Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza kwamba utumie kivinjari kilichosasishwa (au zima hali ya uoanifu katika Internet Explorer).Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Chembe chembe chembe chembe za silika zilitayarishwa kwa njia ya sol-gel na baadhi ya marekebisho ili kupata chembe za macroporous. Chembe hizi zilitolewa kwa upolimishaji wa uhamishaji wa mgawanyiko wa ziada wa kugawanyika (RAFT) na N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) na styrene ili kuandaa N-phenylmaleide ya polybore ya MP (MPI) ya polymer ya N-phenylmaleide ya polyboric. safu wima za chuma cha pua (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) zilipakiwa kwa upakiaji wa tope. Utenganisho wa safu wima ya PMP uliotathminiwa wa mchanganyiko wa peptidi unaojumuisha peptidi tano (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Gly-Ser-Arg-Argtryp) utendakazi usagaji wa albin ya seramu ya binadamu (HAS).Chini ya hali bora zaidi za kufichua, idadi ya sahani ya kinadharia ya mchanganyiko wa peptidi ni ya juu hadi sahani 280,000/m².Ikilinganisha utendaji wa utengano wa safu wima iliyotengenezwa na safu ya kibiashara ya Ascentis Express RP-Amide, ilibainika kuwa utendakazi wa utengano wa safu wima ya PMP ulikuwa wa ubora wa juu na mwonekano wa ubora wa safu wima ya utengano wa PMP.
Katika miaka ya hivi majuzi, tasnia ya dawa ya kibayolojia imekuwa soko linalopanuka la kimataifa na ongezeko kubwa la hisa ya soko. Pamoja na ukuaji wa mlipuko wa tasnia ya dawa ya kibayolojia1,2,3, uchambuzi wa peptidi na protini unahitajika sana. Mbali na peptidi inayolengwa, uchafu kadhaa hutolewa wakati wa usanisi wa peptidi, na hivyo kuhitaji uchanganuzi wa utakaso na utakaso. uainishaji wa protini katika vimiminika vya mwili, tishu na seli ni kazi yenye changamoto kubwa kutokana na idadi kubwa ya spishi zinazoweza kutambulika katika sampuli moja. Ingawa uchunguzi wa wingi ni zana bora ya mpangilio wa peptidi na protini, ikiwa sampuli kama hizo zitadungwa kwenye kipima sauti kwa njia moja, utengano hautakuwa bora. kupunguza idadi ya wachambuzi wanaoingia kwenye spectrometer ya wingi kwa wakati fulani4,5,6.Aidha, wakati wa kutenganishwa kwa awamu ya kioevu, wachambuzi wanaweza kuzingatia katika mikoa nyembamba, na hivyo kuzingatia wachambuzi hawa na kuboresha unyeti wa kugundua MS.Kromatografia ya kioevu (LC) imeendelea kwa kiasi kikubwa zaidi ya miaka kumi iliyopita na imekuwa mbinu maarufu katika uchambuzi wa proteomic,8,10,17.
Kromatografia ya kioevu ya awamu ya reversed (RP-LC) hutumika sana kusafisha na kutenganisha michanganyiko ya peptidi kwa kutumia silika iliyobadilishwa octadecyl (ODS) kama awamu11,12,13.Hata hivyo, awamu za RP zisizosimama hazitoi utengano wa kuridhisha wa peptidi na protini kutokana na,14 muundo wao maalum ulioundwa hapo awali na amfifi. awamu za kusimama zinahitajika ili kuchambua peptidi na protini zilizo na sehemu za polar na zisizo za polar ili kuingiliana na na kuhifadhi uchambuzi huu16. Kromatografia ya hali ya mchanganyiko, ambayo hutoa mwingiliano wa multimodal, inaweza kuwa mbadala ya RP-LC kwa mgawanyiko wa peptidi, protini, na michanganyiko mingine changamano.Safu kadhaa za mchanganyiko zimetayarishwa kwa awamu, na awamu hizi zimepakiwa kwa hali ya stationary, na awamu hizi zimeunganishwa kwa hali ya stationary. mgawanyiko wa peptidi na protini17,18,19,20,21.Awamu za kusimama za hali-mchanganyiko (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, mwingiliano wa polar/RPLC) zinafaa kwa mtengano wa peptidi na protini kwa sababu ya uwepo wa vikundi vya polar na visivyo vya polar22,23,24,25,26,26,26,26. Vikundi vya polar vilivyounganishwa kwa ushirikiano huonyesha nguvu nzuri ya utengano na uteuzi wa kipekee kwa uchanganuzi wa polar na zisizo za polar, kwani utengano unategemea mwingiliano kati ya awamu ya uchanganuzi na ya stationary. Mwingiliano wa aina nyingi 29, 30, 31, 32.Hivi karibuni, Zhang et al. 30 ilitayarisha awamu ya kusimama ya polyamine iliyositishwa kwa dodecyl na kutenganisha kwa ufanisi hidrokaboni, dawamfadhaiko, flavonoidi, nyukleosidi, estrojeni, na uchanganuzi zingine kadhaa. Kiingiliano cha polar kina vikundi vya polar na visivyo vya polar, kwa hivyo inaweza kutumika kutenganisha peptidi na protini ambazo zina hydrophobic na hydrophilic moiembe. safu wima za C18 zilizopachikwa amide) zinapatikana kibiashara chini ya jina la biashara safu wima za Ascentis Express RP-Amide, lakini safu wima hizi hutumiwa kwa uchanganuzi wa amini 33 pekee.
