Tack för att du besöker Nature.com.Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) är en baljväxt som används för livsmedelsproduktion och jordförbättring.Den globala expansionen av NLL som gröda har attraherat många patogena svampar, inklusive lupin antraknos, som orsakar den förödande antraknossjukdomen.Två alleler, Lanr1 och AnMan, som ger ökad resistens, har använts i NLL-uppfödning, men de underliggande molekylära mekanismerna är fortfarande okända.I denna studie användes Lanr1- och AnMan-markörerna för att screena europeiska NLL-prover.Testning av vaccinet i en kontrollerad miljö bekräftade effektiviteten hos båda resistenta donatorerna.Differentiell genuttrycksprofilering utfördes på representativa resistenta och mottagliga linjer.Antraknosresistens associerades med överuttryck av genontologitermerna "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" och "GO:0015979 Photosynthesis".Dessutom visade Lanr1(83A:476)-linjen signifikant omprogrammering av transkriptom snabbt efter inokulering, medan de andra linjerna visade en fördröjning av detta svar med cirka 42 timmar.Försvarssvar är associerade med generna TIR-NBS, CC-NBS-LRR och NBS-LRR, 10 proteiner involverade i patogenes, lipidöverföringsproteiner, endoglukan-1,3-β-glukosidas, glycinrika cellväggsproteiner och gener från reaktiv syreväg.Tidiga svar på 83A:476, inklusive noggrant undertryckande av gener associerade med fotosyntes, sammanföll med framgångsrikt skydd under svampbiologins vegetativa tillväxtfas, vilket tyder på att en effektor utlöser immunitet.Mandeloop-reaktionen saktas ner, liksom det övergripande horisontella motståndet.
Den smalbladiga lupinen (NLL, Lupinus angustifolius L.) är ett högproteinspannmål med ursprung i västra Medelhavsområdet1,2.Den odlas för närvarande som en matgröda för djur och människor.Det anses också som gröngödsel i växtföljdssystem på grund av kvävefixering av symbiotiska kvävefixerande bakterier och övergripande förbättring av markstrukturen.NLL har genomgått en snabb process av domesticering under det senaste århundradet och är fortfarande under högt avelstryck3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Med den utbredda odlingen av NLL utvecklade följden av patogena svampar nya jordbruksnischer och orsakade nya skördeförstörande sjukdomar. Det mest anmärkningsvärda för lupinodlare och uppfödare var uppkomsten av antraknos, orsakad av den patogena svampen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Det mest anmärkningsvärda för lupinodlare och uppfödare var uppkomsten av antraknos, orsakad av den patogena svampen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогноза, вызванного патогнеров (Bondiberg) , Feiler & Hagedorn13. Mest anmärkningsvärt för lupinodlare och uppfödare var uppkomsten av antraknos orsakad av den patogena svampen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眵它是由眵Hårig. 1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенбомого павляется ) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Mest slående för lupinodlare och -uppfödare är uppkomsten av antraknos orsakad av den patogena svampen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.De tidigaste rapporterna om sjukdomen kom från Brasilien och USA, med typiska symtom som uppträdde 1912 respektive 1929.Efter cirka 30 år betecknades emellertid patogenen Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf av Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld i målinriktad morfologi. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .och H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.och H. Schlenk, .Preliminär sjukdomsfenotypning gjord i mitten av 1900-talet visade viss resistens i NLL och gul lupin (L. luteus L.) accessioner, men alla testade vit lupin (L. albus L.) accessioner var mycket mottagliga15,16.Studier har visat att utvecklingen av antraknos är associerad med ökad nederbörd (luftfuktighet) och temperatur (i intervallet 12-28°C), vilket leder till en överträdelse av motståndet vid högre temperaturer17, 18. Faktum är att tiden som krävdes för konidier att gro och sjukdomen började , var fyra gånger kortare vid 24°C (12 timmar) hög luftfuktighet än vid 12°C (12 timmar) hög luftfuktighet.Således har den pågående globala uppvärmningen lett till spridningen av antraknos.Sjukdomen observerades dock i Frankrike (1982) och Ukraina (1983) som ett förebud om ett överhängande hot, men ignorerades uppenbarligen av lupinindustrin vid den tiden20,21.Några år senare spred sig denna förödande sjukdom över hela världen och drabbade även stora lupinproducerande länder som Australien, Polen och Tyskland22,23,24.Efter ett antraknosutbrott i mitten av 1990-talet resulterade omfattande screening i identifieringen av flera resistenta donatorer i NLL19-prover.NLL-resistens mot antraknos kontrolleras av två separata dominanta alleler som finns i olika könsplasmakällor: Lanr1 i kultivar Tanjil och Wonga och AnMan i kultivar.Mandalay 25, 26. Dessa alleler kompletterar de molekylära markörerna som stödjer valet av resistenta bakterieplasma i avelsprogram25,26,27,28,29,30.Den resistenta avelslinjen 83A:476 som bär Lanr1-allelen korsades med den mottagliga vilda linjen P27255 för att erhålla en RIL-population som segregerade för antraknosresistens, vilket gjorde det möjligt att tilldela Lanr1-lokuset till kromosom NLL-1131, 32, 33. Alignering av en flank-genomisk resistensmarkör till en kopplingsgenomisk markör för NLL-1131, 33. LL avslöjade platsen för alla tre alleler på samma kromosom (NLL-11), men i olika positioner29,34,35.Men på grund av det lilla antalet RIL och det stora genetiska avståndet mellan markörer och motsvarande alleler kan inga tillförlitliga slutsatser dras om deras underliggande gener.Å andra sidan är användningen av omvänd genetik i lupiner svår på grund av deras mycket låga regenereringspotential, vilket gör genetisk manipulation besvärlig37.
Utvecklingen av domesticerad bakterieplasma som bär den önskade allelen i det homozygota tillståndet, såsom 83A:476 (Lanr1) och Mandelup (AnMan), har öppnat dörren för att studera antraknosresistens inför närvaron av motsatta kombinationer av alleler i vilda populationer.Molekylära mekanismers möjligheter.Jämför försvarssvar som genereras av specifika genotyper.Denna studie utvärderade det tidiga transkriptomsvaret av NLL på C. lupini-vaccination.Först screenades en europeisk NLL-germplasmapanel innehållande 215 linjer med användning av molekylära markörer som markerar Lanr1- och AnMan-allelerna.Antraknosfenotypning utfördes sedan på 50 NLL-linjer, tidigare utvalda för molekylära markörer, under kontrollerade förhållanden.Baserat på dessa experiment valdes fyra linjer som skilde sig åt i antraknosresistens och Lanr1/AnMan-allelsammansättningen ut för differentiell försvarsgenexpressionsprofilering med två komplementära tillvägagångssätt: RNA-sekvensering med hög genomströmning och PCR-kvantifiering i realtid.
