående äggen hölls i ett klimatkontrollerat rum under standarduppfödningsförhållanden i 24 timmar, och ett delprov av nyligen uppkomna larver från första stadium (n ≥ 200 per diet) mättes, enligt beskrivningen ovan. Antalet ägg och storleken på ägg och larver jämfördes med engångsbehandlingar AJNO, Pro v4c och Tukey' NO, Pro v4c. 0,0, SAS Institute Inc.).
Flyktiga ämnen i huvudutrymmet från färsk (1 timme efter provtagning), 24 timmars, 72 timmars och 168 timmars åldrad urin samlades in från prover som samlats in från Zebu-boskap, Arsi-raser. För enkelhetens skull togs urinprover tidigt på morgonen medan korna fortfarande var i ladugården. Urinprover togs från 000 ml individuella prover av polyamid till varje individuellt bakverk. påsar (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) i 3 l polyamid med lock I vinylkloridplastfat. Flyktiga ämnen i huvudutrymmet från varje urinprov från nötkreatur samlades antingen direkt (färskt) eller efter mognad vid rumstemperatur i 24 timmar, 72 timmar och 168 timmars representativa urinprov i varje urinprov.
För insamling av flyktiga ämnen i huvudutrymmet användes ett slutet system för att cirkulera en aktivt kolfiltrerad gasström (100 ml min-1) genom en polyamidpåse till adsorptionskolonnen i 2,5 timmar med hjälp av en membranvakuumpump (KNF Neuberger, Freiburg, DE).Som kontroll utfördes headspace-uppsamlingen från en tom 5 mm teflon-påse av polyamid. id) innehållande 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) mellan glasullspluggar. Innan användning spolades kolonnen med 1 ml omdestillerad n-hexan (Merck, Darmstadt, DE) och 1 ml pentan (99,0% kvalitet, rena lösningsmedelsrika GC) med Sigma 00-sorbenter. μl pentan. Headspace-samlingar slogs samman och lagrades sedan vid -20°C tills de användes för vidare analys.
Beteendereaktioner hos värdsökande och blodätande An.Headspace-flyktiga extrakt som samlats in från färsk, 24-timmars, 72-timmars och 168h-åldrad urin analyserades med avseende på flyktiga extrakt från Arabidopsis-myggor med hjälp av en rak olfaktometer av glasrör [18]. Experimenten utfördes under ZT-1-aktiviteten under 13-1 försöken i hemmet. [19].En olfaktometer av glasrör (80 cm × 9,5 cm id) belystes med 3 ± 1 lx rött ljus från ovan. Träkolfiltrerat och fuktat luftflöde (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % relativ fuktighet) passerade bioanalysen vid 30 cm rött flöde och skapade en 30 cm lång skärm av stål och en laminerad skärm. enhetlig plymstruktur.Dental tampongdispenser (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), upphängd i en 5 cm spole på olfaktometerns lovartände, med stimulatorbyten var 5:e minut.För analys användes 10 μl av varje headspace-extrakt, utspätt 1:10, som en värddator eller en lika stor mängd blodstimulering. Uggande myggor placerades i individuella utsläppsburar 2-3 timmar innan experimentets början. Utsläppsburen placerades på olfaktometerns medvindssida och myggorna fick acklimatisera sig i 1 min, och sedan öppnades burens fjärilsventil för att släppa. Attraktion till behandling eller kontroll analyserades som andelen av källan för utsläpp av mygga inom 5 minuter i kontakt med mygga och 5 minuter. replikerades minst 30 gånger, och för att undvika effekterna av en dag testades samma antal behandlingar och kontroller på varje experimentdag. Sök svar från värd- och blodmatade Ans. Arabic kontra headspace-uppsättningar analyserades med hjälp av nominell logistisk regression följt av parvisa jämförelser för udda förhållanden (JMP.0 Institute Inc., v4AS).
