Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza kwamba utumie kivinjari kilichosasishwa (au zima hali ya uoanifu katika Internet Explorer).Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Utumbo wa binadamu mofgenesis huanzisha vipengele vya crypt-villus ya microarchitecture ya 3D epithelial na shirika la anga. Muundo huu wa kipekee unahitajika ili kudumisha homeostasis ya utumbo kwa kulinda niche ya seli ya shina katika crypt ya basal kutoka kwa antijeni za microbial exogenous na metabolites zao. Kwa hivyo, kuunda upya miundo ya epithelial ya 3D ni muhimu kwa ajili ya ujenzi wa miundo ya utumbo wa ndani. Kwa hakika, utumbo wa kikaboni wa mimetic kwenye chip unaweza kuibua mofojenesisi ya 3D ya papo hapo ya epitheliamu ya utumbo kwa kuimarishwa kwa utendakazi wa kifiziolojia na mitambo ya kibayolojia kutoa itifaki inayoweza kuzaa tena. morphojenesisi kwenye utumbo kwenye chip ya microfluidic na vile vile kwenye chip ya mseto iliyopachikwa Transwell. Tunaelezea mbinu za kina za utengenezaji wa kifaa, uundaji wa seli za Caco-2 au seli za epithelial za matumbo katika mipangilio ya kawaida na vile vile kwenye jukwaa la microfluidic, uingizaji wa mofogenesis ya 3D, na uwekaji wa sifa za itifaki ya 3D iliyoanzishwa. ya usanifu mdogo wa utumbo unaofanya kazi kwa kudhibiti mtiririko wa maji ya basolateral kwa siku 5. Mbinu yetu ya in vitro morphogenesis hutumia mkazo wa kisaikolojia na mwendo wa kimakenika na hauhitaji uhandisi changamano wa seli au upotoshaji, ambao unaweza kushinda mbinu zingine zilizopo. kwa matumizi ya matibabu, kliniki na dawa.
Majaribio yanaonyesha kuwa seli za utumbo wa Caco-2 zilizokuzwa katika gut-on-a-chip1,2,3,4,5 au bilayer microfluidic device6,7 zinaweza kupitia mofogenesis ya 3D in vitro bila ufahamu wazi wa utaratibu msingi. epithelial morphogenesis in vitro, ambayo imeonyeshwa na Caco-2 na organoids ya matumbo inayotokana na mgonjwa. Seli za epithelial ziliidhinishwa. Katika utafiti huu, tuliangazia hasa uzalishaji wa seli na usambazaji wa mkusanyiko wa mpinzani hodari wa Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), katika gut-on-a-chip na vifaa vya microfluidic vilivyorekebishwa vilivyo na viingilio vya Transwell, vinavyoitwa "Chip Hybrid". protini 1, au Soggy-1) iliyofichwa kwenye utumbo wa chip huzuia mofojenesisi au kuvuruga safu ya epithelial ya 3D iliyopangwa tayari , na kupendekeza kuwa mkazo pinzani wakati wa utamaduni huwajibika kwa mofogenesis ya matumbo katika vitro. katika sehemu ya msingi kwa kusukuma maji amilifu (kwa mfano, kwenye gut-on-a-chip au majukwaa ya mseto-on-a-chip) au uenezaji . Mitandao ya msingi (km, kutoka kwa Transwell kuingizwa kwenye hifadhi kubwa za msingi kwenye visima).
Katika itifaki hii, tunatoa mbinu ya kina ya kutengeneza vifaa vidogo vya gut-on-a-chip na chipsi mseto zinazoweza kuingizwa (hatua 1-5) ili kukuza seli za epithelial za matumbo kwenye utando wa vinyweleo wenye msingi wa polydimethylsiloxane (PDMS) (hatua 6A, 7A, 8, 9) au utando wa polyester 6, 7 9) na mofojenesisi ya 3D katika vitro (hatua ya 10). Pia tulitambua vipengele vya seli na molekuli vinavyoonyesha histogenesis maalum ya tishu na upambanuzi wa seli unaotegemea ukoo kwa kutumia mbinu nyingi za kupiga picha (hatua 11-24). pamoja na maelezo ya kiufundi ikiwa ni pamoja na urekebishaji wa uso wa utando wa vinyweleo, uundaji wa tabaka 2 za 2D, na biokemikali ya matumbo na Uzalishaji wa microenvironment.in vitro.Ili kushawishi mofojenesisi ya 3D kutoka kwa tabaka moja za epithelial za 2D, tuliondoa wapinzani wa mofojeni katika aina zote mbili za kitamaduni kwa kutiririsha wa kati ndani ya uwakilishi wa upande wa nje wa uwakilishi wa kitamaduni wa upande wa nje. safu ya epithelial ya 3D inayoweza kurejeshwa ambayo inaweza kutumika kuiga ukuaji wa epithelial unaotegemea mofojeni, tamaduni shirikishi za mwenyeji-microbiome za longitudinal, maambukizi ya pathojeni, jeraha la kuvimba, kutofanya kazi vizuri kwa kizuizi cha epithelial, na matibabu yanayotegemea probiotic Mfano.influences.
Itifaki yetu inaweza kuwa na manufaa kwa wanasayansi mbalimbali katika msingi (kwa mfano, baiolojia ya mucosa ya matumbo, baiolojia ya seli shina, na baiolojia ya ukuzaji) na utafiti unaotumika (kwa mfano, upimaji wa awali wa dawa, muundo wa magonjwa, uhandisi wa tishu, na ugonjwa wa tumbo) matokeo makubwa. mkakati wa kiufundi unaweza kusambazwa kwa watazamaji wanaosoma mienendo ya uonyeshaji wa seli wakati wa ukuaji wa matumbo, kuzaliwa upya au homeostasis .Aidha, itifaki yetu ni muhimu kwa ajili ya kuhoji maambukizi chini ya mawakala mbalimbali wa kuambukiza kama vile Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium Salmonebrie Vifficilla, Clostridium Salmonebrie Vifficilla au Tymule. Watazamaji wa ugonjwa wa ugonjwa na pathogenesis pia ni muhimu.Matumizi ya mfumo wa microfiziolojia ya matumbo ya on-chip yanaweza kuruhusu utamaduni wa longitudinal 10 na tathmini inayofuata ya ulinzi wa mwenyeji, majibu ya kinga na ukarabati wa majeraha yanayohusiana na pathojeni katika njia ya utumbo (GI) 11 .Matatizo mengine ya GIcekylit yanayohusiana na ugonjwa wa Croceky, le kolitis ya kidonda, ugonjwa wa pouchitis, au ugonjwa wa utumbo unaowaka inaweza kuigwa wakati tabaka za 3D za epithelial za matumbo zinatayarishwa kwa kutumia tabaka za matumbo za 3D za matumbo, magonjwa haya ni pamoja na atrophy mbaya, ufupisho wa crypt, uharibifu wa mucosal, au kizuizi cha epithelial iliyoharibika. ugumu wa hali ya juu wa mazingira ya ugonjwa, wasomaji wanaweza kuzingatia kuongeza aina za seli zinazohusiana na ugonjwa, kama vile seli za damu za pembeni za nyuklia (PBMCs), kwa miundo iliyo na miundo midogo ya 3D ya matumbo ya villus-crypt. seli za kinga za tishu mahususi, 5.
