Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutatoa tovuti bila mitindo na JavaScript.
Biopsy ya kioevu (LB) ni dhana ambayo inapata umaarufu kwa kasi katika uwanja wa matibabu.Dhana hiyo inategemea ugunduzi wa vipande vya DNA ya ziada ya seli (ccfDNA) inayozunguka, ambayo hutolewa hasa kama vipande vidogo baada ya kifo cha seli katika tishu mbalimbali.Sehemu ndogo ya vipande hivi hutoka kwa tishu za kigeni (kigeni) au viumbe.Katika kazi ya sasa, tumetumia dhana hii kwa kome, spishi ya walinzi inayojulikana kwa uwezo wao wa juu wa kuchuja maji ya bahari.Tunatumia uwezo wa kome kufanya kama vichujio vya asili ili kunasa vipande vya DNA vya mazingira kutoka vyanzo mbalimbali ili kutoa taarifa kuhusu bioanuwai ya mifumo ikolojia ya pwani ya baharini.Matokeo yetu yanaonyesha kuwa hemolimfu ya kome ina vipande vya DNA ambavyo hutofautiana sana kwa ukubwa, kutoka kb 1 hadi 5.Mpangilio wa bunduki za risasi ulionyesha kuwa idadi kubwa ya vipande vya DNA ni vya asili ya vijidudu vya kigeni.Miongoni mwao, tulipata vipande vya DNA kutoka kwa bakteria, archaea, na virusi, ikiwa ni pamoja na virusi vinavyojulikana kuambukiza aina mbalimbali za viumbe vinavyopatikana katika mazingira ya pwani ya bahari.Kwa kumalizia, utafiti wetu unaonyesha kuwa dhana ya LB inayotumika kwa kome inawakilisha chanzo tajiri lakini ambacho bado hakijagunduliwa juu ya anuwai ya vijidudu katika mifumo ikolojia ya pwani ya baharini.
Athari za mabadiliko ya hali ya hewa (CC) kwa bioanuwai ya mifumo ikolojia ya baharini ni eneo linalokua kwa kasi la utafiti.Ongezeko la joto duniani sio tu husababisha mafadhaiko muhimu ya kisaikolojia, lakini pia husukuma mipaka ya mabadiliko ya utulivu wa joto wa viumbe vya baharini, na kuathiri makazi ya spishi kadhaa, na kuwafanya kutafuta hali nzuri zaidi [1, 2].Kando na kuathiri bayoanuwai ya metazoa, CC huvuruga usawa wa hali ya juu wa mwingiliano wa mwenyeji na vijidudu.Dysbacteriosis hii ya vijidudu huleta tishio kubwa kwa mifumo ikolojia ya baharini kwani hufanya viumbe vya baharini kushambuliwa zaidi na vimelea vya kuambukiza [3, 4].Inaaminika kuwa SS ina jukumu muhimu katika vifo vya watu wengi, ambayo ni shida kubwa kwa usimamizi wa mifumo ikolojia ya baharini [5, 6].Hili ni suala muhimu kutokana na athari za kiuchumi, kiikolojia na lishe za viumbe vingi vya baharini.Hii ni kweli hasa kwa bivalves wanaoishi katika mikoa ya polar, ambapo madhara ya CK ni ya haraka na kali zaidi [6, 7].Kwa kweli, bivalves kama vile Mytilus spp.hutumika sana kufuatilia athari za CC kwenye mifumo ikolojia ya baharini.Haishangazi, idadi kubwa ya alama za kibayolojia zimetengenezwa ili kufuatilia afya zao, mara nyingi kwa kutumia mkabala wa ngazi mbili unaohusisha viashirio vya utendaji kazi kulingana na shughuli za enzymatic au kazi za seli kama vile uwezo wa seli na shughuli za phagocytic [8].Njia hizi pia ni pamoja na kipimo cha mkusanyiko wa viashiria maalum vya shinikizo ambavyo hujilimbikiza kwenye tishu laini baada ya kunyonya kwa kiasi kikubwa cha maji ya bahari.Hata hivyo, uwezo wa juu wa kuchuja na mfumo wa mzunguko wa nusu-wazi wa bivalves hutoa fursa ya kuendeleza biomarkers mpya ya hemolymph kwa kutumia dhana ya biopsy ya kioevu (LB), mbinu rahisi na isiyo na uvamizi kwa usimamizi wa mgonjwa.sampuli za damu [9, 10].Ingawa aina kadhaa za molekuli zinazozunguka zinaweza kupatikana katika LB ya binadamu, dhana hii kimsingi inategemea uchambuzi wa mpangilio wa DNA wa kuzunguka kwa vipande vya DNA nje ya seli (ccfDNA) katika plazima.Kwa hakika, kuwepo kwa DNA inayozunguka katika plazima ya binadamu kumejulikana tangu katikati ya karne ya 20 [11], lakini ni katika miaka ya hivi majuzi tu ambapo ujio wa mbinu za upangaji matokeo ya juu umesababisha uchunguzi wa kimatibabu kulingana na ccfDNA.Kuwepo kwa vipande hivi vya DNA vinavyozunguka kunatokana kwa sehemu na kutolewa tu kwa DNA ya genomic (nyuklia na mitochondrial) baada ya kifo cha seli. Kwa watu wenye afya nzuri, mkusanyiko wa ccfDNA kawaida huwa chini (<10 ng/mL) lakini unaweza kuongezeka kwa mara 5-10 kwa wagonjwa wanaougua magonjwa mbalimbali au wanakabiliwa na matatizo, na kusababisha uharibifu wa tishu. Kwa watu wenye afya nzuri, mkusanyiko wa ccfDNA kawaida huwa chini (<10 ng/mL) lakini unaweza kuongezeka kwa mara 5-10 kwa wagonjwa wanaougua magonjwa mbalimbali au wanakabiliwa na matatizo, na kusababisha uharibifu wa tishu. Уздоровых людей концентрация вккДНК katika норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться katika 5–10 стрессу, приводящему к повреждению тканей. Kwa watu wenye afya, mkusanyiko wa cccDNA ni kawaida chini (<10 ng/mL), lakini inaweza kuongezeka kwa mara 5-10 kwa wagonjwa wenye patholojia mbalimbali au chini ya dhiki ambayo husababisha uharibifu wa tishu.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患1者 中致组织损伤.2倍 , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены katika 5-10 раз у пациентоный пациентоный что приводит к повреждению тканей. viwango vya ccfDNA kwa kawaida huwa chini (<10 ng/ml) kwa watu wenye afya, lakini vinaweza kuongezeka mara 5-10 kwa wagonjwa walio na magonjwa mbalimbali au mkazo, na kusababisha uharibifu wa tishu.Ukubwa wa vipande vya ccfDNA hutofautiana sana, lakini kwa kawaida huanzia 150 hadi 200 bp.[12].Uchanganuzi wa ccfDNA inayotokana yenyewe, yaani, ccfDNA kutoka kwa seli mwenyeji wa kawaida au iliyobadilishwa, inaweza kutumika kugundua mabadiliko ya kijeni na epijenetiki yaliyopo katika jenomu ya nyuklia na/au mitochondrial, na hivyo kusaidia matabibu kuchagua matibabu mahususi yanayolengwa na molekuli [13] .Hata hivyo, ccfDNA inaweza kupatikana kutoka kwa vyanzo vya kigeni kama vile ccfDNA kutoka kwa seli za fetasi wakati wa ujauzito au kutoka kwa viungo vilivyopandikizwa [14,15,16,17].ccfDNA pia ni chanzo muhimu cha habari cha kugundua uwepo wa asidi nucleic ya wakala wa kuambukiza (kigeni), ambayo inaruhusu ugunduzi usiovamizi wa maambukizo yaliyoenea ambayo hayatambuliwi na tamaduni za damu, kuzuia biopsy vamizi ya tishu zilizoambukizwa [18].Uchunguzi wa hivi majuzi kwa hakika umeonyesha kuwa damu ya binadamu ina chanzo kikubwa cha habari ambacho kinaweza kutumiwa kutambua vimelea vya virusi na bakteria, na kwamba karibu 1% ya ccfDNA inayopatikana katika plasma ya binadamu ni ya asili ya kigeni [19].Tafiti hizi zinaonyesha kwamba bioanuwai ya mikrobiome inayozunguka ya kiumbe inaweza kutathminiwa kwa kutumia uchanganuzi wa ccfDNA.Hata hivyo, hadi hivi majuzi, dhana hii ilitumiwa pekee kwa wanadamu na, kwa kiasi kidogo, katika wanyama wengine wenye uti wa mgongo [20, 21].
