Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி.நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவிப் பதிப்பில் CSS க்கு மட்டுப்படுத்தப்பட்ட ஆதரவே உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்திற்காக, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் பொருந்தக்கூடிய பயன்முறையை முடக்கவும்).இதற்கிடையில், தொடர் ஆதரவை உறுதிசெய்ய, ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் தளத்தைக் காண்பிப்போம்.
மனித குடல் மார்போஜெனீசிஸ், 3D எபிடெலியல் மைக்ரோஆர்கிடெக்சர் மற்றும் ஸ்பேஷியல் அமைப்பின் கிரிப்ட்-வில்லஸ் அம்சங்களை நிறுவுகிறது. இந்த தனித்துவமான அமைப்பு குடல் ஹோமியோஸ்டாசிஸை பராமரிக்க தேவைப்படுகிறது, இதன் மூலம் அடித்தளத்தில் உள்ள ஸ்டெம் செல் இடத்தை வெளிப்புற நுண்ணுயிர் ஆன்டிஜென்கள் மற்றும் அவற்றின் வளர்சிதை மாற்றங்களிலிருந்து பாதுகாக்கிறது. மியூகோசல் மேற்பரப்பு.எனவே, 3D எபிடெலியல் கட்டமைப்புகளை மீண்டும் உருவாக்குவது இன் விட்ரோ குட் மாடல்களின் கட்டுமானத்திற்கு முக்கியமானது.குறிப்பாக, ஆர்கானிக் மைமெடிக் குட்-ஆன்-எ-சிப், குடல் எபிட்டிலியத்தின் தன்னிச்சையான 3D மார்போஜெனீசிஸைத் தூண்டலாம். மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் சில்லு மற்றும் டிரான்ஸ்வெல் உட்பொதிக்கப்பட்ட ஹைப்ரிட் சிப்பில் குடலில் உள்ள tinal morphogenesis. சாதனத் தயாரிப்பு, Caco-2 அல்லது குடல் ஆர்கனாய்டு எபிடெலியல் செல்களை வளர்ப்பதற்கான விரிவான முறைகளை நாங்கள் விவரிக்கிறோம். நெறிமுறையானது, 5 dக்கு basolateral திரவ ஓட்டத்தை கட்டுப்படுத்துவதன் மூலம் செயல்பாட்டு குடல் நுண்ணிய கட்டமைப்பின் மீளுருவாக்கம் அடைகிறது. நமது in vitro morphogenesis முறையானது உடலியல் ரீதியாக பொருத்தமான வெட்டு அழுத்தம் மற்றும் இயந்திர இயக்கத்தை பயன்படுத்துகிறது மற்றும் சிக்கலான செல் பொறியியல் அல்லது கையாளுதல் தேவையில்லை. பயோமெடிக்கல், கிளினிக்கல் மற்றும் பார்மசூட்டிக்கல் பயன்பாடுகளுக்கான விட்ரோவில் உள்ள எபிடெலியல் அடுக்குகள்.
குட்-ஆன்-ஏ-சிப்1,2,3,4,5 அல்லது பைலேயர் மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் சாதனங்கள்6,7 ஆகியவற்றில் வளர்க்கப்பட்ட குடல் எபிடெலியல் Caco-2 செல்கள், அடிப்படை பொறிமுறையைப் பற்றிய தெளிவான புரிதல் இல்லாமல் தன்னிச்சையான 3D மார்போஜெனீசிஸுக்கு உட்படுத்தப்படலாம் என்பதை சோதனைகள் நிரூபிக்கின்றன. டியூஸ் 3டி எபிடெலியல் மார்போஜெனீசிஸ் இன் விட்ரோ, இது காகோ-2 மற்றும் நோயாளி-பெறப்பட்ட குடல் ஆர்கனாய்டுகளால் நிரூபிக்கப்பட்டது.எபிதீலியல் செல்கள் சரிபார்க்கப்பட்டன. இந்த ஆய்வில், "ஹைப்ரிட் சிப்" என அழைக்கப்படும் டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளைக் கொண்ட குட்-ஆன்-எ-சிப் மற்றும் மாற்றியமைக்கப்பட்ட மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் சாதனங்களில், ஒரு சக்திவாய்ந்த Wnt எதிரியான Dickkopf-1 (DKK-1) செல் உற்பத்தி மற்றும் செறிவு விநியோகத்தில் நாங்கள் குறிப்பாக கவனம் செலுத்தினோம். 1, சுரக்கும் ஃப்ரிஸ்ல்ட் தொடர்பான புரதம் 1, அல்லது சோகி-1) ஆன்-சிப் குடலுக்கு மார்போஜெனீசிஸைத் தடுக்கிறது அல்லது முன்கட்டமைக்கப்பட்ட 3D எபிடெலியல் அடுக்கை சீர்குலைக்கிறது. சுறுசுறுப்பான ஃப்ளஷிங் (எ.கா., குடல்-ஆன்-எ-சிப் அல்லது ஹைப்ரிட்-ஆன்-எ-சிப் இயங்குதளங்களில்) அல்லது பரவல் .பாசோலேட்டரல் மீடியா (எ.கா., கிணறுகளில் உள்ள பெரிய பாசோலேட்டரல் நீர்த்தேக்கங்களில் டிரான்ஸ்வெல் செருகுவது) மூலம் பாசோலேட்டரல் பெட்டியில் Wnt எதிரிகளின் அளவை பராமரிக்கவும்.
