Tack för att du besöker Nature.com.Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Fåglarnas fertilitet beror på deras förmåga att lagra tillräckligt med livskraftiga spermier under en längre tid i spermalagringstubuli (SST).Den exakta mekanismen genom vilken spermier kommer in i, vistas i och lämnar SST är fortfarande kontroversiell.Spermierna från sharkasihöns visade en hög tendens till agglutination och bildade mobila filamentösa buntar innehållande många celler.På grund av svårigheten att observera rörligheten och beteendet hos spermier i en ogenomskinlig äggledare, använde vi en mikrofluidisk enhet med ett mikrokanaltvärsnitt som liknar det hos spermier för att studera spermier agglutination och motilitet.Den här studien diskuterar hur spermiebuntar bildas, hur de rör sig och deras möjliga roll för att förlänga spermieuppehållet i SST.Vi undersökte spermiehastighet och reologiskt beteende när vätskeflöde genererades inom en mikrofluidkanal genom hydrostatiskt tryck (flödeshastighet = 33 µm/s).Spermatozoerna tenderar att simma mot strömmen (positiv reologi) och hastigheten hos spermatozoerna är signifikant reducerad jämfört med enstaka spermier.Spermiebuntar har observerats röra sig i en spiral och öka i längd och tjocklek när fler enstaka spermier rekryteras. Spermiebuntar observerades närma sig och fästa vid sidoväggarna av mikrofluidkanalerna för att undvika att svepas med vätskeflödeshastighet > 33 µm/s. Spermiebuntar observerades närma sig och fästa vid sidoväggarna av mikrofluidkanalerna för att undvika att svepas med vätskeflödeshastighet > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных, микрофлюидных, микрофлюидных етания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Spermiebuntar har observerats närma sig och fästa vid sidoväggarna av mikrofluidkanalerna för att undvika att svepas bort vid vätskeflöden >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速>/33 sサs33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостног, боковым стенкам микрожидкостног метания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Spermiebuntar har observerats närma sig och fästa vid sidoväggarna av mikrofluidkanalen för att undvika att svepas bort av vätskeflöde vid >33 µm/s.Scanning och transmissionselektronmikroskopi avslöjade att spermieknippena stöddes av rikligt tätt material.De erhållna uppgifterna visar den unika rörligheten hos Sharkazi-kycklingspermier, såväl som spermiers förmåga att agglutinera och bilda mobila buntar, vilket bidrar till en bättre förståelse för den långsiktiga lagringen av spermier i SMT.
För att uppnå befruktning hos människor och de flesta djur måste spermier och ägg komma till befruktningsplatsen vid rätt tidpunkt.Därför måste parning ske före eller vid tidpunkten för ägglossningen.Å andra sidan lagrar vissa däggdjur, såsom hundar, liksom icke-däggdjursarter, såsom insekter, fiskar, reptiler och fåglar, spermier i sina reproduktionsorgan under en längre tid tills deras ägg är redo för befruktning (asynkron befruktning 1 ).Fåglar kan upprätthålla livskraften hos spermier som kan befrukta ägg i 2-10 veckor2.
Detta är en unik egenskap som skiljer fåglar från andra djur, eftersom det ger en hög sannolikhet för befruktning efter en enda insemination i flera veckor utan samtidig parning och ägglossning.Det huvudsakliga spermalagringsorganet, kallat spermlagringsröret (SST), är beläget i de inre slemhinnevecken vid uterovaginalövergången.Hittills är de mekanismer genom vilka spermier kommer in i, vistas och lämnar spermabanken inte helt förstått.Baserat på tidigare studier har många hypoteser lagts fram, men ingen av dem har bekräftats.
Forman4 antog att spermier bibehåller sin vistelse i SST-kaviteten genom kontinuerlig oscillerande rörelse mot vätskeflödets riktning genom proteinkanaler belägna på SST-epitelceller (reologi).ATP är utarmat på grund av den konstanta flagellära aktiviteten som behövs för att hålla spermierna i SST-lumen och rörligheten avtar så småningom tills spermierna förs ut ur spermiebanken genom vätskeflöde och börjar en ny resa nedför den stigande äggledaren för att befrukta spermierna.Ägg (Forman4).Denna modell av spermielagring stöds av detektering med immuncytokemi av akvaporiner 2, 3 och 9 som finns i SST-epitelceller.Hittills saknas studier om kycklingsperma-reologi och dess roll i SST-lagring, vaginalt spermaval och spermiekonkurrens.Hos kycklingar kommer spermier in i slidan efter naturlig parning, men mer än 80 % av spermierna stöts ut från slidan kort efter parning.Detta tyder på att slidan är den primära platsen för val av spermier hos fåglar.Dessutom har det rapporterats att mindre än 1 % av de spermier som befruktats i slidan hamnar i SSTs2.Vid artificiell insemination av kycklingar i slidan tenderar antalet spermier som når SST att öka 24 timmar efter insemination.Än så länge är mekanismen för spermieurval under denna process oklar, och spermiemotilitet kan spela en viktig roll i SST-spermieupptaget.På grund av äggledarnas tjocka och ogenomskinliga väggar är det svårt att direkt övervaka spermiers rörlighet i fåglarnas äggledare.Därför saknar vi grundläggande kunskap om hur spermier övergår till SST efter befruktning.
