Tack för att du besöker Nature.com.Du använder en webbläsarversion med begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Dessutom, för att säkerställa löpande support, visar vi webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Visar en karusell med tre bilder samtidigt.Använd knapparna Föregående och Nästa för att gå igenom tre bilder åt gången, eller använd skjutknapparna i slutet för att gå igenom tre bilder åt gången.
Blod-hjärnbarriären och blod-hjärnbarriären förhindrar bioterapeutiska medel från att nå sina mål i det centrala nervsystemet och hindrar därigenom effektiv behandling av neurologiska sjukdomar.För att upptäcka nya hjärntransportörer in vivo introducerade vi ett T7-fagpeptidbibliotek och seriellt insamlat blod och cerebrospinalvätska (CSF) med hjälp av en kanylerad medveten stor poolmodell av råttor.Specifika fagkloner anrikades mycket i CSF efter fyra omgångar av selektion.Testning av individuella kandidatpeptider avslöjade mer än 1000-faldig anrikning i CSF.Bioaktiviteten av den peptidförmedlade leveransen till hjärnan bekräftades av en 40 % minskning av nivån av amyloid-β i cerebrospinalvätskan med användning av en BACE1-peptidinhibitor kopplad till den identifierade nya transitpeptiden.Dessa resultat tyder på att de peptider som identifierats genom in vivo fagselektionsmetoder kan vara användbara vehiklar för systemisk leverans av makromolekyler till hjärnan med en terapeutisk effekt.
Målinriktad terapiforskning i centrala nervsystemet (CNS) har till stor del fokuserat på att identifiera optimerade läkemedel och medel som uppvisar CNS-inriktade egenskaper, med mindre ansträngning för att upptäcka mekanismerna som driver aktiv läkemedelstillförsel till hjärnan.Detta börjar förändras nu när läkemedelsleverans, särskilt stora molekyler, är en integrerad del av modern neurovetenskaplig läkemedelsutveckling.Miljön i det centrala nervsystemet är väl skyddad av det cerebrovaskulära barriärsystemet, bestående av blod-hjärnbarriären (BBB) ​​och blod-hjärnbarriären (BCBB)1, vilket gör det utmanande att leverera läkemedel till hjärnan1,2.Det uppskattas att nästan alla läkemedel med stora molekyler och mer än 98 % av läkemedel med små molekyler elimineras från hjärnan3.Det är därför det är mycket viktigt att identifiera nya hjärntransportsystem som ger effektiv och specifik leverans av terapeutiska läkemedel till CNS 4,5.Men BBB och BCSFB utgör också ett utmärkt tillfälle för läkemedelstillförsel eftersom de penetrerar och kommer in i alla strukturer i hjärnan genom dess omfattande kärlsystem.Således är de nuvarande ansträngningarna att använda icke-invasiva metoder för leverans till hjärnan till stor del baserade på mekanismen för receptormedierad transport (PMT) med användning av den endogena BBB6-receptorn.Trots de senaste framstegen med användning av transferrinreceptorvägen7,8 krävs ytterligare utveckling av nya leveranssystem med förbättrade egenskaper.För detta ändamål var vårt mål att identifiera peptider som kan förmedla CSF-transport, eftersom de i princip kan användas för att leverera makromolekyler till CNS eller för att öppna nya receptorvägar.Speciellt kan specifika receptorer och transportörer av det cerebrovaskulära systemet (BBB och BSCFB) tjäna som potentiella mål för aktiv och specifik leverans av bioterapeutiska läkemedel.Cerebrospinalvätska (CSF) är en sekretorisk produkt från choroid plexus (CS) och är i direkt kontakt med interstitialvätskan i hjärnan genom subaraknoidalutrymmet och kammarutrymmet4.Nyligen har det visat sig att subaraknoidal cerebrospinalvätska diffunderar överdrivet in i hjärnans interstitium9.Vi hoppas få tillgång till det parenkymala utrymmet med hjälp av denna subaraknoidala inflödeskanal eller direkt genom BBB.För att uppnå detta implementerade vi en robust in vivo fagselektionsstrategi som idealiskt identifierar peptider som transporteras av någon av dessa två distinkta vägar.
Vi beskriver nu en sekventiell in vivo-fagdisplayscreeningsmetod med CSF-sampling i kombination med high throughput-sekvensering (HTS) för att övervaka initiala urvalsrundor med den högsta biblioteksdiversiteten.Screening utfördes på råttor vid medvetande med en permanent implanterad stor cisterna (CM) kanyl för att undvika blodkontamination.Viktigt är att detta tillvägagångssätt väljer både hjärninriktning och peptider med transportaktivitet över den cerebrovaskulära barriären.Vi använde T7-fager på grund av deras ringa storlek (~ 60 nm)10 och föreslog att de är lämpliga för transport av vesiklar som tillåter transcellulär korsning av endotel- och/eller epitel-medullabarriären.Efter fyra omgångar av panorering isolerades fagpopulationer som visade stark in vivo CSF-berikning och cerebral mikrokärlassociation.Viktigt är att vi kunde bekräfta våra fynd genom att visa att de föredragna och kemiskt syntetiserade bästa kandidatpeptiderna kan transportera proteinlast in i cerebrospinalvätskan.Först fastställdes de farmakodynamiska effekterna av CNS genom att kombinera en ledande transitpeptid med en hämmare av BACE1-peptiden.Förutom att visa att in vivo funktionella screeningsstrategier kan identifiera nya hjärntransportpeptider som effektiva proteinlastbärare, förväntar vi oss att liknande funktionella urvalsmetoder också blir viktiga för att identifiera nya hjärntransportvägar.