இந்த நெறிமுறையில், பாலிடிமெதில்சிலோக்சேன் (PDMS)-அடிப்படையிலான நுண்துளை சவ்வுகளில் (6A, 9A, 9A, 9A, 9A, 9-வது பாலிவெல்லஸ்ட் மெம்பரன்ஸ்) அடிப்படையிலான குடல் எபிடெலியல் செல்களை வளர்ப்பதற்கு, குட்-ஆன்-எ-சிப் மைக்ரோ டிவைஸ்கள் மற்றும் டிரான்ஸ்வெல்-இன்சர்ட்டபிள் ஹைப்ரிட் சிப்ஸ் (படிகள் 1-5) ஆகியவற்றை உருவாக்குவதற்கான விரிவான முறையை நாங்கள் வழங்குகிறோம். s 6B, 7B, 8, 9) மற்றும் தூண்டப்பட்ட 3D morphogenesis in vitro (படி 10). பல இமேஜிங் முறைகளைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் திசு-குறிப்பிட்ட ஹிஸ்டோஜெனீசிஸ் மற்றும் பரம்பரை சார்ந்த செல்லுலார் வேறுபாட்டைக் குறிக்கும் செல்லுலார் மற்றும் மூலக்கூறு அம்சங்களையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படிகள் அல் ஆர்கனாய்டுகள், நுண்ணிய சவ்வுகளின் மேற்பரப்பு மாற்றம், 2டி மோனோலேயர்களை உருவாக்குதல், மற்றும் குடல் உயிர்வேதியியல் மற்றும் பயோமெக்கானிக்கல் மைக்ரோ என்விரோன்மென்ட்டின் இனப்பெருக்கம் உள்ளிட்ட தொழில்நுட்ப விவரங்களுடன் இரண்டு கலாச்சார வடிவங்களில். கலாச்சாரத்தின் பிரிவு.இறுதியாக, மார்போஜென் சார்ந்த எபிதீலியல் வளர்ச்சி, நீளமான ஹோஸ்ட்-மைக்ரோபயோம் இணை கலாச்சாரங்கள், நோய்க்கிருமி தொற்று, அழற்சி காயம், எபிதீலியல் தடை செயலிழப்பு, மற்றும் புரோபயாடிக் அடிப்படையிலான சிகிச்சைகள் போன்றவற்றை மாதிரியாக மாற்றக்கூடிய மீளுருவாக்கம் செய்யக்கூடிய 3D எபிடெலியல் லேயரின் பயன்பாட்டின் பிரதிநிதித்துவத்தை நாங்கள் வழங்குகிறோம்.
எங்கள் நெறிமுறை அடிப்படை (எ.கா., குடல் மியூகோசல் உயிரியல், ஸ்டெம் செல் உயிரியல் மற்றும் வளர்ச்சி உயிரியல்) மற்றும் பயன்பாட்டு ஆராய்ச்சி (எ.கா., முன் மருத்துவ பரிசோதனை, நோய் மாதிரி, திசு பொறியியல் மற்றும் இரைப்பை குடல்) பரந்த அளவிலான விஞ்ஞானிகளுக்கு பயனுள்ளதாக இருக்கும். குடல் வளர்ச்சி, மீளுருவாக்கம் அல்லது ஹோமியோஸ்டாஸிஸ் ஆகியவற்றின் போது செல் சிக்னலின் இயக்கவியலைப் படிக்கும் பார்வையாளர்களுக்கு எங்கள் தொழில்நுட்ப உத்தியைப் பரப்ப முடியும். கூடுதலாக, நோரோவைரஸ் 8, கடுமையான கடுமையான சுவாச நோய்க்குறி Coronavirus 2 (SalkV-2SARS-9) போன்ற பல்வேறு தொற்று முகவர்களின் கீழ் தொற்றுநோயை விசாரிப்பதற்கு எங்கள் நெறிமுறை பயனுள்ளதாக இருக்கும். பிரியோ காலரா.நோய் நோயியல் மற்றும் நோய்க்கிருமி உருவாக்கம் பார்வையாளர்களும் பயனுள்ளதாக இருக்கும். ஆன்-சிப் குடல் நுண்ணுயிர் இயற்பியல் அமைப்பின் பயன்பாடு, நீளமான இணை-பண்பாடு 10 மற்றும் இரைப்பை குடல் (ஜிஐ) பாதையில் புரவலன் பாதுகாப்பு, நோயெதிர்ப்பு மறுமொழிகள் மற்றும் நோய்க்கிருமி தொடர்பான காயங்களை சரிசெய்தல் 11 .இதர ஜி.ஐ. பெருங்குடல் அழற்சி, பூசிடிஸ் அல்லது எரிச்சல் கொண்ட குடல் நோய்க்குறி நோயாளியின் 3D குடல் எபிடெலியல் அடுக்குகளைப் பயன்படுத்தி 3D குடல் எபிடெலியல் அடுக்குகளைத் தயாரிக்கும்போது உருவகப்படுத்தப்படலாம், இந்த நோய்களில் வில்லிஸ் அட்ராபி, க்ரிப்ட் ஷார்ட்டனிங், மியூகோசல் சேதம், அல்லது பலவீனமான எபிதீலியல் தடுப்பு அல்லது உறுப்புகளின் தசைநார் தடுப்பு மாதிரிகள். நோய் சூழலின் அதிக சிக்கலானது, நோயாளியின் புற இரத்த மோனோநியூக்ளியர் செல்கள் (பிபிஎம்சி) போன்ற நோய் தொடர்பான உயிரணு வகைகளை 3D குடல் வில்லஸ்-கிரிப்ட் மைக்ரோஆர்கிடெக்சர்கள் கொண்ட மாதிரிகளில் சேர்ப்பதை வாசகர்கள் பரிசீலிக்கலாம்.திசு சார்ந்த நோயெதிர்ப்பு செல்கள், 5.