Katika utafiti wa sasa, awamu ya stationary iliyopachikwa polar (N-phenylmaleimide-embedded polystyrene) ilitayarishwa na kutathminiwa kwa ajili ya kutenganisha peptidi na trypsin digests ya HSA. Awamu ya stationary ilitayarishwa kwa kutumia mkakati ufuatao.Chembe za silika za porous zilitayarishwa kulingana na utaratibu uliotolewa katika uchapishaji wetu uliopita na baadhi ya marekebisho. TMOS, asidi ya asetiki ya maji ilirekebishwa ili kuandaa chembe za silika zilizo na ukubwa mkubwa wa pore.Pili, ligand mpya, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, iliundwa na kutumika kutengeneza chembe za silika ili kuandaa polar iliyopachikwa awamu ya stationary. Awamu ya stationary iliyosababishwa ilipakiwa kwenye safu wima ya 100 mm ya chuma cha pua 100 mm id. mpango.Ufungaji wa safu husaidiwa na vibration ya mitambo ili kuhakikisha kitanda cha homogeneous kinaundwa ndani ya safu.Tathmini mgawanyiko wa safu iliyojaa ya mchanganyiko wa peptidi unaojumuisha peptidi tano; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) na mmeng'enyo wa Trypsin wa albin ya serum ya binadamu (HAS).Mchanganyiko wa peptidi na mmeng'enyo wa trypsin wa HSA ulizingatiwa kutenganishwa na azimio bora na ufanisi wa safu wima ya AMP ililinganishwa na P ya safu wima ya AMP ililinganishwa. Safu ya RP-Amide. Peptidi na protini zote mbili zilionekana kuwa zimetatuliwa vyema na ufanisi kwenye safu ya PMP, ambayo ilikuwa na ufanisi zaidi kuliko safu ya Ascentis Express RP-Amide.
Kigingi (Polyethilini Glycol), Urea, Asidi ya Acetic, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Trypsin, Human Serum Albumin (HSA), Ammonium Chloride, Urea, Hexane Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Chloride,xydroksidi, MCTEM, Benzoldidroksidi, Benzoldidroksidi, MCTEM. (BPO), HPLC Grade Acetonitrile (ACN), Methanol, 2-Propanol, na Acetone Imenunuliwa kutoka Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Mchanganyiko wa urea (8 g), polyethilini glikoli (8 g), na mililita 8 ya asidi asetiki 0.01 N ilichochewa kwa dakika 10, na kisha mililita 24 za TMOS iliongezwa hapo chini ya hali ya baridi ya barafu. Mchanganyiko wa majibu ulipashwa joto kwa 40°C kwa saa 6 na kisha kwa 120°C na kumwaga chuma cha pua kwa saa 8. nyenzo za mabaki zilikaushwa saa 70 ° C kwa saa 12. Masi ya laini kavu ilikuwa chini ya laini katika tanuri na calcined saa 550 ° C kwa saa 12. Makundi matatu yalitayarishwa na sifa ya kuchunguza kuzaliana kwa ukubwa wa chembe, ukubwa wa pore na eneo la uso.
