Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutatoa tovuti bila mitindo na JavaScript.
Kuna haja ya mfumo wa kuaminika wa in vitro ambao unaweza kuzalisha kwa usahihi mazingira ya kisaikolojia ya moyo kwa ajili ya kupima madawa ya kulevya.Upatikanaji mdogo wa mifumo ya utamaduni wa tishu za moyo wa binadamu umesababisha tafsiri zisizo sahihi za athari za dawa za moyo.Hapa, tumeunda kielelezo cha utamaduni wa tishu za moyo (CTCM) ambacho kieletroniki huchochea vipande vya moyo na kunyoosha kifiziolojia wakati wa awamu za sistoli na diastoli za mzunguko wa moyo.Baada ya siku 12 za tamaduni, mbinu hii iliboresha kwa sehemu uwezekano wa sehemu za moyo, lakini haikuhifadhi kikamilifu uadilifu wao wa kimuundo.Kwa hiyo, baada ya uchunguzi wa molekuli ndogo, tuligundua kuwa nyongeza ya 100 nM triiodothyronine (T3) na 1 μM dexamethasone (Dex) kwa kati yetu ilidumisha microstructure ya sehemu kwa siku 12.Pamoja na matibabu ya T3/Dex, mfumo wa CTCM ulidumisha wasifu wa maandishi, uwezekano, shughuli za kimetaboliki, na uadilifu wa muundo katika kiwango sawa na tishu mpya za moyo kwa siku 12.Kwa kuongezea, kunyoosha kupita kiasi kwa tishu za moyo katika tamaduni kunasababisha ishara ya moyo ya haipatrofiki, ikitoa ushahidi kwa uwezo wa CTCM kuiga hali ya haipatrofiki inayosababishwa na kunyoosha moyo.Kwa kumalizia, CTCM inaweza kuiga fiziolojia na pathofiziolojia ya moyo katika utamaduni kwa muda mrefu, kuwezesha uchunguzi wa kuaminika wa dawa.
Kabla ya utafiti wa kliniki, mifumo ya kuaminika ya vitro inahitajika ambayo inaweza kuzaliana kwa usahihi mazingira ya kisaikolojia ya moyo wa mwanadamu.Mifumo kama hiyo inapaswa kuiga kunyoosha kwa mitambo iliyobadilishwa, mapigo ya moyo, na sifa za kielekrofiziolojia.Miundo ya wanyama hutumiwa kwa kawaida kama jukwaa la uchunguzi wa fiziolojia ya moyo na kuegemea kidogo katika kuonyesha athari za dawa katika moyo wa mwanadamu1,2.Hatimaye, Mfano Bora wa Majaribio wa Utamaduni wa Tishu ya Moyo wa Moyo (CTCM) ni kielelezo ambacho ni nyeti sana na mahususi kwa afua mbalimbali za kimatibabu na kifamasia, na kuzaliana kwa usahihi fiziolojia na pathofiziolojia ya moyo wa mwanadamu3.Kutokuwepo kwa mfumo kama huo kunapunguza ugunduzi wa matibabu mapya ya kushindwa kwa moyo4,5 na kumesababisha sumu ya moyo ya dawa kama sababu kuu ya kuondoka kwenye soko6.
Katika muongo uliopita, dawa nane zisizo za moyo na mishipa zimeondolewa kwenye matumizi ya kliniki kwa sababu husababisha muda wa muda wa QT kurefushwa na kusababisha arrhythmias ya ventrikali na kifo cha ghafla7.Kwa hivyo, kuna hitaji linaloongezeka la mikakati ya kuaminika ya uchunguzi wa mapema ili kutathmini ufanisi wa moyo na mishipa na sumu.Matumizi ya hivi majuzi ya cardiomyocytes ya shina ya pluripotent inayotokana na binadamu (hiPS-CM) katika uchunguzi wa madawa ya kulevya na kupima sumu hutoa suluhu la kiasi kwa tatizo hili.Hata hivyo, hali ya ukomavu ya hiPS-CMs na ukosefu wa utata wa seli nyingi za tishu za moyo ni mapungufu makubwa ya njia hii.Uchunguzi wa hivi majuzi umeonyesha kuwa kizuizi hiki kinaweza kushindwa kwa kutumia hiPS-CM ya mapema kuunda haidrojeli za tishu za moyo muda mfupi baada ya kuanza kwa mikazo ya moja kwa moja na kuongeza hatua kwa hatua kichocheo cha umeme kwa wakati.Hata hivyo, vijidudu hivi vya hiPS-CM havina sifa za kielekrofiziolojia zilizokomaa na za mikataba ya myocardiamu ya watu wazima.Kwa kuongezea, tishu za moyo wa mwanadamu zina muundo mgumu zaidi, unaojumuisha mchanganyiko tofauti wa aina tofauti za seli, pamoja na seli za endothelial, niuroni, na nyuzi za stromal, zilizounganishwa na seti maalum za protini za nje ya seli.Utofauti huu wa idadi ya watu wasio wa cardiomyocyte11,12,13 katika moyo wa mamalia wa watu wazima ni kizuizi kikubwa cha kuunda tishu za moyo kwa kutumia aina za seli za kibinafsi.Vikwazo hivi vikuu vinasisitiza umuhimu wa kuendeleza mbinu za kukuza tishu za myocardial chini ya hali ya kisaikolojia na patholojia.
Sehemu nyembamba (300 µm) za moyo wa mwanadamu zimethibitishwa kuwa mfano mzuri wa myocardiamu ya binadamu.Njia hii hutoa ufikiaji wa mfumo kamili wa seli nyingi za 3D sawa na tishu za moyo wa mwanadamu.Walakini, hadi 2019, matumizi ya sehemu za moyo zilizokuzwa yalipunguzwa na maisha mafupi ya (saa 24).Hii ni kutokana na mambo kadhaa ikiwa ni pamoja na ukosefu wa kunyoosha kwa mitambo ya kimwili, kiolesura cha kioevu-hewa, na matumizi ya vyombo vya habari rahisi ambavyo havikidhi mahitaji ya tishu za moyo.Mnamo mwaka wa 2019, vikundi kadhaa vya utafiti vilionyesha kuwa kujumuisha sababu za kiufundi katika mifumo ya kitamaduni ya tishu za moyo kunaweza kupanua maisha ya kitamaduni, kuboresha usemi wa moyo, na kuiga ugonjwa wa moyo.Masomo mawili ya kifahari ya 17 na 18 yanaonyesha kuwa upakiaji wa mitambo ya uniaxial ina athari nzuri kwenye phenotype ya moyo wakati wa utamaduni.Hata hivyo, tafiti hizi hazikutumia upakiaji wa nguvu wa tatu-dimensional physico-mitambo ya mzunguko wa moyo, kwani sehemu za moyo zilipakiwa na nguvu za kiisometriki za mvutano 17 au upakiaji wa auxotonic wa mstari 18.Njia hizi za kunyoosha tishu zilisababisha ukandamizaji wa jeni nyingi za moyo au udhihirisho mkubwa wa jeni unaohusishwa na majibu yasiyo ya kawaida ya kunyoosha.Hasa, Pitoulis et al.19 ilitengeneza umwagaji wa utamaduni wa kipande cha moyo kwa ajili ya kujenga upya mzunguko wa moyo kwa kutumia maoni ya transducer ya nguvu na viendeshi vya mvutano.Ingawa mfumo huu unaruhusu uundaji sahihi zaidi wa mzunguko wa moyo wa ndani, ugumu na upitishaji wa chini wa njia hii huzuia utumiaji wa mfumo huu.Maabara yetu hivi majuzi imeunda mfumo wa kitamaduni uliorahisishwa kwa kutumia kichocheo cha umeme na njia iliyoboreshwa ili kudumisha uwezekano wa sehemu za nguruwe na tishu za moyo wa binadamu kwa hadi siku 620,21.
Katika muswada wa sasa, tunaelezea mfano wa utamaduni wa tishu za moyo (CTCM) kwa kutumia sehemu za moyo wa nguruwe ambazo hujumuisha ishara za ucheshi ili kurudisha fiziolojia ya moyo ya pande tatu na mgawanyiko wa patholojia wakati wa mzunguko wa moyo.CTCM hii inaweza kuongeza usahihi wa ubashiri wa kabla ya matibabu ya dawa hadi kiwango ambacho hakijawahi kufikiwa hapo awali kwa kutoa mfumo wa moyo wa gharama nafuu, wa katikati wa matokeo unaoiga fiziolojia/pathofiziolojia ya moyo wa mamalia kwa ajili ya majaribio ya dawa kabla ya matibabu.
Ishara za mitambo ya hemodynamic zina jukumu muhimu katika kudumisha kazi ya cardiomyocyte katika vitro 22,23,24.Katika muswada wa sasa, tumeunda CTCM (Mchoro 1a) ambayo inaweza kuiga mazingira ya moyo ya watu wazima kwa kuhamasisha uhamasishaji wa umeme na mitambo katika masafa ya kisaikolojia (1.2 Hz, midundo 72 kwa dakika).Ili kuepuka kunyoosha tishu nyingi wakati wa diastoli, kifaa cha uchapishaji cha 3D kilitumiwa kuongeza ukubwa wa tishu kwa 25% (Mchoro 1b).Mwendo wa umeme unaosababishwa na mfumo wa C-PACE uliratibiwa kuanza 100 ms kabla ya sistoli kwa kutumia mfumo wa kupata data ili kuzalisha kikamilifu mzunguko wa moyo.Mfumo wa uundaji wa tishu hutumia kiwezeshaji cha nyumatiki kinachoweza kupangwa (LB Engineering, Ujerumani) kupanua kwa mzunguko utando wa silikoni unaonyumbulika ili kusababisha upanuzi wa vipande vya moyo kwenye chemba ya juu.Mfumo huo uliunganishwa na mstari wa nje wa hewa kwa njia ya transducer ya shinikizo, ambayo ilifanya iwezekanavyo kurekebisha kwa usahihi shinikizo (± 1 mmHg) na wakati (± 1 ms) (Mchoro 1c).
a Ambatisha sehemu ya tishu kwenye pete ya usaidizi ya mm 7, iliyoonyeshwa kwa bluu, ndani ya chumba cha utamaduni cha kifaa.Chumba cha utamaduni kinatenganishwa na chumba cha hewa na membrane nyembamba ya silicone inayoweza kubadilika.Weka gasket kati ya kila chumba ili kuzuia uvujaji.Kifuniko cha kifaa kina electrodes ya grafiti ambayo hutoa kusisimua kwa umeme.b Uwakilishi wa kimkakati wa kifaa kikubwa cha tishu, pete ya mwongozo na pete ya kuunga mkono.Sehemu za tishu (kahawia) zimewekwa kwenye kifaa kikubwa na pete ya mwongozo iliyowekwa kwenye groove kwenye makali ya nje ya kifaa.Kutumia mwongozo, weka kwa uangalifu pete ya msaada iliyofunikwa na wambiso wa akriliki wa tishu juu ya sehemu ya tishu za moyo.c Grafu inayoonyesha muda wa msisimko wa umeme kama utendaji wa shinikizo la chumba cha hewa kinachodhibitiwa na kiwezeshaji cha nyumatiki kinachoweza kupangwa (PPD).Kifaa cha kupata data kilitumika kusawazisha kichocheo cha umeme kwa kutumia vitambuzi vya shinikizo.Wakati shinikizo katika chumba cha utamaduni hufikia kizingiti kilichowekwa, ishara ya mapigo hutumwa kwa C-PACE-EM ili kuchochea uhamasishaji wa umeme.d Picha ya CCM nne zilizowekwa kwenye rafu ya incubator.Vifaa vinne vimeunganishwa kwenye PPD moja kupitia mzunguko wa nyumatiki, na sensorer za shinikizo huingizwa kwenye valve ya hemostatic ili kufuatilia shinikizo katika mzunguko wa nyumatiki.Kila kifaa kina sehemu sita za tishu.