3D எபிடெலியல் மைக்ரோஸ்ட்ரக்சரை சரிசெய்து காட்சிப்படுத்த முடியும் என்பதால், ஸ்பேஷியல் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் உயர் தெளிவுத்திறன் அல்லது சூப்பர் ரெசல்யூஷன் இமேஜிங் ஆகியவற்றில் பணிபுரியும் பார்வையாளர்கள், எபிதீலியல் இடங்களில் மரபணுக்கள் மற்றும் புரதங்களின் இடஞ்சார்ந்த இயக்கவியலின் மேப்பிங்கில் ஆர்வமாக இருக்கலாம்.தொழில்நுட்பத்தில் ஆர்வம். நுண்ணுயிர் அல்லது நோயெதிர்ப்பு தூண்டுதல்களுக்கு பதில். மேலும், குடல் ஹோமியோஸ்டாசிஸை ஒருங்கிணைக்கும் நீளமான புரவலன்-மைக்ரோபயோம் க்ரோஸ்டாக் 10, 14 பல்வேறு நுண்ணுயிர் இனங்கள், நுண்ணுயிர் சமூகங்கள் அல்லது மல- நுண்ணுயிரிகளில் இணைந்து வளர்ப்பதன் மூலம் 3D குடல் மியூகோசல் அடுக்கில் நிறுவப்படலாம்.மேடையில்.இந்த அணுகுமுறை, ஆய்வகத்தில் முன்னர் கலாச்சாரமற்ற குடல் நுண்ணுயிரிகளை வளர்க்க முயலும் மியூகோசல் இம்யூனாலஜி, காஸ்ட்ரோஎன்டாலஜி, மனித நுண்ணுயிர், கலாச்சாரம் மற்றும் மருத்துவ நுண்ணுயிரியல் ஆகியவற்றைப் படிக்கும் பார்வையாளர்களை ஈர்க்கிறது. ly basolateral பெட்டிகளை நிரப்ப, இந்த நெறிமுறை உணவுத் துறைக்கான மருந்து, உயிரி மருத்துவ அல்லது உயர்-செயல்திறன் திரையிடல் அல்லது சரிபார்ப்பு தளங்களை உருவாக்குபவர்களுக்கும் பரப்பப்படலாம். கொள்கையின் ஆதாரமாக, மல்டிபிளக்ஸ் உயர்-செயல்திறன் morphogenesis அமைப்புக்கு மல்டிபிளெக்ஸ் உயர்-செயல்திறன் morphogenesis அமைப்புக்கான சாத்தியத்தை சமீபத்தில் நாங்கள் நிரூபித்தோம். 16,17,18 வணிகமயமாக்கப்பட்டது.எனவே, எங்கள் இன் விட்ரோ மார்போஜெனீசிஸ் முறையின் சரிபார்ப்பை துரிதப்படுத்தலாம் மற்றும் பல ஆராய்ச்சி ஆய்வகங்கள், தொழில்துறை அல்லது அரசாங்கம் மற்றும் ஒழுங்குமுறை முகமைகள் மூலம் இன் விட்ரோ குட் மார்போஜெனீசிஸின் செல்லுலார் மறுபிரசுரம் புரிந்து கொள்ள முடியும். குடல் மார்போஜெனீசிஸ் செயல்முறையின் மறுஉற்பத்தித்திறனை மதிப்பிடுவதற்கு ரோகேட்ஸ் அல்லது தனிப்பயன் அல்லது வணிக உறுப்பு-ஆன்-எ-சிப் மாதிரிகளைப் பயன்படுத்துதல்.
குடல் எபிடெலியல் மார்போஜெனீசிஸைப் படிக்க குறைந்த எண்ணிக்கையிலான மனித சம்பந்தப்பட்ட சோதனை மாதிரிகள் பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளன, முக்கியமாக விட்ரோவில் 3D மார்போஜெனீசிஸைத் தூண்டுவதற்கு செயல்படுத்தக்கூடிய நெறிமுறைகள் இல்லாததால், குடல் மார்போஜெனீசிஸ் பற்றிய தற்போதைய அறிவு பெரும்பாலானவை விலங்கு ஆய்வுகளின் அடிப்படையில் உள்ளது (எ.கா. நெறிமுறை ரீதியாக கேள்விக்குரியதாக இருக்க வேண்டும், மிக முக்கியமாக, மனித வளர்ச்சி செயல்முறைகளை துல்லியமாக தீர்மானிக்க வேண்டாம். இந்த மாதிரிகள் பல வழிகளில் அளவிடக்கூடிய முறையில் சோதிக்கப்படும் திறனில் மிகவும் குறைவாகவே உள்ளன. எனவே, விட்ரோவில் 3D திசு கட்டமைப்புகளை மீளுருவாக்கம் செய்வதற்கான எங்கள் நெறிமுறை, vivo விலங்கு மாதிரிகள் மற்றும் பிற பாரம்பரிய நிலையான 2D செல் கலாச்சாரங்களை நாங்கள் விவரிக்கிறது. பல்வேறு மியூகோசல் அல்லது நோயெதிர்ப்பு தூண்டுதல்களுக்கு பதிலளிக்கும் வகையில் க்ரிப்ட்-வில்லஸ் அச்சில் உள்ள வேறுபட்ட உயிரணுக்களின் இடஞ்சார்ந்த உள்ளூர்மயமாக்கல். குடல் மைக்ரோபயோட்டா அதன் சமூகங்களை எவ்வாறு கட்டமைக்கிறது மற்றும் சினெர்ஜிஸ்டிக் முறையில் நுண்ணுயிர் வளர்சிதை மாற்றங்களை (எ.கா., குறுகிய சங்கிலி கொழுப்பு அமிலங்கள்) உருவாக்குகிறது, அவை செல்லுலார் அமைப்பு மற்றும் அடித்தள கிரிப்ட்களில் உள்ள ஸ்டெம் செல் இடங்களை வடிவமைக்கின்றன.