Ans lekrespons. Headspace-extrakt från färsk och åldrad kourin analyserades i Bugdorm-burar (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Plastmuggar (30 ml; Nolato Hertila) fyllda med 20 ml destillerat vatten gav leksubstratet och placerades 24 cm från varandra i det motsatta hörnet. med 10 μl av varje headspace-extrakt i en utspädning av 1:10. En lika stor mängd pentan användes för att justera kontrollkoppen. Behandlings- och kontrollkoppar byttes ut mellan varje experiment för att kontrollera positionseffekter. Tio blodmatade honor släpptes i experimentburar vid ZT 9-11 och ägg i koppar räknades efter 24 timmars antal ägg efter formeln för äggräkningen. läggs i behandlingsbägaren – antalet ägg som lagts i kontrollbägaren)/(det totala antalet ägg som lagts). Varje behandling upprepades 8 gånger.
Gaskromatografisk och elektronantennmönsterdetektering (GC-EAD) analys av kvinnlig An.arabiensis utfördes som tidigare beskrivits [20]. Kortfattat separerades färska flyktiga extrakt från headspace med hjälp av en Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, US) utrustad med en HP-5-kolonn (305 mm × 50 mm tjocklek, A 205 mm × 5 0). ).och åldrande urin. Väte användes som den mobila fasen med en genomsnittlig linjär flödeshastighet på 45 cm s-1. Varje prov (2 μl) injicerades i 30 sekunder i splitless-läge med en inloppstemperatur på 225 °C. GC-ugnstemperaturen programmerades från 35 °C (3 minuters uppehåll) till 300 minuter uppehåll °C vid 10 min. °C vid 10 min. 4 psi kväve tillsattes och delades upp 1:1 i ett Gerstel 3D/2 lågdödvolymkorsning (Gerstel, Mülheim, DE) mellan flamjoniseringsdetektorn och EAD. GC-avloppskapillären för EAD leddes genom en Gerstel ODP-2-överföringsledning, som spårar GC-ugnens temperatur med 0 cm x 8 mm, inblandad i ett glasrör, - 1 mm. fuktad luft (1,5 l min−1). Antennen placerades 0,5 cm från rörets utlopp. Varje enskild mygga stod för ett replikat och för värdsökande myggor gjordes minst tre replikat på urinprover i varje ålder.
Identifiering av bioaktiva föreningar i headspace-samlingar av färsk och åldrad nötkreatursurin med en kombinerad GC och masspektrometer (GC-MS; 6890 GC och 5975 MS; Agilent Technologies) för att framkalla antennsvar i GC-EAD-analys, som arbetar i elektronstötjoniseringsläge vid 70 HP-silja caps eV. (60 m × 0,25 mm innerdiameter, 0,25 μm filmtjocklek) med helium som den mobila fasen med en genomsnittlig linjär flödeshastighet på 35 cm s-1. Ett 2 μl prov injicerades med samma injektorinställningar och ugnstemperatur som för GC-EAD-analysen. Föreningar identifierades baserat på deras spectra retentionstid och libr index för N och jämfördes med deras spectra index och libr 4 (anpassad massan) ary (Agilent). Identifierade föreningar bekräftades genom att injicera autentiska standarder (Ytterligare fil 1: Tabell S2). För kvantifiering injicerades heptylacetat (10 ng, 99,8 % kemisk renhet, Aldrich) som en extern standard.
