Tack för att du besöker Nature.com. Du använder en webbläsarversion med begränsat CSS-stöd. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). För att säkerställa fortsatt support visar vi dessutom webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Visar en karusell med tre bilder samtidigt. Använd knapparna Föregående och Nästa för att bläddra igenom tre bilder åt gången, eller använd skjutreglageknapparna i slutet för att bläddra igenom tre bilder åt gången.
Självorganiserande neurala organeller representerar en lovande in vitro-plattform för modellering av mänsklig utveckling och sjukdom. Organoider saknar dock den konnektivitet som finns in vivo, vilket begränsar mognad och förhindrar integration med andra kretsar som styr beteende. Här visar vi att kortikala organoider härledda från mänskliga stamceller som transplanterats in i den somatosensoriska cortexen hos nyfödda nakna råttor utvecklar mogna celltyper som integreras i sensoriska och motivationsrelaterade kretsar. MR avslöjade organoidtillväxt efter transplantation i flera stamcellslinjer och djur, medan single-core-analys avslöjade progression av kortikogenes och framväxten av ett aktivitetsberoende transkriptionsprogram. Transplanterade kortikala neuroner uppvisar faktiskt mer komplexa morfologiska, synaptiska och interna membranegenskaper än deras in vitro-motsvarigheter, vilket möjliggör detektion av neuronala defekter hos patienter med Timothys syndrom. Anatomisk och funktionell spårning har visat att transplanterade organeller tar emot talamokortikala och kortikokortikala input, och in vivo-registreringar av neural aktivitet tyder på att dessa input kan generera sensoriska svar i mänskliga celler. Slutligen sträcker sig kortikala organoider axoner genom råtthjärnan, och deras optogenetiska aktivering leder till belöningssökande beteende. Således mognar transplanterade humana cortexneuroner och deltar i värdens kretsar som styr beteende. Vi förväntar oss att denna metod underlättar detektionen av fenotyper på strängnivå i patientderiverade celler som inte kan detekteras på andra sätt.
Den utvecklande mänskliga hjärnan är en anmärkningsvärd självorganiserande process där celler prolifererar, differentierar, migrerar och ansluter för att bilda funktionella neuronala kretsar som ytterligare förfinas genom sensorisk upplevelse. Ett centralt problem för att förstå den mänskliga hjärnans utveckling, särskilt i samband med sjukdom, är bristen på tillgång till hjärnvävnad. Självorganiserande organeller, inklusive mänskliga cortexorganoider (hCO; även känd som den mänskliga cortexsfären), kan generera 2,3,4,5,6. Emellertid begränsar flera begränsningar deras bredare tillämpning för att förstå utvecklingen och funktionen av neurala kretsar. I synnerhet är det oklart om hCO-mognad begränsas av avsaknaden av vissa mikromiljömässiga och sensoriska input som finns in vivo. Eftersom hCO inte är integrerade i kretsar som kan generera beteendemässiga resultat är deras användbarhet vid modellering av genetiskt komplexa och beteendemässiga neuropsykiatriska störningar för närvarande begränsad.
Transplantation av hCO till en intakt levande hjärna kan övervinna dessa begränsningar. Tidigare studier har visat att mänskliga neuroner transplanterade i gnagarcortex kan överleva, projicera och kommunicera med gnagarceller 7,8,9,10,11,12. Dessa experiment utförs dock vanligtvis på vuxna djur, vilket kan begränsa synaptisk och axonal integration. Här beskriver vi ett transplantationsparadigm där vi transplanterade 3D hCO härledd från hiPS-celler till den primära somatosensoriska cortexen (S1) hos immunbristfälliga råttor i ett tidigt skede av den plastiska utvecklingen. Transplanterade hCO (t-hCO) neuroner genomgår betydande mognad, tar emot thalamokortikala och kortikal-kortikala insignaler som framkallar sensoriska svar och utsträcker axonala projektioner in i råtthjärnan för att driva belöningssökande beteende. Förlängd mognad av t-hCO har avslöjat neuronala defekter hos patienter med Timothys syndrom (TS), en allvarlig genetisk sjukdom orsakad av mutationer i den spänningskänsliga L-typ CaV1.2 kalciumkanalen (kodad av CACNA1C).
För att studera mänskliga kortikala neuroner i kretsar in vivo, transplanterade vi stereotaktiskt intakt 3D hCO till S1 hos tidiga postnatala atymiska råttor (dag 3-7 postnatalt) (Fig. 1a och utökade data i Fig. 1a-c). Vid denna tidpunkt har de thalamokortikala och kortikokortikala axonala projektionerna ännu inte slutfört sin S1-innervation (ref. 13). Således är denna metod utformad för att maximera t-hCO-integrationen samtidigt som påverkan på endogena kretsar minimeras. För att visualisera lokaliseringen av t-hCO hos levande djur utförde vi T2-viktade MRI-hjärnrekonstruktioner av råttor 2–3 månader efter transplantation (Fig. 1b och utökade data, Fig. 1d). t-hCO3 observerades lätt och volymmätningar av t-hCO3 liknade de som beräknats från fixerade skivor (Utökad data Fig. 1d,e; P > 0,05). t-hCO3 observerades lätt och volymmätningar av t-hCO3 liknade de som beräknats från fixerade skivor (Utökad data Fig. 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных расрезис, ( рис Id, e; P> 0,05). t-hCO3 observerades lätt, och volumetriska t-hCO3-mätningar liknade de som beräknats för fasta sektioner (expanderade data, fig. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P >。5）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезиов ( рис Id, e; P> 0,05). t-hCO3 observerades lätt, och volumetriska t-hCO3-mätningar liknade de som beräknats för fasta sektioner (expanderade data, fig. 1d, e; P > 0,05).Vi bestämde t-hCO3 hos 81 % av de transplanterade djuren ungefär 2 månader efter transplantation (n = 72 djur; hCO3 från 10 hiPS-cellinjer; hiPS-cellinjer i tilläggstabell 1). Av dessa var 87 % belägna i hjärnbarken (Fig. 1c). Genom att utföra seriella MR-skanningar vid flera tidpunkter i samma transplanterade råtta fann vi en niofaldig ökning av t-hCO3-volymen inom 3 månader (Fig. 1d och utökade data, Fig. 1f). Transplanterade djur hade en hög överlevnadsgrad (74 %) 12 månader efter transplantation (utökade data, Fig. 1g och tilläggstabell 2), och inga uppenbara motoriska eller minnesstörningar, glios eller elektroencefalogram (EEG) hittades. Data Fig. 1g och tilläggstabell 2). 1h–m och 3e).
a, Schematisk bild av experimentell design. hCO3 härlett från hiPS-celler transplanterades till S1 hos nyfödda nakna råttor på dag 30-60 av differentieringen. b, T2-viktade koronala och horisontella MR-bilder som visar t-hCO3 i S1 2 månader efter transplantation. Skalstreck, 2 mm. c, Kvantifiering av framgångsfrekvensen för engraftment visas för varje hiPS-cellinje (n = 108, siffror inom staplarna indikerar mängden t-hCO3 per hIPS-cellinje) och kortikal eller subkortikal plats (n = 88). d, MR-bild av en kranskärl (vänster; skalstreck, 3 mm) och motsvarande 3D-volymetrisk rekonstruktion (skalstreck, 3 mm) som visar en ökning av t-hCO3 under 3 månader. e, Översikt av t-hCO3-mönster i råtthjärnbarken. Skalstreck, 1 mm. f, Representativa immuncytokemiska bilder av t-hCO visade från vänster till höger (under differentiering): PPP1R17 (4 månader gammal), NeuN (8 månader gammal), SOX9 och GFAP (8 månader gammal), PDGFRα; (8 månader), MAP2 (8 månader) och IBA1 (8 månader). Skalstreck, 20 µm. Samuttryck av HNA indikerar celler av mänskligt ursprung. g, snRNA-sekvens: Unified manifold and projection (UMAP) dimensionalitetsreduktionsavbildning av alla högkvalitativa t-hCO-kärnor efter Seurat-integration (n=3 t-hCO-prover, n=2 hiPS-cellinjer). Astrocyter, celler i astrocytlinjen; cyc prog, cirkulerande progenitorceller; GluN DL, djupa glutamaterga neuroner; GluN DL/SP, djupa och sublamellära glutamaterga neuroner; GluN UL, övre lager glutamaterga neuroner; oligodendrocyter, oligodendrocyter; OPC, oligodendrocytprogenitorceller; RELN, reelin-neuroner. h, Gene Ontology (GO) termisk anrikningsanalys av gener signifikant uppreglerade (justerat P <0,05, vikningsförändring > 2, uttryckt i minst 10% av kärnorna) i t-hCO glutamaterga neuroner jämfört med hCO glutamaterga neuroner. h, Gene Ontology (GO) termisk anrikningsanalys av gener signifikant uppreglerade (justerat P <0,05, vikningsförändring > 2, uttryckt i minst 10% av kärnorna) i t-hCO glutamaterga neuroner jämfört med hCO glutamaterga neuroner. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) för генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, сратность изкретность > > по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO på сравнению с глутаматергическими нейронах. h, Gene Ontology (GO) termanrikningsanalys för gener med signifikant aktivering (justerad P <0, 05, vikningsförändring > 2, uttryck i minst 10 % kärnor) i t-hCO glutamaterga neuroner jämfört med hCO glutamaterga neuroner. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎整后P 0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术〭密术语密 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上谼 弌吃 p <0 ０合变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 焚 的 的 焇 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по 1% краенев краене глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ. h, gener var signifikant uppreglerade (justerat P < 0,05, faldig förändring > 2, uttryckt i minst 10% av kärnorna) i t-hCO glutamaterga neuroner jämfört med hCO glutamaterga neuroner Ontologisk (GO) analys av anrikningstermen.Den streckade linjen indikerar ett aq-värde på 0,05. i, UMAP-avbildning av GluN-celltyper i t-hCO med användning av märkningsöverföring från en referensdatauppsättning av 22 snRNA-sekvenser från vuxen motorisk cortex. CT — kortikotalamiska celler, ET — extracerebrala celler, IT — interna telencefala celler, NP — nära projektion.