Reologi har nyligen erkänts som en viktig faktor som kontrollerar spermietransport i däggdjursgenitalia.Baserat på förmågan hos rörliga spermier att migrera motström, använde Zaferani et al8 ett corra-mikrofluidiskt system för att passivt isolera rörliga spermier från infattade spermaprover.Denna typ av spermasortering är väsentlig för medicinsk infertilitetsbehandling och klinisk forskning, och föredras framför traditionella metoder som är tids- och arbetskrävande och kan äventyra spermiemorfologi och strukturell integritet.Hittills har dock inga studier utförts på effekten av sekret från kycklingars könsorgan på spermiers rörlighet.
Oavsett mekanismen som upprätthåller spermier lagrade i SST, har många forskare observerat att inhemska spermier agglutinerar head-to-head i SST av kycklingar 9, 10, vaktlar 2 och kalkoner 11 för att bilda agglutinerade spermiebuntar.Författarna föreslår att det finns ett samband mellan denna agglutination och långtidslagring av spermier i SST.
Tingari och Lake12 rapporterade ett starkt samband mellan spermier i kycklingens spermiemottagande körtel och ifrågasatte om fågelspermatozoer agglutinerar på samma sätt som däggdjursspermier.De tror att de djupa kopplingarna mellan spermier i sädesledaren kan bero på stressen som orsakas av närvaron av ett stort antal spermier i ett litet utrymme.
När man utvärderar beteendet hos spermier på färska hängande glasskivor kan övergående tecken på agglutination ses, särskilt vid kanterna på spermdroppar.Men agglutinationen stördes ofta av den rotationsverkan som är förknippad med kontinuerlig rörelse, vilket förklarar den övergående naturen hos detta fenomen.Forskarna märkte också att när spädningsmedlet sattes till sperman, uppstod långsträckta "trådliknande" cellaggregat.
Tidiga försök att efterlikna en spermie gjordes genom att ta bort en tunn tråd från en hängande droppe, vilket resulterade i en långsträckt spermieliknande blåsa som sticker ut från droppen av sperma.Spermatozoerna radades omedelbart upp på ett parallellt sätt i vesikeln, men hela enheten försvann snabbt på grund av 3D-begränsningen.För att studera agglutination av spermier är det därför nödvändigt att observera rörligheten och beteendet hos spermier direkt i isolerade spermielagringstubuli, vilket är svårt att uppnå.Därför är det nödvändigt att utveckla ett instrument som efterliknar spermier för att stödja studier av spermiers rörlighet och agglutinationsbeteende.Brillard et al13 rapporterade att den genomsnittliga längden av spermielagringsrör hos vuxna kycklingar är 400–600 µm, men vissa SST kan vara så långa som 2000 µm.Mero och Ogasawara14 delade upp sädeskörtlarna i förstorade och icke-förstorade spermielagringstubuli, som båda var lika i längd (~500 µm) och halsbredd (~38 µm), men den genomsnittliga lumendiametern för tubuli var 56,6 och 56,6 µm..11,2 μm respektive.I den aktuella studien använde vi en mikrofluidisk enhet med en kanalstorlek på 200 µm × 20 µm (W × H), vars tvärsnitt är något nära det för den förstärkta SST.Dessutom undersökte vi spermiers motilitet och agglutinationsbeteende i strömmande vätska, vilket överensstämmer med Foremans hypotes att vätska som produceras av SST-epitelceller håller spermier i lumen i en motströms (reologisk) riktning.
Syftet med denna studie var att övervinna problemen med att observera spermiers rörlighet i äggledaren och att undvika svårigheterna med att studera spermiers reologi och beteende i en dynamisk miljö.En mikrofluidisk enhet användes som skapar hydrostatiskt tryck för att simulera spermiers rörlighet i kycklingens könsorgan.
När en droppe av ett utspätt spermieprov (1:40) laddades in i mikrokanalanordningen kunde två typer av spermiemotilitet identifieras (isolerade spermier och bundna spermier).Dessutom tenderade spermier att simma mot strömmen (positiv reologi; video 1, 2). Även om spermiebuntar hade lägre hastighet än ensamma spermier (p < 0,001), ökade de andelen spermier som visade positiv reotaxi (p < 0,001; Tabell 2). Även om spermiebuntar hade lägre hastighet än ensamma spermier (p < 0,001), ökade de andelen spermier som visade positiv reotaxi (p < 0,001; Tabell 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), алипич озоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Även om spermatozoerna hade en lägre hastighet än enstaka spermier (p < 0,001), ökade de andelen spermier som visade positiv reotaxi (p < 0,001; Tabell 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显羵遰显羵阳分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 澧 倧 倲 礧 逳 礧 示分比 （p <0,001； 2。。。。。。）)）)) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увелитичов положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Även om hastigheten för spermier var lägre än för enstaka spermier (p < 0,001), ökade de andelen spermier med positiv reologi (p < 0,001; Tabell 2).Positiv reologi för enstaka spermier och tofsar uppskattas till cirka 53 % respektive 85 %.
