Tack för att du besöker Nature.com.Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Flytande biopsi (LB) är ett koncept som snabbt vinner popularitet inom det biomedicinska området.Konceptet bygger främst på detektion av fragment av cirkulerande extracellulärt DNA (ccfDNA), som huvudsakligen frigörs som små fragment efter celldöd i olika vävnader.En liten del av dessa fragment kommer från främmande (främmande) vävnader eller organismer.I pågående arbete har vi tillämpat detta koncept på musslor, en vaktpostart som är känd för sin höga havsvattenfiltreringsförmåga.Vi använder musslornas förmåga att fungera som naturliga filter för att fånga in miljöns DNA-fragment från en mängd olika källor för att ge information om den biologiska mångfalden i marina kustekosystem.Våra resultat visar att musselhemolymfa innehåller DNA-fragment som varierar mycket i storlek, från 1 till 5 kb.Hagelgevärssekvensering visade att ett stort antal DNA-fragment är av främmande mikrobiellt ursprung.Bland dem hittade vi DNA-fragment från bakterier, arkéer och virus, inklusive virus som är kända för att infektera en mängd olika värdar som vanligtvis finns i kustnära marina ekosystem.Sammanfattningsvis visar vår studie att begreppet LB tillämpat på musslor representerar en rik men ännu outforskad källa till kunskap om mikrobiell mångfald i marina kustekosystem.
Effekten av klimatförändringar (CC) på den biologiska mångfalden i marina ekosystem är ett snabbt växande forskningsområde.Den globala uppvärmningen orsakar inte bara viktiga fysiologiska påfrestningar, utan pressar också de evolutionära gränserna för den termiska stabiliteten hos marina organismer, vilket påverkar livsmiljön för ett antal arter, vilket får dem att söka efter mer gynnsamma förhållanden [1, 2].Förutom att påverka den biologiska mångfalden hos metazoer, stör CC den känsliga balansen mellan värd-mikrobiella interaktioner.Denna mikrobiella dysbakterios utgör ett allvarligt hot mot marina ekosystem eftersom det gör marina organismer mer mottagliga för infektiösa patogener [3, 4].Man tror att SS spelar en viktig roll vid massdöd, vilket är ett allvarligt problem för förvaltningen av globala marina ekosystem [5, 6].Detta är en viktig fråga med tanke på de ekonomiska, ekologiska och näringsmässiga effekterna av många marina arter.Detta gäller särskilt för musslor som lever i polarområdena, där effekterna av CK är mer omedelbara och allvarliga [6, 7].Faktum är att musslor som Mytilus spp.används ofta för att övervaka effekterna av CC på marina ekosystem.Inte överraskande har ett relativt stort antal biomarkörer utvecklats för att övervaka deras hälsa, ofta med hjälp av en tvåskiktsmetod som involverar funktionella biomarkörer baserade på enzymatisk aktivitet eller cellulära funktioner som cellviabilitet och fagocytisk aktivitet [8].Dessa metoder inkluderar också mätning av koncentrationen av specifika tryckindikatorer som ackumuleras i mjuka vävnader efter absorption av stora mängder havsvatten.Den höga filtreringskapaciteten och det halvöppna cirkulationssystemet hos musslor ger dock en möjlighet att utveckla nya hemolymfabiomarkörer med hjälp av konceptet flytande biopsi (LB), ett enkelt och minimalt invasivt tillvägagångssätt för patienthantering.blodprover [9, 10].Även om flera typer av cirkulerande molekyler kan hittas i humant LB, är detta koncept främst baserat på DNA-sekvensanalys av cirkulerande extracellulära DNA-fragment (ccfDNA) i plasma.I själva verket har förekomsten av cirkulerande DNA i human plasma varit känd sedan mitten av 1900-talet [11], men det är först på senare år som tillkomsten av sekvenseringsmetoder med hög genomströmning har lett till klinisk diagnos baserad på ccfDNA.Närvaron av dessa cirkulerande DNA-fragment beror delvis på den passiva frisättningen av genomiskt DNA (nukleärt och mitokondriellt) efter celldöd. Hos friska individer är koncentrationen av ccfDNA normalt låg (<10 ng/ml) men kan ökas med 5–10 gånger hos patienter som lider av olika patologier eller utsätts för stress, vilket resulterar i vävnadsskada. Hos friska individer är koncentrationen av ccfDNA normalt låg (<10 ng/ml) men kan ökas med 5–10 gånger hos patienter som lider av olika patologier eller utsätts för stress, vilket resulterar i vävnadsskada. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/mл), но может повышаться в 5–10 år логией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Hos friska personer är koncentrationen av cccDNA normalt låg (<10 ng/mL), men den kan öka med 5–10 gånger hos patienter med olika patologier eller under stress som leder till vävnadsskador.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各姍病理或手加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 旅理 刖 扊 理 刖 承可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 распация логиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-koncentrationer är vanligtvis låga (<10 ng/ml) hos friska individer, men kan ökas 5-10 gånger hos patienter med olika patologier eller stress, vilket resulterar i vävnadsskada.Storleken på ccfDNA-fragment varierar stort, men sträcker sig vanligtvis från 150 till 200 bp.[12].Analys av självhärlett ccfDNA, dvs ccfDNA från normala eller transformerade värdceller, kan användas för att detektera genetiska och epigenetiska förändringar som finns i det nukleära och/eller mitokondriella genomet, och därigenom hjälpa kliniker att välja specifika molekylärt riktade terapier [13].Emellertid kan ccfDNA erhållas från främmande källor såsom ccfDNA från fosterceller under graviditeten eller från transplanterade organ [14,15,16,17].ccfDNA är också en viktig informationskälla för att detektera närvaron av nukleinsyror från ett smittämne (främmande), vilket möjliggör icke-invasiv detektering av utbredda infektioner som inte identifieras av blodkulturer, vilket undviker invasiv biopsi av infekterad vävnad [18].Nyligen genomförda studier har verkligen visat att mänskligt blod innehåller en rik källa av information som kan användas för att identifiera virala och bakteriella patogener, och att cirka 1 % av ccfDNA som finns i human plasma är av främmande ursprung [19].Dessa studier visar att den biologiska mångfalden i en organisms cirkulerande mikrobiom kan bedömas med hjälp av ccfDNA-analys.Men fram till nyligen användes detta koncept uteslutande hos människor och, i mindre utsträckning, hos andra ryggradsdjur [20, 21].
