Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza kwamba utumie kivinjari kilichosasishwa (au zima hali ya uoanifu katika Internet Explorer).Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Chembe chembe chembe chembe za silika zilitayarishwa kwa njia ya sol-gel na baadhi ya marekebisho ili kupata chembe za macroporous. Chembe hizi zilitolewa kwa upolimishaji wa uhamishaji wa mgawanyiko wa ziada wa kugawanyika (RAFT) na N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) na styrene ili kuandaa N-phenylmaleide ya stesheni ya MP ya polyboric ya safu ya MP. s (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) zilipakiwa kwa upakiaji wa tope. Tathmini ya utenganishaji wa safu wima ya PMP ya mchanganyiko wa peptidi unaojumuisha peptidi tano (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arnkeg, leucineps ya albamu ya leucineps ya utendakazi wa binadamu wa leucineps) ).Chini ya hali bora zaidi za kufichua, idadi ya sahani ya kinadharia ya mchanganyiko wa peptidi ni ya juu hadi sahani 280,000/m². Ikilinganisha utendaji wa utengano wa safu wima iliyotengenezwa na safu wima ya kibiashara ya Ascentis Express RP-Amide, ilibainika kuwa utendakazi wa utenganisho wa safu wima ya PMP ulikuwa bora kuliko safu wima ya kibiashara katika suala la utenganisho wa utendakazi.
Katika miaka ya hivi majuzi, tasnia ya dawa ya kibayolojia imekuwa soko linalopanuka la kimataifa na ongezeko kubwa la hisa ya soko. Pamoja na ukuaji wa mlipuko wa tasnia ya dawa ya kibayolojia1,2,3, uchambuzi wa peptidi na protini unahitajika sana. Mbali na peptidi inayolengwa, uchafu kadhaa hutolewa wakati wa usanisi wa peptidi, na hivyo kuhitaji uchanganuzi wa utakaso wa protini. maji maji ya mwili, tishu na seli ni kazi yenye changamoto kubwa kutokana na idadi kubwa ya spishi zinazoweza kutambulika katika sampuli moja.Ingawa spectrometry ya molekuli ni chombo madhubuti cha mpangilio wa peptidi na protini, ikiwa sampuli kama hizo zitadungwa kwenye spectrometer ya wingi katika kupita moja, utengano hautakuwa bora. spectrometer kwa wakati fulani4,5,6.Aidha, wakati wa mgawanyo wa awamu ya kioevu, wachambuzi wanaweza kuzingatia katika mikoa nyembamba, na hivyo kuzingatia wachambuzi hawa na kuboresha unyeti wa kugundua MS.Kromatografia ya kioevu (LC) imeendelea kwa kiasi kikubwa zaidi ya miaka kumi iliyopita na imekuwa mbinu maarufu katika uchambuzi wa proteomic7,8,9,10.
Kromatografia ya kioevu ya awamu ya reversed (RP-LC) inatumika sana kwa utakaso na utenganishaji wa michanganyiko ya peptidi kwa kutumia silika iliyobadilishwa octadecyl (ODS) kama awamu ya stationary11,12,13.Hata hivyo, awamu zisizosimama za RP hazitoi utengano wa kuridhisha wa peptidi na protini kutokana na muundo wa amfifi15 ulioundwa kabla,15 awamu ya amfifa. inahitajika kuchambua peptidi na protini zenye sehemu za polar na zisizo za polar ili kuingiliana na na kuhifadhi uchanganuzi huu16.Kromatografia ya hali ya mchanganyiko, ambayo hutoa mwingiliano wa multimodal, inaweza kuwa mbadala wa RP-LC kwa mgawanyo wa peptidi, protini, na mchanganyiko mwingine changamano.Kadhaa mchanganyiko-mode mchanganyiko-mode chromatografia1 zimetayarishwa, awamu za stationary1 zimetayarishwa, awamu za stationary1 zimetayarishwa1 na awamu1 za protini zimetayarishwa. 8,19,20,21.Awamu za stationary za hali-mchanganyiko (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, mwingiliano wa polar/RPLC) zinafaa kwa mgawanyiko wa peptidi na protini kwa sababu ya uwepo wa vikundi vya polar na zisizo za polar22,23,24,25,26,27,28 .Sawa sawa na kituo cha polar cha polar na kituo cha kipekee cha polar. kuchagua kwa uchanganuzi wa polar na zisizo za polar, kwani utengano unategemea mwingiliano kati ya analyte na awamu ya stationary.Mwingiliano wa aina nyingi 29, 30, 31, 32.Hivi karibuni, Zhang et al.30 ilitayarisha awamu ya kusimama ya polyamine iliyokatishwa na dodecyl na kutenganisha kwa ufanisi hidrokaboni, dawamfadhaiko, flavonoidi, nyukleosidi, estrojeni, na uchanganuzi zingine kadhaa. Kiingiliano cha polar kina vikundi vya polar na visivyo vya polar, kwa hivyo inaweza kutumika kutenganisha peptidi na protini ambazo zina haidrofobiki na adrofili-molaidi ya C. safuwima) zinapatikana kibiashara chini ya jina la biashara safu wima za Ascentis Express RP-Amide, lakini safu wima hizi hutumiwa kwa uchanganuzi wa amini 33 pekee.