Det har observerats att spermatozoerna från sharkasi-kycklingar omedelbart efter utlösning bildar linjära buntar, bestående av dussintals individer.Dessa tofsar ökar i längd och tjocklek med tiden och kan förbli in vitro i flera timmar innan de försvinner (video 3).Dessa filamentösa buntar är formade som echidna spermatozoer som bildas i slutet av bitestikeln.Sharkashi-hönssperma har visat sig ha en hög tendens att agglutinera och bilda ett nätformigt knippe på mindre än en minut efter insamling.Dessa strålar är dynamiska och kan fästa vid alla närliggande väggar eller statiska föremål.Även om spermiebuntar minskar hastigheten hos spermier, är det tydligt att de makroskopiskt ökar sin linjäritet.Längden på buntarna varierar beroende på antalet spermier som samlas i buntar.Två delar av bunten isolerades: den initiala delen, inklusive det fria huvudet av den agglutinerade spermien, och den terminala delen, inklusive svansen och hela den distala änden av spermien.Med hjälp av en höghastighetskamera (950 fps) observerades fria huvuden av agglutinerade spermier i den initiala delen av bunten, ansvariga för buntens rörelse på grund av deras oscillerande rörelse, som drar de återstående in i bunten med en spiralformad rörelse (video 4).I långa tofsar har det emellertid observerats att några fria spermiehuvuden fäster vid kroppen och den terminala delen av tofsen fungerar som skovlar för att hjälpa till att driva tofsen.
Medan i ett långsamt vätskeflöde rör sig spermieknippena parallellt med varandra, men de börjar överlappa varandra och fastnar på allt som är stilla, för att inte sköljas bort av strömflödet när flödeshastigheten ökar.Kniparna bildas när en handfull spermier närmar sig varandra, de börjar röra sig synkront och lindar sig runt varandra och håller sig sedan till en klibbig substans.Figurerna 1 och 2 visar hur spermierna närmar sig varandra och bildar en knutpunkt när svansarna sveper sig runt varandra.
Forskarna tillämpade hydrostatiskt tryck för att skapa vätskeflöde i en mikrokanal för att studera spermier reologi.En mikrokanal med en storlek av 200 µm × 20 µm (B × H) och en längd av 3,6 µm användes.Använd mikrokanaler mellan behållare med sprutor monterade i ändarna.Matfärgning användes för att göra kanalerna mer synliga.
Knyt samman kablar och tillbehör på väggen.Videon togs med ett faskontrastmikroskop.Med varje bild presenteras faskontrastmikroskopi och kartläggningsbilder.(A) Kopplingen mellan två strömmar motstår flödet på grund av spiralformad rörelse (röd pil).(B) Anslutningen mellan rörbunten och kanalväggen (röda pilar), samtidigt kopplas de till två andra buntar (gula pilar).(C) Spermiebuntar i mikrofluidkanalen börjar ansluta med varandra (röda pilar) och bildar ett nät av spermiebuntar.(D) Bildande av ett nätverk av spermiebuntar.
När en droppe utspädd sperma laddades in i mikrofluidanordningen och ett flöde skapades, observerades spermiestrålen röra sig mot flödesriktningen.Buntarna passar tätt mot mikrokanalernas väggar, och de fria huvudena i den första delen av buntarna passar tätt mot dem (video 5).De håller också fast vid alla stationära partiklar i deras väg, såsom skräp, för att motstå att svepas bort av strömmen.Med tiden blir dessa tofsar långa filament som fångar andra enstaka spermier och kortare tofsar (video 6).När flödet börjar sakta ner börjar långa rader av spermier bilda ett nätverk av spermielinjer (video 7; figur 2).
Vid hög flödeshastighet (V > 33 µm/s) ökar trådarnas spiralrörelser som ett försök att fånga upp många individuella spermiebildande knippen bättre motstå flödets drivkraft. Vid hög flödeshastighet (V > 33 µm/s) ökar trådarnas spiralrörelser som ett försök att fånga upp många individuella spermiebildande knippen bättre motstå flödets drivkraft. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку оспони пость отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Vid höga flödeshastigheter (V > 33 µm/s) ökar de spiralformade rörelserna av strängarna när de försöker fånga många individuella spermatozoer som bildar knippen som bättre kan motstå flödets drivkraft.在高流速(V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形丐束的在高流速好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形仲 坟 形仲 坟 形成 ​​坟更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке зохтель сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Vid höga flödeshastigheter (V > 33 µm/s) ökar filamentens spiralformade rörelse i ett försök att fånga många individuella spermatozobildande buntar för att bättre motstå flödets drivkrafter.De försökte också fästa mikrokanaler på sidoväggarna.
Spermiebuntar identifierades som kluster av spermiehuvuden och krullande svansar med hjälp av ljusmikroskopi (LM).Spermiebuntar med olika aggregat har också identifierats som vridna huvuden och flagellära aggregat, flera sammansmälta spermiesvansar, spermiehuvuden fästa vid en svans och spermiehuvuden med böjda kärnor som flera sammansmälta kärnor.transmissionselektronmikroskopi (TEM).Svepelektronmikroskopi (SEM) visade att spermiebuntarna var mantlade aggregat av spermiehuvuden och spermieaggregaten visade ett fäst nätverk av omlindade svansar.
Spermatozoernas morfologi och ultrastruktur, bildandet av spermatozobuntar studerades med hjälp av ljusmikroskopi (halvsektion), svepelektronmikroskopi (SEM) och transmissionselektronmikroskopi (TEM), spermieutstryk färgades med akridin orange och undersöktes med epifluorescensmikroskopi.
