3D in vitro morphogenesis ya epithelium ya utumbo wa binadamu kwenye gut-on-a-chip au mseto-on-a-chip na viingizi vya utamaduni wa seli.

Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza kwamba utumie kivinjari kilichosasishwa (au zima hali ya uoanifu katika Internet Explorer).Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Mofogenesis ya utumbo wa binadamu huanzisha vipengele vya crypt-villus ya microarchitecture ya 3D epithelial na shirika la anga. Muundo huu wa kipekee unahitajika ili kudumisha homeostasis ya utumbo kwa kulinda niche ya seli ya shina katika crypt ya basal kutoka kwa antijeni za microbial exogenous na metabolites zao. Kwa hivyo, kuunda upya miundo ya epithelial ya 3D ni muhimu kwa ajili ya ujenzi wa miundo ya utumbo wa ndani. Kwa hakika, utumbo wa kikaboni wa kuiga kwenye chip unaweza kuibua mofogenesis ya 3D ya epitheliamu ya utumbo iliyoimarishwa na utendaji wa kisaikolojia na biomechanics. Chip fluidic na vile vile katika Transwell iliyopachikwa chip ya mseto. Tunaelezea mbinu za kina za utengenezaji wa kifaa, ukuzaji wa Caco-2 au seli za epithelial za matumbo katika mipangilio ya kawaida na vile vile kwenye jukwaa la microfluidic, uingizaji wa mofojenesisi ya 3D, na uainishaji wa epithelia ya 3D iliyoanzishwa kwa kutumia mbinu ya udhibiti wa uundaji wa 3D kwa kutumia mbinu za udhibiti wa upigaji picha nyingi. kwa 5 d.Njia yetu ya in vitro morphogenesis hutumia mkazo wa kifiziolojia na mwendo wa kimakanika na hauhitaji uhandisi changamano wa seli au upotoshaji, ambao unaweza kushinda mbinu zingine zilizopo.Tunafikiria kwamba itifaki yetu inayopendekezwa inaweza kuwa na athari pana kwa jumuiya ya utafiti wa matibabu, kutoa mbinu ya kuzalisha upya 3D ya safu ya matumbo ya 3D, biomedical maombi na matibabu ya kliniki.
Majaribio yanaonyesha kuwa seli za matumbo za Caco-2 zilizokuzwa katika gut-on-a-chip1,2,3,4,5 au bilayer microfluidic device6,7 zinaweza kupitia mofogenesis ya 3D in vitro bila ufahamu wazi wa utaratibu wa msingi. sis in vitro, ambayo imeonyeshwa na Caco-2 na organoids ya matumbo inayotokana na mgonjwa.Seli za epithelial ziliidhinishwa. Katika utafiti huu, tuliangazia hasa uzalishaji wa seli na usambazaji wa umakinifu wa mpinzani hodari wa Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), katika gut-on-a-chip na vifaa vya microfluidic vilivyorekebishwa vilivyo na viingilio vya Transwell, vinavyoitwa "Chip Hybrid". Protini 1 inayohusiana na d, au Soggy-1) kwenye utumbo wa on-chip huzuia mofojenesisi au kuharibu safu ya epithelial ya 3D iliyopangwa tayari, na hivyo kupendekeza kuwa mkazo wa kinzani wakati wa utamaduni huchangia mofojenesisi ya matumbo katika vitro. kusukuma maji (kwa mfano, kwenye gut-on-a-chip au majukwaa ya mseto-on-a-chip) au uenezaji .Vyombo vya habari vya msingi (kwa mfano, kutoka kwa Transwell huingiza kwenye hifadhi kubwa za msingi kwenye visima).
Katika itifaki hii, tunatoa mbinu ya kina ya kutengeneza vifaa vidogo vya gut-on-a-chip na vichipu vya mseto vinavyoweza kuingizwa (hatua 1-5) ili kukuza seli za epithelial za matumbo kwenye utando wa vinyweleo wenye msingi wa polydimethylsiloxane (PDMS) (hatua 6A, 7A, 8, 9) au utando wa polyester 6, 7 wa poliester na 7. 3D morfogenesis in vitro (hatua ya 10). Pia tulitambua vipengele vya seli na molekuli vinavyoonyesha histojenesisi maalum ya tishu na upambanuzi wa seli unaotegemea ukoo kwa kutumia mbinu nyingi za kupiga picha (hatua 11-24). Tunachochea mofojenesisi kwa kutumia epithelial ya utumbo wa binadamu, kama vile chembe za kitaalamu za muundo wa matumbo au utando wa 2 wa matumbo, kama vile muundo wa utando wa matumbo-2. , kuundwa kwa tabaka za 2D, na biokemikali ya matumbo na Utoaji upya wa microenvironment.in vitro.Ili kushawishi mofojenesisi ya 3D kutoka kwa tabaka 2 za epithelial za 2D, tuliondoa wapinzani wa mofojeni katika aina zote mbili za kitamaduni kwa kutiririsha kati kwenye sehemu ya msingi ya kitamaduni.Mwishowe, uwakilishi wa muundo unaoweza kutumika wa D unaweza kutoa muundo unaoweza kubadilika wa D. Ukuaji wa epithelial unaotegemea fojeni, tamaduni shirikishi za mwenyeji-microbiome za longitudinal, maambukizo ya pathojeni, jeraha la kuvimba, kutofanya kazi vizuri kwa kizuizi cha epithelial, na matibabu yanayotegemea probiotic Mfano.influences.
Itifaki yetu inaweza kuwa na manufaa kwa wanasayansi mbalimbali katika msingi (kwa mfano, baiolojia ya mucosa ya matumbo, baiolojia ya seli shina, na baiolojia ya ukuaji) na utafiti unaotumika (kwa mfano, upimaji wa awali wa dawa, muundo wa magonjwa, uhandisi wa tishu, na ugonjwa wa tumbo) athari kubwa. ilitumwa kwa hadhira inayosoma mienendo ya uonyeshaji wa seli wakati wa ukuaji wa matumbo, kuzaliwa upya au homeostasis .Aidha, itifaki yetu ni muhimu kwa kuhoji maambukizo chini ya mawakala mbalimbali wa kuambukiza kama vile Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Salmonella.Watazamaji wa ugonjwa wa ugonjwa na pathogenesis pia ni muhimu.Matumizi ya mfumo wa microfiziolojia ya matumbo ya on-chip yanaweza kuruhusu utamaduni wa muda mrefu 10 na tathmini inayofuata ya ulinzi wa mwenyeji, majibu ya kinga na ukarabati wa majeraha yanayohusiana na pathojeni katika njia ya utumbo (GI) 11 .Matatizo mengine ya GIcolitis, ugonjwa wa Crochex, Ugonjwa wa Crochex, Ugonjwa wa Crochet pouchitis, au ugonjwa wa bowel wenye hasira unaweza kuigwa wakati tabaka za 3D za epithelial za matumbo zinatayarishwa kwa kutumia tabaka za epithelial za matumbo za 3D, magonjwa haya ni pamoja na atrophy mbaya, ufupisho wa crypt, uharibifu wa mucosal, au kizuizi cha epithelial. zingatia kuongeza aina za seli zinazohusika na ugonjwa, kama vile seli za pembeni za damu za mgonjwa za nyuklia (PBMCs), kwa miundo iliyo na miundo midogo ya 3D ya matumbo ya villus-crypt.seli za kinga za tishu mahususi, 5.