Katika utafiti wa sasa, awamu ya stationary iliyopachikwa polar (N-phenylmaleimide-embedded polystyrene) ilitayarishwa na kutathminiwa kwa ajili ya kutenganisha peptidi na trypsin digests ya HSA. Awamu ya stationary ilitayarishwa kwa kutumia mkakati ufuatao.Chembe za silika za porous zilitayarishwa kulingana na utaratibu uliotolewa katika uchapishaji wetu uliopita na baadhi ya marekebisho. Asidi ya cetic ilirekebishwa ili kuandaa chembe za silika zenye ukubwa mkubwa wa pore.Pili, ligand mpya, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, iliundwa na kutumika kutengeneza chembe za silika ili kuandaa polar iliyopachikwa awamu ya stationary. Awamu ya stationary iliyosababisha imefungwa kwenye safu ya packing ya chuma cha pua iliyoboreshwa 100 mm × 100 mm. mtetemo wa mitambo ili kuhakikisha kitanda chenye usawa kinaundwa ndani ya safu.Tathmini mgawanyiko wa safu wima uliojaa wa mchanganyiko wa peptidi unaojumuisha peptidi tano;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) na mmeng'enyo wa Trypsin wa albin ya seramu ya binadamu (HAS).Mchanganyiko wa peptidi na usagaji wa trypsin wa HSA ulizingatiwa ili kutengana na mwonekano mzuri na ufanisi wa safu wima ya AMP ililinganishwa na safu wima ya AMP ya AMP ililinganishwa. peptidi na protini zilionekana kutatuliwa vizuri na kwa ufanisi kwenye safu ya PMP, ambayo ilikuwa na ufanisi zaidi kuliko safu ya Ascentis Express RP-Amide.
Kigingi (Polyethilini Glycol), Urea, Asidi ya Acetiki, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Trypsin, Albumin ya Seramu ya Binadamu (HSA), Ammonium Chloride, Urea, Hexane Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Chloride, POHYDROXOXIDE (MC), Sloydroksidi ya Methacryloyl, POHYRENEDROSIDE (MC-TEM) HPLC Grade Acetonitrile (ACN), Methanol, 2-Propanol, na Acetone Imenunuliwa kutoka Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Mchanganyiko wa urea (8 g), polyethilini glikoli (8 g), na mililita 8 ya asidi asetiki 0.01 N ilichochewa kwa dakika 10, na kisha mililita 24 za TMOS ziliongezwa hapo chini ya hali ya baridi ya barafu. Mchanganyiko wa athari uliwashwa kwa joto la 40 ° C kwa saa 6 na kisha kwa 120 ° C na vifaa vya chuma vilikaushwa kwa saa 8. 70 ° C kwa saa 12. Masi ya laini kavu ilikuwa chini ya laini katika tanuri na calcined saa 550 ° C kwa saa 12. Makundi matatu yalitayarishwa na sifa ya kuchunguza kuzaliana kwa ukubwa wa chembe, ukubwa wa pore na eneo la uso.