Kwa marekebisho ya uso wa chembe za silika na ligand ya awali ya phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) ikifuatiwa na upolimishaji wa radial na styrene, kiwanja kilicho na kikundi cha polar kilitayarishwa. Awamu ya stationary kwa aggregates na minyororo polystyrene.Mchakato wa maandalizi ni ilivyoelezwa hapa chini.
N-phenylmaleimide (200 mg) na methyl vinyl isocyanate (100 mg) ziliyeyushwa katika toluini kavu, na mililita 0.1 ya 2,2′-azoisobutyronitrile ( AIBN) iliongezwa kwenye chupa ya majibu ili kuandaa phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate copolymer saa 3 C ° mchanganyiko kwa saa 6, C °. kuchujwa na kukaushwa katika tanuri saa 40 ° C kwa masaa 3.
Chembe za silika zilizokaushwa (2 g) zilitawanywa katika toluini kavu (100 ml), zikisagwa na kutengenezwa kwenye chupa ya chini ya mililita 500 kwa dakika 10.PMCP (10 mg) iliyeyushwa katika toluini na kuongezwa kwa njia ya kushuka kwenye chupa ya majibu kupitia funnel ya kudondosha. Mchanganyiko huo ulirudishwa kwa joto la 100 ° C na kukaushwa kwa joto la 100 ° C na kukaushwa. 60°C kwa saa 3. Kisha, chembe za silica zilizounganishwa na PMCP (100 g) ziliyeyushwa katika toluini (200 ml) na 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) iliongezwa mbele ya 100 µL ya dibutyltin dilaurate kama kichocheo. Mchanganyiko huo ulichujwa kwa 50 ° C na kukaushwa kwa 50 ° C kwa saa 80 ° C. masaa.
Styrene (1 mL), peroxide ya benzoyl BPO (0.5 mL), na chembe za silika zilizoambatishwa za TEMPO-PMCP (1.5 g) zilitawanywa katika toluini na kusafishwa kwa nitrojeni. Upolimishaji wa styrene ulifanyika kwa 100 ° C kwa saa 12. Bidhaa iliyosababishwa ilioshwa na methanoli ya 60 ° C kwa ujumla na kukaushwa kwa usiku. 1.
Sampuli ziliondolewa gesi kwa 393 K kwa saa 1 ili kupata shinikizo la mabaki la chini ya 10-3 Torr. Kiasi cha N2 kilichotangazwa kwa shinikizo la jamaa la P/P0 = 0.99 kilitumiwa kuamua jumla ya kiasi cha pore. Mofolojia ya chembe za silica tupu na ligand-Bonded ilichunguzwa kwa microscopy elektroni ya Tokyo, Tokyo skanning. Japani) .Sampuli zilizokaushwa (silika tupu na chembe za silika zilizounganishwa na ligand) ziliwekwa kwenye safu ya alumini kwa kutumia mkanda wa kaboni wa wambiso.Dhahabu iliwekwa kwenye sampuli kwa kutumia mipako ya sputter ya Q150T, na safu ya 5 nm Au iliwekwa kwenye sampuli.Hii inaboresha ufanisi wa mchakato kwa kutumia voltages ya chini na hutoa nafaka laini ya USA, USAR Putter, USA. Kichanganuzi cha msingi cha Flash EA1112 kilitumika kwa uchanganuzi wa kimsingi. Malvern (Worcestershire, UK) Kichanganuzi cha ukubwa wa chembe 2000 kilitumiwa kupata usambazaji wa saizi ya chembe. Chembe za silika zilizo uchi na chembe za silika zilizounganishwa na ligand (5 mg kila moja) zilitawanywa katika mililita 5 ya isopropanoli, iliyowekwa kwenye minyoo, sonicated na 5 kwa optical, sonicated. benchi ya Mastersizer.Uchambuzi wa Thermogravimetric ulifanywa kwa kiwango cha 5 °C kwa dakika juu ya kiwango cha joto cha 30 hadi 800 °C.