Kwa kuwa muundo mdogo wa epithelial wa 3D unaweza kusasishwa na kuonyeshwa bila mchakato wa kugawanya, watazamaji wanaofanyia kazi nakala za anga na picha zenye azimio la juu au azimio kuu wanaweza kupendezwa na upangaji wetu wa mienendo ya anga ya jeni na protini kwenye niche za epithelial. Kuvutiwa na teknolojia.Mwitikio wa vichocheo vya vijidudu au kinga. Zaidi ya hayo, longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 inayoratibu homeostasis ya matumbo inaweza kuanzishwa katika safu ya 3D ya mucosa ya utumbo kwa kushirikiana spishi za vijidudu mbalimbali, jumuiya za vijidudu au microbiota ya kinyesi, hasa kwenye gut-a. Mtazamo huu unavutia hasa hadhira inayosoma elimu ya kinga ya mucosal, gastroenterology, microbiome ya binadamu, culturomics na microbiology ya kimatibabu inayotafuta kukuza mikrobiota ya matumbo ambayo haikuwa imetungwa kwenye maabara. Iwapo itifaki yetu ya in vitro morphogenesis inaweza kubadilishwa kwa miundo ya utamaduni scalable, kama vile sahani 43, 2 vizuri 46 au 2 kujaza sehemu za msingi, itifaki pia inaweza kusambazwa kwa wale wanaotengeneza uchunguzi wa dawa, biomedical Au upitishaji wa juu au majukwaa ya uthibitishaji kwa tasnia ya chakula.Kama uthibitisho wa kanuni, hivi majuzi tulionyesha uwezekano wa kuongeza mfumo wa mofogenesis wa kiwango cha juu cha kuongezeka kwa muundo wa chip 24, ogani nyingi. ya kibiashara16,17,18. Kwa hivyo, uthibitisho wa mbinu yetu ya in vitro morphogenesis unaweza kuharakishwa na uwezekano wa kupitishwa na maabara nyingi za utafiti, tasnia au serikali na mashirika ya udhibiti ili kuelewa upangaji upya wa seli za in vitro gut morphogenesis katika kiwango cha transcriptomic kupima dawa au matibabu ya kibayolojia. miundo ya chombo-kwenye-chip ya kibiashara ili kutathmini uwezekano wa kuzaliana kwa mchakato wa mofojenesisi ya utumbo.
Idadi ndogo ya mifano ya majaribio inayohusiana na binadamu imetumiwa kuchunguza mofogenesis ya epithelial ya matumbo, hasa kutokana na ukosefu wa itifaki zinazoweza kutekelezeka ili kushawishi 3D morphogenesis in vitro.Kwa hakika, ujuzi mwingi wa sasa kuhusu mofogenesis ya utumbo unatokana na masomo ya wanyama (kwa mfano, zebrafish20, mice21 au kuku, jinsi gani wanaweza kuwa na labor22). ya kutiliwa shaka, na muhimu zaidi, haibainishi kwa usahihi michakato ya maendeleo ya binadamu. Miundo hii pia ni mdogo sana katika uwezo wao wa kujaribiwa kwa njia nyingi inayoweza kupunguzwa. Kwa hiyo, itifaki yetu ya kuzalisha upya miundo ya tishu za 3D katika vitro inazidi utendakazi katika mifano ya wanyama wa vivo pamoja na miundo mingine ya kitamaduni ya seli tuli ya 2D. Kama ilivyoelezwa hapo awali, ilitumia utumiaji wa muundo tofauti wa 3D wa eneo seli katika mhimili wa crypt-villus katika kukabiliana na vichocheo mbalimbali vya mucosal au kinga. Tabaka za epithelial za 3D zinaweza kutoa nafasi ya kujifunza jinsi seli za microbial zinashindana kuunda niches za anga na mageuzi ya kiikolojia kwa kukabiliana na mambo ya mwenyeji (kwa mfano, tabaka za ndani dhidi ya nje ya kamasi, usiri wa IgA na antimicrobial peptides huweza kuelewa jinsi peptidi za antimicrobial zinaweza kuruhusu usther3D kuelewa). gut microbiota huunda jumuiya zake na huzalisha kwa pamoja metabolites za microbial (kwa mfano, asidi ya mafuta ya mnyororo mfupi) ambayo hutengeneza shirika la seli na niches za seli za shina katika crypts ya basal. Vipengele hivi vinaweza kuonyeshwa tu wakati tabaka za epithelial za 3D zinapoanzishwa katika vitro.
Mbali na njia yetu ya kuunda miundo ya epithelial ya matumbo ya 3D, kuna njia kadhaa za in vitro.Utamaduni wa organoid wa matumbo ni mbinu ya kisasa ya uhandisi wa tishu kulingana na upandaji wa seli za shina za matumbo chini ya hali maalum ya mofojeni23,24,25. lumen imefungwa ndani ya organoid na, kwa hiyo, kuanzishwa kwa vipengele vya mwanga kama vile seli za microbial au antijeni za nje ni mdogo. Upatikanaji wa lumens za organoid unaweza kuboreshwa kwa kutumia kidude kidogo,26,27 lakini njia hii ni vamizi na inahitaji nguvukazi nyingi na inahitaji ujuzi maalumu ili kufanya kazi.Zaidi ya hayo, tamaduni za kitamaduni za oganoid zinazodumishwa katika kiunzi cha hidrojeli chini ya hali tuli haziakisi kwa usahihi kazi katika biomechanics ya vivo.