Kwa marekebisho ya uso wa chembe za silika na ligand ya awali ya phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) ikifuatiwa na upolimishaji wa radial na styrene, kiwanja kilicho na kikundi cha polar kilitayarishwa.Awamu ya stationary kwa aggregates na minyororo polystyrene.Mchakato wa maandalizi ni ilivyoelezwa hapa chini.
N-phenylmaleimide (200 mg) na methyl vinyl isocyanate (100 mg) ziliyeyushwa katika toluini kavu, na mililita 0.1 ya 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) iliongezwa kwenye chupa ya majibu ili kuandaa phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate kwa saa 3 C na kichujio cha C3 ° kilichokaushwa. oveni saa 40 ° C kwa masaa 3.
Chembe za silika zilizokaushwa (2 g) zilitawanywa katika toluini kavu (100 mL), zimechochewa na kusonishwa kwenye chupa ya chini ya mililita 500 kwa dakika 10.PMCP (10 mg) iliyeyushwa katika toluini na kuongezwa kwa njia ya kushuka kwenye chupa ya majibu kupitia funnel ya kudondosha. Mchanganyiko huo ulirudishwa kwa joto la 100 ° C na kukaushwa kwa 100 ° C kwa 100 ° C na kukaushwa kwa 100 ° C. Kisha, chembe za silika zilizounganishwa na PMCP (100 g) ziliyeyushwa katika toluini (mililita 200) na 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) iliongezwa mbele ya 100 µL ya dibutyltin dilaurate kama kichocheo. Mchanganyiko huo ulikorogwa kwa 50 ° C na kukaushwa kwa saa 8 °, 0 ° C.
Styrene (1 mL), peroxide ya benzoyl BPO (0.5 mL), na chembe za silika zilizoambatishwa za TEMPO-PMCP (1.5 g) zilitawanywa katika toluini na kusafishwa kwa nitrojeni. Upolimishaji wa styrene ulifanyika kwa 100 ° C kwa saa 12. Bidhaa iliyosababishwa ilioshwa na methanoli ya 1 kwa jumla ya 60 ° C na kukaushwa kwa usiku.
Sampuli ziliondolewa gesi kwa 393 K kwa saa 1 ili kupata shinikizo la mabaki la chini ya 10-3 Torr. Kiasi cha N2 kilichotangazwa kwa shinikizo la jamaa la P/P0 = 0.99 kilitumiwa kuamua jumla ya kiasi cha pore.Mofolojia ya chembe za silika zisizo wazi na za ligand-bonded, sampuli ya elektroni ya tachiesD ya juu ya Japani ilichunguzwa kwa microscopy ya Tokyo (Hii ya Japani ya kuchunguzwa). (silica tupu na chembe za silika zilizounganishwa na ligand) ziliwekwa kwenye safu ya alumini kwa kutumia mkanda wa kaboni wa wambiso.Dhahabu iliwekwa kwenye sampuli kwa kutumia mipako ya sputter ya Q150T, na safu ya 5 nm Au iliwekwa kwenye sampuli.Hii inaboresha ufanisi wa mchakato kwa kutumia voltages za chini na hutoa nafaka nzuri, sputtering ya baridi ya EA2, EA2 Eleron ya USA1 Eleron ya USA1 ( USAFlash sputtering. hutumika kwa uchanganuzi wa kimsingi.A Malvern (Worcestershire, UK) Kichanganuzi cha ukubwa wa chembe 2000 kilitumika kupata usambazaji wa saizi ya chembe.Chembe za silika zilizo uchi na chembe za silika zilizounganishwa na ligand (5 mg kila moja) zilitawanywa katika mililita 5 ya isopropanol, iliyotiwa glasi kwa dakika 10, iliwekwa kwenye mchanganuo wa 5. inafanywa kwa kiwango cha 5 °C kwa dakika juu ya kiwango cha joto cha 30 hadi 800 °C.