3D குடல் எபிடெலியல் கட்டமைப்புகளை உருவாக்கும் எங்கள் முறைக்கு கூடுதலாக, பல சோதனை முறைகள் உள்ளன. குடல் ஆர்கனாய்டு கலாச்சாரம் என்பது ஒரு அதிநவீன திசு பொறியியல் நுட்பமாகும், இது குறிப்பிட்ட மார்போஜென் நிலைமைகளின் கீழ் குடல் ஸ்டெம் செல்களை வளர்ப்பதை அடிப்படையாகக் கொண்டது. ஆர்கனாய்டுக்குள் இணைக்கப்பட்டுள்ளது, எனவே, நுண்ணுயிர் செல்கள் அல்லது வெளிப்புற ஆன்டிஜென்கள் போன்ற லுமினல் கூறுகளின் அறிமுகம் குறைவாக உள்ளது.ஆர்கனாய்டு லுமன்களுக்கான அணுகலை மைக்ரோஇன்ஜெக்டரைப் பயன்படுத்தி மேம்படுத்தலாம், 26,27 ஆனால் இந்த முறை ஆக்கிரமிப்பு மற்றும் உழைப்பு மிகுந்தது மற்றும் அதைச் செயல்படுத்த சிறப்பு அறிவு தேவைப்படுகிறது. மேலும், நிலையான நிலைமைகளின் கீழ் ஹைட்ரஜல் சாரக்கட்டுகளில் பராமரிக்கப்படும் பாரம்பரிய ஆர்கனாய்டு கலாச்சாரங்கள் விவோ பயோமெக்கானிக்ஸில் செயலில் உள்ளதை துல்லியமாக பிரதிபலிக்காது.
பல ஆராய்ச்சி குழுக்களால் பயன்படுத்தப்படும் பிற அணுகுமுறைகள், ஜெல் மேற்பரப்பில் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மனித குடல் செல்களை வளர்ப்பதன் மூலம் குடல் எபிடெலியல் கட்டமைப்பைப் பிரதிபலிக்கும் முன் கட்டமைக்கப்பட்ட 3D ஹைட்ரஜல் சாரக்கட்டுகளைப் பயன்படுத்துகின்றன. சாரக்கட்டில் உள்ள ஸ்ட்ரோமல் செல்களைச் சேர்ப்பதன் மூலம் உயர் விகித எபிடெலியல் அமைப்பு மற்றும் ஸ்ட்ரோமா-எபிடெலியல் க்ரோஸ்டாக் ஆகியவற்றை பொருத்தமான மார்போஜென் சாய்வுகள் நிறுவுதல் morphogenesis மற்றும் உடலியல் செயல்பாட்டைப் பெறுகிறது.மற்றொரு சமீபத்திய ஆய்வு ஹைட்ரஜல் சாரக்கட்டுகளை மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் மேடையில் பயன்படுத்தியது மற்றும் லேசர்-பொறித்தல் நுட்பங்களைப் பயன்படுத்தி வடிவமைக்கப்பட்ட குடல் எபிடெலியல் கட்டமைப்புகள் தன்னிச்சையான morphogenetic செயல்முறைகள் அல்லது குடல் இயக்கவியல் இயக்கங்களை உள்ளடக்கியது இல்லை. அதே குழுவில் இருந்து 3D அச்சிடும் நுட்பங்கள் தன்னிச்சையான மார்போஜெனடிக் செயல்முறைகளுடன் சிறிய குடல் குழாய்களை உருவாக்க முடிந்தது. குழாயினுள் பல்வேறு குடல் பிரிவுகளின் சிக்கலான புனைகதை இருந்தபோதிலும், இந்த மாதிரியானது லுமினல் திரவ ஓட்டம் இல்லாமல், குறிப்பாக உயிரியல் சிதைவு மாதிரியாக இருக்கலாம். பிங் சோதனை நிலைமைகள் அல்லது செல்-டு-செல் இடைவினைகள். அதற்கு பதிலாக, எங்களின் முன்மொழியப்பட்ட நெறிமுறை தன்னிச்சையான குடல் மார்போஜெனீசிஸ், உடலியல் ரீதியாக பொருத்தமான வெட்டு அழுத்தம், குடல் இயக்கத்தை பிரதிபலிக்கும் பயோமெக்கானிக்ஸ், சுயாதீன நுனி மற்றும் பாசோலேட்டரல் பெட்டிகளின் அணுகல் மற்றும் சிக்கலான உயிரியல் நுண்ணுயிரிகளின் மறு உருவாக்கம் ஆகியவற்றை வழங்குகிறது. ஏற்கனவே உள்ள முறைகளின் சவால்களை சமாளிக்க ஒரு நிரப்பு அணுகுமுறையை வழங்குதல்.
எங்களின் நெறிமுறை முழுவதுமாக 3D எபிடெலியல் மார்போஜெனீசிஸில் கவனம் செலுத்துகிறது, கலாச்சாரத்தில் எபிடெலியல் செல்கள் மட்டுமே உள்ளன மற்றும் மெசன்கிமல் செல்கள், எண்டோடெலியல் செல்கள் மற்றும் நோயெதிர்ப்பு செல்கள் போன்ற வேறு எந்த வகையான சுற்றியுள்ள செல்கள் இல்லை. முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி, எங்கள் நெறிமுறையின் மையமானது எபிதீலியல் மார்போஜெனீசிஸைத் தூண்டுவதாகும். எங்களின் குடல்-ஆன்-எ-சிப் மற்றும் ஹைப்ரிட்-ஆன்-எ-சிப்பின் மட்டுப்படுத்தல், அலையில்லாத 3D எபிதீலியல் லேயரை மீண்டும் உருவாக்க அனுமதிக்கிறது, கூடுதல் உயிரியல் சிக்கல்களான எபிதீலியல்-மெசன்கிமல் இன்டராக்ஷன்ஸ்33,34, எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் மேட்ரிக்ஸ் (ஈசிஎம்) படிவு 35 மற்றும், எங்கள் மாதிரியில், க்ரிப்ட்-வெலிச் செல் அம்சங்கள் மேலும் கிரிப்ட்-வெலிச் செல் அம்சங்களாகக் கருதப்படுகின்றன. மெசன்கைமில் உள்ள tromal செல்கள் (எ.கா., ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள்) ECM புரதங்களின் உற்பத்தி மற்றும் vivo35,37,38 இல் குடல் மார்போஜெனீசிஸை ஒழுங்குபடுத்துவதில் முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன. எங்கள் மாதிரியில் மெசன்கிமல் செல்கள் சேர்ப்பது மார்போஜெனடிக் செயல்முறையை மேம்படுத்துகிறது மற்றும் செல் இணைப்பு திறன் அல்லது உள்நோக்கிப் போக்குவரத்தில் முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது. 9 மற்றும் குடல் நுண்ணிய சூழலில் நோயெதிர்ப்பு உயிரணு ஆட்சேர்ப்பு 40. மேலும், திசு மாதிரிகள் பல உறுப்பு தொடர்புகளை நிரூபிக்க வடிவமைக்கப்படும் போது திசு மாதிரிகள் இடையே இணைக்கப்படக்கூடிய வாஸ்குலேச்சர் கூறுகள் ஒரு முன்நிபந்தனையாகும். எனவே, எண்டோடெலியல் செல்கள் மிகவும் துல்லியமான உடலியல் அம்சங்களை மாதிரியாக சேர்க்க வேண்டும். தகவமைப்பு நோயெதிர்ப்பு க்ரோஸ்டாக், மற்றும் குடல் நோயைப் பிரதிபலிக்கும் சூழலில் திசு-குறிப்பிட்ட நோய் எதிர்ப்பு சக்தி ஆகியவற்றை சாப்பிட்டது.
