Vissa LC-felsökningsämnen är aldrig inaktuella, eftersom det finns problem i LC-praxis, även när instrumenttekniken förbättras med tiden. Det finns många sätt på vilka problem kan uppstå i ett LC-system och hamna i dålig toppform. När problem relaterade till toppform uppstår hjälper en kort lista över möjliga orsaker till dessa resultat att förenkla vår felsökningsupplevelse.
Det har varit roligt att skriva den här kolumnen "LC-felsökning" och tänka på ämnen varje månad, eftersom vissa ämnen aldrig går ur stil. Medan inom området kromatografiforskning blir vissa ämnen eller idéer föråldrade eftersom de ersätts av nyare och bättre idéer, inom felsökningsområdet, eftersom den första felsökningsartikeln i LC-tidskriften (1) fortfarande finns i den här tidskriften (1) 983(1).Under de senaste åren har jag fokuserat flera LC-felsökningssektioner på samtida trender som påverkar vätskekromatografi (LC) (till exempel den relativa jämförelsen av vår förståelse av effekten av tryck på retention [2] New Advances) Vår tolkning av LC-resultat och hur man felsöker med moderna LC-instrument som startade i den här månaden,'20m, installationen i denna månad,'20. , som fokuserade på några av "liv och död"-ämnena för LC-felsökning — element som är bra för alla felsökare är viktiga, oavsett åldern på systemet vi använder. Kärnämnet i den här serien är mycket relevant för LCGC:s berömda "LC Troubleshooting Guide"-väggdiagram (4) som hänger i många laboratorier som är relaterade till den här seriens spetsar eller karaktärsfrågor. bly, väggdiagrammet listar 44 olika potentiella orsaker till dålig toppform! Vi kan inte överväga alla dessa frågor i detalj i en artikel, så i den här första delen om ämnet kommer jag att fokusera på några av de jag ser oftast. Jag hoppas att unga och gamla LC-användare kommer att hitta några användbara tips och påminnelser om detta viktiga ämne.
Jag kommer på mig själv att svara på felsökningsfrågor i allt högre grad med "allt är möjligt". Det här svaret kan tyckas lätt när jag överväger observationer som är svåra att tolka, men jag tycker att det ofta är lämpligt. Med många möjliga orsaker till dålig toppform är det viktigt att hålla ett öppet sinne när man överväger vad problemet kan vara, och att kunna prioritera potentiella orsaker för att börja våra felsökningsinsatser, fokusera på de allra vanligaste möjligheterna.
Ett nyckelsteg i alla felsökningsövningar - men ett som jag tycker är underskattat - är att inse att det finns ett problem som måste lösas. Att inse att det finns ett problem innebär ofta att inse att det som händer med verktyget skiljer sig från våra förväntningar, som formas av teori, empirisk kunskap och erfarenhet (5). y, framkant, svans, etc.), men också till bredden. Våra förväntningar på den faktiska toppformen är enkla. Teorin (6) stöder väl lärobokens förväntning att, i de flesta fall, de kromatografiska topparna ska vara symmetriska och överensstämma med formen av en Gauss-fördelning, som visas i figur 1a. Det vi förväntar oss av en mer komplex toppform i den här artikeln och kommer att diskuteras i en annan peakwidth-artikel. s i figur 1 visar några av de andra möjligheter som kan observeras – med andra ord, några av sätten som saker kan gå fel på. I resten av den här delen kommer vi att ägna tid åt att diskutera några specifika exempel på situationer som kan leda till dessa formtyper.
Ibland observeras toppar inte alls i kromatogrammet där de förväntas elueras. Väggdiagrammet ovan indikerar att frånvaron av en topp (förutsatt att provet faktiskt innehåller målanalyten i en koncentration som borde göra detektorsvaret tillräckligt för att se det ovanför bruset) vanligtvis är relaterat till något instrumentproblem eller felaktiga mobilfasförhållanden (om det observeras under alla förhållanden).toppar, vanligtvis för "svaga"). En kort lista över potentiella problem och lösningar i denna kategori finns i Tabell I.
Som nämnts ovan är frågan om hur mycket toppbreddning som bör tolereras innan man uppmärksammar och försöker fixa det ett komplext ämne som jag kommer att diskutera i en framtida artikel. Min erfarenhet är att betydande toppbreddning ofta åtföljs av en betydande förändring i toppformen, och toppsvansning är vanligare än pre-peak eller splittring.