Safu wima zenye vipimo vyembamba za chuma cha pua zenye mstari wa glasi (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) zilipakiwa kwa kutumia mbinu ya upakiaji wa tope, kwa kutumia utaratibu ule ule uliotumika katika Kumb.31. Safu ya chuma cha pua (iliyo na kioo, kitambulisho cha milimita 100 × 1.8) chenye kifaa cha kutoshea chenye frit ya 1 µm iliunganishwa kwenye kifungashio cha tope (Alltech Deerfield, IL, USA). Tayarisha tope la awamu isiyosimama kwa kusimamisha miligramu 150 za mL ya mL iliyotumika katika safu ya uhifadhi ya menotha katika menotha 1. kutengenezea tope na vile vile kutengenezea. Jaza safu mfuatano kwa kutumia shinikizo la Mbunge 100 kwa dakika 10, Mbunge 80 kwa dakika 15, na Mbunge 60 kwa dakika 30. Wakati wa kufunga, mtetemo wa mitambo ulitumiwa na vitetemeshi viwili vya safu ya GC (Alltech, Deerfield, IL kupakia sare ya safu na kuzuia sare ya safu polepole ili kuzuia uharibifu wa safu wima). safu.Tenganisha safu kutoka kwa kitengo cha kupakia tope na uunganishe kipengee kingine cha kuingiza na kwenye mfumo wa LC ili kuangalia utendaji wake.
Pampu ya LC (10AD Shimadzu, Japani), injector (Valco (Marekani) C14 W.05) yenye kitanzi cha sindano ya 50nL, degasser ya membrane (Shimadzu DGU-14A), dirisha la kapilari la UV-VIS lilitengenezwa Kitambua kifaa Maalum cha µLC (UV-2075) na safu fupi ya kuunganisha mikrofoni yenye laini nyembamba yenye laini ya glasi na mikrofoni yenye laini ya ziada yenye laini ya kioo. ening.Baada ya ufungashaji, kapilari (50 μm id 365 na kapilari za kupunguza muungano (50 μm) ziliwekwa kwenye sehemu ya 1/16″ ya muungano wa kupunguza. Ukusanyaji wa data na uchakataji wa kromatografia ulifanyika kwa kutumia programu ya Multichro 2000. Ufuatiliaji katika 254 data acsorption ya Chromatografia ilijaribiwa na Chromatografia ya Chromatographic ilijaribiwa na Chromatografia ya Chromatographic. Northampton, MA).
Albumini kutoka kwa seramu ya binadamu, poda lyophilized, ≥ 96% (electrophoresis ya gel ya agarose) 3 mg iliyochanganywa na trypsin (1.5 mg), urea 4.0 M (1 mL), na 0.2 M ammonium bicarbonate (1 mL). Suluhisho lilichochewa kwa dakika 10 na kuwekwa katika umwagaji wa maji kwa saa 60 ° C na 60% T que 37 ° C. Chuja suluhisho na uhifadhi chini ya 4 °C.
Mtengano wa michanganyiko ya peptidi na michanganyiko ya trypsin ya HSA ilitathminiwa kando kwenye safu wima za PMP. Angalia utenganisho wa mchanganyiko wa peptidi na trypsin digest ya HSA kwa safu wima ya PMP na ulinganishe matokeo na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide. Nambari ya sahani ya kinadharia imekokotolewa kama ifuatavyo:
Picha za SEM za chembe tupu za silika na chembe za silika zilizounganishwa na ligand zinaonyeshwa kwenye FIG.2 .Sem Picha za chembe za silika (a, b) zinaonyesha kuwa, tofauti na masomo yetu ya zamani, chembe hizi ni za spherical ambazo chembe hizo zinainuliwa au zina ulinganifu usio wa kawaida. Sehemu ya uso wa ligand-bonded (c, d) ni laini kuliko ile ya chembe za silika.
Inachanganua picha za hadubini ya elektroni za chembe tupu za silika (A, B) na chembe za silika zilizounganishwa na ligand (C, D).
Usambazaji wa ukubwa wa chembe za silika tupu na chembe za silika zilizounganishwa na ligand huonyeshwa kwenye Mchoro 3 (A). Mikondo ya usambazaji wa ukubwa wa chembe kulingana na kiasi ilionyesha kuwa saizi ya chembe za silika iliongezeka baada ya urekebishaji wa kemikali (Mchoro 3A). Data ya usambazaji wa ukubwa wa chembe kutoka kwa utafiti wa sasa na utafiti wa awali wa 1 (Ukubwa wa MP5 unalinganishwa). 3.36 μm, ikilinganishwa na utafiti wetu wa awali na thamani ya tangazo (0.5) ya 3.05 μm (chembe za silika zilizofungwa na polystyrene) 34. Kundi hili lilikuwa na usambazaji wa ukubwa wa chembe nyembamba ikilinganishwa na utafiti wetu wa awali kutokana na uwiano tofauti wa PEG, urea, TMOS, na asidi asetiki katika mchanganyiko wa majibu ya awamu ya polystyrene kuliko ukubwa wa Prene MP. .Hii inamaanisha kuwa utendakazi wa uso wa chembe za silika na styrene uliweka tu safu ya polystyrene (0.97 µm) kwenye uso wa silika, ambapo katika awamu ya PMP unene wa safu ulikuwa 1.38 µm.
