Tack för att du besöker Nature.com.Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Okontrollerad blödning är en av de främsta dödsorsakerna.Att uppnå snabb hemostas säkerställer att försökspersonen överlever som första hjälpen under strid, trafikolyckor och dödsminskningsoperationer.Nanoporös fiberförstärkt kompositställning (NFRCS) härledd från en enkel hemostatisk filmbildande komposition (HFFC) som en kontinuerlig fas kan utlösa och förbättra hemostas.Utvecklingen av NFRCS bygger på designen av trollsländans vinge.Trollsländans vingstruktur består av tvärgående och längsgående vingar, och vingmembranen är anslutna till varandra för att bibehålla mikrostrukturens integritet.HFFC täcker likformigt fiberytan med en film av nanometertjocklek och förbinder den slumpmässigt fördelade bomullstjockleken (Ct) (dispergerad fas) för att bilda en nanoporös struktur.Kombinationen av kontinuerliga och dispergerade faser minskar kostnaden för produkten med tio gånger jämfört med kommersiellt tillgängliga produkter.Modifierade NFRCS (tamponger eller armband) kan användas i en mängd olika biomedicinska tillämpningar.In vivo-studier har kommit fram till att den utvecklade Cp NFRCS utlöser och förstärker koaguleringsprocessen vid appliceringsstället.NFRCS kan modulera mikromiljön och agera på cellnivå på grund av dess nanoporösa struktur vilket resulterar i bättre sårläkning i excisionssårsmodellen.
Okontrollerad blödning under strid, intraoperativa och akuta situationer kan utgöra ett allvarligt hot mot de sårades liv1.Dessa tillstånd leder vidare till en total ökning av perifert vaskulärt motstånd, vilket leder till hemorragisk chock.Lämpliga åtgärder för att kontrollera blödning under och efter operationen anses vara potentiellt livshotande2,3.Skador på stora kärl leder till massiv blodförlust, vilket resulterar i en dödlighet på ≤ 50 % i strid och 31 % under operation1.Massiv blodförlust leder till en minskning av kroppsvolymen, vilket minskar hjärtminutvolymen.En ökning av totalt perifert vaskulärt motstånd och en progressiv försämring av mikrocirkulationen leder till hypoxi i de livsuppehållande organen.Hemorragisk chock kan uppstå om tillståndet fortsätter utan effektiva ingrepp1,4,5.Andra komplikationer inkluderar utvecklingen av hypotermi och metabolisk acidos, såväl som en koagulationsrubbning som hindrar koagulationsprocessen.Allvarlig hemorragisk chock är förknippad med en högre risk för död6,7,8.Vid grad III (progressiv) chock är blodtransfusion avgörande för patientens överlevnad under intraoperativ och postoperativ morbiditet och mortalitet.För att övervinna alla ovanstående livshotande situationer har vi utvecklat en nanoporös fiberförstärkt kompositställning (NFRCS) som använder en minimal polymerkoncentration (0,5%) med en kombination av vattenlösliga hemostatiska polymerer.
Med användning av fiberarmering kan kostnadseffektiva produkter utvecklas.De slumpmässigt arrangerade fibrerna liknar strukturen hos en trollsländas vinge, balanserad av de horisontella och vertikala ränderna på vingarna.Vingens tvärgående och längsgående vener kommunicerar med vingmembranet (fig. 1).NFRCS består av förstärkt Ct som ett ställningssystem med bättre fysisk och mekanisk hållfasthet (Figur 1).På grund av prisvärdheten och hantverket föredrar kirurger att använda bomullstrådsmätare (Ct) under operationer och förband. Med tanke på dess många fördelar, inklusive > 90 % kristallin cellulosa (förbättrar hemostatisk aktivitet), användes Ct som ett skelettsystem av NFRCS9,10. Med tanke på dess många fördelar, inklusive > 90 % kristallin cellulosa (förbättrar hemostatisk aktivitet), användes Ct som ett skelettsystem av NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90 % кристаллической целлюческой целлюлозви статической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Därför, med tanke på dess många fördelar, inklusive >90 % kristallin cellulosa (involverad i ökad hemostatisk aktivitet), användes Ct som NFRCS skelettsystem9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强攺止血 FR ,10 的骨架系统.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Därför, med tanke på dess många fördelar, inklusive över 90 % kristallin cellulosa (hjälper till att förbättra hemostatisk aktivitet), användes Ct som en ställning för NFRCS9,10.Ct belades ytligt (nanotjock filmbildning observerades) och sammankopplades med en hemostatisk filmbildande komposition (HFFC).HFFC fungerar som en matrigel och håller ihop slumpmässigt placerade Ct.Den utvecklade designen överför spänningar inom den dispergerade fasen (förstärkningsfibrer).Det är svårt att erhålla nanoporösa strukturer med god mekanisk hållfasthet med minimala polymerkoncentrationer.Dessutom är det inte lätt att anpassa olika formar för olika biomedicinska tillämpningar.
Figuren visar ett diagram över NFRCS-konstruktionen baserat på trollsländans vingstruktur (A).Denna bild visar en jämförande analogi av vingstrukturen hos en trollslända (vingens korsande och längsgående vener är sammankopplade) och ett tvärsnittsmikrografi av Cp NFRCS (B).Schematisk representation av NFRCS.