Katika jarida hili, tunatumia uwezo wa LB kuchanganua ccfDNA ya Aulacomya atra, spishi ya kusini inayopatikana kwa wingi katika Visiwa vya Kerguelen, kundi la visiwa vilivyo juu ya uwanda mkubwa uliofanyizwa miaka milioni 35 iliyopita.mlipuko wa volkano.Kwa kutumia mfumo wa majaribio wa ndani, tuligundua kuwa vipande vya DNA katika maji ya bahari huchukuliwa haraka na kome na kuingia kwenye sehemu ya hemolymph.Mfuatano wa bunduki ya risasi umeonyesha kuwa kome hemolimfu ccfDNA ina vipande vya DNA vya asili yake na isiyo ya asili yake, ikijumuisha bakteria wanaofanana na vipande vya DNA kutoka kwa biomu mfano wa mifumo baridi ya pwani ya bahari ya volkeno.Hemolymph ccfDNA pia ina mifuatano ya virusi inayotokana na virusi vilivyo na safu tofauti za mwenyeji.Pia tulipata vipande vya DNA kutoka kwa wanyama wenye seli nyingi kama vile samaki wa mifupa, anemoni wa baharini, mwani na wadudu.Kwa kumalizia, utafiti wetu unaonyesha kwamba dhana ya LB inaweza kutumika kwa ufanisi kwa viumbe vya baharini vya invertebrates kuzalisha repertoire tajiri ya genomic katika mazingira ya baharini.
Watu wazima (urefu wa milimita 55-70) Mytilus platensis (M. platensis) na Aulacomya atra (A. atra) zilikusanywa kutoka kwenye ufuo wa miamba ya katikati ya mawimbi ya Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Visiwa vya Kerguelen mnamo Desemba 2018. Kome wengine wa rangi ya samawati waliokomaa (Mytilus spp.) walipatikana kutoka kwa msambazaji wa kibiashara (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) na kuwekwa kwenye tanki iliyodhibitiwa na halijoto (4°C) iliyo na 10–20 L ya 32‰ brine bandia.(chumvi ya bahari ya bandia ya Reef Crystal, Bahari ya Papo hapo, Virginia, USA).Kwa kila jaribio, urefu na uzito wa makombora ya kibinafsi yalipimwa.
Itifaki ya ufikiaji wazi bila malipo ya programu hii inapatikana mtandaoni (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Kwa ufupi, hemolimfu ya LB ilikusanywa kutoka kwa misuli ya mtekaji kama ilivyoelezwa [22].Hemolymph ilifafanuliwa na centrifugation saa 1200 × g kwa dakika 3, supernatant ilikuwa iliyohifadhiwa (-20 ° C) hadi matumizi.Kwa kutengwa na utakaso wa cfDNA, sampuli (1.5-2.0 ml) ziliyeyushwa na kusindika kwa kutumia NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) kulingana na maagizo ya mtengenezaji.ccfDNA ilihifadhiwa kwa -80°C hadi uchanganuzi zaidi.Katika baadhi ya majaribio, ccfDNA ilitengwa na kusafishwa kwa kutumia Kifaa cha Uchunguzi wa DNA cha QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).DNA iliyosafishwa ilihesabiwa kwa kutumia kipimo cha kawaida cha PicoGreen.Usambazaji wa vipande vya ccfDNA iliyotengwa ilichanganuliwa na electrophoresis ya kapilari kwa kutumia bioanalyzer ya Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) kwa kutumia Seti ya DNA ya Unyeti wa Juu.Upimaji ulifanywa kwa kutumia 1 µl ya sampuli ya ccfDNA kulingana na maagizo ya mtengenezaji.
Kwa mpangilio wa vipande vya hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) alitayarisha maktaba za bunduki kwa kutumia Illumina DNA Mix seti ya Illumina MiSeq PE75 kit.Adapta ya kawaida (BioO) ilitumiwa.Faili za data ghafi zinapatikana kutoka kwenye Kumbukumbu ya Kusomwa kwa Mfuatano wa NCBI (SRR8924808 na SRR8924809).Ubora wa kimsingi wa kusoma ulitathminiwa kwa kutumia FastQC [23].Trimmomatic [24] imetumika kwa adapta za kunakili na usomaji duni.Masomo ya Shotgun yenye ncha zilizooanishwa yaliunganishwa kwenye usomaji mmoja mrefu zaidi na mwingiliano wa chini wa 20 bp ili kuzuia kutolingana [25]. Masomo yaliyounganishwa yalibainishwa na BLASTN kwa kutumia hifadhidata ya NCBI Taxonomy ya bivalve (thamani ya <1e-3 na 90% homolojia), na ufichaji wa mfuatano wa uchangamano wa chini ulifanyika kwa kutumia DUST [26]. Masomo yaliyounganishwa yalibainishwa na BLASTN kwa kutumia hifadhidata ya NCBI Taxonomy ya bivalve (thamani ya <1e-3 na 90% homolojia), na ufichaji wa mfuatano wa uchangamano wa chini ulifanyika kwa kutumia DUST [26]. Maelezo ya ziada ya BLASTN yamechangiwa na BLASTN kwa kutumia данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI-0900 (999) маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием VUMBI [26]. Usomaji uliounganishwa ulibainishwa na BLASTN kwa kutumia hifadhidata ya NCBI bivalve taxonomy (thamani ya <1e-3 na 90% homolojia), na ufunikaji wa mfuatano wa utata wa chini ulifanyika kwa kutumia DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使平DUST的并恶 [26]掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 na 90% 同源） 用 用 注释 合并 读数 ，并 使强着 [26] .掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩Maelezo ya ziada ya BLASTN yamechangiwa na BLASTN na BLASTN таксономической базы даных двустворчатых молюс10 NCBI (3) а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием VUMBI [26]. Usomaji uliounganishwa ulibainishwa na BLASTN kwa kutumia hifadhidata ya NCBI bivalve taxonomic (thamani ya <1e-3 na 90% homolojia), na ufunikaji wa mfuatano wa utata wa chini ulifanyika kwa kutumia DUST [26].Masomo yaligawanywa katika makundi mawili: yanayohusiana na mfuatano wa bivalve (hapa inaitwa kujisomea) na isiyohusiana (isiyo ya kujisomea).Vikundi viwili vilikusanywa tofauti kwa kutumia MEGAHIT kutengeneza contigs [27].Wakati huo huo, usambazaji wa taxonomic wa usomaji wa mikrobiome ngeni uliainishwa kwa kutumia Kraken2 [28] na kuwakilishwa kielelezo na chati ya pai ya Krona kwenye Galaxy [29, 30].Waendeshaji kilomita bora zaidi walibainishwa kuwa kmers-59 kutoka kwa majaribio yetu ya awali. Vikonyo binafsi vilitambuliwa kwa upatanishi na BLASTN ( hifadhidata ya bivalve NCBI, thamani ya < 1e−10 na 60% homolojia) kwa ufafanuzi wa mwisho. Vikonyo binafsi vilitambuliwa kwa upatanishi na BLASTN ( hifadhidata ya bivalve NCBI, thamani ya < 1e−10 na 60% homolojia) kwa ufafanuzi wa mwisho. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, моля6010 e) нчательной аннотации. Self-contig basi ilitambuliwa kwa kulinganisha dhidi ya BLASTN (NCBI bivalve database, e thamani <1e-10 na 60% homolojia) kwa ufafanuzi wa mwisho.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自叿经红身里行。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Maelezo ya ziada ya BLASTN yanaweza kutekelezwa kwa kutumia BLASTN е e <1e-10 na гомология 60%). Self-contigs basi ilitambuliwa kwa ufafanuzi wa mwisho kwa kulinganisha dhidi ya BLASTN (NCBI bivalve database, e thamani <1e-10 na 60% homolojia). Sambamba, vikundi visivyo vya kibinafsi vilifafanuliwa na BLASTN ( hifadhidata ya nt NCBI, thamani ya < 1e−10 na 60% ya homolojia). Sambamba, vikundi visivyo vya kibinafsi vilifafanuliwa na BLASTN ( hifadhidata ya nt NCBI, thamani ya < 1e−10 na 60% ya homolojia). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 na гомология 60%). Sambamba na hilo, viunganishi vya vikundi vya kigeni vilifafanuliwa na BLASTN (database ya NT NCBI, thamani ya <1e-10 na 60% ya homolojia).平行地, 用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地, 用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, знагогние e и 1e-1%). Sambamba, vikundi visivyo vya kibinafsi vilifafanuliwa na BLASTN (database ya nt NCBI, thamani ya <1e-10 na 60% ya homolojia). BLASTX pia ilifanywa kwa vikonyo visivyojitegemea kwa kutumia hifadhidata za nr na RefSeq protini NCBI (thamani ya <1e−10 na 60% ya homolojia). BLASTX pia ilifanywa kwa vikonyo visivyojitegemea kwa kutumia hifadhidata za nr na RefSeq protini NCBI (thamani ya <1e−10 na 60% ya homolojia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и 6%). BLASTX pia ilitekelezwa kwa waathiriwa wasiojitegemea kwa kutumia hifadhidata za protini za nr na RefSeq NCBI (thamani ya <1e-10 na 60% ya homolojia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием bila данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 na 60%). BLASTX pia ilifanywa kwa waathiriwa wasiojitegemea kwa kutumia hifadhidata za protini za nr na RefSeq NCBI (thamani ya <1e-10 na 60% ya homolojia).Vidimbwi vya BLASTN na BLASTX vya watu wasio-binafsisha vinawakilisha vikonyo vya mwisho (tazama faili ya Nyongeza).
Vielelezo vinavyotumika kwa PCR vimeorodheshwa katika Jedwali S1.Taq DNA polymerase (Bio Basic Kanada, Markham, ON) ilitumika kukuza jeni lengwa la ccfDNA.Masharti yafuatayo ya mmenyuko yalitumika: denaturation ifikapo 95°C kwa dakika 3, 95°C kwa dakika 1, kuweka halijoto ya annealing kwa dakika 1, kurefusha hadi 72°C kwa dakika 1, mizunguko 35, na hatimaye 72°C ndani ya dakika 10..Bidhaa za PCR zilitenganishwa na electrophoresis katika jeli za agarose (1.5%) zilizo na SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) katika 95 V.
Kome (Mytilus spp.) walizoea katika maji ya bahari yenye oksijeni ya 500 ml (32 PSU) kwa saa 24 kwa 4°C.DNA ya Plasmidi iliyo na kichocheo kinachosimba mfuatano wa cDNA ya galectin-7 (nambari ya uwekaji NCBI L07769) iliongezwa kwenye bakuli katika mkusanyiko wa mwisho wa 190 μg/μl.Kome waliowekwa chini ya hali sawa bila nyongeza ya DNA walikuwa udhibiti.Tangi ya tatu ya kudhibiti ilikuwa na DNA bila kome.Ili kufuatilia ubora wa DNA katika maji ya bahari, sampuli za maji ya bahari (20 μl; marudio matatu) zilichukuliwa kutoka kwa kila tank kwa wakati ulioonyeshwa.Kwa ufuatiliaji wa DNA ya plasmid, kome wa LB walivunwa kwa nyakati zilizoonyeshwa na kuchambuliwa na qPCR na ddPCR.Kwa sababu ya kiwango cha juu cha chumvi katika maji ya bahari, aliquots zilipunguzwa katika maji ya ubora wa PCR (1:10) kabla ya majaribio yote ya PCR.
Digital droplet PCR (ddPCR) ilitekelezwa kwa kutumia itifaki ya BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada).Tumia wasifu wa halijoto ili kubaini halijoto ya kutosha (Jedwali S1).Matone yalitolewa kwa kutumia jenereta ya kushuka ya QX200 (BioRad).ddPCR ilifanyika kama ifuatavyo: 95°C kwa dakika 5, mizunguko 50 ya 95°C kwa s 30 na halijoto maalum ya kupenyeza kwa dakika 1 na 72°C kwa s 30, 4°C kwa dakika 5 na 90°C ndani ya dakika 5.Idadi ya matone na miitikio chanya (idadi ya nakala/µl) ilipimwa kwa kutumia kisoma tone cha QX200 (BioRad).Sampuli zilizo na chini ya matone 10,000 zilikataliwa.Udhibiti wa muundo haukutekelezwa kila wakati ddPCR ilipoendeshwa.
qPCR ilitekelezwa kwa kutumia Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) na vitangulizi maalum vya LGALS7.PCR zote za kiasi zilitekelezwa katika µl 20 kwa kutumia QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR ilianzishwa kwa incubation ya dakika 15 ifikapo 95°C ikifuatiwa na mizunguko 40 ifikapo 95°C kwa sekunde 10 na kwa 60°C kwa sekunde 60 na mkusanyiko mmoja wa data.Miindo ya kuyeyuka ilitolewa kwa kutumia vipimo vilivyofuatana katika 95°C kwa s 5, 65°C kwa s 60, na 97°C mwishoni mwa qPCR.Kila qPCR ilitekelezwa katika nakala tatu, isipokuwa kwa sampuli za udhibiti.