Kutumia actuator moja ya nyumatiki, tuliweza kudhibiti vifaa 4 vya CTCM, ambayo kila moja inaweza kushikilia sehemu 6 za tishu (Mchoro 1d).Katika CTCM, shinikizo la hewa katika chumba cha hewa hubadilishwa kuwa shinikizo la synchronous katika chumba cha maji na husababisha upanuzi wa kisaikolojia wa kipande cha moyo (Mchoro 2a na Sinema ya Nyongeza 1).Tathmini ya kunyoosha tishu kwa 80 mm Hg.Sanaa.ilionyesha kunyoosha sehemu za tishu kwa 25% (Mchoro 2b).Asilimia hii ya kunyoosha imeonyeshwa kuwa inalingana na urefu wa sarcomere ya kisaikolojia wa 2.2–2.3 µm kwa upunguzaji wa sehemu ya kawaida ya moyo17,19,25.Usogeaji wa tishu ulitathminiwa kwa kutumia mipangilio ya kamera maalum (Kielelezo cha 1 cha Nyongeza).Amplitude na kasi ya harakati ya tishu (Mchoro 2c, d) inalingana na kunyoosha wakati wa mzunguko wa moyo na wakati wa sistoli na diastoli (Mchoro 2b).Kunyoosha na kasi ya tishu za moyo wakati wa kusinyaa na kupumzika ilibaki bila kubadilika kwa siku 12 kwenye tamaduni (Mchoro 2f).Ili kutathmini athari za uhamasishaji wa umeme kwenye ubanaji wakati wa utamaduni, tulitengeneza mbinu ya kubaini ulemavu unaoendelea kwa kutumia algoriti ya utiaji kivuli (Mchoro wa Nyongeza 2a,b) na tukaweza kutofautisha kati ya ulemavu kwa kuwa na au bila msisimko wa umeme.Sehemu sawa ya moyo (Mchoro 2f).Katika eneo linaloweza kusongeshwa la kata (R6-9), voltage wakati wa msukumo wa umeme ilikuwa 20% ya juu kuliko kutokuwepo kwa msukumo wa umeme, ambayo inaonyesha mchango wa msukumo wa umeme kwa kazi ya mikataba.
Vielelezo wakilishi vya shinikizo la chumba cha hewa, shinikizo la chumba cha maji, na vipimo vya mwendo wa tishu huthibitisha kwamba shinikizo la chumba hubadilisha shinikizo la chumba cha maji, na kusababisha harakati inayolingana ya kipande cha tishu.b Vielelezo vya uwakilishi wa asilimia kunyoosha (bluu) ya sehemu za tishu zinazolingana na kunyoosha kwa asilimia (machungwa).c Mwendo uliopimwa wa kipande cha moyo unalingana na kasi iliyopimwa ya mwendo.(d) Vielelezo wakilishi vya mwendo wa mzunguko (mstari wa buluu) na kasi (mstari wa vitone vya chungwa) katika kipande cha moyo.e Uhesabuji wa muda wa mzunguko (n = vipande 19 kwa kikundi, kutoka kwa nguruwe tofauti), muda wa contraction (n = vipande 19 kwa kikundi), muda wa kupumzika (n = vipande 19 kwa kikundi, kutoka kwa nguruwe tofauti), harakati za tishu (n = 25).vipande)/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti), kasi ya kilele cha systolic (n = 24(D0), 25(D12) vipande/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti) na kiwango cha kilele cha kupumzika (n=24(D0), 25(D12) vipande/vikundi kutoka kwa nguruwe tofauti).Jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili halikuonyesha tofauti kubwa katika kigezo chochote.f Uchambuzi wa matatizo wakilishi hufuatilia sehemu za tishu zenye (nyekundu) na bila (bluu) kichocheo cha umeme, maeneo kumi ya kikanda ya sehemu za tishu kutoka sehemu moja.Paneli za chini zinaonyesha quantification ya tofauti ya asilimia katika matatizo katika sehemu za tishu na bila kusisimua umeme katika maeneo kumi kutoka sehemu tofauti. (n = vipande 8/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, Mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili hufanywa; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = vipande 8/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, Mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili hufanywa; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = sehemu 8/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, Jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). (n = 8 片/组，來自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. (n = 8 片/组，來自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = sehemu 8/kikundi, kutoka kwa nguruwe tofauti, Jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Pau za hitilafu zinawakilisha wastani wa ± mkengeuko wa kawaida.
Katika mfumo wetu wa awali tuli wa utamaduni wa vipande vya moyo wa kibiomimetiki [20, 21], tulidumisha uwezekano, utendakazi, na uadilifu wa muundo wa vipande vya moyo kwa siku 6 kwa kutumia kichocheo cha umeme na kuboresha muundo wa wastani.Walakini, baada ya siku 10, takwimu hizi zilishuka sana.Tutarejelea sehemu zilizokuzwa katika mfumo wetu wa awali tuli wa utamaduni wa kibayomimetiki 20, masharti 21 ya udhibiti (Ctrl) na tutatumia njia yetu iliyoboreshwa hapo awali kama hali na utamaduni wa MC chini ya uhamasishaji wa mitambo na umeme (CTCM).kuitwa.Kwanza, tuliamua kuwa uhamasishaji wa mitambo bila msukumo wa umeme haukutosha kudumisha uhai wa tishu kwa siku 6 (Mchoro wa Nyongeza 3a, b).Inashangaza, pamoja na kuanzishwa kwa uhamasishaji wa physio-mitambo na umeme kwa kutumia STCM, uwezekano wa sehemu za moyo wa siku 12 ulibakia sawa na katika sehemu za moyo safi chini ya hali ya MS, lakini si chini ya hali ya Ctrl, kama inavyoonyeshwa na uchambuzi wa MTT (Mchoro 1).3a).Hili linapendekeza kuwa msisimko wa kimitambo na uigaji wa mzunguko wa moyo unaweza kuweka sehemu za tishu zitumike kwa mara mbili kama ilivyoripotiwa katika mfumo wetu wa awali wa utamaduni tuli.Hata hivyo, tathmini ya uadilifu wa muundo wa sehemu za tishu kwa kuweka kinga ya troponini ya moyo T na connexin 43 ilionyesha kuwa usemi wa connexin 43 ulikuwa wa juu zaidi katika tishu za MC siku ya 12 kuliko katika udhibiti wa siku hiyo hiyo.Hata hivyo, kujieleza kwa connexin 43 na uundaji wa Z-disc haukuwekwa kikamilifu (Mchoro 3b).Tunatumia mfumo wa akili bandia (AI) kutathmini uadilifu wa muundo wa tishu26, bomba la kujifunza kwa kina linalotegemea picha kulingana na troponin-T na connexin staining43 ili kutathmini kiatomati uadilifu wa muundo na mwanga wa vipande vya moyo kulingana na nguvu ya ujanibishaji.Mbinu hii hutumia Mtandao wa Ubadilishaji wa Neural (CNN) na mfumo wa kina wa kujifunza ili kubainisha kwa uaminifu uadilifu wa muundo wa tishu za moyo kwa njia ya kiotomatiki na isiyopendelea, kama ilivyofafanuliwa katika marejeleo.26. Tishu za MC zilionyesha uboreshaji wa muundo sawa na siku 0 ikilinganishwa na sehemu za udhibiti wa tuli.Aidha, Masson ya trichrome Madoa wazi asilimia ya chini sana ya adilifu chini ya hali ya MS ikilinganishwa na hali ya udhibiti katika siku ya 12 ya utamaduni (Mtini. 3c).Ingawa CTCM iliongeza uwezekano wa sehemu za tishu za moyo katika siku ya 12 hadi kiwango sawa na ile ya tishu safi ya moyo, haikuboresha kwa kiasi kikubwa uadilifu wa muundo wa sehemu za moyo.
Grafu ya upau inaonyesha ujazo wa uwezo wa MTT wa vipande vya moyo safi (D0) au utamaduni wa vipande vya moyo kwa siku 12 ama katika utamaduni tuli (D12 Ctrl) au katika CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) vipande / kikundi <0 ikilinganishwa na 0 # ANOVA, #0 ikilinganishwa na jaribio la D#0 0 na **p <0.01 ikilinganishwa na D12 Ctrl). Grafu ya upau inaonyesha ukadiriaji wa uwezo wa MTT wa vipande vya moyo safi (D0) au utamaduni wa vipande vya moyo kwa siku 12 ama katika utamaduni tuli (D12 Ctrl) au katika CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) vipande/kikundi <0 kwa njia moja ya 0 kwa ANOVA # #0 ikilinganishwa na ##p #0 ikilinganishwa na ##p #0; D0 na **p <0.01 ikilinganishwa na D12 Ctrl).histogram inaonyesha ukadiriaji wa uwezekano wa sehemu za moyo safi za MTT (D0) au utamaduni wa sehemu za moyo kwa siku 12 katika tamaduni tuli (D12 control) au CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control). ) ), 12 (D12 MC) sehemu/kikundi cha majaribio kutoka kwa VA;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 ikilinganishwa na D0 na **p <0.01 ikilinganishwa na D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 新鲜心脏切片(D0) 則片(D0) 則片(D0) 或片(D0) 18 (D0)活力的量化)，來自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <0.0001, Ctrl 【P <0.0001 . a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 新鲜心脏切片(D0) 中 則 片(D0) 中則 則(D0)2组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p.)histogram inayoonyesha upimaji wa uwezo wa MTT katika sehemu za moyo safi (D0) au sehemu za moyo zilizokuzwa kwa muda wa siku 12 katika utamaduni tuli (D12 control) au CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control)) , 12 (D12 MC) sehemu / kikundi kutoka kwa ANOVA ya njia tofauti mtihani;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 ikilinganishwa na D0, **p <0.01 ikilinganishwa na D12 Ctrl).b Troponin-T (kijani), connexin 43 (nyekundu) na DAPI (bluu) katika sehemu mpya za moyo zilizotengwa (D0) au sehemu za moyo zilizokuzwa chini ya hali tuli (Ctrl) au hali ya CTCM (MC) kwa siku 12) ya picha wakilishi za immunofluorescence (kipimo tupu = 100 µm). Ukadiriaji wa akili Bandia wa uadilifu wa muundo wa tishu za moyo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), vipande/vipande 5 (D12 MC) kila kimoja kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja hufanywa; ####p <0.0001 ikilinganishwa na D0 na ****p <0.000                                   ya ANOVA  Ukadiriaji wa akili Bandia wa uadilifu wa muundo wa tishu za moyo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), vipande/vikundi 5 (D12 MC) kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja hufanywa; ####p <0.0001 ikilinganishwa na D0 na ****p <0.000                                     ya ANOVA  Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) презов/ ся однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Ukadiriaji wa uadilifu wa muundo wa tishu za moyo kwa akili ya bandia (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), sehemu/vikundi 5 (D12 MC) kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja limefanywa; ####p <0.0001 dhidi ya D0 na ****00 <10  ikilinganishwa na D0 na ****0 2 10                                                                                                                                                                      Ujaribio wa ANOVA]人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) vipande/vikundi kila nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja;###0#p0D ********. 0001 kwa D12 Ctrl 相比.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) vipande/kundi kila nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja;##0#0D0D010. 001 kwa D12 Ctrl 相比. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC/грузей) сзрка ней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 dhidi ya D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Akili Bandia ya kukadiria uthabiti wa muundo wa tishu za moyo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sehemu/kundi la kila nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja; ####p<0.0001 dhidi ya .D0 Kwa kulinganisha ****p02 <10 ikilinganishwa na D****02 <10. c Picha wakilishi (kushoto) na vipimo (kulia) vya vipande vya moyo vilivyotiwa doa la Trichrome la Masson (Kipimo tupu = 500 µm) (n = vipande 10/vikundi kila kimoja kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja hufanywa; ####p <0.0001 <0.0001 ikilinganishwa na D00 na 10 ***p ikilinganishwa na D00 na 10 ***p). c Picha wakilishi (kushoto) na upimaji (kulia) wa vipande vya moyo vilivyotiwa doa la Trichrome la Masson (Kipimo tupu = 500 µm) (n = vipande 10/vikundi kila kimoja kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja hufanywa; #### p <0.0001 <0.0001 ikilinganishwa na D00 na 10 ***p ikilinganishwa na D00 na 10 ***p). c Репрезентативные изображения (слева) na количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масязом Масязом 5 = (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и ***p <0,0001 по с Dвнению с D0 и ***p <0,0001 по с Dвнению с D0 и ***p <0,0001 по с Dвнению). c Picha wakilishi (kushoto) na upimaji (kulia) wa sehemu za moyo zilizotiwa doa la trichrome la Masson (kipimo kisichofunikwa = 500 µm) (n = sehemu 10/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja limefanywa; #### p <0 .0001 ikilinganishwa na D0 na D0 ***p <p. c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 尺度= 500 ¿m） 500 ¥ 500 ¥ 1 =组，每组來自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比。 C 用 mason 三 色 染料的 心脏 切片的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺尺度 左 左） 左 左） 量化µm) （n = 10 个 切片 组 每 组 來自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p <0.00001 , kwa D12 Ctrl funguo. c Репрезентативные изображения (слева) na количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массоя 10 =030 = срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p <0,0001ю помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p <0,0001ю сю , D. Ctrl). c Picha wakilishi (kushoto) na kiasi (kulia) cha sehemu za moyo zilizotiwa doa la trichrome la Masson (tupu = 500 µm) (n = sehemu 10/kikundi, kila moja kutoka kwa nguruwe tofauti, iliyojaribiwa kwa uchanganuzi wa njia moja wa tofauti ;### # p <0.0001 ikilinganishwa na D0. Ctrl 1 ikilinganishwa na D0. ***1).Pau za hitilafu zinawakilisha wastani wa ± mkengeuko wa kawaida.