Screening av en uppsättning NLL-bakterieplasma (N = 215) med markörerna Lanr1 (Anseq3 och Anseq4) och AnMan (Anseq4) och AnMan (AnManM1) visade att endast en linje (95726, nära Salamanca-b) förstärker "resistens"-allelen för alla markörer för alla markörer för alla markörer, medan "precis-markörer i alla markörer" (8) 73,5 %) rader.Tretton linjer producerade två "resistenta" alleler av Lanr1-markören, och 8 linjer producerade "resistenta" alleler av Lanr1.markör."Resistens"-allelen för AnMan-markören (tilläggstabell S1).Två linjer var heterozygota för Anseq3-markören och en heterozygot för AnManM1-markören.42 linjer (19,5%) bar motsatta faser av Anseq3- och Anseq4-allelerna, vilket indikerar en hög frekvens av rekombination mellan dessa två loci.Antraknosfenotyper under kontrollerade förhållanden (kompletterande tabell S2) avslöjade variation i resistensen hos de testade genotyperna, vilket återspeglades i svårighetsgraden av antraknos.Skillnader i medelpoäng varierade från 1,8 (måttligt resistent) till 6,9 (mottaglig) och växtviktsskillnader varierade från 0,62 (mottaglig) till 4,45 g (resistent). Det fanns en signifikant korrelation mellan värden som observerades i två replikationer av experimentet (0,51 för sjukdomens svårighetspoäng, P = 0,00017 och 0,61 för växtvikt, P < 0,0001) såväl som mellan dessa två parametrar (-0,59 och -0,77, P < 0,0001). Det fanns en signifikant korrelation mellan värden observerade i två replikeringar av experimentet (0,51 för sjukdomens svårighetspoäng, P = 0,00017 och 0,61 för växtvikt, P < 0,0001) såväl som mellan dessa två parametrar (- 0,59 och - 0,77, P < 0,001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента = 0,51 повторностях эксперимента 0,00017 och 0,61 för массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 och -0,77, 0,00 < 0,01) . En signifikant korrelation hittades mellan värdena som observerades i två repetitioner av experimentet (0,51 för sjukdomens svårighetspoäng, P = 0,00017 och 0,61 för växtvikt, P < 0,0001), samt mellan dessa två parametrar (- 0,59 och -0,77, P < 0,000)).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分,0,0,0,51︺物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和–0,77，P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程庈度 诟 0 为 庈 诟. 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（２（，，和 （–5.9.和– 0,59 和–0,77，P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценколестях 5,0,0,0,0,0,0 0017 и масса растения 0,61, P <0,0001), och между этими двумя параметрами (-0,59 och -0,0001) 0,77, P <0,0001. Det fanns en signifikant korrelation mellan värdena som observerades i duplikat (poäng för sjukdomens svårighetsgrad 0,51, P = 0,00017 och växtvikt 0,61, P < 0,0001) och mellan dessa två parametrar (-0,59 och -0 ,0001) 0,77, P<0,0001. ).Typiska symtom som ses hos känsliga växter inkluderar veck och vridning av stjälken som liknar en "herdens båge"-struktur, följt av ovala lesioner med orange/rosa sporozoiter (kompletterande bild 1).Australiska accessioner som bär generna Lanr1 (83A:476 och Tanjil) och AnMan (Mandelup) är måttligt resistenta, 0,0331 och 0,0036.Vissa linjer som också bär "resistenta" Lanr1- och/eller AnMan-alleler visar symtom på sjukdomen.
Intressant nog avslöjade några NLL-linjer som saknade någon "resistent" markörallel en hög nivå av antraknosresistens (jämförbar med eller högre än för Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-värde < 0,0001 för båda parametrarna), Bojar (P-värde < 0,0001 för poäng och 0,001 B-värde och 0,001 B-0, 09b-värde) (P-0, 0,09). 1 för poäng och icke-signifikant för vikt). Intressant nog avslöjade några NLL-linjer som saknade någon "resistent" markörallel en hög nivå av antraknosresistens (jämförbar med eller högre än för Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-värde < 0,0001 för båda parametrarna), Bojar (P-värde < 0,0001 för poäng och 0,001 B-värde och 0,001 B-0, 09b-värde) (P-0, 0,09). 1 för poäng och icke-signifikant för vikt). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, покасусаливыки антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (försäljning P <0,0001 för pär), 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) och популяции B-549/79b (försäljning P <0,0001 för оценки и незначим). Intressant nog visade flera NLL-linjer som saknade någon "resistent" markörallel en hög nivå av resistens mot antraknos (jämförbar med eller högre än för Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-värde < 0,0001 för båda parametrarna), Bojar (P-värde < 0,0001 för utvärdering av 0,0001 för 0,001 för 001-värde för växt och B-9b) och B-9b-värde och B-9b-värde och B-9b. .0001 för utvärdering och inte signifikant för vikt).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的瀅疽1基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值高高鸏鸍鸍鸍鸍鸍鸍鸍鸍鸍鸇为为为为三. 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Det är intressant att vissa NLL-system som inte har några "antigena" markörer uppvisar hög horisontell resistens (motsvarande Lanr1- eller AnMan-gener eller högre), såsom Boregine (båda parametrarna P < 0,0001), Bojar (P-värde < 0,0001, växtvikt 0,001) och stam B-549/70,0P0-värde <79b, inte signifikant (vikt). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», покасазалич антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (snaчение P обоих параметрнаов <0,00001), Boregine (för P обоих параметров) <0,000 а растения 0,001) och популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Intressant nog visade vissa NLL-linjer som saknade någon "resistens"-marköralleler höga nivåer av antraknosresistens (jämförbar med eller högre än Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-värde för båda parametrarna <0,0001), Bojar (P-värde < 0,0001, växtvikt 0,00b 04) och B-00b-värde 0,00b 9 och population B-00b. 1, vikt ej signifikant).Detta fenomen antyder möjligheten av en ny genetisk resistenskälla, vilket förklarar den observerade bristen på korrelation mellan markörgenotyper och sjukdomsfenotyper (P-värden från ~0,42 till ~0,98).Således visade Kolmogorov-Smirnov-testet att data om antraknosresistens var ungefär normalfördelade för poäng (P-värden 0,25 och 0,11) och växtmassa (P-värden 0,47 och 0,55), vilket tyder på att jag antar att fler alleler än Lanr1 och AnMan är inblandade.
Baserat på resultaten av screening av antranosresistens valdes 4 linjer ut för transkriptomanalys: 83A:476, Boregine, Mandelup och Population 22660. Dessa linjer testades om för mjältbrandsresistens i inokuleringsexperiment med RNA-sekvensering, förutsatt att de var desamma som i föregående test.Poängvärdena var följande: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) och population 22660 (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000-protokollet uppnådde i genomsnitt 40,5 Mread-par per prov (29,7 till 54,4 Mreads) (kompletterande tabell S3).Inriktningspoäng i referenssekvensen varierade från 75,5 % till 88,6 %.Den genomsnittliga korrelationen av läsräkningsdata mellan experimentella varianter mellan biologiska replikat varierade från 0,812 till 0,997 (medelvärde 0,959). Av de 35 170 analyserade generna visade 2917 inget uttryck, och de andra 4785 generna uttrycktes på försumbar nivå (basmedelvärde < 5). Av de 35 170 analyserade generna visade 2917 inget uttryck, och de andra 4785 generna uttrycktes på försumbar nivå (basmedelvärde < 5). Från 35 170 miljoner kronor 2917 inga kostnader, och 4785 miljoner kronor. зовое среднее <5). Av de 35 170 analyserade generna visade 2917 inget uttryck, och de återstående 4785 generna uttrycktes på en försumbar nivå (basmedelvärde <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可的表达可箳忽值< 5).35 170 Från 35 170 miljoner kronor 2917 inga pengar, och 4785 miljoner kronor нее значение <5). Av de 35 170 analyserade generna uttrycktes inte 2917 och de återstående 4785 generna hade försumbart uttryck (basmedelvärde <5).Således var antalet gener som ansågs uttryckta (basmedelvärde ≥ 5) under experimentet 27 468 (78,1%) (kompletterande tabell S4).