Mbinu nyinginezo zinazotumiwa na vikundi kadhaa vya utafiti hutumia kiunzi cha hidrojeli cha 3D kilichopangwa awali kuiga muundo wa epithelial ya utumbo kwa kutengeneza chembechembe za utumbo wa binadamu zilizojitenga kwenye uso wa jeli. Tengeneza viunzi vya haidrojeli kwa kutumia 3D-iliyochapishwa, milled ndogo, au lithographically fabricated molds self-iliyopangwa. mikunjo ya mofojeni inayohusika kisaikolojia, kuanzisha uwiano wa hali ya juu muundo wa epithelial na mseto wa stroma-epithelial kwa kujumuisha seli za stromal kwenye kiunzi.Hata hivyo, asili ya kiunzi kilichoundwa mapema inaweza kuzuia uonyeshaji wa mchakato wa hiari wa mofojenetiki yenyewe.Miundo hii pia haitoi chembe za utiririko wa mwanga, chini ya mkazo wa kiowevu, au mkazo wa chini wa mkazo wa kiowevu. morfogenesis na kupata kazi ya kisaikolojia.Utafiti mwingine wa hivi majuzi ulitumia kiunzi cha hidrojeli katika jukwaa la microfluidic na miundo ya epithelial ya matumbo yenye muundo kwa kutumia mbinu za leza.Oganoidi za matumbo ya panya hufuata muundo uliowekwa kuunda miundo ya matumbo, na mtiririko wa maji ya intraluminal unaweza kubadilishwa tena kwa kutumia moduli hii ya microfonojeni. wala haijumuishi mienendo ya kimechanobiolojia ya utumbo. Mbinu za uchapishaji za 3D kutoka kwa kundi moja ziliweza kuunda mirija midogo ya matumbo na michakato ya hiari ya mofojenetiki. Licha ya uundaji tata wa sehemu tofauti za matumbo ndani ya bomba, mtindo huu pia hauna mtiririko wa maji ya mwanga na deformation ya mitambo. Zaidi ya hayo, utendakazi wa mfano unaweza kuwa mdogo, hasa baada ya hali ya kuingiliana kwa seli, katika majaribio ya bioprinting kukamilika. itifaki inayopendekezwa hutoa mofojenesisi ya matumbo ya papo hapo, mkazo wa kifiziolojia wa mkataji, mitambo ya kibayolojia inayoiga utembeaji wa matumbo, ufikiaji wa sehemu huru za apical na msingi, na kuunda upya mazingira changamano ya kibayolojia ya modularity. Kwa hivyo, itifaki yetu ya 3D morphogenesis ya in vitro inaweza kutoa mbinu inayosaidia kushinda changamoto zilizopo.
Itifaki yetu inaangazia kikamilifu mofojenesisi ya epithelial ya 3D, ikiwa na seli za epithelial pekee katika utamaduni na hakuna aina nyingine za seli zinazozunguka kama vile seli za mesenchymal, seli za endothelial, na seli za kinga. gut-on-a-chip na mseto-on-a-chip huturuhusu kuunda upya safu ya epithelial ya 3D isiyobadilika, matatizo ya ziada ya kibayolojia kama vile mwingiliano wa epithelial-mesenchymal33,34, extracellular Matrix (ECM) utuaji 35 na, katika muundo wetu, vipengele vya crypt-villus ambavyo huwasilisha seli za shina zinazozingatiwa kuwa seli za fiche. fibroblasts) katika mesenchyme huwa na jukumu muhimu katika utengenezaji wa protini za ECM na udhibiti wa mofogenesis ya matumbo katika vivo35,37,38.Ongezeko la seli za mesenchymal kwenye kielelezo chetu kuliimarisha mchakato wa mofojenetiki na ufanisi wa kuambatanisha seli. Safu ya mwisho (yaani, capilari au lymphatics) ina jukumu muhimu katika udhibiti wa seli ya 4 na recru3 ya chembe. mazingira madogo.Aidha, vipengele vya vasculature vinavyoweza kuunganishwa kati ya miundo ya tishu ni sharti miundo ya tishu inapoundwa ili kuonyesha mwingiliano wa viungo vingi. Kwa hiyo, seli za mwisho zinaweza kuhitaji kujumuishwa ili kuiga vipengele sahihi zaidi vya kisaikolojia na azimio la kiwango cha chombo. Seli za kinga zinazotokana na mgonjwa pia ni muhimu kwa kuonyesha majibu ya kinga ya ndani ya mwili, antijeni ya antijeni ya ndani na kukabiliana na mabadiliko ya tishu za tapeki. kinga katika muktadha wa kuiga ugonjwa wa matumbo.
Matumizi ya chip mseto ni ya moja kwa moja kuliko gut-on-a-chip kwa sababu usanidi wa kifaa ni rahisi zaidi na utumiaji wa vichochezi vya Transwell huruhusu utamaduni hatari wa epithelium ya matumbo.Hata hivyo, viingilio vya Transwell vinavyopatikana kibiashara vyenye utando wa poliesta si nyumbufu na haviwezi kuiga mienendo inayofanana na peristaltic. Zaidi ya hayo, sehemu ya mseto ya chip ilibaki kwenye kituo cha mseto cha mseto kilichowekwa kwenye kituo cha mkazo cha kuwekea chip. upande wa apical. Kwa wazi, sifa tuli katika sehemu ya apical haziwezesha utamaduni wa muda mrefu wa bakteria katika chip mseto. Ingawa tunaweza kushawishi kwa uthabiti mofojenesisi ya 3D katika vichocheo vya Transwell tunapotumia chip mseto, uhaba wa mitambo ya kibayolojia na mtiririko wa kiowevu cha apical unaweza kupunguza uwezekano wa majukwaa ya mseto yanayoweza kutumika.
Usanifu kamili wa mhimili wa crypt-villus ya binadamu katika tamaduni za gut-on-a-chip na mseto-on-a-chip haujaanzishwa kikamilifu. Kwa kuwa mofojenesisi huanza kutoka kwa safu ya epithelial, usanifu midogo wa 3D hautoi ulinganifu wa kimofolojia na siri katika vivo. Epithelium ya 3D, sehemu za siri na mbovu hazikuwekwa mipaka kwa uwazi. Ijapokuwa njia za juu za juu kwenye chip huongoza hadi kuongezeka kwa urefu wa epithelium iliyobuniwa kidogo, urefu wa juu bado ni ~ 300–400 µm. Kina halisi cha matumbo ya binadamu katika utumbo mwembamba na mkubwa, ~1mµmµmµµµ kwa kina ni ~1mµmµµµµµ kwa kiasi na kimo cha utumbo mwembamba ni ~600 µm41.