NFRC utvecklades med HFFC som en kontinuerlig fas för att ta itu med ovanstående begränsningar.HFFC är sammansatt av olika filmbildande hemostatiska polymerer inklusive kitosan (som den huvudsakliga hemostatiska polymeren) med metylcellulosa (MC), hydroxipropylmetylcellulosa (HPMC 50 cp) och polyvinylalkohol (PVA)) (125 kDa) som stödpolymer som främjar trombbildning.bildning.Tillsatsen av polyvinylpyrrolidin K30 (PVP K30) förbättrade NFRCS:s förmåga att absorbera fukt.Polyetylenglykol 400 (PEG 400) tillsattes för att förbättra polymertvärbindningen i bundna polymerblandningar.Tre olika hemostatiska HFFC-kompositioner (Cm HFFC, Ch HFFC och Cp HFFC), nämligen kitosan med MC (Cm), kitosan med HPMC (Ch) och kitosan med PVA (Cp), applicerades på Ct.Olika in vitro och in vivo karakteriseringsstudier har bekräftat den hemostatiska och sårläkande aktiviteten hos NFRCS.Kompositmaterial som erbjuds av NFRCS kan användas för att anpassa olika former av ställningar för att möta specifika behov.
Dessutom kan NFRCS modifieras som ett bandage eller rulle för att täcka hela skadeområdet i de nedre extremiteterna och andra delar av kroppen.Specifikt för stridsskador på extremiteter kan den designade NFRCS-designen ändras till en halvarm eller ett helt ben (tilläggsbild S11).NFRCS kan göras till ett armband med vävnadslim, som kan användas för att stoppa blödningar från allvarliga suicidala handledsskador.Vårt huvudmål är att utveckla en NFRCS med så lite polymer som möjligt som kan levereras till en stor befolkning (under fattigdomsgränsen) och som kan placeras i en första hjälpen-kit.Enkel, effektiv och ekonomisk i design, NFRCS gynnar lokala samhällen och kan ha en global inverkan.
Kitosan (molekylvikt 80 kDa) och amarant köptes från Merck, Indien.Hydroxipropylmetylcellulosa 50 Cp, polyetylenglykol 400 och metylcellulosa köptes från Loba Chemie Pvt.LLC, Mumbai.Polyvinylalkohol (molekylvikt 125 kDa) (87-90 % hydrolyserad) köptes från National Chemicals, Gujarat.Polyvinylpyrrolidin K30 köptes från Molychem, Mumbai, sterila pinnar köptes från Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, med Milli Q-vatten (Direct-Q3 vattenreningssystem, Merck, Indien) som bärare.
NFRCS utvecklades med hjälp av en lyofiliseringsmetod11,12.Alla HFFC-kompositioner (tabell 1) framställdes med användning av en mekanisk omrörare.Bered en 0,5% lösning av kitosan med 1% ättiksyra i vatten genom kontinuerlig omrörning vid 800 rpm på en mekanisk omrörare.Den exakta vikten av den laddade polymeren som anges i tabell 1 sattes till kitosanlösningen och omrördes tills en klar polymerlösning erhölls.PVP K30 och PEG 400 sattes till den resulterande blandningen i de mängder som anges i Tabell 1, och omrörningen fortsattes tills en klar viskös polymerlösning erhölls.Det resulterande badet av polymerlösning sonikerades i 60 minuter för att avlägsna instängda luftbubblor från polymerblandningen.Som visas i tilläggsfigur S1(b), fördelades Ct jämnt i varje brunn i en 6-brunnars platta (form) kompletterad med 5 ml HFFC.
Plattan med sex brunnar sonikerades i 60 minuter för att uppnå enhetlig vätning och distribution av HFFC i Ct-nätverket.Frys sedan in plattan med sex brunnar vid -20°C i 8-12 timmar.Frysplattor lyofiliserades under 48 timmar för att erhålla olika formuleringar av NFRCS.Samma procedur används för att producera olika former och strukturer, såsom tamponger eller cylindriska tamponger, eller någon annan form för olika applikationer.
Noggrant vägd kitosan (80 kDa) (3%) löses i 1% ättiksyra med användning av en magnetomrörare.Till den resulterande lösningen av kitosan sattes 1 % PEG 400 och omrördes i 30 minuter.Häll den resulterande lösningen i en fyrkantig eller rektangulär behållare och frys vid -80°C i 12 timmar.Frysta prover lyofiliserades under 48 timmar för att erhålla porös Cs13.
Den utvecklade NFRCS utsattes för experiment med Fourier transform infraröd spektroskopi (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japan) för att bekräfta kitosans kemiska kompatibilitet med andra polymerer14,15.FTIR-spektra (bredden av spektralområdet från 400 till 4000 cm-1) av alla testade prover erhölls genom att utföra 32 skanningar.