Från den första tidpunkten svarade alla NLL-linjer på inokuleringen av C. lupini (stam Col-08) genom att omprogrammera transkriptomen (tabell 1), men signifikanta skillnader observerades mellan linjerna.Således visade resistenslinjen 83A:476 (som bär Lanr1-genen) signifikant transkriptomomprogrammering vid den första tidpunkten (6 hpi) med en 31-69-faldig ökning av antalet isolerade upp- och nedgener jämfört med andra tidpunkter vid denna tidpunkt.Dessutom var denna topp kortlivad, eftersom uttrycket av endast ett fåtal gener förblev signifikant förändrat vid den andra tidpunkten (12 hpi).Intressant nog genomgick inte Boregine, som också visade en hög resistensnivå i transplantattestet, en sådan massiv transkriptionell omprogrammering under experimentet.Emellertid var antalet differentiellt uttryckta gener (DEG) detsamma för Boregine och 83A:476 vid 12 HPI.Både Mandelup och population 22660 visade DEG-toppar vid den senaste tidpunkten (48 l/s), vilket indikerar en relativ försening i försvarssvar.
Eftersom 83A:476 genomgick massiv transkriptom-omprogrammering som svar på C. lupini vid 6 HPI jämfört med alla andra linjer, var ~91% av de DEG som observerades vid denna tidpunkt härstamningsspecifika (Fig. 1).Det fanns dock en viss överlappning i tidiga svar mellan studielinjer, eftersom 68,5 %, 50,9 % och 52,6 % DEG i Boregine, Mandelup respektive population 22660 överlappade de som hittades i 83A:476 vid vissa tidpunkter.Dessa DEG stod dock bara för en liten bråkdel (0,97–1,70%) av alla DEG som för närvarande detekteras med 83A:476.Dessutom var 11 DEG från alla linjer koherenta vid denna tidpunkt (kompletterande tabeller S4-S6), inklusive vanliga komponenter i växtförsvarssvar: lipidöverföringsprotein (TanjilG_32225), endoglukan-1,3-β-glukosidenzym (TanjilG_23388) (TanjilG_23388-proteiner som t.ex. G_31531), basiskt latexprotein (TanjilG_32352) och två glycinrika strukturella cellväggsproteiner (TanjilG_19701 och TanjilG_19702).Det fanns också en relativt hög överlappning i transkriptomsvar mellan 83A:476 och Boregine vid 24 HPI (totalt 16-38% DEG) och mellan Mandelup och Population 22660 vid 48 HPI (totalt 14-20% DEG).
Venn-diagram som visar antalet differentiellt uttryckta gener (DEG) i smalbladiga lupinlinjer (NLL) inokulerade med Colletotrichum lupini (stam Col-08 erhållen från lupinfält i Wierzhenice, Polen, 1999).NLL-linjerna som analyserades var: 83A:476 (resistent, bärande Lanr1-allelen), Boregine (resistent, genetisk bakgrund okänd), Mandelup (måttligt resistent, bärande AnMan-allelen) och population 22660 (mycket mottaglig).Förkortningen hpi står för timmar efter vaccination.Nollvärden har tagits bort för att förenkla grafen.
Uppsättningen av överuttryckta gener vid 6 hpi analyserades för närvaron av kanoniska R-gendomäner (kompletterande tabell S7).Denna studie avslöjade transkriptominduktion av klassiska sjukdomsresistensgener med NBS-LRR-domäner endast vid 83A:476.Denna uppsättning bestod av en TIR-NBS-LRR-gen (tanjilg_05042), fem CC-NBS-LRR-gener (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, och tanjilg_16162) och Four NBS-LR, NLG_1BS, 1BS, 1BS, 1BS, 1BS 16162) samt fyra NBS-Lrr (tanjilg_16162) och fyra NBS-LRR (TANJILG_16162).Alla dessa gener har kanoniska domäner ordnade i konserverade sekvenser.Utöver NBS-LRR-domängenerna aktiverades flera RLL-kinaser vid 6 hpi, nämligen en i Boregine (TanjilG_19877), två i Mandelup (TanjilG_07141 och TanjilG_19877) och i populationen 22660 (TanjilG_07G 1_4 och 361 G_02) och 22660 (Tanjil01_4 och 361G_02) :476.
Gener med signifikant förändrat uttryck som svar på inokulering med C. lupini (stam Col-08) utsattes för Gene Ontology (GO) anrikningsanalys (kompletterande tabell S8). Den mest frekvent överrepresenterade biologiska processtermen var "GO:0006952 försvarssvar" som förekom i 6 av 16 (tid × linje) kombinationer med hög signifikans (P-värde < 0,001) (Fig. 2). Den mest frekvent överrepresenterade biologiska processtermen var "GO:0006952 försvarssvar" som förekom i 6 av 16 (tid × linje) kombinationer med hög signifikans (P-värde < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитнетый» отвяся из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Den mest frekvent överrepresenterade biologiska processtermen var 'GO:0006952 försvarssvar', som förekom i 6 av 16 (tid × härstamning) kombinationer med hög signifikans (P-värde < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现圴圴圴庐庐缄组庐缄绉个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. Den mest representativa biologiska processtermen är "GO:0006952 försvarssvar", som förekommer i 6 av de 16 (时间×线) kombinationerna, med hög signifikans (P-värde < 0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defence Response», молсторвыв 16 av 16 колля з инаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Den mest frekvent överrepresenterade biologiska processtermen var 'GO:0006952 Defense Response', som förekom i 6 av 16 kombinationer (tid × linje) med hög signifikans (P-värde < 0,001) (Fig. 2).Denna term var överrepresenterad vid två tidpunkter i 83A: 476 och Boregine (6 och 24 hpi) och vid en tidpunkt i Mandelup och Population 22660 (12 respektive 6 hpi).Detta är ett förväntat resultat, som framhäver det svampdödande svaret hos de resistenta linjerna.Dessutom svarade 83A:476 på C. lupini genom att snabbt inducera gener relaterade till den oxidativa explosionen som representeras av termen "GO:0055114 redoxprocess", vilket indikerar ett specifikt försvarssvar, medan Boregine avslöjade specifika försvarssvar, relaterade till termen "GO".:0006950 Stressrespons”.Population 22660 aktiverade det horisontella resistenssvaret som involverade sekundära metaboliter, vilket framhävde det överdrivna antalet termer "GO:0016104 Process of triterpene biosynthesis" och "GO:0006722 Process of triterpene metabolism" (båda termerna tillhör samma uppsättning gener), med hänsyn tagen till termen resultaten av anrikning av GO2-reaktionen från GO2 och GO6-populationsanrikningsreaktionen. 0. Dessutom inkluderar tidig reaktion 83A:476 (6 hpi) och fördröjd reaktion Mandelup och Population 22660 termen GO:0015979 'fotosyntes' och andra relaterade biologiska processer.
Termerna för bioprocessgenens ontologi som valts i annoteringen av differentiellt uttryckta gener under transkriptomsvar av smalbladig lupin (NLL) inokulerad med mjältbrandslupin (Col-08-stam erhållen från lupinfält i Wierzhenice, Polen, 1999) är kraftigt överdrivna.NLL-linjerna som analyserades var: 83A:476 (resistent, bärande den homozygota Lanr1-allelen), Boregine (resistent, okänd genetisk bakgrund), Mandelup (måttligt resistent, bärande den homozygota AnMan-allelen) och population 22660 (mottaglig).