Safu wima zenye vipimo vyembamba za chuma cha pua zenye mstari wa glasi (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) zilipakiwa kwa kutumia mbinu ya upakiaji wa tope, kwa kutumia utaratibu ule ule uliotumika katika Kumb. 31. Safu ya chuma cha pua (iliyo na kioo, kitambulisho cha milimita 100 × 1.8) chenye kifaa cha kutoshea chenye frit ya 1 µm iliunganishwa kwenye kifungashio cha tope (Alltech Deerfield, IL, USA). Tayarisha tope la awamu iliyosimama kwa kusimamisha miligramu 150 za awamu ya tuli ya mL na tuma safu wima ya menotha kwenye menotha 1. ilitumika kama kutengenezea tope na vile vile kutengenezea. Jaza safu mfuatano kwa kutumia shinikizo la Mbunge 100 kwa dakika 10, Mbunge 80 kwa dakika 15, na Mbunge 60 kwa dakika 30. Wakati wa kufunga, mtetemo wa mitambo uliwekwa kwa vitetemeshi viwili vya safu ya GC (Alltech, Deerfield) ili kufunga safu ya IL, Deerfield, USA. na utoe shinikizo polepole ili kuzuia uharibifu wowote ndani ya safu. Tenganisha safu kutoka kwa kitengo cha upakiaji cha tope na uunganishe kifaa kingine cha kuingiza na kwenye mfumo wa LC ili kuangalia utendakazi wake.
Pampu ya LC (10AD Shimadzu, Japani), injector (Valco (Marekani) C14 W.05) yenye kitanzi cha sindano ya 50nL, degasser ya membrane (Shimadzu DGU-14A), dirisha la kapilari la UV-VIS liliundwa Kigunduzi maalum cha kifaa cha µLC (UV-2075) na athari ya kuunganisha mikroli fupi yenye laini ya glasi kwa laini fupi ya mikrofoni na laini ndogo ya glasi. upanuzi wa mkanda wa safu wima ya ziada. Baada ya ufungaji, kapilari (50 μm kitambulisho 365 na kupunguza kapilari za muungano (50 μm) zilisakinishwa kwenye sehemu ya 1/16″ ya muungano wa kupunguza. Ukusanyaji wa data na uchakataji wa kromatografia ulifanyika kwa kutumia programu ya Multichro 2000. Ufuatiliaji ulichunguzwa kwa kutumia data ya Chromatografia ya 25 ya Chromatografia. kuchambuliwa na OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumini kutoka kwa seramu ya binadamu, poda lyophilized, ≥ 96% (electrophoresis ya gel ya agarose) 3 mg iliyochanganywa na trypsin (1.5 mg), urea 4.0 M (1 mL), na 0.2 M ammonium bicarbonate (1 mL). Suluhisho lilichochewa kwa dakika 10 na kuwekwa katika umwagaji wa maji kwa saa 60 ° C na 67 ° C katika umwagaji wa maji. 0.1% TFA.Chuja suluhisho na uhifadhi chini ya 4 °C.
Mtengano wa michanganyiko ya peptidi na michanganyiko ya trypsin ya HSA ilitathminiwa kando kwenye safu wima za PMP. Angalia utenganisho wa mchanganyiko wa peptidi na trypsin digest ya HSA kwa safu wima ya PMP na ulinganishe matokeo na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide. Nambari ya sahani ya kinadharia imekokotolewa kama ifuatavyo:
Picha za SEM za chembe tupu za silika na chembe za silika zilizounganishwa na ligand zinaonyeshwa kwenye FIG. 2 .Picha za SEM za chembe tupu za silika (A, B) zinaonyesha kuwa, tofauti na tafiti zetu zilizopita, chembe hizi ni duara ambamo chembe hizo zimerefushwa au zina ulinganifu usio wa kawaida. Uso wa chembe za silika zilizounganishwa na ligand (C, D) ni laini zaidi kuliko ule wa silika tupu kwenye uso wa polirene, ambayo inaweza kuwa juu ya uso wa polirene. chembe za silika.
Inachanganua picha za hadubini ya elektroni za chembe tupu za silika (A, B) na chembe za silika zilizounganishwa na ligand (C, D).