Utvärdering av effektiviteten av en syntetisk luktblandning bestående av bioaktiva föreningar identifierade i färsk och åldrad urin för att locka till sig värdsökande och blodsugande Ans.arabiensis, med samma olfaktometer och protokoll som ovan. Syntetiska blandningar efterliknade sammansättningen och proportionerna av föreningar i blandade flyktiga extrakt av flyktiga huvudutrymmen av färska, 4-8 timmar, 7-4 timmar, 8 timmar -timmesåldrad urin (Figur 5D-G; Ytterligare fil 1: Tabell S2). För analys, använd 10 μl av en 1:100 utspädning av den helsyntetiska blandningen, med en total frisättningshastighet som sträcker sig från cirka 140-2400 ng h-1, för att bedöma attraktionskraften för värd- och blodsugande blandningen utförs på den fullständiga blandningen av myggor, som suger blod. enstaka föreningar av den kompletta blandningen avlägsnas. Sök svar från värd och blodmatade Ans. Arab vs syntetiska och subtraktiva blandningar analyserades med hjälp av nominell logistisk regression följt av parvisa jämförelser för udda förhållanden (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
För att bedöma om kourin skulle kunna fungera som värdhabitat för malariamyggor, samlades färsk och åldrad kourin, som beskrivits ovan, och vatten i maska ​​3 l hinkar (100 ml) och placerades i värdbetesfällor.(BG-HDT-version; BioGents, Regensburg, DE). Tio fällor placerade 50 m från varandra i betesmarker, 400 m från bysamhället (Silay, Etiopien, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) och inga nötkreatur, på permanenta häckningsplatser och byar. Fem fällor fanns kvar för att efterlikna en fälla som var värd för att simulera en fälla. roteras varje natt under totalt fem nätter. Myggantal som fångats i fällor som betats med urin av olika åldrar jämfördes med logistisk regression med en beta-binomialfördelning (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
I en malaria-endemisk by nära staden Maki, Oromia-regionen, Etiopien (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figur 6A). Studien genomfördes mellan mitten av augusti och mitten av september före den årliga kvarvarande inomhusbesprutningen, tillsammans med 0 m långa regnperioder på 50 m från varandra. utkanten av byn valdes ut för studien (Fig. 6A). Kriterierna som användes för att välja ut husen var: inga djur tillåtna i huset, ingen matlagning inomhus (att rita ved eller träkol) var tillåten (åtminstone under försöksperioden), och hus med högst två invånare, sovande i insekticider.under det behandlade myggnätet.Etiskt godkännande har beviljats ​​av Institutional Research Ethics Review Board (IRB/022/2016) vid Naturvetenskapliga fakulteten (CNS-IRB), Addis Abeba University, i enlighet med riktlinjerna som fastställts av World Medical Associations deklaration i Helsingfors. Samtycke från varje hushållschef erhålls av personalen i hela distriktet och distriktsadministrationen erhölls av distriktsadministrationen. 'kebele') nivå. Den experimentella designen följde en 2 × 2 latinsk kvadratisk design, där syntetiska blandningar och kontroller tilldelades parade hus den första natten och byttes mellan husen nästa experimentnatten. Denna process upprepades tio gånger. Dessutom, för att uppskatta myggaktiviteten i utvalda hus, sattes CDC-fällorna i början av dagen, mittennatten i fältet vid samma tidpunkt, mittennatten i fältet vid samma tidpunkt, tre gånger i följd.
En syntetisk blandning innehållande sex bioaktiva föreningar löstes i heptan (97,0 % lösningsmedel GC-kvalitet, Sigma Aldrich) och släpptes vid 140 ng h-1 med användning av en dispenser för bomullsveke [20]. Vekens dispenser tillät alla föreningar att frigöras i konstanta proportioner under 12 timmars experimentet. Control and Prevention (CDC) ljusfälla (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; Figur 6A). Fällorna hängdes 0,8 – 1 m över marken, nära foten av sängen, och en frivillig sov under ett obehandlat myggnät och opererades mellan kl. 18.00 och 06.30. , och gravida [21] screenades därefter med användning av polymeraskedjereaktion (PCR)-analys för att identifiera arten morfologiskt identifierad som A. gambiae sl. Medlemmar av komplexet [23]. I fältstudien analyserades fångst av parade hus med användning av en nominell logistisk passformsmodell, där attraktionen var den beroende variabeln och behandlingen (J. 4) var den beroende variabeln och behandlingen (J.)0. SAS Institute Inc.).Här rapporterar vi χ2- och p-värdena från sannolikhetsförhållandetestet.