கலப்பின சில்லுகளின் பயன்பாடு குட்-ஆன்-எ-சிப்பை விட நேரடியானது, ஏனெனில் சாதன அமைப்பு எளிமையானது மற்றும் டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களின் பயன்பாடு குடல் எபிட்டிலியத்தை அளவிடக்கூடிய கலாச்சாரத்தை அனுமதிக்கிறது. இருப்பினும், பாலியஸ்டர் சவ்வுகளுடன் வணிக ரீதியாக கிடைக்கக்கூடிய டிரான்ஸ்வெல் செருகல்கள் மீள்தன்மை கொண்டவை அல்ல, மேலும் பெரிஸ்டால்டிக் போன்ற மாற்றங்களை மாற்றியமைக்க முடியாது. ஹைப்ரிட் சிப், நுனிப் பகுதியில் எந்த அழுத்தமும் இல்லாமல் நிலையாக இருந்தது. தெளிவாக, நுனிப் பெட்டியில் உள்ள நிலையான பண்புகள், ஹைப்ரிட் சில்லுகளில் நீண்ட கால பாக்டீரியல் இணை கலாச்சாரத்தை அரிதாகவே செயல்படுத்துகின்றன. சாத்தியமான பயன்பாடுகளுக்கான கலப்பின சிப் தளங்களின் சாத்தியம்.
குட்-ஆன்-எ-சிப் மற்றும் ஹைப்ரிட்-ஆன்-எ-சிப் கலாச்சாரங்களில் மனித கிரிப்ட்-வில்லஸ் அச்சின் முழு அளவிலான புனரமைப்புகள் முழுமையாக நிறுவப்படவில்லை. மார்போஜெனீசிஸ் ஒரு எபிடெலியல் மோனோலேயரில் இருந்து தொடங்குவதால், 3D மைக்ரோஆர்கிடெக்சர்கள் கிரிப்ட்களின் உயிரணுக்களுக்கு அருகில் உள்ள உயிரணுக்களின் உருவ ஒற்றுமையை வழங்க வேண்டிய அவசியமில்லை. மைக்ரோ என்ஜினீயரிங் செய்யப்பட்ட 3D எபிட்டிலியத்தில் உள்ள டொமைன், கிரிப்ட் மற்றும் வில்லஸ் பகுதிகள் தெளிவாக வரையறுக்கப்படவில்லை. சிப்பில் உள்ள உயர் மேல் சேனல்கள் மைக்ரோ என்ஜினீயரிங் எபிட்டிலியத்தின் உயரத்தை அதிகரிக்க வழிவகுத்தாலும், அதிகபட்ச உயரம் இன்னும் ~300-400 µm வரை மட்டுமே உள்ளது. மனித குடலின் உண்மையான ஆழம் 300 µm ஆகும். µm, முறையே, மற்றும் சிறுகுடல் வில்லியின் உயரம் ~600 µm41 ஆகும்.
ஒரு இமேஜிங் நிலைப்பாட்டில், 3D மைக்ரோஆர்கிடெக்சர்களின் சிட்டு சூப்பர்-ரெசல்யூஷன் இமேஜிங் ஒரு சிப்பில் உள்ள குடலுக்கு மட்டுப்படுத்தப்படலாம், ஏனெனில் புறநிலை லென்ஸிலிருந்து எபிடெலியல் அடுக்குக்கு தேவையான வேலை தூரம் சில மில்லிமீட்டர்களின் வரிசையில் உள்ளது. இந்த சிக்கலைச் சமாளிக்க, ஒரு தொலைதூர நோக்கம் தேவைப்படலாம். DMS.மேலும், ஒரு சிப்பில் உள்ள குடலின் அடுக்கு-மூலம்-அடுக்கு மைக்ரோ ஃபேப்ரிகேஷன் ஒவ்வொரு அடுக்குக்கும் இடையே நிரந்தர ஒட்டுதலை உள்ளடக்கியிருப்பதால், மேல் அடுக்கைத் திறப்பது அல்லது அகற்றுவது என்பது மிகவும் சவாலானது.
PDMS இன் ஹைட்ரோபோபிசிட்டி, ஹைட்ரோபோபிக் சிறிய மூலக்கூறுகளைக் கையாளும் மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் அடிப்படையிலான ஆய்வுகளில் ஒரு வரம்புக்குட்பட்ட காரணியாக உள்ளது, ஏனெனில் PDMS அத்தகைய ஹைட்ரோபோபிக் மூலக்கூறுகளை குறிப்பில்லாமல் உறிஞ்சும். PDMS க்கு மாற்றுகள் மற்ற பாலிமெரிக் பொருட்களுடன் பரிசீலிக்கப்படலாம். 43) ஹைட்ரோபோபிக் மூலக்கூறுகளின் உறிஞ்சுதலைக் குறைக்கலாம்.