Eftersom denna studie syftade till att identifiera gener som bidrar till antraknosresistens, analyserades generna som tilldelats termerna GO "GO: 0006952 Defensive responses" och "GO: 0055114 Redox processer" med cut-offs eftersom baslinjen betyder ≥ 30 med minst en linje.× tidpunkt som kombinerar statistiskt signifikanta värden av log2 (faldig förändring).Antalet gener som uppfyller dessa kriterier var 65 för GO:0006952 och 524 för GO:0055114.
83A:476 avslöjade två DEG-toppar kommenterade med termen GO:0006952, den första vid 6 gener per tum (64 gener, upp- och nedreglering) och den andra vid 24 gener per tum (15 gener, endast uppreglering).Boregine visade också att GO:0006952 toppade vid samma tidpunkt, men med mindre DEG (11 och 8) och preferensaktivering.Mandeloop visade två toppar av GO:0006952 vid 12 och 48 HPI, båda bär på 12 gener (den första med aktiverande gener och den andra med endast suppressiva gener), medan 22660-populationen vid 6 HPI (13 gener) hade en större övervikt av ökningstoppen.reglering.Det bör noteras att 96,4 % av GO:0006952 DEG i dessa toppar hade samma typ av svar (upp eller ner), vilket indikerar en signifikant överlappning i försvarssvar trots skillnader i antalet involverade gener.Den största gruppen av sekvenser relaterade till termen GO:0006952 kodar för Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-liknande), som tillhör klass 10 patogenesassocierat protein (PR-10) proteinklad och kärnproteinlatexen.liknande (MLP-liknande) protein) protein (Fig. 3).De två grupperna skilde sig åt i uttryckets karaktär och riktningen för svaret.Generna som kodar för SAM22-liknande proteiner visade konsekvent och signifikant induktion vid tidiga tidpunkter (6 eller 12 hpi) och svarade i allmänhet inte vid slutet av experimentet (48 hpi), medan MLP-liknande proteiner visade koordination vid 6 hpi.hpi.83A:476 och Mandelup med 48 hk/in, nästan alla andra datapunkter svarade inte.Dessutom följde skillnader i uttrycksprofiler för SAM22-liknande proteingener observerad variation i antraknosresistens, eftersom mer resistenta linjer hade fler tidpunkter som signifikant inducerade dessa gener än mer mottagliga gener.En annan LlR18A/B-liknande PR-10-gen visade ett mycket liknande uttrycksmönster som den SAM22-liknande proteingenen.
Huvudkomponenterna i den biologiska processtermen "GO:0006952 Defense Response" och uttrycksmönstren för kandidatgener för Lanr1- och AnMan-allelerna identifierades.Log2-skalan representerar log2-värden (faldig förändring) mellan inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen från lupinfält, Wizhenica, Polen, 1999) och kontrollväxter (skeninokulerade) vid samma tidpunkt.Följande smalbladiga lupinlinjer analyserades: 83A:476 (resistent, bärande den homozygota Lanr1-allelen), Boregine (resistent, genetisk bakgrund okänd), Mandelup (måttligt resistent, bärande den homozygota AnMan-allelen) och Population 22660 (mottaglig).
Dessutom utvärderades expressionsprofilerna för RNA-seq-kandidatgener Lanr1 (TanjilG_05042) och AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3).TanjilG_05042-genen visade ett signifikant svar (aktivering) vid 83A:476 endast vid den första tidpunkten (6 hpi), medan TanjilG_12861 var signifikant i Mandeloop endast vid två tidpunkter: 6 hpi (nedreglering) och 24 hpi (6 hpi).Med.).justerbar) ).
De mest överuttryckta generna i termen GO:0055114 "redoxprocess" var gener som kodade för cytokrom P450-proteiner och peroxidas (Fig. 4).För prover isolerade från 83A:476 vid 6 HPI observerades generellt maximala eller lägsta log2 (faldig förändring) värden (för 86,6% av generna) mellan ympade och kontrollväxter, vilket framhävde det höga svaret av denna genotyp på inokulering av sex.83A:476 visade den mest signifikanta GO: 0055114 DEG vid 6 hpi (503 gener), medan resten av linjerna vid 48 hpi (Boregine, 31 gener; Mandelup, 85 gener; och Population 22660, 78 gener)).I de flesta gener i GO:0055114-familjen observerades två typer av svar på vaccination (aktivering och hämning).Intressant nog tyder upp till 97,6% av de grader som identifierats för termen: 0055114 I mandelupe vid 48 hk tyder dessa observationer att mönstret av försenade transkriptomresponser av mandeloup (dvs. antalet muterade redoxgener, 85 kontra 503), mönstret för försenade transkriptomrespons av mandeloup till anthracnos är liknande till de tidiga svaren på 8566.I Boregine och Population 22660 är denna konvergens lägre på 51,6 % respektive 75,6 %.
Uttrycksmönstren för huvudkomponenterna i termen för den biologiska processen "GO:0055114 Redoxprocess" avslöjades.Log2-skalan representerar log2-värden (faldig förändring) mellan inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen från lupinfält, Wizhenica, Polen, 1999) och kontrollväxter (skeninokulerade) vid samma tidpunkt.Följande smalbladiga lupinlinjer analyserades: 83A:476 (resistent, bärande den homozygota Lanr1-allelen), Boregine (resistent, genetisk bakgrund okänd), Mandelup (måttligt resistent, bärande den homozygota AnMan-allelen) och Population 22660 (mottaglig).
83A:476 Transkriptomiska svar på inokulering med C. lupini (stam Col-08) inkluderade också koordinerad tystning av gener som tillskrivs termen GO:0015979 "fotosyntes" och andra relaterade biologiska processer (FIG. 5).Denna GO:0015979 DEG-uppsättning innehöll 105 gener som var signifikant undertryckta vid 6 hpi vid 83A:476.I denna undergrupp nedreglerades också 37 gener i Mandelup vid 48 HPI och 35 vid samma tidpunkt i 22660-populationen, inklusive 19 grader som är gemensamma för båda genotyperna.Inga DEGs relaterade till termen GO: 0015979 aktiverades signifikant i någon kombination (rad x tid).
Uttrycksmönstren för huvudkomponenterna i termen för den biologiska processen "GO:0015979 Fotosyntes" avslöjades.Log2-skalan representerar log2-värden (faldig förändring) mellan inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen från lupinfält, Wizhenica, Polen, 1999) och kontrollväxter (skeninokulerade) vid samma tidpunkt.Följande smalbladiga lupinlinjer analyserades: 83A:476 (resistent, bärande den homozygota Lanr1-allelen), Boregine (resistent, genetisk bakgrund okänd), Mandelup (måttligt resistent, bärande den homozygota AnMan-allelen) och Population 22660 (mottaglig).
Baserat på resultaten av differentiell uttrycksanalys och förmodligen involverad i försvarssvar mot patogena svampar, valdes denna uppsättning av sju gener för kvantifiering av uttrycksprofiler genom realtids-PCR (kompletterande tabell S9).