Usambazaji wa ukubwa wa chembe (A) na usambazaji wa saizi ya pore (B) ya chembe tupu za silika na chembe za silika zilizofungamana na ligand.
Ukubwa wa pore, kiasi cha pore na eneo la uso wa chembe za silika za utafiti wa sasa zimetolewa katika Jedwali 1(B). Maelezo mafupi ya PSD ya chembe tupu za silika na chembe za silika zilizounganishwa na ligand zimeonyeshwa kwenye Mchoro 3(B).Matokeo yanalinganishwa na utafiti wetu wa awali.Ukubwa wa pore wa tupu na ligand huonyesha kwamba silika 23,30 na 230 hufuatana na 23. ukubwa hupungua kwa 69 baada ya urekebishaji wa kemikali, kama inavyoonyeshwa katika Jedwali 1 (B), na mabadiliko ya curve yanaonyeshwa kwenye Mchoro 3 (B) . Vile vile, kiasi cha pore cha chembe za silika kilipungua kutoka 0.67 hadi 0.58 cm3 / g baada ya kubadilishwa kwa kemikali. Eneo maalum la uso wa silika 11 iliyochunguzwa kwa sasa ni 2 m / 2 chembe za 2 m / 2 ( compg 2 m / 2 ( compg 2 m 2) utafiti uliopita. ).Kama inavyoonyeshwa katika Jedwali 1(B), eneo la uso (m2/g) la chembe za silika pia lilipungua kutoka 116 m2/g hadi 105 m2/g baada ya kurekebishwa kwa kemikali.
Matokeo ya uchambuzi wa msingi wa awamu ya stationary yanaonyeshwa katika Jedwali 2. Upakiaji wa kaboni wa awamu ya sasa ya stationary ni 6.35%, ambayo ni ya chini kuliko upakiaji wa kaboni ya utafiti wetu uliopita (chembe za silika zilizounganishwa na polystyrene, 7.93% 35 na 10.21%, kwa mtiririko huo) 42. Upakiaji wa kaboni wa polar, utayarishaji wa sasa wa SP kwa sasa, kwa sababu ya upakiaji wa kaboni ya polar, lily ya sasa ya SP, ya sasa ya stationary kwa SP. kama vile phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) na 4-hydroxy-TEMPO zilitumika. Asilimia ya uzito wa nitrojeni ya awamu ya sasa ya tuli ni 2.21%, ikilinganishwa na 0.1735 na 0.85% kwa uzito wa nitrojeni katika tafiti zilizopita, kwa mtiririko huo. 4) na (5) walikuwa 2.7% na 2.9%, kwa mtiririko huo, wakati upakiaji wa kaboni ya bidhaa ya mwisho (6) ilikuwa 6.35%, kama inavyoonyeshwa kwenye Jedwali 2. Kupunguza uzito kuliangaliwa na awamu ya PMP ya stationary, na curve ya TGA imeonyeshwa kwenye Mchoro 4. Curve ya TGA inaonyesha kupoteza uzito wa kaboni ambayo 3% ina upakiaji wa 8.6% tu, lakini kaboni ni 8.6% tu. pia N, O, na H.