Vi utvärderade sedan cytoarkitekturen och den övergripande cellsammansättningen av t-hCO. Antikroppsfärgning av råttendotelceller avslöjade vaskularisering med t-hCO, medan IBA1-färgning avslöjade närvaron av råttmikroglia i hela transplantatet (Fig. 1f och utökade data, Fig. 3c, d). Immunfärgning avslöjade humana nukleära antigen (HNA)-positiva celler som samuttryckte PPP1R17 (kortikala progenitorer), NeuN (neuroner), SOX9 och GFAP (glia-deriverade celler) eller PDGFRα (oligodendrocytprogenitorer) (Figur 1f). För att studera den cellulära sammansättningen av t-hCO vid enskild cellupplösning utförde vi single-core RNA-sekvensering (snRNA-seq) efter cirka 8 månaders differentiering. Bulkfiltrering och avlägsnande av råttkärnor gav 21 500 högkvalitativa humana mononukleära kartor (Fig. 1g och utökade data, Fig. 4a, b). Uttrycksmönster för typiska celltypsmarkörer identifierade kluster av viktiga kortikala cellklasser, inklusive djupa och ytliga glutamaterga neuroner, cirkulerande progenitorceller, oligodendrocyter och astrocytlinjer (Fig. 1g, utökade data, Fig. 4c och kompletterande tabell 3). Immunfärgning för SATB2 och CTIP2 visade att trots närvaron av kortikala subtyper uppvisade t-hCO inte tydlig anatomisk stratifiering (utökade data, Fig. 3a). Stadiematchad snRNA-sekvensering av hCO producerade i stort sett liknande cellklasser, med några få undantag, inklusive frånvaron av oligodendrocyter och närvaron av GABAerga neuroner, vilket kan återspegla de tidigare rapporterade gynnsamma in vitro-förhållandena för laterala progenitorceller15 (utökade data, Fig. 4f-i och kompletterande tabell 4). Differentiell genuttrycksanalys avslöjade signifikanta skillnader i glutamaterga neuroner mellan t-hCO och hCO (kompletterande tabell 5), inklusive aktivering av uppsättningar av gener associerade med neuronal mognad såsom synaptisk signalering, dendritisk lokalisering och spänningsstyrd kanalaktivitet (figur 1h och kompletterande tabell 5). Tabell 6). Följaktligen uppvisade kortikala glutamaterga t-hCO-neuroner accelererad transkriptionell mognad.
För att klargöra om dessa transkriptionella förändringar i t-hCO var relaterade till morfologiska skillnader mellan hCO in vitro och t-hCO in vivo, rekonstruerade vi stadium-matchade biocytin-fyllda hCO och hCO i akuta sektioner efter 7–8 månaders differentiering. hCO neuroner (Fig. 2a). t-hCO neuroner var signifikant större, hade 1,5 gånger somadiametern, dubbelt så många dendriter och en total sexfaldig ökning av total dendritisk längd jämfört med in vitro hCO (Fig. 2b). Dessutom observerade vi en signifikant högre densitet av dendritiska taggar i t-hCO neuroner än i hCO neuroner (Fig. 2c). Detta tyder på att t-hCO neuroner genomgår omfattande dendritisk förlängning och förgrening, vilket i kombination med fortsatt cellproliferation kan bidra till den intensiva tillväxten av t-hCO efter transplantation (Fig. 1d och Utökade Data Fig. 1f). Detta fick oss att undersöka de elektrofysiologiska egenskaperna. Membrankapacitansen var åtta gånger högre (utökade data, Fig. 8d), membranpotentialen i vilotillstånd var mer hyperpolariserad (ungefär 20 mV), och ströminjektion inducerade en högre maximal excitationshastighet i t-hCO-neuroner än i hCO-neuroner. in vitro (Fig. 2d), e), vilket överensstämmer med de större och mer komplexa morfologiska egenskaperna hos t-hCO. Dessutom var frekvensen av spontana exciterande postsynaptiska strömhändelser (EPSC) signifikant högre i t-hCO-neuroner (Fig. 2f), vilket tyder på att den ökade densiteten av dendritiska taggar som observerades i t-hCO-neuroner var associerad med funktionell excitabilitet. sexuell synaps. Vi bekräftade den omogna karaktären hos hCO-neuroner in vitro genom att registrera märkta glutamaterga neuroner (utökade data, Fig. 6a-c).
a, 3D-rekonstruktion av biocytinfyllda hCO- och t-hCO-neuroner efter 8 månaders differentiering. b, Kvantifiering av morfologiska egenskaper (n = 8 hCO-neuroner, n = 6 t-hCO-neuroner; **P = 0,0084, *P = 0,0179 och ***P < 0,0001). b, Kvantifiering av morfologiska egenskaper (n = 8 hCO-neuroner, n = 6 t-hCO-neuroner; **P = 0,0084, *P = 0,0179 och ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 9 0,01***). b, kvantifiering av morfologiska egenskaper (n = 8 hCO-neuroner, n = 6 t-hCO-neuroner; **P = 0,0084, *P = 0,0179 och ***P <0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，,0*P9 = 0,0084，1***P9 0 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，,0*P9 = 0,0084，1***P9 0 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 9 0,01***). b, kvantifiering av morfologiska egenskaper (n = 8 hCO-neuroner, n = 6 t-hCO-neuroner; **P = 0,0084, *P = 0,0179 och ***P <0,0001).c, 3D-rekonstruktion av hCO- och t-hCO-dendritgrenar efter 8 månaders differentiering. Röda asterisker indikerar förmodade dendrittaggar. Kvantifiering av dendrittaggarnas densitet (n = 8 hCO-neuroner, n = 6 t-hCO-neuroner; **P = 0,0092). d, Kvantifiering av vilomembranpotentialen (n = 25 hCO₃-neuroner, n = 16 t-hCO₃-neuroner; ***P < 0,0001). d, Kvantifiering av vilomembranpotentialen (n = 25 hCO₃-neuroner, n = 16 t-hCO₃-neuroner; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kvantifiering av vilomembranpotential (n = 25 hCO₃-neuroner, n = 16 t-hCO₃-neuroner; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kvantifiering av vilomembranpotential (n = 25 hCO₃-neuroner, n = 16 t-hCO₃-neuroner; ***P < 0,0001). e, Repetitiv aktionspotentialavfyrning i hCO och t-hCO inducerad genom ökande ströminjektioner och kvantifiering av maximal avfyrningshastighet (n = 25 hCO neuroner, n = 16 t-hCO neuroner; ***P < 0,0001). e, Repetitiv aktionspotentialavfyrning i hCO och t-hCO inducerad genom ökande ströminjektioner och kvantifiering av maximal avfyrningshastighet (n = 25 hCO neuroner, n = 16 t-hCO neuroner; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO och t-hCO, вызванное увеличением тока, och количествия скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, återavfyrning av aktionspotential i hCO och t-hCO inducerad genom strömökning och kvantifiering av maximal avfyrningshastighet (n = 25 hCO neuroner, n = 16 t-hCO neuroner; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电缇n =2个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 夼及 最 夼刏 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO och t-hCO, вызванное увеличением подачи токенкаич, и коцич максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, repetitiv avfyrning av hCO3- och t-hCO3-aktionspotentialer inducerade av ökad strömtillförsel och kvantifiering av maximal avfyrningshastighet (n = 25 hCO3-neuroner, n = 16 t-hCO3-neuroner; *** P < 0,0001). f, Spontana EPSC:er (sEPSC:er) i hCO- och t-hCO-neuroner vid 8 månaders differentiering, och kvantifiering av frekvensen av synaptiska händelser (n = 25 hCO-neuroner, n = 17 t-hCO-neuroner; ***P < 0,0001). f, Spontana EPSC:er (sEPSC:er) i hCO- och t-hCO-neuroner vid 8 månaders differentiering, och kvantifiering av frekvensen av synaptiska händelser (n = 25 hCO-neuroner, n = 17 t-hCO-neuroner; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO och t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка часистоты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Spontana EPSC:er (sEPSC:er) i hCO- och t-hCO-neuroner vid 8 månaders differentiering och kvantifiering av synaptiska händelsehastigheter (n = 25 hCO-neuroner, n = 17 t-hCO-neuroner; ***P <0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的5 CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001）. f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO och t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка часистоты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontana EPSC:er (sEPSC:er) i hCO- och t-hCO-neuroner vid 8 månaders differentiering och kvantifiering av synaptiska händelsefrekvenser (n = 25 hCO-neuroner, n = 17 t-hCO-neuroner; *** P <0,0001).För bf togs hCO3 och t-hCO3 i linje 1208-2 från samma differentieringsbatch som hölls parallellt. g, Genuppsättningsanrikningsanalys (ensidig Fishers exakta test) av gener signifikant uppreglerade (justerat P < 0,05, fold change > 2, uttryckt i minst 10% av kärnorna) i t-hCO glutamaterga neuroner jämfört med hCO glutamaterga neuroner med genuppsättningar av både tidig-respons (ERG) och sen-respons (LRG) aktivitetsberoende gener identifierade från en in vivo-musstudie16 och människospecifika LRG från in vitro-neuroner17. g, Genuppsättningsanrikningsanalys (ensidig Fishers exakta test) av gener signifikant uppreglerade (justerat P < 0,05, fold change > 2, uttryckt i minst 10% av kärnorna) i t-hCO glutamaterga neuroner jämfört med hCO glutamaterga neuroner med genuppsättningar av både tidig-respons (ERG) och sen-respons (LRG) aktivitetsberoende gener identifierade från en in vivo-musstudie16 och människospecifika LRG från in vitro-neuroner17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацорний (сковацией (sk,0,0) кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейровнах t-hCO по сратность глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от aktioner, informationssökningar och applikationer för in vivo16, och erbjudanden för LRG in vitro17. g, analys av genuppsättningsanrikning (ensidigt Fishers exakta test) av gener med signifikant aktivering (justerat P <0,05, faldig förändring >2, uttryck i minst 10 % av kärnorna) i t-hCO glutamaterga neuroner jämfört med hCO glutamaterga neuronuppsättningar av både tidiga (ERG) och sena (LRG) aktivitetsberoende gener identifierade i in vivo-möss och humanspecifika LRG från neuroner in vitro. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 襞经 兰 神绸 兰<0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 羧单） （单体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 嚄 基因瞏 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическическими нейтельно ( P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишератест Фишерат) позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 och нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO glutamaterga neuroner var signifikant uppreglerade jämfört med hCO glutamaterga neuroner (justerat P < 0,05, faldig förändring > 2, minst 10 %. Genanrikningsanalys av tidig respons (ERG) och sen respons (ensidigt Fishers exakta test) responsaktivitetsberoende gener (LRG) identifierade i in vivo-möss16 och in vitro-neuroner.17 Mänskliga specifika LRG.Den streckade linjen indikerar ett Bonferroni-korrigerat P-värde på 0,05. h, GluN-genuttryck (pseudopaket och skalning av varje gen) var signifikant uppreglerat i snRNA-sekvensreplikor av LRG-gener i t-hCO glutamaterga neuroner. i, immunfärgning som visar SCG2-uttryck i t-hCO (övre) och hCO (nedre) neuroner. Vita pilar pekar på SCG2+ celler. Skalstreck, 25 µm. Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse.
