Baadhi ya mada za utatuzi wa LC hazijapitwa na wakati, kwa kuwa kuna masuala katika mazoezi ya LC, hata teknolojia ya chombo inapoboreshwa baada ya muda. Kuna njia nyingi ambazo matatizo yanaweza kutokea katika mfumo wa LC na kuishia katika hali mbaya ya kilele. Masuala yanayohusiana na umbo la kilele yanapotokea, orodha fupi ya sababu zinazowezekana za matokeo haya husaidia kurahisisha uzoefu wetu wa utatuzi.
Imekuwa jambo la kufurahisha kuandika safu hii ya "Utatuzi wa Matatizo ya LC" na kufikiria kuhusu mada kila mwezi, kwa sababu baadhi ya mada huwa haziendi nje ya mtindo. Wakati katika nyanja ya utafiti wa kromatografia mada au mawazo fulani hupitwa na wakati huku yanapochukuliwa na mawazo mapya na bora zaidi, katika uga wa utatuzi, kwa kuwa makala ya kwanza ya utatuzi ilionekana katika jarida hili (bado LC miaka 9 iliyopita bado ni muhimu katika jarida 10 iliyopita). , Nimeangazia sehemu kadhaa za Utatuzi wa LC kuhusu mitindo ya kisasa inayoathiri kromatografia ya kioevu (LC) (kwa mfano, ulinganisho wa jamaa wa uelewa wetu wa athari ya shinikizo kwenye uhifadhi [2] Maendeleo Mapya) Ufafanuzi wetu wa matokeo ya LC na jinsi ya kutatua kwa kutumia zana za kisasa za LC. Katika toleo la mwezi huu, niliendelea na mada ya "Desemba 320", ambayo niliendelea na mfululizo wa mada yangu katika awamu ya 1, Desemba 320 na kuendelea na mada ya kifo. s ya utatuzi wa LC - vipengele ambavyo ni vyema kwa kitatuzi chochote ni muhimu, bila kujali umri wa mfumo tunaotumia. Mada kuu ya mfululizo huu inafaa sana kwa chati ya ukuta ya "LC Troubleshooting Guide" maarufu ya LCGC (4) inayoning'inia katika maabara nyingi. Kwa sehemu ya tatu ya mfululizo huu, nilichagua kuangazia masuala yanayohusiana na kilele cha umbo 4 au kilele cha chati. t kuzingatia masuala haya yote kwa undani katika makala moja, hivyo katika awamu hii ya kwanza juu ya mada, nitazingatia baadhi ya yale ninayoyaona mara nyingi.Natumaini watumiaji wa LC wachanga na wazee watapata vidokezo na vikumbusho vya manufaa juu ya mada hii muhimu.
Ninajikuta nikizidi kujibu maswali ya utatuzi kwa "chochote kinawezekana". Jibu hili linaweza kuonekana kuwa rahisi wakati wa kuzingatia uchunguzi ambao ni vigumu kufasiri, lakini mara nyingi naona inafaa. Pamoja na sababu nyingi zinazowezekana za umbo duni wa kilele, ni muhimu kuwa na mawazo wazi wakati wa kuzingatia shida inaweza kuwa nini, na kuwa na uwezo wa kutanguliza sababu zinazowezekana ili kuanza juhudi zetu za utatuzi, uwezekano wa kuzingatia ni zile muhimu sana.
Hatua muhimu katika zoezi lolote la utatuzi - lakini moja ambayo nadhani haijathaminiwa - ni kutambua kwamba kuna tatizo ambalo linahitaji kutatuliwa. Kutambua kwamba kuna tatizo mara nyingi kunamaanisha kutambua kwamba kile kinachotokea kwa chombo ni tofauti na matarajio yetu, ambayo yanaundwa na nadharia, ujuzi wa nguvu, na uzoefu (5). "Umbo la kilele" sio tu, kilele cha ulinganifu wa ulinganifu (umbo la ulinganifu) unaorejelewa hapa tu, ulinganifu wa ulinganifu wa ulinganifu. ffy, ukingo wa mbele, mkia, n.k.), lakini pia kwa upana.Matarajio yetu ya umbo la kilele halisi ni rahisi.Nadharia (6) inaunga mkono matarajio ya kitabu cha kiada kwamba, katika hali nyingi, vilele vya kromatografia vinapaswa kuwa linganifu na kuendana na umbo la usambazaji wa Gaussian, kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 1a. Tunachotarajia katika kilele cha suala hili katika sura tata zaidi, tutajadili kilele cha makala hii katika siku zijazo. alama ya 1 inaonyesha baadhi ya uwezekano mwingine unaoweza kuzingatiwa—kwa maneno mengine, baadhi ya njia ambazo mambo yanaweza kwenda vibaya.Katika salio la awamu hii, tutatumia muda kujadili baadhi ya mifano mahususi ya hali zinazoweza kusababisha aina hizi za maumbo.