Tulidhania kwamba kwa kuongeza molekuli ndogo kwenye kati ya utamaduni, uaminifu wa cardiomyocyte unaweza kuboreshwa na maendeleo ya fibrosis kupunguzwa wakati wa utamaduni wa CTCM.Kwa hivyo tulichunguza molekuli ndogo kwa kutumia tamaduni zetu za udhibiti tuli20,21 kutokana na idadi ndogo ya mambo ya kutatanisha.Deksamethasoni (Dex), triiodothyronine (T3), na SB431542 (SB) zilichaguliwa kwa skrini hii.Molekuli hizi ndogo zimetumika hapo awali katika tamaduni za hiPSC-CM ili kushawishi ukomavu wa cardiomyocytes kwa kuongeza urefu wa sarcomere, T-tubules, na kasi ya upitishaji.Kwa kuongeza, wote Dex (glucocorticoid) na SB wanajulikana kukandamiza kuvimba29,30.Kwa hivyo, tulijaribu ikiwa kujumuishwa kwa moja au mchanganyiko wa molekuli hizi ndogo kungeboresha uadilifu wa muundo wa sehemu za moyo.Kwa uchunguzi wa awali, kipimo cha kila kiwanja kilichaguliwa kulingana na viwango vinavyotumiwa sana katika mifano ya utamaduni wa seli (1 μM Dex27, 100 nM T327, na 2.5 μM SB31).Baada ya siku 12 za utamaduni, mchanganyiko wa T3 na Dex ulisababisha uadilifu wa muundo wa cardiomyocyte na urekebishaji mdogo wa nyuzi (Takwimu za Ziada 4 na 5).Kwa kuongeza, matumizi ya viwango hivi mara mbili au mbili vya T3 na Dex yalizalisha madhara mabaya ikilinganishwa na viwango vya kawaida (Mchoro wa Nyongeza 6a, b).
Baada ya uchunguzi wa awali, tulifanya ulinganisho wa ana kwa ana wa hali 4 za kitamaduni (Mchoro 4a): Ctrl: sehemu za moyo zilizokuzwa katika utamaduni wetu tuli ulioelezewa hapo awali kwa kutumia njia yetu iliyoboreshwa;20.21 TD: T3 na Ctrl s Added Dex siku ya Jumatano;MC: sehemu za moyo zilizokuzwa katika CTCM kwa kutumia njia yetu iliyoboreshwa hapo awali;na MT: CTCM iliyo na T3 na Dex iliyoongezwa kwa kati.Baada ya siku 12 za kilimo, uwezekano wa tishu za MS na MT ulibakia sawa na katika tishu safi zilizopimwa na mtihani wa MTT (Mchoro 4b).Inashangaza, kuongezwa kwa T3 na Dex kwa tamaduni za transwell (TD) haikusababisha uboreshaji mkubwa wa uwezekano ikilinganishwa na hali ya Ctrl, ikionyesha jukumu muhimu la kusisimua kwa mitambo katika kudumisha uwezekano wa sehemu za moyo.
mchoro wa muundo wa kimajaribio unaoonyesha hali nne za kitamaduni zinazotumiwa kutathmini athari za uhamasishaji wa mitambo na uongezaji wa T3/Dex kwa wastani kwa siku 12. b Grafu ya upau inaonyesha ujazo wa uwezo wa kumea siku 12 baada ya utamaduni katika hali zote 4 za kitamaduni (Ctrl, TD, MC, na MT) ikilinganishwa na vipande vipya vya moyo (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), 12 (D12 MC) vipande/vipande/kikundi kimoja kutoka kwa 0 #0; ###p <0.001 ikilinganishwa na D0 na **p <0.01 ikilinganishwa na D12 Ctrl). b Grafu ya upau inaonyesha ujazo wa uwezo wa kumea siku 12 baada ya utamaduni katika hali zote 4 za kitamaduni (Ctrl, TD, MC, na MT) ikilinganishwa na vipande vipya vya moyo (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), 12 (D12 MC) vipande/vipande/kikundi kimoja kutoka kwa 0 #0; ###p <0.001 ikilinganishwa na D0 na **p <0.01 ikilinganishwa na D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования во всех 4 условиях культивирования всех 4 условиях культивирования ю со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней #0тей свиней, пронсто#VAсто#VAсто#дисто#VAсто#VAсто#дистой , правди ,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Grafu ya upau inaonyesha ukadiriaji wa utendakazi katika utamaduni wa baada ya siku 12 katika hali zote 4 za kitamaduni (udhibiti, TD, MC, na MT) ikilinganishwa na sehemu za moyo safi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, na D12 MT), 12 (D12 MC tofauti) sehemu #00#VA #00p; 1, ###p < 0.001 dhidi ya D0 na **p <0.01 kwa ikilinganishwa na D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)),15 (D12 Ctrl MT1,D12自和2 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p <0.0001,###p <0.001 与D0 相比，**p <0.01 与D12控刧刚。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC na MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 15, D12), Ctrl (D12) (n = 15, D12) разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по компания компон2). b Histogram inayoonyesha hali zote 4 za kitamaduni (udhibiti, TD, MC na MT) ikilinganishwa na sehemu za moyo safi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), kutoka kwa sehemu/kikundi tofauti cha nguruwe 12 (D12 MC), jaribio la ANOVA la njia moja; ##0#0#p. 0.01 dhidi ya kudhibiti D12). c Grafu ya upau inaonyesha idadi ya glukosi siku 12 baada ya kutengenezwa katika hali zote 4 za kitamaduni (Ctrl, TD, MC, na MT) ikilinganishwa na vipande vipya vya moyo (D0) (n = vipande 6/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, mtihani wa ANOVA wa njia moja unafanywa; ###p <0.001, ikilinganishwa na D0 na ***p <0 ikilinganishwa na D0 na ***p <0). c Grafu ya upau inaonyesha idadi ya glukosi siku 12 baada ya kutengenezwa katika hali zote 4 za kitamaduni (Ctrl, TD, MC, na MT) ikilinganishwa na vipande vipya vya moyo (D0) (n = vipande 6/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, mtihani wa ANOVA wa njia moja unafanywa; ###p <0.001, ikilinganishwa na D0 na ***p <0 ikilinganishwa na D0 na ***p <0). c ания (контроль, td, mc na mt) по сравнению со свежими срезами сердца (d0) (n = 6 срезов/грой о р р р няется тест ANOVA; ### p <0,001 по сравнению с D0 и *** p <0,001 по сравению с D12 Ctrl). c Histogram inaonyesha ujazo wa mabadiliko ya glukosi siku 12 baada ya utamaduni chini ya hali zote 4 za kitamaduni (udhibiti, TD, MC na MT) ikilinganishwa na sehemu za moyo safi (D0) (n = sehemu 6/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, mtihani wa ANOVA wa njia moja ulifanyika ; ###p <0.001 ikilinganishwa na D0 na ***p <0.00 Ctrl <0.00). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 培养条件6 片/组，來自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p <0.001，与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切剹 光 切特 切特 光 1的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 來自 猪 ， , , , , , 猪 猪单行向执ANOVA 测试；###p <0.0001 . kwa D12 Ctrl funguo. c Гистограмма, казывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования ю со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,000p *** Dне 12 (контроль). c Histogram inayoonyesha ujazo wa mtiririko wa glukosi katika siku 12 baada ya utamaduni kwa hali zote 4 za kitamaduni (udhibiti, TD, MC, na MT) ikilinganishwa na sehemu za moyo safi (D0) (n = sehemu 6/kikundi, kutoka kwa nguruwe tofauti, majaribio ya ANOVA yalifanywa upande mmoja, ###p <0.001 ikilinganishwa na D01, ***1 ikilinganishwa na D01. ***p).d Viwanja vya uchanganuzi wa matatizo ya tishu safi (za bluu), siku ya 12 MC (kijani), na siku ya 12 MT (nyekundu) katika sehemu kumi za sehemu ya tishu za kanda (n = vipande 4/kikundi, jaribio la ANOVA la njia moja; hapakuwa na tofauti kubwa kati ya vikundi).e Mpangilio wa volcano inayoonyesha jeni zilizoonyeshwa kwa njia tofauti katika sehemu za moyo safi (D0) ikilinganishwa na sehemu za moyo zilizokuzwa chini ya hali tuli (Ctrl) au chini ya hali ya MT (MT) kwa siku 10-12.f Ramani ya joto ya jeni za sarcomere kwa sehemu za moyo zilizokuzwa chini ya kila hali ya kitamaduni.Pau za hitilafu zinawakilisha wastani wa ± mkengeuko wa kawaida.