Usambazaji wa ukubwa wa chembe za silika tupu na chembe za silika zilizounganishwa na ligand huonyeshwa kwenye Mchoro 3 (A). Mikondo ya usambazaji wa ukubwa wa chembe kulingana na kiasi ilionyesha kuwa saizi ya chembe za silika iliongezeka baada ya urekebishaji wa kemikali (Kielelezo 3A). Data ya usambazaji wa ukubwa wa chembe za silika kutoka kwa utafiti wa sasa na utafiti wa awali wa chembe1 (katika ukubwa wa jedwali). d(0.5), ya PMP ni 3.36 μm, ikilinganishwa na utafiti wetu wa awali wenye thamani ya tangazo (0.5) ya 3.05 μm (chembe za silika zilizofungwa na polystyrene) 34. Kundi hili lilikuwa na usambazaji wa ukubwa wa chembe ndogo ikilinganishwa na utafiti wetu wa awali kutokana na uwiano tofauti wa PEG, urea, TMOS katika chembe ya mchanganyiko wa asidi ya awamu ya PMOS na mmenyuko mkubwa wa awamu. ile ya awamu ya chembe ya silika iliyounganishwa na polystyrene tuliyosoma hapo awali.Hii ina maana kwamba utendakazi wa uso wa chembe za silika na styrene uliweka tu safu ya polystyrene (0.97 µm) kwenye uso wa silika, ambapo katika awamu ya PMP unene wa safu ulikuwa 1.38 µm.
Usambazaji wa ukubwa wa chembe (A) na usambazaji wa saizi ya pore (B) ya chembe tupu za silika na chembe za silika zilizofungamana na ligand.
Ukubwa wa pore, ujazo wa pore na eneo la uso wa chembe za silika za utafiti wa sasa zimetolewa katika Jedwali 1(B). Profaili za PSD za chembe tupu za silika na chembe za silika zilizounganishwa na ligand zimeonyeshwa kwenye Mchoro 3(B).Matokeo yanalinganishwa na utafiti wetu wa awali.Ukubwa wa pore wa tupu na ligand na silika ni 23, 10 na 23 kwa heshima. inaonyesha kwamba ukubwa wa pore hupungua kwa 69 baada ya urekebishaji wa kemikali, kama inavyoonyeshwa katika Jedwali 1 (B), na mabadiliko ya curve yanaonyeshwa kwenye Mchoro 3 (B) . Vile vile, kiasi cha pore cha chembe za silika kilipungua kutoka 0.67 hadi 0.58 cm3 / g baada ya marekebisho ya kemikali. utafiti wetu wa awali (124 m2/g) .Kama inavyoonyeshwa katika Jedwali 1 (B), eneo la uso (m2/g) la chembe za silika pia lilipungua kutoka 116 m2/g hadi 105 m2/g baada ya marekebisho ya kemikali.
Matokeo ya uchambuzi wa msingi wa awamu ya stationary yanaonyeshwa katika Jedwali 2. Upakiaji wa kaboni wa awamu ya sasa ya stationary ni 6.35%, ambayo ni ya chini kuliko upakiaji wa kaboni ya utafiti wetu uliopita (chembe za silika zilizounganishwa na polystyrene, 7.93% 35 na 10.21%, kwa mtiririko huo) 42. Upakiaji wa kaboni wa awamu ya chini, ya sasa ya SPrene kwa sababu ya sasa ya stationary, ya sasa ya SPrene. baadhi ya ligandi za polar kama vile phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) na 4-hydroxy-TEMPO zilitumika.Asilimia ya uzito wa nitrojeni ya awamu ya sasa ya tuli ni 2.21%, ikilinganishwa na 0.1735 na 0.85% kwa uzito wa nitrojeni katika masomo ya awali, kwa mtiririko huo.Hii inamaanisha kuwa awamu ya nitrojeni iko juu kutokana na awamu ya kituo phenylmaleimide.Vile vile, upakiaji wa kaboni wa bidhaa (4) na (5) ulikuwa 2.7% na 2.9%, mtawalia, wakati upakiaji wa kaboni ya bidhaa ya mwisho (6) ulikuwa 6.35%, kama inavyoonyeshwa katika Jedwali 2. Kupunguza uzito kuliangaliwa na awamu ya PMP, na Curve ya TGA inavyoonyeshwa katika Mchoro wa 4 wa TGA, ambayo inaonyesha kupoteza uzito wa 6.8. inakubaliana vyema na upakiaji wa kaboni (6.35%) kwa sababu ligandi zina si C tu bali pia N, O, na H.