Utvärdera om det är säkert.arabiensis kunde erhålla urin, dess huvudsakliga kvävekälla, urea, genom direkt utfodring, inom 48 timmar efter administrering under 4 dagar efter (dpe) värdsökande och blodmatade kvinnliga utfodringsförsök (Fig. 1A). Både värdsökande och blodsugande honor absorberade signifikant mer sackaros, <5 p. 0,0001 och F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, respektive; Fig. 1B,C).Vidare åt värdsökande honor mindre i urin vid 72 timmar jämfört med urin vid 168 timmar (Fig. 1B).När de erbjöds en diet som innehöll 6 M urea, absorberade honan en betydande mängd 6 M urea. jämfört med alla andra koncentrationer och vatten, även om det inte går att särskilja från 10 % sackaros (F(10 813) = 15,72, p < 0,0001; figur 1D). Detta var i motsats till svaret från blodmatade honor, som vanligtvis absorberade signifikant mer dieter innehållande urea än vatten, om än 50 (7) % sukros, om än 50 (7) % mindre än vatten. 5, p < 0,0001; Figur 1).1E). Vid jämförelse mellan de två fysiologiska tillstånden, absorberade flebotomiserade honor mer urea än värdsökande honor vid de lägsta koncentrationerna, och dessa honor absorberade liknande mängder urea vid högre koncentrationer (F(1,953,08)= 01,08;Fig. 1F, G). Även om intag från en diet innehållande urea verkade ha optimala värden (Fig. 1D, E), kunde honor i båda fysiologiska tillstånden modulera mängden urea som absorberades över hela intervallet av ureakoncentrationer på ett log-linjärt sätt (Fig. 1F, G).). På liknande sätt verkar myggor kontrollera sitt kväveupptag genom att reglera mängden urin som absorberas, eftersom mängden kväve i urinen återspeglas i den absorberade mängden (figur 1B, C och B).
För att bedöma effekterna av urin och urea på överlevnad av värdsökande och blodsugande myggor, matades honor med urin i alla fyra åldrarna (färskt, 24 timmar, 72 timmar och 168 timmar efter avsättning) och en rad ureakoncentrationer, såväl som destillerat vatten och 10 % sackaros hade en signifikant effekt på överlevnadsanalysen (Figur överlevde överlevnadsanalys 2A). vival hos värdsökande honor (urin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) och blodmatade honor (urin: χ,02, d = 9,02, p = 0,02, d = 9,02, p. χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Figur 2D,E).I alla experiment hade kvinnor som fick en diet med urin, urea och vatten signifikant lägre överlevnadsfrekvens jämfört med kvinnor som fick en sackarosdiet (Figur 2B-E). h gammal urin (p = 0,016) med den lägsta sannolikheten för överlevnad (Fig. 2B). Vidare överlevde värdsökande honor som matades med 135 mM urea längre än vattenkontroller (p < 0,04) (Fig.2C). Jämfört med vatten överlevde kvinnor som matades med färsk urin och 24-timmarsurin längre (p = 0,001 respektive p = 0,012; Figur 2D), medan kvinnor som matades med 72-timmarsurin överlevde längre än de som fick kvinnlig kort färsk urin och 24 timmars ålder < 1,0 p.0 p. e 2D). När de fick 135 mM urea överlevde honor som matades med blod längre än alla andra koncentrationer av urea och vatten (p < 0,013; Figur 2E).