Baserat på den ökade aktiviteten av t-hCO observerad i ex vivo-skivor, avslöjade snRNA-seq en aktivitetsberoende uppreglering av gentranskript i t-hCO jämfört med hCO in vitro. Glutamaterga t-hCO-neuroner uttryckte högre nivåer av gener som reglerar sen responsaktivitet (Fig. 2g,h), vilket hittades i tidigare studier i mus- och humana neuroner 16,17. Till exempel visade BDNF 18, SCG2 och OSTN, en primatspecifik aktivitetsreglerande gen, ökat uttryck i t-hCO-neuroner jämfört med hCO-neuroner (Fig. 2g-i). Således uppvisade t-hCO-neuroner förbättrade mognadsegenskaper jämfört med hCO-neuroner genom transkriptionella, morfologiska och funktionella analyser.
För att ytterligare utvärdera sambandet mellan t-hCO-mognad och mänsklig hjärnutveckling utförde vi transkriptomiska jämförelser av foster- och vuxenkortikala celltyper19,20 och vuxen21,22 samt omfattande data om kortikal genuttryck23 under utveckling (utökade data, Fig. 5). Med tidigare arbete24 är den globala hCO- och t-hCO-transkriptommognadsstatusen vid 7–8 månaders differentiering i stort sett förenlig med in vivo-utvecklingstid och är mest likvärdig med sent fosterliv (Utökade data Fig. 5a). Det är värt att notera att vi observerade ökad transkriptommognad i t-hCO jämfört med åldersmatchad hCO, samt transkriptomaktivering i samband med synaptogenes, astrogenes och myelinisering (utökade data, Fig. 5b-d). På cellnivå fann vi bevis på en tunnare cortex-subtyp i t-hCO, med kluster av glutamaterga neuroner som överlappar med vuxna L2/3-, L5- och L6-neuronsubtyper (Figur 1i). Däremot var klusteröverlappningen mellan glutamaterga t-hCO-neuroner och fosterkortikala neuroner mer begränsad i mitten av graviditeten (utökad data, figur 5e-j). För att avgöra om t-hCO-neuroner funktionellt sett liknar mänskliga postnatala neokortikala neuroner utförde vi elektrofysiologiska registreringar och anatomiska rekonstruktioner av mänskliga L2/3-pyramidala neuroner i skarpa sektioner av den mänskliga postnatala cortexen (utökad data, figur 7a). De elektrofysiologiska egenskaperna hos L2/3-pyramidala neuroner liknade de hos t-hCO-pyramidala neuroner (utökad data, figur 7e). Morfologiskt sett liknade L2/3-neuroner från postnatala mänskliga prover mer t-hCO än hCO, även om L2/3-celler var längre, innehöll fler grenar totalt sett och hade en högre ryggtäthet (figur 3g och utökad data, figur 7b-). G).
a, transplantation av hCO producerad av kontroll- och TS hiPS-cellinjer till nyfödda råttor. b, 3D-rekonstruktion av biocytinfyllda t-hCO-neuroner efter 8 månaders differentiering. c, kvantifiering av genomsnittlig dendritisk längd (n = 19 kontrollneuroner, n = 21 TS-neuroner; **P = 0,0041). d, 3D-rekonstruerade dendritiska grenar från kontroll och TS t-hCO vid 8 månaders differentiering, och kvantifiering av dendritisk ryggradstäthet (n = 16 kontrollneuroner, n = 21 TS-neuroner, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonstruerade dendritiska grenar från kontroll och TS t-hCO vid 8 månaders differentiering, och kvantifiering av dendritisk ryggradstäthet (n = 16 kontrollneuroner, n = 21 TS-neuroner, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonstruerade vätskekontroller och TS t-hCO har 8 månaders ekonomisystem och ekonomisystem дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-rekonstruktion av dendritiska grenar från kontroll och t-hCO TS vid 8 månaders differentiering och kvantifiering av dendritisk ryggradstäthet (n = 16 kontrollneuroner, n = 21 TS-neuroner, ***P <0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化1,6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 导度 1n 度 1n神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-konstnärer och TS t-hCO har 8 månaders ekonomisystem och дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-rekonstruktion av kontrolldendritiska grenar och TS t-hCO vid 8 månaders differentiering och kvantifiering av dendritisk ryggradstäthet (n = 16 kontrollneuroner, n = 21 TS-neuroner, ***P <0,0001).Röda asterisker indikerar förmodade dendritiska taggar. e, spontana EPSC i kontroll- och TS t-hCO-neuroner efter 8 månaders differentiering. f, kumulativ frekvensdiagram och kvantifiering av frekvens och amplitud för synaptiska händelser (n = 32 kontrollneuroner, n = 26 TS-neuroner; **P = 0,0076 och P = 0,8102). g, Scholl-analys av TS- och kontrollneuroner i hCO och t-hCO. Streckade linjer visar humana L2/3 postnatala pyramidala neuroner för jämförelse (n = 24 kontroll t-hCO-neuroner, n = 21 TS t-hCO-neuroner, n = 8 kontroll hCO-neuroner och n = 7 TS hCO-neuroner). Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse.
t-hCO:s förmåga att replikera de morfologiska och funktionella egenskaperna hos mänskliga cortexneuroner på en hög nivå fick oss att undersöka om t-hCO kunde användas för att detektera sjukdomsfenotyper. Vi fokuserade på TS, en allvarlig neurologisk utvecklingsstörning orsakad av gain-of-function-mutationer i genen som kodar för CaV1.2, vilken initierar aktivitetsberoende gentranskription i neuroner. Vi erhöll hCO från tre TS-patienter som bar den vanligaste substitutionen (p.G406R) och tre kontroller (Fig. 3a). Efter transplantation fann vi att dendritisk morfologi förändrades i TS-neuroner jämfört med kontroller (Fig. 3b och utökade data, Fig. 8a,b), med en tvåfaldig ökning av antalet primära dendriter och en total ökning av medel- och total minskning av dendritisk längd (Fig. 3c och utökade data, Fig. 8c). Detta var associerat med en ökad täthet av taggar och en ökad frekvens av spontana EPSC i TS jämfört med kontrollneuroner (Fig. 3d–f och utökade data, Fig. 8g). Vidare analys avslöjade mönster av onormal dendritisk förgrening i t-hCO3-TS jämfört med kontroller, men inte i in vitro-TS hCO3 vid ett liknande differentieringsstadium (Fig. 3g). Detta överensstämmer med våra tidigare rapporter om aktivitetsberoende dendritisk krympning i TS och belyser denna transplantationsplattforms förmåga att detektera sjukdomsfenotyper in vivo.
Vi frågade sedan i vilken utsträckning t-hCO-celler är funktionellt integrerade i råttans S1. S1 hos gnagare får starka synaptiska input från de ipsilaterala ventrala basala och bakre talamuskärnorna, såväl som de ipsilaterala motoriska och sekundära somatosensoriska kortexerna, och kontralaterala S1 (Fig. 4a). För att återställa innervationsmönstret infekterade vi hCO med rabiesvirus-dG-GFP/AAV-G och transplanterade hCO till S1-råtta 3 dagar senare. Vi observerade tätt GFP-uttryck i neuroner i ipsilaterala S1 och ventrala basala ganglier 7–14 dagar efter transplantation (Fig. 4b, c). Dessutom avslöjade antikroppsfärgning av talamusmarkören netrin G1 närvaron av talamusändningar i t-hCO (Fig. 4d, e). För att utvärdera om dessa afferenta projektioner kunde framkalla synaptiska svar i t-hCO-celler utförde vi helcellsregistreringar från mänskliga celler i skarpa sektioner av det talamokortikala lagret. Elektrisk stimulering av rått-S1, inre kapsel, vit substans, fibrer nära t-hCO eller optogenetisk aktivering av opsin-uttryckande talamusändningar i t-hCO inducerade EPSC:er med kort latens i t-hCO-neuroner exponerade för AMPA-receptorantagonisten NBQX. (Fig. 4f, g och utökade data, Fig. 9a–g). Dessa data visar att t-hCO är anatomiskt integrerad i råtthjärnan och kan aktiveras av råttvärdvävnad.