Spermiestrykfärgning med akridin-orange (Fig. 3B) visade att spermiehuvudena var sammanklistrade och täckta med sekretoriskt material, vilket ledde till bildandet av stora tofsar (Fig. 3D).Spermiebuntarna bestod av spermieaggregat med ett nätverk av fästade svansar (Fig. 4A-C).Spermiebuntar är sammansatta av svansarna av många spermier som sitter ihop (Fig. 4D).Hemligheter (fig. 4E,F) täckte huvudena av spermatozobuntar.
Bildning av spermatozobunten Med hjälp av faskontrastmikroskopi och spermieutstryk färgade med akridin orange, visade det sig att spermatozoernas huvuden klibbar ihop.(A) Tidig spermatofsbildning börjar med en spermie (vit cirkel) och tre spermier (gul cirkel), med spiralen som börjar vid svansen och slutar vid huvudet.(B) Mikrofotografi av ett spermieutstryk färgat med akridin orange som visar vidhäftande spermiehuvuden (pilar).Utsläppet täcker huvudet/huvudena.Förstoring × 1000. (C) Utveckling av en stor stråle som transporteras med flöde i en mikrofluidisk kanal (med hjälp av en höghastighetskamera vid 950 fps).(D) Mikrofotografi av ett spermieutstryk färgat med akridin orange som visar stora tofsar (pilar).Förstoring: ×200.
Svepelektronmikrofotografi av en spermiestråle och ett spermieutstryk färgat med akridin orange.(A, B, D, E) är digitala färgavsökningselektronmikrofotografier av spermier, och C och F är mikrofotografier av akridinorangefärgade spermier som visar fastsättning av flera spermatozoer som lindar svansväven.(AC) Spermieaggregat visas som ett nätverk av fästade svansar (pilar).(D) Vidhäftning av flera spermier (med vidhäftande substans, rosa kontur, pil) som lindas runt svansen.(E och F) Spermiehuvudaggregat (pekare) täckta med självhäftande material (pekare).Spermatozoerna bildade knippen med flera virvelliknande strukturer (F).(C) ×400 och (F) ×200 förstoringar.
Med hjälp av transmissionselektronmikroskopi fann vi att spermiebuntar hade fästa svansar (Fig. 6A, C), huvuden fästa vid svansar (Fig. 6B) eller huvuden fästa vid svansar (Fig. 6D).Spermatozoernas huvuden i bunten är krökta och presenterar i sektion två kärnområden (Fig. 6D).I snittknippet hade spermierna ett vridet huvud med två kärnområden och flera flagellområden (Fig. 5A).
Digitalt färgelektronmikrofotografi som visar de anslutande svansarna i spermieknippet och det agglutinerande materialet som förbinder spermiehuvudena.(A) Fäst svans av ett stort antal spermier.Lägg märke till hur svansen ser ut i både stående (pil) och liggande (pil) projektioner.(B) Spermans huvud (pil) är kopplat till svansen (pil).(C) Flera spermiesvansar (pilar) är fästa.(D) Agglutinationsmaterial (AS, blå) förbinder fyra spermiehuvuden (lila).
Svepelektronmikroskopi användes för att detektera spermiehuvuden i spermiebuntar täckta med sekret eller membran (Figur 6B), vilket indikerar att spermieknippena var förankrade av extracellulärt material.Det agglutinerade materialet koncentrerades i spermiehuvudet (manethuvudliknande aggregat; Fig. 5B) och expanderade distalt, vilket gav ett lysande gult utseende under fluorescensmikroskopi när det färgades med akridinorange (Fig. 6C).Detta ämne är tydligt synligt under ett scanningsmikroskop och anses vara ett bindemedel.Halvtunna sektioner (Fig. 5C) och spermieutstryk färgade med akridin orange visade spermiebuntar innehållande tätt packade huvuden och krullade svansar (Fig. 5D).
Olika mikrofotografier som visar aggregering av spermiehuvuden och vikta svansar med olika metoder.(A) Tvärsnitts digital färgöverföringselektronmikrofotografi av ett spermieknippe som visar ett lindat spermiehuvud med en tvådelad kärna (blå) och flera flagellära delar (grön).(B) Digital färgskanningelektronmikrofotografi som visar ett kluster av manetliknande spermiehuvuden (pilar) som verkar vara täckta.(C) Halvtunn sektion som visar aggregerade spermiehuvuden (pilar) och krökta svansar (pilar).(D) Mikrofotografi av ett spermieutstryk färgat med akridin orange som visar aggregat av spermiehuvuden (pilar) och krullade vidhäftande svansar (pilar).Observera att ett klibbigt ämne (S) täcker huvudet på spermierna.(D) × 1000 förstoring.
Med användning av transmissionselektronmikroskopi (Fig. 7A) noterades det också att spermiehuvudena var vridna och kärnorna hade en spiralform, vilket bekräftades av spermieutstryk färgade med akridinorange och undersöktes med fluorescensmikroskopi (Fig. 7B).
(A) Digital färgöverföringselektronmikrofotografi och (B) Akridin-orangefärgad spermieutstryk som visar spiralformade huvuden och fastsättning av spermiehuvuden och svansar (pilar).(B) × 1000 förstoring.
Ett intressant fynd är att Sharkazis spermier aggregerar för att bilda mobila filamentösa buntar.Egenskaperna hos dessa buntar tillåter oss att förstå deras möjliga roll vid absorption och lagring av spermier i SST.