Kwa kuwa kome wanajulikana kwa kiwango cha juu cha kuchujwa, tulichunguza kwanza ikiwa wanaweza kuchuja na kuhifadhi vipande vya DNA vilivyomo kwenye maji ya bahari.Pia tulivutiwa kujua ikiwa vipande hivi hujikusanya katika mfumo wao wa limfu nusu wazi.Tulitatua suala hili kwa majaribio kwa kufuatilia hatima ya vipande vya DNA mumunyifu vilivyoongezwa kwenye mizinga ya kome wa bluu.Ili kuwezesha ufuatiliaji wa vipande vya DNA, tulitumia DNA ya kigeni (si ya kibinafsi) ya plasmid iliyo na jeni la binadamu la galectin-7.ddPCR hufuatilia vipande vya plasmid vya DNA katika maji ya bahari na kome.Matokeo yetu yanaonyesha kwamba ikiwa kiasi cha vipande vya DNA katika maji ya bahari kilibakia mara kwa mara kwa muda (hadi siku 7) kwa kutokuwepo kwa mussels, basi mbele ya mussels ngazi hii karibu kutoweka kabisa ndani ya masaa 8 (Mchoro 1a, b).Vipande vya DNA exogenous walikuwa wanaona kwa urahisi ndani ya 15 min katika intravalvular maji na hemolymph (Mtini. 1c).Vipande hivi bado vinaweza kutambuliwa hadi saa 4 baada ya kufichuliwa.Shughuli hii ya kuchuja kuhusiana na vipande vya DNA inalinganishwa na shughuli ya kuchuja ya bakteria na mwani [31].Matokeo haya yanapendekeza kwamba kome wanaweza kuchuja na kukusanya DNA ya kigeni katika sehemu zao za maji.
Viwango vya jamaa vya DNA ya plasmid katika maji ya bahari ikiwa kuna (A) au kutokuwepo (B) kwa kome, inayopimwa na ddPCR.Katika A, matokeo yanaonyeshwa kama asilimia, huku mipaka ya visanduku ikiwakilisha asilimia ya 75 na 25.Mviringo wa logarithmic uliowekwa unaonyeshwa kwa rangi nyekundu, na eneo lililotiwa kivuli kwa kijivu huwakilisha muda wa 95% wa kujiamini.Katika B, mstari mwekundu unawakilisha wastani na mstari wa bluu unawakilisha muda wa 95% wa kujiamini kwa mkusanyiko.C Mkusanyiko wa DNA ya plasmid katika hemolymph na maji ya valvular ya mussels kwa nyakati tofauti baada ya kuongezwa kwa DNA ya plasmid.Matokeo yanawasilishwa kama nakala kamili zilizogunduliwa/mL (±SE).
Kisha, tulichunguza asili ya ccfDNA katika kome waliokusanywa kutoka kwa kome kwenye Visiwa vya Kerguelen, kikundi cha mbali cha visiwa vilivyo na ushawishi mdogo wa kianthropogenic.Kwa kusudi hili, cccDNA kutoka kwa hemolymphs ya mussel ilitengwa na kusafishwa kwa njia zinazotumiwa kwa kawaida kusafisha cccDNA ya binadamu [32, 33].Tuligundua kuwa viwango vya wastani vya hemolimfu ccfDNA katika kome viko katika maikrogramu za chini kwa kila safu ya hemolimfu ya ml (ona Jedwali S2, Maelezo ya Ziada).Aina hii ya viwango ni kubwa zaidi kuliko kwa watu wenye afya nzuri (nanograms za chini kwa mililita), lakini katika hali nadra, kwa wagonjwa wa saratani, kiwango cha ccfDNA kinaweza kufikia mikrogramu kadhaa kwa mililita [34, 35].Uchanganuzi wa saizi ya usambazaji wa hemolymph ccfDNA ulionyesha kuwa vipande hivi vinatofautiana kwa ukubwa, kuanzia 1000 bp hadi 1000 bp.hadi 5000 bp (Mchoro 2).Matokeo sawia yalipatikana kwa kutumia Kitengo cha Uchunguzi cha QIAamp chenye msingi wa silika, njia inayotumika sana katika sayansi ya uchunguzi ili kutenga na kusafisha DNA ya jeni kutoka kwa sampuli za DNA za mkusanyiko wa chini, ikiwa ni pamoja na ccfDNA [36].
Mwakilishi wa ccfDNA electrophoregram ya mussel hemolymph.Imetolewa kwa NucleoSnap Plasma Kit (juu) na Kitengo cha Uchunguzi wa DNA cha QIAamp.B Mpangilio wa vinanda unaoonyesha usambazaji wa viwango vya hemolimfu ccfDNA (±SE) katika kome.Mistari nyeusi na nyekundu inawakilisha wastani na quartiles ya kwanza na ya tatu, kwa mtiririko huo.
Takriban 1% ya ccfDNA katika wanadamu na nyani ina chanzo cha kigeni [21, 37].Kwa kuzingatia mfumo wa mzunguko wa nusu-wazi wa bivalves, maji ya bahari yenye vijidudu vingi, na ukubwa wa usambazaji wa kome ccfDNA, tulidhania kwamba hemolymph ya kome ccfDNA inaweza kuwa na kundi kubwa na tofauti la DNA ya viumbe vidogo.Ili kujaribu dhana hii, tulipanga hemolymph ccfDNA kutoka kwa sampuli za Aulacomya atra zilizokusanywa kutoka Visiwa vya Kerguelen, na kutoa zaidi ya usomaji milioni 10, 97.6% ambao walipitisha udhibiti wa ubora.Masomo yaliwekwa kulingana na vyanzo vya kibinafsi na visivyo vya kibinafsi kwa kutumia hifadhidata za bivalve za BLASTN na NCBI (Mchoro S1, Habari ya Ziada).
Kwa wanadamu, DNA ya nyuklia na mitochondrial inaweza kutolewa kwenye mkondo wa damu [38].Hata hivyo, katika utafiti huu, haikuwezekana kuelezea kwa undani DNA ya nyuklia ya kome, ikizingatiwa kwamba jenomu ya A. atra haijapangwa au kuelezewa.Hata hivyo, tuliweza kutambua idadi ya vipande vya ccfDNA vya asili yetu wenyewe kwa kutumia maktaba ya bivalve (Mchoro S2, Taarifa ya Ziada).Pia tulithibitisha kuwepo kwa vipande vya DNA vya asili yetu kwa ukuzaji wa PCR ulioelekezwa wa jeni hizo za A. atra ambazo zilipangwa (Mchoro 3).Vile vile, ikizingatiwa kwamba jenomu ya mitochondrial ya A. atra inapatikana katika hifadhidata za umma, mtu anaweza kupata ushahidi wa kuwepo kwa vipande vya ccfDNA vya mitochondrial katika hemolimfu ya A. atra.Uwepo wa vipande vya DNA vya mitochondrial ulithibitishwa na amplification ya PCR (Mchoro 3).
Jeni mbalimbali za mitochondrial zilikuwepo katika hemolimfu ya A. atra (doti nyekundu - nambari ya hisa: SRX5705969) na M. platensis (doti za bluu - nambari ya hisa: SRX5705968) iliyokuzwa na PCR.Kielelezo kilichotolewa kutoka kwa Breton et al., 2011 B Ukuzaji wa dawa ya juu ya hemolymph kutoka A. atra Imehifadhiwa kwenye karatasi ya FTA.Tumia ngumi ya mm 3 kuongeza moja kwa moja kwenye mirija ya PCR iliyo na mchanganyiko wa PCR.