Blodabsorptionshastigheten (BAR) för alla formuleringar utvärderades med användning av metoden beskriven av Chen et al.16 med små modifieringar.De utvecklade NFRKs av alla kompositioner torkades i en vakuumugn vid 105°C över natten för att avlägsna kvarvarande lösningsmedel.30 mg NFRCS (initial provvikt – W0) och 30 mg Ct (positiv kontroll) placerades i separata skålar innehållande en förblandning av 3,8 % natriumcitrat.Vid förutbestämda tidsintervall, dvs. 5, 10, 20, 30, 40 och 60 sekunder, avlägsnades NFRCS och deras ytor rengjordes från oabsorberat blod genom att placera proverna på Ct under 30 sekunder.Den slutliga vikten av blod absorberat av NFRCS 16 beaktades (W1) vid varje tidpunkt.Beräkna BAR-procenten med hjälp av följande formel:
Blodkoaguleringstid (BCT) bestämdes såsom rapporterats av Wang et al.17 .Den tid som krävdes för helblod (råttblod förblandat med 3,8 % natriumcitrat) att koagulera i närvaro av NFRCS beräknades som BCT för testprovet.De olika NFRCS-komponenterna (30 mg) placerades i 10 ml skruvlocksflaskor och inkuberades vid 37°C.Blod (0,5 ml) sattes till flaskan och 0,3 ml 0,2 M CaCl2 tillsattes för att aktivera blodkoagulation.Vänd slutligen på flaskan var 15:e sekund (upp till 180°) tills det bildas en fast propp.BCT för provet uppskattas av antalet vändningar vails17,18.Baserat på BCT valdes två optimala kompositioner från NFRCS Cm, Ch och Cp ut för ytterligare karakteriseringsstudier.
BCT för Ch NFRCS- och Cp NFRCS-kompositioner bestämdes genom att implementera metoden som beskrivs av Li et al.19 .Placera 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS och Cs (positiv kontroll) i separata petriskålar (37 °C).Blod innehållande 3,8 % natriumcitrat blandades med 0,2 M CaCl2 i ett 10:1 volymförhållande för att starta blodkoaguleringsprocessen.20 ul av 0,2 M CaCl2-råttblodblandning applicerades på provytan och placerades i en tom petriskål.Kontrollen var blod som hälldes i tomma petriskålar utan Ct.Med fasta intervaller på 0, 3 och 5 minuter, stoppa koaguleringen genom att tillsätta 10 ml avjoniserat (DI) vatten till provet som innehåller skålen utan att störa koaguleringen.Okoagulerade erytrocyter (erytrocyter) genomgår hemolys i närvaro av avjoniserat vatten och frigör hemoglobin.Hemoglobin vid olika tidpunkter (HA(t)) mättes vid 540 nm (λmax hemoglobin) med användning av en UV-Vis-spektrofotometer.Den absoluta absorptionen av hemoglobin (AH(0)) i 0 min av 20 µl blod i 10 ml avjoniserat vatten togs som referensstandard.Det relativa hemoglobinupptaget (RHA) av koagulerat blod beräknades från förhållandet HA(t)/HA(0) med användning av samma sats blod.
Med användning av en texturanalysator (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA) bestämdes NFRKs vidhäftningsegenskaper till skadad vävnad.Tryck en cylindrisk form med öppen botten mot insidan av fläskskinnet (utan fettlagret).Prover (Ch NFRCS och Cp NFRCS) applicerades via kanyl i cylindriska formar för att skapa vidhäftning till huden på grisen.Efter en 3 minuters inkubation vid rumstemperatur (RT) (25°C) registrerades NFRCS-vidhäftningsstyrkan vid en konstant hastighet av 0,5 mm/sek.
Huvudfunktionen hos kirurgiska tätningsmedel är att öka blodkoaguleringen samtidigt som blodförlusten minskar.Förlustfri koagulation i NFRCS utvärderades med en tidigare publicerad metod med små modifieringar 19 .Gör ett mikrocentrifugrör (2 ml) (innerdiameter 10 mm) med ett 8 × 5 mm2 hål på ena sidan av centrifugröret (representerar ett öppet sår).NFRCS används för att stänga öppningen och tejp används för att täta ytterkanterna.Tillsätt 20 µl 0,2 M CaCl2 till mikrocentrifugröret som innehåller 3,8 % natriumcitratförblandningen.Efter 10 minuter avlägsnades mikrocentrifugrören från skålarna och ökningen av skålarnas massa bestämdes på grund av utflödet av blod från NFRK (n = 3).Blodförlust Ch NFRCS och Cp NFRCS jämfördes med Cs.
Våtintegriteten hos NFRCS bestämdes baserat på metoden som beskrivs av Mishra och Chaudhary21 med mindre modifieringar.Placera NFRCS i en 100 ml Erlenmeyer-kolv med 50 ml vatten och snurra i 60 s utan att bilda en topp.Visuell kontroll och prioritering av prover för fysisk integritet baserat på insamling.