Kutoka kwa mtazamo wa picha, picha ya in situ super-resolution ya miundo midogo ya 3D inaweza kuwa mdogo kwa utumbo kwenye chip, kwa kuwa umbali unaohitajika wa kufanya kazi kutoka kwa lensi ya lengo hadi safu ya epithelial ni kwa mpangilio wa milimita chache. PDMS.Zaidi ya hayo, kwa kuwa uundaji wa safu-kwa-safu ya utumbo kwenye chip unahusisha kushikamana kwa kudumu kati ya kila safu, ni vigumu sana kufungua au kuondoa safu ya juu ili kuchunguza muundo wa uso wa safu ya epithelial.Kwa mfano, kwa kutumia darubini ya elektroni ya skanning (SEM).
Hali ya haidrofobu ya PDMS imekuwa sababu ya kikwazo katika tafiti zenye msingi wa microfluidic zinazoshughulikia molekuli ndogo za haidrofobu, kwa kuwa PDMS inaweza kutangaza kwa njia isiyo maalum molekuli kama hizo za haidrofobu. Njia mbadala za PDMS zinaweza kuzingatiwa na nyenzo zingine za polimeri. glycol) 43 ) inaweza kuzingatiwa ili kupunguza adsorption ya molekuli haidrofobu.
Hatimaye, mbinu yetu haijabainishwa vyema katika suala la kutoa uchunguzi wa hali ya juu au jukwaa la majaribio la kirafiki la watumiaji wa "saizi moja". Itifaki ya sasa inahitaji pampu ya sindano kwa kila kifaa kidogo, ambayo inachukua nafasi katika incubator ya CO2 na kuzuia majaribio makubwa. Kizuizi hiki kinaweza kuboreshwa kwa kiasi kikubwa na muundo wa 94well, kiutamaduni wa 94well, kiutamaduni 24well, au 64well 384-vizuri vya kuingiza vinyweleo vinavyoruhusu kujaza tena na kuondolewa kwa vyombo vya habari vya msingi).
Ili kushawishi mofojenesisi ya 3D ya epitheliamu ya matumbo ya binadamu katika vitro, tulitumia kifaa cha utumbo cha microfluidic chenye mikondo midogo miwili sambamba na utando nyororo wa upenyo katikati ili kuunda kiolesura cha lumen-capilari. Pia tunaonyesha matumizi ya kifaa chenye microfluidic chenye njia moja (chipsi mseto) ambayo hutoa mtiririko wa kila mara kwenye sehemu ya nyuma ya sehemu ya juu. katika majukwaa yote mawili, mofojenesisi ya seli mbalimbali za epithelial ya matumbo ya binadamu inaweza kuonyeshwa kwa kutumia upotoshaji wa mwelekeo wa mtiririko ili kuondoa wapinzani wa morfojeni kutoka kwa sehemu ya msingi. Utaratibu mzima wa majaribio (Mchoro 1) una sehemu tano: (i) uundaji mdogo wa chip ya matumbo au mseto wa Transwellable (5) mseto wa 1 seli za epithelial za matumbo (seli za Caco-2) au organoids ya matumbo ya binadamu; masanduku 2-5), (iii) utamaduni wa seli za epithelial za matumbo kwenye chipsi za matumbo au chipsi mseto (hatua 6-9), (iv) uingizaji wa 3D morphogenesis in vitro (hatua ya 10) na (v) ) ili kubainisha muundo mdogo wa epithelial wa 3D (hatua 11-24). in vitro morfogenesis kwa kulinganisha mofojenesisi ya epithelial na udhibiti wa anga, wa muda, wa masharti, au wa utaratibu.
Tulitumia majukwaa mawili tofauti ya kitamaduni: gut-on-a-chip yenye chaneli zilizonyooka au chaneli zisizo na mstari zilizochanganyika, au chipsi mseto zilizo na vichocheo vya Transwell (TW) katika kifaa chenye microfluidic, kilichobuniwa kama ilivyoelezwa katika Kisanduku 1, na hatua ya 1-5."Utengenezaji wa Kifaa" unaonyesha hatua kuu za kutengeneza chip moja au chipu mseto." (Caco-2 au organoids ya matumbo ya binadamu) na utaratibu wa kitamaduni unaotumiwa katika itifaki hii."In vitro morphogenesis" inaonyesha hatua za jumla ambazo seli za epithelial zinazotokana na Caco-2 au oganoid hupandwa kwenye chip ya utumbo au kwenye vichocheo vya Transwell vya chipu mseto, ikifuatiwa na uwekaji wa mofojenesisi ya 3D na uundaji wa nambari ya kisanduku cha epitheli chini ya kila muundo wa nambari ya hatua. mshale.Matumizi yanatoa mifano ya jinsi tabaka za epithelial za matumbo zinaweza kutumika, kwa mfano, katika upambanuzi wa seli, tafiti za fiziolojia ya utumbo, uanzishaji wa mifumo ikolojia ya viumbe hai na uundaji wa magonjwa. Picha za Immunofluorescence katika "Utofauti wa Kiini" zinazoonyesha nuclei, F-actin na MUCd 3D kwenye safu ya 3D iliyoonyeshwa kwenye gundi ya MUC2 iliyoonyeshwa kwenye gundi. ishara ya chip.MUC2 iko kwenye seli za glasi na kamasi iliyofichwa kutoka kwenye uso wa mucosal. Picha za fluorescent katika Fiziolojia ya Utumbo zinaonyesha kamasi inayotolewa kwa kutia madoa kwa asidi ya sialic na mabaki ya N-acetylglucosamine kwa kutumia vijidudu vya ngano ya fluorescent agglutinin. Picha mbili zinazopishana katika "Mwakilishi wa Kilimo-Kilimo-shirika" matumbo kwenye chip.Jopo la kushoto linaonyesha utamaduni shirikishi wa E. koli inayoonyesha protini ya kijani ya fluorescent (GFP) yenye seli za epithelial za 3D Caco-2. Paneli ya kulia inaonyesha ujanibishaji wa GFP E. koli iliyokuzwa kwa ushirikiano wa 3D Caco-2 seli za epithelial, ikifuatiwa na chembe za immunofluoresce (Fseincleasece) ya Fseinclease (Fseinclease) ya nuru ya Fseinclease ya Diin. uundaji wa mfano unaonyesha afya dhidi ya utumbo unaovuja katika chipsi za uvimbe wa matumbo chini ya changamoto ya kisaikolojia na antijeni za bakteria (km, lipopolysaccharide, LPS) na seli za kinga (km, PBMC; kijani). Seli za Caco-2 ziliundwa ili kuanzisha safu ya epithelial ya 3D. Upau wa kipimo, 50 µsmabadiliko ya chini ya seli za "Differ". rejea.2. Oxford University Press; Imetolewa tena kwa idhini kutoka kwa Kumb.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" ilichukuliwa kwa ruhusa kutoka kwa ref.3. NAS; "Mfano wa Ugonjwa" uliochukuliwa kwa ruhusa kutoka kwa kumbukumbu.5. NAS.