I denna artikel använder vi LB-potentialen för att analysera ccfDNA från Aulacomya atra, en sydlig art som vanligen finns på de subantarktiska Kerguelen-öarna, en grupp öar ovanpå en stor platå som bildades för 35 miljoner år sedan.vulkanutbrott.Med hjälp av ett in vitro-experimentsystem fann vi att DNA-fragment i havsvatten snabbt tas upp av musslor och kommer in i hemolymfrummet.Hagelgevärssekvensering har visat att musselhemolymfa ccfDNA innehåller DNA-fragment av eget och icke-självursprung, inklusive symbiotiska bakterier och DNA-fragment från biomer som är typiska för kalla vulkaniska marina kustekosystem.Hemolymph ccfDNA innehåller också virala sekvenser härledda från virus med olika värdområden.Vi hittade även DNA-fragment från flercelliga djur som benfiskar, havsanemoner, alger och insekter.Sammanfattningsvis visar vår studie att LB-konceptet framgångsrikt kan tillämpas på marina ryggradslösa djur för att generera en rik genomisk repertoar i marina ekosystem.
Vuxna (55-70 mm långa) Mytilus platensis (M. platensis) och Aulacomya atra (A. atra) samlades från de klippiga kuststränderna mellan tidvatten i Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .).Kerguelen Islands i december 2018. Andra vuxna blåmusslor (Mytilus spp.) erhölls från en kommersiell leverantör (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) och placerades i en temperaturkontrollerad (4°C) luftad tank innehållande 10–20 L 32‰ artificiell saltlake.(konstgjorda havssalt Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).För varje experiment mättes längden och vikten av individuella skal.
Ett gratis open access-protokoll för detta program finns tillgängligt online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Kortfattat samlades LB-hemolymfa från abduktormuskler som beskrivits [22].Hemolymfen klarnades genom centrifugering vid 1200 xg under 3 minuter, supernatanten frystes (-20°C) tills användning.För isolering och rening av cfDNA tinades prover (1,5-2,0 ml) och bearbetades med hjälp av NucleoSnap cfDNA-kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) enligt tillverkarens instruktioner.ccfDNA lagrades vid -80°C tills vidare analys.I vissa experiment isolerades ccfDNA och renades med användning av QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Renat DNA kvantifierades med användning av en standard PicoGreen-analys.Fragmentfördelningen av det isolerade ccfDNA:t analyserades genom kapillärelektrofores med användning av en Agilent 2100 bioanalysator (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) med användning av ett DNA-kit med hög känslighet.Analysen utfördes med användning av 1 µl av ccfDNA-provet enligt tillverkarens instruktioner.
För sekvensering av hemolymfa ccfDNA-fragment förberedde Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) hagelgevärsbibliotek med hjälp av Illumina DNA Mix-satsen i Illumina MiSeq PE75-kitet.En standardadapter (BioO) användes.Rådatafiler är tillgängliga från NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 och SRR8924809).Grundläggande läskvalitet bedömdes med FastQC [23].Trimmomatic [24] har använts för klippadaptrar och avläsningar av dålig kvalitet.Hagelgevärsavläsningar med parade ändar slogs FLASH samman till längre enkelläsningar med en minsta överlappning på 20 bp för att undvika felmatchningar [25]. Sammanslagna läsningar kommenterades med BLASTN med hjälp av en tvåskalig NCBI Taxonomy-databas (e-värde <1e-3 och 90% homologi), och maskering av lågkomplexitetssekvenser utfördes med hjälp av DUST [26]. Sammanslagna läsningar kommenterades med BLASTN med hjälp av en tvåskalig NCBI Taxonomy-databas (e-värde <1e-3 och 90% homologi), och maskering av lågkomplexitetssekvenser utfördes med hjälp av DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии BINCIENC 1e-3 och 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием [26]. Sammanslagna läsningar kommenterades med BLASTN med hjälp av NCBI tvåskaliga taxonomidatabas (e-värde < 1e-3 och 90% homologi), och sekvensmaskering med låg komplexitet utfördes med användning av DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的蔌甌DUST 2低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 輿濹 读濹 2行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двиNCов ( е e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использов [26]. Poolade läsningar kommenterades med BLASTN med hjälp av NCBI taxonomiska tvåskaliga databas (e-värde <1e-3 och 90% homologi), och sekvensmaskering med låg komplexitet utfördes med användning av DUST [26].Avläsningar delades in i två grupper: relaterade till tvåskaliga sekvenser (här kallade självläsningar) och orelaterade (icke-självläsningar).Två grupper sattes samman separat med hjälp av MEGAHIT för att generera contigs [27].Samtidigt klassificerades den taxonomiska fördelningen av främmande mikrobiomläsningar med Kraken2 [28] och representerades grafiskt av ett Krona-cirkeldiagram på Galaxy [29, 30].De optimala kmers bestämdes vara kmers-59 från våra preliminära experiment. Självkontiger identifierades sedan genom anpassning med BLASTN (bivalve NCBI-databas, e-värde <1e−10 och 60% homologi) för en slutlig anteckning. Självkontiger identifierades sedan genom anpassning med BLASTN (bivalve NCBI-databas, e-värde <1e−10 och 60% homologi) för en slutlig anteckning. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатлыю, скомоставления с BLASTN) и гомология 60%) для окончательной аннотации. Självkontiger identifierades sedan genom matchning mot BLASTN (NCBI tvåskaliga databas, e-värde <1e-10 och 60% homologi) för slutlig annotering.