இறுதியாக, எங்கள் முறையானது உயர்-செயல்திறன் திரையிடல் அல்லது "ஒரே அளவு-பொருந்தும்-அனைத்தும்" பயனர்-நட்பு சோதனை தளத்தை வழங்குவதில் நன்கு வகைப்படுத்தப்படவில்லை. தற்போதைய நெறிமுறைக்கு ஒரு மைக்ரோ சாதனத்திற்கு ஒரு சிரிஞ்ச் பம்ப் தேவைப்படுகிறது, இது ஒரு CO2 இன்குபேட்டரில் இடத்தை எடுத்துக்கொள்கிறது மற்றும் பெரிய அளவிலான சோதனைகளைத் தடுக்கிறது. இந்த வரம்பு கணிசமாக மேம்படுத்தப்படலாம். 384-நன்கு நுண்துளை செருகல்கள் தொடர்ச்சியான நிரப்புதல் மற்றும் பாசோலேட்டரல் மீடியாவை அகற்ற அனுமதிக்கின்றன).
விட்ரோவில் மனித குடல் எபிட்டிலியத்தின் 3D மார்போஜெனீசிஸைத் தூண்டுவதற்கு, லுமன்-கேபிலரி இடைமுகத்தை உருவாக்க, இரண்டு இணையான மைக்ரோ சேனல்கள் மற்றும் ஒரு மீள் நுண்ணிய சவ்வு ஆகியவற்றைக் கொண்ட மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் சிப் குடல் சாதனத்தைப் பயன்படுத்தினோம். டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களில் வளர்க்கப்படும் எபிடெலியல் அடுக்குகள். இரண்டு தளங்களிலும், பல்வேறு மனித குடல் எபிடெலியல் செல்களின் மார்போஜெனீசிஸ், basolateral பெட்டியில் இருந்து morphogen எதிரிகளை அகற்ற, ஓட்டத்தின் திசைக் கையாளுதலைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் நிரூபிக்கப்படலாம். முழு சோதனை செயல்முறையும் (படம் 1) ஐந்து பகுதிகளைக் கொண்டுள்ளது (படம் 1) eps 1-5; பெட்டி 1), (ii) குடல் எபிடெலியல் செல்கள் (Caco-2 செல்கள்) அல்லது மனித குடல் ஆர்கனாய்டுகள் தயாரித்தல்;பெட்டிகள் 2-5), (iii) குடல் சில்லுகள் அல்லது ஹைப்ரிட் சில்லுகளில் உள்ள குடல் எபிடெலியல் செல்களின் கலாச்சாரம் (படிகள் 6-9), (iv) விட்ரோவில் 3D மார்போஜெனீசிஸின் தூண்டல் (படி 10) மற்றும் (v) ) 3D எபிடெலியல் நுண்ணிய கட்டமைப்பை வகைப்படுத்துதல். ) எபிடெலியல் மார்போஜெனீசிஸை இடஞ்சார்ந்த, தற்காலிக, நிபந்தனை அல்லது நடைமுறைக் கட்டுப்பாடுகளுடன் ஒப்பிடுவதன் மூலம் இன் விட்ரோ மார்போஜெனீசிஸின் செயல்திறனை சரிபார்க்க வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது.
நாங்கள் இரண்டு வெவ்வேறு கலாச்சார தளங்களைப் பயன்படுத்தினோம்: நேரான சேனல்கள் அல்லது நேரியல் அல்லாத சுருண்ட சேனல்கள் கொண்ட குட்-ஆன்-எ-சிப் அல்லது மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் சாதனத்தில் டிரான்ஸ்வெல் (TW) செருகல்களைக் கொண்ட ஹைப்ரிட் சில்லுகள், பெட்டி 1 இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி புனையப்பட்டது, மற்றும் படி 1 -5.”டிவைஸ் ஃபேப்ரிகேஷன்” ஒற்றை மனித சிப் அல்லது சிப்செல் சிப் தயாரிப்பதற்கான முக்கிய படிகளைக் காட்டுகிறது.” இந்த நெறிமுறையில் பயன்படுத்தப்படும் செல் ஆதாரம் (Caco-2 அல்லது மனித குடல் ஆர்கனாய்டுகள்) மற்றும் கலாச்சார செயல்முறை.” In vitro morphogenesis” ஆனது Caco-2 அல்லது ஆர்கனாய்டு-பெறப்பட்ட எபிடெலியல் செல்கள் ஒரு குடல் சில்லு அல்லது டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களில் வளர்க்கப்படும் ஒட்டுமொத்த படிகளைக் காட்டுகிறது. ஒவ்வொரு அம்புக்குறியின் கீழும் படி எண் அல்லது பெட்டி எண் காட்டப்படும். செல் வேறுபாட்டின் குணாதிசயம், குடல் உடலியல் ஆய்வுகள், ஹோஸ்ட்-மைக்ரோபயோம் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளை நிறுவுதல் மற்றும் நோய் மாடலிங் ஆகியவற்றில் நிறுவப்பட்ட குடல் எபிடெலியல் அடுக்குகளை எவ்வாறு பயன்படுத்தலாம் என்பதற்கான எடுத்துக்காட்டுகளை பயன்பாடு வழங்குகிறது. குடல் சிப்பில் உருவாக்கப்படும் ஒரு அடுக்கு. MUC2 சிக்னலிங் கோப்லெட் செல்கள் மற்றும் மியூகோசல் பரப்புகளில் இருந்து சுரக்கும் சளி ஆகியவற்றில் உள்ளது. குடல் உடலியலில் உள்ள ஃப்ளோரசன்ட் படங்கள், சியாலிக் அமிலம் மற்றும் என்-அசிடைல்குளுகோசமைன் எச்சங்களை கறைபடுத்துவதன் மூலம் உற்பத்தி செய்யப்படும் சளியைக் காட்டுகின்றன. ஒரு சிப்பில் உள்ள குடலில் உள்ள ative host-microbiome co-cultures. இடது குழு E. coli இன் இணை கலாச்சாரத்தை காட்டுகிறது ) மற்றும் கருக்கள் (நீலம்).நோய் மாதிரியாக்கம், பாக்டீரியா ஆன்டிஜென்கள் (எ.கா., லிப்போபோலிசாக்கரைடு, எல்.பி.எஸ்) மற்றும் நோயெதிர்ப்பு செல்கள் (எ.கா., பிபிஎம்சி;பச்சை).ஆக்ஸ்போர்டு யுனிவர்சிட்டி பிரஸ்;Ref.5 இன் அனுமதியுடன் மீண்டும் உருவாக்கப்பட்டது.NAS;"ஹோஸ்ட்-மைக்ரோப் கோ-கல்ச்சர்" ref.3 இன் அனுமதியுடன் மாற்றப்பட்டது.NAS;"நோய் மாதிரியாக்கம்" குறிப்பு அனுமதியுடன் மாற்றப்பட்டது.5.NAS