Kwa kuwa muundo mdogo wa epithelial wa 3D unaweza kusasishwa na kuonyeshwa bila mchakato wa kugawanya, watazamaji wanaofanyia kazi nakala za anga na picha zenye azimio la juu au azimio kuu wanaweza kupendezwa na upangaji wetu wa mienendo ya anga ya jeni na protini kwenye niche za epithelial.Kuvutiwa na teknolojia.Mwitikio wa vichocheo vya vijidudu au kinga. Zaidi ya hayo, longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 inayoratibu homeostasis ya matumbo inaweza kuanzishwa katika safu ya 3D ya mucosa ya utumbo kwa kushirikiana spishi za vijidudu mbalimbali, jumuiya za vijidudu au microbiota ya kinyesi, hasa kwenye gut-a.Mtazamo huu unavutia hasa watazamaji wanaosoma elimu ya kinga ya mucosal, gastroenterology, microbiome ya binadamu, culturomics na microbiology ya kimatibabu inayotafuta kukuza mikrobiota ya utumbo ambayo haikuwa imetungwa kwenye maabara. Ikiwa itifaki yetu ya in vitro morphogenesis inaweza kubadilishwa kwa miundo ya utamaduni scalable, kama vile sahani 43, bamba 2, 28 49 kwa pamoja au 43 49 49 pamoja na bamba 43 49 itifaki, itifaki inaweza pia kusambazwa kwa wale wanaotengeneza uchunguzi wa dawa, matibabu ya kibayolojia Au uchunguzi wa juu zaidi au majukwaa ya uthibitishaji kwa ajili ya sekta ya chakula.Kama uthibitisho wa kanuni, hivi majuzi tulionyesha uwezekano wa mfumo wa mofogenesis wa kiwango cha juu cha kuongezeka kwa muundo wa sahani 24-visima. Uboreshaji wa mbinu yetu ya in vitro morphogenesis inaweza kuharakishwa na kuwezekana kupitishwa na maabara nyingi za utafiti, tasnia au serikali na mashirika ya udhibiti ili kuelewa upangaji upya wa seli za in vitro gut morphogenesis katika kiwango cha maandishi ili kupima dawa au matibabu ya kibayolojia. mchakato wa morphgenesis ya matumbo.
Idadi ndogo ya mifano ya majaribio inayohusiana na binadamu imetumika kuchunguza mofogenesis ya epithelial ya matumbo, hasa kutokana na ukosefu wa itifaki zinazoweza kutekelezeka ili kushawishi morphogenesis ya 3D in vitro.Kwa hakika, ujuzi mwingi wa sasa kuhusu mofogenesis ya utumbo unategemea masomo ya wanyama (kwa mfano, zebrafish20, mice21 au jinsi gani, wanaweza kuwa na uchungu wa gharama kubwa, jinsi zinavyoweza kuwa na uchungu na kuku2). ly, haibainishi kwa usahihi michakato ya maendeleo ya binadamu. Miundo hii pia ina mipaka sana katika uwezo wake wa kujaribiwa kwa njia nyingi inayoweza kupunguzwa. Kwa hiyo, itifaki yetu ya kuzalisha upya miundo ya tishu za 3D katika vitro inazidi utendakazi katika mifano ya wanyama wa vivo pamoja na miundo mingine ya kitamaduni ya seli tuli ya 2D. Kama ilivyoelezwa hapo awali, kutumia muundo tofauti wa 3D wa spatisiliated kuruhusiwa kuchunguza seli za spatisili ya 3D. kwa kukabiliana na vichocheo mbalimbali vya utando wa mucous au kinga. Tabaka za epithelial za 3D zinaweza kutoa nafasi ya kujifunza jinsi seli za vijidudu hushindana kuunda niches za anga na mageuzi ya kiikolojia kwa kukabiliana na mambo ya mwenyeji (kwa mfano, tabaka za ndani dhidi ya nje ya kamasi, usiri wa IgA na peptidi za antimicrobial). metabolite ndogo ndogo (kwa mfano, asidi ya mafuta ya mnyororo fupi) ambayo hutengeneza mpangilio wa seli na niche za seli shina kwenye mirija ya msingi. Vipengele hivi vinaweza kuonyeshwa tu wakati tabaka za epithelial za 3D zinapoanzishwa kwa njia isiyo ya kawaida.
Mbali na njia yetu ya kuunda miundo ya epithelial ya matumbo ya 3D, kuna njia kadhaa za in vitro.Utamaduni wa organoid wa matumbo ni mbinu ya kisasa ya uhandisi wa tishu kulingana na kilimo cha seli za shina za matumbo chini ya hali maalum ya mofojeni23,24,25. d ndani ya organoid na, kwa hiyo, kuanzishwa kwa vipengele vya mwanga kama vile seli za microbial au antijeni za nje ni mdogo.Upatikanaji wa lumens za organoid unaweza kuboreshwa kwa kutumia kidude kidogo,26,27 lakini njia hii ni vamizi na inahitaji nguvukazi nyingi na inahitaji maarifa maalumu ili kufanya kazi.Zaidi ya hayo, tamaduni za kitamaduni za oganoid zinazodumishwa katika kiunzi cha hidrojeli chini ya hali tuli haziakisi kwa usahihi kazi katika biomechanics ya vivo.