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (беспоставления с BLASTN) х моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Självkontiger identifierades sedan för slutlig annotering genom matchning mot BLASTN (NCBI tvåskaliga databas, e-värde <1e-10 och 60% homologi). Parallellt kommenterades icke-självgruppskontiger med BLASTN (nt NCBI-databas, e-värde <1e−10 och 60% homologi). Parallellt kommenterades icke-självgruppskontiger med BLASTN (nt NCBI-databas, e-värde <1e−10 och 60% homologi). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (för NCBI under 10 %). Parallellt annoterades främmande gruppkontiger med BLASTN (NT NCBI-databas, e-värde <1e-10 och 60% homologi).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重倠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重倠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (базнах даннче 1, 1 2011 och гомология 60 %). Parallellt kommenterades icke-självgruppskontiger med BLASTN (nt NCBI-databas, e-värde <1e-10 och 60 % homologi). BLASTX utfördes också på nonself contigs med hjälp av nr och RefSeq protein NCBI databaser (e värde <1e−10 och 60% homologi). BLASTX utfördes också på nonself contigs med hjälp av nr och RefSeq protein NCBI databaser (e värde <1e−10 och 60% homologi). BLASTX tакже был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (e. 6. 0. 0. 1. 01 %). BLASTX utfördes också på icke-självkontiger med användning av nr- och RefSeq NCBI-proteindatabaserna (e-värde < 1e-10 och 60 % homologi).nrnr BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX utfördes också på icke-självkontiger med användning av nr- och RefSeq NCBI-proteindatabaserna (e-värde <1e-10 och 60% homologi).BLASTN- och BLASTX-poolerna av icke-självkontiger representerar de slutliga contigerna (se tilläggsfil).
De primrar som används för PCR listas i tabell S1.Taq DNA-polymeras (Bio Basic Canada, Markham, ON) användes för att amplifiera ccfDNA-målgenerna.Följande reaktionsbetingelser användes: denaturering vid 95°C under 3 minuter, 95°C under 1 minut, inställd glödgningstemperatur i 1 minut, förlängning vid 72°C under 1 minut, 35 cykler och slutligen 72°C inom 10 minuter..PCR-produkter separerades genom elektrofores i agarosgeler (1,5%) innehållande SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) vid 95 V.
Musslor (Mytilus spp.) acklimatiserades i 500 ml syresatt havsvatten (32 PSU) under 24 timmar vid 4°C.Plasmid-DNA innehållande en insättning som kodar för den humana galectin-7-cDNA-sekvensen (NCBI-accessionsnummer L07769) sattes till flaskan i en slutlig koncentration av 190 μg/μl.Musslor inkuberade under samma betingelser utan DNA-tillsats var kontrollen.Den tredje kontrolltanken innehöll DNA utan musslor.För att övervaka kvaliteten på DNA i havsvatten togs havsvattenprover (20 μl; tre repetitioner) från varje tank vid angiven tidpunkt.För plasmid-DNA-spårbarhet skördades LB-musslor vid de angivna tidpunkterna och analyserades med qPCR och ddPCR.På grund av den höga salthalten i havsvatten späddes alikvoter i PCR-kvalitetsvatten (1:10) före alla PCR-analyser.
Digital dropp-PCR (ddPCR) utfördes med användning av BioRad QX200-protokollet (Mississauga, Ontario, Kanada).Använd temperaturprofilen för att bestämma den optimala temperaturen (tabell S1).Droppar genererades med en QX200 droppgenerator (BioRad).ddPCR utfördes enligt följande: 95°C under 5 min, 50 cykler av 95°C i 30 s och en given glödgningstemperatur under 1 min och 72°C i 30 s, 4°C i 5 min och 90°C inom 5 minuter.Antalet droppar och positiva reaktioner (antal kopior/µl) mättes med en QX200 droppläsare (BioRad).Prover med mindre än 10 000 droppar avvisades.Mönsterkontroll utfördes inte varje gång ddPCR kördes.
qPCR utfördes med användning av Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australien) och LGALS7 specifika primers.Alla kvantitativa PCR utfördes i 20 µl med användning av QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR startades med en 15 minuters inkubation vid 95°C följt av 40 cykler vid 95°C i 10 sekunder och vid 60°C i 60 sekunder med en datainsamling.Smältkurvor genererades med användning av successiva mätningar vid 95°C i 5 s, 65°C i 60 s och 97°C i slutet av qPCR.Varje qPCR utfördes i tre exemplar, förutom kontrollprover.
Eftersom musslor är kända för sin höga filtreringshastighet undersökte vi först om de kunde filtrera och behålla DNA-fragment som finns i havsvatten.Vi var också intresserade av om dessa fragment ackumuleras i deras halvöppna lymfsystem.Vi löste detta problem experimentellt genom att spåra ödet för lösliga DNA-fragment som lagts till blåmusseltankar.För att underlätta spårning av DNA-fragment använde vi främmande (inte själv) plasmid-DNA innehållande den humana galectin-7-genen.ddPCR spårar plasmid-DNA-fragment i havsvatten och musslor.Våra resultat visar att om mängden DNA-fragment i havsvatten förblev relativt konstant över tiden (upp till 7 dagar) i frånvaro av musslor, så försvann denna nivå nästan helt inom 8 timmar i närvaro av musslor (Fig. 1a,b).Fragment av exogent DNA detekterades lätt inom 15 minuter i intravalvulär vätska och hemolymfa (Fig. 1c).Dessa fragment kunde fortfarande detekteras upp till 4 timmar efter exponering.Denna filtreringsaktivitet med avseende på DNA-fragment är jämförbar med filtreringsaktiviteten hos bakterier och alger [31].Dessa resultat tyder på att musslor kan filtrera och ackumulera främmande DNA i sina vätskeutrymmen.