a, Schematiskt diagram över ett rabiesspårningsexperiment. b, GFP och människospecifikt STEM121-uttryck mellan t-hCO och råtthjärnbark (övre panelen). GFP-uttryck i råttans ipsilaterala ventrala basala kärna (VB) (nedre vänster) och ipsilaterala S1 (nedre höger). Skalstreck, 50 µm. De röda rutorna representerar de områden i hjärnan där bilderna togs. c, kvantifiering av celler som uttrycker GFP (n = 4 råttor). d, e — Netrin G1+ talamusterminaler i t-hCO. d visar en koronal sektion innehållande t-hCO- och VB-kärnor. Skalstreck, 2 mm. e visar Netrin G1- och STEM121-uttryck i t-hCO- (vänster) och VB- (höger) neuroner. Skalstreck, 50 µm. Den orange streckade linjen indikerar t-hCO-gränsen. f, g, Nuvarande spår av t-hCO-neuroner efter elektrisk stimulering i S1-råtta (f) eller inre kapsel (g), med (lila) eller utan (svart) NBQX (vänster). EPSC-amplituder med och utan NBQX (n = 6 S1-neuroner, *P = 0,0119; och n = 6 inre kapselneuroner, **P = 0,0022) (mitten). Procentandel av t-hCO-neuroner som visar EPSC som svar på elektrisk stimulering av råtta-S1 (f) eller inre kapsel (g) (höger). aCSF, artificiell cerebrospinalvätska. h, schematiskt diagram över 2P-avbildningsexperimentet (vänster). Uttryck av GCaMP6s i t-hCO (mitten). Skalstreck, 100 µm. Fluorescenstidsförlopp för GCaMP6s (höger). i, Z-poäng för spontan aktivitetsfluorescens. j, schematisk illustration av mustaschstimulering. k, z-poängbedömda 2P-fluorescensbanor i ett försök, i linje med morrhårsavvikelse vid tidpunkten noll (streckad linje) i exempelceller. l, populationsgenomsnittliga z-poängsvar för alla celler i linje med morrhårsavvikelse vid tidpunkten noll (streckad linje) (röd) eller slumpmässigt genererade tidsstämplar (grå). m. Schematiskt diagram över experimentet med optisk markering. n, Råspänningskurvor från ett exempel på t-hCO-cell under blå laserstimulering eller morrhårsavböjning. Röda pilar indikerar de första topparna orsakade av ljus (överst) eller orsakade av morrhårsavböjning (nederst). Grå skuggning indikerar perioder av morrhårsavböjning. o, Maximala ljusvågformer och morrhårsavböjningssvar. p, toppar från ett enda försök, i linje med morrhårsavvikelsen i cellerna i exemplet. 0 indikerar morrhårsavvikelse (streckad linje). q, populationsgenomsnittlig z-poängavfyrningshastighet för alla ljuskänsliga celler, i linje med morrhårsavvikelse vid tidpunkten noll (streckad linje) (röd) eller slumpmässigt genererade tidsstämplar (grå). r, Andel ljuskänsliga enheter signifikant modulerade av morrhårsavvikelse (n = 3 råttor) (vänster). Maximal z-poänglatens (n ​​= 3 råttor; n = 5 (ljusgrön), n = 4 (mörkgrön) och n = 4 (cyan) morrhårsavböjningsmoduleringsenheter per råtta) (höger). Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse
Vi frågade sedan om t-hCO kunde aktiveras av sensoriska stimuli in vivo. Vi transplanterade hCO som uttrycker de genetiskt kodade kalciumindikatorerna GCaMP6 till S1-råttor. Efter 150 dagar utförde vi fiberfotometri eller tvåfotonkalciumavbildning (figur 4h och utökade data, figur 10a). Vi fann att t-hCO-celler uppvisade synkroniserad rytmisk aktivitet (figur 4i, utökade data, figur 10b och kompletterande video 1). För att karakterisera maximal t-hCO-aktivitet utförde vi extracellulära elektrofysiologiska registreringar i sövda transplantationsråttor (utökade data, figur 10c-f). Vi har genererat stereotaxiska koordinater från MR-bilder; dessa registrerade enheter representerar således förmodade mänskliga neuroner, även om elektrofysiologi ensamt inte tillåter bestämning av en ursprungsart. Vi observerade synkroniserade aktivitetsutbrott (utökade data, figur 10d). Utbrotten varade i cirka 460 ms och separerades av tysta perioder på cirka 2 sekunder (utökade data, Fig. 10d, e). Enskilda enheter avfyrade i genomsnitt cirka tre skott per utbrott, vilket är cirka 73 % av de registrerade enheterna per utbrott. Aktiviteten hos de enskilda enheterna var starkt korrelerad, och dessa korrelationer var högre än de hos enheter som identifierats hos ovaccinerade djur registrerade under samma förhållanden (utökade data, Fig. 10f). För att ytterligare karakterisera spikresponserna hos identifierade mänskliga neuroner utförde vi ljusmärkningsexperiment på sövda råttor transplanterade med hCO3 som uttrycker den ljuskänsliga katjonkanalen rhodopsin 2 (hChR2), genom vilken t-hCO3-neuroner har kort latens igenkänning (mindre än 10 ms) som svar på blått ljusstimuli (Fig. 4m–o). t-hCO-neuroner uppvisade utbrott av spontan aktivitet vid frekvenser liknande de som observerats vid kalciumavbildning, såväl som elektrofysiologiska registreringar utförda i t-hCO i frånvaro av ljusmarkering (utökade data, Fig. 10c-g). Ingen spontan aktivitet observerades i motsvarande stadier av hCO registrerade in vitro. För att bedöma om t-hCO kunde aktiveras av sensoriska stimuli, avlänkade vi kort råtthårstråna bort från t-hCO (Fig. 4j,m och utökade data, Fig. 10h,k). Enligt tidigare studier8,10 visade en delmängd av t-hCO-celler ökad aktivitet som svar på hårstrånsavböjning, vilket inte observerades när data jämfördes med slumpmässiga tidsstämplar (Fig. 4k–q och utökade data, Fig. 10h–q). Faktum är att cirka 54 % av de optomärkta enskilda enheterna visade en signifikant ökad upphetsningshastighet efter hårstrånsstimulering, med en topp på cirka 650 ms (Fig. 4r). Sammantaget tyder dessa data på att t-hCO får lämpliga funktionella input och kan aktiveras av miljöstimuli.
Vi undersökte sedan om t-hCO kunde aktivera kretsar hos råttor för att kontrollera beteende. Vi undersökte först om axonerna från t-hCO-neuroner skjuter ut i råttans omgivande vävnader. Vi infekterade hCO med ett lentivirus som kodar för hChR2 fusionerat med EYFP (hChR2-EYFP). Efter 110 dagar observerade vi EYFP-uttryck i ipsilaterala kortikala regioner, inklusive hörsel-, motor- och somatosensoriska cortex, såväl som i subkortikala regioner, inklusive striatum, hippocampus och thalamus (Fig. 5a). För att bedöma om dessa efferenta projektioner kunde framkalla synaptiska svar i råttceller aktiverade vi optiskt t-hCO-celler som uttrycker hChR2-EYFP genom att registrera råtthjärnbarkceller i skarpa hjärnsnitt. Aktivering av t-hCO-axoner med blått ljus inducerade EPSC:er med kort latens i råttpyramidala cortexneuroner, vilka blockerades av NBQX (Fig. 5b–g). Dessutom kunde dessa svar blockeras av tetrodotoxin (TTX) och återställas av 4-aminopyridin (4-AP), vilket tyder på att de orsakades av monosynaptiska kopplingar (fig. 5e).
a, Schematiskt diagram över axonspårning (vänster). t-hCO EYFP-uttryck (höger). Skalstreck, 100 µm. A1, hörselbark, ACC, främre cingulära cortex, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diafragma, lateral septum, mPFC, medial prefrontal cortex, piri, piriform cortex, v. striatum, ventral striatum, VPM, ventropostomediala kärnan i thalamus, VTA, ventral tegmental region. De röda rutorna representerar de områden i hjärnan där bilderna togs. b, Schematiskt diagram över stimuleringsexperimentet. c, d, Exempel på responsen från blått ljusinducerad fotoström (överst) och spänning (nederst) i humana (c) EYFP+ t-hCO eller råtta (d) EYFP- celler. e, f, Nuvarande spår av råttneuroner efter blåljusstimulering av t-hCO-axoner med TTX och 4-AR (grönt), TTX (grå) eller aCSF (svart) (e), med (violett) eller utan (svart)) NBQX (e). g, latens för svar inducerade av blått ljus i råttceller (n = 16 celler); horisontella staplar indikerar genomsnittlig latens (7,13 ms) (vänster). Amplitud för ljusframkallade EPSC:er registrerade med eller utan NBQX (n = 7 celler; ***P < 0,0001) (mitten). Amplitud för ljusframkallade EPSC:er registrerade med eller utan NBQX (n = 7 celler; ***P < 0,0001) (mitten). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (i centrе). Amplitud för ljusinducerade EPSC:er registrerade med eller utan NBQX (n = 7 celler; ***P < 0,0001) (mitten).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (i centrе). Amplitud för ljusinducerade EPSC:er registrerade med eller utan NBQX (n = 7 celler; ***P < 0,0001) (mitten).Procentandel råttceller som visar EPSC:er som svarar på blått ljus (höger). h, Schematiskt diagram över en beteendeuppgift. d0, dag 0. i. Prestanda hos exemplariska djur på dag 1 (vänster) eller dag 15 (höger) av träningen. Medelantalet slickningar utförda på dag 1 (vänster) eller dag 15 (höger i mitten) (n = 150 försök med blått ljus, n = 150 försök med rött ljus; ***P < 0,0001). Medelantalet slickningar utförda på dag 1 (vänster) eller dag 15 (höger i mitten) (n = 150 försök med blått ljus, n = 150 försök med rött ljus; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) eller день 15 (i центре справа) (n = 150 исправа) n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Genomsnittligt antal slickningar utförda på dag 1 (vänster) eller dag 15 (mitten höger) (n = 150 försök med blått ljus, n = 150 försök med rött ljus; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150次红光试验；***P < 0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) eller день 15 (i центре справа) (n = 150 исправа) n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Genomsnittligt antal slickningar utförda på dag 1 (vänster) eller dag 15 (mitten höger) (n = 150 försök med blått ljus, n = 150 försök med rött ljus; ***P < 0,0001).Kumulativa slickningar för försök med rött och blått ljus på dag 1 (mitten vänster) eller dag 15 (höger). NS, ej signifikant. j,k, Beteendeegenskaper hos alla djur transplanterade med t-hCO som uttrycker hChR2-EYFP (j) eller kontrollfluorofor (k) på dag 1 eller 15 (hChR2-EYFP: n = 9 råttor, ** P = 0,0049; kontroll: n = 9, P = 0,1497). l, Utveckling av preferenspoäng (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Utveckling av preferenspoäng (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Utveckling av preferenspoäng (n = 9 hChR2, n = 9 kontroller; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Utveckling av preferenspoäng (n = 9 hChR2, n = 9 kontroller; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS-uttryck som svar på optogenetisk aktivering av t-hCO i S1. Bilder av FOS-uttryck (vänster) och kvantifiering (n = 3 per grupp; *P < 0,05, **P < 0,01 och ***P < 0,001) (höger) visas. Bilder av FOS-uttryck (vänster) och kvantifiering (n = 3 per grupp; *P < 0,05, **P < 0,01 och ***P < 0,001) (höger) visas. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 för группу; * P <0,05, <01 ** P <0***) (справа). Bilder av FOS-uttryck (vänster) och kvantifiering (n = 3 per grupp; *P <0,05, **P <0,01 och ***P <0,001) visas (höger).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像㏳）（像〳）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像㏳）（像〳） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 för группу; * P <0,05, <01 ** P <0***) (справа). Bilder av FOS-uttryck (vänster) och kvantifiering (n = 3 per grupp; *P <0,05, **P <0,01 och ***P <0,001) visas (höger).Skalstreck, 100 µm. Data uttrycks som medelvärde ± standardfel för BLA, basolateral tonsill, MDT, dorsomediala thalamuskärna, PAG, periaqueduktal grå.