Ligand ya phenylmaleimide-methylvinylisocyanate ilichaguliwa kwa ajili ya kurekebisha uso wa chembe za silika kwa sababu ina makundi ya phenylmaleimide ya polar na vikundi vya vinylisocyanate.Vikundi vya isosianati vya vinyl vinaweza kuguswa zaidi na styrene kwa kuishi upolimishaji wa radical.Sababu ya pili ni kuingiza kikundi ambacho kina mwingiliano wa wastani na kituo cha uchambuzi na hakuna mwingiliano wa umeme wa awamu ya analyte. Sehemu ya phenylmaleimide haina malipo ya mtandaoni katika pH ya kawaida. Polarity ya awamu ya kusimama inaweza kudhibitiwa kwa kiasi bora cha styrene na wakati wa majibu ya upolimishaji wa radical huru. Hatua ya mwisho ya mmenyuko (upolimishaji wa bure-radical) ni muhimu na inaweza kubadilisha polarity ya awamu ya stationary. Uchambuzi wa kimsingi ulifanyika ili kuangalia kiwango cha upakiaji wa awamu ya kaboni iliyoongezeka ya awamu hii ilizingatiwa. upakiaji wa kaboni ya awamu ya stationary na kinyume chake.SPs zilizoandaliwa na viwango tofauti vya styrene zina upakiaji tofauti wa kaboni.Tena, pakia awamu hizi za stationary kwenye nguzo za chuma cha pua na uangalie utendaji wao wa chromatographic (selectivity, azimio, thamani ya N, nk) .Kulingana na majaribio haya, uundaji ulioboreshwa ulichaguliwa ili kuandaa awamu ya udhibiti wa stationary ya PMP na kuhakikisha urejeshaji mzuri wa udhibiti wa PMP.
Mchanganyiko wa peptidi tano (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) pia zilitathminiwa kwa kutumia safu ya PMP kwa kutumia awamu ya simu; 60/40 (v/v) asetonitrili/maji (0.1% TFA) kwa kiwango cha mtiririko cha 80 μL/min. Chini ya hali bora zaidi za kufichua, nambari ya bati ya kinadharia (N) kwa kila safu (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) ni 20,000 ± 100 (sahani 200/m² inatoa 200,000). Safu wima za PMP na kromatogramu zimeonyeshwa kwenye Mchoro 5A. Uchanganuzi wa haraka kwenye safu wima ya PMP kwa kiwango cha juu cha mtiririko (700 μL/min), peptidi tano zilitolewa ndani ya dakika moja, thamani za N zilikuwa nzuri sana, 13,500 ± 330 kwa safu (100 × 1.8 mm kitambulisho), 0 Sambamba na 0, 0 Sambamba na 0 (0, 0, 0, 0, 0, 0, 0. 5B).Safu wima tatu zenye ukubwa sawa (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) zilipakiwa na kura tatu tofauti za awamu ya kusimama ya PMP ili kuangalia uwezekano wa kuzaliana.Mkusanyiko wa uchanganuzi kwa kila safu ulirekodiwa kwa kutumia hali bora zaidi za kufafanua na idadi ya bati za kinadharia N na muda wa kubaki ili kutenganisha mchanganyiko sawa wa majaribio katika safu wima ya P4 iliyoonyeshwa. uzalishwaji upya wa safu wima ya PMP unahusiana vyema na thamani za chini sana za %RSD, kama inavyoonyeshwa katika Jedwali la 3.
Mgawanyiko wa mchanganyiko wa peptidi kwenye safu ya PMP (B) na safu ya Ascentis Express RP-Amide (A); awamu ya simu 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), vipimo vya safu ya PMP (kitambulisho cha 100 × 1.8 mm); uchambuzi Utaratibu wa elution wa misombo: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) na 5 (leucine) asidi enkephalin)).
Safu wima ya PMP (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) ilitathminiwa kwa kutenganishwa kwa miyeyusho ya tryptic ya albin ya serum ya binadamu katika kromatografia ya kioevu ya utendaji wa juu. Kromatogramu katika Mchoro 6 inaonyesha kuwa sampuli imetenganishwa vyema na mwonekano ni mzuri sana. Michanganyiko ya HSA ilichanganuliwa kwa kutumia kiwango cha mtiririko cha 100 µ, L/3/3 ya simu ya mkononi. asetonitrile/maji na 0.1% TFA.Kama inavyoonyeshwa kwenye kromatogramu (Mchoro 6), usagaji chakula wa HSA umegawanyika katika vilele 17 vinavyolingana na peptidi 17. Ufanisi wa utenganisho wa kila kilele katika usagaji wa HSA ulikokotolewa na maadili yametolewa katika Jedwali la 5.