Mbinu nyinginezo zinazotumiwa na vikundi kadhaa vya utafiti hutumia kiunzi cha hidrojeli cha 3D kilichopangwa awali kuiga muundo wa epithelial ya utumbo kwa kutengeneza chembechembe za matumbo ya binadamu zilizotengwa kwenye uso wa jeli. Tengeneza viunzi vya haidrojeli kwa kutumia 3D-iliyochapishwa, milled ndogo, au lithographically fabricated molds self-organizes mpangilio wa kipekee au kwa njia ya mpangilio wa seli hizi. gradients husika za mofojeni, kuanzisha uwiano wa hali ya juu muundo wa epithelial na mseto wa stroma-epithelial kwa kujumuisha seli za stromal kwenye kiunzi.Hata hivyo, asili ya kiunzi kilichopangwa awali inaweza kuzuia onyesho la mchakato wa kimofojenetiki wa hiari wenyewe.Miundo hii pia haitoi mwanga wenye nguvu au mseto wa kubadilika wa kiowevu na mfadhaiko wa kiowevu wa kiowevu chini ya utiririko wa kiowevu wa kiowevu unaohitaji utiririshaji wa kiowevu chini ya utiririshaji wa tishu za mwili chini ya utiririko wa kiowevu wa thestinalgia, na utiririshaji wa kiowevu. kazi.Utafiti mwingine wa hivi majuzi ulitumia kiunzi cha hidrojeli katika jukwaa la microfluidic na miundo ya epithelial ya matumbo yenye muundo kwa kutumia mbinu za leza.Oganoidi za matumbo ya panya hufuata muundo uliowekwa ili kuunda miundo ya mirija ya matumbo, na mtiririko wa maji ya intraluminal unaweza kubadilishwa kwa kutumia moduli ya microfluidics. mbinu kutoka kwa kundi moja ziliweza kuunda mirija ndogo ya utumbo yenye michakato ya moja kwa moja ya mofojenetiki. Licha ya uundaji tata wa sehemu tofauti za utumbo ndani ya bomba, mtindo huu pia hauna mtiririko wa maji ya mwanga na deformation ya mitambo. Zaidi ya hayo, utendakazi wa mfano unaweza kuwa mdogo, hasa baada ya mchakato wa uchapishaji wa kibayo kukamilika, na kusumbua hali ya majaribio au mwingiliano wa kiini-to-kiini hutoa uingiliano wa seli moja kwa moja. mkazo unaofaa wa kung'oa manyoya, mitambo ya kibayolojia inayoiga motility ya matumbo, ufikiaji wa sehemu huru za apical na basolateral, na uundaji upya wa mazingira changamano ya kibayolojia ya modularity. Kwa hivyo, itifaki yetu ya in vitro 3D morphogenesis inaweza kutoa mbinu inayosaidia kushinda changamoto za mbinu zilizopo.
Itifaki yetu inaangazia kikamilifu mofojenesisi ya epithelial ya 3D, ikiwa na seli za epithelial pekee katika utamaduni na hakuna aina nyingine za seli zinazozunguka kama vile seli za mesenchymal, seli za endothelial, na seli za kinga. chip na mseto-on-a-chip huturuhusu kuunda upya safu ya epithelial ya 3D inayoendelea, matatizo ya ziada ya kibayolojia kama vile mwingiliano wa epithelial-mesenchymal33,34, utuaji wa extracellular Matrix (ECM) 35 na, katika muundo wetu, vipengele vya crypt-villus ambavyo vinawasilisha niche za seli shina katika seli za msingi zinazozingatiwa kuwa mesenchymal crypts, dhima kuu ya mesenchymal. katika utengenezaji wa protini za ECM na udhibiti wa mofojenesisi ya matumbo katika vivo35,37,38. Kuongezewa kwa seli za mesenchymal kwa mfano wetu kuliimarisha mchakato wa mofojenetiki na ufanisi wa kushikamana kwa seli. Safu ya mwisho (yaani, capillaries au lymphatics) ina jukumu muhimu katika kudhibiti usafiri wa molekuli39 na kinga ya mwili inaweza kuajiri vipengele vidogo vya seli. kuunganishwa kati ya miundo ya tishu ni sharti miundo ya tishu inapoundwa ili kuonyesha mwingiliano wa viungo vingi. Kwa hivyo, seli za mwisho za mwisho zinaweza kuhitaji kujumuishwa ili kuiga vipengele sahihi zaidi vya kisaikolojia na utatuzi wa kiwango cha chombo. Seli za kinga zinazotokana na mgonjwa pia ni muhimu kwa kuonyesha majibu ya asili ya kinga, uwasilishaji wa antijeni, mseto wa asili wa kukabiliana na hali ya kinga, na kinga ya tishu inayoiga katika muktadha wa utaalamu wa tishu.
Matumizi ya chip mseto ni ya moja kwa moja kuliko gut-on-a-chip kwa sababu usanidi wa kifaa ni rahisi na utumiaji wa vichochezi vya Transwell huruhusu utamaduni hatari wa epithelium ya matumbo.Hata hivyo, vichochezi vya Transwell vinavyopatikana kibiashara vyenye utando wa poliesta si nyumbufu na haviwezi kuiga miondoko ya peristaltic. Zaidi ya hayo, sehemu ya mseto ya kisima cha mseto kilichowekwa kwenye kituo cha mseto cha mseto kilichowekwa kwenye kituo cha mkazo cha mseto kilichowekwa kwenye kituo kinachopitisha mkazo kilibaki kwenye kituo cha mkazo cha kibodi. awali, sifa tuli katika sehemu ya apical haziwezesha utamaduni wa muda mrefu wa bakteria katika chipsi mseto. Ingawa tunaweza kushawishi kwa uthabiti mofojenesisi ya 3D katika vichocheo vya Transwell tunapotumia chip mseto, uhaba wa mbinu za kibayolojia na mtiririko wa maji ya apical unaweza kupunguza uwezekano wa majukwaa ya chipu mseto yanayoweza kutekelezwa.
Usanifu kamili wa mhimili wa crypt-villus ya binadamu katika tamaduni za gut-on-a-chip na mseto-on-a-chip haujaanzishwa kikamilifu. Kwa kuwa mofojenesisi huanza kutoka kwa safu moja ya epithelial, usanifu midogo wa 3D hautoi ulinganifu wa kimofolojia na siri katika vivo. lium, sehemu za siri na mbovu hazikuwekewa mipaka kwa uwazi. Ingawa njia za juu zaidi kwenye chip huongoza hadi kuongezeka kwa urefu wa epithelium iliyobuniwa kidogo, urefu wa juu bado ni ~ 300–400 µm. Kina halisi cha nyumbo za utumbo wa binadamu katika utumbo mwembamba na mkubwa ni ~135 µm na urefu wa ndani wa matumbo madogo ~135µm,0,0,0,0,0,0,0,000 hadi 135 µm. lli ni ~600 µm41.
Kwa mtazamo wa taswira, upigaji picha wa in situ super-azimio la miundo midogo ya 3D inaweza kuwa mdogo kwenye utumbo kwenye chip, kwa kuwa umbali unaohitajika wa kufanya kazi kutoka kwa lenzi ya lengo hadi safu ya epithelial ni kwa mpangilio wa milimita chache. Ili kuondokana na tatizo hili, lengo la mbali linaweza kuhitajika. Zaidi ya hayo, kutengeneza sehemu nyembamba kwa ajili ya utayarishaji wa sampuli ya juu ya PD ni kutokana na upigaji picha wa elastic. uundaji wa safu ndogo ya utumbo kwenye chip unahusisha mshikamano wa kudumu kati ya kila safu, ni changamoto kubwa sana kufungua au kuondoa safu ya juu ili kuchunguza muundo wa uso wa safu ya epithelial.Kwa mfano, kwa kutumia darubini ya elektroni ya skanning (SEM).