Baserat på plackbildande enheter (PFU), efter fagpaketeringssteget, designades och skapades ett bibliotek av slumpmässiga 12-mer linjära T7-fagpeptider med en diversitet på cirka 109 (se Material och metoder).Det är viktigt att notera att vi noggrant analyserade detta bibliotek innan panorering in vivo.PCR-amplifiering av fagbiblioteksprover med användning av modifierade primrar genererade amplikoner som var direkt applicerbara på HTS (kompletterande fig. la).På grund av a) HTS11-sekvenseringsfel, b) påverkan på kvaliteten av primers (NNK)1-12, och c) närvaron av vildtypsfag (wt) (skelettinsättningar) i standbybiblioteket, implementerades en sekvensfiltreringsprocedur för att extrahera endast verifierad sekvensinformation (kompletterande fig. 1b).Dessa filtersteg gäller för alla HTS-sekvenseringsbibliotek.För standardbiblioteket erhölls totalt 233 868 läsningar, varav 39 % klarade filterkriterierna och användes för biblioteksanalys och urval för efterföljande omgångar (kompletterande figur 1c–e).Avläsningarna var övervägande multiplar av 3 baspar i längd med en topp vid 36 nukleotider (kompletterande figur 1c), vilket bekräftar biblioteksdesignen (NNK) 1-12.Notera att cirka 11 % av biblioteksmedlemmarna innehöll en 12-dimensionell vildtyp (wt) ryggrad PAGISRELVDKL-insert, och nästan hälften av sekvenserna (49 %) innehöll insertioner eller deletioner.HTS för biblioteksbiblioteket bekräftade den höga mångfalden av peptider i biblioteket: mer än 81 % av peptidsekvenserna hittades endast en gång och endast 1,5 % förekom i ≥4 kopior (kompletterande Fig. 2a).Frekvenserna för aminosyror (aa) vid alla 12 positioner i repertoaren korrelerade väl med de förväntade frekvenserna för antalet kodon som genererades av den degenererade NKK-repertoaren (kompletterande fig. 2b).Den observerade frekvensen av aa-rester kodade av dessa insatser korrelerade väl med den beräknade frekvensen (r = 0,893) (kompletterande fig. 2c).Framställningen av fagbibliotek för injektion inkluderar stegen för amplifiering och avlägsnande av endotoxin.Detta har tidigare visat sig potentiellt minska mångfalden av fagbibliotek12,13.Därför sekvenserade vi ett plattförstärkt fagbibliotek som hade genomgått endotoxinavlägsnande och jämförde det med det ursprungliga biblioteket för att uppskatta frekvensen av AA.En stark korrelation (r = 0,995) observerades mellan den ursprungliga poolen och den amplifierade och renade poolen (kompletterande fig. 2d), vilket indikerar att konkurrens mellan kloner amplifierade på plattor med användning av T7-fag inte orsakade större bias.Denna jämförelse är baserad på frekvensen av tripeptidmotiv i varje bibliotek, eftersom mångfalden av bibliotek (~109) inte kan fångas helt ens med HTS.Frekvensanalys av aa vid varje position avslöjade en liten positionsberoende bias i de sista tre positionerna av den inmatade repertoaren (kompletterande fig. 2e).Sammanfattningsvis drog vi slutsatsen att kvaliteten och mångfalden av biblioteket var acceptabla och endast mindre förändringar i mångfald observerades på grund av amplifiering och beredning av fagbibliotek mellan flera urvalsomgångar.
Seriell provtagning av cerebrospinalvätska kan utföras genom att kirurgiskt implantera en kanyl i CM hos råttor vid medvetande för att underlätta identifiering av T7-fag som injicerats intravenöst (iv) via BBB och/eller BCSFB (Fig. 1a-b).Vi använde två oberoende urvalsarmar (armarna A och B) i de första tre omgångarna av in vivo-selektion (Fig. 1c).Vi ökade gradvis selektionens stringens genom att minska den totala mängden fag som introducerades under de tre första selektionsomgångarna.För den fjärde omgången av panorering kombinerade vi prover från grenarna A och B och utförde ytterligare tre oberoende urval.För att studera in vivo-egenskaperna hos T7-fagpartiklar i denna modell injicerades vildtypsfag (PAGISRELVDKL-masterinlägg) i råttor via svansvenen.Utvinning av fager från cerebrospinalvätska och blod vid olika tidpunkter visade att relativt små T7 ikosaedriska fager hade en snabb initial clearancefas från blodutrymmet (kompletterande fig. 3).Baserat på de administrerade titrarna och blodvolymen hos råttorna, beräknade vi att endast cirka 1 vikt-%.fag från den administrerade dosen detekterades i blodet 10 minuter efter intravenös injektion.Efter denna initiala snabba minskning uppmättes en långsammare primär clearance med en halveringstid på 27,7 minuter.Viktigt är att endast mycket få fager hämtades från CSF-avdelningen, vilket indikerar en låg bakgrund för vildtypsfagmigration in i CSF-avdelningen (kompletterande fig. 3).I genomsnitt detekterades endast cirka 1 x 10-3% titrar av T7-fag i blodet och 4 x 10-8% av initialt infunderade fager i cerebrospinalvätskan under hela provtagningsperioden (0-250 min).Noterbart var att halveringstiden (25,7 min) för vildtypsfag i cerebrospinalvätska liknade den som observerades i blod.Dessa data visar att barriären som separerar CSF-avdelningen från blodet är intakt i CM-kanylerade råttor, vilket tillåter in vivo-selektion av fagbibliotek för att identifiera kloner som lätt transporteras från blodet in i CSF-avdelningen.
(a) Inrätta en metod för ny provtagning av cerebrospinalvätska (CSF) från en stor pool.(b) Diagram som visar den cellulära platsen för det centrala nervsystemet (CNS) barriären och urvalsstrategin som används för att identifiera peptider som passerar blod-hjärnbarriären (BBB) ​​och blod-hjärnbarriären.(c) In vivo flödesschema för screening av fagdisplay.I varje urvalsomgång injicerades fager (djuridentifierare inuti pilarna) intravenöst.Två oberoende alternativa grenar (A, B) hålls separat fram till den fjärde urvalsomgången.För selektionsomgångarna 3 och 4 sekvenserades varje fagklon extraherad från CSF manuellt.(d) Kinetik av fag isolerad från blod (röda cirklar) och cerebrospinalvätska (gröna trianglar) under den första urvalsomgången i två kanylerade råttor efter intravenös injektion av T7-peptidbiblioteket (2 x 1012 fager/djur).Blå rutor indikerar den genomsnittliga initiala koncentrationen av fag i blodet, beräknad från mängden injicerad fag, med hänsyn tagen till den totala blodvolymen.De svarta rutorna indikerar skärningspunkten för y-linjen extrapolerad från fagkoncentrationer i blodet.(e,f) Presentera den relativa frekvensen och fördelningen av alla möjliga överlappande tripeptidmotiv som finns i peptiden.Antalet motiv som hittats i 1000 avläsningar visas.Signifikant (p < 0,001) berikade motiv är markerade med röda prickar.(e) Korrelationsspridningsdiagram som jämför den relativa frekvensen av tripeptidmotivet i det injicerade biblioteket med blodhärledda fager från djur #1.1 och #1.2.(f) Korrelationsspridningsdiagram som jämför de relativa frekvenserna av djurfagtripeptidmotiv #1.1 och #1.2 isolerade i blod och cerebrospinalvätska.(g, h) Sekvens-ID-representation av fag anrikad i blod (g) kontra injicerade bibliotek och fag anrikad i CSF (h) kontra blod efter en omgång av in vivo-selektion i båda djuren.Storleken på enbokstavskoden anger hur ofta den aminosyran förekommer i den positionen.Grön = polär, lila = neutral, blå = basisk, röd = sur och svart = hydrofoba aminosyror.Figur 1a, b designades och producerades av Eduard Urich.