Överlevnad av värd- och blodsugande hona Anopheles arabinis som livnär sig på kourin och urea. I bioanalysen (A) fick honmyggor en diet bestående av färsk och åldrad kourin, olika koncentrationer av urea, sackaros (10 %) och destillerat vatten (H2O). Överlevnaden av värdssökande (B, C) och blodsocker (E-D) registrerade blod (B, C) 2 timmar tills alla honor som matats med urin (B, D) och urea (C, E) och kontroller, sackaros och vatten, är döda
Det totala avståndet och antalet omgångar som bestämdes i flygkvarnstestet under en 24-timmarsperiod skilde sig mellan värdsökande och blodsugande myggor, som visade mindre flygaktivitet totalt sett (Fig. 3). Värdsökande myggor som gav färsk och åldrad urin eller sackaros och vatten visade distinkta flygmönster vid dawn, medan de som födas av honan var mer aktiva vid dawn (Fig. 2). 4- och 168-timmarsåldrade myggor som matades på urin uppvisade olika flygmönster och var i första hand dagaktiva. Myggor av honkön som gav sackaros eller 72-timmarsurin visade aktivitet under 24-timmarsperioden, medan honor som gav vatten var mer aktiva under mitten av perioden. Myggor uppvisade den högsta aktiviteten på morgonen och på morgonen och på morgonen. 72-timmarsåldrad urin upplevde en stadig nedgång i aktivitet under 24 timmar (Figur 3).
Flygprestanda för jägaresökande blodsugande hona Anopheles arabinis som livnär sig på kourin och urea.I testet på flygkvarnen var mygghonor utfodrade med färsk och åldrad ko-urin, olika koncentrationer av urea, sackaros (10%) och destillerat vatten (H2O) tjudrade till horisontellt, fritt roterande blod (för värd och fritt roterande armar). , det totala avståndet och antalet flygningar per timme för varje diet under en 24-timmarsperiod registrerades (mörkt: grått; ljust: vitt). Genomsnittligt avstånd och genomsnittligt antal matcher visas till höger om dygnsaktivitetsdiagrammet. Felstaplar representerar standardfel för medelvärdet. Statistisk analys se text
I allmänhet följde den totala flygaktiviteten för värdsökande honor ett mönster som liknade flygdistansen under en 24-timmarsperiod. Medelflygdistansen påverkades signifikant av diet som intogs (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), och värdsökande honor fick i sig 72 timmars urin och flög signifikant längre avstånd (0,0), jämfört med alla andra avstånd från 0,0 gånger. utfodrade myggor flög längre än färska (p = 0,022) och 24-timmarsåldrade urin- (p = 0,022)-matade myggor. I motsats till flygaktivitetsmönstret som beskrivs av urindieten, uppvisade ureamatade värdsökande honor en ihållande flygaktivitet under en 24-timmarsperiod under andra halvan av mörka aktivitetsmönstret (fig. Sökande honor som matades med urea ökade signifikant medelflygdistansen beroende på den absorberade koncentrationen (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Värdsökande honor som matades med någon koncentration av urea flög längre än honor som fick antingen vatten eller sackaros (p < 0,03).
Den övergripande flygaktiviteten för blodsugande myggor var stabil och upprätthölls under 24 timmar över alla dieter, med ökad urinaktivitet under andra halvan av mörkerperioden för honor som matades med vatten såväl som hos honor som matades färska och 24 timmar gamla (bild 3). Medan urindieten signifikant påverkade det genomsnittliga flygavståndet hos blodmatade honor (F = 38(5, 01), dör 38(5, 01). t gjorde det inte (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24).
Effekterna av urin- och ureamatning på reproduktionsparametrar utvärderades i äggläggningsbioanalyser (Figur 4A) och undersöktes enligt antalet ägg som lagts av varje hona, äggstorlek och nykläckta larver i första stadium. Antalet ägg som lades. Urinmatade arabiska honor varierade med diet (F. 4B). Kvinnor som fick 24-timmars urin, blodmjöl lade betydligt fler ägg än honor som fick annan urindieter och liknade de som fick sackaros (Fig. 4B). Likaså varierade storleken på ägg som lades av honor som urinmatades efter diet (F(5, 209) = 120.0, -0, 0, 0, 128. utfodrade honor som lägger signifikant större ägg än vattenmatade honor, medan äggen från honor som utfodrats med 168 timmar urin var signifikant mindre (Fig. 4C). Dessutom påverkade urindieten signifikant larvstorleken (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), med signifikant 4-2 larvar och 4-2 larvar. gamla urinmatade honor än från ägg som läggs från ägglarver.Vattenmatade och 168-h urinmatade honor (Figur 4D).