Utegemezi wa kimetaboliki juu ya kubadili kutoka kwa oxidation ya asidi ya mafuta hadi glycolysis ni alama ya kutenganisha cardiomyocyte.Kadiyositi ambazo hazijakomaa hutumia glukosi kwa ajili ya utengenezaji wa ATP na huwa na mitochondria ya plastiki yenye cristae5,32 chache.Uchambuzi wa utumiaji wa glukosi ulionyesha kuwa chini ya hali ya MC na MT, matumizi ya glukosi yalikuwa sawa na yale ya siku 0 (Mchoro 4c).Hata hivyo, sampuli za Ctrl zilionyesha ongezeko kubwa la matumizi ya glukosi ikilinganishwa na tishu safi.Hii inaonyesha kuwa mchanganyiko wa CTCM na T3/Dex huongeza uwezekano wa tishu na kuhifadhi phenotype ya kimetaboliki ya sehemu za moyo zilizokuzwa kwa siku 12.Kwa kuongeza, uchambuzi wa matatizo ulionyesha kuwa viwango vya matatizo vilibakia sawa na katika tishu za moyo safi kwa siku 12 chini ya hali ya MT na MS (Mchoro 4d).
Ili kuchanganua athari ya jumla ya CTCM na T3/Dex kwenye mandhari ya kimataifa ya unukuzi ya tishu za kipande cha moyo, tulifanya RNAseq kwenye vipande vya moyo kutoka kwa hali zote nne tofauti za utamaduni (Data ya Ziada 1).Inashangaza, sehemu za MT zilionyesha ulinganifu wa juu wa maandishi na tishu mpya za moyo, na 16 tu zilizoonyeshwa tofauti kati ya jeni 13,642.Hata hivyo, kama tulivyoonyesha hapo awali, vipande vya Ctrl vilionyesha jeni 1229 zilizoonyeshwa kwa njia tofauti baada ya siku 10-12 katika utamaduni (Mchoro 4e).Data hizi zilithibitishwa na qRT-PCR ya jeni za moyo na fibroblast (Mchoro wa ziada wa 7a-c).Inashangaza, sehemu za Ctrl zilionyesha kupunguzwa kwa jeni za mzunguko wa moyo na seli na uanzishaji wa programu za jeni za uchochezi.Data hizi zinaonyesha kuwa utengano, ambao kwa kawaida hutokea baada ya kilimo cha muda mrefu, hupunguzwa kabisa chini ya hali ya MT (Mchoro wa Nyongeza 8a, b).Uchunguzi wa makini wa jeni za sarcomere ulionyesha kuwa tu chini ya hali ya MT ni jeni zinazosimba sarcomere (Mchoro 4f) na njia ya ion (Mchoro wa ziada wa 9) uliohifadhiwa, kuwalinda kutokana na kukandamiza chini ya hali ya Ctrl, TD, na MC.Data hizi zinaonyesha kuwa pamoja na mseto wa kimitambo na ucheshi (T3/Dex), nukuu ya kipande cha moyo inaweza kubaki sawa na vipande vipya vya moyo baada ya siku 12 katika utamaduni.
Matokeo haya ya maandishi yanaungwa mkono na ukweli kwamba uadilifu wa muundo wa cardiomyocytes katika sehemu za moyo huhifadhiwa vyema chini ya hali ya MT kwa siku 12, kama inavyoonyeshwa na connexin 43 isiyoharibika na ya ndani (Mchoro 5a).Kwa kuongeza, fibrosis katika sehemu za moyo chini ya hali ya MT ilipungua kwa kiasi kikubwa ikilinganishwa na Ctrl na sawa na sehemu za moyo safi (Mchoro 5b).Data hizi zinaonyesha kuwa mchanganyiko wa kichocheo cha mitambo na matibabu ya T3/Dex huhifadhi vyema muundo wa moyo katika sehemu za moyo katika utamaduni.
a Mwakilishi wa picha za immunofluorescence za troponin-T (kijani), connexin 43 (nyekundu), na DAPI (bluu) katika sehemu mpya za moyo zilizotengwa (D0) au zilizokuzwa kwa siku 12 katika hali zote nne za utamaduni wa sehemu ya moyo (kipimo cha kipimo = 100 µm).) Ukadiriaji wa akili Bandia wa utimilifu wa muundo wa tishu za moyo (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), vipande/vipande 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja hufanywa; ####p <0.0001 ikilinganishwa na D000 na 1 ****5p ikilinganishwa na D00 na 1 ****5p. Ctrl). Ukadiriaji wa akili Bandia wa utimilifu wa muundo wa tishu za moyo (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), vipande/vipande 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja hufanywa; <### p <0.0001 ikilinganishwa na D00 na 1 ****5p ikilinganishwa na D00 na 1 ****5p. Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC/ D12 MC/ Dпре) ых свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Ukadiriaji wa uadilifu wa muundo wa tishu za moyo kwa kutumia akili ya bandia (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), sehemu/kundi 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja limefanywa; #### p <0.0001 <0.0001 ikilinganishwa na D0 p0 na 1 **** Ctrl 1 ikilinganishwa na D0 na 1 **** 5 Ctrl 1 ikilinganishwa na D0 na 1 **** 5. )对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组人）切片/组行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 和*p <0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mc 和 d12 mt）化 进行 单向 单向 测试 ; ########### # p <0.0001 与D0 和*p <0.05 相比，或****p <0.0001 与D .Ukadiriaji wa uadilifu wa muundo wa tishu za moyo kwa kutumia akili ya bandia katika nguruwe tofauti (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) sehemu / kikundi) na mtihani wa njia moja wa ANOVA;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 ikilinganishwa na D0 na *p <0.05 au ****p <0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). b Picha wakilishi na ukadiriaji wa vipande vya moyo vilivyotiwa doa la Trichrome la Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, na D12 MC), 9 (D12 MT) vipande/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la njia moja 0#0 # 0 # D0 linalinganishwa 0#0 ANOVA #0#0 ikilinganishwa na 0#0 #0 #0 inafanywa kwa njia moja 1 #D#0 1 #D#0 ikilinganishwa na 0#0 0.001, au ****p <0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). b Picha wakilishi na ukadiriaji wa vipande vya moyo vilivyotiwa doa la Trichrome la Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, na D12 MC), 9 (D12 MT) vipande/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la njia moja 0#0 # 0 # D0 linalinganishwa 0#0 ANOVA #0#0 ikilinganishwa na 0#0 #0 #0 inafanywa kwa njia moja 1 #D#0 1 #D#0 ikilinganishwa na 0#0 0.001, au ****p <0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная млине 10,20 = D010) Ctrl, D12 TD na D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001ю по 0,0001ю по D00 и0, *** 1 kwa сравнению с D12 Ctrl). b Picha wakilishi na ukadiriaji wa sehemu za moyo zilizo na doa la trichrome la Masson (kipimo cha kipimo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD na D12 MC), 9 (D12 MT) sehemu/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, kilitekelezwa kwa njia moja.#001 na ANOVA.#001. 1 au ****p <0.0001 dhidi ya D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D2D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D（D）同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p <0.001p <0.00p Ctrl 0.001 p <0.001 p.比）. b 用 masson 三 色 染料的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n d 1, d 1, d 1, d 1, d 1, d 1, d 1, d 1 d 2, d 1 = 1 d 1 d 1 d 2 d 1 d 1 d 1 d 1 d 1 d 1 d 1 d 1 d 1 d 1和 d12 mc） 來自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片片 切片 ​​切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相毅 <0.*0D0 相毅 <0 1 D0 <0 D0 1 比 0. 2 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка линейка = 500n, DкD = 500n, DкD = 500n, DкD = 500m) 12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или 0****p не по сравнению с D0, ***p < 0,001 или 0****p 1 Ctrl, 0 ****p 1). B picha za mwakilishi na ufafanuzi wa sehemu za moyo zilizowekwa na trichrome ya Masson (wigo wa bar = 500 µm) (n = 10 (d0, d12 ctrl, d12 td na d12 mc), 9 (d12 mt) sehemu kutoka kwa nguruwe/kikundi tofauti, njia moja ya ANOVA;####p <0. ).Pau za hitilafu zinawakilisha wastani wa ± mkengeuko wa kawaida.
Hatimaye, uwezo wa CTCM kuiga hypertrophy ya moyo ulipimwa kwa kuongeza kunyoosha kwa tishu za moyo.Katika CTCM, shinikizo la juu la chumba cha hewa liliongezeka kutoka 80 mmHg hadi 80 mmHg.Sanaa.(kunyoosha kawaida) hadi 140 mmHg Sanaa.(Mchoro 6a).Hii inalingana na ongezeko la 32% la kunyoosha (Mchoro 6b), ambayo hapo awali ilionyeshwa kama asilimia inayolingana inayohitajika kwa sehemu za moyo kufikia urefu wa sarcomere sawa na ule unaoonekana katika hypertrophy.Kunyoosha na kasi ya tishu ya moyo wakati wa contraction na relaxation alibakia mara kwa mara wakati wa siku sita ya utamaduni (Mtini. 6c).Tishu za moyo kutoka kwa hali ya MT ziliwekwa chini ya kunyoosha kawaida (MT (Kawaida)) au hali ya kunyoosha (MT (OS)) kwa siku sita.Tayari baada ya siku nne katika utamaduni, biomarker hypertrophic NT-ProBNP ilikuwa imeinuliwa kwa kiasi kikubwa katika kati chini ya hali ya MT (OS) ikilinganishwa na hali ya MT (ya kawaida) (Mchoro 7a).Kwa kuongeza, baada ya siku sita za kilimo, ukubwa wa seli katika MT (OS) (Mchoro 7b) uliongezeka kwa kiasi kikubwa ikilinganishwa na sehemu za moyo wa MT (kawaida).Kwa kuongeza, uhamisho wa nyuklia wa NFATC4 uliongezeka kwa kiasi kikubwa katika tishu zilizozidi (Mchoro 7c).Matokeo haya yanaonyesha maendeleo ya maendeleo ya urekebishaji wa patholojia baada ya shinikizo la damu na kuunga mkono dhana kwamba kifaa cha CTCM kinaweza kutumika kama jukwaa la kuchunguza ishara za hypertrophy ya moyo iliyosababishwa na kunyoosha.