Vi injicerade ett fagpeptidbibliotek i två CM-instrumentråttor (klädd A och B) och isolerade fag från cerebrospinalvätska och blod (Figur 1d).Den initiala snabba clearancen av biblioteket var mindre uttalad jämfört med vildtypsfagen.Medelhalveringstiden för det injicerade biblioteket i båda djuren var 24,8 minuter i blod, liknande vildtypsfag, och 38,5 minuter i CSF.Blod- och cerebrospinalvätskefagprover från varje djur utsattes för HTS och alla identifierade peptider analyserades med avseende på närvaron av ett kort tripeptidmotiv.Tripeptidmotiv valdes eftersom de ger en minimal grund för strukturbildning och peptid-proteininteraktioner14,15.Vi fann en god korrelation i fördelningen av motiv mellan det injicerade fagbiblioteket och kloner extraherade från blodet från båda djuren (Fig. 1e).Data indikerar att sammansättningen av biblioteket endast är marginellt berikad i blodfacket.Aminosyrafrekvenser och konsensussekvenser analyserades vidare vid varje position med hjälp av en anpassning av programvaran Weblogo16.Intressant nog hittade vi en stark anrikning av blodglycinrester (Fig. 1g).När blod jämfördes med kloner valda från CSF, observerades stark selektion och viss bortval av motiv (fig. lf), och vissa aminosyror var företrädesvis närvarande vid förutbestämda positioner i 12-medlemmen (fig. 1h).Speciellt skilde sig individuella djur signifikant i cerebrospinalvätska, medan blodglycinberikning observerades hos båda djuren (kompletterande fig. 4a–j).Efter strikt filtrering av sekvensdata i cerebrospinalvätskan hos djur #1.1 och #1.2 erhölls totalt 964 och 420 unika 12-mer-peptider (kompletterande fig. 1d–e).De isolerade fagklonerna amplifierades och utsattes för en andra omgång in vivo-selektion.Fager extraherade från den andra selektionsomgången utsattes för HTS i varje djur och alla identifierade peptider användes som input till ett motivigenkänningsprogram för att analysera förekomsten av tripeptidmotiv (fig. 2a, b, ef).Jämfört med den första cykeln av fagen som återvunnits från CSF, observerade vi ytterligare urval och bortval av många motiv i CSF i grenarna A och B (Fig. 2).En nätverksidentifieringsalgoritm användes för att bestämma om de representerade olika mönster av konsekvent sekvens.En tydlig likhet observerades mellan de 12-dimensionella sekvenserna som utvanns av CSF i alternativ kladd A (fig. 2c, d) och kladd B (fig. 2g, h).Den sammanslagna analysen i varje gren avslöjade olika selektionsprofiler för 12-mer peptider (kompletterande fig. 5c, d) och en ökning av CSF/blodtiterförhållandet över tiden för poolade kloner efter den andra selektionsomgången jämfört med den första selektionsomgången (kompletterande fig. 5e).).
Anrikning av motiv och peptider i cerebrospinalvätska genom två på varandra följande omgångar av in vivo funktionell fagdisplay-selektion.
Alla cerebrospinalvätskefager som utvanns från den första omgången av varje djur (djur #1.1 och #1.2) slogs samman, amplifierades, HT-sekvenserades och återinjicerades tillsammans (2 x 1010 fager/djur) 2 SM kanylerade råttor (#1.1 → #).2.1 och 2.2, 1.2 → 2.3 och 2.4).(a,b,e,f) Korrelationsspridningsdiagram som jämför den relativa frekvensen av tripeptidmotiv för alla CSF-härledda fager i den första och andra selektionsomgången.Relativ frekvens och fördelning av motiv som representerar alla möjliga överlappande tripeptider som finns i peptider i båda orienteringarna.Antalet motiv som hittats i 1000 avläsningar visas.Motiv som var signifikant (p < 0,001) valda eller uteslutna i ett av de jämförda biblioteken är markerade med röda prickar.(c, d, g, h) Sekvenslogo-representation av alla CSF-rika 12 aminosyror långa sekvenser baserat på omgångarna 2 och 1 av in vivo-selektion.Storleken på enbokstavskoden anger hur ofta den aminosyran förekommer i den positionen.För att representera logotypen jämförs frekvensen av CSF-sekvenser som extraherats från individuella djur mellan två urvalsomgångar och de berikade sekvenserna i den andra omgången visas: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 och (h) #1.2–#2.4.De mest anrikade aminosyrorna vid en given position i (c, d) djur nr.2.1 och nr.2.2 eller (g, h) hos djur nr.2.3 och nr.2.4 visas i färg.Grön = polär, lila = neutral, blå = basisk, röd = sur och svart = hydrofoba aminosyror.
Efter den tredje selektionsomgången identifierade vi 124 unika peptidsekvenser (#3.1 och #3.2) från 332 CSF-rekonstituerade fagkloner isolerade från två djur (kompletterande fig. 6a).Sekvensen LGSVS (18,7 %) hade den högsta relativa andelen, följt av vildtypsinsättningarna PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) och SARGSWREIVSLS (2,2 %).I den sista fjärde omgången slog vi ihop två oberoende utvalda grenar från tre separata djur (Fig. 1c).Av de 925 sekvenserade fagklonerna som återvunnits från CSF fann vi i den fjärde omgången 64 unika peptidsekvenser (Supplerande Fig. 6b), bland vilka den relativa andelen vildtypsfag sjönk till 0,8 %.De vanligaste CSF-klonerna i den fjärde omgången var LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) och RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Längdintervallet för de utvalda peptiderna beror på nukleotidinsertioner/deletioner eller för tidigt stoppkodon i biblioteksprimrarna när degenererade kodoner används för NNK-biblioteksdesign.Tidiga stoppkodon genererar kortare peptider och väljs ut eftersom de innehåller det gynnsamma aa-motivet.Längre peptider kan resultera från insertioner/deletioner i primrarna i de syntetiska biblioteken.Detta placerar det designade stoppkodonet utanför ramen och läser det tills ett nytt stoppkodon dyker upp nedströms.I allmänhet beräknade vi anrikningsfaktorer för alla fyra urvalsomgångarna genom att jämföra indata med provutdata.För den första omgången av screening använde vi vildtypsfagtitrar som en icke-specifik bakgrundsreferens.Intressant nog var negativ fagselektion mycket stark i den första CSF-cykeln, men inte i blod (Fig. 3a), vilket kan bero på den låga sannolikheten för passiv diffusion av de flesta medlemmarna av peptidbiblioteket in i CSF-avdelningen eller att relativa fager tenderar att mer effektivt kvarhållas eller avlägsnas från blodomloppet än bakteriofager.I den andra omgången av panorering observerades emellertid ett starkt urval av fager i CSF i båda kladerna, vilket tyder på att den föregående omgången var berikad med fager som uppvisar peptider som främjar CSF-upptag (Fig. 3a).Återigen, utan betydande blodanrikning.Även i den tredje och fjärde omgången anrikades fagklonerna signifikant i CSF.Genom att jämföra den relativa frekvensen av varje unik peptidsekvens mellan de två sista selektionsomgångarna fann vi att sekvenserna var ännu mer berikade i den fjärde selektionsomgången (Fig. 3b).Totalt 931 tripeptidmotiv extraherades från alla 64 unika peptidsekvenser med användning av båda peptidorienteringarna.De mest anrikade motiven i den fjärde omgången undersöktes mer noggrant med avseende på deras anrikningsprofiler över alla omgångar jämfört med det injicerade biblioteket (cut-off: 10 % anrikning) (kompletterande fig. 6c).Allmänna urvalsmönster visade att de flesta av de studerade motiven berikades i alla tidigare omgångar av båda urvalsgrenarna.Vissa motiv (t.ex. SGL, VSG, LGS GSV) kom dock till övervägande del från alternativ kladd A, medan andra (t.ex. FGW, RTN, WGF, NTR) berikades med alternativ kladd B.
Validering av CSF-transport av CSF-berikade fag-visade peptider och biotinylerade ledarpeptider konjugerade till streptavidin-nyttolaster.