Reproduktionsförmåga hos kvinnliga Anopheles arabinis som livnär sig på kourin och urea. Blodmatade myggor av honkön utfodrades med dieter bestående av färsk och åldrad kourin, olika koncentrationer av urea, sackaros (10%) och destillerat vatten (H2O) i 48 timmar innan de placerades i bioanalyser (Egg-storlek A, äggstorlek A, 4 timmar, äggstorlek A, B). , F) och larverstorlek (D, G) påverkades signifikant av den kost som gavs (kourin: BD; urea: EG). Medelvärden för varje parameter mätt med olika bokstavsnamn skilde sig signifikant från varandra (envägs ANOVA med Tukeys post hoc-analys; p < 0,05). Felstaplar representerar standardfel för medelvärdet
Som den huvudsakliga kvävehaltiga komponenten i urinen, urea, när den tillfördes som en diet till honor som matats med blod, påverkade reproduktionsparametrarna signifikant i alla studier. Antalet ägg som lades av honor som matades med urea, efter en blodmåltid, beroende på ureakoncentrationen (F(11, 360) = 4,69; p < 1,00 s mellan 0,00 honor, 3M och 1,000. 34 mM lade fler ägg (Figur 4E). Honor som matats med ureakoncentrationer på 134 µM eller högre lägger större ägg än honor som matats med vatten (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figur 4F), och larvstorlekar på 31,00 i mor, även om de är påverkade av 31 urea (31, 31) p < 0,0001) var mer variabel (Fig. 4G).
Övergripande attraktionskraft för värdsökande flyktiga extrakt av nöturin i huvudutrymmet. Arabiensen som bedömdes i glasrörets olfaktometer (Fig. 5A) påverkades signifikant av urinåldern (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Fig. 5B orsakade en signifikant högre urinhalt vid analys av lukten vid 24 timmar). jämfört med alla andra behandlingar (72 timmar: p = 0,0060, 168 timmar: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), med undantag för lukten av färsk urin (p = 0,13; figur 5B). Även om den övergripande attraktionen av blodsugande myggor inte var signifikant olik urin =2 df,8 lukt = χ df,8 0,067; Fig. 5C), befanns dessa honor vara signifikant mer attraktiva för flyktiga extrakt från headspace jämfört med 72 timmars åldrad urin jämfört med kontroller (p = 0,0066; Figur 5C).
Beteendereaktioner på naturliga och syntetiska kourinlukter i sökandet efter värd- och blodmatade Anopheles arabianus. Schematisk beskrivning av glasrörets olfaktometer (A).Attraktion av flyktiga extrakt från headspace från färsk och åldrad ko-urin till värd (B) och blodsugande (C) myggor.Hitta (Färska tältmyggor) och (D)-reaktionen från Lord tältar. -timmar (E), 72-timmars (F) och 168-timmars (G) åldrad kourin visas. Elektronantenndetektering (EAD)-spår visar spänningsförändringar som svar på bioaktiva föreningar i headspace som elueras från gaskromatografen och detekteras av en flamjoniseringsdetektor bar (FID). s (µg h-1) av de biologiskt aktiva föreningarna visas.En enstaka asterisk (*) indikerar ett konsekvent lågamplitudsvar.Dubbla asterisker (**) indikerar oreproducerbara svar.Hitta värden (H) och den blodsugande (I) An.arabiensis har olika dragningskrafter till syntetiska blandningar av urin med olika dofter av färska och åldrade ko, olika namn från myggor till olika dofter av färsk och åldrad ko. varandra (envägs ANOVA med Tukeys post hoc-analys;p < 0,05). Felstaplar representerar standardfel på skalan
Hona Ann.arabiensis, 72 timmar och 120 timmar efter blodmåltid, under leken, visades ingen preferens för flyktiga extrakt från headspace från färsk och åldrad kourin jämfört med pentankontroller (χ2 = 3,07, p > 0,05; Ytterligare fil 1: Fig. S1).