Muhtasari wa tryptic wa HSA (id 100 × 1.8 mm) ulitenganishwa kwenye safu wima ya PMP; kasi ya mtiririko (100 µL/min), awamu ya simu 60/40 asetonitrile/maji yenye 0.1% TFA.
ambapo L ni urefu wa safu, η ni mnato wa awamu ya simu, ΔP ni shinikizo la nyuma la safu, na u ni kasi ya mstari wa awamu ya simu. Upenyezaji wa safu wima ya PMP ulikuwa 2.5 × 10-14 m2, kiwango cha mtiririko kilikuwa 25 μL/min, na 60/40 v/v. 0/v ACN kwa kila safu ya maji ilitumika × MP0 kwa kila safu ya maji 1.8 mm id) ilikuwa sawa na ile ya utafiti wetu wa awali Ref.34. Upenyezaji wa safu iliyojaa chembe za vinyweleo vya juu juu ni: 1.7 × 10-15 kwa chembe 1.3 μm, 3.1 × 10-15 kwa 1.7 μm chembe, 5.0-1 × 2 × 2 × 5.2 × 1. 2.6 μm chembe Kwa chembe 5 μm 43. Kwa hiyo, upenyezaji wa awamu ya PMP ni sawa na ile ya 5 μm chembe za msingi-shell.
ambapo Wx ni uzito wa safu iliyopakiwa na klorofomu, Wy ni uzito wa safu iliyojaa methanoli, na ρ ni msongamano wa kiyeyusho.Msongamano wa methanoli (ρ = 0.7866) na klorofomu (ρ = 1.484).Ubora wa jumla wa SILICA PARTICLES 108 × 108 mm i. na nguzo za C18-Urea 31 ambazo tulisoma hapo awali zilikuwa 0.63 na 0.55, kwa mtiririko huo.Hii ina maana kwamba kuwepo kwa ligand za urea hupunguza upenyezaji wa awamu ya stationary.Kwa upande mwingine, jumla ya porosity ya safu ya PMP (100 × 1.8 mm id) ni 0.60 ya chini ya upenyezaji wa safu ya MP. Chembe chembe za silika zilizounganishwa kwa C18 kwa sababu katika awamu zisizosimama za aina ya C18, ligandi za C18 huunganishwa kwenye chembe za silika kama minyororo ya mstari, huku katika awamu za tuli za aina ya polystyrene, safu ya polima ya A nene kiasi huundwa kuizunguka. Katika jaribio la kawaida, uthabiti wa safu wima huhesabiwa kama:
Kielelezo 7A,B kinaonyesha safu wima ya PMP (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) kwa kutumia hali sawa za uboreshaji (yaani, 60/40 ACN/H2O na 0.1% TFA). ) ya njama ya van Deemter. Michanganyiko ya peptidi iliyochaguliwa (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ilitayarishwa katika 20 µL/ Kiwango cha chini cha mtiririko kwa safu zote mbili ni 800 µL/min. Kiwango cha chini cha mtiririko wa HETP kwa L/min µ thamani za MP8 kwa L/min safu wima na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide zilikuwa 2.6 µm na 3.9 µm, mtawalia. Thamani za HETP zinaonyesha kuwa ufanisi wa utenganisho wa safu wima ya PMP (kitambulisho cha mm 100 × 1.8) ni bora zaidi kuliko safu wima ya Ascentis Express RP-Amide inayopatikana kibiashara (100 × id em 1.8 mm). kwamba kupungua kwa thamani ya N na mtiririko unaoongezeka sio muhimu ikilinganishwa na utafiti wetu wa awali.Ufanisi wa juu wa utengano wa safu ya PMP (id ya 100 × 1.8 mm) ikilinganishwa na safu ya Ascentis Express RP-Amide inategemea uboreshaji wa umbo la chembe, ukubwa, na taratibu za upakiaji wa safu tata zinazotumiwa katika kazi ya sasa34.