Chips zote mbili za gut-on-chip na mseto zilibuniwa kwa kutumia nakala za PDMS ambazo zilitolewa kutoka kwa molds za silicon kwa lithography laini1,44 na kuchorwa na SU-8. Muundo wa mikondo midogo katika kila chip huamuliwa kwa kuzingatia hidrodynamics kama vile mkazo wa shear na shinikizo la hidrodynamic1,4,12.Muundo wa awali wa Database njia ndogo mbili zilizounganishwa sambamba zilizonyooka, zimebadilika na kuwa gut-on-a-chip (Data Iliyopanuliwa Kielelezo 1b) ambayo inajumuisha jozi ya njia ndogo zilizopinda ili kushawishi Kuongezeka kwa muda wa makazi ya maji, mwelekeo wa mtiririko usio na mstari, na ugeuzaji wa multiaxial wa seli za utamaduni (Kielelezo 2a-f) zinahitaji kuwa tata zaidi, wakati wa biocreated 12. gut-on-a-chips inaweza kuchaguliwa.Tumeonyesha kuwa Gut-Chip iliyochanganyikiwa pia hushawishi kwa nguvu mofojenesisi ya 3D katika muda sawa na kiwango sawa cha ukuaji wa epithelial ikilinganishwa na Gut-Chip asili, bila kujali aina ya seli iliyokuzwa. Kwa hivyo, ili kushawishi mofojenesisi ya 3D, muundo wa laini na changamano kwenye silicon ya gundi hubadilishana kwenye silicon. na mifumo ya SU-8 ilitoa vipengele hasi baada ya kubomoa (Mchoro 2a). Ili kutengeneza utumbo kwenye chip, safu ya juu ya PDMS iliyotayarishwa iliunganishwa kwa mtiririko kwa filamu ya PDMS yenye vinyweleo na kisha kuunganishwa na safu ya chini ya PDMS kwa kuunganisha kusikoweza kutenduliwa kwa kutumia dawa ya corona (Mchoro 2b-f) . vifaa vya microfluidic vya njia moja ambavyo vinaweza kuchukua vichochezi vya Transwell (Mchoro wa 2 na Data Iliyoongezwa Kielelezo 2). Mchakato wa kuunganisha unafanywa kwa kutibu nyuso za replica ya PDMS na glasi na plasma ya oksijeni au matibabu ya corona. Baada ya utiaji wa kifaa cha kitambaa kidogo kilichounganishwa kwenye bomba la silikoni, usanidi wa kifaa cha 3D epiliphonite ya epiliphoni ulikuwa tayari kutekeleza (Kielelezo 2g).
a, Mchoro wa kimkakati wa utayarishaji wa sehemu za PDMS kutoka kwa ukungu za silikoni zenye muundo wa SU-8. Suluhisho la PDMS ambalo halijatibiwa lilimwagwa kwenye ukungu wa silicon (kushoto), kuponywa kwa 60 °C (katikati) na kubomolewa (kulia).PDMS iliyobomolewa ilikatwa vipande vipande na kusafishwa kwa matumizi zaidi.b, Picha iliyotumiwa kwenye safu ya silicon. ukungu wa silikoni unaotumika kutengeneza utando wa vinyweleo vya PDMS.d, Msururu wa picha za sehemu ya juu na ya chini ya PDMS na kifaa cha utumbo kilichounganishwa kwenye chip.e, Mpangilio wa upangaji wa vipengele vya PDMS ya juu, ya utando na ya chini. njia ndogo ndogo zilizochanganyika na vyumba vya utupu.m., Kuweka utumbo kwenye chip kwa ajili ya utamaduni wa seli ndogo ndogo. Utumbo uliotengenezwa kwenye chip iliyounganishwa na bomba la silikoni na sirinji iliwekwa kwenye kifuniko. Kifaa cha chip kiliwekwa kwenye kifuniko cha sahani ya Petri ya mm 150 kwa usindikaji. Kifungashio cha chip cha Vishona hutumiwa kufunga silikoni ya mseto. uundaji na mofojenesisi ya 3D kwa kutumia chips mseto. Viingilio vya Transwell vilivyotayarishwa kwa kujitegemea kwa utamaduni wa 2D monolayers ya seli za epithelial za matumbo ziliingizwa kwenye chip cha mseto ili kushawishi mofogenesis ya 3D ya utumbo. Ya kati inapuuzwa kupitia njia ndogo chini ya safu ya seli iliyoanzishwa kwenye Transwell bar. Elsevier.
Katika itifaki hii, mstari wa seli ya Caco-2 na organoidi za matumbo zilitumika kama vyanzo vya epithelial (Mchoro 3a). Aina zote mbili za seli zilikuzwa kwa kujitegemea (Sanduku la 2 na Sanduku la 5) na kutumika kuzalisha njia ndogo zilizofunikwa na ECM za uwekaji wa on-chip au Transwell. Wakati seli zinaunganishwa (> 95% ya seli za cacocoid) (kati ya vifungu 10 na 50) katika chupa za T huvunwa ili kuandaa kusimamishwa kwa seli zilizotenganishwa kwa maji ya trypsinization (sanduku 2). Mishipa ya matumbo ya binadamu kutoka kwa biopsies ya matumbo au upasuaji wa upasuaji ilikuzwa katika nyumba za scaffold za Matrigel katika sahani za 24-visima ili kuunga mkono muundo wa microenvironment muhimu. R-spondin, na Noggin) na vipengele vya ukuaji vilivyotayarishwa kama ilivyoelezwa katika Kisanduku cha 3 viliongezewa kila siku nyingine hadi organoids kukua hadi ~ 500 µm kwa kipenyo. Organoids iliyokua kikamilifu huvunwa na kutenganishwa katika seli moja kwa ajili ya kupanda kwenye utumbo au kuingizwa kwa Transwell kwenye chip (Sanduku 5). Ugonjwa wa Crohn, saratani ya utumbo mpana, au mtoaji wa kawaida), eneo la kidonda (kwa mfano, kidonda dhidi ya eneo lisilo na vidonda) na eneo la utumbo kwenye njia ya utumbo (km, duodenum, jejunum, ileamu, cecum, koloni, au rektamu). Tunatoa itifaki iliyoboreshwa katika Kisanduku cha 5 kwa ajili ya ukolezi wa koloni za kawaida za koloni au koloni za koloni za koloni au rektamu. organoids ya matumbo.