(a) Anrikningsförhållanden beräknade i alla fyra omgångarna (R1-R4) baserat på injicerade (input = I) fagtitrar (PFU) och bestämda CSF-fagtitrar (output = O).Anrikningsfaktorer för de tre sista omgångarna (R2-R4) beräknades genom jämförelse med föregående omgång och den första omgången (R1) med viktdata.Öppna staplar är cerebrospinalvätska, skuggade staplar är plasma.(***p<0,001, baserat på Students t-test).(b) Lista över de mest förekommande fagpeptiderna, rangordnade enligt deras relativa proportion till alla fager som samlats in i CSF efter omgång 4 av selektion.De sex vanligaste fagklonerna är markerade i färg, numrerade och deras anrikningsfaktorer mellan omgångarna 3 och 4 av selektion (insättningar).(c,d) De sex mest anrikade fagklonerna, tomma fag- och föräldrafagpeptidbibliotek från omgång 4 analyserades individuellt i en CSF-provtagningsmodell.CSF och blodprover samlades in vid de angivna tidpunkterna.(c) Lika mängder av 6 kandidatfagkloner (2 x 1010 fager/djur), tomma fager (#1779) (2 x 1010 fager/djur) och stamfagpeptidbibliotek (2 x 1012 fager/djur) Injicera minst 3 CM separat till djuret som administreras i en CM som administreras via svansen.CSF-farmakokinetiken för varje injicerad fagklon och fagpeptidbibliotek över tiden visas.(d) visar det genomsnittliga förhållandet CSF/blod för alla återvunna fager/ml under provtagningstiden.(e) Fyra syntetiska ledarpeptider och en förvrängd kontroll kopplades med biotin till streptavidin genom deras N-terminal (tetramerdisplay) följt av injektion (svansven iv, 10 mg streptavidin/kg).Minst tre intuberade råttor (N = 3).).CSF-prover samlades in vid de angivna tidpunkterna och streptavidinkoncentrationer mättes med CSF-anti-streptavidin ELISA (nd = ej detekterad).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, baserat på ANOVA-test).(f) Jämförelse av aminosyrasekvensen för den mest anrikade fagpeptidklonen #2002 (lila) med andra utvalda fagpeptidkloner från den fjärde urvalsomgången.Identiska och liknande aminosyrafragment är färgkodade.
Av alla anrikade fager i den fjärde omgången (Fig. 3b) valdes sex kandidatkloner ut för ytterligare individuell analys i CSF-provtagningsmodellen.Lika mängder av sex kandidatfag-, tomma fag- (ingen infogning) och profagpeptidbibliotek injicerades i tre kanylerade CM-djur, och farmakokinetiken bestämdes i CSF (Fig. 3c) och blod (Supplerande Fig. 7) analyser.Alla fagkloner som testades riktade in sig på CSF-avdelningen på en nivå 10-1000 gånger högre än den för den tomma kontrollfagen (#1779).Till exempel hade klonerna #2020 och #2077 cirka 1000 gånger högre CSF-titer än kontrollfag.Den farmakokinetiska profilen för varje utvald peptid är olika, men alla har en hög CSF-målförmåga.Vi observerade en konstant minskning över tid för klonerna #1903 och #2011, medan för klonerna #2077, #2002 och #2009 kan en ökning under de första 10 minuterna indikera aktiv transport men måste verifieras.Kloner #2020, #2002 och #2077 stabiliserades på höga nivåer, medan CSF-koncentrationen av klon #2009 långsamt minskade efter den initiala ökningen.Vi jämförde sedan den relativa frekvensen av varje CSF-kandidat med dess blodkoncentration (Fig. 3d).Korrelationen mellan medeltitern för varje CSF-kandidat med dess blodtiter vid alla provtagningstillfällen visade att tre av de sex kandidaterna var signifikant berikade i blod-CSF.Intressant nog visade klon #2077 högre blodstabilitet (kompletterande figur 7).För att bekräfta att peptiderna själva är kapabla att aktivt transportera annan last än fagpartiklar till CSF-avdelningen, syntetiserade vi fyra ledarpeptider derivatiserade med biotin vid N-terminalen där peptiderna fäster till fagpartikeln.Biotinylerade peptider (nr 2002, 2009, 2020 och 2077) konjugerades med streptavidin (SA) för att erhålla multimera former som något efterliknar faggeometrin.Detta format gjorde det också möjligt för oss att mäta SA-exponering i blod och cerebrospinalvätska som lasttransporterande proteinpeptider.Viktigt är att fagdata ofta kunde reproduceras när syntetiska peptider administrerades i detta SA-konjugerade format (Fig. 3e).De förvrängda peptiderna hade mindre initial exponering och snabbare CSF-clearance med odetekterbara nivåer inom 48 timmar.För att få insikt i leveransvägarna för dessa peptidfagkloner i CSF-utrymmet, analyserade vi lokaliseringen av individuella fagpeptidträffar med hjälp av immunhistokemi (IHC) för att direkt detektera fagpartiklar 1 timme efter intravenös injektion in vivo.Noterbart kunde klon #2002, #2077 och #2009 detekteras genom kraftig färgning i hjärnkapillärer, medan kontrollfag (#1779) och klon #2020 inte detekterades (kompletterande figur 8).Detta tyder på att dessa peptider bidrar till effekten på hjärnan just genom att korsa BBB.Ytterligare detaljerad analys krävs för att testa denna hypotes, eftersom BSCFB-vägen också kan vara involverad.När man jämförde aminosyrasekvensen för den mest anrikade klonen (#2002) med andra utvalda peptider, noterades att några av dem har liknande aminosyraförlängningar, vilket kan indikera en liknande transportmekanism (Fig. 3f).
På grund av dess unika plasmaprofil och signifikanta ökning av CSF över tid, undersöktes fagdisplayklon #2077 ytterligare under en längre 48-timmarsperiod och kunde reproducera den snabba ökningen av CSF som observerades i samband med ihållande SA-nivåer (Fig. 4a).När det gäller andra identifierade fagkloner, färgades #2077 starkt för hjärnkapillärer och visade signifikant kolokalisering med kapillärmarkörlektin när den sågs med högre upplösning och möjligen viss färgning i det parenkymala utrymmet (Figur 4b).För att undersöka om peptidmedierade farmakologiska effekter kunde erhållas i CNS utförde vi ett experiment där biotinylerade versioner av i) transitpeptiden #2077 och ii) BACE1-hämmarpeptiden blandades med SA i två olika förhållanden.För en kombination använde vi endast BACE1-peptidinhibitorn och för den andra använde vi ett förhållande på 1:3 av BACE1-peptidinhibitorn till #2077-peptiden.Båda proverna administrerades intravenöst och blod- och cerebrospinalvätskenivåer av beta-amyloid peptid 40 (Abeta40) mättes över tiden.Abeta40 mättes i CSF eftersom det återspeglar BACE1-hämning i hjärnans parenkymet.Som väntat minskade båda komplexen signifikant blodnivåerna av Abeta40 (fig. 4c, d).Dock endast prover som innehåller en blandning av peptid nr.2077 och en hämmare av BACE1-peptiden konjugerad till SA orsakade en signifikant minskning av Abeta40 i cerebrospinalvätskan (Fig. 4c).Data visar att peptid nr.2077 kan transportera SA-proteinet på 60 kDa in i CNS och inducerar även farmakologiska effekter med SA-konjugerade hämmare av BACE1-peptiden.