Efter parning kommer spermierna in i slidan och genomgår en intensiv urvalsprocess, vilket resulterar i att endast ett begränsat antal spermier kommer in i SST15,16.Hittills är mekanismerna genom vilka spermier kommer in och ut ur SST oklara.Hos fjäderfä lagras spermier i SST under en längre period på 2 till 10 veckor, beroende på art6.Kontroverser kvarstår om spermans tillstånd under lagring i SST.Är de i rörelse eller vila?Med andra ord, hur bibehåller spermier sin position i SST så länge?
Forman4 föreslog att SST-residens och utstötning kunde förklaras i termer av spermiemotilitet.Författarna antar att spermier bibehåller sin position genom att simma mot vätskeflödet som skapas av SST-epitelet och att spermier stöts ut från SST när deras hastighet faller under den punkt där de börjar röra sig bakåt på grund av brist på energi.Zaniboni5 bekräftade närvaron av aquaporiner 2, 3 och 9 i den apikala delen av SST-epitelceller, vilket indirekt kan stödja Foremans spermielagringsmodell.I den aktuella studien fann vi att nästan hälften av Sharkashis spermier visar positiv reologi i den strömmande vätskan, och att agglutinerade spermier ökar antalet spermier som visar positiv reologi, även om agglutination saktar ner dem.Hur spermier färdas upp genom fågelns äggledare till platsen för befruktning är inte helt förstått.Hos däggdjur drar follikelvätskan till sig spermatozoer.Emellertid tros kemoattraktanter styra spermier att närma sig långa avstånd7.Därför är andra mekanismer ansvariga för spermietransport.Förmågan hos spermier att orientera sig och strömma mot äggledarvätskan som frigörs efter parning har rapporterats vara en viktig faktor för att rikta in sig på spermier hos möss.Parker 17 föreslog att spermier korsar äggledarna genom att simma mot ciliärströmmen hos fåglar och reptiler.Även om det inte har påvisats experimentellt på fåglar, var Adolphi18 den första som upptäckte att fågelspermier ger positiva resultat när ett tunt lager av vätska mellan ett täckglas och objektglas skapas med en remsa av filterpapper.Reologi.Hino och Yanagimachi [19] placerade ett musäggstock-tubal-livmoderkomplex i en perfusionsring och injicerade 1 µl bläck i näset för att visualisera vätskeflödet i äggledarna.De märkte en mycket aktiv rörelse av sammandragning och avslappning i äggledaren, där alla bläckkulor stadigt rörde sig mot äggledarens ampulla.Författarna betonar vikten av äggledarvätskeflöde från de nedre till de övre äggledarna för spermielyft och befruktning.Brillard20 rapporterade att hos kycklingar och kalkoner migrerar spermier genom aktiv rörelse från slidingången, där de förvaras, till utero-vaginalövergången, där de förvaras.Denna rörelse krävs dock inte mellan den uterovaginala korsningen och infundibulum eftersom spermatozoerna transporteras genom passiv förskjutning.Med kännedom om dessa tidigare rekommendationer och de resultat som erhållits i den aktuella studien kan man anta att förmågan hos spermier att röra sig uppströms (reologi) är en av de egenskaper som selektionsprocessen bygger på.Detta bestämmer passagen av spermier genom slidan och deras inträde i CCT för lagring.Som Forman4 föreslog, kan detta också underlätta processen med att spermier kommer in i SST och dess livsmiljö under en period och sedan lämnar när deras hastighet börjar avta.
Å andra sidan föreslog Matsuzaki och Sasanami 21 att fågelspermatozoer genomgår motilitetsförändringar från dvala till motilitet i de manliga och kvinnliga fortplantningsorganen.Hämning av spermiers motilitet i SST har föreslagits för att förklara den långa lagringstiden för spermier och sedan föryngring efter att ha lämnat SST.Under hypoxiska förhållanden, Matsuzaki et al.1 rapporterade hög produktion och frisättning av laktat i SST, vilket kan leda till hämning av bosatta spermiers motilitet.I detta fall återspeglas vikten av spermier reologi i urvalet och absorptionen av spermier, och inte i deras lagring.
Spermaagglutinationsmönstret anses vara en rimlig förklaring till den långa lagringsperioden för spermier i SST, eftersom detta är ett vanligt mönster av spermieretention hos fjäderfä2,22,23.Bakst et al.2 observerade att de flesta spermier fäste vid varandra och bildade fascikulära aggregat, och enstaka spermier hittades sällan i vaktel CCM.Å andra sidan, Wen et al.24 observerade fler spridda spermier och färre spermatozoer i SST-lumen hos kycklingar.Utifrån dessa observationer kan man anta att benägenheten för spermieagglutination skiljer sig mellan fåglar och mellan spermier i samma ejakulat.Dessutom har Van Krey et al.9 föreslog att slumpmässig dissociation av agglutinerade spermier är ansvarig för den gradvisa penetrationen av spermier i äggledarens lumen.Enligt denna hypotes bör spermier med lägre agglutinationsförmåga först utvisas från SST.I detta sammanhang kan spermiers förmåga att agglutinera vara en faktor som påverkar resultatet av spermiekonkurrens hos smutsiga fåglar.Dessutom, ju längre de agglutinerade spermierna dissocierar, desto längre upprätthålls fertiliteten.