குட்-ஆன்-சிப் மற்றும் ஹைப்ரிட் சில்லுகள் இரண்டும் PDMS பிரதிகளை பயன்படுத்தி சிலிக்கான் அச்சுகளில் இருந்து மென்மையான லித்தோகிராபி மூலம் சிதைக்கப்பட்டு SU-8 உடன் வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளன. ஒவ்வொரு சிப்பில் உள்ள மைக்ரோ சேனல்களின் வடிவமைப்பும் ஹைட்ரோடைனமிக்ஸ் போன்ற ஹைட்ரோடைனமிக்ஸைக் கருத்தில் கொண்டு தீர்மானிக்கப்படுகிறது. இரண்டு இணைக்கப்பட்ட இணையான நேரான மைக்ரோ சேனல்களை உள்ளடக்கிய, ஒரு சிக்கலான குடல்-ஆன்-எ-சிப்பாக (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 1b) பரிணாம வளர்ச்சியடைந்தது, இது ஒரு ஜோடி வளைந்த மைக்ரோ சேனல்களை உள்ளடக்கியது, இது அதிகரித்த திரவ வசிப்பிட நேரம், நேரியல் அல்லாத ஓட்ட முறைகள் மற்றும் பண்பட்ட உயிரணுக்களின் பன்முகச் சிதைவுகள் மற்றும் g2-Wfhen சிக்கலான உயிரணுக்களின் மறுஉருவாக்கம் தேவை (படம். , சிக்கலான குட்-ஆன்-எ-சிப்களை தேர்வு செய்யலாம். பண்பட்ட செல் வகையைப் பொருட்படுத்தாமல், அசல் குட்-சிப்புடன் ஒப்பிடும்போது, ​​அதே அளவிலான எபிடெலியல் வளர்ச்சியுடன், சுருண்ட குட்-சிப் அதே கால கட்டத்தில் 3D மார்போஜெனீசிஸை வலுவாகத் தூண்டுகிறது என்பதை நாங்கள் நிரூபித்துள்ளோம். SU-8 வடிவங்களைக் கொண்ட சிலிக்கான் அச்சுகளில் குணப்படுத்தப்பட்ட லிக்காக்கள் சிதைந்த பிறகு எதிர்மறை அம்சங்களை வழங்குகின்றன (படம் 1).2a).ஒரு சிப்பில் குடலைத் தயாரிக்க, தயாரிக்கப்பட்ட மேல் பிடிஎம்எஸ் அடுக்கு ஒரு நுண்துளை பிடிஎம்எஸ் படத்துடன் தொடர்ச்சியாகப் பிணைக்கப்பட்டு, பின்னர் கரோனா ட்ரீட்டரைப் பயன்படுத்தி மீளமுடியாத பிணைப்பின் மூலம் கீழ் பிடிஎம்எஸ் லேயருடன் சீரமைக்கப்பட்டது (படம். 2 பி-எஃப்). commodate Transwell செருகல்கள் (படம். 2h மற்றும் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம். 2).பி.டி.எம்.எஸ் பிரதி மற்றும் கண்ணாடியின் மேற்பரப்புகளை ஆக்ஸிஜன் பிளாஸ்மா அல்லது கரோனா சிகிச்சையுடன் சிகிச்சையளிப்பதன் மூலம் பிணைப்பு செயல்முறை செய்யப்படுகிறது.
a, SU-8 வடிவிலான சிலிக்கான் அச்சுகளிலிருந்து PDMS பாகங்களைத் தயாரிப்பதற்கான திட்டவட்டமான விளக்கப்படம். சுத்தப்படுத்தப்படாத PDMS கரைசல் சிலிக்கான் அச்சில் (இடது) ஊற்றப்பட்டு, 60 °C (நடுத்தர) மற்றும் சிதைக்கப்பட்ட (வலது) வடிகட்டப்பட்டது. பி.டி.எம்.எஸ்., புகைப்படத்தின் மேல் அடுக்குகளாக வெட்டப்பட்டு, புகைப்பட அடுக்கின் புகைப்பட அடுக்கை மேலும் பயன்படுத்துவதற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது. பிடிஎம்எஸ் நுண்ணிய சவ்வைத் தயாரிக்கப் பயன்படும் சிலிக்கான் அச்சு, மேல் மற்றும் கீழ் பிடிஎம்எஸ் கூறுகளின் புகைப்படங்களின் வரிசை மற்றும் கூடியிருந்த ஆன்-சிப் குடல் சாதனம்.இ, மேல், சவ்வு மற்றும் கீழ் பிடிஎம்எஸ் கூறுகளின் சீரமைப்புத் திட்டம். மிகைப்படுத்தப்பட்ட சுருண்ட மைக்ரோ சேனல்கள் மற்றும் வெற்றிட அறைகள்.g, மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் செல் கலாச்சாரத்திற்கான குட்-ஆன்-எ-சிப்பின் அமைப்பு. ஒரு சிலிகான் குழாய் மற்றும் சிரிஞ்ச் மூலம் கூடிய ஒரு சிப்பில் உள்ள புனையப்பட்ட குடல் ஒரு கவர்ஸ்லிப்பில் வைக்கப்பட்டது. இந்த சிப் சாதனம் 150 மிமீ டிஷ் குழாயின் மூடியில் வைக்கப்பட்டது. கலப்பின சில்லுகளைப் பயன்படுத்தி ஹைப்ரிட் சிப் ஃபேப்ரிகேஷன் மற்றும் 3டி மோர்போஜெனீசிஸின் ஸ்னாப்ஷாட்கள். கலாச்சாரத்திற்குத் தனியே தயாரிக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்வெல் செருகல்கள் 2D இன்செஸ்டினல் எபிடெலியல் செல்கள் கலப்பின சிப்பில் செருகப்பட்டன. பட்டை, 1 cm.h குறிப்பு அனுமதியுடன் மறுபதிப்பு.4.எல்சேவியர்.