Den förmodade proteingenen TanjilG_10657 inducerades signifikant i alla studerade linjer och tidpunkter jämfört med kontroll (härmar) växter (kompletterande tabeller S10, S11).Dessutom visade uttrycksprofilen för TanjilG_10657 en ökande trend under experimentets gång för alla linjer.Population 22660 visade den högsta känsligheten av TanjilG_10657 för inokulering med 114-faldig aktivering och den högsta relativa uttrycksnivån (4,4 ± 0,4) vid 24 HPI (Fig. 6a).PR10 LlR18A-proteingenen TanjilG_27015 visade också aktivering över alla linjer och tidpunkter, med statistisk signifikans vid de flesta datapunkter (Fig. 6b).I likhet med TanjilG_10657 observerades den högsta relativa uttrycksnivån av TanjilG_27015 i den 22660 inokulerade populationen vid 24 HPI (19,5 ± 2,4).Den sura endokitinasgenen TanjilG_04706 var signifikant uppreglerad i alla linjer och vid alla tidpunkter utom för Boregine 6 hpi (Fig. 6c).Den inducerades kraftigt vid den första tidpunkten (6 HPI) vid 83A:476 (med 10,5 gånger) och ökade måttligt i andra linjer (med 6,6-7,5 gånger).Under experimentet förblev uttrycket av TanjilG_04706 på liknande nivåer i 83A:476 och Boregine, medan det i Mandelup och Population 22660 ökade signifikant och nådde relativt höga värden (5,9 ± 1,5 respektive 6,2 ± 1,5).Den endoglukan-1,3-β-glukosidasliknande genen TanjilG_23384 visade hög aktivering vid de första två tidpunkterna (6 och 12 hpi) i alla linjer utom population 22660 (Fig. 6d).De högsta relativa uttrycksnivåerna av TanjilG_23384 observerades vid den andra tidpunkten (12 hpi) i Mandelup (2,7 ± 0,3) och 83A:476 (1,5 ± 0,1).Vid 24 HPI var uttrycket av TanjilG_23384 relativt lågt i alla studerade linjer (från 0,04 ± 0,009 till 0,44 ± 0,12).
Expressionsprofiler för utvalda gener (ag) avslöjade genom kvantitativ PCR.Siffrorna 6, 12 och 24 representerar timmar efter vaccination.LanDExH7- och LanTUB6-generna användes för normalisering och LanTUB6 användes för inter-seriekalibrering.Felstaplar representerar standardavvikelsen baserat på tre biologiska replikat, som var och en är medelvärdet av tre tekniska replikat. Den statistiska signifikansen av skillnader i uttrycksnivåer mellan de inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen 1999 från lupinfältet i Wierzenica, Polen) och kontrollväxterna (skeninokulerade) är markerade ovanför datapunkterna (*P-värde < 0,05, **P-värde ≤ .0). Den statistiska signifikansen av skillnader i uttrycksnivåer mellan de inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen 1999 från lupinfältet i Wierzenica, Polen) och kontrollväxterna (skeninokulerade) är markerade ovanför datapunkterna (*P-värde < 0,05, **P-värde ≤ .0). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, 9 пгв Col-09 пг. юпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данными (*0,0 p/0, 0,0 ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistiskt signifikanta skillnader i uttrycksnivåer mellan inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen 1999 från ett lupinfält i Wierzhenice, Polen) och kontrollväxter (skeninokulerade) noteras ovanför datapunkterna (*P-värde < 0,05, **P-värde ≤,*** 0,0).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（騡种缉）和对慧（模种缉接水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 倂)≤ 0,0)接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 撌 对煤照 缈平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤。01)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, пвыюпю Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над тонтрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над тонтрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над тонтрольными (li. начение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistiskt signifikanta skillnader i uttrycksnivåer mellan inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen från lupinfält i Verzhenice, Polen, 1999) och kontrollväxter (skeninokulerade) noteras ovanför datapunkterna (*P-värde < 0,05 , **P-värde ≤ , 0, 0, 0, 0, 0).NLL-linjerna som analyserades var: 83A:476 (resistent, bärande den homozygota Lanr1-allelen), Mandelup (måttligt resistent, bärande den homozygota AnMan-allelen), Boregine (resistent, okänd genetisk bakgrund) och population 22660 (mottaglig).
Kandidatgenen TanjilG_05042 vid Lanr1-lokuset visade ett markant annorlunda uttrycksmönster från profilerna erhållna från RNA-seq-studier (Fig. 6e).Signifikant aktivering av denna gen observerades i Mandelup och 22660-populationen (upp till 39,7 respektive 11,7 gånger), vilket resulterade i relativt höga expressionsnivåer (upp till 1,4 ± 0,14 respektive 7,2 ± 1,3).83A:476 avslöjade också viss uppreglering av TanjilG_05042-genen (upp till 3,8 gånger), men de relativa uttrycksnivåerna som uppnåddes (0,044 ± 0,002) var mer än 30 gånger lägre än de som observerades i Mandelup och 22660-populationen.analyserad med qPCR visade signifikanta skillnader i uttrycksnivåer mellan genotyper i låtsasvaccinerade (kontroll) varianter, och nådde en 58-faldig skillnad mellan populationerna 22660 och 83A:476, såväl som mellan populationerna 22660 och 22660. En tvåfaldig skillnad uppnåddes mellan Boregine och Mandalup.
Kandidatgenen vid AnMan-lokuset, TanjilG_12861, aktiverades som svar på vaccination i 83A:476 och Mandelup, var neutral i 22660-populationen och nedreglerades i Boregine (Fig. 6f).Det relativa uttrycket av TanjilG_12861-genen var det högsta i inokulerade 83A: 476 (0,14±0,01).17,4 kDa klass I värmechockproteingenen TanjilG_05080 HSP17.4 visade lägre relativa uttrycksnivåer i alla studerade stammar och tidpunkter (Fig. 6g).Det högsta värdet observerades vid 24 HPI i 22660-populationen (0,14 ± 0,02, en åttafaldig ökning som svar på vaccination).
Jämförelse av genuttrycksprofiler (Fig. 7) avslöjade en hög korrelation mellan TanjilG_10657 och fyra andra gener: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80 (r = 0,6_0) och 4 Tanjil (7)).Sådana resultat kan indikera samreglering av dessa gener under försvarssvar.TanjilG_12861- och TanjilG_23384-generna visade olika uttrycksprofiler med lägre Pearson-korrelationskoefficientvärden (från 0,08 till 0,43 respektive -0,19 till 0,28) jämfört med andra gener.
Korrelationer mellan genuttrycksprofiler detekterades med användning av kvantitativ PCR.Följande smalbladiga lupinlinjer analyserades: 83A:476 (resistent, bärande den homozygota Lanr1-allelen), Mandelup (måttligt resistent, bärande den homozygota AnMan-allelen), Boregine (resistent, genetisk bakgrund okänd) och Population 22660 (mottaglig).Tre tidpunkter beräknades (6, 12 och 24 timmar efter ympning), inklusive inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen från lupinfält i Wierzhenice, Polen, 1999) och kontrollväxter (skeninokulerade).Skalan visar värdet på Pearsons korrelationskoefficient.