(A) van Deemter plot (HETP dhidi ya kasi ya mstari wa awamu ya simu) iliyopatikana kwa kutumia safu wima ya PMP (100 × 1.8 mm kitambulisho) katika 60/40 ACN/H2O yenye 0.1% TFA.(B) van Deemter plot (HETP dhidi ya kasi ya mstari wa awamu ya simu) iliyopatikana kwa kutumia safu wima ya Ascentis 1.RP-Ascentis Express 60/40 ACN/H2O yenye TFA 0.1%.
Awamu ya kusimama ya polystyrene iliyopachikwa katika ncha ya polar ilitayarishwa na kutathminiwa kwa ajili ya kutenganisha michanganyiko ya peptidi sanisi na miyeyusho ya trypsin ya albin ya seramu ya binadamu (HAS) katika utendaji wa juu wa kromatografia ya kioevu. Utendaji wa kromatografia wa safu wima za PMP kwa mchanganyiko wa peptidi ni bora katika ufanisi wa utengano na azimio. ukubwa wa chembe za silika, usanisi unaodhibitiwa wa awamu ya kusimama, na ufungashaji wa safu tata.Mbali na ufanisi mkubwa wa kujitenga, shinikizo la chini la safu ya nyuma katika viwango vya juu vya mtiririko ni faida nyingine ya awamu hii ya stationary. Nguzo za PMP zinaonyesha uzazi mzuri na zinaweza kutumika kwa ajili ya uchambuzi wa mchanganyiko wa peptidi na trypsin digestion ya protini mbalimbali. dondoo za kuvu katika kromatografia ya kioevu.Katika siku zijazo, safu wima za PMP pia zitatathminiwa kwa mgawanyo wa protini na kingamwili za monokloni.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Utafiti kuhusu Mifumo ya Kutenganisha Peptidi kwa Awamu Iliyobadilishwa Kromatografia Sehemu ya I: Ukuzaji wa Itifaki ya Uainishaji wa Safu wima.J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Peptidi amilifu zilizoboreshwa zilizoundwa kwa ajili ya matibabu ya magonjwa ya kuambukiza.Bioteknolojia.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptidi za matibabu ya syntetisk: sayansi na ugunduzi wa soko.dawa.15 (1-2) leo, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.10.0).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kioo cha hali ya juu cha kromatografia-mass spectrometry huwezesha ujumuishaji wa kimetaboliki na proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019) inayolengwa kwa mapana.
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Jukumu la UHPLC katika ukuzaji wa dawa za kulevya.J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Vipengele vya kimsingi na vya vitendo vya kromatografia ya kioevu ya shinikizo la juu kwa utengano wa haraka.J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitchef, P. Utumiaji wa kromatografia ya utendakazi wa hali ya juu ya kioevu katika ukuzaji wa dawa.J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Monolithic macroporous hydrogels iliyotayarishwa kutoka kwa emulsion ya awamu ya juu ya ndani ya mafuta ya ndani ya maji kwa ajili ya utakaso mzuri wa enteroviruses.Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Jukumu la kromatografia ya kioevu katika proteomics.J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Mitindo inayoibuka katika utenganisho wa kromatografia ya kioevu ya awamu iliyogeuzwa ya peptidi za matibabu na protini: nadharia na matumizi.J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Mgawanyo wa pande mbili wa peptidi kwa kutumia mfumo wa RP-RP-HPLC unaotumia thamani tofauti za pH katika vipimo vya utenganisho wa kwanza na wa pili.J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.Sifa za uhamishaji wa wingi na utendakazi wa kinetic wa safu wima za kromatografia za utendakazi wa hali ya juu zilizopakiwa na C18 ndogo ya 2 μm kikamilifu na kwa juu juu zilichunguzwa.J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Mitindo ya hivi majuzi na changamoto za uchanganuzi katika kutengwa, utambuzi na uthibitishaji wa peptidi amilifu ya mimea.anus.mkundu wa kibiolojia.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-02-18-08-08).
Mueller, JB et al.Mandhari ya proteomic ya ufalme wa maisha.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al.Uchakataji wa chini wa peptidi za matibabu kwa kromatografia ya kioevu iliyotayarishwa.Molekuli (Basel, Uswizi) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia ya hali-mseto na matumizi yake kwa biopolima.J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands kwa kromatografia ya protini ya hali-mchanganyiko: kanuni, sifa, na muundo.J. Bayoteknolojia.144(1), 3-11 (2009).