Bindningsstyrkan av HFFC till Ct studerades med tidigare publicerade metoder med mindre modifieringar.Ytbeläggningens integritet utvärderades genom att exponera NFRK för akustiska vågor (extern stimulans) i närvaro av milliQ vatten (Ct).De utvecklade NFRCS Ch NFRCS och Cp NFRCS placerades i en bägare fylld med vatten och sonikerades under 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 respektive 30 minuter.Efter torkning användes den procentuella skillnaden mellan den initiala och slutliga vikten av NFRCS för att beräkna den procentuella förlusten av material (HFFC).In vitro BCT stödde ytterligare bindningsstyrkan eller förlusten av ytmaterial.Effektiviteten av HFFC-bindning till Ct ger blodkoagulering och en elastisk beläggning på ytan av Ct22.
Homogeniteten hos den utvecklade NFRCS bestämdes av BCT av prover (30 mg) tagna från slumpmässigt utvalda allmänna platser i NFRCS.Följ den tidigare nämnda BCT-proceduren för att fastställa NFRCS-efterlevnad.Närhet mellan alla fem prover säkerställer enhetlig yttäckning och HFFC-avsättning i Ct-nätet.
Den nominella blodkontaktytan (NBCA) bestämdes som tidigare rapporterats med vissa modifieringar.Koagulera blodet genom att klämma fast 20 µl blod mellan de två ytorna av Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS och Cs.Efter 1 timme separerades de två delarna av stenten och mättes manuellt av koagelområdet.Medelvärdet av tre repetitioner ansågs vara NBCA NFRCS19.
Dynamic Vapor Sorption (DVS)-analys användes för att utvärdera effektiviteten av NFRCS för att absorbera vatten från den yttre miljön eller från skadeplatsen som är ansvarig för att initiera koagulering.DVS utvärderar eller registrerar ångupptaget och förlusten i ett prov gravimetriskt med hjälp av en ultrakänslig våg med en massaupplösning på ±0,1 µg.Ett partiellt ångtryck (relativ fuktighet) genereras av en elektronisk massflödesregulator runt provet genom att blanda mättade och torra bärargaser. Enligt riktlinjerna för Europeiska farmakopén, baserat på procentandelen fuktupptag av proverna, kategoriserades proverna i 4 kategorier (0–0,012 % vikt/vikt- icke-hygroskopiska, 0,2–2 % vikt/vikt lätt hygroskopiska, 2–15 % måttligt hygroskopiska och > 15 % hygroskopiska)23 mycket hygroskopiska. Enligt riktlinjerna för den europeiska farmakopén, baserat på den procentuella fuktupptagningen av proverna, kategoriserades proverna i 4 kategorier (0–0,012 % vikt/vikt- icke-hygroskopiska, 0,2–2 % vikt/vikt lätt hygroskopiska, 2–15 % måttligt hygroskopiska och > 15 % hygroskopiska)23 mycket hygroskopiska.I enlighet med rekommendationerna i den europeiska farmakopén, beroende på procentuell fuktupptagning av proverna, delades proverna in i 4 kategorier (0–0,012 % vikt/vikt – icke-hygroskopisk, 0,2–2 % vikt/vikt lätt hygroskopisk, 2–15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % måttligt hygroskopisk och > 15 % mycket hygroskopisk)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（逧0-0,012% w/w-2% w/w-2% w/w. /w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15 % 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 分为 刱为 刱＆为 .-2.000.湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % W/w 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23.I enlighet med den europeiska farmakopéns rekommendationer delas proverna in i 4 klasser beroende på procentandelen fukt som absorberas av provet (0-0,012 viktprocent – ​​icke-hygroskopisk, 0,2-2 viktprocent lätt hygroskopisk, 2-15 viktprocent).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % måttligt hygroskopisk, > 15 % mycket hygroskopisk) 23.Den hygroskopiska effektiviteten av NFCS X NFCS och TsN NFCS bestämdes på en analysator DVS TA TGA Q5000 SA.Under denna process erhölls körtid, relativ fuktighet (RH) och provvikt i realtid vid 25°C24.Fukthalten beräknas genom noggrann NFRCS-massanalys med hjälp av följande ekvation:
MC är NFRCS-fuktighet.m1 – torrvikt av NSAID.m2 är NFRCS-massan i realtid vid en given RH.
Den totala ytarean uppskattades med hjälp av ett kväveadsorptionsexperiment med flytande kväve efter tömning av proverna vid 25 °C i 10 timmar (< 7 × 10–3 Torr). Den totala ytarean uppskattades med hjälp av ett kväveadsorptionsexperiment med flytande kväve efter tömning av proverna vid 25 °C i 10 timmar (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азоперимента при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Den totala ytan uppskattades med hjälp av ett kväveadsorptionsexperiment med flytande kväve efter att proverna tömts vid 25 °C i 10 timmar (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计怂觯逢积鯝+25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азоцентов ов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Den totala ytarean uppskattades med användning av kväveadsorptionsexperiment med flytande kväve efter att proverna tömts under 10 timmar vid 25°C (< 7 x 10-3 torr).Total yta, porvolym och NFRCS-porstorlek bestämdes med en Quantachrome från NOVA 1000e, Österrike med användning av RS 232-mjukvara.