Ligand ya phenylmaleimide-methylvinylisocyanate ilichaguliwa kwa ajili ya kurekebisha uso wa chembe za silika kwa sababu ina vikundi vya phenylmaleimide ya polar na vikundi vya vinylisocyanate.Vikundi vya isocyanate vya vinyl vinaweza kuguswa zaidi na styrene kwa kuishi upolimishaji mkali.Sababu ya pili ni kuingiza kikundi ambacho kina mwingiliano wa wastani na kituo cha analyte ya analyte na hakuna mwingiliano wa awamu ya analyte na hakuna phenyl ya analyte ya awamu ya analyte. mide moiety haina malipo virtual katika pH ya kawaida.Polarity ya awamu ya stationary inaweza kudhibitiwa na kiasi mojawapo ya styrene na wakati mmenyuko wa bure radical upolimishaji.Hatua ya mwisho ya mmenyuko (free-radical upolimishaji) ni muhimu na inaweza kubadilisha polarity ya awamu stationary.Uchambuzi wa kipengele ulifanywa ili kuangalia upakiaji wa kaboni ya upakiaji wa kaboni ya awamu hii iliyoongezeka na kuongezeka kwa awamu ya kaboni ilizingatiwa kuwa awamu ya stationary iliyoongezeka na mmenyuko wa kaboni uliongezeka. kinyume chake.SP zilizotayarishwa kwa viwango tofauti vya styrene zina upakiaji tofauti wa kaboni.Tena, pakia awamu hizi zisizosimama kwenye safu wima za chuma cha pua na uangalie utendaji wao wa kromatografia (uteuzi, azimio, thamani ya N, n.k.).Kulingana na majaribio haya, uundaji ulioboreshwa ulichaguliwa ili kuandaa awamu ya kusimama ya PMP ili kuhakikisha polarity iliyodhibitiwa na uchanganuzi mzuri.
Mchanganyiko wa peptidi tano (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) pia zilitathminiwa kwa kutumia safu ya PMP kwa kutumia awamu ya simu;60/40 (v/v) asetonitrili/maji (0.1% TFA) kwa kiwango cha mtiririko cha 80 μL/min. Chini ya hali bora zaidi za ufichuzi, nambari ya bati ya kinadharia (N) kwa kila safu (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) ni 20,000 ± 100 (sahani 200,00 kwa safu wima ya P30000000000). kromatogramu zimeonyeshwa kwenye Mchoro 5A. Uchambuzi wa haraka kwenye safu wima ya PMP kwa kiwango cha juu cha mtiririko (700 μL/min), peptidi tano zilitolewa ndani ya dakika moja, thamani za N zilikuwa nzuri sana, 13,500 ± 330 kwa kila safu (id (Id 100 × 1.8 mm) zilipakiwa na kura tatu tofauti za awamu ya kusimama ya PMP ili kuangalia uwezekano wa kuzaliana. Mkusanyiko wa uchanganuzi kwa kila safu ulirekodiwa kwa kutumia hali bora zaidi za ufafanuzi na idadi ya bati za kinadharia N na muda wa kubaki ili kutenganisha mchanganyiko sawa wa majaribio kwenye kila safu. Data ya kuzaliana kwa safuwima za PMP na uwiano wa chini wa safuwima ya PMP imeonyeshwa katika safu wima ya chini ya PMP. Thamani za RSD, kama inavyoonyeshwa kwenye Jedwali 3.
Mgawanyiko wa mchanganyiko wa peptidi kwenye safu ya PMP (B) na safu ya Ascentis Express RP-Amide (A);awamu ya simu 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), vipimo vya safu ya PMP (kitambulisho cha 100 × 1.8 mm);uchambuzi Utaratibu wa elution wa misombo: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) na 5 (leucine) asidi enkephalin)).
Safu wima ya PMP (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) ilitathminiwa kwa kutenganishwa kwa miyeyusho ya tryptic ya albin ya serum ya binadamu katika kromatografia ya kioevu ya utendaji wa juu. Kromatogramu katika Mchoro wa 6 inaonyesha kuwa sampuli imetenganishwa vyema na mwonekano ni mzuri sana. Michanganyiko ya HSA ilichanganuliwa kwa kutumia kiwango cha mtiririko cha 100min/toni3/awamu ya rununu ya 100/toni µ µ ya simu ya mkononi ya 100/toni µµ 1% TFA.Kama inavyoonyeshwa kwenye kromatogramu (Mchoro 6), usagaji chakula wa HSA umegawanyika katika vilele 17 vinavyolingana na peptidi 17. Ufanisi wa utenganisho wa kila kilele katika muhtasari wa HSA ulikokotolewa na maadili yametolewa katika Jedwali la 5.