Baserat på data erhållna vid 6 hästkrafter per tum, utfördes WGCNA på 9981 DEG identifierat genom att jämföra ympade och kontrollväxter för att fokusera på tidiga försvarssvar (kompletterande tabell S12).Tjugotvå genmoduler (kluster) hittades med korrelerade (positiva eller negativa) uttrycksprofiler mellan genotyper och experimentella varianter. I genomsnitt var nivåerna av genuttryck fallande i ordning 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i båda varianterna var denna trend dock starkare i kontrollväxter). I genomsnitt var nivåerna av genuttryck fallande i ordning 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i båda varianterna var denna trend dock starkare i kontrollväxter). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660 (в обоих вариантах, боих вариантах, боих вариантах, ла сильнее у контрольных растений). I genomsnitt minskade genuttrycksnivåerna i storleksordningen 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i båda varianterna var dock denna trend starkare i kontrollväxter).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> befolkning 22660 的 顺序 下降 （， ， 県 圿在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660 ильнее у контрольных растений). I genomsnitt minskade genuttrycksnivåerna i serien 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i båda varianterna var dock denna trend starkare i kontrollväxter).Vaccination resulterade i uppreglering av genuttryck, speciellt i modulerna 18, 19, 14, 6 och 1 (i fallande effektordning), negativ reglering (t.ex. modulerna 9 och 20) eller med neutrala effekter (t.ex. modulerna 11, 22, 8 och 13).GO term anrikningsanalys (kompletterande tabell S13) avslöjade "GO: 0006952 Skyddssvar" för den inokulerade modulen (18) med maximal aktivering, inklusive gener analyserade med qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_1055, TanjilG_1055, såväl som många undertryckta som många inculate_1055). fotosyntesmoduler (9).Modul 18-koncentratorn (fig. 8) identifierades som TanjilG_26536-genen som kodar för det PR-10-liknande LlR18B-proteinet, och modul 9-koncentratorn identifierades som TanjilG_28955-genen som kodar för fotosystem II PsbQ-proteinet.En kandidat för antraknosresistensgen Lanr1, TanjilG_05042, hittades i modul 22 (Fig. 9) och är associerad med termerna "GO:0044260 Cellulära makromolekylära metaboliska processer" och "GO:0006355 Transcriptional Regulation, DNA-templating" som bär Tangentina 01212_hub.genen kodar för värmestresstranskriptionsfaktor A-4a (HSFA4a).
Viktad nätverksanalys av gensamuttryck av moduler med överrepresenterade biologiska processtermer "GO: 0006952 Defense responses".Ligering förenklades för att lyfta fram de fyra generna som analyserats med qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 och TanjilG_27015).
Viktad nätverksanalys av gensamuttryck av en modul med en överrepresenterad biologisk processterm "GO: 0006355: Transcriptional Regulation, DNA-templating" och bärande en kandidat antraknosresistensgen Lanr1 TanjilG_05042.Ligering förenklades för att isolera TanjilG_05042-genen och den centrala TanjilG_01212-genen.
Antraknosresistensscreening insamlad i Australien visade att de flesta av de tidigt släppta sorterna var mottagliga;Kalya, Coromup och Mandelup har beskrivits som måttligt resistenta, medan Wonga, Tanjil och 83A:476 har beskrivits som mycket resistenta26,27,31.hade samma resistensallel, betecknad Lanr1, och Coromup och Mandelup hade en annan allel, betecknad AnMan10, 26, 39, medan Kalya överförde en annan allel., Lanr2.Screening för antraknosresistens i Tyskland resulterade i identifieringen av en resistent linje Bo7212 med en annan kandidatallel än Lanr1, betecknad LanrBo36.
Vår studie avslöjade en mycket låg frekvens (cirka 6%) av Lanr1-allelen i den testade bakterieplasman.Denna observation överensstämmer med resultaten av screening av östeuropeisk könsplasma med användning av Anseq3- och Anseq4-markörerna, som visade att Lanr1-allelen endast finns i två vitryska linjer.Detta tyder på att Lanr1-allelen ännu inte används i stor utsträckning av lokala avelsprogram, till skillnad från i Australien, där den är en av nyckelallelerna för markörassisterad avel.Detta kan bero på den lägre nivån av resistens som tillhandahålls av Lanr1-allelen under europeiska fältförhållanden jämfört med den australiensiska rapporten.Dessutom har studier av antraknos i områden med hög nederbörd i Australien visat att resistenssvar som förmedlas av Lanr1-allelen kanske inte är effektiva i väderförhållanden som gynnar tillväxt och snabb utveckling av patogenen19,42.Faktum är att i den aktuella studien observerades vissa symtom på antraknos också i genotyper som bär Lanr1-allelen, vilket tyder på att resistens kan försvinna under optimala förhållanden för utvecklingen av C. lupini.Dessutom är falska positiva tolkningar av närvaron av Anseq3- och Anseq4-markörer, som är cirka 1 cM från Lanr1-lokuset, möjliga 28,30,43.
Vår studie visade att 83A:476, som bär Lanr1-allelen, svarade på C. lupini-ympning med storskalig transkriptom-omprogrammering vid den första analyserade tidpunkten (6 hpi), medan i Mandelup, som bär på AnMan-allelen, observerades transkriptomiska svar mycket senare.(från 24 till 48 hk).Dessa tidsmässiga variationer i försvarssvar är förknippade med skillnader i sjukdomssymptom, vilket understryker vikten av tidig patogenigenkänning för ett framgångsrikt svar på resistens.För att infektera växtvävnad måste mjältbrandssporer gå igenom flera utvecklingsstadier på värdytan, inklusive groning, celldelning och bildandet av ett appressorium.Ett bihang är en infektiös struktur som fäster på värdens yta och underlättar penetration in i värdens vävnader.Således visade sporer av C. gloeosporioides i ärtextrakt den första delningen av kärnan efter 75-90 minuters inkubation, bildandet av ett groddrör efter 90-120 minuter och undertryckande efter 4 timmar 45 .Mango C. gloeosporioides visade mer än 40 % konidiell groning efter 3 timmars inkubation och ca 20 % bildning av apressorer efter 4 timmar.Den virulensassocierade CAP20-genen av C. gloeosporioides visade transkriptionsaktivitet i epifytbildande konidier efter 3,5 timmars inkubation i avokadoytvax med höga koncentrationer av CAP20-protein efter 4 timmar och 46 minuter.På liknande sätt inducerades aktiviteten av melaninbiosyntesgener i C. trifolii under en 2-timmars inkubation följt av bildandet av ett appressorium efter 1 timme.Studier av bladvävnader har visat att jordgubbar inokulerade med C. acutatum har första suppression vid 8 hpi, medan tomater ympade med C. coccodes har första suppression vid 4 hpi48,49.i stort sett överensstämmande med tidsskalan för Colletotrichum spp.infektiös process.Snabba försvarssvar till 83A:476 tyder på involvering av växtresistens och effektorutlösta immunitetsgener (ETI) i denna linje, medan Mandelups fördröjda svar stödjer hypotesen mikroassocierade molekylärt mönsterutlösta immunitet (MTI) 50. Tidiga svar på 83A: 476 och Mandelup.Den partiella överlappningen mellan upp- eller nedreglerade gener i fördröjd respons stöder också detta koncept, eftersom ETI ofta anses vara ett accelererat och förstärkt MTI-svar som kulminerar i programmerad celldöd vid infektionsplatsen, känd som anafylaktisk chock 51,52.
De flesta av generna som tillskrivs den överrepresenterade termen Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" är de 11 homologerna av det stressinducerade fastemeddelandet 22-proteinet (liknande SAM22) och de sju stora latexproteinlika (MLPs).-liknande proteinerna 31, 34, 43 och 423 visade sekvenslikhet.SAM22-liknande gener visade signifikant aktivering som varade längre, vilket visade ökade nivåer av antraknosresistens (83A:476 och Boregine).Emellertid nedreglerades MLP-liknande gener endast i linjer som bär kandidatresistensallelen (83A:476/Lanr1 vid 6 hpi och Mandelup/AnMan vid 24 hpi).Det bör noteras att alla identifierade SAM22-liknande homologer härstammar från ett genkluster som spänner över cirka 105 kb, medan MLP-liknande gener härstammar från separata regioner av genomet.Koordinerad aktivering av sådana SAM22-liknande gener hittades också i vår tidigare studie av NLL-resistens mot Diaporthetoxica-ympning, vilket tyder på att de är involverade i de horisontella komponenterna i försvarssvaret.Denna slutsats stöds också av rapporter om ett positivt svar av SAM22-liknande gener på skada eller behandling med salicylsyra, svampinducerare eller väteperoxid.