Vielelezo wakilishi vya shinikizo la chumba cha hewa, shinikizo la chumba cha maji, na vipimo vya mwendo wa tishu huthibitisha kwamba shinikizo la chumba hubadilisha shinikizo la chumba cha maji, na kusababisha harakati inayolingana ya kipande cha tishu.b Asilimia wakilishi ya kunyoosha na mikunjo ya kasi ya kunyoosha kwa sehemu za tishu zilizonyooshwa kawaida (za chungwa) na (bluu).c Grafu ya upau inayoonyesha muda wa mzunguko (n = vipande 19 kwa kila kikundi, kutoka kwa nguruwe tofauti), muda wa kubana (n = vipande 18-19 kwa kila kikundi, kutoka kwa nguruwe tofauti), muda wa kupumzika (n = vipande 19 kwa kila kikundi, kutoka kwa nguruwe tofauti)), amplitude ya harakati ya tishu (n = 14 vipande / kikundi, kutoka kwa nguruwe tofauti), kilele cha systolic ya systolic, kilele cha systolic = 1. n = 14 (D0), 15 (D6) ) sehemu/vikundi) kutoka kwa nguruwe tofauti), Jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili halikuonyesha tofauti kubwa katika kigezo chochote, ikionyesha kwamba vigezo hivi vilibakia mara kwa mara wakati wa siku 6 za utamaduni na overvoltage.Pau za hitilafu zinawakilisha wastani wa ± mkengeuko wa kawaida.
upimaji wa grafu ya mwamba wa mkusanyiko wa NT-ProBNP katika maudhui ya utamaduni kutoka kwa vipande vya moyo vilivyokuzwa chini ya hali ya MT ya kawaida (Kawaida) au ya kunyoosha kupita kiasi (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, na D4 MTOS) vipande/vipande kutoka kwa nguruwe tofauti, ANOVA ya njia mbili hadi ya kawaida inafanywa. **1 inafanywa <p. upimaji wa grafu ya mwamba wa mkusanyiko wa NT-ProBNP katika maudhui ya utamaduni kutoka kwa vipande vya moyo vilivyokuzwa chini ya hali ya MT ya kawaida (Kawaida) au ya kunyoosha kupita kiasi (OS) (n\= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, na D4 MTOS) vipande/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, ANOVA ya njia mbili ikilinganishwa na ANOVA0 inafanywa kwa njia mbili.Histogram ya kiasi cha mkusanyiko wa NT-ProBNP katika utamaduni kutoka kwa vipande vya moyo vilivyopandwa chini ya hali ya kawaida ya MT kunyoosha (kawaida) au overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, na D4).MTOS) vipande / kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, uchambuzi wa mambo mawili ya tofauti hufanywa;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 ikilinganishwa na kunyoosha kawaida). a 在MT 正常拉伸(Kawaida) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓麦的条彈3, MT-ProBNP 浓麦的条彈3 (D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）來自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p. Ukadiriaji wa mkusanyiko wa NT-ProBNP katika vipande vya moyo vilivyokuzwa chini ya hali ya kunyoosha ya kawaida ya MT (Kawaida) au ya kuzidisha (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm neD4 MTOS) kutoka kwa 猪的切片/组，可以双双向 tofauti p <0.01).histogram Uhesabuji wa viwango vya NT-ProBNP katika vipande vya moyo vilivyopandwa chini ya hali ya kawaida ya MT kunyoosha (kawaida) au overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) na D4 MTOS) vipande / kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, uchambuzi wa njia mbili za kutofautiana;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 ikilinganishwa na kunyoosha kawaida). b Picha wakilishi za vipande vya moyo vilivyochafuliwa na troponin-T na WGA (kushoto) na upimaji wa saizi ya seli (kulia) (n = 330 (D6 MTOS), seli/kundi 369 (D6 MTNorm) kutoka vipande 10 tofauti kutoka kwa nguruwe tofauti, Jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili linafanywa ikilinganishwa na kawaida; 0****001). b Picha wakilishi za vipande vya moyo vilivyo na troponin-T na WGA (kushoto) na upimaji wa saizi ya seli (kulia) (n = 330 (D6 MTOS), seli/kikundi 369 (D6 MTNorm) kutoka vipande 10 tofauti kutoka kwa nguruwe tofauti, Jaribio la t la Mwanafunzi mwenye mikia miwili linafanywa. 0 ****01 p. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) na количественного определения размера кле30 (69D) (6D = 6D) (6) MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p <0,00001 подруженный программы). b Picha wakilishi za sehemu za moyo zilizo na troponin-T na AZP (kushoto) na upimaji wa saizi ya seli (kulia) (n = 330 (D6 MTOS), seli/kundi 369 (D6 MTNorm) kutoka sehemu 10 tofauti kutoka kwa nguruwe tofauti, Mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili <0 0 ikilinganishwa na 0; 0. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图自像像（n 33)个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p <1）0. b Picha wakilishi za vipande vya moyo vilivyotiwa rangi ya calcarein-T na WGA (kushoto) na saizi ya seli (kulia) (n = 330 (D6 MTOS), 369 kutoka vipande 10 tofauti (D6 MTNorm)) Seli/组，两方法有尾学生0 mtihani wa kawaida. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) na количественная оценка размера клеток (с69 MT) (D69Mt) rm) na 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p <0,0001 по сравнению с номнистенные). b Picha za uwakilishi wa sehemu za moyo zilizochafuliwa na troponin-T na AZP (kushoto) na quantification ya ukubwa wa seli (kulia) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) kutoka sehemu 10 tofauti kutoka kwa nguruwe tofauti) Seli/kikundi, kigezo chenye mikia miwili t;****p <0.0001 ikilinganishwa na matatizo ya kawaida). c Picha wakilishi kwa siku 0 na siku 6 vipande vya moyo vya MTOS vilivyowekwa kinga ya troponin-T na NFATC4 na kuhesabu kiasi cha uhamisho wa NFATC4 hadi kwenye viini vya CMs (n = 4 (D0), vipande 3 (D6 MTOS) kutoka kwa nguruwe tofauti, Mwanafunzi mwenye mikia miwili 0; c Picha wakilishi kwa siku 0 na siku 6 vipande vya moyo vya MTOS vilivyowekwa kinga ya troponin-T na NFATC4 na kuhesabu kiasi cha uhamishaji wa NFATC4 hadi kwenye viini vya CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) vipande/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti , Jaribio la Mkia Mbili 0 ni Mwanafunzi. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 na 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т na NFATC4, na количественная оценская TCRA 4 зных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента, *5 <p. c Picha wakilishi za sehemu za moyo katika MTOS ya siku 0 na 6, zilizo na alama ya kinga ya troponin-T na NFATC4, na uainishaji wa uhamishaji wa NFATC4 kwenye kiini cha seli za mapango (n = 4 (D0), vipande/kundi 3 (D6 MTOS) kutoka kwa nguruwe tofauti) walifanya mtihani wa wanafunzi wenye mikia miwili;*p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来诚同TC4的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c Picha wakilishi za calcanin-T na NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS vipande vya moyo, na NFATC4 kutoka NFATC4 易位至 kiini kiini cha CM的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 其兄生et 电影；*p <0.05). c Utoaji wa taarifa kuhusu matumizi ya MTOS katika 0 na 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т na NFATC4 na количественная оценское TCFAD. зных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p <0,05). c Picha wakilishi za vipande vya moyo vya MTOS katika siku ya 0 na 6 kwa ajili ya kuweka kinga ya troponin-T na NFATC4 na upimaji wa uhamishaji wa NFATC4 kwenye kiini cha CM kutoka kwa nguruwe tofauti (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) vipande/kikundi, chenye mikia miwili t -0p <5p Mwanafunzi).'Pau za hitilafu zinawakilisha wastani wa ± mkengeuko wa kawaida.
Utafiti wa kutafsiri wa moyo na mishipa unahitaji mifano ya seli zinazozalisha kwa usahihi mazingira ya moyo.Katika utafiti huu, kifaa cha CTCM kilitengenezwa na sifa ambayo inaweza kuchochea sehemu za moyo za ultrathin.Mfumo wa CTCM unajumuisha kichocheo cha kielektroniki kilichosawazishwa kisaikolojia na uboreshaji wa maji ya T3 na Dex.Wakati sehemu za moyo wa nguruwe ziliathiriwa na mambo haya, uwezekano wao, ukamilifu wa muundo, shughuli za kimetaboliki, na usemi wa maandishi ulibakia sawa na katika tishu mpya za moyo baada ya siku 12 za utamaduni.Kwa kuongeza, kunyoosha kwa kiasi kikubwa kwa tishu za moyo kunaweza kusababisha hypertrophy ya moyo inayosababishwa na hyperextension.Kwa ujumla, matokeo haya yanaunga mkono jukumu muhimu la hali ya utamaduni wa kisaikolojia katika kudumisha phenotype ya kawaida ya moyo na kutoa jukwaa la uchunguzi wa madawa ya kulevya.
Sababu nyingi huchangia kuunda mazingira bora ya utendaji na maisha ya cardiomyocytes.Mambo yaliyo dhahiri zaidi ya mambo haya yanahusiana na (1) mwingiliano kati ya seli, (2) kusisimua kwa umeme, (3) vipengele vya ucheshi, na (4) substrates za kimetaboliki.Mwingiliano wa kisaikolojia wa seli hadi seli unahitaji mitandao changamano ya pande tatu ya aina nyingi za seli zinazoauniwa na matrix ya ziada ya seli.Mwingiliano huo changamano wa seli ni vigumu kuunda upya katika vitro kwa ushirikiano wa aina za seli za kibinafsi, lakini unaweza kupatikana kwa urahisi kwa kutumia asili ya organotypic ya sehemu za moyo.
Kunyoosha mitambo na uhamasishaji wa umeme wa cardiomyocytes ni muhimu kwa kudumisha phenotype ya moyo33,34,35.Ingawa kichocheo cha kimitambo kimetumika sana kwa urekebishaji na ukomavu wa hiPSC-CM, tafiti kadhaa za kifahari hivi majuzi zimejaribu uhamasishaji wa kiufundi wa vipande vya moyo katika utamaduni kwa kutumia upakiaji wa uniaxial.Masomo haya yanaonyesha kuwa upakiaji wa mitambo ya 2D uniaxial ina athari nzuri kwenye phenotype ya moyo wakati wa utamaduni.Katika masomo haya, sehemu za moyo zilipakiwa na nguvu za kiisometriki za mvutano17, upakiaji wa auxotonic wa mstari18, au mzunguko wa moyo uliundwa upya kwa kutumia maoni ya transducer ya nguvu na anatoa za mvutano.Hata hivyo, njia hizi hutumia kunyoosha kwa tishu za uniaxial bila uboreshaji wa mazingira, na kusababisha ukandamizaji wa jeni nyingi za moyo au udhihirisho wa jeni unaohusishwa na majibu yasiyo ya kawaida ya kunyoosha.CTCM iliyoelezwa hapa hutoa kichocheo cha umeme cha 3D ambacho kinaiga mzunguko wa asili wa moyo kwa suala la muda wa mzunguko na kunyoosha kisaikolojia (kunyoosha 25%, sistoli 40%, diastoli 60% na beats 72 kwa dakika).Ijapokuwa kichocheo hiki cha kimitambo cha pande tatu pekee hakitoshi kudumisha uadilifu wa tishu, mchanganyiko wa kichocheo cha ucheshi na kimakanika kwa kutumia T3/Dex unahitajika ili kudumisha utendakazi, utendakazi na uadilifu wa tishu.
Sababu za ucheshi zina jukumu muhimu katika kurekebisha phenotype ya moyo wa watu wazima.Hili liliangaziwa katika tafiti za HiPS-CM ambapo T3 na Dex ziliongezwa kwenye vyombo vya habari vya utamaduni ili kuharakisha upevukaji wa seli.T3 inaweza kuathiri usafirishaji wa amino asidi, sukari na kalsiamu kwenye utando wa seli36.Zaidi ya hayo, T3 inakuza usemi wa MHC-α na upunguzaji wa MHC-β, na hivyo kukuza uundaji wa myofibrils ya haraka katika cardiomyocytes kukomaa ikilinganishwa na myofibrils ya polepole katika CM ya fetasi.Upungufu wa T3 kwa wagonjwa wa hypothyroid husababisha upotezaji wa bendi za myofibrillar na kiwango cha kupunguzwa cha ukuzaji wa sauti37.Dex hutenda kwenye vipokezi vya glukokotikoidi na imeonyeshwa kuongeza utepetevu wa myocardial katika mioyo iliyotengwa na manukato;38 uboreshaji huu unafikiriwa kuwa unahusiana na athari kwenye kuingia kwa kutumia amana ya kalsiamu (SOCE) 39,40.Kwa kuongezea, Dex hufunga kwa vipokezi vyake, na kusababisha mwitikio mpana wa ndani wa seli ambao unakandamiza kazi ya kinga na uchochezi30.