För kvinnliga Ann.arabiensis, GC-EAD och GC-MS analyser identifierade åtta, sex, tre och tre bioaktiva föreningar (Figur 5D-G). Även om skillnader i antalet föreningar som framkallade elektrofysiologiska svar observerades, fanns de flesta av dessa föreningar närvarande i varje flyktigt extrakt i headspace som samlats in från färsk och åldrad förening av urin, för varje kvinnlig förening som endast producerade den ovanstående fysiologiska föreningen. tröskeln ingick i ytterligare analyser.
Den totala flyktiga frisättningshastigheten av bioaktiva föreningar i headspace-samlingen ökade från 29 µg h-1 i färsk urin till 242 µg h-1 i 168-timmars åldrad urin, främst på grund av p-kresol och m-formaldehyd Fenol ökar såväl som fenol. Däremot minskar frisättningshastigheterna för 1, cyklon- och urinföreningar, t.ex. ålder, vilket korrelerade med den observerade minskningen i signalintensitet (överflöd) i kromatogrammet (Fig. 5D)-G vänstra panelen) och fysiologiska svar på dessa föreningar (Fig. 5D-G högra panelen).
Sammantaget hade den syntetiska blandningen ett liknande naturligt förhållande av bioaktiva föreningar identifierade i flyktiga extrakt av färska och åldrade urinhuvudutrymmen (Fig. 5D–G) och verkade inte locka fram någon signifikant dragningskraft i sökandet efter en värd (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Fig. 5H) eller mygga, 4, 2, mygga, 4,9 Emellertid visade post hoc parvisa jämförelser mellan behandlingar att värdsökande myggor var signifikant attraktiva för den syntetiska blandningen av 24-timmars åldrad urin jämfört med pentankontroller (p = 0,0086; figur 5H).
För att bedöma rollen av individuella komponenter i syntetiska blandningar av 24-timmars åldrad urin utvärderades sex subtraktiva blandningar mot kompletta blandningar i Y-rörsanalysen, där enskilda föreningar togs bort. För värdsökande myggor hade subtrahering av enskilda föreningar från den kompletta blandningen en signifikant effekt på beteenderesponser (χ2 = 19,60 fil: S = 19,60; 2A), var alla subtraktiva blandningar mer attraktiva än mindre än helt blandade. Däremot påverkade borttagning av enskilda föreningar från den helsyntetiska blandningen inte beteendereaktionerna hos blodsugande myggor (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), med undantag av dekanalnivåer, vilket resulterade i lägre blandningsnivåer på 2 0 (2) B).
I en malaria-endemisk by i Etiopien utvärderades effekten av en syntetisk blandning av 24-timmars kourin för att locka myggor under fältförhållanden under tio nätter (Fig. 6A). Totalt fångades och identifierades 4 861 myggor, varav 45,7 % var Anthropus, 3 % Anthropus och 5 % Anthropus. ,4 % var Culex spp.(Ytterligare fil 1: Tabell S1). Anopheles arabinis är den enda medlemmen av An.Gambian artkomplex som identifierats genom PCR-analys. I genomsnitt fångades 320 myggor per natt, under vilken tidsfällor med syntetiska blandningsbeten fångade fler myggor än parade fällor utan blandning, χ,0129 (χ,0129) = .0129 (χ. ). Icke-betade fällor sattes ut på var och en av de fem kontrollnätterna i början, mitten och slutet av försöket. Liknande antal myggor fångades in i varje par av fällor, vilket tyder på att det inte finns någon snedvridning mellan husen (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05 antal myggor under studieperioden av kontrollperioden och ingen fälla av myggor. fångad i fällorna som innehöll den syntetiska blandningen ökade signifikant: värdsökning (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), nyligen genomförd blodmatning (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) och graviditet (χ2,0,0,28) = 26,0, 0,26;Ytterligare fil 1: Tabell S1). Detta återspeglas också i det totala antalet infångade myggor: värd söker > blodsugande > gravid > halvgravid > hane.