Bered 5% RBC (saltlösning som spädningsmedel) från helblod.Överför sedan en alikvot av HFFC (0,25 ml) till en 96-brunnars platta och 5 % RBC-massa (0,1 ml).Inkubera blandningen vid 37°C i 40 minuter.En blandning av röda blodkroppar och serum ansågs vara en positiv kontroll och en blandning av saltlösning och röda blodkroppar som en negativ kontroll.Hemagglutination bestämdes enligt Stajitzky-skalan.De föreslagna skalorna är följande: + + + + täta granulära aggregat;+ + + släta bottenkuddar med böjda kanter;+ + släta bottenkuddar med trasiga kanter;+ smala röda ringar runt kanterna på de släta dynorna;– (negativ) diskret röd knapp 12 i mitten av den nedre brunnen.
Hemokompatibiliteten hos NFRCS studerades enligt metoden från International Organization for Standardization (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Den gravimetriska metoden som beskrivs av Singh et al.Mindre modifieringar gjordes för att bedöma trombbildning i närvaro av eller på ytan av NFRCS.500 mg Cs, Ch NFRCS och Cp NFRCS inkuberades i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under 24 timmar vid 37°C.Efter 24 timmar avlägsnades PBS och NFRCS behandlades med 2 ml blod innehållande 3,8 % natriumcitrat.På ytan av NFRCS, tillsätt 0,04 ml 0,1 M CaCl2 till de inkuberade proverna.Efter 45 minuter tillsattes 5 ml destillerat vatten för att stoppa koaguleringen.Koagulerat blod på ytan av NFRK behandlades med 36-38% formaldehydlösning.Koaglarna fixerade med formaldehyd torkades och vägdes.Procentandelen trombos uppskattades genom att beräkna vikten av glaset utan blod och prov (negativ kontroll) och glaset med blod (positiv kontroll).
Som en första bekräftelse visualiserades proverna under ett optiskt mikroskop för att förstå förmågan hos HFFC-ytbeläggningen, Ct sammankopplade och Ct-nätverket att bilda porer.Tunna sektioner av Ch och Cp från NFRCS trimmades med ett skalpellblad.Den resulterande sektionen placerades på en glasskiva, täckt med ett täckglas, och kanterna fixerades med lim.De preparerade objektglasen betraktades under ett optiskt mikroskop och fotografier togs med olika förstoringar.
Polymeravsättning i Ct-nätverk visualiserades med användning av fluorescensmikroskopi baserat på metoden som beskrivs av Rice et al.29. HFFC-kompositionen som användes för formuleringen blandades med ett fluorescerande färgämne (amarant), och NFRCS (Ch & Cp) framställdes enligt metoden som nämnts tidigare. HFFC-kompositionen som användes för formuleringen blandades med ett fluorescerande färgämne (amarant), och NFRCS (Ch & Cp) framställdes enligt metoden som nämnts tidigare.HFFC-kompositionen som användes för formuleringen blandades med ett fluorescerande färgämne (amarant) och NFRCS (Ch och Cp) erhölls enligt den tidigare nämnda metoden.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到缄方提到的方戇 &CFR将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到缄方提到的方戇 &CFRHFFC-kompositionen som användes i formuleringen blandades med ett fluorescerande färgämne (Amaranth) och mottog NFRCS (Ch och Cp), som nämnts tidigare.Tunna sektioner av NFRK skars från de erhållna proverna, placerades på objektglas och täcktes med täckglas.Observera de förberedda objektglasen under ett fluorescerande mikroskop med ett grönt filter (310-380 nm).Bilder togs med 4x förstoring för att förstå Ct-förhållanden och överskott av polymeravsättning i Ct-nätverket.
Yttopografin för NFRCS Ch och Cp bestämdes med hjälp av ett atomkraftsmikroskop (AFM) med en ultraskarp TESP-konsol i tappläge: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.Ytjämnheten bestämdes genom root mean square (RMS) med användning av programvara (Scanning Probe Image Processor).Olika NFRCS-platser återgavs på 3D-bilder för att kontrollera ytans enhetlighet.Standardavvikelsen för poängen för ett givet område definieras som ytjämnheten.RMS-ekvationen användes för att kvantifiera ytjämnheten hos NFRCS31.
FESEM-baserade studier utfördes med FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, för att förstå ytmorfologin för Ch NFRCS och Cp NFRCS, som visade bättre BCT än Cm NFRCS.FESEM-studien utfördes enligt den metod som beskrivs av Zhao et al.32 med smärre modifieringar.NFRCS 20 till 30 mg Ch NFRCS och Cp NFRCS förblandades med 20 ul 3,8 % natriumcitrat förblandat med råttblod.20 μl 0,2 M CaCl2 sattes till de blodbehandlade proverna för att initiera koagulering och proverna inkuberades vid rumstemperatur i 10 minuter.Dessutom avlägsnades överskott av erytrocyter från NFRCS-ytan genom sköljning med saltlösning.