Kwa kuzingatia maudhui mengi ya vijiumbe katika maji ya bahari, awali tuliangazia sifa za mfuatano wa DNA wa vijidudu katika hemolimfu.Ili kufanya hivyo, tunatumia mbinu mbili tofauti.Mkakati wa kwanza ulitumia Kraken2, mpango wa uainishaji wa mfuatano unaotegemea algoriti ambao unaweza kutambua mfuatano wa viumbe vidogo kwa usahihi kulinganishwa na BLAST na zana zingine [28].Zaidi ya usomaji wa 6719 uliamua kuwa wa asili ya bakteria, wakati 124 na 64 walikuwa kutoka kwa archaea na virusi, kwa mtiririko huo (Mchoro 4).Vipande vingi vya DNA vya bakteria vilikuwa Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), na Bacteroidetes (17%) (Mchoro 4a).Usambazaji huu unaambatana na tafiti za awali za microbiome ya baharini ya mussel ya bluu [39, 40].Gammaproteobacteria walikuwa darasa kuu la Proteobacteria (44%), ikiwa ni pamoja na Vibrionales nyingi (Mchoro 4b).Mbinu ya ddPCR ilithibitisha kuwepo kwa vipande vya DNA ya Vibrio katika ccfDNA ya A. atra hemolymph (Mchoro 4c) [41].Ili kupata taarifa zaidi kuhusu asili ya bakteria ya ccfDNA, mbinu ya ziada ilichukuliwa (Mchoro S2, Taarifa ya Ziada). Katika kesi hii, usomaji ambao ulipishana ulikusanywa kama usomaji wa mwisho wa jozi na uliainishwa kama wa kibinafsi (bivalves) au asili isiyo ya kibinafsi kwa kutumia BLASTN na thamani ya e ya 1e-3 na mkato na >90% ya homolojia. Katika kesi hii, usomaji ambao ulipishana ulikusanywa kama usomaji wa mwisho wa jozi na uliainishwa kama wa kibinafsi (bivalves) au asili isiyo ya kibinafsi kwa kutumia BLASTN na thamani ya e ya 1e-3 na mkato na >90% ya homolojia. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами na были классифицированы как собственные (двые) происхождению с использованием BLASTN na значения e 1e-3 na отсечения с гомологией> 90%. Katika hali hii, usomaji unaopishana ulikusanywa kama usomaji uliokamilika kwa jozi na kuainishwa kuwa asili (bivalve) au isiyo ya asili kwa kutumia BLASTN na thamani ya e ya 1e-3 na kukatwa kwa >90% ya homolojia.在這种情况下，重叠的读数组装為配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 yako na>90%类）或非自身來源.在 這 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 為配 末端 读数 , 使用 使用 blastn na 1e-3 的 值% na > 90 （双 壳类） 非 自身。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами na классифицированы как собственыные (двуствонство) происхождению с использованием значений e BLASTN na 1e-3 na matokeo ya гомологии> 90%. Katika kesi hii, usomaji unaopishana ulikusanywa kama usomaji uliokamilika kwa jozi na kuainishwa kama mwenyewe (bivalves) au isiyo ya asili kwa kutumia e BLASTN na maadili ya 1e-3 na kizingiti cha homology> 90%.Kwa kuwa jenomu ya A. atra bado haijapangwa, tulitumia mkakati wa kuunganisha de novo wa kiunganishi cha MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Jumla ya contigi 147,188 zimetambuliwa kuwa tegemezi (bivalves) za asili.Contigs hizi zililipuka na maadili ya elektroniki ya 1e-10 kwa kutumia BLASTN na BLASTX.Mkakati huu ulituruhusu kutambua vipande 482 visivyo vya bivalve vilivyopo katika A. atra ccfDNA.Zaidi ya nusu (57%) ya vipande hivi vya DNA vilipatikana kutoka kwa bakteria, hasa kutoka kwa viungo vya gill, ikiwa ni pamoja na symbionts ya sulfotrophic, na kutoka kwa viungo vya gill Solemya velum (Mchoro 5).
Wingi wa jamaa katika kiwango cha aina.B Utofauti wa vijiumbe wa phyla kuu mbili (Firmicutes na Proteobacteria).Ukuzaji wakilishi wa ddPCR C Vibrio spp.A. Vipande vya jeni 16S rRNA (bluu) katika hemolimfu tatu za atra.
Jumla ya contigs 482 zilizokusanywa zilichambuliwa.Wasifu wa jumla wa usambazaji wa taxonomic wa maelezo ya contig ya metagenomic (prokariyoti na yukariyoti).B Usambazaji wa kina wa vipande vya DNA vya bakteria vinavyotambuliwa na BLASTN na BLASTX.
Uchambuzi wa Kraken2 pia ulionyesha kuwa ccfDNA ya kome ilikuwa na vipande vya DNA vya akiolojia, vikiwemo vipande vya DNA vya Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), na Thaurmarcheota (11%) (Mchoro 6a).Uwepo wa vipande vya DNA vinavyotokana na Euryarchaeota na Crenarchaeota, vilivyopatikana hapo awali katika jumuiya ya viumbe vidogo vya kome wa California, haipaswi kushangaza [42].Ingawa Euryarchaeota mara nyingi huhusishwa na hali mbaya zaidi, sasa inatambuliwa kuwa Euryarchaeota na Crenarcheota ni kati ya prokariyoti za kawaida katika mazingira ya bahari ya cryogenic [43, 44].Kuwepo kwa vijidudu vya methanogenic katika kome haishangazi, ikizingatiwa ripoti za hivi majuzi za uvujaji mkubwa wa methane kutokana na uvujaji wa chini kwenye Plateau ya Kerguelen [45] na uwezekano wa uzalishaji wa methane wa microbial kuzingatiwa katika pwani ya Visiwa vya Kerguelen [46].
Kisha umakini wetu ukahamia kwenye usomaji kutoka kwa virusi vya DNA.Kwa kadri ya ufahamu wetu, huu ni utafiti wa kwanza usiolengwa wa maudhui ya virusi vya kome.Kama ilivyotarajiwa, tulipata vipande vya DNA vya bacteriophages (Caudovirales) (Mchoro 6b).Hata hivyo, DNA ya virusi vya kawaida hutoka kwenye phylum ya nucleocytoviruses, pia inajulikana kama nyuklia cytoplasmic big DNA virus (NCLDV), ambayo ina genome kubwa zaidi ya virusi yoyote.Ndani ya filamu hii, mfuatano mwingi wa DNA ni wa familia za Mimimidoviridae (58%) na Poxviridae (21%), ambazo mwenyeji wake asilia ni pamoja na wanyama wenye uti wa mgongo na arthropods, huku sehemu ndogo ya mfuatano huu wa DNA ni wa mwani unaojulikana wa virusi.Huambukiza mwani wa yukariyoti wa baharini.Mfuatano huo pia ulipatikana kutoka kwa virusi vya Pandora, virusi vikubwa vilivyo na saizi kubwa ya jenomu ya jenasi yoyote inayojulikana ya virusi.Jambo la kushangaza ni kwamba aina mbalimbali za wahudumu wanaojulikana kuambukizwa virusi, kama ilivyobainishwa na mpangilio wa hemolymph ccfDNA, zilikuwa kubwa kiasi (Mchoro S3, Taarifa ya Ziada).Inajumuisha virusi vinavyoambukiza wadudu kama vile Baculoviridae na Iridoviridae, pamoja na virusi vinavyoambukiza amoeba, mwani na wanyama wenye uti wa mgongo.Pia tulipata mfuatano unaolingana na genome ya Pithovirus sibericum.Virusi vya pito (pia hujulikana kama "virusi vya zombie") vilitengwa kwa mara ya kwanza kutoka kwa baridi ya miaka 30,000 huko Siberia [47].Kwa hivyo, matokeo yetu yanawiana na ripoti za awali zinazoonyesha kwamba si spishi zote za kisasa za virusi hivi zimetoweka [48] na kwamba virusi hivi vinaweza kuwa katika mifumo ikolojia ya baharini iliyo mbali sana.