Relativa koncentrationer av plasmid-DNA i havsvatten i närvaro (A) eller frånvaro (B) av musslor, mätt med ddPCR.I A uttrycks resultaten i procent, där rutornas ramar representerar den 75:e och 25:e percentilen.Den anpassade logaritmiska kurvan visas i rött, och området skuggat i grått representerar 95 % konfidensintervall.I B representerar den röda linjen medelvärdet och den blå linjen representerar 95 % konfidensintervall för koncentrationen.C Ansamling av plasmid-DNA i musslors hemolymfa och klaffvätska vid olika tidpunkter efter tillsats av plasmid-DNA.Resultaten presenteras som absoluta kopior detekterade/ml (±SE).
Därefter undersökte vi ursprunget till ccfDNA i musslor insamlade från musselbäddar på Kerguelenöarna, en avlägsen grupp av öar med begränsad antropogen påverkan.För detta ändamål isolerades och renades cccDNA från musselhemolymfer med metoder som vanligtvis används för att rena humant cccDNA [32, 33].Vi fann att genomsnittliga hemolymf-ccfDNA-koncentrationer i musslor ligger i det låga mikrogram per ml hemolymfa-intervall (se tabell S2, kompletterande information).Detta koncentrationsintervall är mycket större än hos friska människor (låga nanogram per milliliter), men i sällsynta fall, hos cancerpatienter, kan nivån av ccfDNA nå flera mikrogram per milliliter [34, 35].En analys av storleksfördelningen av hemolymph ccfDNA visade att dessa fragment varierar mycket i storlek, från 1000 bp till 1000 bp.upp till 5000 bp (fig. 2).Liknande resultat erhölls med det kiseldioxidbaserade QIAamp Investigator Kit, en metod som vanligtvis används inom kriminalteknik för att snabbt isolera och rena genomiskt DNA från lågkoncentrations-DNA-prover, inklusive ccfDNA [36].
Representativt ccfDNA-elektroforegram av musselhemolymfa.Extraherad med NucleoSnap Plasma Kit (överst) och QIAamp DNA Investigator Kit.B Violinplot som visar fördelningen av hemolymfa ccfDNA-koncentrationer (±SE) i musslor.De svarta och röda linjerna representerar medianen respektive den första och tredje kvartilen.
Ungefär 1% av ccfDNA hos människor och primater har en främmande källa [21, 37].Med tanke på det halvöppna cirkulationssystemet hos musslor, mikrobiellt rikt havsvatten och storleksfördelningen av mussel-ccfDNA, antog vi att musselhemolymf-ccfDNA kan innehålla en rik och mångsidig pool av mikrobiellt DNA.För att testa denna hypotes sekvenserade vi hemolymfa ccfDNA från Aulacomya atra-prover som samlats in från Kerguelenöarna, vilket gav över 10 miljoner avläsningar, varav 97,6% klarade kvalitetskontroll.Avläsningarna klassificerades sedan enligt egna och icke-självkällor med hjälp av BLASTN och NCBI tvåskaliga databaser (Fig. S1, Kompletterande information).
Hos människor kan både nukleärt och mitokondriellt DNA frisättas i blodomloppet [38].I den aktuella studien var det dock inte möjligt att i detalj beskriva musslors kärngenomiska DNA, eftersom A. atra-genomet inte har sekvenserats eller beskrivits.Vi kunde dock identifiera ett antal ccfDNA-fragment av vårt eget ursprung med hjälp av det tvåskaliga biblioteket (Fig. S2, kompletterande information).Vi bekräftade också närvaron av DNA-fragment av vårt eget ursprung genom riktad PCR-amplifiering av de A. atra-gener som sekvenserades (Fig. 3).På samma sätt, med tanke på att mitokondriella genomet av A. atra är tillgängligt i offentliga databaser, kan man hitta bevis för närvaron av mitokondriella ccfDNA-fragment i hemolymfen av A. atra.Närvaron av mitokondriella DNA-fragment bekräftades genom PCR-amplifiering (fig. 3).
Olika mitokondriella gener var närvarande i hemolymfen hos A. atra (röda prickar – lagernummer: SRX5705969) och M. platensis (blå prickar – lagernummer: SRX5705968) amplifierade med PCR.Figur anpassad från Breton et al., 2011 B Amplifiering av hemolymfsupernatant från A. atra Lagras på FTA-papper.Använd en 3 mm stans för att lägga direkt till PCR-röret som innehåller PCR-blandningen.