Var och en av dessa frågor har diskuterats i detalj i tidigare nummer av Troubleshooting LC, och läsare som är intresserade av dessa ämnen kan hänvisa till dessa tidigare artiklar för information om grundorsakerna och potentiella lösningar på dessa problem.Fler detaljer.
Peak tailing, peak fronting och splitting kan alla orsakas av kemiska eller fysikaliska fenomen, och listan över potentiella lösningar på dessa problem varierar mycket, beroende på om vi har att göra med ett kemiskt eller fysikaliskt problem. Ofta, genom att jämföra de olika topparna i ett kromatogram, kan du hitta viktiga ledtrådar om vilken som är den skyldige i någon av de flesta fallen, utan de flesta av de skyldiga. fysisk. Om bara en eller ett fåtal toppar påverkas, men resten ser bra ut, är orsaken troligen kemisk.
De kemiska orsakerna till peak tailing är för komplexa för att kortfattat diskuteras här. Den intresserade läsaren hänvisas till det senaste numret av "LC Troubleshooting" för en mer djupgående diskussion (10). En enkel sak att försöka är dock att minska massan av den injicerade analyten och se om toppformen förbättras. I så fall är detta en bra ledtråd om att "analyten måste vara begränsad till mängden i mängden". eller så måste de kromatografiska förhållandena ändras så att bra toppformer kan erhållas även med större massor injicerade.
Det finns också många potentiella fysiska orsaker till peak tailing.Läsare som är intresserade av en detaljerad diskussion om möjligheterna hänvisas till ett annat färskt nummer av "LC Troubleshooting" (11). En av de vanligare fysiska orsakerna till peak tailing är en dålig anslutning vid en punkt mellan injektorn och detektorn (12). Ett extremt exempel visas i figur 1d, i ett nytt fall, i en vecka sedan, vi byggde ett nytt system. ve som vi inte hade använt tidigare, och installerade en injektionsslinga med liten volym med en hylsa som hade gjutits fast på en kapillär av rostfritt stål. Efter några inledande felsökningsexperiment insåg vi att portdjupet i insprutningsventilens stator var mycket djupare än vad vi var vana vid, vilket resulterade i en stor dödvolym i botten av öppningen, det här problemet kan enkelt lösas med en annan slinga. till rätt position för att eliminera dödvolymen i botten av porten.
Toppfronter som de som visas i figur 1e kan också orsakas av fysikaliska eller kemiska problem. En vanlig fysisk orsak till framkanten är att partikelbädden i kolonnen inte är väl packad, eller att partiklarna har omorganiserats med tiden. Precis som med toppsvans orsakad av detta fysikaliska fenomen, är det bästa sättet att åtgärda detta att ersätta kolonnens form och fortsätta att vara en kemiskt ursprungslinje, som vi ofta kallar en främre kant. tentionsförhållanden.Under ideala (linjära) förhållanden är mängden analyt som kvarhålls av den stationära fasen (därav retentionsfaktorn) linjärt relaterad till koncentrationen av analyten i kolonnen. Kromatografiskt betyder detta att när massan av analyt som injiceras i kolonnen ökar, blir toppen högre, men inte bredare. ed.Dessutom bestämmer ickelinjära former formen på kromatografiska toppar, vilket resulterar i främre eller bakre kanter. Liksom med massöverbelastning som orsakar toppsvans (10), kan toppledning orsakad av ickelinjär retention också diagnostiseras genom att reducera den injicerade analytmassan. Om toppformen förbättras, får metoden inte överskrida den främre kanten till att ändras till att överskrida den främre kantens kvalitet till att inte överskrida den grafiska kvaliteten. imitera detta beteende.
Ibland observerar vi vad som verkar vara en "delad" topp, som visas i figur 1f. Det första steget för att lösa detta problem är att bestämma om toppformen beror på partiell sameluering (dvs närvaron av två distinkta men nära eluerande föreningar). Om det faktiskt finns två olika analyter som elueras nära varandra, så är det en platta, t.ex. att välja en platta eller en platta. och de uppenbara "delade" topparna är relaterade till fysiska prestanda har ingenting att göra med själva kolonnen. Ofta är den viktigaste ledtråden till detta beslut om alla toppar i kromatogrammet uppvisar delade former, eller bara en eller två. Om det bara är en eller två, är det förmodligen en fråga om sameluering;om alla toppar är delade är det förmodligen ett fysiskt problem, troligen relaterat till själva kolumnen.