Även om aggregering och aggregering av spermier till buntar har observerats i flera studier2,22,24, har de inte beskrivits i detalj på grund av komplexiteten i deras kinematiska observation inom SST.Flera försök har gjorts för att studera spermieagglutination in vitro.Omfattande men övergående aggregation observerades när den tunna tråden avlägsnades från den dinglande frödroppen.Detta leder till det faktum att en långsträckt bubbla sticker ut från droppen och imiterar sädeskörteln.På grund av 3D-begränsningar och korta dropptorktider förföll hela blocket snabbt9.I den aktuella studien, med hjälp av Sharkashi-kycklingar och mikrofluidchips, kunde vi beskriva hur dessa tovor bildas och hur de rör sig.Spermiebuntar bildades omedelbart efter spermauppsamling och visade sig röra sig i en spiral, och visade positiv reologi när de fanns i flödet.Vidare, när makroskopiskt ses, har spermiebuntar observerats öka linjäriteten av motilitet jämfört med isolerade spermier.Detta tyder på att spermieagglutination kan inträffa före SST-penetration och att spermieproduktionen inte är begränsad till ett litet område på grund av stress som tidigare föreslagits (Tingari och Lake12).Under tofsbildning simmar spermierna synkront tills de bildar en knutpunkt, sedan sveper deras svansar runt varandra och spermiernas huvud förblir fritt, men svansen och den distala delen av spermien håller ihop med en klibbig substans.Därför är ligamentets fria huvud ansvarig för rörelsen och drar resten av ligamentet.Svepelektronmikroskopi av spermieknippena visade vidhäftade spermiehuvuden täckta med mycket klibbigt material, vilket tyder på att spermiehuvudena var fästa i vilande knippen, vilket kan ha inträffat efter att de nått lagringsplatsen (SST).
När ett spermieutstryk färgas med akridin orange kan extracellulärt vidhäftande material runt spermiecellerna ses under ett fluorescerande mikroskop.Detta ämne gör att spermieknippen kan fästa vid och klamra sig fast vid omgivande ytor eller partiklar så att de inte driver med det omgivande flödet.Således visar våra observationer rollen av spermatozoers vidhäftning i form av mobila buntar.Deras förmåga att simma mot strömmen och hålla sig till närliggande ytor gör att spermier stannar längre i SST.
Rothschild25 använde en hemocytometrikamera för att studera den flytande fördelningen av bovin sperma i en droppe suspension, och tog mikrofotografier genom en kamera med både vertikal och horisontell optisk axel i mikroskopet.Resultaten visade att spermierna attraherades till ytan av kammaren.Författarna föreslår att det kan finnas hydrodynamiska interaktioner mellan spermierna och ytan.Om man tar hänsyn till detta, tillsammans med Sharkashi-kycklingspermans förmåga att bilda klibbiga tofsar, kan det öka sannolikheten för att sperma fäster vid SST-väggen och lagras under långa tidsperioder.
Bccetti och Afzeliu26 rapporterade att spermierna glycocalyx krävs för gameterigenkänning och agglutination.Forman10 observerade att hydrolys av a-glykosidbindningar i glykoprotein-glykolipidbeläggningar genom att behandla fågelsperma med neuraminidas resulterade i minskad fertilitet utan att påverka spermiernas motilitet.Författarna föreslår att effekten av neuraminidas på glykokalyxen försämrar spermiesekvestreringen vid livmoder-vaginalövergången och därigenom minskar fertiliteten.Deras observationer kan inte ignorera möjligheten att neuraminidasbehandling kan minska igenkänningen av spermier och oocyter.Forman och Engel10 fann att fertiliteten minskade när höns inseminerades intravaginalt med sperma behandlad med neuraminidas.IVF med neuraminidas-behandlade spermier påverkade dock inte fertiliteten jämfört med kontrollkycklingar.Författarna drog slutsatsen att förändringar i glykoprotein-glykolipidbeläggningen runt spermiernas membran minskade spermiernas förmåga att befrukta genom att försämra lagringen av spermier i utero-vaginal junction, vilket i sin tur ökade spermieförlusten på grund av hastigheten i livmoder-vaginalövergången, men inte påverkar igenkänningen av spermier och ägg.
Hos kalkoner hittade Bakst och Bauchan 11 små vesiklar och membranfragment i lumen av SST och observerade att några av dessa granuler hade smält samman med spermiemembranet.Författarna föreslår att dessa relationer kan bidra till långtidslagring av spermier i SST.Forskarna specificerade dock inte källan till dessa partiklar, om de utsöndras av CCT-epitelceller, produceras och utsöndras av det manliga reproduktionssystemet eller produceras av själva spermien.Dessa partiklar är också ansvariga för agglutination.Grützner et al27 rapporterade att epididymala epitelceller producerar och utsöndrar ett specifikt protein som krävs för bildandet av enkelporiga sädesvägar.Författarna rapporterar också att spridningen av dessa buntar beror på interaktionen mellan epididymala proteiner.Nixon et al28 fann att adnexa utsöndrar ett protein, det sura cysteinrika osteonektinet;SPARC är involverad i bildandet av spermietossar i kortnäbbade echidnas och platypuses.Spridningen av dessa strålar är associerad med förlusten av detta protein.