Efterföljande prover behandlades med 0,1% glutaraldehyd och torkades sedan i en varmluftsugn vid 37°C för att avlägsna fukt.De torkade proverna belades och analyserades 32 .Andra bilder som erhölls under analysen var koagelbildning på ytan av enskilda bomullsfibrer, polymeravsättning mellan Ct, erytrocytmorfologi (form), koagelintegritet och erytrocytmorfologi i närvaro av NFRCS.Obehandlade NFRCS-områden och Ch- och Cp-behandlade NFRCS-områden inkuberade med blod skannades för elementära joner (natrium, kalium, kväve, kalcium, magnesium, zink, koppar och selen)33.Jämför andelen elementära joner mellan behandlade och obehandlade prover för att förstå ackumulering av elementära joner under koagelbildning och koagelhomogenitet.
Tjockleken på Cp HFFC-ytbeläggningen på Ct-ytan bestämdes med användning av FESEM.Tvärsnitten av Cp NFRCS skars från ramverket och sputterbelagdes.De resulterande sputterbeläggningsproverna observerades av FESEM och tjockleken på ytbeläggningen mättes 34, 35, 36.
Röntgenmikro-CT ger högupplöst 3D icke-förstörande bildbehandling och låter dig studera det interna strukturella arrangemanget av NFRK.Micro-CT använder en röntgenstråle som passerar genom provet för att registrera den lokala linjära dämpningskoefficienten för röntgenstrålningen i provet, vilket hjälper till att få morfologisk information.Den inre platsen för Ct i Cp NFRCS och blodbehandlad Cp NFRCS undersöktes med mikro-CT för att förstå absorptionseffektivitet och blodkoagulering i närvaro av NFRCS37,38,39.3D-strukturerna av blodbehandlade och obehandlade Cp NFRCS-prover rekonstruerades med hjälp av mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Tyskland).Med VG STUDIO-MAX version 2.2 togs flera röntgenbilder från olika vinklar (helst 360° täckning) för att utveckla 3D-bilder för NFRCS.Den insamlade projektionsdatan rekonstruerades till 3D-volymetriska bilder med hjälp av motsvarande enkla 3D ScanIP Academic-programvara.
För att förstå fördelningen av koaglet tillsattes dessutom 20 µl förblandat citratblod och 20 µl 0,2 M CaCl2 till NFRCS för att initiera blodkoagulering.De förberedda proverna lämnas att härda.NFRK-ytan behandlades med 0,5 % glutaraldehyd och torkades i en varmluftsugn vid 30–40°C i 30 minuter.Blodproppen som bildades på NFRCS skannades, rekonstruerades och en 3D-bild av blodproppen visualiserades.
Antibakteriella analyser utfördes på Cp NFRCS (bäst jämfört med Ch NFRCS) med användning av den tidigare beskrivna metoden med mindre modifieringar.Den antibakteriella aktiviteten av Cp NFRCS och Cp HFFC bestämdes med användning av tre olika testmikroorganismer [S.aureus (grampositiva bakterier), E.coli (gramnegativa bakterier) och vit Candida (C.albicans)] som växte på agar i petriskålar i en inkubator.Inokulera enhetligt 50 ml av den utspädda bakteriekultursuspensionen i en koncentration av 105-106 CFU ml-1 på agarmediet.Häll mediet i en petriskål och låt stelna.Brunnar gjordes på ytan av agarplattan för att fyllas med HFFC (3 brunnar för HFFC och 1 för negativ kontroll).Tillsätt 200 µl HFFC till 3 brunnar och 200 µl pH 7,4 PBS till den 4:e brunnen.På andra sidan av petriskålen, placera en 12 mm Cp NFRCS-skiva på den stelnade agaren och fukta med PBS (pH 7,4).Ciprofloxacin, ampicillin och flukonazol tabletter anses vara referensstandarder för Staphylococcus aureus, Escherichia coli och Candida albicans.Mät hämningszonen manuellt och ta en digital bild av hämningszonen.
Efter institutionellt etiskt godkännande genomfördes studien vid Kasturba Medical College of Education and Research i Manipal, Karnataka, i södra Indien.Det experimentella TEG-protokollet in vitro har granskats och godkänts av den institutionella etiska kommittén vid Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Försökspersoner rekryterades från frivilliga blodgivare (i åldern 18 till 55) från sjukhusets blodbank.Dessutom inhämtades ett informerat samtycke från de frivilliga för insamling av blodprov.Native TEG (N-TEG) ​​användes för att studera effekten av Cp HFFC-formuleringen på helblod förblandat med natriumcitrat.N-TEG är allmänt erkänt för sin roll inom återupplivning på vårdplatsen, vilket skapar problem för läkare på grund av risken för kliniskt signifikanta förseningar av resultat (rutinmässiga koagulationstester).N-TEG-analys utfördes med hjälp av helblod.Informerat samtycke och detaljerad medicinsk historia erhölls från alla deltagare.Studien inkluderade inte deltagare med hemostatiska eller trombotiska komplikationer såsom graviditet/postpartum eller leversjukdom.Försökspersoner som tog läkemedel som påverkar koagulationskaskaden uteslöts också från studien.Grundläggande laboratorietester (hemoglobin, protrombintid, aktiverat tromboplastin och trombocytantal) utfördes på alla deltagare enligt standardprocedurer.N-TEG bestämmer blodproppsviskoelasticitet, initial koagelstruktur, partikelinteraktion, koagelförstärkning och koagellys.N-TEG-analysen ger grafiska och numeriska data om de kollektiva effekterna av flera cellulära element och plasma.N-TEG-analys utfördes på två olika volymer av Cp HFFC (10 µl och 50 µl).Som ett resultat tillsattes 1 ml helblod med citronsyra till 10 μl Cp HFFC.Tillsätt 1 ml (Cp HFFC + citratblod), 340 µl blandat blod till 20 µl 0,2 M CaCl2-innehållande TEG-skål.Därefter laddades TEG-skålar i TEG® 5000, US för att mäta R, K, alfavinkel, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30 % av blodproverna i närvaro av Cp HFFC41.