Wakati mwingine vilele havizingatiwi kabisa katika kromatogramu ambapo vinatarajiwa kufutwa.Chati ya ukutani iliyo hapo juu inaonyesha kuwa kukosekana kwa kilele (ikizingatiwa kuwa sampuli kweli ina uchanganuzi lengwa katika mkusanyiko ambao unapaswa kufanya jibu la kigunduzi kutosha kuiona juu ya kelele) kwa kawaida huhusiana na suala fulani la kifaa au hali zisizo sahihi za awamu ya rununu (ikiwa imezingatiwa kabisa).vilele, kwa kawaida ni “dhaifu” mno).Orodha fupi ya matatizo na masuluhisho yanayoweza kutokea katika kategoria hii yanaweza kupatikana katika Jedwali la I.
Kama ilivyoelezwa hapo juu, swali la ni kiasi gani cha kupanua kilele kinapaswa kuvumiliwa kabla ya kuzingatia na kujaribu kurekebisha ni mada ngumu ambayo nitajadili katika makala ya baadaye. Uzoefu wangu ni kwamba upanuzi mkubwa wa kilele mara nyingi hufuatana na mabadiliko makubwa katika sura ya kilele, na kilele cha mkia ni kawaida zaidi kuliko kilele cha awali au kugawanyika.
Kila moja ya masuala haya yamejadiliwa kwa kina katika matoleo ya awali ya Kutatua Matatizo LC, na wasomaji wanaovutiwa na mada hizi wanaweza kurejelea nakala hizi za awali kwa habari juu ya sababu kuu na suluhisho zinazowezekana kwa maswala haya.Maelezo zaidi.
Uwekaji mkia wa kilele, uwekaji mbele wa kilele, na mgawanyiko vyote vinaweza kusababishwa na matukio ya kemikali au ya kimwili, na orodha ya suluhu zinazowezekana kwa matatizo haya inatofautiana sana, kutegemea kama tunashughulika na tatizo la kemikali au la kimwili. Mara nyingi, kwa kulinganisha kilele tofauti katika kromatogramu, unaweza kupata dalili muhimu kuhusu ambayo ni mhalifu.Ikiwa kuna uwezekano mkubwa wa kusababisha umbo moja au linalofanana, onyesho linaweza kuwa na umbo moja tu. vilele vinaathiriwa, lakini vingine vinaonekana vyema, sababu ni uwezekano mkubwa wa kemikali.
Sababu za kemikali za mkia wa kilele ni ngumu sana kujadiliwa kwa ufupi hapa. Msomaji anayevutiwa anarejelewa toleo la hivi majuzi la "Utatuzi wa Shida za LC" kwa majadiliano ya kina zaidi (10). Walakini, jambo rahisi kujaribu ni kupunguza wingi wa kichanganuzi kilichochomwa na kuona ikiwa umbo la kilele linaboresha. Ikiwa ni hivyo, basi hii ni kidokezo kizuri kwamba, njia ndogo ya kupakia, lazima iwe ndogo, kwa kesi ndogo, shida ni ndogo. au hali ya kromatografia lazima ibadilishwe ili maumbo mazuri ya kilele yaweze kupatikana hata kwa wingi mkubwa hudungwa.
Pia kuna sababu nyingi za kimwili zinazoweza kusababisha mkia wa kilele.Wasomaji wanaovutiwa na mjadala wa kina wa uwezekano wanarejelewa toleo lingine la hivi majuzi la "LC Troubleshooting" (11). Mojawapo ya sababu za kawaida za kimwili za kilele cha mkia ni muunganisho duni kati ya kidunga na kigunduzi (12). Mfano uliokithiri unaonyeshwa kwenye Mchoro wa 1, ambao tulitumia mfumo mpya wa valvu wiki chache zilizopita. kabla, na kusakinisha kitanzi kidogo cha sindano ya ujazo na kivuko ambacho kilikuwa kimeundwa kwenye kapilari ya chuma cha pua. Baada ya majaribio ya awali ya utatuzi, tuligundua kuwa kina cha bandari katika stator ya vali ya sindano kilikuwa kirefu zaidi kuliko tulivyokuwa tukizoea, na kusababisha sauti kubwa iliyokufa chini ya mlango. .