Matokeo yetu yanaonyesha kuwa uhamasishaji wa kimitambo wa kimwili (MS) uliboresha utendaji wa jumla wa utamaduni ikilinganishwa na Ctrl, lakini haukuweza kudumisha uwezekano, uadilifu wa muundo, na hisia ya moyo kwa muda wa siku 12 katika utamaduni.Ikilinganishwa na Ctrl, kuongezwa kwa T3 na Dex kwa tamaduni za CTCM (MT) kuliboresha utendakazi na kudumisha wasifu sawa wa unukuzi, uadilifu wa muundo, na shughuli za kimetaboliki na tishu mpya za moyo kwa siku 12.Kwa kuongeza, kwa kudhibiti kiwango cha kunyoosha kwa tishu, mfano wa hypertrophy ya moyo unaosababishwa na hyperextension uliundwa kwa kutumia STCM, inayoonyesha ustadi wa mfumo wa STCM.Ikumbukwe kwamba ingawa urekebishaji wa moyo na adilifu kwa kawaida huhusisha viungo visivyobadilika ambavyo seli zake zinazozunguka zinaweza kutoa saitokini zinazofaa pamoja na fagosaitosisi na mambo mengine ya kurekebisha, sehemu za moyo bado zinaweza kuiga mchakato wa nyuzi katika kukabiliana na mfadhaiko na kiwewe.kwenye myofibroblasts.Hii imetathminiwa hapo awali katika modeli hii ya kipande cha moyo.Ikumbukwe kwamba vigezo vya CTCM vinaweza kubadilishwa kwa kubadilisha amplitude ya shinikizo/umeme na mzunguko ili kuiga hali nyingi kama vile tachycardia, bradycardia, na usaidizi wa mzunguko wa mitambo (moyo usio na mitambo).Hii inafanya mfumo kuwa wa kati wa kupitisha majaribio ya dawa.Uwezo wa CTCM kuiga hypertrophy ya moyo inayosababishwa na kuzidisha nguvu hufungua njia ya kupima mfumo huu kwa matibabu ya kibinafsi.Kwa kumalizia, utafiti wa sasa unaonyesha kuwa kunyoosha kwa mitambo na kusisimua kwa humoral ni muhimu kwa kudumisha utamaduni wa sehemu za tishu za moyo.
Ingawa data iliyowasilishwa hapa inapendekeza kwamba CTCM ni jukwaa la kuahidi sana la kuiga myocardiamu isiyoharibika, mbinu hii ya utamaduni ina vikwazo fulani.Kizuizi kikuu cha tamaduni ya CTCM ni kwamba inaweka mikazo ya mitambo inayoendelea kwenye vipande, ambayo inazuia uwezo wa kufuatilia kikamilifu mikazo ya vipande vya moyo wakati wa kila mzunguko.Kwa kuongeza, kutokana na ukubwa mdogo wa sehemu za moyo (7 mm), uwezo wa kutathmini kazi ya systolic nje ya mifumo ya utamaduni kwa kutumia sensorer za jadi za nguvu ni mdogo.Katika maandishi ya sasa, tunashinda kwa kiasi kizuizi hiki kwa kutathmini voltage ya macho kama kiashirio cha kazi ya contractile.Hata hivyo, kizuizi hiki kitahitaji kazi zaidi na kinaweza kushughulikiwa katika siku zijazo kwa kuanzisha mbinu za ufuatiliaji wa macho wa utendaji wa vipande vya moyo katika utamaduni, kama vile uchoraji wa ramani ya macho kwa kutumia kalsiamu na rangi zinazohimili volteji.Kizuizi kingine cha CTCM ni kwamba mtindo wa kufanya kazi haudhibiti mkazo wa kisaikolojia (upakiaji wa awali na upakiaji).Katika CTCM, shinikizo lilichochewa katika mwelekeo tofauti ili kuzaliana 25% ya kunyoosha kisaikolojia katika diastoli (kunyoosha kamili) na sistoli (urefu wa mkazo wakati wa kusisimua umeme) katika tishu kubwa sana.Kizuizi hiki kinapaswa kuondolewa katika miundo ya baadaye ya CTCM kwa shinikizo la kutosha kwenye tishu za moyo kutoka pande zote mbili na kwa kutumia uhusiano halisi wa shinikizo-kiasi unaotokea kwenye vyumba vya moyo.
Urekebishaji uliosababishwa na kuzidisha ulioripotiwa katika hati hii ni mdogo kwa kuiga ishara za hypertrophic hyperstretch.Kwa hivyo, mtindo huu unaweza kusaidia katika utafiti wa ishara ya hypertrophic iliyosababishwa na kunyoosha bila hitaji la sababu za humoral au neural (ambazo hazipo katika mfumo huu).Masomo zaidi yanahitajika ili kuongeza wingi wa CTCM, kwa mfano, kulima kwa ushirikiano na seli za kinga, kuzunguka kwa vipengele vya ucheshi wa plasma, na uhifadhi wa ndani wakati wa kulima kwa kushirikiana na seli za nyuroni kutaboresha uwezekano wa kuiga ugonjwa na CTCM.
Nguruwe kumi na tatu walitumika katika utafiti huu.Taratibu zote za wanyama zilifanywa kwa mujibu wa miongozo ya kitaasisi na ziliidhinishwa na Kamati ya Utunzaji na Matumizi ya Wanyama ya Chuo Kikuu cha Louisville.Upinde wa aota ulibanwa na moyo ulitiwa manukato kwa lita 1 ya cardioplegia tasa (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mm MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparini, pH hadi 7.4); mioyo ilihifadhiwa katika mmumunyo wa moyo wenye baridi-baridi hadi kusafirishwa hadi kwenye maabara kwenye barafu ambayo kwa kawaida huwa chini ya dakika 10. mioyo ilihifadhiwa katika mmumunyo wa moyo wenye baridi-baridi hadi kusafirishwa hadi kwenye maabara kwenye barafu ambayo kwa kawaida huwa chini ya dakika 10. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. Mioyo ilihifadhiwa kwenye suluhisho la baridi la moyo na mishipa hadi kusafirishwa hadi kwenye maabara kwenye barafu, ambayo kawaida huchukua chini ya dakika 10.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟. Держите сердца katika ледяной кардиоплегии до транспортировки katika laбораторию kwenye льду, обычно <10 мин. Weka mioyo kwenye barafu ya moyo hadi usafirishwe kwenye maabara kwenye barafu, kwa kawaida chini ya dakika 10.
Kifaa cha CTCM kilitengenezwa katika programu ya muundo unaosaidiwa na kompyuta ya SolidWorks (CAD).Vyumba vya utamaduni, vigawanyiko na vyumba vya hewa vinafanywa kwa plastiki ya akriliki ya CNC ya wazi.Pete ya chelezo ya kipenyo cha 7mm imeundwa kwa poliethilini yenye msongamano wa juu (HDPE) katikati na ina sehemu ya o-ring ili kubeba pete ya o ya silikoni inayotumika kuziba midia iliyo chini yake.Utando mwembamba wa silika hutenganisha chumba cha utamaduni kutoka kwa sahani ya kujitenga.Utando wa silikoni ni leza iliyokatwa kutoka karatasi nene ya 0.02″ na ina ugumu wa 35A.Gaskets za silikoni za chini na za juu zimekatwa leza kutoka 1/16″ karatasi nene ya silikoni na zina ugumu wa 50A.316L skrubu za chuma cha pua na kokwa za bawa hutumika kwa kufunga kizuizi na kutengeneza muhuri usiopitisha hewa.
Bodi ya mzunguko iliyochapishwa maalum (PCB) imeundwa kuunganishwa na mfumo wa C-PACE-EM.Soketi za kiunganishi cha mashine ya Uswisi kwenye PCB zimeunganishwa na elektrodi za grafiti kwa waya za shaba zilizojaa fedha na screws za shaba 0-60 zilizopigwa kwenye elektroni.Bodi ya mzunguko iliyochapishwa imewekwa kwenye kifuniko cha kichapishi cha 3D.
Kifaa cha CTCM kinadhibitiwa na kipenyo cha nyumatiki kinachoweza kupangwa (PPD) ambacho hutengeneza shinikizo la mzunguko linalodhibitiwa sawa na mzunguko wa moyo.Kadiri shinikizo ndani ya chumba cha hewa inavyoongezeka, utando wa silicone unaonyumbulika hupanuka juu, na kulazimisha kati chini ya tovuti ya tishu.Eneo la tishu basi litapanuliwa na uondoaji huu wa maji, kuiga upanuzi wa kisaikolojia wa moyo wakati wa diastoli.Katika kilele cha kupumzika, msukumo wa umeme ulitumiwa kwa njia ya electrodes ya grafiti, ambayo ilipunguza shinikizo katika chumba cha hewa na kusababisha kupungua kwa sehemu za tishu.Ndani ya bomba ni valve ya hemostatic yenye sensor ya shinikizo ili kuchunguza shinikizo katika mfumo wa hewa.Shinikizo linalohisiwa na kihisi shinikizo linatumika kwa mkusanyaji wa data aliyeunganishwa kwenye kompyuta ya mkononi.Hii inaruhusu ufuatiliaji unaoendelea wa shinikizo ndani ya chumba cha gesi.Wakati shinikizo la juu la chumba lilipofikiwa (kiwango cha 80 mmHg, 140 mmHg OS), kifaa cha kupata data kiliamriwa kutuma mawimbi kwa mfumo wa C-PACE-EM ili kutoa mawimbi ya volteji mbili kwa 2 ms, iliyowekwa kwa 4 V.
Sehemu za moyo zilipatikana na hali ya kitamaduni katika visima 6 ilifanyika kama ifuatavyo: Hamisha mioyo iliyovunwa kutoka kwa chombo cha uhamisho hadi kwenye tray yenye baridi (4 ° C.) cardioplegia.Ventricle ya kushoto ilitengwa na blade ya kuzaa na kukatwa vipande vipande vya 1-2 cm3.Vitalu hivi vya tishu viliambatishwa kwenye viambatisho vya tishu kwa kibandiko cha tishu na kuwekwa kwenye bafu ya tishu inayotetemeka iliyo na myeyusho wa Tyrode na yenye oksijeni inayoendelea (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.101M G-Glukosi), 6 mM KCl (0.101M G-Glukosi ya 0.401) (2.38 g), 1 mm MgCl2 (1 ml 1 M ufumbuzi), 1.8 mM CaCl2 ( 1.8 ml 1 M ufumbuzi), hadi 1 L ddH2O).Maikrotomu inayotetemeka iliwekwa ili kukata vipande vya unene wa µm 300 kwa mzunguko wa 80 Hz, amplitude ya mtetemo mlalo ya mm 2, na kasi ya mapema ya 0.03 mm/s.Bafu ya tishu ilizingirwa na barafu ili kuweka mmumunyo wa baridi na halijoto ilidumishwa kwa 4°C.Hamisha sehemu za tishu kutoka kwa bafu ya microtome hadi bafu ya incubation iliyo na suluhisho la Tyrode yenye oksijeni kila wakati kwenye barafu hadi sehemu za kutosha zipatikane kwa sahani moja ya kitamaduni.Kwa tamaduni za transwell, sehemu za tishu ziliambatishwa kwa vihimili vya poliurethane vyenye kuzaa 6 mm na kuwekwa katika mililita 6 za kati iliyoboreshwa (199 kati, 1x nyongeza ya ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkali na 2X antibiotiki-antifungal).Kichocheo cha umeme (10 V, frequency 1.2 Hz) kilitumika kwa sehemu za tishu kupitia C-Pace.Kwa hali ya TD, T3 mpya na Dex ziliongezwa kwa nM 100 na 1 μM kwa kila mabadiliko ya kati.Ya kati imejaa oksijeni kabla ya uingizwaji mara 3 kwa siku.Sehemu za tishu zilikuzwa katika incubator kwa 37°C na 5% CO2.