Hatimaye, tulijaribu kuona ikiwa tunaweza kupata vipande vya DNA kutoka kwa wanyama wengine wenye chembe nyingi.Jumla ya contigi 482 za kigeni zilitambuliwa na BLASTN na BLASTX na maktaba za nt, nr na RefSeq (genomic na protini).Matokeo yetu yanaonyesha kuwa kati ya vipande vya kigeni vya ccfDNA ya wanyama wa seli nyingi DNA ya mifupa ya mfupa inatawala (Mchoro 5).Vipande vya DNA kutoka kwa wadudu na viumbe vingine pia vimepatikana.Sehemu kubwa kiasi ya vipande vya DNA haijatambuliwa, pengine kutokana na uwakilishi mdogo wa idadi kubwa ya spishi za baharini katika hifadhidata za genomic ikilinganishwa na spishi za nchi kavu [49].
Katika jarida hili, tunatumia dhana ya LB kwa kome, tukisema kwamba mpangilio wa risasi wa hemolymph ccfDNA unaweza kutoa maarifa kuhusu muundo wa mifumo ikolojia ya pwani.Hasa, tuligundua kwamba 1) hemolimfu ya kome ina viwango vya juu kiasi (viwango vya mikrogramu) vya kiasi kikubwa (~1-5 kb) vipande vya DNA vinavyozunguka;2) vipande hivi vya DNA ni vya kujitegemea na visivyo na uhuru 3) Miongoni mwa vyanzo vya kigeni vya vipande hivi vya DNA, tulipata DNA ya bakteria, archaeal na virusi, pamoja na DNA ya wanyama wengine wa multicellular;4) Mkusanyiko wa vipande hivi vya kigeni vya ccfDNA katika hemolymph hutokea kwa haraka na huchangia shughuli ya kuchuja ndani ya mussels.Kwa kumalizia, utafiti wetu unaonyesha kwamba dhana ya LB, ambayo hadi sasa imetumiwa hasa katika uwanja wa biomedicine, husimba chanzo cha ujuzi lakini ambacho hakijachunguzwa ambacho kinaweza kutumika kuelewa zaidi mwingiliano kati ya viumbe vya sentinel na mazingira yao.
Mbali na nyani, kutengwa kwa ccfDNA kumeripotiwa kwa mamalia, pamoja na panya, mbwa, paka, na farasi [50, 51, 52].Hata hivyo, kwa ufahamu wetu, utafiti wetu ndio wa kwanza kuripoti ugunduzi na mpangilio wa ccfDNA katika viumbe vya baharini kwa mfumo wazi wa mzunguko.Kipengele hiki cha anatomiki na uwezo wa kuchuja wa kome unaweza, angalau kwa sehemu, kueleza sifa tofauti za ukubwa wa vipande vya DNA vinavyozunguka ikilinganishwa na viumbe vingine.Kwa wanadamu, vipande vingi vya DNA vinavyozunguka katika damu ni vipande vidogo vya ukubwa kutoka 150 hadi 200 bp.na kilele cha juu cha 167 bp [34, 53].Sehemu ndogo lakini muhimu ya vipande vya DNA ni kati ya 300 na 500 kwa ukubwa, na karibu 5% ni ndefu zaidi ya 900 bp.[54].Sababu ya usambazaji wa saizi hii ni kwamba chanzo kikuu cha ccfDNA katika plasma hutokea kama matokeo ya kifo cha seli, ama kwa sababu ya kifo cha seli au kwa sababu ya nekrosisi ya seli zinazozunguka za hematopoietic kwa watu wenye afya nzuri au kwa sababu ya apoptosis ya seli za tumor kwa wagonjwa wa saratani ( inayojulikana kama DNA ya tumor inayozunguka)., ctDNA).Usambazaji wa ukubwa wa hemolymph ccfDNA ambao tulipata katika kome ulikuwa kati ya 1000 hadi 5000 bp, na kupendekeza kuwa ccfDNA ya kome ina asili tofauti.Hii ni dhana ya kimantiki, kwani kome wana mfumo wa mishipa ya nusu-wazi na wanaishi katika mazingira ya majini ya baharini yaliyo na viwango vya juu vya DNA ya genomic ya microbial.Kwa hakika, majaribio yetu ya kimaabara kwa kutumia DNA ya kigeni yameonyesha kuwa kome hujilimbikiza vipande vya DNA kwenye maji ya bahari, angalau baada ya saa chache huharibika baada ya kuchukua seli na/au kutolewa na/au kuhifadhiwa katika mashirika mbalimbali.Kwa kuzingatia adimu ya seli (zote za prokaryotic na yukariyoti), matumizi ya sehemu za ndani ya vali yatapunguza kiwango cha ccfDNA kutoka kwa vyanzo vya kibinafsi na vile vile kutoka kwa vyanzo vya kigeni.Kwa kuzingatia umuhimu wa kinga ya ndani ya bivalve na idadi kubwa ya phagocytes zinazozunguka, tulisisitiza zaidi kwamba hata ccfDNA ya kigeni hutajirishwa katika phagocytes zinazozunguka ambazo hukusanya DNA ya kigeni wakati wa kumeza kwa viumbe vidogo na/au uchafu wa seli.Yakijumlishwa, matokeo yetu yanaonyesha kuwa bivalve hemolymph ccfDNA ni hifadhi ya kipekee ya taarifa za molekuli na huimarisha hali yao kama spishi ya walinzi.
Data zetu zinaonyesha kuwa mpangilio na uchanganuzi wa vipande vya hemolymph ccfDNA vinavyotokana na bakteria vinaweza kutoa taarifa muhimu kuhusu mimea ya bakteria mwenyeji na bakteria waliopo katika mfumo ikolojia wa baharini.Mbinu za kupanga mpangilio wa risasi zimefichua mfuatano wa bakteria wa kawaida A. atra gill ambao ungekosekana ikiwa mbinu za kitambulisho za kawaida za 16S rRNA zingetumika, kutokana na sehemu fulani ya upendeleo wa maktaba ya marejeleo.Kwa hakika, matumizi yetu ya data ya LB iliyokusanywa kutoka kwa M. platensis katika safu sawa ya kome huko Kerguelen ilionyesha kuwa muundo wa symbionts ya bakteria inayohusiana na gill ilikuwa sawa kwa spishi zote mbili za kome (Mchoro S4, Maelezo ya Ziada).Kufanana huku kwa kome wawili tofauti kwa vinasaba kunaweza kuonyesha muundo wa jamii za bakteria katika baridi, salfa, na amana za volkeno za Kerguelen [55, 56, 57, 58].Viwango vya juu vya vijidudu vya kupunguza salfa vimeelezewa vyema wakati wa kuvuna kome kutoka maeneo ya pwani yenye hewa chafu [59], kama vile pwani ya Port-au-France.Uwezekano mwingine ni kwamba mimea ya kome commensal inaweza kuathiriwa na maambukizi ya mlalo [60, 61].Utafiti zaidi unahitajika ili kubaini uwiano kati ya mazingira ya baharini, uso wa sakafu ya bahari, na muundo wa bakteria wanaofanana katika kome.Masomo haya yanaendelea kwa sasa.