Fältutvärdering av effektiviteten av en 24-timmars syntetisk kourinluktblandning. Fältförsök genomfördes i södra centrala Etiopien (karta), nära staden Maki (bifoga), med hjälp av en Centers for Disease Control (CDC) ljusfälla (höger) i parade hus, med en latinsk fyrkantig design (flygbild av cd-filmen) (Aerial image) (Aerial image) (Aerial bild) (Aerial-rapheltes). besques (B), men inte Anopheles farroes (C), på ett annat sätt, en fysiologiskt tillståndsberoende effekt.Dessutom fångade dessa fällor ett signifikant ökat antal av värdmyggorna från Culex.(D) Jämfört med kontroll. Staplarna till vänster representerar det genomsnittliga urvalsindexet för myggor som fångats i par av luktmedelsfällan och kontroll (öppen)0 medelvärde för doftfällan och kontroll (N) index i par av kontrollfällor (öppna; N = 5).).Asterisker indikerar statistiska signifikansnivåer (*p = 0,01 och ***p < 0,0001)
De tre arterna fångades olika i fällor som innehöll syntetiska blandningar. Letar efter värd (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), blodmatning (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) och graviditet (χ1801, 0,01, 0,01) = χ112,0) = 6,01,0 .arabiensis fångades i fällan som släppte den syntetiska blandningen (Fig. 6B), medan mängden An inte skiljde sig. Pharoensis i olika fysiologiska tillstånd hittades (Fig. 6C). För Culex hittades endast en signifikant ökning av antalet myggor som sökte värdar i fällor som betats med den syntetiska blandningen (13129) (13129) (13129; 6D), jämfört med kontrollfällor.
Värdbetesfällor placerade utanför potentiella värdar mellan uppfödningsplatser och landsbygdssamhällen i Etiopien användes för att bedöma om malariamyggor använder kourinlukt som en värdhabitatsignal. I avsaknad av värdsignaler, värme och med eller utan närvaro av kourinlukt fångades inga myggor (Figur över kvinnlig temperatur i närvaro av kourin S3 1: hög temperatur av kvinnlig urin och kvinnlig doft S31). ariamyggor attraherades och fångades, om än i små antal, oberoende av urinens ålder (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Ytterligare fil 1: Figur S3). Däremot fångade inte vattenkontroller malariamyggor vid höga temperaturer (Ytterligare fil 1: Figur S3).
Malariamyggor förvärvar och distribuerar kvävehaltiga föreningar genom kompenserande utfodring av kourin (dvs. pölar) för att förbättra livshistoriska egenskaper, liknande andra insekter [2, 4, 24, 25, 26]. Kourin är en lättillgänglig förnybar resurs som är nära förknippad med malariamyggor, t.ex. .Mygghonor lokaliserar denna resurs genom lukt och kan reglera upptaget av kvävehaltiga föreningar i urinen, inklusive urea, den huvudsakliga kvävehaltiga komponenten i urinen [15, 16]. Beroende på mygghonans fysiologiska tillstånd, tilldelas näringsämnen i urinen för att förbättra värdaktiviteten och överlevnadsaktiviteten och överlevnadsaktiviteten hos honmyggor och överlevnad av myggor. egenskaper hos blodmatade individer under den första gonadotropa cykeln.Därför spelar urinblandning en viktig näringsmässig roll för malariavektorer som är stängda som undernärda vuxna [8], eftersom det ger mygghonor förmågan att förvärva viktiga kvävehaltiga föreningar genom att delta i lågriskmatning. Detta fynd har betydande livsepidemiologiska konsekvenser för kvinnlig aktivitet, vilket ökar kvinnliga effekter på livsepidemi. kapacitet. Dessutom kan detta beteende vara målet för framtida vektorhanteringsprogram.