a, Mtiririko wa kazi kwa ajili ya uingizaji wa mofogenesis ya gut katika chip ya gut.Caco-2 epithelium ya matumbo ya binadamu na organoids ya matumbo hutumiwa katika itifaki hii ili kuonyesha morphogenesis ya 3D. Seli za epithelial zilizotengwa zilipandwa kwenye kifaa kilichoandaliwa cha gut-on-a-chip (maandalizi ya chip). Mara tu seli zinapowekwa kwenye membrane (PDD) na kuunganishwa kwa membrane (PDD). siku ya 0 (D0), mtiririko wa apical (AP) huanzishwa na kudumishwa kwa siku 2 za kwanza (mtiririko, AP, D0-D2).Mtiririko wa Basolateral (BL) pia huanzishwa pamoja na mwendo wa kunyoosha wa mzunguko (kunyoosha, mtiririko, AP na BL) wakati monolayer kamili ya 2D inapoundwa.Utumbo wa 3D wa micromorphogenesis baada ya siku 5 ulitokea, utamaduni wa 3D wa mofogenesis baada ya siku 5 ulitokea. D5).Picha za utofautishaji wa awamu zinaonyesha mofolojia wakilishi ya seli za Caco-2 katika kila hatua ya majaribio au hatua ya wakati (grafu ya upau, 100 µm).Michoro minne ya mpangilio inayoonyesha misururu inayolingana ya mofojenesisi ya utumbo (juu kulia). Mishale iliyopigwa katika mpangilio inawakilisha mwelekeo wa mtiririko wa umajimaji.b, SEM ya picha ya Cacoli ya sehemu ya juu ya 3 iliyoidhinishwa. kipengee cha ndani kinachoangazia eneo lililokuzwa (kisanduku cheupe kilichopigwa) kinaonyesha microvilli iliyozalishwa upya kwenye safu ya 3D Caco-2 (kulia).c, Mtazamo wa mbele wa Mlalo wa Caco-2 3D iliyoanzishwa, claudin (ZO-1, nyekundu) na utando wa mpaka wa brashi unaoendelea ulioandikwa F-actin (kijani) na nuclei (bluu) mwonekano wa chembechembe za mwonekano wa kingamwili. chip.Mishale inayoelekeza kwenye mpangilio wa kati huonyesha eneo la ndege ya msingi kwa kila mwonekano wa mshikamano.d, Muda wa mabadiliko ya kimofolojia katika oganoidi zilizopandikizwa kwenye chip iliyopatikana kwa hadubini ya utofautishaji wa awamu katika siku ya 3, 7, 9, 11, na 13. Sehemu ya ndani (juu kulia) inaonyesha ukuzaji wa juu wa picha ya 3 iliyotolewa ya guICD au picha ndogo ya Dganoid iliyowekwa kwenye picha ndogo ya Dganoid ya guICD iliyoanzishwa. kwenye kipande kilichochukuliwa siku ya 7.f, picha za immunofluorescence zilizofunikwa zinazoonyesha alama za seli shina (LGR5; magenta), seli za goblet (MUC2; kijani), F-actin (kijivu) na nuclei (cyan) zinazokuzwa kwenye chips za utumbo kwa siku 3, mtawalia (Kushoto) na siku 13 (katikati) oganolidi pia huangazia safu ya epiguretende3. LGR5 inayoonyesha ishara bila kuashiria MUC2.Picha za Fluorescence zinazoonyesha muundo mdogo wa epithelial (kulia) wa epithelium ya oganoid ya 3D iliyoanzishwa kwenye utumbo kwenye chip kwa kutia madoa utando wa plasma na rangi ya CellMask (kulia) katika siku ya 13 ya utamaduni. Upau wa kipimo ni 50 μm isipokuwa ikiwa imeelezwa vinginevyo.b. Oxford University Press; c Imechukuliwa kwa idhini kutoka kwa Rejea.2. Oxford University Press; e na f ilichukuliwa kwa ruhusa kwa marejeleo.12 Chini ya Leseni ya Creative Commons CC BY 4.0.
Katika utumbo kwenye chip, ni muhimu kurekebisha uso wa hydrophobic wa membrane ya porous ya PDMS kwa mipako yenye mafanikio ya ECM. Katika itifaki hii, tunatumia mbinu mbili tofauti za kurekebisha hydrophobicity ya membrane ya PDMS. PDMS membrane. seli zimeunganishwa, utamaduni wa seli za microfluidic huanza kwa kunyunyiza tu kati ndani ya microchannel ya juu hadi seli zitengeneze monolayer kamili, wakati microchannel ya chini inashikilia hali ya tuli.Njia hii iliyoboreshwa ya uanzishaji wa uso na mipako ya ECM inawezesha kiambatisho cha epithelium ya organoid ili kushawishi morphogenesis ya 3D kwenye uso wa PDMS.