I den aktuella studien visade ultrastrukturell analys med hjälp av elektronmikroskopi att spermatozoerna höll fast vid en stor mängd tätt material.Dessa ämnen tros vara ansvariga för agglutinationen som kondenserar mellan och runt de vidhäftande huvudena, men vid lägre koncentrationer i svansregionen.Vi antar att denna agglutinerande substans utsöndras från det manliga reproduktionssystemet (epididymis eller sädesledaren) tillsammans med sperma, eftersom vi ofta observerar sperma som separeras från lymf- och sädesplasma under ejakulation.Det har rapporterats att när fågelspermatozoer passerar genom epididymis och sädesledaren, genomgår de mognadsrelaterade förändringar som stödjer deras förmåga att binda proteiner och förvärva plasmalemmaassocierade glykoproteiner.Beständigheten av dessa proteiner på bosatta spermiemembran i SST antyder att dessa proteiner kan påverka förvärvet av spermamembranstabilitet 30 och bestämma deras fertilitet 31 .Ahammad et al32 rapporterade att spermier erhållna från olika delar av det manliga reproduktionssystemet (från testiklarna till distala sädesledaren) visade en progressiv ökning av livsduglighet under vätskelagringsförhållanden, oavsett lagringstemperatur, och livsduglighet hos kycklingar ökar också i äggledarna efter artificiell insemination.
Sharkashi kycklingspermier har andra egenskaper och funktioner än andra arter som echidnas, platypuses, skogsmöss, rådjursråttor och marsvin.Hos sharkasi-kycklingar minskade bildandet av spermatozobuntar deras simhastighet jämfört med enstaka spermier.Dessa buntar ökade dock andelen reologiskt positiva spermier och ökade spermiers förmåga att stabilisera sig i en dynamisk miljö.Således bekräftar våra resultat det tidigare förslaget att spermieagglutination i SST är associerad med långvarig spermielagring.Vi antar också att benägenheten hos spermier att bilda tofsar kan styra graden av spermieförlust i SST, vilket kan förändra resultatet av spermiekonkurrens.Enligt detta antagande släpper spermier med låg agglutinationskapacitet SST först, medan spermier med hög agglutinationskapacitet producerar det mesta av avkomman.Bildandet av enporiga spermier är fördelaktigt och påverkar förhållandet mellan föräldrar och barn, men använder en annan mekanism.Hos echidnas och platypuses är spermatozoerna anordnade parallellt med varandra för att öka strålens framåthastighet.Buntar av echidnas rör sig ungefär tre gånger snabbare än enstaka spermier.Man tror att bildandet av sådana spermietossar i echidnas är en evolutionär anpassning för att bibehålla dominans, eftersom honor är promiskuösa och vanligtvis parar sig med flera hanar.Därför tävlar spermier från olika ejakulat hårt om befruktningen av ägget.
Agglutinerade spermier från sharkasi-kycklingar är lätta att visualisera med hjälp av faskontrastmikroskopi, vilket anses vara fördelaktigt eftersom det gör det enkelt att studera beteendet hos spermier in vitro.Mekanismen genom vilken spermatofsbildning främjar reproduktionen hos sharkasi-kycklingar skiljer sig också från den som ses hos vissa placenta däggdjur som representerar samarbetande spermiebeteende som skogsmöss, där vissa spermier når äggen, vilket hjälper andra relaterade individer att nå och skada sina ägg.att bevisa dig själv.altruistiskt beteende.Självbefruktning 34. Ett annat exempel på samarbetsbeteende hos spermier hittades hos rådjursmöss, där spermier kunde identifiera och kombinera med de mest genetiskt besläktade spermier och bilda samarbetsgrupper för att öka sin hastighet jämfört med orelaterade spermier35.
Resultaten som erhållits i denna studie motsäger inte Fomans teori om långtidslagring av spermier i SWS.Forskarna rapporterar att spermieceller fortsätter att röra sig i flödet av epitelceller som kantar SST under en längre tid, och efter en viss tidsperiod är spermiecellernas energidepåer uttömda, vilket resulterar i en minskning av hastigheten, vilket möjliggör utstötning av ämnen med liten molekylvikt.energi av spermier med flödet av vätska från lumen av SST Kaviteten i äggledaren.I den aktuella studien observerade vi att hälften av de enskilda spermierna visade förmågan att simma mot strömmande vätskor, och deras vidhäftning i bunten ökade deras förmåga att visa positiv reologi.Dessutom överensstämmer våra uppgifter med de från Matsuzaki et al.1 som rapporterade att ökad laktatsekretion i SST kan hämma bosatta spermiers motilitet.Våra resultat beskriver dock bildandet av spermier motila ligament och deras reologiska beteende i närvaro av en dynamisk miljö inom en mikrokanal i ett försök att belysa deras beteende i SST.Framtida forskning kan fokusera på att bestämma agglutineringsmedlets kemiska sammansättning och ursprung, vilket utan tvekan kommer att hjälpa forskare att utveckla nya sätt att lagra flytande sperma och öka fertilitetens varaktighet.
Femton 30 veckor gamla barnackade sharkasihanar (homozygot dominant; Na Na) valdes ut som spermiedonatorer i studien.Fåglarna föds upp på forskningsfjäderfäfarmen vid fakulteten för jordbruk, Ashit University, Ashit Governorate, Egypten.Fåglar hölls i individuella burar (30 x 40 x 40 cm), utsattes för ett ljusprogram (16 timmars ljus och 8 timmars mörker) och matades med en diet innehållande 160 g råprotein, 2800 kcal metaboliserbar energi, 35 g kalcium vardera.5 gram tillgänglig fosfor per kilogram kost.