Hali ya haidrofobu ya PDMS imekuwa sababu ya kikwazo katika tafiti zenye msingi wa microfluidic zinazoshughulikia molekuli ndogo za haidrofobu, kwa kuwa PDMS inaweza kutangaza kwa njia isiyo maalum molekuli hizo za haidrofobu. Njia mbadala za PDMS zinaweza kuzingatiwa pamoja na nyenzo nyingine za polimeri. 3) inaweza kuzingatiwa kupunguza utangazaji wa molekuli za haidrofobu.
Hatimaye, mbinu yetu haijaonyeshwa vyema katika suala la kutoa uchunguzi wa hali ya juu au jukwaa la majaribio la kirafiki la mtumiaji la "ukubwa mmoja". Itifaki ya sasa inahitaji pampu ya sindano kwa kila kifaa kidogo, ambayo inachukua nafasi katika incubator ya CO2 na kuzuia majaribio makubwa. Kikomo hiki kinaweza kuboreshwa kwa kiasi kikubwa na muundo wa 94well, 64well, utamaduni wa 94well, 64well, au 94well, utamaduni wa 94well. kuingizwa vizuri kwa porous ambayo inaruhusu kujaza tena na kuondolewa kwa vyombo vya habari vya basolateral).
Ili kushawishi mofojenesisi ya 3D ya epitheliamu ya utumbo wa binadamu katika vitro, tulitumia kifaa cha utumbo cha microfluidic chenye mikondo midogo miwili sambamba na utando nyororo wa upenyo katikati ili kuunda kiolesura cha lumen-capilari. Pia tunaonyesha matumizi ya kifaa chenye microfluidic chenye njia moja (chipsi mseto) ambacho hutoa mtiririko wa kila sehemu kwenye safu ya pande zote mbili. s, mofojenesisi ya seli mbalimbali za epithelial ya matumbo ya binadamu inaweza kuonyeshwa kwa kutumia upotoshaji wa mwelekeo wa mtiririko ili kuondoa wapinzani wa morfojeni kutoka kwa sehemu ya msingi. Utaratibu mzima wa majaribio (Mchoro 1) una sehemu tano: (i) uundaji mdogo wa chip ya gut au Transwell chip 1-5; seli za co-2) au organoids ya matumbo ya binadamu;masanduku 2-5), (iii) utamaduni wa seli za epithelial za matumbo kwenye chipsi za matumbo au chipsi mseto (hatua 6-9), (iv) uingizwaji wa 3D morphogenesis in vitro (hatua ya 10) na (v) ) ili kubainisha muundo wa epithelial wa 3D (hatua 11-24). genesis kwa kulinganisha mofogenesis ya epithelial na udhibiti wa anga, wa muda, wa masharti, au wa utaratibu.
Tulitumia majukwaa mawili tofauti ya kitamaduni: gut-on-a-chip yenye chaneli zilizonyooka au chaneli zisizo na mstari zilizochanganyika, au chipsi mseto zilizo na vichochezi vya Transwell (TW) kwenye kifaa chenye microfluidic, kilichobuniwa kama ilivyofafanuliwa katika Kisanduku cha 1, na hatua ya 1 -5."Utengenezaji wa Kifaa" huonyesha hatua kuu za kutengeneza chip moja au chipu mseto."Culture of Human Cell-Incoclimate" stinal organoids) na utaratibu wa kitamaduni unaotumika katika itifaki hii."In vitro morphogenesis" inaonyesha hatua za jumla ambazo Caco-2 au seli za epithelial zinazotokana na oganoid hupandwa kwenye chip ya utumbo au kwenye viingilio vya Transwell vya chipu ya mseto, ikifuatiwa na uingizaji wa mofojenesisi ya 3D na uundaji wa nambari ya epithelial yenye sifa jinsi nambari ya epithelial inavyoonyeshwa chini ya muundo wa hatua ya programu. tabaka za epithelial zinaweza kutumika, kwa mfano, katika upambanuzi wa seli, tafiti za fiziolojia ya utumbo, uanzishaji wa mifumo ikolojia ya mwenyeji-microbiome, na uundaji wa magonjwa. Picha za Immunofluorescence katika "Utofauti wa Kiini" zinazoonyesha viini, F-actin na MUC2 iliyoonyeshwa katika 3D Caco-2 ya epithelial iliyopo kwenye safu ya siri ya mucus na seli za mucus zinazozalishwa kwenye safu ya siri ya MUC2. nyuso za mucosal.Picha za fluorescent katika Fiziolojia ya Utumbo zinaonyesha kamasi inayotolewa kwa kutia madoa kwa asidi ya sialic na mabaki ya N-acetylglucosamine kwa kutumia kijidudu cha ngano cha fluorescent agglutinin. Picha mbili zinazopishana katika "Host-Microbe Co-Cultures" zinaonyesha mwakilishi wa mwenyeji-microbiome gut kushoto kwenye paneli ya utamaduni wa fluorescent kwenye co-co-cultural panel. protini rescent (GFP) yenye chembe chembe chembe za epithelial za 3D Caco-2 zenye uhandisi midogo. Paneli ya kulia inaonyesha ujanibishaji wa GFP E. koli iliyokuzwa pamoja na seli za epithelial za 3D Caco-2, ikifuatwa na madoa ya immunofluorescence yenye F-actin (nyekundu) na nuclei (bluu) .Kielelezo cha ugonjwa wa guussiaki ya antiphysiological inaonyesha changamoto ya antiphysiolojia ya ugonjwa. s (kwa mfano, lipopolysaccharide, LPS) na seli za kinga (kwa mfano, PBMC);kijani).Seli za Caco-2 ziliundwa ili kuanzisha safu ya epithelial ya 3D. Upau wa mizani, 50 µm. Picha katika safu mlalo ya chini: "Utofauti wa visanduku" vilivyorekebishwa kwa ruhusa kutoka kwa marejeleo.2.Oxford University Press;Imetolewa tena kwa idhini kutoka kwa Kumb.5.NAS;"Host-Microbe Co-Culture" ilichukuliwa kwa ruhusa kutoka kwa ref.3.NAS;"Mfano wa Ugonjwa" uliochukuliwa kwa ruhusa kutoka kwa kumbukumbu.5.NAS.