In vivo-studieprotokollet granskades och godkändes av Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Alla djurförsök utfördes i enlighet med rekommendationerna från kommittén för kontroll och övervakning av djurförsök (CPCSEA).Alla NFRCS-studier in vivo (2 × 2 cm2) utfördes på Wistar-honråttor (som vägde 200 till 250 g).Alla djur acklimatiserades vid en temperatur av 24-26°C, djuren hade fri tillgång till standardfoder och vatten ad libitum.Alla djur delades slumpmässigt in i olika grupper, varje grupp bestod av tre djur.Alla studier utfördes i enlighet med djurstudier: rapport från in vivo-experiment 43 .Före studien bedövades djuren genom intraperitoneal (ip) administrering av en blandning av 20-50 mg ketamin (per 1 kg kroppsvikt) och 2-10 mg xylazin (per 1 kg kroppsvikt).Efter studien beräknades blödningsvolymen genom att utvärdera skillnaden mellan provernas initiala och slutliga vikt, medelvärdet erhållet från de tre testerna togs som blödningsvolymen för provet.
Amputationsmodellen för råttsvans implementerades för att förstå potentialen hos NFRCS för att modulera blödning vid trauma, strid eller trafikolycka (skademodell).Skär av 50 % av svansen med ett skalpellblad och lägg i luften i 15 s för att säkerställa normal blödning.Dessutom placerades testprover på svansen av en råtta genom att applicera tryck (Ct, Cs, Ch NFRCS och Cp NFRCS).Blödning och PCT rapporterades för testprover (n = 3) 17,45.
Effektiviteten av NFRCS tryckkontroll i strid undersöktes på en modell av den ytliga lårbensartären.Lårbensartären exponeras, punkteras med en 24G trokar och blöder inom 15 sekunder.Efter att okontrollerad blödning har observerats placeras testprovet på punkteringsstället med tryck applicerat.Omedelbart efter applicering av testprovet registrerades koaguleringstiden och hemostatisk effektivitet observerades under de följande 5 minuterna.Samma procedur upprepades med Cs och Ct46.
Dowling et al.47 föreslog en leverskademodell för att bedöma den hemostatiska potentialen hos hemostatiska material i samband med intraoperativ blödning.BCT registrerades för Ct-prover (negativ kontroll), Cs-ramverk (positiv kontroll), Ch NFRCS-prover och Cp NFRCS-prover.Den suprahepatiska vena cava hos råttan exponerades genom att utföra en median laparotomi.Därefter skars den distala delen av vänster lob ut med sax.Gör ett snitt i levern med ett skalpellblad och låt det blöda i några sekunder.Noggrant vägda Ch NFRCS och Cp NFRCS testprover placerades på den skadade ytan utan något positivt tryck och BCT registrerades.Kontrollgruppen (Ct) applicerade sedan tryck följt av Cs 30 s47 utan att skada skadan.
In vivo sårläkningsanalyser utfördes med användning av en excisionssårmodell för att utvärdera sårläkningsegenskaperna hos de utvecklade polymerbaserade NFRCS:erna.Modeller av excisionssår valdes ut och utfördes enligt tidigare publicerade metoder med mindre modifieringar19,32,48.Alla djur bedövades som tidigare beskrivits.Använd en biopsistans (12 mm) för att göra ett cirkulärt djupt snitt i huden på ryggen.Förberedda sårställen kläddes med Cs (positiv kontroll), Ct (som insåg att bomullsdynor stör läkning), Ch NFRCS och Cp NFRCS (experimentell grupp) och en negativ kontroll utan någon behandling.På varje dag av studien mättes sårområdet hos alla råttor.Använd en digitalkamera för att ta en bild av sårområdet och sätt på ett nytt förband.Procentandelen av sårtillslutning mättes med följande formel:
Baserat på procentandelen sårtillslutning den 12:e dagen av studien, skars råtthuden i den bästa gruppen ut ((Cp NFRCS) och kontrollgruppen) och studerades med H&E-färgning och Massons trikromfärgning. Baserat på procentandelen sårtillslutning den 12:e dagen av studien, skars råtthuden i den bästa gruppen ut ((Cp NFRCS) och kontrollgruppen) och studerades med H&E-färgning och Massons trikromfärgning.Baserat på procentandelen sårtillslutning den 12:e dagen av studien skars huden på råttorna i den bästa gruppen ((Cp NFRCS) och kontrollgruppen) ut och undersöktes genom färgning med hematoxylin-eosin och Massons trikrom.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大雤嚌的大雤硌Madsson三色染色研究.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大雤行暄大雤皌大雠皌眳组)Råttor i den bästa gruppen ((Cp NFRCS) och kontrollgrupperna) skars ut för hematoxylin-eosinfärgning och Massons trikromfärgning baserat på procentuell sårtillslutning på dag 12 av studien.Den implementerade färgningsproceduren utfördes enligt tidigare beskrivna metoder49,50.Kortfattat, efter fixering i 10 % formalin, dehydratiserades proverna med användning av en serie graderade alkoholer.Använd en mikrotom för att få tunna sektioner (5 µm tjocka) av den utskurna vävnaden.Tunna seriella sektioner av kontroller och Cp NFRCS behandlades med hematoxylin och eosin för att studera histopatologiska förändringar.Massons trikromfärgning användes för att detektera bildandet av kollagenfibriller.De erhållna resultaten studerades blint av patologer.