Kwa tamaduni za CTCM, sehemu za tishu ziliwekwa kwenye kichapishi cha 3D kilichoundwa maalum katika sahani ya Petri iliyo na suluhu iliyorekebishwa ya Tyrode.Kifaa kimeundwa ili kuongeza ukubwa wa kipande cha moyo kwa 25% ya eneo la pete ya msaada.Hii imefanywa ili sehemu za moyo zisinyooshe baada ya kuhamishwa kutoka kwa suluhisho la Tyrode hadi kati na wakati wa diastole.Kwa kutumia gundi ya histoacrylic, sehemu 300 µm nene ziliwekwa kwenye pete ya kipenyo cha mm 7.Baada ya kupachika sehemu za tishu kwenye pete ya usaidizi, kata sehemu za tishu zilizozidi na urudishe sehemu za tishu zilizoambatishwa kwenye umwagaji wa myeyusho wa Tyrode kwenye barafu (4°C) hadi sehemu za kutosha ziwe zimetayarishwa kwa ajili ya kifaa kimoja.Jumla ya muda wa usindikaji wa vifaa vyote haipaswi kuzidi saa 2.Baada ya sehemu 6 za tishu kuunganishwa kwenye pete zao za usaidizi, kifaa cha CTCM kilikusanyika.Chumba cha utamaduni cha CTCM kinajazwa awali na 21 ml ya kati ya oksijeni kabla.Uhamishe sehemu za tishu kwenye chumba cha utamaduni na uondoe kwa makini Bubbles yoyote ya hewa na pipette.Kisha sehemu ya tishu inaongozwa ndani ya shimo na kushinikizwa kwa upole mahali pake.Hatimaye, weka kofia ya electrode kwenye kifaa na uhamishe kifaa kwenye incubator.Kisha unganisha CTCM kwenye bomba la hewa na mfumo wa C-PACE-EM.Kitendaji cha nyumatiki hufungua na valve ya hewa inafungua CTCM.Mfumo wa C-PACE-EM ulisanidiwa kutoa 4 V kwa 1.2 Hz wakati wa mwendo wa mara mbili kwa 2 ms.Ya kati ilibadilishwa mara mbili kwa siku na electrodes ilibadilishwa mara moja kwa siku ili kuepuka mkusanyiko wa grafiti kwenye electrodes.Ikiwa ni lazima, sehemu za tishu zinaweza kuondolewa kutoka kwa visima vyao vya kitamaduni ili kufukuza Bubbles yoyote ya hewa ambayo inaweza kuwa imeanguka chini yao.Kwa hali ya matibabu ya MT, T3/Dex iliongezwa safi kwa kila badiliko la wastani na 100 nM T3 na 1 μM Dex.Vifaa vya CTCM vilikuzwa katika incubator katika 37°C na 5% CO2.
Ili kupata trajectories iliyopanuliwa ya vipande vya moyo, mfumo maalum wa kamera ulitengenezwa.Kamera ya SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) ilitumiwa na Navitar Zoom 7000 18-108mm lenzi kubwa (Navitar, San Francisco, CA).Taswira ilifanyika kwa joto la kawaida baada ya kubadilisha kati na kati safi.Kamera imewekwa kwa pembe ya 51° na video inarekodiwa kwa fremu 30 kwa sekunde.Kwanza, programu huria (MUSCLEMOTION43) ilitumiwa pamoja na Image-J ili kukadiria mwendo wa vipande vya moyo.Kinyago kiliundwa kwa kutumia MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) ili kufafanua maeneo yanayokuvutia kwa kupiga vipande vya moyo ili kuepuka kelele.Vinyago vilivyogawanywa kwa mikono hutumika kwa picha zote katika mfuatano wa fremu na kisha kupitishwa kwenye programu-jalizi ya MUSCLEMOTION.Muscle Motion hutumia ukubwa wa wastani wa pikseli katika kila fremu ili kubainisha mwendo wake ukilinganisha na fremu ya marejeleo.Data ilirekodiwa, kuchujwa na kutumika kuhesabu muda wa mzunguko na kutathmini kunyoosha kwa tishu wakati wa mzunguko wa moyo.Video iliyorekodiwa ilichakatwa kwa kutumia kichujio cha dijiti cha agizo la kwanza cha awamu ya sifuri.Ili kuhesabu kunyoosha kwa tishu (kilele-hadi-kilele), uchanganuzi wa kilele hadi kilele ulifanywa ili kutofautisha kati ya vilele na vijiti kwenye mawimbi iliyorekodiwa.Kwa kuongeza, uzuiaji unafanywa kwa kutumia polynomial ya 6 ili kuondokana na kuteleza kwa mawimbi.Msimbo wa programu uliundwa katika MATLAB ili kubainisha mwendo wa tishu duniani kote, muda wa mzunguko, muda wa kupumzika, na muda wa kubana (Msimbo wa Mpango wa Ziada 44).
Kwa uchanganuzi wa matatizo, kwa kutumia video zile zile zilizoundwa kwa tathmini ya kunyoosha kimitambo, kwanza tulifuatilia picha mbili zinazowakilisha vilele vya mwendo (sehemu za juu zaidi (za juu) na za chini zaidi (za chini) kulingana na programu ya MUSCLEMOTION.Kisha tuligawanya maeneo ya tishu na kutumia aina ya algorithm ya kivuli kwenye tishu zilizogawanyika (Mchoro wa ziada wa 2a).Kisha tishu zilizogawanywa ziligawanywa katika sehemu ndogo kumi, na mkazo kwenye kila uso ulihesabiwa kwa kutumia usawa ufuatao: Strain = (Sup-Sdown) / Sdown, ambapo Sup na Sdown ni umbali wa sura kutoka juu na chini ya vivuli vya kitambaa, kwa mtiririko huo (Mchoro wa Nyongeza. .2b).
Sehemu za moyo ziliwekwa katika paraformaldehyde 4% kwa masaa 48.Tishu zisizohamishika zilipungukiwa na maji kwa 10% na 20% ya sucrose kwa h 1, kisha katika 30% sucrose usiku mmoja.Kisha sehemu hizo zilipachikwa kwenye kiwanja bora cha kukata joto (kiwanja cha OCT) na hatua kwa hatua kugandishwa katika umwagaji wa barafu wa isopentane/kavu.Hifadhi vizuizi vya kupachika vya OCT kwa -80 °C hadi vitenganishwe.Slaidi zilitayarishwa kama sehemu zenye unene wa 8 μm.
Ili kuondoa OCT kwenye sehemu za moyo, pasha joto slaidi kwenye kizuizi cha joto ifikapo 95 °C kwa dakika 5.Ongeza 1 ml PBS kwa kila slaidi na uangulie kwa dakika 30 kwenye joto la kawaida, kisha penya sehemu kwa kuweka 0.1% Triton-X katika PBS kwa dakika 15 kwenye joto la kawaida.Ili kuzuia kingamwili zisizo maalum kutoka kwa sampuli, ongeza 1 ml ya suluhisho la BSA la 3% kwenye slaidi na uangushe kwa saa 1 kwenye joto la kawaida.BSA iliondolewa kisha slaidi zikaoshwa na PBS.Weka alama kwa kila sampuli kwa penseli.Kingamwili za msingi (zilizopunguzwa 1:200 katika 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) na troponin-T (Thermo F Scientific; #MA5-12960) ziliongezwa kwa zaidi ya dakika 90, kisha kingamwili 4 za panya 12% Alexaluted 1:20. 8 (Thermo Scientific; #A16079), dhidi ya sungura Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) kwa dakika 90 za ziada Nilioshwa mara 3 kwa kutumia PBS Ili kutofautisha upakaji rangi lengwa na mandharinyuma, tulitumia kingamwili ya pili pekee kama kidhibiti. Hatimaye, madoa ya nyuklia ya DAPI yaliongezwa na kuwekwa kwenye vali la vali. -x ukuzaji) na darubini ya Keyence yenye ukuzaji wa 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) yenye 5 μg/ml katika PBS ilitumiwa kutia doa WGA na kutumika kwa sehemu zisizobadilika kwa dakika 30 kwa joto la kawaida.Kisha slaidi zilioshwa na PBS na Sudan nyeusi iliongezwa kwa kila slaidi na kuangaziwa kwa dakika 30.Kisha slaidi zilioshwa na PBS na upachikaji wa vectashield uliongezwa.Slaidi zilionekana kwenye darubini ya Keyence katika ukuzaji wa 40x.
OCT iliondolewa kutoka kwa sampuli kama ilivyoelezwa hapo juu.Baada ya kuondoa OCT, tumbukiza slaidi kwenye suluhisho la Bouin usiku kucha.Kisha slaidi hizo zilioshwa kwa maji yaliyochemshwa kwa saa 1 na kisha kuwekwa kwenye mmumunyo wa fuchsin wa asidi ya Bibrich kwa dakika 10.Kisha slaidi zilioshwa na maji yaliyotengenezwa na kuwekwa kwenye suluhisho la 5% phosphomolybdenum/5% asidi phosphotungstic kwa dakika 10.Bila suuza, uhamishe slaidi moja kwa moja kwenye suluhisho la bluu la aniline kwa dakika 15.Kisha slaidi zilioshwa na maji yaliyosafishwa na kuwekwa kwenye suluhisho la asidi asetiki 1% kwa dakika 2.Slaidi zilikaushwa katika ethanoli 200 N na kuhamishiwa zililini.Slaidi zenye madoa zilionekana kwa kutumia darubini ya Keyence yenye lengo la 10x.Asilimia ya eneo la Fibrosis ilihesabiwa kwa kutumia programu ya Keyence Analyzer.
Uchambuzi wa Uwezo wa Kiini cha CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), nambari ya katalogi V13154, kulingana na itifaki ya mtengenezaji iliyo na marekebisho kadhaa.Hasa, punch ya upasuaji yenye kipenyo cha mm 6 ilitumiwa ili kuhakikisha ukubwa wa tishu sare wakati wa uchambuzi wa MTT.Tishu ziliwekwa ndani ya visima vya sahani yenye visima 12 iliyo na sehemu ndogo ya MTT kulingana na itifaki ya mtengenezaji.Sehemu hizo huingizwa kwenye 37 ° C. kwa saa 3 na tishu hai hubadilisha substrate ya MTT kuunda kiwanja cha zambarau cha formazan.Badilisha mchanganyiko wa MTT na 1 ml DMSO na uangulie kwa 37 °C kwa dakika 15 ili kutoa formazan ya zambarau kutoka kwa sehemu za moyo.Sampuli zilipunguzwa 1:10 katika DMSO katika bati 96 za chini zilizo wazi na kiwango cha rangi ya zambarau kilichopimwa kwa nm 570 kwa kutumia kisoma sahani cha Cytation (BioTek).Masomo yalifanywa kuwa ya kawaida kwa uzito wa kila kipande cha moyo.