Tamaduni za Transwell pia zinahitaji mipako ya ECM kabla ya mbegu za seli; hata hivyo, tamaduni za Transwell hazihitaji hatua ngumu za matayarisho ili kuamilisha uso wa vichocheo vya vinyweleo.Kwa ukuaji wa seli za Caco-2 kwenye viingilio vya Transwell, mipako ya ECM kwenye viingilio vya vinyweleo huharakisha uunganisho wa seli za Caco-2 zilizotenganishwa (
Vipengele vya kimofolojia vya tabaka za epithelial za uhandisi wa 3D zinaweza kuchanganuliwa kwa kutumia mbinu mbalimbali za upigaji picha, ikiwa ni pamoja na hadubini ya utofautishaji wa awamu, hadubini ya utofautishaji wa utofautishaji (DIC), SEM, au hadubini ya immunofluorescence confocal (Kielelezo 3 na 4). Utofautishaji wa awamu au upigaji picha wa DIC unaweza kufanywa kwa urahisi wakati wowote wa uundaji wa umbo la 3D wakati wa upanuzi wa 3D. tabaka za epithelial. Kwa sababu ya uwazi wa macho wa PDMS na filamu za polyester, jukwaa la gut-on-a-chip na chip mseto linaweza kutoa taswira ya wakati halisi bila hitaji la kutenganisha au kutenganisha kifaa. Wakati wa kufanya upigaji picha wa immunofluorescence (Takwimu 1, 3b, 4b, 4, c, f na seli za kawaida). (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), ikifuatiwa na Triton X-100 na 2% (wt/vol) ) albumin ya seramu ya ng'ombe (BSA), kwa mpangilio. Kulingana na aina ya seli, viambajesho tofauti, vipenyezaji, na vizuia-kinga vinaweza kutumika. Kingamwili za msingi zinazolenga tegemezi-tegemezi la seli kwenye seli au chembechembe za kanda hutumika kuangazia chembe chembe za seli au alama za kanda. pamoja na rangi ya rangi inayolenga aidha kiini (kwa mfano, 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) au F-actin (km, iliyoandikwa kwa fluorescently phalloidin).Upigaji picha wa moja kwa moja unaotegemea fluorescence pia unaweza kufanywa katika situ ili kugundua utokezaji wa kamasi (Mtini. 1, koloni tofauti), uwekaji wa kamasi nasibu seli za vijidudu (Kielelezo 1, "utamaduni wa ushirikiano wa vijiumbe-jeshi") , uandikishaji wa seli za kinga (Mchoro 1, 'Muundo wa Ugonjwa') au mikondo ya mofolojia ya epithelial ya 3D (Kielelezo 3c, f na 4b, c). Wakati wa kurekebisha utumbo kwenye chip ili kutenganisha safu ya chini ya safu ya juu iliyoonyeshwa. 2, mofolojia ya epithelial ya 3D pamoja na microvilli kwenye mpaka wa brashi ya apical inaweza kuonyeshwa kwa SEM (Mchoro 3b). Usemi wa alama za upambanuzi unaweza kutathminiwa kwa kutekeleza PCR5 ya kiasi au mpangilio wa RNA wa seli moja. Katika kesi hii, tabaka za 3D za epithelium ya epithelial hutumiwa na chembe za mseto za epithelial na jaribu kuvuna seli za psin na jaribu la molekuli za psin. uchambuzi wa maumbile.
a, Mtiririko wa kazi kwa ajili ya kuingizwa kwa mofojenesisi ya matumbo katika chip ya mseto.Caco-2 na organoidi za matumbo hutumiwa katika itifaki hii ili kuonyesha mofojenesisi ya 3D katika jukwaa la chip cha mseto.Seli za epithelial zilizotenganishwa zilipandwa katika viingilio vya Transwell vilivyotayarishwa (TW prep; tazama kielelezo hapa chini).Mara seli ziliwekwa kwenye seli za polyester (seedeed membranes) ziliwekwa kwenye seli za polyester. iliyopandwa chini ya hali tuli ( TW culture). Baada ya siku 7, kiingio kimoja cha Transwell kilicho na monolayer ya 2D ya seli za epithelial kiliunganishwa kwenye chip ya mseto ili kuanzisha mtiririko wa basolateral (Flow, BL), ambayo hatimaye ilisababisha kuzalishwa kwa safu ya epithelial ya 3D (morphogenesis). Mikrografu ya awamu ya tofauti inayoonyesha vipengele vya kawaida vya ogani ya ogani ya binadamu. (Mstari wa C103) koloni inayopanda katika kila hatua ya majaribio au hatua ya wakati.Mipangilio katika tabaka za juu zinaonyesha usanidi wa majaribio kwa kila hatua.b, Chipu Mseto (mchoro wa kushoto) unaweza kusababisha mofojenesisi ya 3D ya seli za epithelial za oganoid zilizo na hadubini ya juu-chini ya confocal iliyochukuliwa katika nafasi tofauti za kati, na mistari ya chini ya Z (mionekano ya mpangilio wa chini na mstari wa chini wa Z). ilionyesha sifa dhahiri za kimofolojia.F-actin (cyan), nucleus (kijivu).c, Fluorescence confocal micrographs (3D angled view) ya seli za epithelial zinazotokana na oganoid zilizokuzwa katika Transwell tuli (TW; inset ndani ya kisanduku cheupe kilichopasuliwa) dhidi ya chipu mseto (risasi kubwa kabisa) ikilinganisha mofti ya 2D ya 2D 2D. mionekano ya wima iliyokatwa (iliyowekwa kwenye kona ya juu kulia; "XZ") pia inaonyesha vipengele vya 2D na 3D. Upau wa mizani, 100 µm.c Imechapishwa tena kwa ruhusa kutoka kwa marejeleo.4. Elsevier.
Udhibiti unaweza kutayarishwa kwa kutengeneza seli zile zile (Caco-2 au seli za epithelial za matumbo) kuwa tabaka mbili-dimensional chini ya hali ya kawaida ya utamaduni tuli. Ikumbukwe kwamba, kupungua kwa virutubishi kunaweza kusababisha kutokana na uwezo mdogo wa ujazo wa mikondo midogo (yaani ~4 µL kwenye chaneli ya juu kwenye muundo wa awali wa gut-chippisoli baada ya utiririshaji wa balolojia ya gut-chip naHapo). pia kulinganishwa.
Mchakato wa kusoma maandishi laini unapaswa kufanywa katika chumba safi. Kwa kila safu kwenye chip (tabaka za juu na chini na utando) na chips mseto, fotomasksi tofauti zilitumiwa na kutengenezwa kwenye kaki tofauti za silikoni kwa sababu urefu wa mikondo midogo ulikuwa tofauti. Urefu unaolengwa wa mikondo ya juu na ya chini ya utumbo kwenye chip ni 500, µmµta na urefu wa 500mµm kwa mtiririko huo. Chip ya mseto ni 200 µm.
Weka kaki ya silicon ya inchi 3 kwenye sahani yenye asetoni. Zungusha sahani kwa upole kwa sekunde 30, kisha kausha kaki kwa hewa. Hamisha kaki kwenye sahani yenye IPA, kisha zungusha sahani kwa sekunde 30 ili kusafisha.
Suluhisho la piranha (mchanganyiko wa peroksidi ya hidrojeni na asidi ya sulfuriki iliyokolea, 1:3 (vol/vol)) inaweza kwa hiari kutumika kuongeza uondoaji wa mabaki ya kikaboni kutoka kwenye uso wa kaki wa silicon.