(a) Klonal injektion (2 × 10 fager/djur) av T7-fag som visar långtidsfarmakokinetiska profiler av CSF-peptid #2077 (RLSSVDSDLSGC) och oinjicerad kontrollfag (#1779) i minst tre CM-intuberade råttor.(b) Konfokal mikroskopisk bild av representativa kortikala mikrokärl i faginjicerade råttor (2 × 10 10 fager/djur) som visar motfärgning av peptid #2077 och kärl (lektin).Dessa fagkloner administrerades till 3 råttor och fick cirkulera i 1 timme före perfusion.Hjärnor sektionerades och färgades med polyklonala FITC-märkta antikroppar mot T7-fagkapsiden.Tio minuter före perfusion och efterföljande fixering administrerades DyLight594-märkt lektin intravenöst.Fluorescerande bilder som visar lektinfärgning (röd) av den luminala sidan av mikrokärl och fager (grön) i lumen av kapillärer och perivaskulär hjärnvävnad.Skalstången motsvarar 10 µm.(c, d) Biotinylerad BACE1-hämmande peptid ensam eller i kombination med biotinylerad transitpeptid #2077 kopplades till streptavidin följt av intravenös injektion av minst tre kanylerade CM-råttor (10 mg streptavidin/kg).BACE1 peptidinhibitor-medierad minskning av Aβ40 mättes med Aβ1-40 ELISA i blod (röd) och cerebrospinalvätska (orange) vid de angivna tidpunkterna.För bättre tydlighet ritas en prickad linje på grafen i en skala på 100 %.(c) Procentuell minskning av Aβ40 i blod (röda trianglar) och cerebrospinalvätska (orange trianglar) hos råttor behandlade med streptavidin konjugerat till transitpeptid #2077 och BACE1-hämmande peptid i ett 3:1-förhållande.(d) Procentuell minskning av blod Aβ40 (röda cirklar) och cerebrospinalvätska (orange cirklar) hos råttor behandlade med streptavidin kopplade till en BACE1-hämmande peptid endast.Ap-koncentrationen i kontrollen var 420 pg/ml (standardavvikelse = 101 pg/ml).
Fagdisplay har framgångsrikt tillämpats inom flera områden av biomedicinsk forskning17.Denna metod har använts för in vivo vaskulära mångfaldsstudier18,19 samt studier inriktade på cerebrala kärl20,21,22,23,24,25,26.I denna studie utökade vi tillämpningen av denna urvalsmetod inte bara till direkt identifiering av peptider som riktar in sig på hjärnkärl, utan också till upptäckten av kandidater med aktiva transportegenskaper för att passera blod-hjärnbarriären.Vi beskriver nu utvecklingen av en in vivo-selektionsprocedur i CM-intuberade råttor och visar dess potential att identifiera peptider med CSF-hemsökningsegenskaper.Genom att använda T7-fagen som visar ett bibliotek av 12-mer slumpmässiga peptider kunde vi visa att T7-fagen är tillräckligt liten (cirka 60 nm i diameter)10 för att anpassas till blod-hjärnbarriären och därigenom direkt korsa blod-hjärnbarriären eller plexus åderhinne.Vi observerade att CSF-skörd från kanylerade CM-råttor var en välkontrollerad funktionell screeningmetod in vivo, och att den extraherade fagen inte bara band till kärlsystemet utan också fungerade som en transportör över blod-hjärnbarriären.Dessutom, genom att samtidigt samla blod och applicera HTS på CSF och blodhärledda fager, bekräftade vi att vårt val av CSF inte påverkades av blodanrikning eller lämplighet för expansion mellan urvalsomgångarna.Blodavdelningen är dock en del av urvalsproceduren, eftersom fager som kan nå CSF-avdelningen måste överleva och cirkulera i blodomloppet tillräckligt länge för att berika sig själva i hjärnan.För att extrahera tillförlitlig sekvensinformation från rå HTS-data implementerade vi filter anpassade till plattformsspecifika sekvenseringsfel i analysarbetsflödet.Genom att införliva kinetiska parametrar i screeningsmetoden bekräftade vi den snabba farmakokinetiken för T7-fager av vildtyp (t½ ~ 28 min) i blod24, 27, 28 och bestämde också deras halveringstid i cerebrospinalvätska (t½ ~ 26 min) per minut).Trots liknande farmakokinetiska profiler i blod och CSF kunde endast 0,001 % av blodkoncentrationen av fag detekteras i CSF, vilket indikerar låg bakgrundsrörlighet för vildtyp T7-fag över blod-hjärnbarriären.Detta arbete belyser vikten av den första urvalsomgången när man använder in vivo panoreringsstrategier, särskilt för fagsystem som snabbt rensas från cirkulationen, eftersom få kloner kan nå CNS-avdelningen.Sålunda, i den första omgången, var minskningen av biblioteksdiversitet mycket stor, eftersom endast ett begränsat antal kloner så småningom samlades in i denna mycket strikta CSF-modell.Denna in vivo panoreringsstrategi inkluderade flera selektionssteg såsom aktiv ackumulering i CSF-avdelningen, klonöverlevnad i blodavdelningen och snabbt avlägsnande av T7-fagkloner från blodet inom de första 10 minuterna (Fig. Id och Kompletterande Fig. 4M).).Sålunda, efter den första omgången, identifierades olika fagkloner i CSF, även om samma initiala pool användes för individuella djur.Detta tyder på att flera strikta urvalssteg för källbibliotek med ett stort antal biblioteksmedlemmar resulterar i en betydande minskning av mångfalden.Därför kommer slumpmässiga händelser att bli en integrerad del av den initiala urvalsprocessen, vilket i hög grad påverkar resultatet.Det är troligt att många av klonerna i det ursprungliga biblioteket hade en mycket liknande CSF-anrikningsbenägenhet.Men även under samma experimentella förhållanden kan urvalsresultaten skilja sig åt på grund av det lilla antalet av varje särskild klon i den initiala poolen.