Sehemu za juu kama zile zinazoonyeshwa kwenye Mchoro 1e pia zinaweza kusababishwa na matatizo ya kimwili au kemikali. Sababu ya kawaida ya kimwili ya ukingo unaoongoza ni kwamba sehemu ya chembe ya safu haijajazwa vizuri, au kwamba chembe zimejipanga upya baada ya muda. Kama ilivyo kwa mkia wa kilele unaosababishwa na jambo hili la kimwili, njia bora ya kurekebisha hili ni kuchukua nafasi ya safu wima na kuendelea na kile tunachoita asilia kutoka kwa msingi wa kemikali mara nyingi, ambayo mara nyingi huitwa "msingi" wa kemikali inayoongoza. Chini ya hali bora (za mstari), kiasi cha uchanganuzi kinachobakizwa na awamu ya kusimama (kwa hivyo, kipengele cha kubaki) kinahusiana sawia na mkusanyiko wa uchanganuzi kwenye safu wima. Kikromatografia, hii inamaanisha kuwa kadri wingi wa uchanganuzi unavyodungwa kwenye safu unavyoongezeka, kilele huwa kirefu zaidi, lakini si pana. Uhusiano huu, na sio upana zaidi, lakini pia huvunjika na sio kuwa mrefu zaidi. hudungwa.Aidha, maumbo yasiyo ya mstari huamua umbo la vilele vya kromatografia, na kusababisha kingo zinazoongoza au zinazofuata.Kama ilivyo na upakiaji mkubwa unaosababisha mkia wa kilele (10), kilele kinachoongoza kinachosababishwa na uhifadhi usio na mstari kinaweza pia kutambuliwa kwa kupunguza wingi wa kichanganuzi kilichodungwa.Ikiwa umbo la kilele litaboreshwa, mbinu lazima ibadilishwe ili kuboresha hali ya sindano, ambayo inasababisha kupunguzwa kwa kiwango cha chini cha ematografia. tabia.
Wakati mwingine tunaona kile kinachoonekana kama kilele cha "mgawanyiko", kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 1f. Hatua ya kwanza katika kutatua tatizo hili ni kubainisha kama umbo la kilele linatokana na mshirikiano wa sehemu (yaani, kuwepo kwa misombo miwili tofauti lakini inayojitokeza kwa karibu). Ikiwa kwa kweli kuna wachanganuzi wawili tofauti wanaokaribiana, basi ni suala la kuboresha utatuzi wao, chagua "sahani" kwa kuongeza azimio lao, au chagua hesabu ya sahani (kwa mfano), ikiwa kuna vichanganuzi viwili tofauti vinavyokaribiana. vilele vinahusiana na utendakazi wa kimwili hauhusiani na safu yenyewe.Mara nyingi, kidokezo muhimu zaidi kwa uamuzi huu ni kama vilele vyote katika maonyesho ya kromatogramu vina maumbo yaliyogawanyika, au moja au mbili tu.Ikiwa ni moja au mbili tu, pengine ni suala la tathmini ya pamoja;ikiwa vilele vyote vimegawanywa, pengine ni suala la kimwili, ambalo lina uwezekano mkubwa wa kuhusiana na safu yenyewe.
Vilele vya mgawanyiko vinavyohusiana na sifa halisi za safu wima yenyewe kwa kawaida hutokana na miigo ya kuingilia au ya kutoka iliyozuiwa kwa kiasi, au upangaji upya wa chembe kwenye safu, kuruhusu awamu ya rununu kutiririka kwa kasi zaidi kuliko awamu ya rununu katika maeneo fulani ya uundaji wa safu wima .katika maeneo mengine (11).Frit iliyoziba kwa kiasi wakati mwingine inaweza kusafishwa kwa kugeuza safu wima; mtiririko kupitia safu wima.hata hivyo, katika uzoefu wangu, hii ni kawaida ya muda mfupi badala ya ufumbuzi wa muda mrefu.Hii mara nyingi ni mbaya na nguzo za kisasa ikiwa chembe zinaungana tena ndani ya safu.Kwa wakati huu, ni bora kuchukua nafasi ya safu na kuendelea.