Med tanke på det rikliga mikrobiella innehållet i havsvatten fokuserade vi initialt på karakteriseringen av mikrobiella DNA-sekvenser i hemolymfa.För att göra detta använder vi två olika strategier.Den första strategin använde Kraken2, ett algoritmbaserat sekvensklassificeringsprogram som kan identifiera mikrobiella sekvenser med en noggrannhet jämförbar med BLAST och andra verktyg [28].Mer än 6719 avläsningar fastställdes vara av bakteriellt ursprung, medan 124 och 64 var från archaea respektive virus (Fig. 4).De vanligaste bakteriella DNA-fragmenten var Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) och Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Denna fördelning överensstämmer med tidigare studier av den marina blåmusslans mikrobiomet [39, 40].Gammaproteobacteria var huvudklassen av Proteobacteria (44%), inklusive många Vibrionales (Fig. 4b).ddPCR-metoden bekräftade närvaron av Vibrio DNA-fragment i ccfDNA från A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41].För att få mer information om det bakteriella ursprunget för ccfDNA togs ett ytterligare tillvägagångssätt (Fig. S2, Kompletterande information). I det här fallet sattes läsningar som överlappade samman som parade ändläsningar och klassificerades som av själv- (musslingar) eller icke-själv-ursprung med användning av BLASTN och ett e-värde på 1e−3 och en cutoff med >90 % homologi. I det här fallet sattes läsningar som överlappade samman som parade ändläsningar och klassificerades som av själv- (musslingar) eller icke-själv-ursprung med användning av BLASTN och ett e-värde på 1e−3 och en cutoff med >90 % homologi. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были класисивы ворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN och значения e 1e-3 och отсечениол с гого%. I det här fallet samlades överlappande avläsningar som parade avläsningar och klassificerades som naturliga (bivalv) eller icke-original med användning av BLASTN och e-värdet på 1e-3 och cutoff med >90 % homologi.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皒倢暒倢倢倢e 债倌e值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使缄的 的 用 的 的 的和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классианфицович ые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN och 1e-3 och порога гомолога. I det här fallet samlades överlappande avläsningar som parade avläsningar och klassificerades som egna (musslingar) eller icke-original med hjälp av e BLASTN och 1e-3 värden och en homologitröskel >90%.Eftersom A. atra-genomet ännu inte har sekvenserats använde vi de novo monteringsstrategin för MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler.Totalt 147 188 kontiger har identifierats som beroende (musslingar) av ursprung.Dessa contigs exploderades sedan med e-värden på 1e-10 med BLASTN och BLASTX.Denna strategi gjorde det möjligt för oss att identifiera 482 icke-bivalve fragment närvarande i A. atra ccfDNA.Mer än hälften (57 %) av dessa DNA-fragment erhölls från bakterier, huvudsakligen från gälsymbionter, inklusive sulfotrofa symbionter, och från gälsymbiioner Solemya velum (fig. 5).
Relativt överflöd på typnivå.B Mikrobiell mångfald av två huvudfylor (Firmicutes och Proteobacteria).Representativ amplifiering av ddPCR C Vibrio spp.A. Fragment av 16S rRNA-genen (blå) i tre atrahemolymfer.
Totalt 482 insamlade contigs analyserades.Allmän profil för den taxonomiska fördelningen av metagenomiska kontigannoteringar (prokaryoter och eukaryoter).B Detaljerad fördelning av bakteriella DNA-fragment identifierade av BLASTN och BLASTX.
Kraken2-analys visade också att mussel-ccfDNA innehöll arkeala DNA-fragment, inklusive DNA-fragment av Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) och Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).Förekomsten av DNA-fragment härrörande från Euryarchaeota och Crenarchaeota, som tidigare hittats i det mikrobiella samhället av kaliforniska musslor, borde inte komma som en överraskning [42].Även om Euryarchaeota ofta förknippas med extrema förhållanden, är det nu känt att både Euryarchaeota och Crenarcheota är bland de vanligaste prokaryoterna i den marina kryogena miljön [43, 44].Förekomsten av metanogena mikroorganismer i musslor är inte förvånande, med tanke på de senaste rapporterna om omfattande metanläckor från bottenläckor på Kerguelenplatån [45] och möjlig mikrobiell metanproduktion som observerats utanför Kerguelenöarnas kust [46].
Vår uppmärksamhet flyttades sedan till avläsningar från DNA-virus.Så vitt vi vet är detta den första studien utanför målet av virushalten i musslor.Som väntat hittade vi DNA-fragment av bakteriofager (Caudovirales) (Fig. 6b).Det vanligaste virala DNA:t kommer dock från en filum av nukleocytovirus, även känd som det nukleära cytoplasmatiska stora DNA-viruset (NCLDV), som har det största genomet av alla virus.Inom denna filum tillhör de flesta DNA-sekvenser familjerna Mimimidoviridae (58%) och Poxviridae (21%), vars naturliga värdar inkluderar ryggradsdjur och leddjur, medan en liten del av dessa DNA-sekvenser tillhör kända virologiska alger.Infekterar marina eukaryota alger.Sekvenserna erhölls också från Pandora-viruset, det jättevirus med den största genomstorleken av alla kända virala släkten.Intressant nog var utbudet av värdar som var kända för att vara infekterade med viruset, bestämt genom hemolymph ccfDNA-sekvensering, relativt stort (Figur S3, kompletterande information).Det inkluderar virus som infekterar insekter som Baculoviridae och Iridoviridae, samt virus som infekterar amöbor, alger och ryggradsdjur.Vi hittade också sekvenser som matchade Pithovirus sibericum-genomet.Pitovirus (även känd som "zombievirus") isolerades först från 30 000 år gammal permafrost i Sibirien [47].Således överensstämmer våra resultat med tidigare rapporter som visar att inte alla moderna arter av dessa virus är utdöda [48] och att dessa virus kan finnas i avlägsna subarktiska marina ekosystem.
Slutligen testade vi för att se om vi kunde hitta DNA-fragment från andra flercelliga djur.Totalt 482 främmande kontiger identifierades av BLASTN och BLASTX med nt-, nr- och RefSeq-bibliotek (genomiskt och protein).Våra resultat visar att bland de främmande fragmenten av ccfDNA från flercelliga djur dominerar DNA från benben (Fig. 5).DNA-fragment från insekter och andra arter har också hittats.En relativt stor del av DNA-fragmenten har inte identifierats, möjligen på grund av underrepresentationen av ett stort antal marina arter i genomiska databaser jämfört med landlevande arter [49].