Chips zote mbili za gut-on-chip na mseto zilibuniwa kwa kutumia nakala za PDMS ambazo zilivunjwa kutoka kwa ukungu wa silicon kwa lithography1,44 na kuchorwa na SU-8. Muundo wa mikondo midogo katika kila chip huamuliwa kwa kuzingatia hidrodynamics kama vile mkazo wa shear na shinikizo la hidrodynamic1,4,12. Muundo wa awali wa Database iliyounganishwa (Expressed Data) njia ndogo ndogo zinazofanana, zimebadilika na kuwa gut-on-a-chip changamano (Data Iliyopanuliwa Kielelezo 1b) ambayo inajumuisha jozi ya njia ndogo zilizopinda ili kushawishi Ongezeko la muda wa makazi ya maji, mifumo ya mtiririko usio na mstari, na ubadilikaji wa seli nyingi za kitamaduni (Mchoro 2a-f) 12.Wakati utumbo wa kibayolojia unaweza kuchaguliwa kuwa ngumu zaidi. Tumethibitisha kuwa Gut-Chip iliyochanganyikiwa pia hushawishi kwa nguvu mofojenesisi ya 3D katika muda sawa na kiwango sawa cha ukuaji wa epithelial ikilinganishwa na Gut-Chip asili, bila kujali aina ya seli iliyokuzwa. Kwa hivyo, ili kuleta mofojenesisi ya 3D, miundo ya gut ya 3D na changamano inaweza kubadilishana. Miundo hasi ya PDMS kwenye moshi 8 ya silicon inayotolewa na silicon.2a).Ili kutengeneza utumbo kwenye chip, safu ya juu ya PDMS iliyotayarishwa iliunganishwa kwa mtiririko kwa filamu ya PDMS yenye vinyweleo na kisha kusawazishwa na safu ya chini ya PDMS kwa uunganisho usioweza kutenduliwa kwa kutumia dawa ya corona (Kielelezo 2b-f). Ili kutengeneza chipsi mseto, nakala za PDMS zilizoponywa ziliunganishwa kwenye vifaa vya kioo vinavyoweza kuunganishwa kwenye kifaa kimoja cha Transflul. Kielelezo cha 2h na Data Iliyoongezwa Kielelezo 2).Mchakato wa kuunganisha unafanywa kwa kutibu nyuso za replica ya PDMS na kioo na plasma ya oksijeni au matibabu ya corona.Baada ya sterilization ya kifaa cha microfabricated kilichounganishwa na tube ya silicone, usanidi wa kifaa ulikuwa tayari kufanya mofogenesis ya 3D ya epithelium ya matumbo 2g (Kielelezo).
a, Mchoro wa kimkakati wa utayarishaji wa sehemu za PDMS kutoka kwa ukungu za silikoni zenye muundo wa SU-8. Suluhisho la PDMS ambalo halijatibiwa lilimwagwa kwenye ukungu wa silicon (kushoto), kuponywa kwa 60 °C (katikati) na kubomolewa (kulia). PDMS iliyobomolewa ilikatwa vipande vipande na kusafishwa kwa matumizi zaidi.b, Picha iliyotumiwa kwenye safu ya silicon ya mold ya silicon. tengeneza utando wa vinyweleo vya PDMS.d, Msururu wa picha za sehemu za juu na za chini za PDMS na kifaa cha utumbo kilichounganishwa kwenye chip.e, Kiratibu cha upangaji wa sehemu za juu, za membrane na za chini za PDMS. Kila safu huunganishwa bila kurekebishwa na plasma au matibabu. k.m. Utumbo uliotungwa kwenye chip iliyounganishwa na bomba la silikoni na sindano iliwekwa kwenye kifuniko. Kifaa cha chip kiliwekwa kwenye kifuniko cha sahani ya Petri ya mm 150 kwa ajili ya usindikaji. Kifungashio hutumika kufunga bomba la silicone.h, Visual hybrids chipsD genesis chipsD, Visual hybrids genesis. iliyoandaliwa kwa kujitegemea kwa utamaduni 2D monolayers ya seli za epithelial za matumbo ziliingizwa kwenye chip ya mseto ili kushawishi mofogenesis ya 3D ya matumbo. Ya kati inapuuzwa kwa njia ya microchannels chini ya safu ya seli iliyoanzishwa kwenye kuingiza Transwell. Upau wa Scale, 1 cm.h Imechapishwa tena kwa ruhusa kutoka kwa kumbukumbu.4.Elsevier.
Katika itifaki hii, mstari wa seli ya Caco-2 na organoidi za matumbo zilitumika kama vyanzo vya epithelial (Mchoro 3a). Aina zote mbili za seli zilikuzwa kwa kujitegemea (Sanduku la 2 na Sanduku la 5) na kutumika kwa mbegu za microchannels zilizofunikwa na ECM za uwekaji wa on-chip au Transwell. Wakati seli zinaunganishwa (> 95%) 0 na 50) katika T-flasks huvunwa ili kuandaa kusimamishwa kwa seli zilizotenganishwa kwa maji ya trypsinization (sanduku 2). Oganoid za matumbo ya binadamu kutoka kwa biopsies ya matumbo au upasuaji wa upasuaji zilipandwa katika domes za scaffold za Matrigel katika sahani 24 za visima ili kuunga mkono muundo wa muundo wa microenvironment, asggennt, na microenvironment muhimu ya Rypogennt, na Nophogennt ya Rypogennt, na aggsndiuch muhimu. vipengele vya ukuaji vilivyotayarishwa kama ilivyoelezwa katika Kisanduku cha 3 viliongezewa kila siku nyingine hadi oganoidi zilipokua hadi ~ 500 µm kwa kipenyo. Oganoidi zilizokua kikamilifu huvunwa na kugawanywa katika seli moja kwa ajili ya kuotesha kwenye utumbo au kuwekewa Transwell kwenye chip (Sanduku 5). Kama tulivyoripoti hapo awali, inaweza kutofautishwa kulingana na ugonjwa wa aina12,13, ugonjwa wa ulcerative, saratani ya koloni, saratani ya ngozi, ugonjwa wa kawaida wa vidonda, ugonjwa wa ngozi, ugonjwa wa ngozi, ugonjwa wa ngozi, ugonjwa wa ugonjwa wa ngozi, ugonjwa wa ugonjwa wa ngozi, ugonjwa wa ugonjwa wa ngozi, ugonjwa wa ngozi, au ugonjwa wa ngozi ya kawaida. tovuti (kwa mfano, kidonda dhidi ya eneo lisilo na vidonda) na eneo la utumbo kwenye njia ya utumbo (km, duodenum, jejunum, ileamu, cecum, colon, au rectum). Tunatoa itifaki iliyoboreshwa katika Kisanduku cha 5 kwa ajili ya ukuzaji wa oganoidi za koloni (coloids) ambazo kwa kawaida zinahitaji viwango vya juu vya mofojeni au mofrojeni ndogo.
a, Mtiririko wa kazi kwa ajili ya kuingizwa kwa mofogenesis ya gut katika chip ya gut.Caco-2 epithelium ya matumbo ya binadamu na organoids ya matumbo hutumiwa katika itifaki hii ili kuonyesha morphogenesis ya 3D. Seli za epithelial zilizotengwa zilipandwa kwenye kifaa kilichoandaliwa cha gut-on-a-chip (maandalizi ya chip). Mara tu seli zinapowekwa kwenye membrane (iliyounganishwa) kwa siku (PDD). D0), mtiririko wa apical (AP) huanzishwa na kudumishwa kwa siku 2 za kwanza (mtiririko, AP, D0-D2) .Mtiririko wa Basolateral (BL) pia huanzishwa pamoja na mwendo wa kunyoosha wa mzunguko (kunyoosha, mtiririko, AP na BL) wakati monolayer kamili ya 2D inapoundwa.Mofogenesis ya 3D ya utumbo ilitokea siku za kitamaduni za uwakilishi wa micromorphosesi ya 5 D kwa hiari (5). ya seli za Caco-2 katika kila hatua ya majaribio au hatua ya muda (grafu ya upau, 100 µm).Michoro minne ya mpangilio inayoonyesha misururu inayolingana ya mofojenesisi ya utumbo (juu kulia). Mishale iliyopasuka katika mpangilio inawakilisha mwelekeo wa mtiririko wa umajimaji.b, picha ya SEM inayoonyesha topolojia ya uso wa kisanduku cheupe cha 3D (sehemu nyeupe) kuangazia kisanduku cheupe cha 3D. inaonyesha microvilli iliyozalishwa upya kwenye safu ya 3D Caco-2 (kulia).c, Mtazamo wa mbele wa Mlalo wa Caco-2 3D iliyoanzishwa, claudin (ZO-1, nyekundu) na utando wa mpaka wa brashi unaoendelea unaoitwa F-actin (kijani) na nuclei (bluu) Taswira ya uti wa mgongo wa Immunofluorescence confocal ya chembechembe za epithelial kwenye sehemu ya katikati ya chembechembe za kiini cha katikati. confocal view.d, Muda wa mabadiliko ya kimofolojia katika oganoidi zilizopandikizwa kwenye chip iliyopatikana kwa hadubini ya utofautishaji wa awamu katika siku ya 3, 7, 9, 11, na 13. Sehemu iliyoingizwa (juu kulia) inaonyesha ukuzaji wa juu wa picha iliyotolewa. k.m, picha ya DIC ya epithelium ya organoid ya 3D iliyoanzishwa kwenye chembechembe za matumbo ya siku 7, ikionyesha picha za mashina ya siku 7 kwenye gut. GR5;magenta), seli za glasi (MUC2; kijani), F-actin (kijivu) na nuclei (cyan) zilizokuzwa kwenye chips za matumbo kwa siku 3, mtawalia (Kushoto) na organoidi za siku 13 (za kati) kwenye safu ya epithelial. Tazama pia Kielelezo cha 3 cha Data Iliyopanuliwa, kinachoangazia uonyeshaji wa LGR5 bila muundo wa muundo wa 3 wa MUC2. epithelium ya oganoid iliyoanzishwa kwenye utumbo kwenye chip kwa kutia rangi kwenye plasma kwa rangi ya CellMask (kulia) katika siku ya 13 ya utamaduni. Upau wa kipimo ni 50 μm isipokuwa imeelezwa vinginevyo.b Imechapishwa tena kwa ruhusa kutoka kwa marejeleo.2.Oxford University Press;c Imechukuliwa kwa idhini kutoka kwa Rejea.2.Oxford University Press;e na f ilichukuliwa kwa ruhusa kwa marejeleo.12 Chini ya Leseni ya Creative Commons CC BY 4.0.
Katika utumbo kwenye chip, ni muhimu kurekebisha uso wa haidrofobu wa utando wa PDMS kwa ajili ya upako wa ECM uliofaulu. Katika itifaki hii, tunatumia mbinu mbili tofauti kurekebisha haidrofobu ya membrane za PDMS. Kwa kukuza seli za Caco-2, uanzishaji wa uso kwa matibabu ya UV/ozoni pekee ulitosha kupunguza haidrofobu na kuambatisha seli za uso wa hydrophobicity ya Caco-2MS. milele, utamaduni wa microfluidic wa epithelium ya organoid inahitaji utendakazi wa uso unaotegemea kemikali ili kufikia utuaji bora wa protini za ECM kwa kutumia polyethilini (PEI) na glutaraldehyde kwa njia ndogo za PDMS. utamaduni huanza na perfusing ya kati tu ndani ya microchannel ya juu mpaka seli kuunda monolayer kamili, wakati microchannel ya chini hudumisha hali tuli.Njia hii iliyoboreshwa ya uanzishaji wa uso na mipako ya ECM inawezesha kiambatisho cha epithelium ya organoid kushawishi mofogenesis ya 3D kwenye uso wa PDMS.
Tamaduni za Transwell pia zinahitaji mipako ya ECM kabla ya mbegu za seli;hata hivyo, tamaduni za Transwell hazihitaji hatua ngumu za matayarisho ili kuamilisha uso wa viingilio vya vinyweleo.Kwa ukuaji wa seli za Caco-2 kwenye viingilio vya Transwell, mipako ya ECM kwenye viingilio vya porous huharakisha kuunganishwa kwa seli za Caco-2 zilizotenganishwa (In vitro 3D morphogenesis inaweza kuanzishwa kwa kutumia mtiririko wa maji kwenye kipengele cha msingi cha safu ya epithelial iliyoanzishwa. Katika utumbo kwenye chip, morphogenesis ya epithelial ilianza wakati kati iliingizwa kwenye mikondo ya juu na ya chini (Mchoro 3a) .Kama ilivyoelezwa hapo awali, ni muhimu kuanzisha mtiririko wa siri wa mofogensi ( uondoaji wa siri wa mofojeni katika uondoaji wa mofojeni unaoendelea). inhibitors.Ili kutoa virutubisho vya kutosha na seramu kwa seli zilizofungwa kwenye utando wa vinyweleo na kutoa mkazo wa kung'aa kwa mwanga, kwa kawaida tunaweka mtiririko wa pande mbili kwenye utumbo kwenye chip.Katika chipsi za mseto, vichocheo vya Transwell vilivyo na tabaka moja za epithelial viliingizwa kwenye chip za mseto.Kisha, cha kati kiliwekwa chini ya upande wa basolateral wa kipenyo cha Transwell. majukwaa yote mawili ya kitamaduni.
Vipengele vya kimofolojia vya tabaka za epithelial zenye uhandisi wa 3D zinaweza kuchanganuliwa kwa kutumia mbinu mbalimbali za upigaji picha, ikiwa ni pamoja na hadubini ya utofautishaji wa awamu, hadubini ya utofautishaji wa utofautishaji (DIC), SEM, au hadubini ya immunofluorescence confocal (Takwimu 3 na 4). Utofautishaji wa awamu au upigaji picha wa DIC unaweza kutekelezwa kwa urahisi wakati wa uundaji wa umbo la DIC wakati wowote wa uundaji wa umbo la 3D. e kwa uwazi wa macho wa PDMS na filamu za polyester, majukwaa ya gut-on-a-chip na chip ya mseto yanaweza kutoa taswira ya wakati halisi bila kuhitaji kutenganisha kifaa au kutenganisha kifaa. Wakati wa kutekeleza upigaji picha wa immunofluorescence (Takwimu 1, 3c, f na 4b, na 4b), seli za triformed na 4b kawaida hufuatwa na triformed na hyde 4 (APF kwa kawaida) tani X-100 na 2% (wt/vol) ) albumin ya seramu ya ng'ombe (BSA), kwa utaratibu.Kulingana na aina ya seli, viambajesho tofauti, vipenyezaji na vizuia vinaweza kutumika.Kingamwili za msingi zinazolenga seli tegemezi za mstari au alama za eneo hutumika kuangazia seli zisizohamishika kwenye situ kwenye chembechembe 4, ikifuatiwa na chembechembe ya chembechembe 6, na kingamwili inayolenga 6. diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) au F-actin (km, iliyoandikwa kwa fluorescently phalloidin). Upigaji picha wa moja kwa moja unaotegemea Fluorescence unaweza pia kufanywa katika situ ili kugundua utokaji wa kamasi (Mtini.1, "Utofautishaji wa seli" na "Fiziolojia ya matumbo"), ukoloni bila mpangilio wa seli za vijidudu (Mchoro 1, "Tamaduni shirikishi ya vijiumbe-jeshi"), uandikishaji wa seli za kinga (Mchoro 1, 'Mfano wa Ugonjwa') au mtaro wa mofolojia ya epithelial ya 3D (Kielelezo 4bc kwenye safu ya kurekebisha, na kutenganisha safu ya 3D kutoka kwa urekebishaji, f. safu ya chini ya chaneli ndogo, kama inavyofafanuliwa katika kielelezo cha 2, mofolojia ya epithelial ya 3D na vile vile microvilli kwenye mpaka wa brashi ya apical inaweza kuonyeshwa kwa SEM (Mchoro 3b). Usemi wa vialama vya upambanuzi unaweza kutathminiwa kwa kutekeleza kiasi cha PCR5 au chipsi za seli moja za RNA katika safu ya mseto ya RNA iliyokuzwa katika safu ya 3 ya seli za RNA. huvunwa kwa trypsinization na kisha kutumika kwa uchambuzi wa molekuli au jeni.
a, Mtiririko wa kazi kwa ajili ya kuingiza mofojenesisi ya matumbo katika chip ya mseto.Caco-2 na organoidi za matumbo hutumiwa katika itifaki hii ili kuonyesha mofojenesisi ya 3D katika jukwaa la chip cha mseto. Seli za epithelial zilizotenganishwa zilipandwa katika viingilio vya Transwell vilivyotayarishwa (TW prep; tazama kielelezo hapa chini) .Mara baada ya seli ziliwekwa chini ya seli za polyester zilizowekwa chini ya hali ya mbegu zilizowekwa chini ya seli za polyester. (Ttamaduni ya TW).Baada ya siku 7, kichocheo kimoja cha Transwell kilicho na safu ya 2D ya seli za epithelial kiliunganishwa kwenye chipu ya mseto ili kuanzisha mtiririko wa basolateral (Flow, BL), ambayo hatimaye ilisababisha kuzalishwa kwa safu ya epithelial ya 3D (morphogenesis).Mikrografu ya awamu ya utofautishaji inayoonyesha vipengele vya kimofolojia vya seli za koloni3 zilizotoka kwa safu ya kiungo cha binadamu1 kama safu ya kawaida ya kiungo cha binadamu. hatua au hatua ya wakati.Michoro katika tabaka za juu zinaonyesha usanidi wa majaribio kwa kila hatua.b, Chipu za Mseto (mchoro wa kushoto) zinaweza kusababisha mofojenesisi ya 3D ya seli za epithelial za organoid zilizo na maoni ya hadubini ya juu-chini yaliyochukuliwa katika nafasi tofauti za Z (juu, katikati, na chini;tazama mpangilio wa kulia na mistari yenye vitone inayolingana).ilionyesha sifa dhahiri za kimofolojia.F-actin (cyan), nucleus (kijivu).c, Fluorescence confocal micrographs (3D angled view) ya seli za epithelial zinazotokana na oganoid zilizokuzwa katika Transwell tuli (TW; inset ndani ya kisanduku cheupe kilichopasuliwa) dhidi ya chipu cha mseto (risasi kubwa kabisa) ikilinganisha mofti ya 2D ya 2D ya mgawanyiko wa 2D. mitazamo (iliyowekwa kwenye kona ya juu kulia; "XZ") pia inaonyesha vipengele vya 2D na 3D. Upau wa kipimo, 100 µm.c Imechapishwa tena kwa ruhusa kutoka kwa marejeleo.4.Elsevier.
Udhibiti unaweza kutayarishwa kwa kutengeneza seli zile zile (Caco-2 au seli za epithelial za matumbo za organoid) kuwa tabaka mbili-dimensional chini ya hali ya kawaida ya kitamaduni tuli. Ikumbukwe kwamba, kupungua kwa virutubishi kunaweza kusababisha kutokana na uwezo mdogo wa ujazo wa njia ndogo (yaani ~4 µL katika chaneli ya juu juu ya muundo wa awali wa gut-chippisoli ya awali ya gut-chippiso na kabla ya kulinganishwa na muundo wa awali wa gut-chippiso.
Mchakato wa lithography laini unapaswa kufanywa katika chumba safi. Kwa kila safu kwenye chip (tabaka za juu na chini na utando) na chips mseto, fotomasksi tofauti zilitumiwa na kutengenezwa kwenye kaki tofauti za silicon kwa sababu urefu wa mikondo midogo ulikuwa tofauti. Urefu unaolengwa wa mikondo ya juu na ya chini ya utumbo kwenye chip ni 500 chipµ urefu wa mseto µmµ kwa mtiririko huo. 200 µm.
Weka kaki ya silicon ya inchi 3 kwenye sahani yenye asetoni. Zungusha sahani kwa upole kwa sekunde 30, kisha kausha kaki kwa hewa. Hamisha kaki kwenye sahani yenye IPA, kisha zungusha sahani kwa sekunde 30 ili kusafisha.
Suluhisho la piranha (mchanganyiko wa peroksidi ya hidrojeni na asidi ya sulfuriki iliyokolea, 1:3 (vol/vol)) inaweza kwa hiari kutumika kuongeza uondoaji wa mabaki ya kikaboni kutoka kwenye uso wa kaki wa silicon.
Suluhisho la Piranha ni babuzi sana na huzalisha joto. Tahadhari za ziada za usalama ni muhimu. Kwa utupaji wa taka, ruhusu kiyeyusho kipoe na kuhamishiwa kwenye chombo kisafi na kikavu cha taka.Tumia vyombo vya pili na uweke lebo vizuri vyombo vya taka. Tafadhali fuata miongozo ya usalama ya kituo kwa taratibu za kina zaidi.
Punguza maji kaki kwa kuziweka kwenye sahani ya moto ya 200 ° C kwa dakika 10. Baada ya maji mwilini, kaki ilitikiswa mara tano hewani ili kupoe.
Mimina ~10 g ya mpito wa kupiga picha SU-8 2100 katikati ya kaki ya silicon iliyosafishwa.Tumia kibano ili kueneza kizuia picha sawasawa kwenye kaki. Mara kwa mara weka kaki kwenye sahani ya moto ya 65°C ili kufanya kipigo cha kupiga picha kisibandike na kiwe rahisi kueneza. Usiweke kaki moja kwa moja kwenye sahani moto.
SU-8 ilisambazwa sawasawa kwenye kaki kwa kuendesha mipako inayozunguka. Panga mzunguko unaoingia wa SU-8 kwa sekunde 5-10 ili kueneza kwa kasi ya 500 rpm kwa kuongeza kasi ya 100 rpm/s. Weka mzunguuko mkuu kwa muundo wa unene wa 200 µm saa 1,500 µmµm 2 (unene wa 1,500 m³ 2pm au 500 rpm 2pm). urefu wa m kwa safu ya juu ya utumbo kwenye chip; angalia "Hatua muhimu" hapa chini) iliyowekwa kwa kuongeza kasi ya 300 rpm / s sekunde 30 kwa 1,200 rpm.
Kasi kuu ya mzunguko inaweza kubadilishwa kulingana na unene wa lengo la muundo wa SU-8 kwenye kaki ya silicon.
Ili kutengeneza mifumo ya SU-8 ya urefu wa 500 µm kwa tabaka la juu la utumbo kwenye chip, mipako ya kusokota na hatua za kuoka laini za Sanduku hili (hatua ya 7 na 8) zilirudiwa kwa mpangilio (angalia hatua ya 9) ili kutoa tabaka mbili za 250 µm Safu nene ya SU-8, ambayo inaweza kuwekwa safu ya µ2 kwa safu ya 0 na kuunganishwa kwa safu ya 0 ya 0 kwa 0. .
Oka kaki zilizopakwa kwa SU-8 kwa upole kwa kuweka kaki kwenye sahani moto ifikapo 65 °C kwa dakika 5, kisha ubadilishe mpangilio hadi 95 °C na uanguke kwa dakika 40 za ziada.
Ili kufikia urefu wa 500 μm wa muundo wa SU-8 kwenye chaneli ya juu, rudia hatua ya 7 na 8 ili kutoa tabaka mbili za 250 μm nene za SU-8.
Kwa kutumia Kilinganishi cha Mask ya UV, fanya mtihani wa taa kulingana na maagizo ya mtengenezaji ili kukokotoa muda wa mfiduo wa kaki. (muda wa mfiduo, ms) = (kipimo cha mfiduo, mJ/cm2)/(nguvu ya taa, mW/cm2).
Baada ya kubainisha muda wa kukaribia aliyeambukizwa, weka kinyago cha picha kwenye kishikilia barakoa cha kipangilio cha vinyago vya UV na uweke kibambo cha picha kwenye kaki iliyopakwa SU-8.
Weka uso uliochapishwa wa fotomask moja kwa moja kwenye upande uliofunikwa wa SU-8 wa kaki ya silicon ili kupunguza mtawanyiko wa UV.
Onyesha kaki iliyopakwa SU-8 na barakoa ya picha kwa wima hadi 260 mJ/cm2 ya mwanga wa UV kwa muda uliobainishwa mapema wa kukaribia mwanga (angalia hatua ya 10 ya kisanduku hiki).
Baada ya mwanga wa UV, kaki za silikoni zilizopakwa kwa SU-8 ziliokwa kwa 65°C kwa dakika 5 na 95°C kwa dakika 15 kwenye kila sahani moto ili kutengeneza ruwaza zenye urefu wa 200 μm. Ongeza muda wa baada ya kuoka kwa 95 °C hadi dakika 30 ili kutengeneza ruwaza zenye urefu wa 500 µm.
Msanidi hutiwa ndani ya bakuli la glasi, na kaki iliyookwa huwekwa kwenye sahani. Kiasi cha msanidi wa SU-8 kinaweza kutofautiana kulingana na saizi ya sahani ya glasi. Hakikisha kuwa unatumia msanidi wa kutosha wa SU-8 ili kuondoa kabisa SU-8. Kwa mfano, unapotumia sahani ya glasi yenye kipenyo cha mm 150 na uwezo wa L 1, tumia kwa upole wa dakika 300 ya mold ya SU-8. .
Osha ukungu uliotengenezwa kwa ~10 mL ya msanidi mpya ikifuatiwa na IPA kwa kunyunyizia suluhisho kwa kutumia pipette.
Weka kaki kwenye kisafishaji cha plasma na uweke plasma ya oksijeni (gesi ya angahewa, shinikizo la lengo 1 × 10-5 Torr, nguvu 125 W) kwa dakika 1.5.
Weka kaki kwenye kipokezi cha utupu chenye slaidi ya glasi ndani.Kaki na slaidi zinaweza kuwekwa kando.Ikiwa kiondoa utupu kimegawanywa katika tabaka kadhaa na sahani, weka slaidi kwenye chumba cha chini na kaki kwenye chumba cha juu.Dondosha 100 μL ya glasi ya trikloroo,H2H,Hylfluororo,H2H,H2H,L telezesha kidole na uweke ombwe kwa ajili ya silanization.
Kuyeyusha bakuli la seli za Caco-2 zilizogandishwa katika umwagaji wa maji wa 37°C, kisha uhamishe seli zilizoyeyushwa hadi kwenye chupa ya T75 iliyo na mililita 15 ya 37°C iliyotiwa moto kabla ya Caco-2.
Ili kupitisha seli za Caco-2 kwa msongamano wa ~90%, kwanza joto la wastani la Caco-2, PBS, na trypsin 0.25%/1 mM EDTA katika umwagaji wa maji wa 37°C.
Aspirate medium by vacuum aspiration.Osha seli mara mbili kwa mililita 5 za PBS joto kwa kurudia utupu wa kupumua na kuongeza PBS mpya.


Muda wa kutuma: Jul-16-2022