Slutligen frågade vi om t-hCO kunde modulera råttors beteende. För att testa detta transplanterade vi hChR2-EYFP-uttryckande hCO i S1, och 90 dagar senare implanterade vi optiska fibrer i t-hCO för ljustillförsel. Vi tränade sedan råttorna med ett modifierat operant betingningsparadigm (Fig. 5h). Vi placerade djuren i en beteendetestkammare och applicerade slumpmässigt 5 sekunders blå (473 nm) och röd (635 nm) laserstimuli. Djuren fick en vattenbelöning om de slickade under blå ljusstimulering men inte slickade under röd ljusstimulering. På den första träningsdagen visade djuren ingen skillnad i slickning när de stimulerades med blått eller rött ljus. Men på dag 15 visade djur transplanterade med hCO-uttryckande hChR2-EYFP mer aktiv slickning när de stimulerades med blått ljus jämfört med röd ljusstimulering. Dessa förändringar i slickbeteende observerades inte hos kontrolldjur transplanterade med hCO som uttryckte kontrollfluoroforen (inlärningsframgångsgrad: hChR2 89 %, EYFP 0 %, figur 5i-1 och kompletterande video 2). Dessa data tyder på att t-hCO-celler kan aktivera råttneuroner för att stimulera belöningssökande beteende. För att ta reda på vilka rått-t-hCO-neuronkretsar som kan vara involverade i dessa beteendeförändringar aktiverade vi optogenetiskt t-hCO hos tränade djur och skördade vävnader 90 minuter senare. Immunohistokemi avslöjade uttryck av det aktivitetsberoende FOS-proteinet i flera hjärnregioner involverade i motiverat beteende, inklusive mediala prefrontala cortex, mediala thalamus och periaqueduktal grå substans, vilket uttrycktes antingen i ostimulerade kontrolldjur eller hos djur. ris. 5m). Sammantaget tyder dessa data på att t-hCO kan modulera råttneuronal aktivitet för att driva beteende.
Neurala organoider representerar ett lovande system för att studera mänsklig utveckling och sjukdomar in vitro, men de begränsas av bristen på kopplingar mellan kretsar som finns in vivo. Vi har utvecklat en ny plattform där vi transplanterade hCO till S1 hos immunsupprimerade tidiga postnatala råttor för att studera mänsklig cellutveckling och funktion in vivo. Vi har visat att t-hCO utvecklar mogna celltyper som inte observerats in vitro28 och att t-hCO är anatomiskt och funktionellt integrerat i gnagares hjärna. Integreringen av t-hCO i gnagares neurala kretsar gjorde det möjligt för oss att etablera en koppling mellan mänsklig cellaktivitet och studerat djurbeteende, vilket visar att t-hCO-neuroner kan modulera råttneuronaktivitet för att driva beteendemässiga svar.
Plattformen vi beskriver har flera fördelar jämfört med tidigare forskning om transplantation av mänskliga celler till gnagarhjärnor. Först transplanterade vi hCO3 i den utvecklande cortexen hos tidigt postnatala råttor, vilket kan underlätta anatomisk och funktionell integration. För det andra gjorde t-hCO3 MRI-övervakning det möjligt för oss att studera transplantatets position och tillväxt hos levande djur, vilket gjorde det möjligt för oss att genomföra långsiktiga studier med flera djur och fastställa tillförlitligheten hos flera hiPS-cellinjer. Slutligen transplanterade vi intakta organoider, snarare än isolerade enskilda cellsuspensioner, vilka är mindre destruktiva för mänskliga celler och kan främja integrationen och genereringen av mänskliga cortexneuroner i råtthjärnor.
Vi är medvetna om att trots framsteg inom denna plattform förhindrar tidsmässiga, rumsliga och artöverskridande begränsningar bildandet av mänskliga neurala kretsar med hög återgivning, även efter transplantation i ett tidigt utvecklingsstadium. Det är till exempel inte klart om den spontana aktiviteten som observeras i t-hCO representerar en utvecklingsfenotyp som liknar den rytmiska aktivitet som observeras under kortikal utveckling, eller om den beror på avsaknaden av hämmande celltyper i t-hCO. På liknande sätt är det inte klart i vilken utsträckning avsaknaden av laminering i t-hCO påverkar kedjekonnektiviteten30. Framtida arbete kommer att fokusera på att integrera andra celltyper såsom humana mikroglia, humana endotelceller och varierande proportioner av GABAerga interneuroner såsom visas med hjälp av assembly 6 in vitro, samt att förstå hur neural integration och bearbetning kan ske i förändrade transkriptionella, synaptiska och beteendemässiga nivåer i t-hCO i celler erhållna från patienter.
Sammantaget representerar denna in vivo-plattform en kraftfull resurs som kan komplettera in vitro-forskning på mänsklig hjärnutveckling och sjukdomar. Vi förväntar oss att denna plattform kommer att göra det möjligt för oss att upptäcka nya fenotyper på strängnivå i annars svårfångade patienthärledda celler och testa nya terapeutiska strategier.
Vi genererade hCO2.5 från HiPS-celler enligt tidigare beskrivning. För att initiera hCO2-produktion från hiPS-celler odlade på matarlager avlägsnades intakta kolonier av hiPS-celler från odlingsskålar med hjälp av dispas (0,35 mg/ml) och överfördes till plastkulturer med ultralåg vidhäftning innehållande skålar med hiPS-cellodlingsmedium (Corning) kompletterat med två SMAD-hämmare dorsomorfin (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) och SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) och ROCK-hämmare Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Under de första 5 dagarna byttes hiPS-cellmediet dagligen och dorsomorfin och SB-431542 tillsattes. På den sjätte dagen i suspension överfördes neurala sfäroider till neuralt medium innehållande neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-tillskott utan vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin och streptomycin (1:100, Life Technologies) och kompletterat med epidermal tillväxtfaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) och fibroblasttillväxtfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) fram till dag 24. Från dag 25 till dag 42 kompletterades mediet med hjärnderiverad neurotrofisk faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) och neurotrofin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) med mediumbyten varannan dag. På den sjätte dagen i suspension överfördes neurala sfäroider till neuralt medium innehållande neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-tillskott utan vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin och streptomycin (1:100, Life Technologies) och kompletterat med epidermal tillväxtfaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) och fibroblasttillväxtfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) fram till dag 24. Från dag 25 till dag 42 kompletterades mediet med hjärnderiverad neurotrofisk faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) och neurotrofin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) med mediumbyten varannan dag.På den sjätte dagen i suspension överfördes de neurala sfäroiderna till ett neuralt medium innehållande Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-tillskott utan vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) och дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/ml; R&D Systems) och факторофи робста20F; нг/мл; FoU-system) till 24-го дня. och streptomycin (1:100, Life Technologies) och kompletterat med epidermal tillväxtfaktor (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) och fibroblasttillväxtfaktor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) fram till dag 24.Från dag 25 till 42 tillsattes hjärnderiverad neurotrofisk faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) och neurotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) till mediet, varvid mediet byttes varannan dag.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生焠B-27生焠补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基丠和瓼，1瓼霉:链霉Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；FoU Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies０ 焫 焉 縍b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 祴经 培养 基 中（链链霉 ） 缌链霉:0 Teknik） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D SystemsＳ瀩瀬24弳 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), till 27 А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением фальпицин (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) och фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг ml-1) 1; På dag 6 byttes neurosfärsuspensionerna till ett tillskott innehållande neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-tillskott utan vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillinneutraliserat streptomycin (1:100, Life Technologies) kompletterat med epidermal tillväxtfaktor (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) och fibroblasttillväxtfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml-1)1; FoU-system) till 24-го дня. FoU-system) fram till dag 24.Från dag 25 till 42 tillsattes hjärnderiverad neurotrofisk faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) och neurotrofisk faktor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) till odlingsmediet varannan dag. Mediumbyte en gång.Från och med dag 43 bibehölls hCO₂ i osupplementerat neurobasal-A-medium (NM; 1088022, Thermo Fisher) med mediumbyte var 4–6:e dag. För att erhålla hCO₂ från hiPS-celler odlade under förhållanden utan matning inkuberades hiPS-celler med Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) vid 37 °C i 7 minuter, dissocierades till enskilda celler och pläterades på AggreWell 800-plattor (34815, STEMCELL Technologies) med en densitet av 3 × 10⁶ enskilda celler per brunn i Essential 8-medium kompletterat med ROCK-hämmaren Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Efter 24 timmar pipetterades mediet i brunnarna upp och ner i medium innehållande Essential 6-medium (A1516401, Life Technologies) kompletterat med dorsomorfin (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) och SB-431542 (10 μM; 1614, Tocrida). Från dag 2 till 6 ersattes Essential 6-medium dagligen med dorsomorfin och tillskottet SB-431542. Från den sjätte dagen överfördes neurosfärsuspensionerna till det neurobasala mediet och upprätthölls enligt beskrivningen ovan.
Alla djurförsök utfördes i enlighet med de riktlinjer för djurskötsel som godkänts av Stanford University Laboratory Animal Care Administrative Committee (APLAC). Dräktiga eutymiska RNU (rnu/+) råttor köptes in (Charles River Laboratories) eller hölls in. Djuren hölls i en 12-timmars ljus-mörkercykel med mat och vatten ad libitum. Nakna (FOXN1–/–) råttungar i åldern tre till sju dagar identifierades genom tillväxt av omogna morrhår före avlivning. Valparna (hanar och honor) sövdes med 2–3 % isofluran och placerades på en stereotaxisk ram. En trepanation av skallen med en diameter på cirka 2–3 mm över S1 utfördes samtidigt som dura mater bibehölls. Använd sedan en 30-G nål (cirka 0,3 mm) strax utanför kraniotomin för att genomborra dura. Applicera sedan HCO3 på en tunn 3×3 cm parafilm och ta bort överflödigt medium. Använd en Hamilton-spruta fäst vid en 23 G, 45° nål, och dra försiktigt in hCO3 i nålens mest distala ände. Montera sedan sprutan på sprutpumpen som är ansluten till den stereotaxiska enheten. Placera sedan nålspetsen över ett tidigare gjort 0,3 mm brett punkteringshål i dura (z = 0 mm) och smalna av sprutan 1–2 mm (z = ungefär –1,5 mm) tills nålen är mellan dura mater A. En tät försegling bildas. Lyft sedan sprutan till mitten av den kortikala ytan vid z = -0,5 mm och injicera hCO3 med en hastighet av 1–2 µl per minut. Efter avslutad hCO3-injektion dras nålen tillbaka med en hastighet av 0,2–0,5 mm per minut, huden sys fast och valpen placeras omedelbart på en varm värmedyna tills den är helt återställd. Några djur transplanterades bilateralt.