Delade toppar relaterade till de fysikaliska egenskaperna hos själva kolonnen beror vanligtvis på delvis blockerade inlopps- eller utloppsfrittor, eller omorganisering av partiklar i kolonnen, vilket gör att den mobila fasen kan flöda snabbare än den mobila fasen i vissa områden av kolonnkanalbildningen .i andra regioner (11). Delvis igensatt fritta kan ibland rensas genom att vända flödet genom kolonnen;Men enligt min erfarenhet är detta vanligtvis en kortsiktig snarare än en långsiktig lösning. Detta är ofta ödesdigert med moderna kolonner om partiklarna rekombineras i kolonnen. Vid det här laget är det bäst att byta ut kolonnen och fortsätta.
Toppen i figur 1g, också från ett nyligen tillfälle i mitt eget labb, indikerar vanligtvis att signalen är så hög att den har nått den övre delen av svarsintervallet. För optiska absorbansdetektorer (UV-vis i det här fallet), när analytkoncentrationen är mycket hög, absorberar analyten det mesta av ljuset som passerar genom detektorflödescellen, vilket lämnar mycket litet ljus under dessa förhållanden att detekteras från olika förhållanden. källor till brus, såsom ströljus och "mörkström", vilket gör signalen mycket "suddig" till utseendet och oberoende av analytkoncentrationen.När detta händer kan problemet ofta enkelt lösas genom att minska injektionsvolymen för analyten – minska injektionsvolymen, späda ut provet eller båda.
I Chromatography School använder vi detektorsignalen (dvs. Y-axeln i kromatogrammet) som en indikator på analytkoncentrationen i provet. Så det verkar konstigt att se ett kromatogram med en signal under noll, som den enkla tolkningen är att detta indikerar en negativ analyskoncentration-vilket inte är fysiskt möjligt. I min erfarenhet, negativa toppar är mest observerade när det är observerat att det är en negativ analytkoncentration-vilket inte är fysiskt möjligt.
I det här fallet betyder en negativ topp helt enkelt att molekylerna som elueras från kolonnen absorberar mindre ljus än själva den mobila fasen omedelbart före och efter toppen. Detta kan till exempel inträffa när man använder relativt låga detektionsvåglängder (<230 nm) och tillsatser i mobilfas som absorberar det mesta av ljuset vid dessa våglängder. Sådana tillsatser kan vara t.ex. lösningsmedel i form av rörlig fas eller buffertform, som i själva verket är metanol eller buffert. s att förbereda en kalibreringskurva och erhålla korrekt kvantitativ information, så det finns ingen grundläggande anledning att undvika dem i sig (denna metod kallas ibland för "indirekt UV-detektering") (13). Men om vi verkligen vill undvika negativa toppar helt och hållet, när det gäller absorbansdetektering, är den bästa lösningen att använda en annan detektionsvåglängd, så att den mobila fasen av analyten absorberar mer än analytens sammansättning, så att den mobila fasen av analyterna absorberar mer eller ändrar ljuset. .
Negativa toppar kan också uppträda vid användning av brytningsindex (RI)-detektion när brytningsindexet för andra komponenter än analyten i provet, såsom lösningsmedelsmatrisen, skiljer sig från brytningsindexet för den mobila fasen. Detta händer också med UV-vis-detektion, men denna effekt tenderar att dämpas i förhållande till RI-detektionen. mobil fas.
I del tre om det grundläggande ämnet för LC-felsökning diskuterade jag situationer där den observerade toppformen skiljer sig från den förväntade eller normala toppformen. Effektiv felsökning av sådana problem börjar med kunskap om förväntade toppformer (baserat på teori eller tidigare erfarenhet av befintliga metoder), så avvikelser från dessa förväntningar är uppenbara. Vid toppform, kan problem med toppform, etc. diskuteras många olika. i detalj några av de anledningar som jag ser oftast. Att känna till dessa detaljer är ett bra ställe att börja felsökning på, men fångar inte alla möjligheter. Läsare som är intresserade av en mer djupgående lista över orsaker och lösningar kan hänvisa till LCGC:s "LC Troubleshooting Guide"-väggdiagram.
(4) LCGC “LC Troubleshooting Guide” väggdiagram.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), sid. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF och Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.