Motiven berikade i CSF skiljer sig från de i blodet.Intressant nog noterade vi det första skiftet mot glycinrika peptider i blodet hos enskilda djur.(Fig. Ig, Kompletterande Fig. 4e, 4f).Fag innehållande glycinpeptider kan vara mer stabila och mindre benägna att tas ur cirkulationen.Dessa glycinrika peptider upptäcktes dock inte i cerebrospinalvätskeproverna, vilket tyder på att de kurerade biblioteken gick igenom två olika urvalssteg: en i blodet och en annan fick ackumuleras i cerebrospinalvätskan.CSF-berikade kloner som härrör från den fjärde selektionsomgången har testats omfattande.Nästan alla de individuellt testade klonerna bekräftades vara anrikade på CSF jämfört med blank kontrollfag.En peptidträff (#2077) undersöktes mer i detalj.Den visade en längre plasmahalveringstid jämfört med andra träffar (figur 3d och kompletterande figur 7), och intressant nog innehöll denna peptid en cysteinrest vid C-terminalen.Det har nyligen visat sig att tillsats av cystein till peptider kan förbättra deras farmakokinetiska egenskaper genom att binda till albumin 29 .Detta är för närvarande okänt för peptid #2077 och kräver ytterligare studier.Vissa peptider visade ett valensberoende i CSF-anrikning (data visas inte), vilket kan vara relaterat till den visade ytgeometrin hos T7-kapsiden.T7-systemet vi använde visade 5-15 kopior av varje peptid per fagpartikel.IHC utfördes på kandidat blyfagkloner injicerade intravenöst i hjärnbarken hos råttor (kompletterande fig. 8).Data visade att minst tre kloner (nr 2002, nr 2009 och nr 2077) interagerade med BBB.Det återstår att bestämma om denna BBB-interaktion resulterar i ackumulering av CSF eller förflyttning av dessa kloner direkt till BCSFB.Viktigt är att vi visar att de utvalda peptiderna behåller sin CSF-transportkapacitet när de syntetiseras och binds till proteinlasten.Bindning av N-terminala biotinylerade peptider till SA upprepar i huvudsak resultaten som erhållits med deras respektive fagkloner i blod och cerebrospinalvätska (fig. 3e).Slutligen visar vi att blypeptid #2077 kan främja hjärnans verkan av en biotinylerad peptidhämmare av BACE1 konjugerad till SA, vilket orsakar uttalade farmakodynamiska effekter i CNS genom att signifikant minska Abeta40-nivåerna i CSF (Fig. 4).Vi kunde inte identifiera några homologer i databasen genom att utföra en peptidsekvenshomologisökning av alla träffar.Det är viktigt att notera att storleken på T7-biblioteket är cirka 109, medan den teoretiska biblioteksstorleken för 12-merer är 4 x 1015. Därför valde vi bara ut en liten del av mångfaldsutrymmet i 12-mer-peptidbiblioteket, vilket kan innebära att mer optimerade peptider kan identifieras genom att identifiera träffsekvenser i dessa angränsande sekvenser.Hypotetiskt kan en av anledningarna till att vi inte har hittat några naturliga homologer av dessa peptider vara bortval under evolution för att förhindra okontrollerat inträde av vissa peptidmotiv i hjärnan.
Sammantaget ger våra resultat en grund för framtida arbete med att mer detaljerat identifiera och karakterisera transportsystemen för den cerebrovaskulära barriären in vivo.Den grundläggande uppställningen av denna metod är baserad på en funktionell selektionsstrategi som inte bara identifierar kloner med cerebrala vaskulära bindande egenskaper, utan inkluderar också ett kritiskt steg där framgångsrika kloner har inneboende aktivitet för att korsa biologiska barriärer in vivo in i CNS-avdelningen.är att belysa mekanismen för transport av dessa peptider och deras preferens för bindning till den mikrovaskulatur som är specifik för hjärnregionen.Detta kan leda till upptäckten av nya vägar för transport av BBB och receptorer.Vi förväntar oss att de identifierade peptiderna direkt kan binda till cerebrovaskulära receptorer eller till cirkulerande ligander som transporteras genom BBB eller BCSFB.Peptidvektorerna med CSF-transportaktivitet som upptäckts i detta arbete kommer att undersökas ytterligare.Vi undersöker för närvarande hjärnspecificiteten för dessa peptider för deras förmåga att korsa BBB och/eller BCSFB.Dessa nya peptider kommer att vara extremt värdefulla verktyg för den potentiella upptäckten av nya receptorer eller vägar och för utvecklingen av nya högeffektiva plattformar för leverans av makromolekyler, såsom biologiska läkemedel, till hjärnan.
Kanylera den stora cisternen (CM) med en modifiering av den tidigare beskrivna metoden.Bedövade Wistar-råttor (200-350 g) monterades på en stereotaxisk apparat och ett mediansnitt gjordes över den rakade och aseptiskt preparerade hårbotten för att exponera skallen.Borra två hål i området för den övre bågen och skruva fast fästskruvarna i hålen.Ett ytterligare hål borrades i den laterala nackkammen för stereotaktisk styrning av en kanyl av rostfritt stål in i CM.Applicera dentalt cement runt kanylen och fäst med skruvar.Efter fotohärdning och cementhärdning stängdes hudsåret med 4/0 supramidsutur.Korrekt placering av kanylen bekräftas av spontant läckage av cerebrospinalvätska (CSF).Ta bort råttan från den stereotaktiska apparaten, få lämplig postoperativ vård och smärtbehandling och låt den återhämta sig i minst en vecka tills tecken på blod observeras i cerebrospinalvätskan.Wistar-råttor (Crl:WI/Han) erhölls från Charles River (Frankrike).Alla råttor hölls under specifika patogenfria förhållanden.Alla djurförsök godkändes av veterinärkontoret i staden Basel, Schweiz, och utfördes i enlighet med djurlicens nr 2474 (bedömning av aktiv hjärntransport genom att mäta nivåer av terapeutiska kandidater i cerebrospinalvätskan och hjärnan hos råtta).
Håll råttan försiktigt vid medvetande med CM-kanylen i handen.Ta bort Datura från kanylen och samla upp 10 µl spontant strömmande cerebrospinalvätska.Eftersom kanylens öppenhet till slut kompromitterades inkluderades endast klara cerebrospinalvätskeprover utan tecken på blodkontamination eller missfärgning i denna studie.Parallellt togs cirka 10–20 μl blod från ett litet snitt i svansspetsen i rör med heparin (Sigma-Aldrich).CSF och blod samlades in vid olika tidpunkter efter intravenös injektion av T7-fag.Cirka 5–10 μl vätska kastades innan varje CSF-prov togs, vilket motsvarar kateterns dödvolym.
Bibliotek genererades med användning av vektorn T7Select 10-3b såsom beskrivs i T7Select-systemmanualen (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Kortfattat syntetiserades en slumpmässig 12-mer DNA-insättning i följande format:
NNK-kodonet användes för att undvika dubbla stoppkodon och aminosyraöveruttryck i insättningen.N är ett manuellt blandat ekvimolärt förhållande för varje nukleotid, och K är ett manuellt blandat ekvimolärt förhållande av adenin- och cytosinnukleotider.Enkelsträngade regioner omvandlades till dubbelsträngat DNA genom ytterligare inkubation med dNTP (Novagen) och Klenow-enzym (New England Biolabs) i Klenow-buffert (New England Biolabs) under 3 timmar vid 37°C.Efter reaktionen utvanns dubbelsträngat DNA genom EtOH-utfällning.Det resulterande DNA:t digererades med restriktionsenzymer EcoRI och Hindlll (båda från Roche).Den kluvna och renade (QIAquick, Qiagen) insättningen (T4-ligas, New England Biolabs) ligerades sedan i ram in i en förklyvd T7-vektor efter aminosyra 348 i 10B-kapsidgenen.Ligeringsreaktioner inkuberades vid 16°C under 18 timmar före in vitro-förpackning.Fagförpackning in vitro utfördes enligt instruktionerna som medföljde T7Select 10-3b kloningskit (Novagen) och förpackningslösningen amplifierades en gång till lys med Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lysaten centrifugerades, titrerades och frystes vid -80°C som en stamlösning av glycerol.