Muhtasari wa tryptic wa HSA (id 100 × 1.8 mm) ulitenganishwa kwenye safu wima ya PMP;kasi ya mtiririko (100 µL/min), awamu ya simu 60/40 asetonitrile/maji yenye 0.1% TFA.
ambapo L ni urefu wa safu, η ni mnato wa awamu ya simu, ΔP ni shinikizo la nyuma la safu, na u ni kasi ya mstari wa awamu ya simu. Upenyezaji wa safu wima ya PMP ulikuwa 2.5 × 10-14 m2, kiwango cha mtiririko kilikuwa 25 μL/min, na 60/40 v/v. 0/v ACN × 1 ya safu wima ya 1 x 1 ilitumika kwa safu wima ya 1 ya maji. ilikuwa sawa na ile ya utafiti wetu wa awali Ref.34.Upenyezaji wa safu iliyojaa chembe za vinyweleo vya juu juu ni: 1.7 × 10-15 kwa chembe 1.3 μm, 3.1 × 10-15 kwa chembe 1.7 μm, 5.2 × 10-5 × 2 μm 2 × 5. μm chembe 43. Kwa hiyo, upenyezaji wa awamu ya PMP ni sawa na ile ya 5 μm chembe za msingi-shell.
ambapo Wx ni uzito wa safu iliyopakiwa na klorofomu, Wy ni uzito wa safu iliyopakiwa na methanoli, na ρ ni msongamano wa kiyeyusho.Msongamano wa methanoli (ρ = 0.7866) na klorofomu (ρ = 1.484).Ubora wa jumla wa SILICA PARTICLES 108 × 108mm CARTICLES 108-18666 (ρ = 0.7866) na klorofomu (ρ = 1.484). Nguzo za Urea 31 ambazo tulisoma hapo awali zilikuwa 0.63 na 0.55, mtawalia.Hii ina maana kwamba kuwepo kwa ligandi za urea hupunguza upenyezaji wa awamu ya kusimama. Kwa upande mwingine, ukamilifu wa jumla wa safu wima ya PMP (id ya 100 × 1.8 mm) ni 0.60.Upenyezaji wa upenyezaji wa safuwima ya C1 iliyopakiwa chini ya safuwima ya silika ya C1 kwa sababu ya safu wima ya C1. Awamu zisizosimama za aina 8, ligandi za C18 huunganishwa kwenye chembe za silika kama minyororo ya mstari, ilhali katika awamu za tuli za aina ya polystyrene, safu ya polima yenye unene kiasi huundwa kuizunguka. Katika jaribio la kawaida, uimara wa safu wima huhesabiwa kama:
Kielelezo 7A,B kinaonyesha safu wima ya PMP (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) kwa kutumia hali sawa za uboreshaji (yaani, 60/40 ACN/H2O na 0.1% TFA).) ya njama ya van Deemter.Michanganyiko ya peptidi iliyochaguliwa (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ilitayarishwa katika 20 µL/ Kiwango cha chini cha mtiririko kwa safu zote mbili ni 800 µL/min. Kiwango cha chini cha thamani cha HETP kwa safu wima ya 8µµ kiwango cha chini cha mtiririko wa HETP kwa L/min µm Safu wima ya Express RP-Amide ilikuwa 2.6 µm na 3.9 µm, mtawalia. Thamani za HETP zinaonyesha kwamba ufanisi wa utenganisho wa safu wima ya PMP (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) ni bora zaidi kuliko safu inayopatikana kibiashara ya Ascentis Express RP-Amide (safu wima 100 × 1.8 na mtiririko huo katika kiwanja cha N7 huonyesha kupungua kwa thamani ya 7 mm). si muhimu ikilinganishwa na utafiti wetu wa awali.Ufanisi wa juu wa kutenganisha safu ya PMP (id ya 100 × 1.8 mm) ikilinganishwa na safu ya Ascentis Express RP-Amide inategemea uboreshaji wa umbo la chembe, ukubwa, na taratibu changamano za kufunga safu zinazotumiwa katika kazi ya sasa34.