Kilele katika Mchoro 1g, pia kutoka kwa tukio la hivi karibuni katika maabara yangu mwenyewe, kwa kawaida huonyesha kwamba ishara ni ya juu sana kwamba imefikia mwisho wa juu wa safu ya majibu. Kwa vigunduzi vya kunyonya vya macho (UV-vis katika kesi hii), wakati mkusanyiko wa analyte ni wa juu sana, analyte inachukua zaidi ya mwanga kupita kupitia kiini cha mtiririko wa detector, na kuacha hali ndogo sana ya kugundua au kuathiriwa na umeme. vyanzo mbalimbali vya kelele, kama vile mwanga hafifu na "giza la sasa", na kufanya mawimbi kuwa "ya fuzzy" sana kwa kuonekana na huru ya mkusanyiko wa analyte.Hili linapotokea, mara nyingi tatizo linaweza kutatuliwa kwa urahisi kwa kupunguza ujazo wa sindano ya kichanganuzi-kupunguza kiasi cha sindano, kuzimua sampuli, au zote mbili.
In chromatography school, we use the detector signal (ie, the y-axis in the chromatogram) as an indicator of the analyte concentration in the sample.So it seems odd to see a chromatogram with a signal below zero, as the simple interpretation is that this indicates a negative analyte concentration – which of course is not physically possible.In my experience, negative peaks are most often observed when using optical absorbance detectors (eg, UV-vis).
Katika hali hii, kilele hasi humaanisha tu kwamba molekuli zinazoondoka kwenye safu wima hunyonya mwanga kidogo kuliko awamu ya rununu yenyewe mara moja kabla na baada ya kilele.Hii inaweza kutokea, kwa mfano, wakati wa kutumia urefu wa chini wa utambuzi wa urefu (<230 nm) na viambajengo vya awamu ya simu ambavyo hufyonza mwanga mwingi katika urefu huu wa mawimbi. Viungio hivyo vinaweza kuwa vijenzi vya kutengenezea kwa awamu ya rununu kama vile vijenzi hasi vya kutengenezea kama vile sehemu ya juu au sehemu hasi. ili kuandaa curve ya urekebishaji na kupata taarifa sahihi ya kiasi, kwa hivyo hakuna sababu ya msingi ya kuziepuka kwa kila sekunde (njia hii wakati mwingine hujulikana kama "ugunduzi wa UV usio wa moja kwa moja") (13). Hata hivyo, ikiwa tunataka kabisa kuepuka vilele hasi kabisa, katika kesi ya ugunduzi wa kunyonya, suluhu bora ni kutumia kutambua tofauti ya urefu wa wimbi, ili kunyonya awamu ya mwanga kuliko utungaji wa simu ya mkononi, ili kunyonya awamu ya simu kuliko uchanganuzi. mtihani.
Vilele hasi vinaweza pia kuonekana unapotumia ugunduzi wa fahirisi ya refractive (RI) wakati faharasa ya refractive ya vipengee vingine isipokuwa kichanganuzi kwenye sampuli, kama vile matrix ya kutengenezea, ni tofauti na faharasa ya kuakisi ya awamu ya simu. Hili pia hutokea kwa utambuzi wa UV-vis, lakini athari hii huwa na kupunguzwa ikilinganishwa na utambuzi wa RI. Katika hali zote mbili, kilele hasi kwa sampuli ya utunzi wa karibu zaidi wa awamu ya matrix inaweza kuwa ndogo zaidi ya awamu ya simu.
Katika sehemu ya tatu juu ya mada ya msingi ya utatuzi wa LC, nilijadili hali ambazo umbo la kilele lililozingatiwa hutofautiana na sura inayotarajiwa au ya kawaida ya kilele. Utatuzi mzuri wa shida kama hizo huanza na ufahamu wa maumbo ya kilele kinachotarajiwa (kulingana na nadharia au uzoefu wa hapo awali na mbinu zilizopo), kwa hivyo kupotoka kutoka kwa matarajio haya ni dhahiri. Matatizo ya umbo la kilele yana sababu nyingi zinazowezekana, inayoongoza kwa undani zaidi, naona kwa undani zaidi usakinishaji, nk. mara nyingi.Kujua maelezo haya kunatoa mahali pazuri pa kuanza utatuzi, lakini hakunakili uwezekano wote.Wasomaji wanaovutiwa na orodha ya kina zaidi ya sababu na masuluhisho wanaweza kurejelea chati ya ukuta ya LCGC ya "Mwongozo wa Utatuzi wa Matatizo" wa LCGC.
(4) Chati ya ukuta ya LCGC ya “LC Troubleshooting Guide”.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Uchambuzi wa Data na Usindikaji wa Ishara katika Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), ukurasa wa 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF na Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.