Urefu na mkusanyiko wa hemolymph ccfDNA, urahisi wake wa kusafishwa, na ubora wa juu kuruhusu upangaji wa haraka wa bunduki ni baadhi ya faida nyingi za kutumia ccfDNA ya kome kutathmini bayoanuwai katika mifumo ikolojia ya pwani ya bahari.Mbinu hii inafaa hasa kwa kubainisha jumuiya za virusi (viromes) katika mfumo ikolojia fulani [62, 63].Tofauti na bakteria, archaea, na yukariyoti, jenomu za virusi hazina jeni zilizohifadhiwa kifilojenetiki kama vile mfuatano wa 16S.Matokeo yetu yanaonyesha kuwa biopsies kioevu kutoka kwa spishi za kiashirio kama vile kome zinaweza kutumiwa kutambua idadi kubwa ya vipande vya virusi vya ccfDNA vinavyojulikana kuwaambukiza wenyeji ambao kwa kawaida hukaa kwenye mifumo ikolojia ya pwani.Hii inajumuisha virusi vinavyojulikana kuambukiza protozoa, arthropods, wadudu, mimea, na virusi vya bakteria (kwa mfano, bacteriophages).Usambazaji sawa ulipatikana tulipochunguza hemolimfu ccfDNA virome ya kome wa bluu (M. platensis) iliyokusanywa katika safu sawa ya kome huko Kerguelen (Jedwali S2, Maelezo ya Ziada).Mfuatano wa bunduki wa ccfDNA kwa hakika ni mbinu mpya inayopata kasi katika utafiti wa virome ya binadamu au spishi nyingine [21, 37, 64].Mbinu hii ni muhimu hasa kwa ajili ya kuchunguza virusi vya DNA vyenye nyuzi-mbili, kwa kuwa hakuna jeni moja inayohifadhiwa kati ya virusi vyote vya DNA vilivyo na ncha mbili, vinavyowakilisha aina mbalimbali na pana zaidi za virusi huko Baltimore [65].Ingawa nyingi za virusi hivi hazijaainishwa na zinaweza kujumuisha virusi kutoka sehemu isiyojulikana kabisa ya ulimwengu wa virusi [66], tuligundua kwamba viromes na safu za mwenyeji wa kome A. atra na M. platensis huanguka kati ya spishi hizi mbili.vile vile (tazama takwimu S3, maelezo ya ziada).Kufanana huku haishangazi, kwani kunaweza kuonyesha ukosefu wa kuchagua katika kuchukua DNA iliyopo katika mazingira.Masomo ya siku zijazo kwa kutumia RNA iliyosafishwa kwa sasa inahitajika ili kubainisha virome ya RNA.
Katika utafiti wetu, tulitumia bomba kali sana lililochukuliwa kutoka kwa kazi ya Kowarski na wenzake [37], ambao walitumia ufutaji wa hatua mbili wa usomaji wa pamoja na contigs kabla na baada ya mkusanyiko wa ccfDNA asilia, na kusababisha idadi kubwa ya usomaji ambao haujapangwa.Kwa hivyo, hatuwezi kukataa kwamba baadhi ya usomaji huu ambao haujapangwa bado unaweza kuwa na asili yao wenyewe, kimsingi kwa sababu hatuna jenomu ya marejeleo ya spishi hii ya kome.Pia tulitumia bomba hili kwa sababu tulikuwa na wasiwasi kuhusu chimera kati ya usomaji wa kibinafsi na usio wa kibinafsi na urefu wa kusoma unaozalishwa na Illumina MiSeq PE75.Sababu nyingine ya usomaji mwingi ambao haujasomwa ni kwamba vijidudu vingi vya baharini, haswa katika maeneo ya mbali kama vile Kerguelen, hawajafafanuliwa.Tulitumia Illumina MiSeq PE75, tukichukulia urefu wa vipande vya ccfDNA sawa na ccfDNA ya binadamu.Kwa tafiti za baadaye, kutokana na matokeo yetu kuonyesha kwamba hemolymph ccfDNA ina usomaji wa muda mrefu kuliko binadamu na/au mamalia, tunapendekeza kutumia mfumo wa mfuatano unaofaa zaidi kwa vipande virefu vya ccfDNA.Zoezi hili litafanya iwe rahisi zaidi kutambua dalili zaidi za uchambuzi wa kina.Kupata mfuatano kamili wa jenomu ya nyuklia wa A. atra ambao kwa sasa unaweza kuwezesha kwa kiasi kikubwa ubaguzi wa ccfDNA kutoka kwa vyanzo vya kibinafsi na visivyo vya kibinafsi.Kwa kuzingatia kwamba utafiti wetu umezingatia uwezekano wa kutumia dhana ya biopsy ya maji kwa kome, tunatumai kuwa dhana hii inapotumika katika utafiti wa siku zijazo, zana na bomba mpya zitatengenezwa ili kuongeza uwezo wa njia hii kusoma anuwai ya vijidudu vya kome.mfumo ikolojia wa baharini.
Kama alama ya kliniki isiyo ya uvamizi, viwango vya juu vya plasma ya ccfDNA vinahusishwa na magonjwa mbalimbali, uharibifu wa tishu, na hali ya mkazo [67,68,69].Ongezeko hili linahusishwa na kutolewa kwa vipande vya DNA vya asili yake baada ya uharibifu wa tishu.Tulishughulikia suala hili kwa kutumia mkazo mkali wa joto, ambapo kome waliwekwa kwenye joto la 30 °C kwa muda mfupi.Tulifanya uchambuzi huu kwa aina tatu tofauti za kome katika majaribio matatu huru.Hata hivyo, hatukupata mabadiliko yoyote katika viwango vya ccfDNA baada ya mkazo mkali wa joto (ona Mchoro S5, maelezo ya ziada).Ugunduzi huu unaweza kueleza, angalau kwa sehemu, ukweli kwamba mussels wana mfumo wa mzunguko wa nusu-wazi na kukusanya kiasi kikubwa cha DNA ya kigeni kutokana na shughuli zao za juu za kuchuja.Kwa upande mwingine, kome, kama wanyama wengi wasio na uti wa mgongo, wanaweza kuwa sugu zaidi kwa uharibifu wa tishu unaosababishwa na mafadhaiko, na hivyo kuzuia kutolewa kwa ccfDNA katika hemolymph yao [70, 71].