I denna artikel tillämpar vi LB-konceptet på musslor, med argumentet att sekvensering av hemolymfa ccfDNA-skott kan ge insikt i sammansättningen av marina kustekosystem.I synnerhet fann vi att 1) ​​musselhemolymfa innehåller relativt höga koncentrationer (mikrogramnivåer) av relativt stora (~1-5 kb) cirkulerande DNA-fragment;2) dessa DNA-fragment är både oberoende och icke-oberoende 3) Bland de främmande källorna till dessa DNA-fragment fann vi bakteriellt, arkealt och viralt DNA, såväl som DNA från andra flercelliga djur;4) Ansamlingen av dessa främmande ccfDNA-fragment i hemolymfen sker snabbt och bidrar till musslornas inre filtreringsaktivitet.Sammanfattningsvis visar vår studie att begreppet LB, som hittills främst tillämpats inom biomedicinområdet, kodar för en rik men outforskad kunskapskälla som kan användas för att bättre förstå interaktionen mellan vaktpostarter och deras miljö.
Förutom primater har ccfDNA-isolering rapporterats hos däggdjur, inklusive möss, hundar, katter och hästar [50, 51, 52].Såvitt vi vet är vår studie den första som rapporterar upptäckt och sekvensering av ccfDNA i marina arter med ett öppet cirkulationssystem.Denna anatomiska egenskap och filtreringsförmåga hos musslor kan, åtminstone delvis, förklara de olika storleksegenskaperna hos cirkulerande DNA-fragment jämfört med andra arter.Hos människor är de flesta DNA-fragment som cirkulerar i blodet små fragment som varierar i storlek från 150 till 200 bp.med en maximal topp på 167 bp [34, 53].En liten men betydande del av DNA-fragmenten är mellan 300 och 500 bp i storlek, och cirka 5% är längre än 900 bp.[54].Anledningen till denna storleksfördelning är att huvudkällan till ccfDNA i plasma uppstår som ett resultat av celldöd, antingen på grund av celldöd eller på grund av nekros av cirkulerande hematopoetiska celler hos friska individer eller på grund av apoptos av tumörceller hos cancerpatienter (känd som cirkulerande tumör-DNA).ctDNA).Storleksfördelningen av hemolymph ccfDNA som vi hittade i musslor varierade från 1000 till 5000 bp, vilket tyder på att mussel ccfDNA har ett annat ursprung.Detta är en logisk hypotes, eftersom musslor har ett halvöppet kärlsystem och lever i marina vattenmiljöer som innehåller höga koncentrationer av mikrobiellt genomiskt DNA.Faktum är att våra laboratorieexperiment med exogent DNA har visat att musslor ackumulerar DNA-fragment i havsvatten, åtminstone efter några timmar bryts de ned efter cellulärt upptag och/eller frigörs och/eller lagras i olika organisationer.Med tanke på sällsyntheten hos celler (både prokaryota och eukaryota), kommer användningen av intravalvulära avdelningar att minska mängden ccfDNA från egna källor såväl som från främmande källor.Med tanke på vikten av tvåskalig medfödd immunitet och det stora antalet cirkulerande fagocyter, antog vi vidare att även främmande ccfDNA anrikas i cirkulerande fagocyter som ackumulerar främmande DNA vid intag av mikroorganismer och/eller cellrester.Sammantaget visar våra resultat att tvåskalig hemolymfa ccfDNA är ett unikt förråd av molekylär information och förstärker deras status som en vaktpostart.
Våra data indikerar att sekvensering och analys av bakteriehärledda hemolymfa ccfDNA-fragment kan ge nyckelinformation om värdbakteriefloran och bakterierna som finns i det omgivande marina ekosystemet.Skottsekvenseringstekniker har avslöjat sekvenser av den kommensala bakterien A. atra gill som skulle ha missats om konventionella 16S rRNA-identifieringsmetoder hade använts, delvis på grund av en bias i referensbiblioteket.Faktum är att vår användning av LB-data som samlats in från M. platensis i samma mussellager vid Kerguelen visade att sammansättningen av gälassocierade bakteriesymbionter var densamma för båda musselarterna (Fig. S4, Kompletterande information).Denna likhet mellan två genetiskt olika musslor kan återspegla sammansättningen av bakteriesamhällen i de kalla, svavelhaltiga och vulkaniska avlagringarna i Kerguelen [55, 56, 57, 58].Högre halter av svavelreducerande mikroorganismer har beskrivits väl vid skörd av musslor från bioturberade kustområden [59], såsom kusten i Port-au-France.En annan möjlighet är att den kommensala musselfloran kan påverkas av horisontell överföring [60, 61].Mer forskning behövs för att fastställa sambandet mellan havsmiljön, havsbottenytan och sammansättningen av symbiotiska bakterier i musslor.Dessa studier pågår för närvarande.