(A) van Deemter plot (HETP dhidi ya kasi ya mstari wa awamu ya simu) iliyopatikana kwa kutumia safu wima ya PMP (100 × 1.8 mm id) katika 60/40 ACN/H2O yenye 0.1% TFA.(B) van Deemter plot (HETP dhidi ya kasi ya mstari wa awamu ya simu) iliyopatikana kwa kutumia safu wima ya RP-Ascentis 1 × 10 RP-Ascentis Express. 0 ACN/H2O yenye TFA 0.1%.
Awamu ya kusimama ya polystyrene iliyopachikwa polar ilitayarishwa na kutathminiwa kwa ajili ya kutenganisha michanganyiko ya peptidi sanisi na miyeyusho ya trypsin ya albumin ya seramu ya binadamu (HAS) katika kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa juu. Utendaji wa kromatografia wa safu wima za PMP kwa michanganyiko ya peptidi ni bora katika ufanisi wa utengano na azimio. chembe, usanisi unaodhibitiwa wa awamu ya kusimama, na ufungashaji wa safu tata.Mbali na ufanisi mkubwa wa kujitenga, shinikizo la chini la safu ya nyuma katika viwango vya juu vya mtiririko ni faida nyingine ya awamu hii ya stationary. Nguzo za PMP zinaonyesha uzazi mzuri na zinaweza kutumika kwa ajili ya uchambuzi wa mchanganyiko wa peptidi na trypsin digestion ya protini mbalimbali. ography.Katika siku zijazo, safu wima za PMP pia zitatathminiwa kwa ajili ya kutenganisha protini na kingamwili za monokloni.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Utafiti kuhusu Mifumo ya Kutenganisha Peptidi kwa Awamu Iliyobadilishwa Kromatografia Sehemu ya I: Ukuzaji wa Itifaki ya Uainishaji wa Safu wima.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Peptidi amilifu zilizoboreshwa zilizoundwa kwa ajili ya matibabu ya magonjwa ya kuambukiza.Bioteknolojia.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptidi za matibabu ya syntetisk: sayansi na soko.ugunduzi wa madawa ya kulevya.15 (1-2) leo, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.10.0).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kioo cha hali ya juu cha kromatografia-mass spectrometry huwezesha ujumuishaji wa kimetaboliki na proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019) inayolengwa kwa mapana.
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Jukumu la UHPLC katika ukuzaji wa dawa za kulevya.J.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Vipengele vya kimsingi na vya vitendo vya kromatografia ya kioevu ya shinikizo la juu kwa utengano wa haraka.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitchef, P. Utumiaji wa kromatografia ya utendakazi wa hali ya juu ya kioevu katika ukuzaji wa dawa.J.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Monolithic macroporous hydrogels iliyotayarishwa kutoka kwa emulsion ya awamu ya juu ya ndani ya mafuta ya ndani ya maji kwa ajili ya utakaso mzuri wa enteroviruses.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Jukumu la kromatografia ya kioevu katika proteomics.J.Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Mitindo inayoibuka katika utenganisho wa kromatografia ya kioevu ya awamu iliyogeuzwa ya peptidi za matibabu na protini: nadharia na matumizi.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Mgawanyo wa pande mbili wa peptidi kwa kutumia mfumo wa RP-RP-HPLC unaotumia thamani tofauti za pH katika vipimo vya utenganisho wa kwanza na wa pili.J.Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.Sifa za uhamishaji wa wingi na utendakazi wa kinetic wa safu wima za kromatografia za utendakazi wa hali ya juu zilizopakiwa na C18 ndogo ya 2 μm kikamilifu na kwa juu juu zilichunguzwa.J.Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Mitindo ya hivi majuzi na changamoto za uchanganuzi katika kutengwa, utambuzi na uthibitishaji wa peptidi amilifu ya mimea.anus.mkundu wa kibiolojia.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-02-18-08-08).
Mueller, JB et al.Mandhari ya proteomic ya ufalme wa maisha.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al.Uchakataji wa chini wa peptidi za matibabu kwa kromatografia ya kioevu iliyotayarishwa.Molekuli (Basel, Uswizi) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia ya hali-mseto na matumizi yake kwa biopolima.J.Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands kwa kromatografia ya protini ya hali-mchanganyiko: kanuni, sifa, na muundo.J.Bayoteknolojia.144(1), 3-11 (2009).