Alla djurförsök utfördes i enlighet med Stanford Universitys APLAC-godkända riktlinjer för djurvård. Råttor (mer än 60 dagar efter transplantation) inducerades med 5 % isoflurananestesi och sövdes med 1–3 % isofluran under avbildning. För visualisering användes en 7 Tesla aktivt skärmad horisontell borrhålsskanner från Bruker (Bruker Corp.) med en gradientdrivning från International Electric Company (IECO), en skärmad gradientinsats med en innerdiameter på 120 mm (600 mT/m², 1000 T/m²/s) med AVANCE. III, åttakanals flerspols-RF och flerkärniga funktioner, och den medföljande Paravision 6.0.1-plattformen. Inspelning utfördes med en aktivt frikopplad volumetrisk RF-spole med en innerdiameter på 86 mm och en fyrkanals kryokyld RF-spole endast för mottagning. Axial 2D Turbo-RARE (repetitionstid = 2500 ms, ekotid = 33 ms, 2 medelvärden) med 16 skivinfångningar, skivtjocklek 0,6–0,8 mm, innehållande 256 × 256 sampel. Signalerna mottogs med hjälp av en kvadratursändtagare volymetrisk RF-spole med en innerdiameter på 2 cm (Rapid MR International, LLC). Slutligen användes de inbyggda Imaris (BitPlane) ytestningsfunktionerna för 3D-rendering och volymanalys. En lyckad transplantation definierades som en där områden med kontinuerlig T2-viktad MRI-signal bildades i den transplanterade hemisfären. Transplantatavstötning definierades som ett transplantat som inte producerade områden med kontinuerlig T2-viktad MRI-signal i den transplanterade hemisfären. Subkortikal t-hCO exkluderades från efterföljande analys.
För att stabilt uttrycka GCaMP6s i hCO3 för tvåfoton-kalciumavbildning infekterades hiPS-celler med pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro följt av val av antibiotika. Kortfattat dissocierades cellerna med EDTA och suspenderades i 1 ml Essential 8-medium vid en densitet av cirka 300 000 celler i närvaro av polybren (5 μg/ml) och 15 μl virus. Cellerna inkuberades sedan i suspension i 60 minuter och såddes vid en densitet av 50 000 celler per brunn. Efter konfluens behandlades cellerna med 5-10 μg ml-1 puromycin i 5-10 dagar eller tills stabila kolonier uppstod. Akut hCO3-infektion utfördes som tidigare beskrivits5 med vissa modifieringar. Kortfattat överfördes dag 30-45 hCO3 till 1,5 ml Eppendorf-mikrocentrifugrör innehållande 100 μl nervmedium. Sedan avlägsnas cirka 90 µl av mediet, 3–6 µl högtiterlentivirus (från 0,5 x 108 till 1,2 x 109) tillsätts till röret och hCO3 överförs till inkubatorn i 30 minuter. Tillsätt sedan 90–100 µl medium till varje rör och sätt tillbaka rören i inkubatorn över natten. Nästa dag, överför hCO3 till färskt nervmedium i plattor med låg fästförmåga. Efter 7 dagar överfördes hCO3 till 24-brunnsplattor med glasbotten för visualisering och utvärdering av infektionskvaliteten. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE och pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE genererades av VectorBuilder. Lentivirus används i de flesta experiment eftersom det är integrerat i värdgenomet, vilket möjliggör reportergenuttryck i infekterade cellinjer. För rabiesuppföljning saminfekterades hCO dag 30-45 med rabies-ΔG-eGFP och AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), tvättades noggrant i 3 dagar och transplanterades till råttor i S1 och hölls in vivo i 7-14 dagar.
För immuncytokemi sövdes djuren och perfunderades transkardiellt med PBS följt av 4 % paraformaldehyd (PFA i PBS; Electron Microscopy Sciences). Hjärnorna fixerades i 4 % PFA i 2 timmar eller över natten vid 4 °C, kryokonserverades i 30 % sackaros i PBS i 48–72 timmar och inbäddades i 1:1, 30 % sackaros:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) och koronala snitt gjordes vid 30 µm med hjälp av en kryostat (Leica). För immunhistokemi av tjocka snitt perfunderades djuren med PBS, och hjärnan dissekerades och sektionerades koronalt vid 300–400 µm med hjälp av en vibratom (Leica) och snitten fixerades med 4 % PFA i 30 minuter. Därefter tvättades kryosnitten eller tjocka snitt med PBS, blockerades i 1 timme vid rumstemperatur (10 % normalt åsneserum (NDS) och 0,3 % Triton X-100 utspätt i PBS) och blockerades med blockeringslösning vid 4 °C. – Inkubation Kryosnitten inkuberades över natten och tjocka snitt inkuberades i 5 dagar. Primära antikroppar som användes var: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (råtta, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanin, 1:1 000; Z0334, Dako), anti-GFP (kyckling, 1:1 000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanin, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanin, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanin, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kanin, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (get, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (get, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) och anti-IBA1 (get, 1:100; ab5076, abcam). Primära antikroppar som användes var: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (råtta, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanin, 1:1 000; Z0334, Dako), anti-GFP (kyckling, 1:1 000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanin, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanin, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanin, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kanin, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (get, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (get, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) och anti-IBA1 (get, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысины5,abcam),abcam,abcam,abcam анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab19118, рокица, ab19118) 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (scg2, анти-SCG2; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мыный: 20ши; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) och анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). De primära antikropparna som användes var: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (råtta, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanin, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (kyckling, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanin, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanin, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanin, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kanin, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (get, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (get, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) och anti-IBA1 (get, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1 000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，（山羊，，10 Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1 000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 nr System）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) och anti-IBA1 (get, 1:100; ab5076, abcam).De primära antikropparna som användes var: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (råtta, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanin, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (kyckling, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanin, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanin, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanin, 1:200; HPA047819, Atlas-antikropp), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kanin), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121, мы1ш400; Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) och анти-IBA1 (коза, 1:100; абаба76; аба50ка). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (get, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (get, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) och anti-IBA1 (get, 1:100; ab5076, abkam).Sektionerna tvättades sedan med PBS och inkuberades med sekundär antikropp i 1 timme vid rumstemperatur (frysta sektioner) eller över natten vid 4 °C (tjocka sektioner). Alexa Fluor sekundär antikropp (Life Technologies) utspädd 1:1000 i blockeringslösning användes. Efter tvättning med PBS visualiserades kärnorna med en Hoechst 33258 (Life Technologies). Slutligen placerades objektglasen på ett mikroskop med täckglas (Fisher Scientific) med hjälp av en Aquamount (Polysciences) och analyserades på ett Keyence fluorescerande mikroskop (BZ-X analysator) eller ett Leica TCS SP8 konfokalmikroskop (Las-X) på bilden. Bilderna bearbetades med hjälp av ImageJ-programmet (Fiji). För att kvantifiera andelen mänskliga neuroner i t-hCO och råttbarken togs 387,5 μm breda rektangulära bilder i mitten av t-hCO, vid eller nära kanten av råttbarken. Transplantatmarginaler bestämdes genom att bedöma förändringar i vävnadstransparens, HNA+ kärnor och/eller förekomsten av vävnadsautofluorescens. I varje bild dividerades det totala antalet NeuN+ och HNA+ celler med det totala antalet NeuN+ celler i samma område. För att säkerställa att endast celler med kärnor i bildplanet räknas, inkluderas endast celler som också är Hoechst+ i beräkningen. Två bilder separerade med minst 1 mm medelvärdesbildades för att minska det statistiska felet.
En vecka före provtagning placerades hCO3-transplantationsdjuren (ungefär 8 månaders differentiering) i ett mörkt rum med morrhår trimmade för att minimera sensorisk stimulering. Isolering av cellkärnor utfördes enligt tidigare beskrivning, med vissa modifieringar. Kortfattat förstördes t-hCO3 och hCO3 med hjälp av detergentmekanisk cellys och en 2 ml glasvävnadskvarn (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). De råa cellkärnorna filtrerades sedan bort med ett 40 µm filter och centrifugerades vid 320 g i 10 minuter vid 4 °C innan en sackarosdensitetsgradient utfördes. Efter centrifugeringssteget (320 g i 20 minuter vid 4 °C) resuspenderades proverna i 0,04 % BSA/PBS med tillsats av 0,2 enheter µl-1 RNase-hämmare (40 u µl-1, AM2682, Ambion) och fick passera genom ett 40 µm flödesfilter. De dissocierade kärnorna resuspenderades sedan i PBS innehållande 0,02 % BSA och laddades på ett Chromium Single Cell 3′-chip (uppskattad återhämtning av 8 000 celler per bana). snRNA-sekvenseringsbibliotek framställdes med Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-sekvenseringsbibliotek framställdes med Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq-biblioteken framställdes med hjälp av Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq-biblioteket framställdes med hjälp av Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Bibliotek från olika prover poolades och sekvenserades av Admera Health på NovaSeq S4 (Illumina).
Genuttrycksnivåerna för varje förmodad nukleär streckkod kvantifierades med hjälp av analysprogrampaketet 10x Genomics CellRanger (version 6.1.2). Mer specifikt matchades avläsningarna mot en kombination av humana (GRCh38, Ensemble, version 98) och rått- (Rnor_6.0, Ensemble, version 100) referensgenom skapade med kommandot mkref och med hjälp av kommandot count med kommandot –include-introns=TRUE för att kvantifiera inkluderande avläsningar mappade till intronregioner. För t-hCO-prover identifierades humana kärnor baserat på det konservativa kravet att minst 95 % av alla mappade avläsningar matchar det mänskliga genomet. Alla efterföljande analyser utfördes på en filtrerad streckkodsmatris som utmatades från CellRanger med hjälp av R-paketet (version 4.1.2) Seurat (version 4.1.1)32.
För att säkerställa att endast högkvalitativa kärnor inkluderas i den efterföljande analysen implementerades en iterativ filtreringsprocess för varje prov. Först identifieras och avlägsnas kärnor av låg kvalitet med färre än 1000 unika gener funna och mer än 20 % av det totala antalet mitokondrier. Därefter normaliserades den råa gennummermatrisen genom regulariserad negativ binomial regression med hjälp av funktionen sctransform(vst.flavor=”v2″), som också identifierade de 3000 mest variabla generna med hjälp av standardparametrar. Dimensionsreduktion utfördes på de övre variabla generna med hjälp av Principal Component Analysis (PCA) med standardparametrar med en datamängdsdimension på 30 (dims = 30 valdes baserat på visuell inspektion av knäplatser och användes för alla prover och ensembleanalyser). Vi utförde sedan flera omgångar av iterativ klustring (upplösning = 1) för att klassificera gener baserat på onormalt lågt genantal (median under 10:e percentilen), onormalt högt mitokondriellt genantal (median över 95:e percentilen) för att identifiera och ta bort förmodade celler av låg kvalitet. kluster och/eller en hög andel misstänkta tvillingar identifierade med DoubletFinder33-paketet (genomsnittlig DoubletFinder-poäng över 95:e percentilen). t-hCO-prover (n=3) och hCO-prover (n=3) integrerades separat med hjälp av funktionen IntegrateData med ovanstående parametrar. Sedan ytterligare en omgång kvalitativ filtrering av den integrerade datamängden utfördes enligt beskrivningen ovan.