Stabiliteten av Cp NFRCS-prover studerades vid rumstemperatur (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) under 12 månader51.Cp NFRCS (ytmissfärgning och mikrobiell tillväxt) inspekterades visuellt och testades med avseende på slitstyrka mot veck och BCT enligt ovanstående metoder som beskrivs i avsnittet Material och metoder.
Skalbarheten och reproducerbarheten av Cp NFRCS undersöktes genom att bereda Cp NFRCS med en storlek på 15×15 cm2.Dessutom skars 30 mg prover (n = 5) ut från olika Cp NFRCS-fraktioner och BCT för de studerade proverna utvärderades som beskrivits tidigare i avsnittet Metoder.
Vi har försökt utveckla olika former och strukturer med användning av Cp NFRCS-kompositioner för olika biomedicinska tillämpningar.Sådana former eller konfigurationer inkluderar koniska pinnar för näsblod, tandingrepp och cylindriska pinnar för vaginal blödning.
Alla datamängder uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse och analyserades med ANOVA med Prism 5,03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) följt av Bonferronis multipla jämförelsetest (*p<0,05).
Alla förfaranden som utfördes i humanstudier överensstämde med institutets och Statens forskningsråds standarder samt Helsingforsdeklarationen 1964 och dess efterföljande ändringar eller liknande etiska normer.Alla deltagare informerades om egenskaperna hos studien och dess frivilliga karaktär.Deltagardata förblir konfidentiella när de samlats in.Det experimentella TEG-protokollet in vitro har granskats och godkänts av den institutionella etiska kommittén vid Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Frivilliga undertecknade informerat samtycke för att samla in blodprover.
Alla procedurer som utförts i djurstudier utfördes i enlighet med Kastuba Faculty of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Alla djurförsök utformade utfördes i enlighet med riktlinjerna från kommittén för kontroll och övervakning av djurförsök (CPCSEA).Alla författare följer ARRIVE-riktlinjerna.
FTIR-spektra för alla NFRCS analyserades och jämfördes med kitosanspektrumet som visas i figur 2A.Karakteristiska spektrala toppar av kitosan (inspelade) vid 3437 cm-1 (OH- och NH-sträckning, överlappning), 2945 och 2897 cm-1 (CH-sträckning), 1660 cm-1 (NH2-stam), 1589 cm-1 (N-H-böjning ), 1157 cm-1 C (2000-100 cm-1 C), 1157 cm-1 C (sekundär 0,7 cm-1 C). hydroxyl), 993 cm-1 (sträckt CO, Bo-OH) 52.53.54.Kompletterande tabell S1 visar FTIR NFRCS-absorptionsspektrumvärdena för kitosan (reporter), ren kitosan, Cm, Ch och Cp.FTIR-spektra för alla NFRCS (Cm, Ch och Cp) visade samma karakteristiska absorptionsband som rent kitosan utan några signifikanta förändringar (Fig. 2A).FTIR-resultaten bekräftade frånvaron av kemiska eller fysikaliska interaktioner mellan polymererna som användes för att utveckla NFRCS, vilket indikerar att de använda polymererna är inerta.
In vitro karakterisering av Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS och Cs.(A) representerar de kombinerade FTIR-spektra av kompositionerna av kitosan och Cm NFRCS, Ch NFRCS och Cp NFRCS under kompression.(B) a) Helblodsupptagningshastighet av NFRCS Cm, Ch, Cp och Cg (n = 3);Ct-proverna visade en högre BAR eftersom bomullspinnen har en högre absorptionseffektivitet;b) Blod efter blodabsorption Illustration av det absorberade provet.Grafisk representation av BCT för testprov C (Cp NFRCS hade den bästa BCT (15 s, n = 3)). Data i C, D, E och G visades som medelvärde ± SD, och felstaplarna representerar SD, ***p < 0,0001. Data i C, D, E och G visades som medelvärde ± SD, och felstaplarna representerar SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E och G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляю *** 0,0001. Data i C, D, E och G presenteras som medelvärde ± standardavvikelse, och felstaplar representerar standardavvikelse, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E och G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей предартавля*** p <0,0001. Data i C, D, E och G visas som medelvärde ± standardavvikelse, felstaplar representerar standardavvikelse, ***p<0,0001.