Längden och koncentrationen av hemolymfa ccfDNA, dess enkla rening och höga kvalitet för att möjliggöra snabb hagelgevärssekvensering är några av de många fördelarna med att använda musslor ccfDNA för att bedöma biologisk mångfald i marina kustekosystem.Detta tillvägagångssätt är särskilt effektivt för att karakterisera virala samhällen (virom) i ett givet ekosystem [62, 63].Till skillnad från bakterier, archaea och eukaryoter innehåller virala genom inte fylogenetiskt konserverade gener såsom 16S-sekvenser.Våra resultat indikerar att flytande biopsier från indikatorarter som musslor kan användas för att identifiera ett relativt stort antal ccfDNA-virusfragment som är kända för att infektera värdar som vanligtvis lever i kustnära marina ekosystem.Detta inkluderar virus som är kända för att infektera protozoer, leddjur, insekter, växter och bakteriella virus (t.ex. bakteriofager).En liknande fördelning hittades när vi undersökte hemolymf-ccfDNA-viromet från blåmusslor (M. platensis) samlade i samma mussellager vid Kerguelen (tabell S2, kompletterande information).Hagelgevärssekvensering av ccfDNA är verkligen ett nytt tillvägagångssätt som tar fart i studiet av viromen hos människor eller andra arter [21, 37, 64].Detta tillvägagångssätt är särskilt användbart för att studera dubbelsträngade DNA-virus, eftersom ingen enskild gen är bevarad bland alla dubbelsträngade DNA-virus, som representerar den mest mångsidiga och breda klassen av virus i Baltimore [65].Även om de flesta av dessa virus förblir oklassificerade och kan inkludera virus från en helt okänd del av den virala världen [66], fann vi att viromerna och värdområdena för musslorna A. atra och M. platensis faller mellan de två arterna.på liknande sätt (se figur S3, ytterligare information).Denna likhet är inte förvånande, eftersom den kan återspegla en brist på selektivitet i upptaget av DNA som finns i miljön.Framtida studier som använder renat RNA behövs för närvarande för att karakterisera RNA-viromet.
I vår studie använde vi en mycket rigorös pipeline anpassad från arbetet av Kowarski och kollegor [37], som använde en tvåstegsradering av poolade läsningar och contigs före och efter montering av inhemskt ccfDNA, vilket resulterade i en hög andel omappade läsningar.Därför kan vi inte utesluta att vissa av dessa omartade läsningar fortfarande kan ha sitt eget ursprung, främst för att vi inte har ett referensgenom för denna musselart.Vi använde också denna pipeline eftersom vi var oroliga över chimärerna mellan själv- och icke-självläsningar och läslängderna som genererades av Illumina MiSeq PE75.En annan anledning till majoriteten av okända avläsningar är att mycket av de marina mikroberna, särskilt i avlägsna områden som Kerguelen, inte har kommenterats.Vi använde Illumina MiSeq PE75, förutsatt att ccfDNA-fragmentlängder liknar humant ccfDNA.För framtida studier, med tanke på våra resultat som visar att hemolymph ccfDNA har längre avläsningar än människor och/eller däggdjur, rekommenderar vi att du använder en sekvenseringsplattform som är mer lämpad för längre ccfDNA-fragment.Denna praxis kommer att göra det mycket lättare att identifiera fler indikationer för djupare analys.Att erhålla den för närvarande otillgängliga fullständiga A. atra nukleära genomsekvensen skulle också i hög grad underlätta urskiljningen av ccfDNA från egna och icke-självkällor.Med tanke på att vår forskning har fokuserat på möjligheten att tillämpa konceptet flytande biopsi på musslor, hoppas vi att eftersom detta koncept används i framtida forskning kommer nya verktyg och pipelines att utvecklas för att öka potentialen för denna metod för att studera den mikrobiella mångfalden hos musslor.marina ekosystem.
Som en icke-invasiv klinisk biomarkör är förhöjda humana plasmanivåer av ccfDNA associerade med olika sjukdomar, vävnadsskador och stresstillstånd [67,68,69].Denna ökning är associerad med frisättningen av DNA-fragment av sitt eget ursprung efter vävnadsskada.Vi tog upp detta problem med akut värmestress, där musslor kortvarigt exponerades för en temperatur på 30 °C.Vi utförde denna analys på tre olika typer av musslor i tre oberoende experiment.Vi hittade dock ingen förändring i ccfDNA-nivåer efter akut värmestress (se figur S5, ytterligare information).Denna upptäckt kan förklara, åtminstone delvis, det faktum att musslor har ett halvöppet cirkulationssystem och ackumulerar stora mängder främmande DNA på grund av sin höga filtreringsaktivitet.Å andra sidan kan musslor, liksom många ryggradslösa djur, vara mer motståndskraftiga mot stressinducerad vävnadsskada, vilket begränsar frisättningen av ccfDNA i deras hemolymfa [70, 71].