Efter att ha tagit bort kärnorna av låg kvalitet grupperades den integrerade datamängden (upplösning = 0,5) och bäddades in för UMAP34-visualiseringsändamål. Markörgener för varje kluster bestämdes med hjälp av FindMarkers-funktionen med standardparametrar beräknade från normaliserade genuttrycksdata. Vi identifierar och klassificerar större cellklasser genom att kombinera referensdatamängder för fetala och vuxna kortikala celler med markörgenuttryck [19, 20, 21, 35] och annotering. I synnerhet identifierades cirkulerande prekursorer genom uttrycket av MKI67 och TOP2A. Progenitorkluster definierades genom avsaknaden av mitotiska transkript, hög överlappning med multipotenta glialprogenitorkluster beskrivna i sen metafas av fetala cortex, och EGFR- och OLIG1-uttryck. Vi använder termen astrocyt för att omfatta flera tillstånd av astrocytdifferentiering, från sen radial glia till mognad av astrocyter. Astrocytkluster uttrycker höga nivåer av SLC1A3 och AQP4 och har visat sig kartlägga med subtyper av fetala radiala glia och/eller vuxna astrocyter. OPC uttrycker PDGFRA och SOX10 medan oligodendrocyter uttrycker myeliniseringsmarkörer (MOG och MYRF). Glutamaterga neuroner identifierades genom närvaron av neuronala transkript (SYT1 och SNAP25), frånvaron av GABAerga markörer (GAD2) och uttrycket av NEUROD6, SLC17A7, BCL11B eller SATB2. GluN-neuroner delades vidare in i övre (SATB2-uttryck och förlust av BCL11B) och djupa (BCL11B-uttryck) subklasser. Förmodade subplattneuroner (SP) uttrycker kända SP18-markörer såsom ST18 och SORCS1 utöver djupa GluN-markörer. Choroidplexusliknande celler identifierades genom TTR-uttryck, och meningealliknande celler uttryckte fibroblastassocierade gener och kartlade pial-/vaskulära celler från referensdatauppsättningen.
Differentiell analys av genuttryck mellan t-hCO och hCO subklasser utfördes med hjälp av en nyutvecklad pseudo-batch-metod reproducerad i prover implementerade med Libra R-paketet (version 1.0.0). Mer specifikt utfördes edgeR log-likelihood-tester (version 3.36.0, paket R) för grupper genom att summera antalet gener i celler för en given cellklass för varje provreplikering. För visualisering av värmekartor beräknades normaliserade per miljon (CPM) värden med hjälp av edgeR (cpm() funktion) och skalades (för att uppnå medelvärde = 0, standardavvikelse = 1). Genontologi (GO) anrikningsanalys av signifikant uppreglerade t-hCO GluN-gener utfördes (Benjamini-Hochberg-korrigerat P-värde på mindre än 0,05 uttryckt i minst 10 % av t-hCO GluN-celler och en ökning i förändring på minst 2 gånger) utfördes med ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Vi använder ToppFun-appen med standardparametrar och rapporterar Benjamini-Hochberg-korrigerade p-värden beräknade från GO-annoterade hypergeometriska tester.
För att matcha våra snRNA-sekvenseringskluster med annoterade cellkluster från referensstudier av primär encellig RNA-sekvensering eller vuxen snRNA-sekvensering19,20,21,22, tillämpade vi en metod för integration av parade dataset. Vi använde normaliseringsarbetsflödet SCTransform (v2) i Seurat för att integrera och jämföra klusteröverlappningar mellan dataset (med samma parametrar som ovan). Individuella dataset delades slumpmässigt upp till 500 celler eller kärnor per ursprungligt kluster för beräkningseffektivitet. Med hjälp av en liknande metod som beskrivits tidigare definierades klusteröverlappning som andelen celler eller kärnor i varje poolat kluster som överlappade med referensklustrets etikett. För att ytterligare klassificera GluN:er använde vi Seurats TransferData-arbetsflöde för GluN-delmängdsdata för att tilldela referensdatasetetiketter till våra GluN-celler.
För att bedöma mognadsstatusen för det globala transkriptomet från t-hCO och hCO-prover jämförde vi våra pseudo-bulkprover med BrainSpan/psychENCODE23, som består av en stor RNA-sekvens som spänner över mänsklig hjärnutveckling. Vi utförde PCA på en kombinerad mönsternormaliserad genuttrycksmatris från kortikala prover 10 veckor efter befruktningen och senare, i 5567 gener (tillsammans med våra data) som tidigare identifierats som aktiva i BrainSpan-kortikala prover (definierade som större än 50 % i utvecklingsvarians förklarad av ålder med hjälp av en kubisk modell)38. Dessutom härledde vi gener associerade med viktiga transkriptomsignaturer för neurologisk utveckling med hjälp av icke-negativ matrisfaktorisering som tidigare beskrivits. Provvikterna beräknade med hjälp av den icke-negativa matrisfaktoriseringsproceduren visas i figur 5b med expanderade data för var och en av de fem signaturerna som beskrivs av Zhu et al.38. Återigen härleddes aktivitetsberoende transkriptionsmarkörer från tidigare publicerade studier. I synnerhet var ERG och LRG signifikant uppreglerade i glutamaterga neuroner identifierade genom musens visuella cortex snRNA-seq-samling efter visuell stimulering från kompletterande tabell 3 Hrvatin et al.16. Humant berikade LRG:er erhölls från KCl-aktiverade humana fosterhjärnkulturer och skördades 6 timmar efter stimulering, och de filtrerade generna var signifikant uppreglerade hos människor men inte hos gnagare (kompletterande tabell 4). Analys av genuppsättningsanrikning med hjälp av dessa genuppsättningar utfördes med hjälp av ett envägs Fishers exakta test.
Bedöva råttorna med isofluran, ta ut hjärnorna och placera dem i kall (cirka 4 °C) syresatt (95 % O2 och 5 % CO2) sackaroslösning för snitt innehållande: 234 mM sackaros, 11 mM glukos, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 och 0,5 mM CaCl2 (cirka 310 mOsm). Koronala snitt av råtthjärna (300–400 µm) innehållande t-hCO3 gjordes med en Leica VT1200 vibratom enligt tidigare beskrivning. Snitten överfördes sedan till en sektioneringskammare med kontinuerlig rumstemperaturoxygenering innehållande aCSF framställd från: 10 mM glukos, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 och 126 mM NaCl (298 mOsm), minst 45 minuter före registrering. Snitten registrerades i en nedsänkt kammare där de kontinuerligt perfunderades med aCSF (95 % O2 och 5 % CO2-ampull). Alla data registrerades vid rumstemperatur. t-hCO-neuroner terminerades med en borosilikatglaspipett fylld med en lösning innehållande 127 mM kaliumglukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0,3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES och 0,6 mM EGTA, pH 7,2, intern lösning justerad med KOH (290 mOsm). För att återvinna tillsattes biocytin (0,2 %) till inspelningslösningen.
Data samlades in med hjälp av en MultiClamp 700B-förstärkare (Molecular Devices) och en Digidata 1550B-digitaliserare (Molecular Devices), lågpassfiltrerade vid 2 kHz, digitaliserade vid 20 kHz och analyserades med Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro, 2021b, OriginLab) och anpassade MATLAB-funktioner (Mathworks). Övergångspotentialen beräknades med JPCalc och inmatningarna justerades till det beräknade värdet -14 mV. Operation IV består av en serie strömsteg i steg om 10–25 pA, från -250 till 750 pA.
Thalamus, vit substans och S1-afferenter stimulerades elektriskt i thalamokortikala skivor under patch-clamp-registrering av hCO-neuroner, såsom beskrivits tidigare. Kortfattat placerades hjärnan på ett 3D-utskriftsbord lutat i en 10° vinkel, och hjärnans framsida skars i en 35° vinkel. Hjärnan limmades sedan fast vid den skurna ytan och delades upp, vilket bevarade de thalamokortikala utskjutande axonerna. Bipolära volframelektroder (0,5 MΩ) monterades på en andra mikromanipulator och placerades strategiskt för att stimulera fyra regioner per cell (inre kapsel, vit substans, S1 och hCO). Registrera synaptiska svar efter 300 µA fasisk stimulering vid 0,03–0,1 Hz.
hChR2-uttryckande hCO-neuroner aktiverades vid 480 nm och ljuspulser genererade av en LED (Prizmatix) applicerades genom ett ×40-objektiv (0,9 NA; Olympus) för att registrera hChR2-uttryck nära cellerna. Det belysta fältets diameter är ungefär 0,5 mm och den totala effekten är 10–20 mW. Pulsbredden ställdes in på 10 ms, vilket motsvarar den puls som gavs under beteendeinlärningsexperimentet. Olika stimuleringsfrekvenser användes, från 1 till 20 Hz, men endast den första pulsen i serien användes för kvantifiering. Intervallet mellan tågen är vanligtvis längre än 30 sekunder för att minimera effekten på synaptiska hämmande eller underlättande vägar. För att testa om hChR2-svaret var monosynaptiskt applicerade vi TTX (1 μM) på badet tills EPSC-reaktionen försvann och applicerade sedan 4-aminopyridin (4-AP; 100 μM). Vanligtvis återkommer ett svar inom några minuter, med en något längre fördröjning mellan LED-tändning och EPSC-generering. NBQX (10 μM) användes för att testa om svaret drivs av AMPA-receptorer.
Skarpa hCO₂-sektioner skapades enligt tidigare beskrivning. Kortfattat inbäddades hCO₂-sektioner i 4 % agaros och överfördes till celler innehållande 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃ och 10 mM d-(+)-glukos i sektioner. Sektionerna skars vid 200–300 µm vid rumstemperatur med hjälp av en Leica VT1200-vibrator och förvarades i ASF vid rumstemperatur. Därefter utfördes patch-camp-registrering av hela celler på hCO₂-sektioner under ett direkt SliceScope-mikroskop (Scientifica). Sektionerna perfunderades med aCSF (95 % O₂ och 5 % CO₂) och cellsignaler registrerades vid rumstemperatur. hCO-neuroner applicerades med en borosilikatglaspipett fylld med en lösning innehållande 127 mM kaliumglukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0,3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES och 0,6 mM EGTA, internt pH 7, 2, justerat med KOH (osmolaritet 290). För återvinningsändamål, tillsätt 0,2% Biocytin till den interna lösningen.