Direkt PCR-amplifiering av variabla fagregioner amplifierade i buljong eller platta med användning av patenterade 454/Roche-amplicon-fusionsprimrar.Den framåtgående fusionsprimern innehåller sekvenser som flankerar den variabla regionen (NNK) 12 (mallspecifik), GS FLX Titanium Adapter A och en fyra-bas biblioteksnyckelsekvens (TCAG) (kompletterande figur 1a):
Den omvända fusionsprimern innehåller också biotin fäst vid infångningskulor och GS FLX Titanium Adapter B som krävs för klonal amplifiering under emulsions-PCR:
Amplikonerna utsattes sedan för 454/Roche pyrosekvensering enligt 454 GS-FLX Titanium-protokollet.För manuell Sanger-sekvensering (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) amplifierades T7-fag-DNA med PCR och sekvenserades med följande primerpar:
Inlägg från individuella plack utsattes för PCR-amplifiering med användning av Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (enligt tillverkarens instruktioner).Utför en varmstart (10 min vid 95 °C) och 35 boostcykler (50 s vid 95 °C, 1 min vid 50 °C och 1 min vid 72 °C).
Fager från bibliotek, vildtypsfag, fag räddad från CSF och blod, eller individuella kloner amplifierades i Escherichia coli BL5615 i TB-buljong (Sigma Aldrich) eller i 500 cm2 skålar (Thermo Scientific) under 4 timmar vid 37°C.Fager extraherades från plattorna genom att skölja plattorna med Tris-EDTA-buffert (Fluka Analytical) eller genom att samla upp plattorna med sterila pipettspetsar.Fager isolerades från odlingssupernatant eller extraktionsbuffert med en omgång polyetylenglykol (PEG 8000) utfällning (Promega) och återsuspenderades i Tris-EDTA-buffert.
Den amplifierade fagen utsattes för 2-3 omgångar av endotoxinborttagning med endotoxinborttagningspärlor (Miltenyi Biotec) före intravenös (IV) injektion (500 μl/djur).I den första omgången introducerades 2×1012 fager;i den andra, 2×1010 fager;i den tredje och fjärde urvalsomgången, 2×109 fager per djur.Faginnehåll i CSF och blodprover som samlats in vid de angivna tidpunkterna bestämdes genom plackräkning enligt tillverkarens instruktioner (T7Select-systemmanualen).Fagselektion utfördes genom intravenös injektion av renade bibliotek i svansvenen eller genom återinjektion av fag extraherad från CSF från föregående selektionsomgång, och efterföljande skördar utfördes vid 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min respektive 240 min blodprover.Totalt fyra omgångar av in vivo panorering genomfördes där de två utvalda grenarna lagrades separat och analyserades under de tre första urvalsomgångarna.Alla faginsättningar extraherade från CSF från de två första selektionsomgångarna utsattes för 454/Roche-pyrosekvensering, medan alla kloner extraherade från CSF från de två sista selektionsomgångarna sekvenserades manuellt.Alla blodfager från den första urvalsomgången utsattes också för 454/Roche-pyrosekvensering.För injektion av fagkloner amplifierades utvalda fager i E. coli (BL5615) på 500 cm2 plattor vid 37°C under 4 timmar.Individuellt utvalda och manuellt sekvenserade kloner förökades i TB-medium.Efter fagextraktion, rening och avlägsnande av endotoxin (som beskrivits ovan), injicerades 2×1010 fager/djur i 300 μl intravenöst i en svansven.
Förbearbetning och kvalitativ filtrering av sekvensdata.Rå 454/Roche-data konverterades från ett binärt standardformat för strömkart (sff) till ett Pearsons mänskligt läsbart format (fasta) med hjälp av leverantörens programvara.Ytterligare bearbetning av nukleotidsekvensen utfördes med användning av proprietära C-program och skript (ej släppt mjukvarupaket) som beskrivs nedan.Analysen av primärdata inkluderar strikta flerstegsfiltreringsprocedurer.För att filtrera bort läsningar som inte innehöll en giltig 12-mer insatt DNA-sekvens, justerades läsningarna sekventiellt till startetikett (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stoppetikett (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) och bakgrundsinsättning (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) med hjälp av den globala testet Needleman-Wunsch.justering som tillåter upp till 2 inkonsekvenser per justering31.Därför togs läsningar utan start- och stopptaggar och läsningar som innehåller bakgrundsinfogningar, dvs justeringar som överskrider det tillåtna antalet felmatchningar, från biblioteket.När det gäller de återstående läsningarna, togs N-mer-DNA-sekvensen som sträcker sig från startmärket och slutar före stoppmärket bort från den ursprungliga lässekvensen och bearbetades vidare (hädanefter kallad "infogning").Efter translation av insättningen avlägsnas delen efter det första stoppkodonet vid 5'-änden av primern från insättningen.Dessutom avlägsnades även nukleotider som leder till ofullständiga kodoner vid 3'-änden av primern.För att utesluta inlägg som endast innehåller bakgrundssekvenser togs också översatta inlägg som börjar med aminosyramönstret "PAG".Peptider med en posttranslationell längd av mindre än 3 aminosyror avlägsnades från biblioteket.Ta slutligen bort redundans i insättningspoolen och bestäm frekvensen för varje unikt inlägg.Resultaten av denna analys inkluderade en lista över nukleotidsekvenser (inserts) och deras (läs) frekvenser (kompletterande figurer 1c och 2).
Gruppera N-mer-DNA-insättningar efter sekvenslikhet: För att eliminera 454/Roche-specifika sekvenseringsfel (som problem med sekvensering av homopolymerförlängningar) och ta bort mindre viktiga redundanser, sorteras tidigare filtrerade N-mer-DNA-sekvensinsättningar (inserts) efter likhet.infogningar (upp till 2 icke-matchande baser tillåtna) med en iterativ algoritm som definieras enligt följande: infogningar sorteras först efter deras frekvens (högst till lägst), och om de är lika, efter deras sekundära sortering efter längd (längst till kortast) ).Således definierar de vanligaste och längsta infogningarna den första "gruppen".Gruppfrekvensen är inställd på nyckelfrekvensen.Sedan försökte man lägga till varje insättning som fanns kvar i den sorterade listan i gruppen genom parvis Needleman-Wunsch-anpassning.Om antalet felmatchningar, infogningar eller borttagningar i en anpassning inte överstiger ett tröskelvärde på 2 läggs en infogning till i gruppen och den totala gruppfrekvensen ökas med hur ofta infogningen lades till.Bilagor som läggs till i en grupp markeras som använda och exkluderas från vidare bearbetning.Om infogningssekvensen inte kan läggas till i en redan befintlig grupp, används infogningssekvensen för att skapa en ny grupp med lämplig infogningsfrekvens och markeras som använd.Iterationen avslutas när varje infogningssekvens antingen har använts för att bilda en ny grupp eller kan inkluderas i en redan existerande grupp.När allt kommer omkring översätts grupperade insättningar bestående av nukleotider så småningom till peptidsekvenser (peptidbibliotek).Resultatet av denna analys är en uppsättning insättningar och deras motsvarande frekvenser som utgör antalet på varandra följande avläsningar (kompletterande fig. 2).