Hadi sasa, uchanganuzi wa DNA wa bioanuwai katika mifumo ikolojia ya majini umezingatia hasa uwekaji alama za DNA (eDNA) wa mazingira.Hata hivyo, njia hii kwa kawaida huwa na mipaka katika uchanganuzi wa bioanuwai wakati viasili vinapotumika.Utumiaji wa mpangilio wa bunduki hukwepa vikwazo vya PCR na uteuzi wa upendeleo wa seti za primer.Kwa hivyo, kwa maana fulani, njia yetu iko karibu na njia ya upangaji wa safu ya juu ya eDNA Shotgun iliyotumiwa hivi karibuni, ambayo inaweza kupanga moja kwa moja DNA iliyogawanyika na kuchambua karibu viumbe vyote [72, 73].Walakini, kuna idadi ya maswala ya kimsingi ambayo hutofautisha LB kutoka kwa njia za kawaida za eDNA.Bila shaka, tofauti kuu kati ya eDNA na LB ni matumizi ya majeshi ya asili ya chujio.Matumizi ya spishi za baharini kama vile sponji na bivalves (Dresseina spp.) kama kichungi asilia cha kusoma eDNA imeripotiwa [74, 75].Walakini, uchunguzi wa Dreissena ulitumia biopsies ya tishu ambayo DNA ilitolewa.Uchambuzi wa ccfDNA kutoka LB hauhitaji biopsy ya tishu, vifaa maalum na wakati mwingine vya gharama kubwa na vifaa vinavyohusishwa na eDNA au biopsy ya tishu.Kwa hakika, hivi majuzi tuliripoti kwamba ccfDNA kutoka LB inaweza kuhifadhiwa na kuchambuliwa kwa usaidizi wa FTA bila kudumisha msururu wa baridi, ambayo ni changamoto kubwa kwa utafiti katika maeneo ya mbali [76].Uchimbaji wa ccfDNA kutoka kwa biopsy kioevu pia ni rahisi na hutoa DNA ya ubora wa juu kwa mpangilio wa bunduki na uchambuzi wa PCR.Hii ni faida kubwa kutokana na baadhi ya mapungufu ya kiufundi yanayohusiana na uchanganuzi wa eDNA [77].Urahisi na gharama ya chini ya njia ya sampuli pia inafaa hasa kwa programu za ufuatiliaji wa muda mrefu.Mbali na uwezo wao wa juu wa kuchuja, kipengele kingine kinachojulikana zaidi cha bivalves ni kemikali ya mucopolysaccharide ya kamasi yao, ambayo inakuza ufyonzaji wa virusi [78, 79].Hii inafanya bivalves kuwa chujio bora cha asili cha kubainisha bioanuwai na athari za mabadiliko ya hali ya hewa katika mfumo ikolojia wa majini.Ingawa kuwepo kwa vipande vya DNA vinavyotokana na mwenyeji kunaweza kuonekana kuwa kikomo cha mbinu ikilinganishwa na eDNA, gharama inayohusishwa na kuwa na ccfDNA asilia ikilinganishwa na eDNA inaeleweka wakati huo huo kwa kiasi kikubwa cha taarifa inayopatikana kwa masomo ya afya.kukabiliana na mwenyeji.Hii inajumuisha uwepo wa mfuatano wa virusi uliounganishwa kwenye jenomu ya mwenyeji.Hii ni muhimu hasa kwa kome, ikizingatiwa kuwepo kwa virusi vya leukemia zinazopitishwa kwa mlalo kwenye bivalves [80, 81].Faida nyingine ya LB juu ya eDNA ni kwamba hutumia shughuli ya phagocytic ya kuzunguka kwa seli za damu katika hemolimfu, ambayo humeza microorganisms (na jenomu zao).Phagocytosis ni kazi kuu ya seli za damu katika bivalves [82].Hatimaye, njia hiyo inachukua fursa ya uwezo wa juu wa kuchuja wa mussels (wastani wa 1.5 l / h ya maji ya bahari) na mzunguko wa siku mbili, ambayo huongeza mchanganyiko wa tabaka tofauti za maji ya bahari, kuruhusu kukamata eDNA ya heterologous.[83, 84].Kwa hivyo, uchanganuzi wa ccfDNA ya kome ni njia ya kuvutia kutokana na athari za lishe, kiuchumi na kimazingira za kome.Sawa na uchambuzi wa LB uliokusanywa kutoka kwa wanadamu, njia hii pia inafungua uwezekano wa kupima mabadiliko ya maumbile na epigenetic katika DNA mwenyeji kwa kukabiliana na vitu vya nje.Kwa mfano, teknolojia za upangaji za kizazi cha tatu zinaweza kuzingatiwa kufanya uchanganuzi wa methylation ya genome katika ccfDNA asilia kwa kutumia mpangilio wa nanopore.Utaratibu huu unapaswa kuwezeshwa na ukweli kwamba urefu wa vipande vya ccfDNA vya mussel ni vyema kuendana na majukwaa ya mfuatano yaliyosomwa kwa muda mrefu ambayo huruhusu uchambuzi wa methylation ya DNA ya genome kutoka kwa mlolongo mmoja wa kukimbia bila ya haja ya mabadiliko ya kemikali.85,86] Huu ni uwezekano wa kuvutia, kwani imeonyeshwa kuwa majibu ya DNA juu ya mifumo ya methylist ya mazingira yanaakisi mifumo mingi ya dhiki ya DNA juu ya mazingira.Kwa hivyo, inaweza kutoa ufahamu muhimu katika mifumo ya msingi inayoongoza majibu baada ya kufichuliwa na mabadiliko ya hali ya hewa au uchafuzi wa mazingira [87].Walakini, utumiaji wa LB sio bila mapungufu.Bila kusema, hii inahitaji uwepo wa aina za viashiria katika mfumo wa ikolojia.Kama ilivyotajwa hapo juu, kutumia LB kutathmini bioanuwai ya mfumo ikolojia fulani pia kunahitaji bomba la habari za kibayolojia ambalo huzingatia uwepo wa vipande vya DNA kutoka kwa chanzo.Tatizo jingine kubwa ni upatikanaji wa jenomu rejea kwa viumbe vya baharini.Inatarajiwa kwamba mipango kama vile Mradi wa Marine Mammal Genomes na mradi ulioanzishwa hivi majuzi wa Fish10k [88] utawezesha uchanganuzi kama huo katika siku zijazo.Utumiaji wa dhana ya LB kwa viumbe vinavyolisha vichujio vya baharini pia unaendana na maendeleo ya hivi punde katika teknolojia ya kupanga mpangilio, na kuifanya inafaa kwa ajili ya maendeleo ya alama za viumbe zenye ohm nyingi ili kutoa taarifa muhimu kuhusu afya ya makazi ya baharini ili kukabiliana na matatizo ya mazingira.
Data ya mpangilio wa jenomu imewekwa katika Kumbukumbu ya Kusomwa kwa Mfuatano wa NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 chini ya Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Athari za mabadiliko ya hali ya hewa kwa viumbe vya baharini na mifumo ikolojia.Biolojia ya Cole.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Fikiria athari za pamoja za mabadiliko ya hali ya hewa na mafadhaiko mengine ya ndani kwenye mazingira ya baharini.mazingira ya kisayansi ya jumla.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.)Sayansi ya kwanza ya Machi.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Kupunguza uvumilivu wa joto chini ya hali ya mkazo wa kurudia joto huelezea vifo vya juu vya msimu wa joto wa kome wa bluu.Ripoti ya kisayansi 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Mabadiliko ya hivi karibuni katika mzunguko, sababu na kiwango cha vifo vya wanyama.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Viini vingi visivyo vya spishi maalum vinaweza kusababisha vifo vingi vya Pinna nobilis.Maisha.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Athari zinazowezekana za mabadiliko ya hali ya hewa kwenye magonjwa ya zoonotiki ya Aktiki.Afya ya Int J Circumpolar.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Kome wa bluu (Mytilus edulis spp.) kama viumbe vya ishara katika ufuatiliaji wa uchafuzi wa pwani: mapitio.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Ushirikiano wa biopsy kioevu katika matibabu ya saratani.Nat Rev Safi Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Ukomavu wa biopsy ya kioevu: Huruhusu DNA ya tumor kuzunguka.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nucleic asidi katika plasma ya binadamu.Dakika za mkutano za kampuni tanzu za Soc Biol.1948;142:241-3 .
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Jukumu jipya la DNA isiyo na seli kama kiashirio cha molekuli ya matibabu ya saratani.Uhesabuji wa uchambuzi wa biomolar.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy inaingia kliniki - masuala ya utekelezaji na changamoto za siku zijazo.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW na wengine.DNA ya fetasi iko katika plasma ya mama na seramu.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Utafiti wa kipindi cha ujauzito na matatizo yake kwa kutumia RNA ya ziada ya seli inayozunguka katika damu ya wanawake wakati wa ujauzito.Madaktari wa watoto.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsy ya kioevu: DNA isiyo na seli ya wafadhili hutumiwa kugundua vidonda vya alojeneki kwenye pandikizi la figo.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Uvumbuzi wa Lo YM katika uchunguzi wa kabla ya kuzaa: mpangilio wa jenomu ya plasma ya mama.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Ugunduzi wa haraka wa pathojeni kwa mfuatano wa kizazi kijacho wa metagenomic ya viowevu vya mwili vilivyoambukizwa.Dawa ya Nat.2021;27:115-24.