Suluhisho la Piranha ni babuzi sana na huzalisha joto. Tahadhari za ziada za usalama ni muhimu. Kwa utupaji wa taka, ruhusu kiyeyusho kipoe na kuhamishiwa kwenye chombo kisafi na kikavu cha taka.Tumia vyombo vya pili na uweke lebo vizuri vyombo vya taka. Tafadhali fuata miongozo ya usalama ya kituo kwa taratibu za kina zaidi.
Punguza maji kaki kwa kuziweka kwenye sahani ya moto ya 200 ° C kwa dakika 10. Baada ya maji mwilini, kaki ilitikiswa mara tano hewani ili kupoe.
Mimina ~10 g ya mpito wa kupiga picha SU-8 2100 katikati ya kaki ya silicon iliyosafishwa.Tumia kibano ili kueneza kizuia picha sawasawa kwenye kaki. Mara kwa mara weka kaki kwenye sahani ya moto ya 65°C ili kufanya kipigo cha kupiga picha kisibandike na kiwe rahisi kueneza. Usiweke kaki moja kwa moja kwenye sahani moto.
SU-8 ilisambazwa sawasawa kwenye kaki kwa kuendesha mipako inayozunguka. Panga mzunguko unaoingia wa SU-8 kwa sekunde 5-10 ili kueneza kwa kasi ya 500 rpm kwa kuongeza kasi ya 100 rpm/s. Weka spin kuu kwa muundo wa unene wa 200 µm saa 1,500 rpm au kufikia unene wa 1,500 rpm / s. 500 µm urefu kwa safu ya juu ya utumbo kwenye chip; angalia "Hatua muhimu" hapa chini) iliyowekwa kwa kuongeza kasi ya 300 rpm/s sekunde 30 kwa 1,200 rpm.
Kasi kuu ya mzunguko inaweza kubadilishwa kulingana na unene wa lengo la muundo wa SU-8 kwenye kaki ya silicon.
Ili kutengeneza mifumo ya SU-8 ya urefu wa 500 µm kwa safu ya juu ya utumbo kwenye chip, mipako ya kusokota na hatua za kuoka laini za Sanduku hili (hatua ya 7 na 8) zilirudiwa kwa mpangilio (angalia hatua ya 9) ili kutoa tabaka mbili za 250 µm Safu nene ya SU-8, ambayo inaweza kuwekwa kwenye safu 1 na kuunganishwa kwa safu ya 0 ya UV2 kwenye safu ya 0. µm juu.
Oka kaki zilizopakwa kwa SU-8 kwa upole kwa kuweka kaki kwenye sahani moto ifikapo 65 °C kwa dakika 5, kisha ubadilishe mpangilio hadi 95 °C na uanguke kwa dakika 40 za ziada.
Ili kufikia urefu wa 500 μm wa muundo wa SU-8 katika njia ndogo ya juu, rudia hatua ya 7 na 8 ili kuzalisha tabaka mbili za 250 μm nene za SU-8.
Kwa kutumia Kilinganishi cha Mask ya UV, fanya mtihani wa taa kulingana na maagizo ya mtengenezaji ili kukokotoa muda wa mfiduo wa kaki. (muda wa mfiduo, ms) = (kipimo cha mfiduo, mJ/cm2)/(nguvu ya taa, mW/cm2).
Baada ya kubainisha muda wa kukaribia aliyeambukizwa, weka kinyago cha picha kwenye kishikilia barakoa cha kipangilio cha vinyago vya UV na uweke kibambo cha picha kwenye kaki iliyopakwa SU-8.
Weka uso uliochapishwa wa fotomask moja kwa moja kwenye upande uliofunikwa wa SU-8 wa kaki ya silicon ili kupunguza mtawanyiko wa UV.
Onyesha kaki iliyopakwa SU-8 na barakoa ya picha kwa wima hadi 260 mJ/cm2 ya mwanga wa UV kwa muda uliobainishwa mapema wa kukaribia mwanga (angalia hatua ya 10 ya kisanduku hiki).
Baada ya mwanga wa UV, kaki za silikoni zilizopakwa kwa SU-8 ziliokwa kwa 65°C kwa dakika 5 na 95°C kwa dakika 15 kwenye kila sahani moto ili kutengeneza ruwaza zenye urefu wa 200 μm. Ongeza muda wa baada ya kuoka kwa 95 °C hadi dakika 30 ili kutengeneza ruwaza zenye urefu wa 500 µm.
Msanidi hutiwa ndani ya bakuli la glasi, na kaki iliyooka huwekwa kwenye sahani. Kiasi cha msanidi wa SU-8 kinaweza kutofautiana kulingana na saizi ya sahani ya glasi. Hakikisha kutumia msanidi wa kutosha wa SU-8 ili kuondoa kabisa SU-8. Kwa mfano, unapotumia sahani ya glasi ya kipenyo cha mm 150 na uwezo wa L 1, tumia ~ 300 ml ya mold ya SU-8 mL kwa dakika 300. mzunguko mpole mara kwa mara.
Osha ukungu uliotengenezwa kwa ~10 mL ya msanidi mpya ikifuatiwa na IPA kwa kunyunyizia suluhisho kwa kutumia pipette.
Weka kaki kwenye kisafishaji cha plasma na uweke plasma ya oksijeni (gesi ya angahewa, shinikizo la lengo 1 × 10-5 Torr, nguvu 125 W) kwa dakika 1.5.
Weka kaki kwenye kipokezi cha utupu chenye slaidi ya kioo ndani.Kaki na slaidi zinaweza kuwekwa kando.Kama kifuta utupu kimegawanywa katika tabaka kadhaa na sahani, weka slaidi kwenye chumba cha chini na kaki kwenye chumba cha juu.Dondosha 100 μL ya trikloro,1H,2H,H. 2H-perfluorooctyl)mmumunyo wa silane kwenye slaidi ya glasi na weka utupu kwa silanization.
Kuyeyusha bakuli la seli za Caco-2 zilizogandishwa katika umwagaji wa maji wa 37°C, kisha uhamishe seli zilizoyeyushwa hadi kwenye chupa ya T75 iliyo na mililita 15 ya 37°C iliyotiwa moto kabla ya Caco-2.
Ili kupitisha seli za Caco-2 kwa msongamano wa ~90%, kwanza joto la wastani la Caco-2, PBS, na trypsin 0.25%/1 mM EDTA katika umwagaji wa maji wa 37°C.
Aspirate medium by vacuum aspiration.Osha seli mara mbili kwa mililita 5 za PBS joto kwa kurudia utupu wa kupumua na kuongeza PBS mpya.
Muda wa kutuma: Jul-16-2022