MLP-liknande gener har visat sig svara på olika abiotiska och biotiska påfrestningar, inklusive bakteriella, virala och patogena svampinfektioner i många växtarter55.Reaktionsriktningarna på vissa interaktioner mellan växter och patogener varierade från kraftigt ökande (dvs under angrepp av bomull med Verticillium dahliae) till signifikant minskande (dvs efter infektion av äppelträd med Alternaria spp.)56,57.Signifikant nedreglering av den MLP-liknande 423-genen har observerats under avokadoförsvar mot F. niger-infektion och under infektion av äppelträdet Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola och Alternaria alternata är äppelpatotyper58,59.Dessutom hade äppelkalli som överuttryckte den MLP-liknande 423-genen lägre uttryck av resistensassocierade gener och var mer mottagliga för svampinfektion59.Efter Fusarium oxysporum f undertrycktes även den MLP-liknande 423-genen i resistenta groddar från vanliga bönor.cn.Böninfektion 60.
Andra medlemmar av PR-10-familjen som identifierades i vår RNA-seq-studie var LlR18A- och LlR18B-generna som svar på uppreglering, såväl som den uppreglerade (1 gen) eller nedreglerade (3 gener) genen för lipidöverföringsproteinet DIR1..Dessutom lyfter WGCNA fram LlR18B-genen som ett nav i denna modul, som är mycket mottaglig för vaccination och bär flera skyddande responsgener.LlR18A- och LlR18B-generna inducerades i gula lupinblad som svar på patogena bakterier, såväl som i NLL-stammar efter inokulering av D. toxica, medan rishomologen för dessa gener, RSOsPR10, snabbt inducerades av en svampinfektion som antagligen var involverad i den icke-specifika signalvägen för jasmonsyragenen 532, IR, 532,6, IR. id-transportproteiner som krävs för uppkomsten av systemisk förvärvad resistens (SAR).Med utvecklingen av skyddsreaktioner transporteras DIR1-proteinet från infektionsfokus genom floemet för att inducera SAR i avlägsna organ.Intressant nog inducerades TanjilG_02313 DIR1-genen signifikant vid den första tidpunkten i raderna 84A:476 och Population 22660, men antraknosresistens utvecklades framgångsrikt endast i linje 84A:476.Detta kan indikera viss subfunktionalisering av DIR1-genen i NLL, eftersom de återstående tre homologerna svarade på ympning endast i 83A:476-linjen vid 6 hpi, och detta svar riktades nedåt.
I vår studie var de vanligaste komponenterna som motsvarar den biologiska processen som kallas "GO:0055114 Redoxprocess" cytokrom P450-protein, peroxidas, linolsyra 9S-/13S-lipoxygenas och 1-aminocyklopropan-1-karboxylsyraoxidas.Dessutom definierar vår WGCNA HSFA4a-homologen som ett nav som bär moduler som Lanr1-resistensgenkandidaten TanjilG_05042.HSFA4a är en komponent i den redoxberoende regleringen av nukleär transkription i växter.
Cytokrom P450-proteiner är oxidoreduktaser som katalyserar NADPH och/eller O2-beroende hydroxyleringsreaktioner i primär och sekundär metabolism, inklusive metabolismen av xenobiotika, såväl som hormoner, fettsyror, steroler, cellväggskomponenter, biopolymerer och biosyntesen av skyddande föreningar 69. I vår P50-studie var cytokrom-inabiliteten reducerad från växten. 2 (faldig förändring) till 5,7 på grund av ett stort antal förändrade homologer (37) och skillnader i svarsmönster mellan specifika gener, vilket återspeglar en uppåtgående revision..Att endast använda RNA-sekv-data för att belysa den förmodade biologiska funktionen hos NLL-generna i en så stor proteinsuperfamilj skulle vara mycket spekulativt.Det är dock värt att notera att vissa cytokrom P450-gener är associerade med ökad resistens mot patogena svampar eller bakterier, inklusive ett bidrag till allergiska reaktioner69,70,71.
Klass III peroxidaser är multifunktionella växtenzymer involverade i ett brett spektrum av metaboliska processer under växttillväxt och utveckling, såväl som som svar på miljöpåfrestningar som salthalt, torka, hög ljusintensitet och patogenattacker72.Peroxidaser är involverade i interaktionen av flera växtarter med Anthracis, inklusive Stylosanthes humilis och C. gloeosporioides, Lens culinaris och C. truncatum, Phaseolus vulgaris och C. lindemuthianum, Cucumis sativus och C. lagenarium73,74,75,76.Svaret är mycket snabbt, ibland till och med vid 4 HPI, innan svampen penetrerar växtvävnaden73.Peroxidasgenen svarade också på D. toxica NLL-ympning.Utöver deras typiska funktioner för att reglera oxidativ explosion eller eliminera oxidativ stress, kan peroxidaser störa patogentillväxt genom att skapa fysiska barriärer baserade på cellväggsförstärkning under lignifiering, subenhet eller tvärbindning av specifika föreningar.Denna funktion kan tillskrivas i silico till TanjilG_03329-genen som kodar för ett förmodat ligninbildande anjonperoxidas som var signifikant uppreglerat i vår studie i den 83A:476-resistenta linjen vid 6 HPI, men inte i andra stammar och tidpunkter som inte svarade.
9S-/13S-lipoxygenas av linolsyra är det första steget i den oxidativa vägen för lipidbiosyntes78.Produkterna från denna väg har flera funktioner i växtförsvar, inklusive cellväggsförstärkning genom bildning av kallos- och pektinavlagringar, och reglering av oxidativ stress genom produktion av reaktiva syrearter79,80,81,82,83.I den aktuella studien förändrades uttrycket av linolsyra 9S-/13S-lipoxygenas i alla stammar, men i den mottagliga populationen 22660 rådde uppreglering vid olika tidpunkter, medan det i stammar som bär resistent Lanr1 och AnMan-allelen betonar diversifieringen av det oxylipintypiska skiktet i reaktionen mellan dessa genotyper.
1-aminocyklopropan-1-karboxylatoxidas (ACO) homologen var signifikant uppreglerad (9 gener) eller nedreglerad (2 gener) när den inokulerades med lupin.Med två undantag inträffade alla dessa svar vid 6 hk.vid 83A:476.Den enzymatiska reaktionen som medieras av ACO-proteiner är det hastighetsbegränsande steget i etenproduktion och är därför starkt reglerad84.Etylen är ett växthormon som spelar en mängd olika roller för att reglera växtutveckling och svar på abiotiska och biotiska stressförhållanden.Induktionen av ACO-transkription och aktivering av etylensignalvägen är involverade i att öka motståndet hos ris mot den hemibiotrofa svampen oryzae oryzae genom att reglera produktionen av reaktiva syrearter och fytoalexiner.En mycket liknande bladinfektionsprocess som hittats mellan M. oryzae och C. lupini88,89, mot bakgrund av en betydande uppreglering av ACO-homologer i 83A:476-linjen som rapporterats i denna studie, förändrar möjligheten att ge resistens mot NLL antraknosetylen ett centralt signalsteg i molekylära vägar.