Motivgenerering: Baserat på en lista över unika peptider skapades ett bibliotek innehållande alla möjliga aminosyramönster (aa) som visas nedan.Varje möjligt mönster av längd 3 extraherades från peptiden och dess omvända mönster tillsattes tillsammans med ett gemensamt motivbibliotek innehållande alla mönster (tripeptider).Bibliotek med mycket repetitiva motiv sekvenserades och redundans togs bort.Sedan, för varje tripeptid i motivbiblioteket, kontrollerade vi dess närvaro i biblioteket med hjälp av beräkningsverktyg.I det här fallet läggs frekvensen av peptiden som innehåller tripeptiden på hittat motiv till och tilldelas motivet i motivbiblioteket ("antal motiv").Resultatet av motivgenerering är en tvådimensionell array som innehåller alla förekomster av tripeptider (motiv) och deras respektive värden, vilket är antalet sekvenseringsläsningar som resulterar i motsvarande motiv när läsningarna filtreras, grupperas och översätts.Mätvärden som beskrivs i detalj ovan.
Normalisering av antalet motiv och motsvarande spridningsdiagram: Antalet motiv för varje prov normaliserades med hjälp av
där ni är antalet läsningar som innehåller ämne i.Således representerar vi den procentuella frekvensen av avläsningar (eller peptider) som innehåller motiv i i provet.P-värden för det icke-normaliserade antalet motiv beräknades med Fishers exakta test.När det gäller korrelogram av antalet motiv, beräknades Spearmans korrelationer med det normaliserade antalet motiv med R.
För att visualisera innehållet av aminosyror vid varje position i peptidbiblioteket skapades webblogogram 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Först lagras innehållet av aminosyror vid varje position av 12-mer-peptiden i en 20×12-matris.Sedan genereras en uppsättning av 1000 peptider som innehåller samma relativa aminosyrainnehåll vid varje position i fasta-sekvensformat och tillhandahålls som input till webblogotyp 3, som genererar en grafisk representation av det relativa aminosyrainnehållet vid varje position.för ett givet peptidbibliotek.För att visualisera flerdimensionella datamängder skapades värmekartor med hjälp av ett internt utvecklat verktyg i R (biosHeatmap, ett ännu inte släppt R-paket).Dendrogrammen som presenteras i värmekartorna beräknades med Wards hierarkiska klustringsmetod med det euklidiska avståndsmåttet.För statistisk analys av motivpoängdata beräknades P-värden för onormaliserad poängsättning med Fishers exakta test.P-värden för andra datamängder beräknades i R med Students t-test eller ANOVA.
Utvalda fagkloner och fager utan insättningar injicerades intravenöst via svansvenen (2×1010 fager/djur i 300 μl PBS).Tio minuter före perfusion och efterföljande fixering injicerades samma djur intravenöst med 100 μl DyLight594-märkt lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minuter efter faginjektion perfunderades råttor genom hjärtat med 50 ml PBS följt av 50 ml 4% PFA/PBS.Hjärnprover fixerades dessutom över natten i 4% PFA/PBS och blötlades i 30% sackaros över natten vid 4°C.Proverna är snabbfrysta i OCT-blandningen.Immunhistokemisk analys av frusna prover utfördes vid rumstemperatur på 30 µm kryosnitt blockerade med 1% BSA och inkuberade med polyklonala FITC-märkta antikroppar mot T7-fag (Novus NB 600-376A) vid 4 °C.Inkubera över natten.Slutligen tvättades sektionerna 3 gånger med PBS och undersöktes med ett konfokalt lasermikroskop (Leica TCS SP5).
Alla peptider med en minsta renhet på 98 % syntetiserades av GenScript USA, biotinylerades och lyofiliserades.Biotin binds via en ytterligare trippel glycin-spacer vid N-terminalen.Kontrollera alla peptider med masspektrometri.
Streptavidin (Sigma S0677) blandades med ett 5-faldigt ekvimolärt överskott av biotinylerad peptid, biotinylerad BACE1-hämmande peptid eller en kombination (förhållande 3:1) av biotinylerad BACE1-hämmande peptid och BACE1-hämmande peptid i DMSOBS/10 % kuberad peptid.1 timme i rumstemperatur före injektion.Streptavidin-konjugerade peptider injicerades intravenöst i en dos av 10 mg/kg i en av svansvenerna hos råttor med en cerebral hålighet.
Koncentrationen av streptavidin-peptidkomplex bedömdes med ELISA.Nunc Maxisorp mikrotiterplattor (Sigma) belades över natten vid 4°C med 1,5 μg/ml mus-anti-streptavidin-antikropp (Thermo, MA1-20011).Efter blockering (blockerande buffert: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % gelatin, 1 % BSA) vid rumstemperatur i 2 timmar, tvätta plattan med 0,05 % Tween-20/PBS (tvättbuffert) under 3 sekunder, CSF och plasmaprover späddes ut 0ma med CSF,0ma och plasmabuffert 0ma. SF 1:115).Plattan inkuberades sedan över natten vid 4°C med detektionsantikropp (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Efter tre tvättsteg detekterades streptavidin genom inkubation i TMB-substratlösning (Roche) i upp till 20 minuter.Efter att ha stoppat färgutvecklingen med 1M H2SO4, mät absorbansen vid 450 nm.
Funktionen av streptavidin-peptid-BACE1-inhibitorkomplexet utvärderades med Ap(1-40) ELISA enligt tillverkarens protokoll (Wako, 294-64701).Kortfattat späddes CSF-prover i standardutspädningsmedel (1:23) och inkuberades över natten vid 4°C i 96-brunnars plattor belagda med BNT77-infångningsantikropp.Efter fem tvättsteg tillsattes HRP-konjugerad BA27-antikropp och inkuberades i 2 timmar vid 4°C, följt av fem tvättsteg.Aβ(1–40) detekterades genom inkubation i TMB-lösning i 30 minuter vid rumstemperatur.Efter att färgutvecklingen har stoppats med stopplösning, mät absorbansen vid 450 nm.Plasmaprover utsattes för fastfasextraktion före Aβ(1–40) ELISA.Plasma sattes till 0,2% DEA (Sigma) i 96-brunnars plattor och inkuberades vid rumstemperatur under 30 minuter.Efter successiv tvättning av SPE-plattorna (Oasis, 186000679) med vatten och 100 % metanol sattes plasmaprover till SPE-plattorna och all vätska avlägsnades.Proverna tvättades (först med 5 % metanol och sedan 30 % metanol) och eluerades med 2 % NH4OH/90 % metanol.Efter torkning av eluatet vid 55°C i 99 minuter vid konstant N2-ström reducerades proverna i standardutspädningsmedel och Aβ(1–40) mättes enligt beskrivningen ovan.
Hur man citerar denna artikel: Urich, E. et al.Lastleverans till hjärnan med hjälp av transitpeptider identifierade in vivo.vetenskapen.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB och Moos T. Leverans av makromolekylära läkemedel till hjärnan med hjälp av riktad terapi.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. och Martinez-Martinez, P. Leverans av peptid- och proteinläkemedel över blod-hjärnbarriären.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Blod-hjärnbarriären: en flaskhals i utvecklingen av hjärnläkemedel.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG och Byrd, A. Utsikter för förbättrad läkemedelstillförsel och målinriktning till hjärnan via choroid plexus-CSF-vägen.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisering av bioläkemedel med molekylära trojanska hästar för hjärnleverans.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-receptormedierad peptidtransport över blod-hjärnbarriären.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Öka hjärnpenetration och effektivitet av terapeutiska antikroppar med hjälp av monovalenta molekylära skyttlar.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transferrinreceptor (TfR) transport bestämmer hjärnans upptag av affinitetsvarianter av TfR-antikroppar.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).