Kipande cha habari cha moyo kilibadilishwa na kuwa na 1 μCi/ml [5-3H] -glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) kwa ajili ya kupima matumizi ya glukosi kama ilivyoelezwa hapo awali.Baada ya saa 4 za incubation, ongeza 100 µl ya kati hadi mirija ya wazi ya microcentrifuge iliyo na 100 µl ya 0.2 N HCl.Kisha mrija huo uliwekwa kwenye mirija ya kukamua iliyo na 500 μl ya dH2O ili kuyeyuka [3H]2O kwa saa 72 kwa 37°C.Kisha uondoe tube ya microcentrifuge kutoka kwenye tube ya scintillation na kuongeza 10 ml ya maji ya scintillation.Hesabu za unyakuzi zilifanywa kwa kutumia kichanganuzi cha uchanganuzi wa kioevu cha Tri-Carb 2900TR (Kampuni ya Packard Bioscience, Meriden, CT, USA).Kisha matumizi ya glukosi yalikokotolewa kwa kuzingatia [5-3H] -shughuli maalum ya glukosi, usawaziko usio kamili na usuli, myeyusho wa [5-3H] -hadi glukosi isiyo na lebo, na ufanisi wa kukabiliana na kikocho.Data ni ya kawaida kwa wingi wa sehemu za moyo.
Baada ya kuunganishwa kwa tishu katika Trizol, RNA ilitengwa kutoka kwa sehemu za moyo kwa kutumia Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 kulingana na itifaki ya mtengenezaji.Utayarishaji wa maktaba ya RNAsec, mpangilio na uchambuzi wa data ulifanyika kama ifuatavyo:
1 μg ya RNA kwa kila sampuli ilitumika kama nyenzo ya kuanzia kwa utayarishaji wa maktaba ya RNA.Maktaba za mpangilio zilitolewa kwa kutumia NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) kufuatia mapendekezo ya mtengenezaji, na misimbo ya faharasa iliongezwa kwenye mfuatano wa sifa kwa kila sampuli.Kwa ufupi, mRNA ilisafishwa kutoka kwa jumla ya RNA kwa kutumia shanga za sumaku zilizounganishwa na oligonucleotidi za poly-T.Mgawanyiko unafanywa kwa kutumia migawanyiko katika halijoto ya juu katika NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).CDNA ya uzi wa kwanza iliundwa kwa kutumia vianzilishi vya hexamer nasibu na M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-).CDNA ya mkondo wa pili kisha kuunganishwa kwa kutumia DNA polimasi I na RNase H. Mihimili iliyobaki inabadilishwa kuwa ncha butu kwa shughuli ya exonuclease/polymerase.Baada ya kutengwa kwa mwisho wa 3′ ya kipande cha DNA, Adapta ya NEBNext yenye muundo wa kitanzi cha hairpin inaunganishwa nayo ili kuitayarisha kwa mseto.Kwa uteuzi wa vipande vya cDNA vya urefu uliopendekezwa 150-200 bp.vipande vya maktaba vilisafishwa kwa kutumia mfumo wa AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).Kisha, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) yenye cDNA iliyochaguliwa kwa ukubwa iliyounganishwa na adapta ilitumiwa kwa dakika 15 kwa 37 ° C na kisha kwa dakika 5 kwa 95 ° C kabla ya PCR.Kisha PCR ilifanywa kwa kutumia polimerasi ya DNA ya Phusion High-Fidelity, vianzio vya awali vya PCR, na vianzio vya Index (X).Hatimaye, bidhaa za PCR zilisafishwa (mfumo wa AMPure XP) na ubora wa maktaba ukatathminiwa kwenye mfumo wa Agilent Bioanalyzer 2100.Maktaba ya cDNA kisha ilipangwa kwa kutumia mfuatano wa Novaseq.Faili za picha ghafi kutoka kwa Illumina zilibadilishwa kuwa mbichi za usomaji kwa kutumia Upigaji simu wa CASAVA.Data ghafi huhifadhiwa katika faili za umbizo la FASTQ(fq) zilizo na mfuatano wa kusoma na sifa za msingi zinazolingana.Chagua HISAT2 ili kulinganisha na usomaji wa mpangilio uliochujwa na jenomu ya marejeleo ya Sscrofa11.1.Kwa ujumla, HISAT2 inasaidia jenomu za ukubwa wowote, ikiwa ni pamoja na jenomu kubwa kuliko besi bilioni 4, na maadili chaguo-msingi yamewekwa kwa vigezo vingi.Kugawanya usomaji kutoka kwa data ya RNA Seq kunaweza kupangiliwa vyema kwa kutumia HISAT2, mfumo wa haraka zaidi unaopatikana kwa sasa, kwa usahihi sawa au bora zaidi kuliko njia nyingine yoyote.
Wingi wa nakala huonyesha moja kwa moja kiwango cha usemi wa jeni.Viwango vya usemi wa jeni hutathminiwa na wingi wa manukuu (idadi ya mfuatano) inayohusishwa na jenomu au exons.Idadi ya usomaji inalingana na viwango vya usemi wa jeni, urefu wa jeni, na kina cha mpangilio.FPKM (vipande kwa kila jozi elfu za msingi za nakala zilizopangwa kwa kila jozi za msingi milioni) zilihesabiwa na thamani za P za usemi tofauti ziliamuliwa kwa kutumia kifurushi cha DESeq2.Kisha tulikokotoa kiwango cha ugunduzi wa uwongo (FDR) kwa kila thamani ya P kwa kutumia mbinu ya Benjamini-Hochberg9 kulingana na kazi ya R iliyojengewa ndani "p.adjust".
RNA iliyotengwa na sehemu za moyo ilibadilishwa kuwa cDNA katika mkusanyiko wa 200 ng/μl kwa kutumia mchanganyiko wa SuperScript IV Vilo Master kutoka Thermo (Thermo, cat. no. 11756050).Kiasi cha RT-PCR kilitekelezwa kwa kutumia bamba la athari la uwazi la Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 (Thermo, cat. no. 4483319) na kibandiko cha macho cha microamp (Thermo, cat. no. 4311971).Mchanganyiko wa majibu ulijumuisha 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, paka # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer na 3.5 µl H2O iliyochanganywa kwa kila kisima.Mizunguko ya kawaida ya qPCR iliendeshwa na thamani za CT zilipimwa kwa kutumia kifaa cha PCR cha Applied Biosystems Quantstudio 5 (moduli ya visima 384; bidhaa # A28135).Primers za Taqman zilinunuliwa kutoka Thermo (GAPDH (SS03375629_U1), PARP12 (SS06908795_M1), PKDCC (SS06903874_M1), Cygb (SS06900188_M1) (SS0689 (SS0689 (SS0689 (SS0681818181818188 8_mh), GATA4 (SS03383805_u1), GJA1 (SS03374839_U1), Col1a2 (SS03375009_u1), Col3a1 (SS04323794_m1), ACTA2 (SS0458_EP1 CONPEP1 CORMEP1 CORMEPED Apdh.
Toleo la media la NT-ProBNP lilitathminiwa kwa kutumia kifaa cha NT-ProBNP (nguruwe) (Paka Nambari ya MBS2086979, MyBioSource) kulingana na itifaki ya mtengenezaji.Kwa ufupi, 250 µl za kila sampuli na kiwango ziliongezwa katika nakala kwa kila kisima.Mara tu baada ya kuongeza sampuli, ongeza 50 µl za Assay Reagent A kwa kila kisima.Upole kutikisa sahani na muhuri na sealant.Kisha vidonge viliwekwa kwenye 37 ° C kwa saa 1.Kisha tamanisha suluhisho na osha visima mara 4 kwa 350 µl ya mmumunyo wa safisha wa 1X, kwa kuachilia suluhisho la kuosha kwa dakika 1-2 kila wakati.Kisha ongeza 100 µl za Assay Reagent B kwa kila kisima na utie muhuri kwa sahani.Kompyuta kibao ilitikiswa kwa upole na kuingizwa kwa joto la 37 ° C kwa dakika 30.Aspirate ufumbuzi na osha visima mara 5 na 350 µl ya 1X safisha ufumbuzi.Ongeza 90 µl ya suluhisho la substrate kwa kila kisima na ufunge sahani.Ingiza sahani kwa joto la 37 ° C kwa dakika 10-20.Ongeza 50 µl Stop Solution kwa kila kisima.Sahani ilipimwa mara moja kwa kutumia kisoma sahani cha Cytation (BioTek) kilichowekwa kwenye 450 nm.
Uchanganuzi wa nguvu ulifanywa ili kuchagua ukubwa wa kikundi ambao utatoa >80% nguvu ya kugundua badiliko kamili la 10% kwenye kigezo chenye kiwango cha makosa cha Aina ya 5%. Uchanganuzi wa nguvu ulifanywa ili kuchagua ukubwa wa kikundi ambao utatoa >80% nguvu ya kugundua badiliko kamili la 10% kwenye kigezo chenye kiwango cha makosa cha Aina ya 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружений 10% абеспечат той ошибок типа I. Uchanganuzi wa nguvu ulifanywa ili kuchagua ukubwa wa kikundi ambao ungetoa >80% ya nguvu ili kugundua mabadiliko kamili ya kigezo cha 10% na kiwango cha makosa cha 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения обнаружения 10% абеспечил астоты ошибок типа I. Uchanganuzi wa nguvu ulifanywa ili kuchagua ukubwa wa kikundi ambao utatoa >nguvu 80% ili kugundua mabadiliko kamili ya kigezo cha 10% na kiwango cha makosa cha aina ya 5%.Sehemu za tishu zilichaguliwa bila mpangilio kabla ya jaribio.Uchambuzi wote haukuwa na hali ya upofu na sampuli ziliamuliwa tu baada ya data zote kuchambuliwa.Programu ya GraphPad Prism (San Diego, CA) ilitumika kufanya uchanganuzi wote wa takwimu. Kwa takwimu zote, thamani za p zilizingatiwa kuwa muhimu katika thamani <0.05. Kwa takwimu zote, thamani za p zilizingatiwa kuwa muhimu kwa thamani <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kwa takwimu zote, thamani za p zilizingatiwa kuwa muhimu kwa thamani <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认為是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认為是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kwa takwimu zote, thamani za p zilizingatiwa kuwa muhimu kwa thamani <0.05.Jaribio la T la Mwanafunzi lenye mikia miwili lilifanywa kwenye data kwa ulinganisho 2 pekee.ANOVA ya njia moja au mbili ilitumiwa kubainisha umuhimu kati ya vikundi vingi.Wakati wa kufanya majaribio ya baada ya muda mfupi, masahihisho ya Tukey yalitumika kwa ulinganifu mwingi.Data ya RNAsec ina mazingatio maalum ya kitakwimu wakati wa kukokotoa FDR na p.kurekebisha kama ilivyoelezwa katika sehemu ya Mbinu.
Kwa habari zaidi juu ya muundo wa utafiti, angalia muhtasari wa Ripoti ya Utafiti wa Mazingira iliyounganishwa na nakala hii.