Hittills har DNA-analys av biologisk mångfald i akvatiska ekosystem främst fokuserat på miljö-DNA (eDNA) metabarcoding.Denna metod är dock vanligtvis begränsad i biodiversitetsanalys när primers används.Användningen av hagelgevärssekvensering kringgår begränsningarna för PCR och det partiska urvalet av primeruppsättningar.På sätt och vis är vår metod alltså närmare den nyligen använda high-throughput eDNA Shotgun-sekvenseringsmetoden, som kan direkt sekvensera fragmenterat DNA och analysera nästan alla organismer [72, 73].Det finns dock ett antal grundläggande problem som skiljer LB från vanliga eDNA-metoder.Naturligtvis är den största skillnaden mellan eDNA och LB användningen av naturliga filtervärdar.Användning av marina arter som svampar och musslor (Dresseina spp.) som ett naturligt filter för att studera eDNA har rapporterats [74, 75].Dreissenas studie använde dock vävnadsbiopsier från vilka DNA extraherades.Analys av ccfDNA från LB kräver inte vävnadsbiopsi, specialiserad och ibland dyr utrustning och logistik i samband med eDNA eller vävnadsbiopsi.Faktum är att vi nyligen rapporterade att ccfDNA från LB kan lagras och analyseras med FTA-stöd utan att upprätthålla en kylkedja, vilket är en stor utmaning för forskning i avlägsna områden [76].Extraktionen av ccfDNA från flytande biopsier är också enkel och ger högkvalitativt DNA för hagelgevärssekvensering och PCR-analys.Detta är en stor fördel med tanke på några av de tekniska begränsningarna som är förknippade med eDNA-analys [77].Provtagningsmetodens enkelhet och låga kostnad är också särskilt lämplig för långsiktiga övervakningsprogram.Förutom deras höga filtreringsförmåga är en annan välkänd egenskap hos musslor den kemiska mukopolysackaridsammansättningen av deras slem, vilket främjar absorptionen av virus [78, 79].Detta gör musslor till ett idealiskt naturligt filter för att karakterisera biologisk mångfald och effekterna av klimatförändringar i ett givet akvatiskt ekosystem.Även om närvaron av värdhärledda DNA-fragment kan ses som en begränsning av metoden jämfört med eDNA, är kostnaden förknippad med att ha ett sådant naturligt ccfDNA jämfört med eDNA samtidigt förståeligt för den stora mängd information som finns tillgänglig för hälsostudier.offset värd.Detta inkluderar närvaron av virala sekvenser integrerade i värdvärdens genom.Detta är särskilt viktigt för musslor, med tanke på förekomsten av horisontellt överförda leukemiska retrovirus i musslor [80, 81].En annan fördel med LB framför eDNA är att den utnyttjar den fagocytiska aktiviteten hos cirkulerande blodkroppar i hemolymfan, som uppslukar mikroorganismer (och deras genom).Fagocytos är huvudfunktionen hos blodkroppar i musslor [82].Slutligen utnyttjar metoden den höga filtreringskapaciteten hos musslor (i genomsnitt 1,5 l/h havsvatten) och två dagars cirkulation, vilket ökar blandningen av olika lager av havsvatten, vilket möjliggör infångning av heterologt eDNA.[83, 84].Därför är ccfDNA-analys av musslor en intressant väg med tanke på musslornas näringsmässiga, ekonomiska och miljömässiga effekter.I likhet med analysen av LB som samlats in från människor, öppnar denna metod också för möjligheten att mäta genetiska och epigenetiska förändringar i värd-DNA som svar på exogena ämnen.Till exempel kan tredje generationens sekvenseringsteknologier tänkas utföra genomomfattande metyleringsanalys i nativt ccfDNA med användning av nanopore-sekvensering.Denna process bör underlättas av det faktum att längden på musselns ccfDNA-fragment är idealiskt kompatibel med långlästa sekvenseringsplattformar som tillåter genomomfattande DNA-metyleringsanalys från en enda sekvenseringskörning utan behov av kemiska transformationer.85,86] Detta är en intressant möjlighet, eftersom det har visat sig att DNA-respons-metylering över många miljömässiga stress- och persistmönster återspeglar en miljöpåverkan.Därför kan det ge värdefull insikt i de underliggande mekanismerna som styr reaktionen efter exponering för klimatförändringar eller föroreningar [87].Användningen av LB är dock inte utan begränsningar.Det behöver inte sägas att detta kräver närvaron av indikatorarter i ekosystemet.Som nämnts ovan kräver användning av LB för att bedöma den biologiska mångfalden i ett givet ekosystem också en rigorös bioinformatikpipeline som tar hänsyn till närvaron av DNA-fragment från källan.Ett annat stort problem är tillgången på referensgenom för marina arter.Förhoppningen är att initiativ som Marine Mammal Genomes Project och det nyligen etablerade Fish10k-projektet [88] kommer att underlätta sådan analys i framtiden.Tillämpningen av LB-konceptet på marina filtermatande organismer är också kompatibel med de senaste framstegen inom sekvenseringsteknologi, vilket gör den väl lämpad för utveckling av multi-ohm biomarkörer för att ge viktig information om hälsan hos marina livsmiljöer som svar på miljöstress.
Genomsekvenseringsdata har deponerats i NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 under Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Klimatförändringarnas inverkan på marint liv och ekosystem.Cole biologi.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Tänk på de kombinerade effekterna av klimatförändringar och andra lokala stressfaktorer på den marina miljön.allmän vetenskaplig miljö.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Vetenskap av den första mars.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Minskad värmetolerans under upprepade värmestressförhållanden förklarar den höga sommardödligheten för blåmusslor.Vetenskaplig rapport 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Senaste förändringar i frekvens, orsaker och omfattning av djurdöd.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Flera icke-artsspecifika patogener kan ha orsakat massdödlighet hos Pinna nobilis.Liv.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potentiell påverkan av klimatförändringar på arktiska zoonotiska sjukdomar.Int J Circumpolär hälsa.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Blåmusslor (Mytilus edulis spp.) som signalorganismer vid övervakning av kustföroreningar: en översyn.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integration av flytande biopsi i cancerbehandling.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Mognad i flytande biopsi: Tillåter tumör-DNA att cirkulera.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinsyror i human plasma.Mötesprotokoll för Soc Biols dotterbolag.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. En ny roll för cellfritt DNA som en molekylär markör för cancerbehandling.Kvantifiering av biomolär analys.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Vätskebiopsi kommer in på kliniken – implementeringsfrågor och framtida utmaningar.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW och andra.Foster-DNA finns i moderns plasma och serum.Lansett.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studie av graviditetsförloppet och dess komplikationer med hjälp av cirkulerande extracellulärt RNA i blodet hos kvinnor under graviditeten.Dopediatrik.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Vätskebiopsi: donatorcellsfritt DNA används för att detektera allogena lesioner i ett njurtransplantat.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovationer i prenatal diagnostik: moderns plasmagenomsekvensering.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Snabb patogendetektering med nästa generations metagenomisk sekvensering av infekterade kroppsvätskor.Nat Medicin.2021;27:115-24.