I den aktuella studien observerades storskalig undertryckning av många gener associerade med fotosyntes vid 6 hpi i 83A:476 och vid 48 hpi i Mandeloop och 22660-populationen.Omfattningen och utvecklingen av dessa förändringar är proportionell mot nivån.Antraknosresistens observerades i detta experiment.Nyligen har stark och tidig repression av fotosyntesrelaterade transkript rapporterats i flera modeller av växt-patogen-interaktioner, inklusive patogena bakterier och svampar.Hastighet (från 2 HPI i vissa interaktioner) och globalt undertryckande av gener associerade med fotosyntes som svar på infektion kan utlösa växtimmunitet baserat på utplaceringen av reaktiva syrearter och deras interaktion med salicylsyravägen för att mediera allergiska reaktioner 90,94.
Sammanfattningsvis inkluderar försvarsresponsmekanismer som föreslagits för den mest resistenta härstamningen (83A:476) snabb patogenigenkänning av R-genen (förmodligen TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) och allergisk respons-medierad salicylsyra- och etensignalering, följt av etablering av långdistans-SAR.verkan stöds av DIR-1-proteinet.Det bör noteras att den biotrofa perioden för C. lupini-infektion är mycket kort (cirka 2 dagar), följt av nekrotisk tillväxt95.Övergången mellan dessa stadier kan vara associerad med nekros och uttryck av eten-inducerbara proteiner som fungerar som triggers för överkänslighetsreaktioner i värdväxter.Därför är tidsfönstret för framgångsrik fångst av C. lupini i det biotrofiska skedet mycket snävt.Omprogrammeringen av gener associerade med redox och fotosyntes som observerats i 83A:476 vid 6 hpi överensstämmer med utvecklingen av svamphyfer och förebådar utvecklingen av ett framgångsrikt skyddssvar i det biotrofiska stadiet.De transkriptomiska svaren från Mandelup och 22660-populationen kan vara för försenade för att fånga svampen innan övergången till nekrotisk tillväxt, men Mandelup kan vara mer effektiv än 22660-populationen eftersom den relativt snabba regleringen av PR-10-proteinet främjar horisontell resistens.
ETI, som drivs av den kanoniska R-genen, verkar vara en vanlig mekanism för bönresistens mot antraknos.Således, i modellbaljväxten Medicago truncatula, förlänas resistens mot antraknos av RCT1-genen, en medlem av TIR-NBS-LRR97 växt R-genklassen.Denna gen ger också bredspektrat antraknosresistens i alfalfa när den överförs till mottagliga växter.I den vanliga bönan (P. vulgaris) har mer än två dussin antraknosresistensgener hittills identifierats.Vissa av dessa gener finns i regioner som saknar några kanoniska R-gener, men många andra är belägna vid kanterna av kromosomer som bär NBS-LRR-genklustret, inklusive TIR-NBS-LRRs99.Den genomomfattande SSR-studien bekräftade också sambandet mellan NBS-LRR-genen och antraknosresistens i den vanliga bönan.Den kanoniska R-genen hittades också i den genomiska regionen som bär det huvudsakliga antraknosresistenslokuset i vit lupin 101.
Vårt arbete visar att en omedelbar resistensreaktion, aktiverad i ett tidigt skede av växtinfektion (helst senast 12 hpi), effektivt skyddar smalbladig lupin från antraknos orsakad av den patogena svampen Collelotrichum lupini.Med hjälp av sekvensering med hög genomströmning visade vi differentiella uttrycksprofiler för antraknosresistensgener i NLL-växter förmedlade av Lanr1- och AnMan-resistensgener.Framgångsrikt försvar innebär att noggrant utforma generna för proteiner som är involverade i redox, fotosyntes och patogenes inom några timmar efter växtens första kontakt med en patogen.Liknande skyddsreaktioner, men försenade i tid, är mycket mindre effektiva för att skydda växter från sjukdomar.Mjältbrandsresistens medierad av Lanr1-genen liknar det typiska snabba svaret av R-genen (effektorutlöst immunitet), medan AnMan-genen med största sannolikhet ger ett horisontellt svar (immunitet utlöst av ett mikrobassocierat molekylärt mönster), vilket ger en måttlig nivå av hållbarhet.
De 215 NLL-linjerna som användes för att screena för antraknosmarkörer bestod av 74 kultivarer, 60 linjer erhållna genom korsning eller förädling, 5 mutanter och 76 vilda eller ursprungliga bakterieplasmer.Linjerna kom från 17 länder, främst från Polen (58), Spanien (47), Tyskland (27), Australien (26), Ryssland (19), Vitryssland (7), Italien (5) och andra linjer.från 10 länder.Setet innehåller också referensresistenta linjer: 83A:476, Tanjil, Wonga som bär Lanr1-allelen och Mandelup som bär AnMan-allelen.Linjerna erhölls från European Lupin Genetic Resource Database som underhålls av Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polen (tilläggstabell S1).
Växter odlades under kontrollerade förhållanden (fotoperiod 16 timmar, temperatur 25°C under dagen och 18°C ​​på natten).Två biologiska replikat analyserades.DNA isolerades från tre veckor gamla löv med användning av DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) enligt protokollet.Kvaliteten och koncentrationen av det isolerade DNA:t utvärderades med spektrofotometriska metoder (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).AnManM1-markören som markerar antraknosresistensgenen AnMan (härledd från cv. Mandelup) och markörerna Anseq3 och Anseq4 som flankerar genen Lanr1 (härledd från cv. Tanjil) analyserades 11,26,28.Homozygoter för den resistenta allelen poängsattes som "1", känsliga - som "0", och heterozygoter - som 0,5.
Baserat på resultaten av screening för markörer AnManM1, AnSeq3 och AnSeq4 och tillgången på frön för slutliga uppföljningsexperiment, valdes 50 NLL-linjer ut för fenotypning av antraknosresistens.Analysen utfördes i duplikat i ett datorstyrt växthus med en 14 timmars fotoperiod med ett temperaturområde på 22°C under dagen och 19°C på natten.Frön skrapas (skär av fröskalet på motsatt sida av embryot med ett vasst blad) före sådd för att förhindra att fröet vilar på grund av att fröskalet är för hårt och för att säkerställa jämn groning.Plantorna odlades i krukor (11 × 11 × 21 cm) med steril jord (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warszawa, Polen).Inokulering utfördes med Colletotrichum lupini Col-08-stammen, odlad 1999 från stjälkar av smalbladiga lupinplantor som odlats på ett fält i Verzhenitsa, Storpolen (52° 27′ 42″ N 17° 04′ E 05″).Skaffa ett område.Isolaten odlades i SNA-medium vid 20°C under svart ljus under 21 dagar för att inducera sporulering.Fyra veckor efter sådd, när plantorna hade nått 4-6-bladsstadiet, genomfördes ympningen genom besprutning med en suspension av konidier i en koncentration av 0,5 x 106 konidier per ml.Efter ympning hölls plantorna mörkt i 24 timmar vid en luftfuktighet på ca 98% och en temperatur på 25°C för att underlätta groningen av konidier och infektionsprocessen.Plantorna odlades sedan under en 14-timmars fotoperiod vid 22°C dag/19°C natt och 70% fuktighet.Sjukdomspoängen gjordes 22 dagar efter inokulering och varierade från 0 (immun) till 9 (mycket mottaglig) beroende på närvaron eller frånvaron av nekrotiska lesioner på stjälkar och blad.Dessutom, efter poängsättning, mättes vikten av plantorna.Relationer mellan markörgenotyper och sjukdomsfenotyper beräknades som punkt två-sekvenskorrelationer (frånvaro av heterozygota markörer i uppsättningen av linjer för analys av antraknosresistensfenotypen).