Enligt data 36, ​​37 samlades sperma in från män genom bukmassage.Totalt 45 spermaprover samlades in från 15 män under 3 dagar.Spädning (n = 15/dag) späddes omedelbart 1:1 (v:v) med Belsville Poultry Semen Diluent, som innehåller kaliumdifosfat (1,27 g), mononatriumglutamatmonohydrat (0,867 g), fruktos (0,5 d) vattenfritt natrium.acetat (0,43 g), tris(hydroximetyl)aminometan (0,195 g), kaliumcitratmonohydrat (0,064 g), kaliummonofosfat (0,065 g), magnesiumklorid (0,034 g) och H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaritet 3 kg/m3kg mOsm3kg.Spädda spermaprover undersöktes först under ett ljusmikroskop för att säkerställa god spermakvalitet (fuktighet) och förvarades sedan i ett vattenbad vid 37°C fram till användning inom en halvtimme efter insamling.
Kinematik och reologi hos spermier beskrivs med hjälp av ett system av mikrofluidiska enheter.Spermaprover späddes ytterligare till 1:40 i Beltsville Avian Semen Diluent, laddade i en mikrofluidisk anordning (se nedan), och kinetiska parametrar bestämdes med användning av ett datoriserat semenanalyssystem (CASA) som tidigare utvecklats för mikrofluidikkarakterisering.om rörligheten av spermier i flytande medier (Institutionen för maskinteknik, fakulteten för tekniska ämnen, Assiut University, Egypten).Insticksprogrammet kan laddas ner på: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Kurvhastighet (VCL, μm/s), linjär hastighet (VSL, μm/s) och genomsnittlig banahastighet (VAP, μm/s) mättes.Videor av spermier togs med ett inverterat Optika XDS-3 faskontrastmikroskop (med 40x objektiv) kopplat till en Tucson ISH1000-kamera vid 30 fps i 3 s.Använd programvaran CASA för att studera minst tre områden och 500 spermiebanor per prov.Den inspelade videon bearbetades med en hemmagjord CASA.Definitionen av motilitet i CASA-plugin är baserad på spermiernas simhastighet jämfört med flödeshastigheten, och inkluderar inte andra parametrar såsom sida-till-sida-rörelse, eftersom detta har visat sig vara mer tillförlitligt i vätskeflödet.Reologisk rörelse beskrivs som spermiecellers rörelse mot vätskeflödets riktning.Spermatozoer med reologiska egenskaper dividerades med antalet rörliga spermier;spermier som var i vila och konvektivt rörliga spermier uteslöts från räkningen.
Alla använda kemikalier erhölls från Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Egypten) om inte annat anges.Anordningen tillverkades enligt beskrivning av El-sherry et al.40 med vissa modifieringar.Materialen som användes för att tillverka mikrokanalerna inkluderade glasplattor (Howard Glass, Worcester, MA), negativ resist SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), diacetonalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Tyskland) och polyaceton.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanaler tillverkas med hjälp av mjuk litografi.Först trycktes en tydlig skyddande ansiktsmask med önskad mikrokanaldesign på en högupplöst skrivare (Prismatic, Cairo, Egypt och Pacific Arts and Design, Markham, ON).Mästarna tillverkades med glasplattor som underlag.Plattorna rengjordes i aceton, isopropanol och avjoniserat vatten och belades sedan med ett 20 µm skikt av SU8-25 genom spinnbeläggning (3000 rpm, 1 min).SU-8-skikten torkades sedan försiktigt (65°C, 2 min och 95°C, 10 min) och exponerades för UV-strålning i 50 s.Baka efter exponering vid 65°C och 95°C i 1 min och 4 min för att tvärbinda exponerade SU-8-lager, följt av utveckling i diacetonalkohol i 6,5 min.Hårdgrädda våfflorna (200°C i 15 min) för att ytterligare stelna SU-8-skiktet.
PDMS framställdes genom att blanda monomeren och härdaren i ett viktförhållande av 10:1, sedan avgasades i en vakuumexsickator och hälldes på SU-8 huvudramen.PDMS härdades i en ugn (120°C, 30 min), sedan skars kanalerna ut, separerades från mastern och perforerades för att tillåta rör att fästas vid mikrokanalens inlopp och utlopp.Slutligen fästes PDMS-mikrokanaler permanent till objektglas med hjälp av en bärbar koronaprocessor (Electro-Technic Products, Chicago, IL) som beskrivs på annat håll.Mikrokanalen som används i denna studie mäter 200 µm × 20 µm (B × H) och är 3,6 cm lång.
Vätskeflödet som induceras av hydrostatiskt tryck inuti mikrokanalen uppnås genom att hålla vätskenivån i inloppsbehållaren över höjdskillnaden Δh39 i utloppsbehållaren (fig. 1).
där f är friktionskoefficienten, definierad som f = C/Re för laminärt flöde i en rektangulär kanal, där C är en konstant beroende på kanalens bildförhållande, L är längden på mikrokanalen, Vav är medelhastigheten inuti mikrokanalen, Dh är kanalens hydrauliska diameter, g – tyngdacceleration.Med hjälp av denna ekvation kan den genomsnittliga kanalhastigheten beräknas med följande ekvation: