Asante kwa kutembelea Nature.com.Unatumia toleo la kivinjari lenye uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Kwa kuongeza, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Huonyesha jukwa la slaidi tatu kwa wakati mmoja.Tumia vitufe vilivyotangulia na Vifuatavyo ili kupitia slaidi tatu kwa wakati mmoja, au tumia vitufe vya kutelezesha vilivyo mwishoni ili kupitia slaidi tatu kwa wakati mmoja.
Kizuizi cha damu-ubongo na kizuizi cha damu-ubongo huzuia mawakala wa biotherapeutic kufikia malengo yao katika mfumo mkuu wa neva, na hivyo kuzuia matibabu ya ufanisi ya magonjwa ya neva.Ili kugundua visafirishaji riwaya vya ubongo katika vivo, tulianzisha maktaba ya peptidi ya T7 na kukusanya damu mfululizo na ugiligili wa ubongo (CSF) kwa kutumia kielelezo kikubwa cha bwawa cha panya.Kloni maalum za fagio zilirutubishwa sana katika CSF baada ya duru nne za uteuzi.Kujaribiwa kwa peptidi za mgombea binafsi kulionyesha uboreshaji zaidi ya mara 1000 katika CSF.Utendaji wa kibayolojia wa utoaji wa peptidi kwa ubongo ulithibitishwa na kupunguzwa kwa 40% kwa kiwango cha amiloidi-β katika ugiligili wa ubongo kwa kutumia kizuizi cha peptidi BACE1 kilichounganishwa na peptidi ya mpito ya riwaya iliyotambuliwa.Matokeo haya yanapendekeza kwamba peptidi zinazotambuliwa na mbinu za uteuzi wa fagio katika vivo zinaweza kuwa gari muhimu kwa uwasilishaji wa kimfumo wa molekuli kuu hadi kwa ubongo na athari ya matibabu.
Utafiti wa tiba unaolengwa wa mfumo mkuu wa neva (CNS) umelenga kwa kiasi kikubwa kutambua dawa na mawakala zilizoboreshwa ambazo zinaonyesha sifa zinazolenga mfumo mkuu wa neva, huku kukiwa na juhudi kidogo katika kugundua mbinu zinazoongoza utoaji wa dawa kwa ubongo.Hii inaanza kubadilika sasa kwani uwasilishaji wa dawa, haswa molekuli kubwa, ni sehemu muhimu ya ukuzaji wa dawa za kisasa za sayansi ya neva.Mazingira ya mfumo mkuu wa neva yanalindwa vyema na mfumo wa kizuizi cha cerebrovascular, unaojumuisha kizuizi cha ubongo-damu (BBB) ​​na kizuizi cha ubongo-damu (BCBB)1, na kuifanya kuwa ngumu kupeleka dawa kwa ubongo1,2.Inakadiriwa kuwa karibu dawa zote za molekuli kubwa na zaidi ya 98% ya dawa ndogo za molekuli huondolewa kwenye ubongo3.Ndiyo maana ni muhimu sana kutambua mifumo mpya ya usafiri wa ubongo ambayo hutoa utoaji wa ufanisi na maalum wa dawa za matibabu kwa CNS 4,5.Hata hivyo, BBB na BCSFB pia zinawasilisha fursa nzuri ya utoaji wa dawa zinapopenya na kuingia miundo yote ya ubongo kupitia mshipa wake mpana wa mishipa.Kwa hivyo, jitihada za sasa za kutumia mbinu zisizo za uvamizi za utoaji kwenye ubongo zinategemea sana utaratibu wa usafiri wa receptor-mediated (PMT) kwa kutumia kipokezi cha BBB6 endogenous.Licha ya maendeleo muhimu ya hivi majuzi kwa kutumia njia ya kipokezi cha transferrin7,8, uendelezaji zaidi wa mifumo mipya ya uwasilishaji yenye sifa zilizoboreshwa inahitajika.Ili kufikia mwisho huu, lengo letu lilikuwa kutambua peptidi zinazoweza kupatanisha usafiri wa CSF, kwani zinaweza kutumika kimsingi kutoa macromolecules kwa CNS au kufungua njia mpya za vipokezi.Hasa, vipokezi maalum na visafirishaji vya mfumo wa cerebrovascular (BBB na BSCFB) vinaweza kutumika kama shabaha zinazowezekana za utoaji hai na maalum wa dawa za matibabu.Ugiligili wa ubongo (CSF) ni bidhaa ya siri ya plexus ya choroid (CS) na inagusana moja kwa moja na maji ya unganishi ya ubongo kupitia nafasi ya subbaraknoida na nafasi ya ventrikali4.Hivi majuzi imeonekana kuwa kiowevu cha ubongo cha subbarachnoid huenea kupita kiasi hadi katikati ya ubongo9.Tunatumai kufikia nafasi ya parenkaima kwa kutumia njia hii ya uingiaji ya subbaraknoida au moja kwa moja kupitia BBB.Ili kufanikisha hili, tulitekeleza mkakati thabiti wa uteuzi wa magugu ambayo hubainisha peptidi zinazosafirishwa na mojawapo ya njia hizi mbili tofauti.
Sasa tunaelezea mfuatano wa mbinu ya uchunguzi wa onyesho la vivo phage na sampuli za CSF pamoja na mpangilio wa juu wa matokeo (HTS) ili kufuatilia duru za awali za uteuzi na anuwai ya juu zaidi ya maktaba.Uchunguzi ulifanywa kwa panya wanaofahamu na kanula kubwa iliyopandikizwa kwa kudumu (CM) ili kuzuia uchafuzi wa damu.Muhimu zaidi, mbinu hii huchagua ulengaji wa ubongo na peptidi na shughuli za usafirishaji kwenye kizuizi cha cerebrovascular.Tulitumia fagio T7 kutokana na ukubwa wake mdogo (~60 nm)10 na tukapendekeza kuwa zinafaa kwa usafiri wa vesicles ambayo inaruhusu kuvuka kwa seli ya endothelial na/au epithelial-medulla kizuizi.Baada ya duru nne za upangaji, idadi ya fagio ilitengwa ikionyesha nguvu katika uboreshaji wa CSF na ushirika wa vyombo vidogo vya ubongo.Muhimu zaidi, tuliweza kuthibitisha matokeo yetu kwa kuonyesha kwamba peptidi bora zaidi zinazopendekezwa na zilizoundwa kwa kemikali zinaweza kusafirisha shehena ya protini hadi kwenye giligili ya ubongo.Kwanza, athari za kifamasia za mfumo mkuu wa neva zilianzishwa kwa kuchanganya peptidi inayoongoza na kizuizi cha peptidi BACE1.Kando na kuonyesha kwamba katika mikakati ya utendakazi wa vivo inaweza kutambua peptidi za usafiri wa ubongo kama vibeba shehena bora za protini, tunatarajia mbinu zinazofanana za uteuzi pia kuwa muhimu katika kutambua njia mpya za usafiri wa ubongo.
Kulingana na vitengo vya kutengeneza plaque (PFU), baada ya hatua ya ufungaji wa fagio, maktaba ya peptidi za fagisi za mstari wa 12-mer zenye utofauti wa takriban 109 iliundwa na kuundwa (angalia Nyenzo na Mbinu).Ni muhimu kutambua kwamba tulichanganua maktaba hii kwa uangalifu kabla ya upanuzi wa vivo.Ukuzaji wa PCR wa sampuli za maktaba ya fagio kwa kutumia vitangulizi vilivyobadilishwa vilivyotolewa vya amplicons ambazo zilitumika moja kwa moja kwa HTS (Mchoro wa ziada 1a).Kutokana na a) hitilafu za mpangilio wa HTS11, b) athari kwa ubora wa vianzio (NNK)1-12, na c) uwepo wa aina ya pori (wt) fagio (viingilio vya mifupa) katika maktaba ya kusubiri, utaratibu wa kuchuja mlolongo ulitekelezwa ili kutoa taarifa za mfuatano zilizothibitishwa pekee (Mchoro wa Nyongeza 1b).Hatua hizi za kichujio hutumika kwa maktaba zote za mpangilio wa HTS.Kwa maktaba ya kawaida, jumla ya usomaji 233,868 ulipatikana, ambapo 39% walipitisha vigezo vya kuchuja na kutumika kwa uchambuzi wa maktaba na uteuzi kwa raundi zilizofuata (Kielelezo cha Nyongeza 1c–e).Usomaji ulikuwa mwingi wa jozi 3 za urefu na kilele cha nyukleotidi 36 (Mchoro wa ziada wa 1c), ikithibitisha muundo wa maktaba (NNK) 1-12.Hasa, takriban 11% ya washiriki wa maktaba walikuwa na uti wa mgongo wa aina 12-mwitu (wt) PAGISRELVDKL, na karibu nusu ya mifuatano (49%) ilikuwa na viambajengo au ufutaji.HTS ya maktaba ilithibitisha utofauti mkubwa wa peptidi katika maktaba: zaidi ya 81% ya mlolongo wa peptidi ilipatikana mara moja tu na 1.5% tu ilitokea katika nakala ≥4 (Mchoro wa Nyongeza 2a).Masafa ya amino asidi (aa) katika nafasi zote 12 kwenye repertoire yalihusiana vyema na masafa yanayotarajiwa kwa idadi ya kodoni zinazozalishwa na repertoire iliyoharibika ya NKK (Mchoro wa Nyongeza 2b).Mzunguko unaozingatiwa wa mabaki ya aa yaliyosimbwa na viingilio hivi yanahusiana vizuri na mzunguko uliohesabiwa (r = 0.893) (Mchoro wa ziada wa 2c).Maandalizi ya maktaba ya fagio kwa sindano ni pamoja na hatua za kukuza na kuondoa endotoxin.Hapo awali hii imeonyeshwa kuwa inaweza kupunguza utofauti wa maktaba za fagio12,13.Kwa hivyo, tulipanga maktaba ya fagio iliyoimarishwa kwa sahani ambayo ilikuwa imeondolewa endotoxin na kuilinganisha na maktaba asilia ili kukadiria mara kwa mara ya AA.Uwiano wenye nguvu (r = 0.995) ulionekana kati ya bwawa la awali na bwawa lililoimarishwa na kutakaswa (Mchoro wa ziada wa 2d), ikionyesha kuwa ushindani kati ya clones zilizopanuliwa kwenye sahani kwa kutumia T7 phage haukusababisha upendeleo mkubwa.Ulinganisho huu unatokana na marudio ya motifu za tripeptidi katika kila maktaba, kwa kuwa anuwai ya maktaba (~109) haiwezi kunaswa kikamilifu hata kwa HTS.Uchambuzi wa mara kwa mara wa aa katika kila nafasi ulifunua upendeleo mdogo wa kutegemea nafasi katika nafasi tatu za mwisho za repertoire iliyoingia (Mchoro wa ziada wa 2e).Kwa kumalizia, tulihitimisha kuwa ubora na utofauti wa maktaba ulikubalika na ni mabadiliko madogo tu katika utofauti yalizingatiwa kutokana na ukuzaji na utayarishaji wa maktaba za fagio kati ya duru kadhaa za uteuzi.
Sampuli ya kiowevu cha uti wa mgongo inaweza kufanywa kwa kupandikiza kanula kwenye CM ya panya fahamu ili kuwezesha utambuzi wa fagio T7 iliyodungwa kwa njia ya mshipa (iv) kupitia BBB na/au BCSFB (Mchoro 1a-b).Tulitumia silaha mbili za uteuzi huru (silaha A na B) katika raundi tatu za kwanza za uteuzi wa vivo (Mchoro 1c).Hatua kwa hatua tuliongeza ukali wa uteuzi kwa kupunguza jumla ya kiasi cha fagio iliyoletwa katika awamu tatu za kwanza za uteuzi.Kwa raundi ya nne ya upanuzi, tuliunganisha sampuli kutoka kwa matawi A na B na tukafanya chaguzi tatu za ziada za kujitegemea.Kuchunguza sifa za vivo za chembe za fagio T7 katika modeli hii, fagio aina ya mwitu (PAGISRELVDKL master insert) ilidungwa ndani ya panya kupitia mshipa wa mkia.Urejeshaji wa fagio kutoka kwa ugiligili wa ubongo na damu kwa wakati tofauti ulionyesha kuwa phaji ndogo za T7 za icosahedral zilikuwa na awamu ya haraka ya kibali kutoka kwa sehemu ya damu (Kielelezo cha 3 cha Nyongeza).Kulingana na titers kusimamiwa na kiasi cha damu ya panya, sisi mahesabu kwamba tu takriban 1% wt.phage kutoka kwa kipimo kilichosimamiwa iligunduliwa katika damu dakika 10 baada ya sindano ya mishipa.Baada ya upungufu huu wa haraka wa awali, kibali cha polepole cha msingi kilipimwa na nusu ya maisha ya dakika 27.7.Muhimu, ni fagio chache tu zilitolewa kutoka kwa sehemu ya CSF, ikionyesha hali ya chini ya uhamiaji wa fagio wa aina ya mwitu kwenye sehemu ya CSF (Mchoro wa 3 wa Nyongeza).Kwa wastani, ni takriban 1 x 10-3% tu ya chembechembe za T7 kwenye damu na 4 x 10-8% ya giligili zilizoingizwa hapo awali ziligunduliwa kwenye giligili ya ubongo katika kipindi chote cha sampuli (dakika 0-250).Hasa, nusu ya maisha (dakika 25.7) ya phaji ya aina ya mwitu katika giligili ya uti wa mgongo ilikuwa sawa na ile inayoonekana katika damu.Data hizi zinaonyesha kuwa kizuizi kinachotenganisha sehemu ya CSF kutoka kwa damu kiko sawa katika panya zilizowekwa kwenye CM, na hivyo kuruhusu uteuzi wa maktaba za fagio ili kutambua clones ambazo husafirishwa kwa urahisi kutoka kwa damu hadi kwenye chumba cha CSF.
(a) Kuweka mbinu ya kuchukua tena sampuli ya ugiligili wa ubongo (CSF) kutoka kwenye bwawa kubwa.(b) Mchoro unaoonyesha eneo la seli za kizuizi cha mfumo mkuu wa neva (CNS) na mkakati wa uteuzi unaotumiwa kutambua peptidi zinazovuka kizuizi cha ubongo-damu (BBB) ​​na kizuizi cha ubongo-damu.(c) Chati ya uchunguzi ya maonyesho ya fagio katika vivo.Katika kila duru ya uteuzi, fagio (vitambulisho vya wanyama ndani ya mishale) vilidungwa kwa njia ya mshipa.Matawi mawili huru mbadala (A, B) huwekwa kando hadi awamu ya 4 ya uteuzi.Kwa raundi ya 3 na 4 ya uteuzi, kila kisanii cha fagio kilichotolewa kutoka kwa CSF kilipangwa kwa mikono.(d) Kinetiki ya faji kutengwa na damu (duara nyekundu) na ugiligili wa ubongo (pembetatu ya kijani) wakati wa raundi ya kwanza ya uteuzi katika panya mbili za makopo baada ya kudungwa kwa mishipa ya maktaba ya peptidi ya T7 (2 x 1012 phages/mnyama).Viwanja vya bluu vinaonyesha wastani wa mkusanyiko wa awali wa phaji katika damu, iliyohesabiwa kutoka kwa kiasi cha phaji iliyoingizwa, kwa kuzingatia jumla ya kiasi cha damu.Viwanja vyeusi vinaonyesha mahali pa makutano ya mstari y uliotolewa kutoka kwa viwango vya phaji la damu.(e,f) Onyesha masafa ya jamaa na usambazaji wa motifu zote zinazopishana za tripeptidi zinazopatikana kwenye peptidi.Idadi ya motifs inayopatikana katika usomaji 1000 imeonyeshwa.Kwa kiasi kikubwa (p <0.001) motif zilizoboreshwa zina alama ya dots nyekundu.(e) Kitambaa cha uwiano kinacholinganisha marudio ya kiasi cha motifu ya tripeptidi ya maktaba iliyodungwa na fagio linalotokana na damu kutoka kwa wanyama #1.1 na #1.2.(f) Uwiano scatterplot kulinganisha masafa ya jamaa ya wanyama fage tripeptide motifs #1.1 na #1.2 pekee katika damu na ugiligili wa ubongo.(g, h) Uwakilishi wa kitambulisho cha mfuatano wa fagio iliyorutubishwa katika damu (g) ​​dhidi ya maktaba zilizodungwa na fagio iliyoboreshwa katika CSF (h) dhidi ya damu baada ya awamu ya uteuzi wa wanyama katika wanyama wote wawili.Ukubwa wa msimbo wa herufi moja unaonyesha ni mara ngapi asidi hiyo ya amino hutokea katika nafasi hiyo.Kijani = polar, zambarau = neutral, bluu = msingi, nyekundu = tindikali na nyeusi = haidrofobu amino asidi.Kielelezo 1a, b kiliundwa na kutayarishwa na Eduard Urich.
Tulidunga maktaba ya peptidi ya fagio katika panya wawili wa chombo cha CM (clade A na B) na faji iliyotengwa kutoka kwa maji na damu ya uti wa mgongo (Mchoro 1d).Uondoaji wa haraka wa awali wa maktaba haukutamkwa kidogo ikilinganishwa na fagio la aina ya mwitu.Nusu ya maisha ya maktaba iliyodungwa katika wanyama wote wawili ilikuwa dakika 24.8 katika damu, sawa na fagio aina ya mwitu, na dakika 38.5 katika CSF.Sampuli za phaji za damu na ugiligili wa ubongo kutoka kwa kila mnyama ziliathiriwa na HTS na peptidi zote zilizotambuliwa zilichambuliwa kwa uwepo wa motifu fupi ya tripeptidi.Motifu za Tripeptide zilichaguliwa kwa sababu hutoa msingi mdogo wa uundaji wa muundo na mwingiliano wa peptidi-protini14,15.Tulipata uwiano mzuri katika usambazaji wa motifs kati ya maktaba ya phaji iliyoingizwa na clones iliyotolewa kutoka kwa damu ya wanyama wote wawili (Mchoro 1e).Takwimu zinaonyesha kuwa muundo wa maktaba umeboreshwa kidogo tu katika sehemu ya damu.Masafa ya asidi ya amino na mifuatano ya makubaliano ilichanganuliwa zaidi katika kila nafasi kwa kutumia urekebishaji wa programu ya Weblogo16.Inashangaza, tulipata uboreshaji mkubwa katika mabaki ya glycine ya damu (Mchoro 1g).Wakati damu ikilinganishwa na clones kuchaguliwa kutoka CSF, uteuzi nguvu na baadhi deselection ya motifs walikuwa aliona (Mtini. 1f), na baadhi ya amino asidi walikuwa preferentially sasa katika nafasi predetermined katika 12-mwanachama (Mtini. 1h).Hasa, wanyama binafsi walitofautiana kwa kiasi kikubwa katika maji ya cerebrospinal, ambapo uboreshaji wa glycine ya damu ulionekana katika wanyama wote wawili (Supplementary Fig. 4a-j).Baada ya uchujaji mkali wa data ya mlolongo katika giligili ya ubongo ya wanyama #1.1 na #1.2, jumla ya peptidi 964 na 420 za kipekee za 12-mer zilipatikana (Mchoro wa Nyongeza 1d-e).Kloni za fagio zilizotengwa zilikuzwa na kukabiliwa na duru ya pili ya uteuzi wa in vivo.Phage iliyotolewa kutoka kwa awamu ya pili ya uteuzi ilikabiliwa na HTS katika kila mnyama na peptidi zote zilizotambuliwa zilitumiwa kama ingizo la programu ya utambuzi wa motifu ili kuchanganua kutokea kwa motifu za tripeptidi (Mchoro 2a, b, ef).Ikilinganishwa na mzunguko wa kwanza wa fagio zilizopatikana kutoka kwa CSF, tuliona uteuzi zaidi na uondoaji wa motif nyingi katika CSF katika matawi A na B (Mchoro 2).Algoriti ya utambulisho wa mtandao ilitumiwa ili kubaini ikiwa inawakilisha mifumo tofauti ya mfuatano thabiti.kufanana wazi alikuwa aliona kati ya Utaratibu 12-dimensional zinalipwa na CSF katika clade mbadala A (Kielelezo 2c, d) na clade B (Mtini. 2g, h).Uchanganuzi wa pamoja katika kila tawi ulifunua wasifu tofauti wa uteuzi wa peptidi za 12-mer (Mchoro wa Nyongeza. 5c, d) na ongezeko la uwiano wa CSF/titer ya damu baada ya muda kwa clones zilizounganishwa baada ya awamu ya pili ya uteuzi ikilinganishwa na awamu ya kwanza ya uteuzi (Mchoro wa Nyongeza. 5e).)
Uboreshaji wa motifu na peptidi katika ugiligili wa ubongo kwa mizunguko miwili mfululizo ya uteuzi wa onyesho la utendakazi wa in vivo.
Phaji zote za viowevu vya uti wa mgongo zilizopatikana kutoka kwa mzunguko wa kwanza wa kila mnyama (mnyama #1.1 na #1.2) ziliunganishwa, kukuzwa, kupangwa kwa HT na kudungwa tena pamoja (2 x 1010 phages/mnyama) 2 SM panya bati (#1.1 → #).2.1 na 2.2, 1.2 → 2.3 na 2.4).(a,b,e,f) Migawanyiko ya uwiano ikilinganisha marudio ya jamaa ya motifu ya tripeptidi ya phaji zote zinazotokana na CSF katika awamu ya kwanza na ya pili ya uteuzi.Uwiano wa marudio na usambazaji wa motifu zinazowakilisha tripeptidi zote zinazopishana zinazopatikana katika peptidi katika mielekeo yote miwili.Idadi ya motifs inayopatikana katika usomaji 1000 imeonyeshwa.Motifu ambazo zilichaguliwa kwa kiasi kikubwa (p <0.001) au kutengwa katika mojawapo ya maktaba zilizolinganishwa zimeangaziwa kwa nukta nyekundu.(c, d, g, h) Panga uwasilishaji wa nembo ya mfuatano mrefu wa amino asidi 12 yenye utajiri wa CSF kulingana na raundi ya 2 na 1 ya uteuzi wa in vivo.Ukubwa wa msimbo wa herufi moja unaonyesha ni mara ngapi asidi hiyo ya amino hutokea katika nafasi hiyo.Ili kuwakilisha nembo, mzunguko wa mfuatano wa CSF unaotolewa kutoka kwa wanyama binafsi kati ya duru mbili za uteuzi hulinganishwa na mfuatano ulioboreshwa katika raundi ya pili huonyeshwa: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 na (h) #1.2–#2.4.Asidi za amino zilizoboreshwa zaidi katika nafasi fulani katika (c, d) wanyama hakuna.2.1 na hapana.2.2 au (g, h) katika wanyama nambari.2.3 na hapana.2.4 zinaonyeshwa kwa rangi.Kijani = polar, zambarau = neutral, bluu = msingi, nyekundu = tindikali na nyeusi = haidrofobu amino asidi.
Baada ya awamu ya tatu ya uteuzi, tulitambua mfuatano wa kipekee wa peptidi 124 (#3.1 na #3.2) kutoka kwa clones 332 za fagio zilizoundwa upya na CSF zilizotengwa na wanyama wawili (Mchoro wa Nyongeza 6a).Mfuatano wa LGSVS (18.7%) ulikuwa na uwiano wa juu zaidi, ukifuatwa na vichochezi vya aina-mwitu PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), na SARGSWREIVSLS (2.2%).Katika duru ya nne ya mwisho, tuliunganisha matawi mawili yaliyochaguliwa kwa kujitegemea kutoka kwa wanyama watatu tofauti (Mchoro 1c).Kati ya clones 925 zilizofuatana za fagio zilizopatikana kutoka kwa CSF, katika raundi ya nne tulipata mifuatano 64 ya kipekee ya peptidi (Mchoro wa Nyongeza 6b), kati ya ambayo uwiano wa jamaa wa fagio wa aina ya mwitu ulishuka hadi 0.8%.Clones za kawaida za CSF katika raundi ya nne zilikuwa LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) na RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Urefu wa urefu wa peptidi zilizochaguliwa unatokana na uwekaji/ufutaji wa nyukleotidi au kodoni za kusimama mapema kwenye vianzio vya maktaba wakati wa kutumia kodoni zilizoharibika kwa muundo wa maktaba ya NNK.Kodoni za kusimama kabla ya wakati hutoa peptidi fupi na huchaguliwa kwa sababu zina motifu ya aa inayofaa.Peptidi ndefu zaidi zinaweza kutokana na kuwekewa/kufutwa katika vianzio vya maktaba ya syntetisk.Hii huweka kodoni ya kusimama iliyobuniwa nje ya fremu na huisoma hadi kodoni mpya ya kusimama ionekane chini ya mkondo.Kwa ujumla, tulikokotoa vipengele vya uboreshaji kwa awamu zote nne za uteuzi kwa kulinganisha data ya ingizo na data ya sampuli ya matokeo.Kwa awamu ya kwanza ya uchunguzi, tulitumia vyeo vya aina ya fagio kama marejeleo yasiyo maalum ya usuli.Inashangaza, uteuzi hasi wa fagio ulikuwa na nguvu sana katika mzunguko wa kwanza wa CSF, lakini sio katika damu (Mchoro 3a), ambayo inaweza kuwa kutokana na uwezekano mdogo wa kuenea kwa tu kwa wanachama wengi wa maktaba ya peptidi kwenye compartment ya CSF au phages jamaa huwa na kubakizwa kwa ufanisi zaidi au kuondolewa kutoka kwa damu kuliko bacteriophages.Hata hivyo, katika duru ya pili ya upanuzi, uteuzi mkubwa wa fagio katika CSF ulionekana katika makundi yote mawili, na kupendekeza kuwa duru ya awali ilirutubishwa katika fagio zinazoonyesha peptidi zinazokuza utumiaji wa CSF (Mchoro 3a).Tena, bila uboreshaji mkubwa wa damu.Pia katika raundi ya tatu na ya nne, clones za fagio zilirutubishwa kwa kiasi kikubwa katika CSF.Kulinganisha mzunguko wa jamaa wa kila mlolongo wa kipekee wa peptidi kati ya raundi mbili za mwisho za uteuzi, tuligundua kwamba mlolongo huo uliboreshwa zaidi katika awamu ya nne ya uteuzi (Mchoro 3b).Jumla ya motifu 931 za tripeptidi zilitolewa kutoka kwa mifuatano yote 64 ya kipekee ya peptidi kwa kutumia mielekeo yote miwili ya peptidi.Motifu zilizoboreshwa zaidi katika raundi ya nne zilichunguzwa kwa karibu zaidi kwa wasifu wao wa uboreshaji katika raundi zote ikilinganishwa na maktaba iliyodungwa (kukatwa: 10% uboreshaji) (Mchoro wa Nyongeza 6c).Mitindo ya jumla ya uteuzi ilionyesha kuwa nia nyingi zilizosomwa ziliboreshwa katika raundi zote za awali za matawi yote mawili ya uteuzi.Hata hivyo, baadhi ya motifu (km SGL, VSG, LGS GSV) zilitoka kwa fungu A, huku zingine (km FGW, RTN, WGF, NTR) zilirutubishwa katika fungu B.
Uthibitishaji wa usafiri wa CSF wa peptidi zinazoonyeshwa kwa fagio zilizorutubishwa na CSF na peptidi za kiongozi zenye kibayolojia zilizounganishwa kwa mizigo ya streptavidin.
(a) Uwiano wa uboreshaji unaokokotolewa katika mizunguko yote minne (R1-R4) kulingana na tita (zinazoingiza = I) za fagio (PFU) na tita za CSF zilizobainishwa (pato = O).Sababu za uboreshaji kwa raundi tatu za mwisho (R2-R4) zilihesabiwa kwa kulinganisha na mzunguko uliopita na mzunguko wa kwanza (R1) na data ya uzito.Baa wazi ni maji ya cerebrospinal, baa zenye kivuli ni plasma.(***p<0.001, kulingana na mtihani wa t wa Mwanafunzi).(b) Orodha ya peptidi za fagio nyingi zaidi, zilizoorodheshwa kulingana na uwiano wao wa jamaa na fagio zote zilizokusanywa katika CSF baada ya awamu ya 4 ya uteuzi.Nguzo sita za kawaida za fagio zimeangaziwa kwa rangi, zimeorodheshwa na sababu zao za uboreshaji kati ya raundi ya 3 na 4 ya uteuzi (zilizowekwa).(c,d) Kloni sita za fagio zilizorutubishwa zaidi, maktaba tupu za fagio na maktaba za peptidi za wazazi kutoka raundi ya 4 zilichanganuliwa kibinafsi katika modeli ya sampuli ya CSF.CSF na sampuli za damu zilikusanywa kwa muda uliowekwa.(c) Kiasi sawa cha fagio 6 za fagio (2 x 1010 fagio/wanyama), fagio tupu (#1779) (2 x 1010 fagio/wanyama) na maktaba ya fagio la hisa (2 x 1012 fagio/wanyama) Chonga angalau 3 CM inasimamiwa kwa mkia wa mnyama kando ya mshipa.Pharmacokinetics ya CSF ya kila clone ya fagi iliyodungwa na maktaba ya peptidi ya fagio baada ya muda inaonyeshwa.(d) inaonyesha wastani wa uwiano wa CSF/damu kwa fagio/mL zote zilizopatikana katika muda wa sampuli.(e) Peptidi nne za uongozi wa syntetisk na kidhibiti kimoja kilichopigwa viliunganishwa na biotin kwa streptavidin kupitia N-terminus yao (onyesho la tetramer) ikifuatiwa na sindano (mshipa wa mkia iv, 10 mg streptavidin/kg).Angalau panya tatu zilizoingizwa (N = 3).)Sampuli za CSF zilikusanywa kwa wakati ulioonyeshwa na viwango vya streptavidin vilipimwa na CSF anti-streptavidin ELISA (nd = haijagunduliwa).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, kulingana na jaribio la ANOVA).(f) Ulinganisho wa mfuatano wa asidi ya amino wa kloni ya peptidi ya faji iliyorutubishwa zaidi #2002 (zambarau) na kloni nyingine zilizochaguliwa za peptidi za feni kutoka awamu ya 4 ya uteuzi.Vipande vya asidi ya amino vinavyofanana na vinavyofanana vinawekwa rangi.
Kati ya fagio zote zilizoboreshwa katika raundi ya nne (Mchoro 3b), watahiniwa sita walichaguliwa kwa uchanganuzi zaidi wa mtu binafsi katika modeli ya sampuli ya CSF.Kiasi sawa cha fagio sita, fagio tupu (hakuna kuingiza) na maktaba za peptidi za prophage zilidungwa katika wanyama watatu wa CM waliochomwa, na dawa za dawa ziliamuliwa katika majaribio ya CSF (Mchoro 3c) na damu (Mchoro wa 7 wa Nyongeza.Nguzo zote za fagio zilizojaribiwa zililenga sehemu ya CSF katika kiwango cha mara 10-1000 zaidi ya ile ya fagio tupu ya kudhibiti (#1779).Kwa mfano, clones #2020 na #2077 zilikuwa na chembechembe za CSF takriban mara 1000 kuliko fagio la kudhibiti.Profaili ya kifamasia ya kila peptidi iliyochaguliwa ni tofauti, lakini zote zina uwezo wa juu wa CSF.Tuliona kupungua mara kwa mara baada ya muda kwa clones #1903 na #2011, ilhali kwa clones #2077, #2002 na #2009 ongezeko katika dakika 10 za kwanza linaweza kuonyesha usafiri unaoendelea lakini inahitaji kuthibitishwa.Clones #2020, #2002, na #2077 zilitulia katika viwango vya juu, huku mkusanyiko wa CSF wa clone #2009 ulipungua polepole baada ya ongezeko la awali.Kisha tulilinganisha mzunguko wa jamaa wa kila mgombea wa CSF na mkusanyiko wake wa damu (Mchoro 3d).Uwiano wa wastani wa kila mtahiniwa wa CSF na kiwango chake cha damu wakati wote wa sampuli ulionyesha kuwa watahiniwa watatu kati ya sita walirutubishwa kwa kiasi kikubwa katika CSF ya damu.Inashangaza, clone #2077 ilionyesha utulivu wa juu wa damu (Kielelezo cha 7 cha Nyongeza).Ili kuthibitisha kwamba peptidi zenyewe zina uwezo wa kusafirisha shehena nyingine isipokuwa chembe za fagio hadi kwenye sehemu ya CSF, tuliunganisha peptidi nne zinazoongoza zilizotoka kwa biotini kwenye N-terminus ambapo peptidi huambatanisha na chembe ya fagio.Peptidi za biotini (nambari za 2002, 2009, 2020 na 2077) ziliunganishwa na streptavidin (SA) ili kupata aina za multimeric zinazoiga jiometri ya phaji.Muundo huu pia ulituruhusu kupima mfiduo wa SA katika damu na ugiligili wa ubongo kama peptidi za protini zinazosafirisha shehena.Muhimu zaidi, data ya fagio mara nyingi inaweza kutolewa tena wakati peptidi za syntetisk zilisimamiwa katika muundo huu wa SA-conjugated (Mchoro 3e).Peptidi zilizopigwa zilikuwa na mfiduo mdogo wa awali na kibali cha haraka cha CSF na viwango visivyoweza kutambulika ndani ya saa 48.Ili kupata ufahamu juu ya njia za utoaji wa kloni hizi za feni ya peptidi kwenye nafasi ya CSF, tulichanganua ujanibishaji wa mipigo ya peptidi ya kila mtu kwa kutumia immunohistokemia (IHC) kugundua moja kwa moja chembe za faji saa 1 baada ya kudungwa kwa mishipa katika vivo.Hasa, clones #2002, #2077, na #2009 zinaweza kutambuliwa kwa madoa makali katika kapilari za ubongo, ilhali faji ya kudhibiti (#1779) na clone #2020 hazikugunduliwa (Mchoro wa Nyongeza 8).Hii inaonyesha kuwa peptidi hizi huchangia athari kwenye ubongo kwa kuvuka BBB.Uchambuzi wa kina zaidi unahitajika ili kujaribu nadharia hii, kwani njia ya BSCFB inaweza pia kuhusika.Wakati wa kulinganisha mlolongo wa asidi ya amino ya clone iliyoboreshwa zaidi (#2002) na peptidi nyingine zilizochaguliwa, ilibainisha kuwa baadhi yao yana upanuzi sawa wa amino asidi, ambayo inaweza kuonyesha utaratibu sawa wa usafiri (Mchoro 3f).
Kwa sababu ya wasifu wake wa kipekee wa plasma na ongezeko kubwa la CSF kwa muda, clone ya maonyesho ya fagi #2077 ilichunguzwa zaidi kwa muda mrefu wa saa 48 na iliweza kuzaa ongezeko la haraka la CSF lililozingatiwa kwa kushirikiana na viwango vya SA vilivyoendelea (Mchoro 4a).Kuhusu kloni nyingine za fagio zilizotambuliwa, #2077 ilichafuliwa sana kwa kapilari za ubongo na ilionyesha ujanibishaji mkubwa wa lectini ya kapilari ilipotazamwa kwa mwonekano wa juu na ikiwezekana madoa fulani katika nafasi ya parenkaima (Mchoro 4b).Ili kuchunguza ikiwa athari za kifamasia zinazopatanishwa na peptidi zinaweza kupatikana katika Mfumo wa neva, tulifanya jaribio ambalo matoleo ya i) ya peptidi ya usafirishaji ya #2077 na ii) peptidi ya kizuizi cha BACE1 yalichanganywa na SA kwa uwiano mbili tofauti.Kwa mchanganyiko mmoja tulitumia kizuia peptidi BACE1 pekee na kwa nyingine tulitumia uwiano wa 1:3 wa kizuizi cha peptidi BACE1 hadi #2077 peptidi.Sampuli zote mbili zilisimamiwa kwa njia ya mishipa na viwango vya damu na ugiligili wa ubongo vya beta-amyloid peptidi 40 (Abeta40) vilipimwa kwa muda.Abeta40 ilipimwa katika CSF kwani inaonyesha kizuizi cha BACE1 kwenye parenkaima ya ubongo.Kama ilivyotarajiwa, complexes zote mbili zilipunguza kwa kiasi kikubwa viwango vya damu vya Abeta40 (Mchoro 4c, d).Walakini, ni sampuli tu zilizo na mchanganyiko wa peptidi no.2077 na kiviza ya peptidi BACE1 iliyounganishwa na SA ilisababisha kupungua kwa kiasi kikubwa kwa Abeta40 katika ugiligili wa ubongo (Mchoro 4c).Takwimu zinaonyesha kuwa peptidi no.2077 ina uwezo wa kusafirisha protini ya 60 kDa SA hadi kwenye mfumo mkuu wa neva na pia husababisha athari za kifamasia kwa kutumia vizuizi vilivyounganishwa na SA vya peptidi BACE1.
(a) Sindano ya clonal (2 × 10 phages/mnyama) ya fagio T7 inayoonyesha maelezo mafupi ya pharmacokinetic ya CSF peptidi #2077 (RLSSVDSDLSGC) na phaji ya kudhibiti isiyochomwa (#1779) katika angalau panya tatu zilizoingizwa na CM.(b) Taswira ya hadubini iliyoambatanishwa ya vijidudu wakilishi vya gamba kwenye panya waliodungwa sindano ya feji (2 × 10 10 phages/mnyama) inayoonyesha kupinga peptidi #2077 na vyombo (lectin).Clones hizi za fagio zilisimamiwa kwa panya 3 na kuruhusiwa kuzunguka kwa saa 1 kabla ya kunyunyiziwa.Ubongo uliwekwa sehemu na kuchafuliwa na kingamwili zenye lebo ya polyclonal FITC dhidi ya capsid ya fagio T7.Dakika kumi kabla ya kumwagilia na kurekebisha baadae, lectin yenye lebo ya DyLight594 ilisimamiwa kwa njia ya mishipa.Picha za fluorescent zinazoonyesha lectini madoa (nyekundu) ya upande wa mwanga wa mishipa ndogo na phaji (kijani) katika lumen ya kapilari na tishu za ubongo zinazozunguka.Upau wa mizani unalingana na 10 µm.(c, d) Peptidi ya kuzuia biotini ya BACE1 peke yake au pamoja na peptidi ya usafirishaji wa biotini #2077 iliunganishwa na streptavidin ikifuatiwa na sindano ya mishipa ya angalau panya tatu za CM zilizoingizwa (10 mg streptavidin/kg).Upunguzaji wa upatanishi wa vizuizi vya peptidi BACE1 katika Aβ40 ulipimwa na Aβ1-40 ELISA katika damu (nyekundu) na ugiligili wa ubongo (machungwa) kwa muda ulioonyeshwa.Kwa uwazi zaidi, mstari wa nukta huchorwa kwenye grafu kwa kiwango cha 100%.(c) Asilimia ya kupunguzwa kwa Aβ40 katika damu (pembetatu nyekundu) na ugiligili wa ubongo (pembetatu ya chungwa) katika panya waliotibiwa kwa streptavidin iliyounganishwa ili kupitisha peptidi #2077 na peptidi ya kuzuia BACE1 katika uwiano wa 3:1.(d) Kupungua kwa asilimia ya damu Aβ40 (miduara nyekundu) na kiowevu cha ubongo (miduara ya chungwa) ya panya waliotibiwa kwa streptavidin pamoja na peptidi ya kuzuia BACE1 pekee.Mkusanyiko wa Aβ katika udhibiti ulikuwa 420 pg/ml (mkengeuko wa kawaida = 101 pg/ml).
Onyesho la fagio limetumika kwa mafanikio katika maeneo kadhaa ya utafiti wa matibabu17.Njia hii imetumika katika masomo ya utofauti wa mishipa ya vivo18,19 pamoja na tafiti zinazolenga mishipa ya ubongo20,21,22,23,24,25,26.Katika utafiti huu, tulipanua matumizi ya mbinu hii ya uteuzi sio tu kwa utambuzi wa moja kwa moja wa peptidi zinazolenga mishipa ya ubongo, lakini pia kwa ugunduzi wa watahiniwa walio na sifa tendaji za usafirishaji kuvuka kizuizi cha ubongo-damu.Sasa tunaelezea ukuzaji wa utaratibu wa kuchagua katika vivo katika panya zilizowekwa ndani ya CM na kuonyesha uwezo wake wa kutambua peptidi zilizo na sifa za homing za CSF.Kwa kutumia fagio la T7 linaloonyesha maktaba ya peptidi zisizo na mpangilio za mer 12, tuliweza kuonyesha kwamba fagio T7 ni ndogo ya kutosha (takriban kipenyo cha nm 60) 10 kubadilishwa kwa kizuizi cha ubongo-damu, na hivyo kuvuka moja kwa moja kizuizi cha damu-ubongo au mishipa ya fahamu ya koroidi.Tuliona kwamba uvunaji wa CSF kutoka kwa panya wa CM waliobatizwa ulikuwa njia iliyodhibitiwa vyema katika utendakazi wa vivo, na kwamba fagio iliyotolewa sio tu inayofungamana na vasculature bali pia ilifanya kazi kama kisafirishaji kwenye kizuizi cha ubongo-damu.Zaidi ya hayo, kwa kukusanya damu wakati huo huo na kutumia HTS kwa CSF ​​na magugu yanayotokana na damu, tulithibitisha kwamba uchaguzi wetu wa CSF haukuathiriwa na uboreshaji wa damu au usawa kwa upanuzi kati ya raundi za uteuzi.Hata hivyo, sehemu ya damu ni sehemu ya utaratibu wa uteuzi, kwa kuwa fagio zenye uwezo wa kufikia sehemu ya CSF lazima zidumu na zizunguke kwenye mkondo wa damu kwa muda wa kutosha ili kujitajirisha kwenye ubongo.Ili kupata maelezo ya kuaminika ya mfuatano kutoka kwa data mbichi ya HTS, tulitekeleza vichujio vilivyorekebishwa kwa hitilafu za upangaji wa jukwaa mahususi katika utendakazi wa uchanganuzi.Kwa kujumuisha vigezo vya kinetic katika njia ya uchunguzi, tulithibitisha pharmacokinetics ya haraka ya phages ya aina ya T7 (t½ ~ 28 min) katika damu24, 27, 28 na pia tuliamua nusu ya maisha yao katika maji ya cerebrospinal (t½ ~ 26 min) kwa dakika).Licha ya wasifu sawa wa kifamasia katika damu na CSF, ni 0.001% tu ya mkusanyiko wa damu wa fagio ingeweza kutambuliwa katika CSF, ikionyesha uhamaji wa chinichini wa fagio ya aina ya T7 kwenye kizuizi cha ubongo-damu.Kazi hii inaangazia umuhimu wa duru ya kwanza ya uteuzi wakati wa kutumia mikakati ya kutengeneza nyundo katika vivo, haswa kwa mifumo ya fagio ambayo huondolewa haraka kutoka kwa mzunguko, kwani koni chache zinaweza kufikia sehemu ya mfumo mkuu wa neva.Kwa hivyo, katika raundi ya kwanza, upunguzaji wa anuwai ya maktaba ulikuwa mkubwa sana, kwani ni idadi ndogo tu ya clones hatimaye ilikusanywa katika mtindo huu mkali sana wa CSF.Mkakati huu wa upanuzi wa vivo ulijumuisha hatua kadhaa za uteuzi kama vile mkusanyiko hai katika sehemu ya CSF, maisha ya clone katika sehemu ya damu, na uondoaji wa haraka wa clones za T7 kutoka kwa damu ndani ya dakika 10 za kwanza (Mchoro 1d na Kielelezo cha 4M cha Nyongeza).)Kwa hivyo, baada ya mzunguko wa kwanza, clones tofauti za fagio zilitambuliwa katika CSF, ingawa bwawa sawa la awali lilitumiwa kwa wanyama binafsi.Hii inapendekeza kwamba hatua nyingi kali za uteuzi wa maktaba chanzo zenye idadi kubwa ya washiriki wa maktaba husababisha kupungua kwa utofauti kwa kiasi kikubwa.Kwa hivyo, matukio ya nasibu yatakuwa sehemu muhimu ya mchakato wa uteuzi wa awali, na kuathiri sana matokeo.Kuna uwezekano kwamba wengi wa clones katika maktaba ya awali walikuwa sawa sana CSF uboreshaji propensity.Hata hivyo, hata chini ya hali sawa za majaribio, matokeo ya uteuzi yanaweza kutofautiana kutokana na idadi ndogo ya kila clone fulani katika bwawa la awali.
Motifu zilizoboreshwa katika CSF hutofautiana na zile zilizo kwenye damu.Inashangaza, tuliona mabadiliko ya kwanza kuelekea peptidi yenye utajiri wa glycine katika damu ya wanyama binafsi.(Mchoro 1g, Tini za ziada. 4e, 4f).Phaji iliyo na peptidi za glycine inaweza kuwa thabiti zaidi na uwezekano mdogo wa kutolewa nje ya mzunguko.Hata hivyo, peptidi hizi zenye utajiri wa glycine hazikugunduliwa katika sampuli za kiowevu cha ubongo, na hivyo kupendekeza kwamba maktaba zilizoratibiwa zilipitia hatua mbili tofauti za uteuzi: moja katika damu na nyingine kuruhusiwa kujilimbikiza kwenye giligili ya uti wa mgongo.Miiko iliyoboreshwa kwa CSF kutokana na awamu ya nne ya uteuzi imejaribiwa kwa kina.Takriban clones zote zilizojaribiwa kibinafsi zilithibitishwa kuwa zimerutubishwa katika CSF ikilinganishwa na fagio tupu la kudhibiti.Wimbo mmoja wa peptide (#2077) ulichunguzwa kwa undani zaidi.Ilionyesha maisha marefu ya nusu ya plasma ikilinganishwa na vibao vingine (Kielelezo 3d na Kielelezo cha Nyongeza 7), na cha kufurahisha, peptidi hii ilikuwa na mabaki ya cysteine ​​kwenye C-terminus.Hivi karibuni imeonyeshwa kuwa kuongezwa kwa cysteine ​​​​kwa peptidi kunaweza kuboresha sifa zao za pharmacokinetic kwa kuunganisha kwa albumin 29.Hii kwa sasa haijulikani kwa peptidi #2077 na inahitaji utafiti zaidi.Baadhi ya peptidi zilionyesha utegemezi wa valence katika uboreshaji wa CSF (data haijaonyeshwa), ambayo inaweza kuhusiana na jiometri ya uso iliyoonyeshwa ya capsid ya T7.Mfumo wa T7 tuliotumia ulionyesha nakala 5-15 za kila peptidi kwa kila chembe ya fagio.IHC ilifanywa kwa clones za fagio za mgombea zilizodungwa ndani ya gamba la ubongo la panya (Kielelezo cha 8 cha Nyongeza).Data ilionyesha kuwa angalau clones tatu (No. 2002, No. 2009 na No. 2077) ziliingiliana na BBB.Inabakia kubainishwa ikiwa mwingiliano huu wa BBB unasababisha mkusanyiko wa CSF au uhamishaji wa clones hizi moja kwa moja hadi BCSFB.Muhimu zaidi, tunaonyesha kwamba peptidi zilizochaguliwa huhifadhi uwezo wao wa usafiri wa CSF zinapounganishwa na kufungwa kwa shehena ya protini.Kufunga peptidi za N-terminal biotinilated kwa SA kimsingi hurudia matokeo yaliyopatikana na clones zao za faji katika damu na ugiligili wa ubongo (Mchoro 3e).Hatimaye, tunaonyesha kwamba peptidi ya risasi #2077 ina uwezo wa kukuza utendaji wa ubongo wa kiviza peptidi ya biotini ya BACE1 iliyounganishwa hadi SA, na kusababisha athari za pharmacodynamic katika CNS kwa kupunguza kwa kiasi kikubwa viwango vya Abeta40 katika CSF (Mchoro 4).Hatukuweza kutambua homologues yoyote katika hifadhidata kwa kufanya utafutaji wa homolojia ya peptidi wa vibao vyote.Ni muhimu kutambua kwamba ukubwa wa maktaba ya T7 ni takriban 109, wakati ukubwa wa maktaba ya kinadharia kwa 12-mers ni 4 x 1015. Kwa hiyo, tulichagua sehemu ndogo tu ya nafasi ya utofauti wa maktaba ya peptidi ya 12-mer, ambayo inaweza kumaanisha kuwa peptidi zilizoboreshwa zaidi zinaweza kutambuliwa kwa kutathmini nafasi ya karibu ya safu hizi zilizotambuliwa.Kidhahania, moja ya sababu kwa nini hatujapata homologues zozote za asili za peptidi hizi inaweza kuwa kutochaguliwa wakati wa mageuzi ili kuzuia uingiaji usiodhibitiwa wa motifu fulani za peptidi kwenye ubongo.
Yakijumlishwa, matokeo yetu hutoa msingi wa kazi ya baadaye ya kutambua na kubainisha mifumo ya usafiri ya kizuizi cha cerebrovascular katika vivo kwa undani zaidi.Usanidi wa kimsingi wa njia hii unatokana na mkakati wa uteuzi wa utendaji ambao hautambui tu clones zilizo na sifa za kuunganisha mishipa ya ubongo, lakini pia inajumuisha hatua muhimu ambayo kloni zilizofaulu huwa na shughuli za ndani za kuvuka vizuizi vya kibayolojia katika vivo hadi kwenye sehemu ya mfumo mkuu wa neva.ni kufafanua utaratibu wa usafiri wa peptidi hizi na upendeleo wao wa kushikamana na microvasculature maalum kwa eneo la ubongo.Hii inaweza kusababisha ugunduzi wa njia mpya za usafirishaji wa BBB na vipokezi.Tunatarajia kwamba peptidi zilizotambuliwa zinaweza kushikamana moja kwa moja na vipokezi vya ubongo au mishipa inayozunguka inayosafirishwa kupitia BBB au BCSFB.Vekta za peptidi zilizo na shughuli za usafiri za CSF zilizogunduliwa katika kazi hii zitachunguzwa zaidi.Kwa sasa tunachunguza umahususi wa ubongo wa peptidi hizi kwa uwezo wao wa kuvuka BBB na/au BCSFB.Peptidi hizi mpya zitakuwa zana muhimu sana kwa ugunduzi unaowezekana wa vipokezi au njia mpya na kwa ukuzaji wa majukwaa mapya yenye ufanisi zaidi ya uwasilishaji wa macromolecules, kama vile biolojia, hadi kwenye ubongo.
Cannulate birika kubwa (CM) kwa kutumia marekebisho ya mbinu ilivyoelezwa hapo awali.Panya wa Wistar wenye ganzi (gramu 200-350) waliwekwa kwenye kifaa cha stereotaxic na chale ya wastani ilifanywa juu ya kichwa kilichonyolewa na kilichotayarishwa kwa njia isiyofaa ili kufichua fuvu la kichwa.Piga mashimo mawili kwenye eneo la sash ya juu na funga screws za kurekebisha kwenye mashimo.Shimo la ziada lilitobolewa kwenye mwamba wa nyuma wa oksipitali kwa mwongozo wa stereotactic wa kanula ya chuma cha pua hadi kwenye CM.Weka simenti ya meno kuzunguka kanula na uimarishe kwa skrubu.Baada ya kuponya picha na ugumu wa saruji, jeraha la ngozi lilifungwa na mshono wa 4/0 wa supramid.Uwekaji sahihi wa cannula unathibitishwa na kuvuja kwa hiari kwa maji ya cerebrospinal (CSF).Ondoa panya kutoka kwa vifaa vya stereotaxic, pata utunzaji sahihi baada ya upasuaji na udhibiti wa maumivu, na uiruhusu kupona kwa angalau wiki moja hadi dalili za damu zionekane kwenye giligili ya ubongo.Panya wa Wistar (Crl:WI/Han) walipatikana kutoka Charles River (Ufaransa).Panya zote ziliwekwa chini ya hali maalum zisizo na pathogen.Majaribio yote ya wanyama yaliidhinishwa na Ofisi ya Mifugo ya Jiji la Basel, Uswisi, na yalifanywa kwa mujibu wa Leseni ya Wanyama Na. 2474 (Tathmini ya Usafirishaji wa Ubongo Hai kwa Kupima Viwango vya Wagombea wa Tiba katika Maji ya Cerebrospinal na Ubongo wa Panya).
Kwa upole mzuie panya akiwa na kanula ya CM mkononi.Ondoa Datura kutoka kwenye kanula na kukusanya 10 µl ya maji ya uti wa mgongo yanayotiririka yenyewe.Kwa kuwa uwezo wa kanula hatimaye kuathiriwa, ni sampuli za maji ya uti wa mgongo tu zisizo na ushahidi wa uchafuzi wa damu au kubadilika rangi ndizo zilijumuishwa katika utafiti huu.Sambamba, takriban 10-20 μl ya damu ilichukuliwa kutoka kwa mkato mdogo kwenye ncha ya mkia ndani ya mirija yenye heparini (Sigma-Aldrich).CSF na damu zilikusanywa kwa nyakati tofauti baada ya kudungwa kwa njia ya mshipa ya fagio T7.Takriban 5-10 μl ya maji ilitupwa kabla ya kila sampuli ya CSF kukusanywa, ambayo inalingana na kiasi kilichokufa cha catheter.
Maktaba zilitolewa kwa kutumia vekta ya T7Select 10-3b kama ilivyofafanuliwa katika mwongozo wa mfumo wa T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Kwa ufupi, uwekaji nasibu wa DNA-mer 12 uliundwa katika umbizo lifuatalo:
Kodoni ya NNK ilitumiwa ili kuepuka kodoni za kuacha mara mbili na overexpression ya amino asidi katika kuingiza.N ni uwiano wa usawa uliochanganywa kwa kila nyukleotidi, na K ni uwiano wa usawa uliochanganywa wa adenine na nyukleotidi za cytosine.Mikoa iliyokwama moja iligeuzwa kuwa DNA iliyokwama maradufu kwa kuingizwa zaidi na dNTP (Novagen) na kimeng'enya cha Klenow (New England Biolabs) katika bafa ya Klenow (Biolabs ya New England) kwa saa 3 kwa 37°C.Baada ya majibu, DNA yenye ncha mbili ilipatikana kwa kunyesha kwa EtOH.DNA iliyosababishwa ilichujwa na vimeng'enya vya kizuizi EcoRI na HindIII (zote kutoka Roche).Ingizo lililopasuliwa na kusafishwa (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) kisha liliunganishwa katika fremu katika vekta ya T7 iliyopasuliwa awali baada ya asidi ya amino 348 ya jeni ya capsid 10B.Athari za kuunganisha ziliwekwa kwenye 16 ° C. kwa saa 18 kabla ya ufungaji wa in vitro.Ufungaji wa fagio katika vitro ulifanyika kulingana na maagizo yaliyotolewa na T7Select 10-3b cloning kit (Novagen) na ufumbuzi wa ufungaji ulikuzwa mara moja kwa lysis kwa kutumia Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lisaiti ziliwekwa katikati, zimetiwa alama na kugandishwa kwa -80° C. kama suluhisho la hisa la glycerol.
Ukuzaji wa moja kwa moja wa PCR wa kanda za kutofautiana za fagio zilizopanuliwa katika mchuzi au sahani kwa kutumia primers za fusion 454/Roche-amplicon za wamiliki.Kitangulizi cha muunganisho wa mbele kina mifuatano inayozunguka eneo badiliko (NNK) 12 (kiolezo mahususi), Adapta ya Titanium ya GS FLX A, na mfuatano wa vitufe vya maktaba ya msingi nne (TCAG) (Kielelezo cha Ziada 1a):
Kitangulizi cha muunganisho wa nyuma pia kina biotini iliyoambatishwa ili kunasa shanga na Adapta B ya Titanium ya GS FLX inayohitajika kwa ukuzaji wa clonal wakati wa emulsion PCR:
Kisha amplicons ziliwekwa chini ya 454/Roche pyrosequencing kulingana na itifaki ya 454 GS-FLX Titanium.Kwa mpangilio wa mwongozo wa Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 fage DNA ilikuzwa na PCR na kupangwa kwa jozi zifuatazo za msingi:
Ingizo kutoka kwa plaques za kibinafsi ziliwekwa kwenye ukuzaji wa PCR kwa kutumia Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (kulingana na maagizo ya mtengenezaji).Anza kwa joto kali (dakika 10 kwa 95 °C) na mizunguko 35 ya kuongeza nguvu (sekunde 50 kwa 95 °C, dakika 1 kwa 50 °C, na dakika 1 kwa 72 °C).
Fagio kutoka kwa maktaba, fagio aina ya pori, fagio iliyookolewa kutoka kwa CSF na damu, au koni za kibinafsi zilikuzwa katika Escherichia coli BL5615 katika mchuzi wa TB (Sigma Aldrich) au katika sahani 500 cm2 (Thermo Scientific) kwa saa 4 kwa 37°C.Phage ilitolewa kutoka kwa bamba kwa kusuuza bamba na bafa ya Tris-EDTA (Fluka Analytical) au kwa kukusanya vibao vyenye ncha za bomba tasa.Phage zilitengwa kutoka kwa nguvu ya juu zaidi ya kitamaduni au bafa ya uchimbaji na mvua ya raundi moja ya polyethilini glikoli (PEG 8000) (Promega) na kusimamishwa tena katika bafa ya Tris-EDTA.
Faji iliyoimarishwa iliwekwa chini ya raundi 2-3 za kuondolewa kwa endotoxin kwa kutumia shanga za kuondoa endotoksini (Miltenyi Biotec) kabla ya kudungwa kwa mishipa (IV) (500 μl/mnyama).Katika mzunguko wa kwanza, fagio 2×1012 zilianzishwa;katika pili, 2 × 1010 phages;katika awamu ya tatu na ya nne ya uteuzi, 2 × 109 phages kwa kila mnyama.Maudhui ya fagio katika CSF na sampuli za damu zilizokusanywa kwa muda ulioonyeshwa iliamuliwa kwa kuhesabu plaque kulingana na maagizo ya mtengenezaji (T7Select system manual).Uteuzi wa fagio ulifanywa kwa kudunga kwa mshipa wa maktaba zilizosafishwa kwenye mshipa wa mkia au kwa kudungwa tena fagio iliyotolewa kutoka kwa CSF kutoka kwa duru ya awali ya uteuzi, na mavuno yaliyofuata yalifanywa kwa dakika 10, dakika 30, dakika 60, dakika 90, dakika 120, dakika 180, na sampuli za damu za 240 kwa mtiririko huo.Jumla ya duru nne za upanuzi wa vivo zilifanyika ambapo matawi mawili yaliyochaguliwa yalihifadhiwa kando na kuchambuliwa wakati wa awamu tatu za kwanza za uteuzi.Ingizo zote za fagio zilizotolewa kutoka kwa CSF kutoka raundi mbili za kwanza za uteuzi ziliwekwa chini ya 454/Roche pyrosequencing, wakati clones zote zilizotolewa kutoka CSF kutoka kwa awamu mbili za mwisho za uteuzi zilipangwa kwa mikono.Phaji zote za damu kutoka kwa duru ya kwanza ya uteuzi pia ziliwekwa kwa 454/Roche pyrosequencing.Kwa sindano ya clones ya fagio, fagio zilizochaguliwa zilikuzwa katika E. koli (BL5615) kwenye sahani 500 cm2 kwa 37°C kwa saa 4.Clones zilizochaguliwa kibinafsi na zilizopangwa kwa mikono zilienezwa kwa njia ya TB.Baada ya uchimbaji wa fagio, utakaso na kuondolewa kwa endotoksini (kama ilivyoelezwa hapo juu), 2×1010 phages/mnyama katika 300 μl zilidungwa kwa njia ya mshipa kwenye mshipa mmoja wa mkia.
Usindikaji na uchujaji wa ubora wa data ya mlolongo.Data ghafi ya 454/Roche ilibadilishwa kutoka umbizo la ramani ya mtiririko wa kiwango cha binary (sff) hadi umbizo la kibinadamu la Pearson (fasta) kwa kutumia programu ya mchuuzi.Uchakataji zaidi wa mfuatano wa nyukleotidi ulifanyika kwa kutumia programu na hati za C za wamiliki (kifurushi cha programu ambacho hakijatolewa) kama ilivyoelezwa hapa chini.Uchambuzi wa data ya msingi ni pamoja na taratibu kali za uchujaji wa hatua nyingi.Ili kuchuja usomaji ambao haukuwa na mfuatano halali wa DNA wa 12mer, usomaji ulipangiliwa kwa mfuatano ili kuanza lebo (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), lebo ya kuacha (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) na uwekaji wa usuli (CCCTGCAGGGATATCCCGGAGCTCTCGTCGAC) kwa kutumia jaribio la kimataifa la Needed.upangaji unaoruhusu hadi kutofautiana 2 kwa kila upangaji31.Kwa hiyo, kusoma bila kuanza na kuacha vitambulisho na kusoma zenye kuwekeza background, yaani, alignments kwamba kupita idadi inayoruhusiwa ya kutolingana, walikuwa kuondolewa kutoka maktaba.Kuhusu usomaji uliosalia, mfuatano wa DNA wa N-mer unaoenea kutoka alama ya mwanzo na kuisha kabla ya alama ya kuacha kukatwa kutoka kwa mlolongo wa awali wa kusoma na kuchakatwa zaidi (hapa inajulikana kama "ingiza").Baada ya tafsiri ya kuingiza, sehemu baada ya kodoni ya kwanza ya kuacha kwenye mwisho wa 5 wa primer huondolewa kwenye kuingiza.Kwa kuongeza, nucleotides zinazoongoza kwa codons zisizo kamili kwenye mwisho wa 3 wa primer pia ziliondolewa.Ili kutenga viingilio vilivyo na mpangilio wa usuli pekee, vipandikizi vilivyotafsiriwa vinavyoanza na muundo wa asidi ya amino “PAG” pia viliondolewa.Peptidi zenye urefu wa baada ya kutafsiriwa chini ya asidi 3 za amino ziliondolewa kwenye maktaba.Hatimaye, ondoa upungufu katika bwawa la kuingiza na uamua mzunguko wa kila kuingiza kipekee.Matokeo ya uchanganuzi huu yalijumuisha orodha ya mfuatano wa nyukleotidi (zinazoingizwa) na masafa yao (ya kusoma) (Takwimu za Ziada 1c na 2).
Uingizaji wa DNA wa Kikundi cha N-mer kwa ulinganifu wa mfuatano: Kuondoa hitilafu za mpangilio maalum wa 454/Roche (kama vile matatizo ya kupanga viendelezi vya homopolymer) na kuondoa upungufu usio muhimu sana, viingilio vya mfuatano wa N-mer vilivyochujwa hapo awali (viingizo) hupangwa kwa kufanana.viingizo (hadi besi 2 zisizolingana zinazoruhusiwa) kwa kutumia algoriti ya kurudia iliyofafanuliwa kama ifuatavyo: viingilio hupangwa kwanza kulingana na marudio yao (ya juu hadi ya chini zaidi), na ikiwa ni sawa, kwa aina ya pili kwa urefu (mrefu zaidi hadi mfupi zaidi) ).Kwa hivyo, uingizaji wa mara kwa mara na mrefu zaidi hufafanua "kundi" la kwanza.Mzunguko wa kikundi umewekwa kwa mzunguko wa ufunguo.Kisha, kila uwekaji uliosalia katika orodha iliyopangwa ulijaribiwa kuongezwa kwa kikundi kwa upatanishi wa jozi wa Needleman-Wunsch.Ikiwa idadi ya kutolingana, uingizaji, au ufutaji katika mpangilio hauzidi kizingiti cha 2, uingizaji huongezwa kwa kikundi, na mzunguko wa jumla wa kikundi huongezeka kwa mara ngapi uingizaji huongezwa.Ingizo lililoongezwa kwa kikundi hutiwa alama kuwa limetumika na kutojumuishwa katika uchakataji zaidi.Ikiwa mlolongo wa kuingiza hauwezi kuongezwa kwa kikundi kilichopo tayari, mfuatano wa kuingiza hutumiwa kuunda kikundi kipya na marudio ya kuingiza sahihi na alama kama kutumika.Marudio huisha wakati kila mfuatano wa uwekaji umetumiwa kuunda kikundi kipya au unaweza kujumuishwa katika kikundi kilichopo tayari.Baada ya yote, uwekaji wa vikundi unaojumuisha nyukleotidi hatimaye hutafsiriwa kuwa mlolongo wa peptidi (maktaba za peptidi).Matokeo ya uchambuzi huu ni seti ya uingizaji na mzunguko wao unaofanana ambao hufanya idadi ya kusoma mfululizo (Mchoro wa ziada wa 2).
Uzalishaji wa Motifu: Kulingana na orodha ya peptidi za kipekee, maktaba iliundwa ikiwa na mifumo yote inayowezekana ya asidi ya amino (aa) kama inavyoonyeshwa hapa chini.Kila muundo unaowezekana wa urefu wa 3 ulitolewa kutoka kwa peptidi na muundo wake wa kinyume uliongezwa pamoja na maktaba ya motifu ya kawaida iliyo na ruwaza zote (tripeptides).Maktaba za motifu zinazorudiwa sana zilipangwa na kuondolewa kwa upungufu.Kisha, kwa kila tripeptidi kwenye maktaba ya motif, tuliangalia uwepo wake kwenye maktaba kwa kutumia zana za kukokotoa.Katika kesi hii, mara kwa mara ya peptidi iliyo na motif tripeptidi iliyopatikana huongezwa na kupewa motif katika maktaba ya motif ("idadi ya motifs").Matokeo ya uundaji wa motifu ni safu ya pande mbili iliyo na matukio yote ya tripeptides (motifu) na maadili yao husika, ambayo ni idadi ya usomaji wa mpangilio unaosababisha motifu inayolingana wakati usomaji unachujwa, kuwekwa kwenye vikundi na kutafsiriwa.Vipimo kama ilivyoelezwa kwa undani hapo juu.
Urekebishaji wa idadi ya motifu na sehemu zinazolingana: Idadi ya motifu kwa kila sampuli ilirekebishwa kwa kutumia
ambapo ni ni idadi ya masomo yenye mada i.Kwa hivyo, vi inawakilisha asilimia ya marudio ya usomaji (au peptidi) iliyo na motif i katika sampuli.Thamani za P za idadi isiyo ya kawaida ya motifu zilihesabiwa kwa kutumia jaribio kamili la Fisher.Kuhusu urekebishaji wa idadi ya nia, uunganisho wa Spearman ulihesabiwa kwa kutumia nambari ya kawaida ya nia na R.
Ili kuibua maudhui ya amino asidi katika kila nafasi katika maktaba ya peptidi, nembo za wavuti 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ziliundwa.Kwanza, maudhui ya asidi ya amino katika kila nafasi ya peptidi 12-mer huhifadhiwa kwenye tumbo la 20 × 12.Kisha, seti ya peptidi 1000 zilizo na maudhui sawa ya asidi ya amino katika kila nafasi huzalishwa katika umbizo la mfuatano wa fasta na kutolewa kama ingizo la nembo ya 3 ya wavuti, ambayo hutoa uwakilishi wa picha wa maudhui ya asidi ya amino katika kila nafasi.kwa maktaba fulani ya peptidi.Ili kuibua mkusanyiko wa data wa pande nyingi, ramani za joto ziliundwa kwa kutumia zana iliyotengenezwa ndani katika R (biosHeatmap, kifurushi cha R ambacho bado hakijatolewa).Dendrogramu zilizowasilishwa katika ramani za joto zilikokotolewa kwa kutumia mbinu ya ngazi ya Ward ya kuunganisha kwa kipimo cha umbali cha Euclidean.Kwa uchanganuzi wa takwimu wa data ya alama za motif, thamani za P kwa alama zisizo za kawaida zilikokotolewa kwa kutumia jaribio kamili la Fisher.Thamani za P za seti zingine za data zilikokotolewa katika R kwa kutumia t-test ya Mwanafunzi au ANOVA.
Kloni za fagio zilizochaguliwa na fagio bila vichochezi vilidungwa kwa njia ya mshipa wa mshipa (2×1010 phages/mnyama katika 300 μl PBS).Dakika kumi kabla ya kunyunyiziwa na urekebishaji uliofuata, wanyama hao hao walidungwa kwa njia ya mshipa na 100 μl ya lectin yenye lebo ya DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).Dakika 60 baada ya sindano ya fagio, panya walitiwa manukato kupitia moyo na 50 ml PBS ikifuatiwa na 50 ml 4% PFA/PBS.Sampuli za ubongo zilirekebishwa kwa usiku mmoja katika 4% PFA/PBS na kulowekwa katika 30% ya sucrose usiku mmoja saa 4°C.Sampuli zimegandishwa katika mchanganyiko wa OCT.Uchambuzi wa immunohistokemikali wa sampuli zilizogandishwa ulifanywa kwa joto la kawaida kwenye 30 µm mikunjo iliyozuiwa na 1% BSA na kuwekewa kingamwili zenye lebo ya polyclonal FITC dhidi ya phaji T7 (Novus NB 600-376A) kwa 4 °C.Ingiza usiku kucha.Hatimaye, sehemu zilioshwa mara 3 na PBS na kuchunguzwa kwa darubini ya lesa ya confocal (Leica TCS SP5).
Peptidi zote zilizo na kiwango cha chini cha usafi wa 98% ziliundwa na GenScript USA, biotinylated na lyophilized.Biotin imefungwa kupitia spacer ya ziada ya glycine tatu kwenye N-terminus.Angalia peptidi zote kwa kutumia spectrometry ya wingi.
Streptavidin (Sigma S0677) ilichanganywa na ziada ya mara 5 ya usawa wa peptidi ya biotini, peptidi ya kuzuia BACE1 ya biotini, au mchanganyiko (uwiano wa 3:1) wa peptidi ya kuzuia BACE1 ya biotini na peptidi ya kuzuia BACE1 katika 5/10% ya DM iliyotiwa ndani ya SO.Saa 1 kwa joto la kawaida kabla ya sindano.Peptidi zilizounganishwa na Streptavidin zilidungwa kwa njia ya mshipa kwa kipimo cha 10 mg/kg kwenye moja ya mishipa ya mkia ya panya yenye kaviti ya ubongo.
Mkusanyiko wa streptavidin-peptide complexes ilitathminiwa na ELISA.Sahani za Nunc Maxisorp microtiter (Sigma) zilipakwa usiku kucha saa 4°C na kingamwili ya anti-streptavidin ya panya ya 1.5 μg/ml (Thermo, MA1-20011).Baada ya kuzuia (kibao cha kuzuia: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, gelatin 0.25%, 1% BSA) kwenye joto la kawaida kwa saa 2, osha sahani na 0.05% Kati-20/PBS (bafa ya kuosha) kwa Sekunde 3, CluSF100 na plasma ya plasma1 iliongezwa sampuli ya plasma1 tofauti 0, CSF 1:115).Sahani hiyo iliingizwa usiku mmoja kwa 4 ° C na kingamwili ya kugundua (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Baada ya hatua tatu za kuosha, streptavidin iligunduliwa kwa incubation katika suluhisho la substrate la TMB (Roche) kwa hadi dakika 20.Baada ya kusimamisha maendeleo ya rangi na 1M H2SO4, pima kunyonya kwa 450 nm.
Utendakazi wa streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor complex ilitathminiwa na Aβ(1-40) ELISA kulingana na itifaki ya mtengenezaji (Wako, 294-64701).Kwa ufupi, sampuli za CSF ziliyeyushwa katika kiyeyusho cha kawaida (1:23) na kuingizwa usiku kucha kwa nyuzijoto 4°C katika sahani zenye visima 96 zilizopakwa kingamwili BNT77.Baada ya hatua tano za kuosha, kingamwili ya BA27 iliyounganishwa na HRP iliongezwa na kuangaziwa kwa saa 2 kwa 4° C., ikifuatiwa na hatua tano za kuosha.Aβ(1–40) iligunduliwa kwa kuwekewa myeyusho wa TMB kwa dakika 30 kwa joto la kawaida.Baada ya maendeleo ya rangi kusimamishwa na ufumbuzi wa kuacha, pima kunyonya kwa 450 nm.Sampuli za plasma ziliwekwa chini ya uchimbaji wa awamu thabiti kabla ya Aβ (1-40) ELISA.Plasma iliongezwa kwa 0.2% DEA (Sigma) katika sahani zenye visima 96 na kuangaziwa kwenye joto la kawaida kwa dakika 30.Baada ya kuosha sahani za SPE mfululizo (Oasis, 186000679) kwa maji na methanoli 100%, sampuli za plasma ziliongezwa kwenye sahani za SPE na kioevu vyote kiliondolewa.Sampuli zilioshwa (kwanza kwa 5% methanoli kisha 30% methanoli) na kutolewa kwa 2% NH4OH/90% methanoli.Baada ya kukausha kioevu kwenye joto la 55°C kwa dakika 99 kwa mkondo wa N2 usiobadilika, sampuli zilipunguzwa katika viyeyusho vya kawaida na Aβ (1–40) ilipimwa kama ilivyoelezwa hapo juu.
Jinsi ya kutaja makala hii: Urich, E. et al.Uwasilishaji wa mizigo kwa ubongo kwa kutumia peptidi za usafirishaji zilizotambuliwa katika vivo.sayansi.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB na Moos T. Uwasilishaji wa dawa za makromolekuli kwenye ubongo kwa kutumia tiba inayolengwa.Jarida la Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., na Martinez-Martinez, P. Uwasilishaji wa dawa za peptidi na protini kwenye kizuizi cha ubongo-damu.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Kizuizi cha ubongo-damu: kizuizi katika ukuzaji wa dawa za ubongo.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, na Byrd, A. Matarajio ya uwasilishaji bora wa dawa na kulenga ubongo kupitia njia ya plexus-CSF.Utafiti wa Dawa 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Uboreshaji wa dawa za dawa kwa kutumia farasi wa Trojan wa molekuli kwa utoaji wa ubongo.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, peptidi iliyopatanishwa na kipokezi cha WM kuvuka kizuizi cha damu na ubongo.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Kuongeza kupenya kwa ubongo na ufanisi wa kingamwili za matibabu kwa kutumia shuttles za monovalent za molekuli.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Usafiri wa kipokezi cha Transferrin (TfR) huamua uchukuaji wa ubongo wa vibadala vya mshikamano wa kingamwili za TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).