Data samlades in med Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) med hjälp av en MultiClamp 700B-förstärkare (Molecular Devices) och en Digidata 1550B-digitaliserare (Molecular Devices), lågpassfiltrerades vid 2 kHz, digitaliserades vid 20 kHz och analyserades med Clampfit (version 10.6) för analys (molekylära enheter) och anpassade MATLAB-funktioner (MATLAB 2019b, Mathworks). Övergångspotentialen beräknades med JPCalc och inmatningarna justerades till den beräknade övergångspotentialen på -14 mV. Operation IV består av en serie strömsteg i steg om 5–10 pA från -50 till 250 pA.
För morfologisk rekonstruktion av klämda neuroner tillsattes 0,2 % biocytin (Sigma-Aldrich) till den interna lösningen. Cellerna primas i minst 15 minuter efter hackning. Pipetten dras sedan långsamt in i 1–2 minuter tills det registrerade membranet är helt förseglat. Enligt snittfysiologisk procedur fixerades snitten över natten vid 4 °C i 4 % PFA, tvättades med PBS X3 och späddes 1:1000 med streptavidin-konjugerad DyLight 549 eller DyLight 405 (Vector Labs). Celler fyllda med biocytin (2 %; Sigma-Aldrich) märktes under patchclamp-inspelning vid rumstemperatur i 2 timmar. Snitten monterades sedan på mikroskopiglas med hjälp av en Aquamount (Thermo Scientific) och visualiserades nästa dag på ett Leica TCS SP8 konfokalmikroskop med ett oljeimmersionsobjektiv med en numerisk apertur ×40 1,3, förstoring ×0,9–1,0, xy. Samplingsfrekvensen är cirka 7 pixlar per mikron. Z-stackar med 1 µm intervall erhölls seriellt, och z-stack-mosaiker och Leica-baserad auto-stitching utfördes för att täcka hela det dendritiska trädet för varje neuron. Neuroner spårades sedan halvmanuellt med hjälp av neuTube 40-gränssnittet och SWC-filer genererades. Filerna laddades sedan upp till SimpleNeuriteTracer41 Fiji-pluginet (ImageJ, version 2.1.0; NIH).
Mänsklig kortikalvävnad erhölls med informerat samtycke enligt ett protokoll som godkänts av Institutional Review Board vid Stanford University. Två prover av mänsklig postpartumvävnad (3 och 18 år gamla) erhölls genom resektion av frontala cortex (mellersta frontala gyrus) som en del av kirurgi för refraktär epilepsi. Efter resektion samlades vävnaden i iskall NMDG-aCSF innehållande: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukos, 2 mM tiourea, 5 mM natriumaskorbat, 3 mM natriumpyruvat, 0,5 mM CaCl2 4H2O och 10 mM MgSO4 7H2O. Titrera till pH 7,3-7,4 med koncentrerad saltsyra. Vävnaderna levererades till laboratoriet inom 30 minuter och koronala snitt togs enligt den procedur som beskrivs ovan.
Alla djurförsök utfördes i enlighet med Stanford Universitys APLAC-godkända riktlinjer för djurvård. Råttor (mer än 140 dagar efter transplantation) inducerades med 5 % isoflurananestesi och sövdes med 1–3 % isofluran intraoperativt. Djuren placerades i en stereotaxisk ram (Kopf) och buprenorfin (SR) med fördröjd frisättning injicerades subkutant. Skallen exponerades, rengjordes och 3–5 benskruvar infördes. För att rikta in t-hCO3 genererade vi stereotaxiska koordinater från MR-bilder. Ett borrhål borrades på det intressanta stället och fibrer (400 µm i diameter, NA 0,48, dorisk) sänktes 100 µm under hCO3-ytan och fästes vid skallen med UV-härdande tandcement (Relyx).
Fiberfotometriska registreringar utfördes enligt tidigare beskrivning42. För att registrera spontan aktivitet placerades råttorna i en ren bur och en fiberoptisk patchkabel (Doric) med en diameter på 400 µm, ansluten till ett fiberoptiskt fotometriskt datainsamlingssystem, anslöts till den implanterade fiberoptiska kabeln. Under den 10 minuter långa registreringen av motorisk aktivitet fick djuren utforska buren fritt. För att registrera den framkallade aktiviteten sövdes råttorna (mer än 140 dagar efter transplantation) med 5 % isofluran för induktion och 1–3 % isofluran för underhåll. Placera djuret i en stereotaktisk ram (Kopf) och morrhåren på motsatt sida av t-hCO trimmas till cirka 2 cm och förs genom ett nät anslutet till ett piezoelektriskt ställdon (PI). En 400 µm fiberoptisk patchkabel (Doric) anslöts till den implanterade fibern och till datainsamlingssystemet. Morrhåren på motsatt sida av t-hCO3 avböjdes sedan 50 gånger (2 mm vid 20 Hz, 2 s per presentation) vid slumpmässiga tidpunkter av en piezoelektrisk drivenhet under en 20 minuters inspelningsperiod. Använd Arduino MATLAB Support Package för att styra avböjningstiden med anpassad MATLAB-kod. Händelser synkroniseras med datainsamlingsprogramvaran med hjälp av transistor-transistorlogik (TTL) pulser.
Råttor (mer än 140 dagar efter transplantation) inducerades med 5 % isoflurananestesi och sövdes med 1–3 % isofluran intraoperativt. Djuren placerades i en stereotaxisk ram (Kopf) och buprenorfin SR och dexametason injicerades subkutant. Skallen exponerades, rengjordes och 3–5 benskruvar infördes. För att rikta in t-hCO genererade vi stereotaxiska koordinater från MR-bilder. En cirkulär kraniotomi (ungefär 1 cm i diameter) utfördes med en höghastighetsborr direkt över den transplanterade hCO. När benet är så tunt som möjligt, men innan man borrar igenom hela benet, använd pincett för att ta bort den återstående intakta bäckendisken för att avslöja underliggande t-hCO. Kraniotomin fylldes med steril saltlösning och ett täckglas och en speciell huvudstift fästes på skallen med UV-härdande tandcement (Relyx).
Tvåfotonavbildning utfördes med ett Bruker multifotonmikroskop med ett Nikon LWD (×16, 0,8 NA) objektiv. GCaMP6-avbildning utfördes vid 920 nm med 1,4x enkel z-plansförstoring och 8x genomsnitt på 7,5 fps. Råttorna inducerades med 5 % isoflurananestesi och hölls med 1–3 % isofluran. Råttorna placerades i en specialtillverkad huvudfixtur och placerades under linsen. En 3-minuters bakgrundsinspelning av motorisk aktivitet erhölls. Under 20 minuters inspelning levererades 50 puffar (varje presentation 100 ms lång) slumpmässigt till whisker-plattan mittemot t-hCO med hjälp av en picospricer. Använd Arduino MATLAB Support Package för att kontrollera burst-tiden med anpassad MATLAB-kod. Synkronisera händelser med datainsamlingsprogramvara (PrairieView 5.5) med hjälp av TTL-pulser. För analys korrigerades bilderna för xy-rörelse med hjälp av affinkorrigering i MoCo-programmet som lanserades i Fiji. Extraktion av fluorescensspår från individuella celler med CNMF-E43. Fluorescens extraherades för varje region av intresse, konverterades till dF/F-kurvor och sedan till z-poäng.
Råttor (mer än 140 dagar efter transplantation) inducerades med 5 % isoflurananestesi och sövdes med 1–3 % isofluran intraoperativt. Djuren placerades i en stereotaxisk ram (Kopf) och buprenorfin SR och dexametason injicerades subkutant. Morrhåren på motsatt sida av t-hCO klipptes till cirka 2 cm och träddes genom ett nät anslutet till ett piezoelektriskt ställdon. Skallen exponeras och rengörs. En jordskruv i rostfritt stål fästs på skallen. För att rikta in sig på t-hCO genererade vi stereotaxiska koordinater från MR-bilder. Utför en cirkulär kraniotomi (ungefär 1 cm i diameter) med en höghastighetsborr strax ovanför t-hCO. När benet är så tunt som möjligt, men innan du borrar igenom hela benet, använd pincett för att ta bort den återstående intakta bäckendisken för att avslöja underliggande t-hCO. Individuella celler registrerades med hjälp av 32-kanaliga eller 64-kanaliga högdensitetskiselsonder (Cambridge Neurotech) jordade till jordskruvar och förförstärkta med RHD-förstärkare (Intan). Använd manipulatorn för att sänka elektroderna till målstället genom kraniotomi, som är fylld med steril saltlösning. Datainsamling utfördes vid en frekvens av 30 kHz med hjälp av Open Ephys datainsamlingssystem. Registreringen fortsatte endast när vi detekterade starkt korrelerad rytmisk spontan aktivitet i mer än 10 kanaler, vilket tyder på att elektroderna var belägna i transplantatet (baserat på tvåfotons kalciumavbildningsdata). En 10-minuters bakgrundsregistrering av motorisk aktivitet erhölls. Morrhåren på motsatt sida av t-hCO3 avböjdes sedan 50 gånger (2 mm vid 20 Hz, 2 s per presentation) vid slumpmässiga tidpunkter av en piezoelektrisk drivenhet under en 20-minuters inspelningsperiod. Med hjälp av MATLAB Support Package för Arduino (MATLAB 2019b) kan avböjningstiden kontrolleras med anpassad MATLAB-kod. Använd TTL-pulser för att synkronisera händelser med datainsamlingsprogramvara.
För optiska markeringsexperiment anslöts en 200 µm optisk patchkabel (Dorisk) ansluten till en 473 nm laser (Omicron) till en 200 µm optisk fiber placerad över kraniotomin. Omedelbart innan detta, justera jumpereffekten till 20 mW. Använd manipulatorn för att sänka elektroderna till målområdet genom kraniotomin, som är fylld med steril saltlösning. I början av inspelningen avgavs tio ljuspulser 473 nm (frekvens 2 Hz, pulslängd 10 ms). Ljuskänsliga celler definierades som celler som uppvisade ett spikrespons inom 10 ms ljus i 70 % eller mer av försöken.