இந்த நெறிமுறையில், Caco-2 செல் கோடு மற்றும் குடல் ஆர்கனாய்டுகள் எபிடெலியல் மூலங்களாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன (படம். 3a).இரண்டு வகையான செல்களும் சுயாதீனமாக வளர்க்கப்பட்டன (பெட்டி 2 மற்றும் பெட்டி 5) மற்றும் ஆன்-சிப் குடல் அல்லது டிரான்ஸ்வெல் இன்செர்ட்டுகளின் ECM- பூசப்பட்ட மைக்ரோ சேனல்களை விதைக்க பயன்படுத்தப்பட்டது. பத்திகள் 10 மற்றும் 50 க்கு இடையில் டி-பிளாஸ்க்களில் டிரிப்சினைசேஷன் திரவம் (பெட்டி 2) மூலம் பிரிக்கப்பட்ட செல் சஸ்பென்ஷன்களைத் தயாரிக்க அறுவடை செய்யப்படுகிறது. ஆர்கனாய்டுகள் ~500 µm விட்டம் வரை வளரும் வரை, பெட்டி 3 இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி nt, R-spondin, மற்றும் Noggin) மற்றும் வளர்ச்சி காரணிகள் ஒவ்வொரு நாளும் கூடுதலாக வழங்கப்பட்டன. முழுமையாக வளர்ந்த ஆர்கனாய்டுகள் குடலில் விதைப்பதற்காக ஒற்றை செல்களாகப் பிரிக்கப்படுகின்றன அல்லது டிரான்ஸ்வெல் செருகப்பட்டவை முந்தைய நோய்களாக இருக்கலாம். எ.கா. அல்சரேட்டிவ் பெருங்குடல் அழற்சி, கிரோன் நோய், பெருங்குடல் புற்றுநோய் அல்லது சாதாரண நன்கொடையாளர்), புண் தளம் (எ.கா., காயம் மற்றும் புண் இல்லாத பகுதி) மற்றும் பாதையில் உள்ள இரைப்பை குடல் இடம் (எ.கா., டியோடெனம், ஜெஜூனம், இலியம், செகம், பெருங்குடல், அல்லது மலக்குடல்). சிறிய குடல் ஆர்கனாய்டுகளை விட மார்போஜன்களின் அதிக செறிவு தேவைப்படுகிறது.
a, குடல் சிப்பில் குடல் மார்போஜெனீசிஸின் தூண்டலுக்கான வேலைப்பாய்வு. காகோ-2 மனித குடல் எபிட்டிலியம் மற்றும் குடல் ஆர்கனாய்டுகள் இந்த நெறிமுறையில் 3D மார்போஜெனீசிஸை நிரூபிக்கப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. தனிமைப்படுத்தப்பட்ட எபிடெலியல் செல்கள் தயாரிக்கப்பட்ட குடல்-ஆன்-எ-சிப்களில் விதைக்கப்பட்டு, இணைக்கப்பட்டுள்ளது. நாள் 0 (D0) இல் DMS நுண்துளை சவ்வு, apical (AP) ஓட்டம் முதல் 2 நாட்களுக்கு (ஓட்டம், AP, D0-D2) தொடங்கப்பட்டு பராமரிக்கப்படுகிறது. ஒரு முழுமையான 2D மோனோலேயர் உருவாகும்போது, ​​2D மோனோலேயர் உருவாகும்போது, ​​சுழற்சி நீட்சி இயக்கங்களுடன் (நீட்சி, ஓட்டம், AP மற்றும் BL) பாசோலேட்டரல் (BL) ஓட்டமும் தொடங்கப்படுகிறது. 5 நாட்கள் மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் கலாச்சாரம் (மார்போஜெனீசிஸ், D5).கட்ட மாறுபாடு படங்கள் ஒவ்வொரு சோதனை படி அல்லது நேரப் புள்ளியிலும் Caco-2 செல்களின் பிரதிநிதித்துவ உருவ அமைப்பைக் காட்டுகின்றன (பார் வரைபடம், 100 µm). குடல் மார்போஜெனீசிஸின் தொடர்புடைய அடுக்குகளை விளக்கும் நான்கு திட்ட வரைபடங்கள். நிறுவப்பட்ட 3D Caco-2 எபிட்டிலியத்தின் (இடது) பெரிதாக்கப்பட்ட பகுதியை முன்னிலைப்படுத்தும் இன்செட் (வெள்ளை கோடு போட்ட பெட்டி) 3D Caco-2 லேயரில் (வலது) மீளுருவாக்கம் செய்யப்பட்ட மைக்ரோவில்லியைக் காட்டுகிறது. குடல் சில்லுகளில் உள்ள எபிடெலியல் செல்களின் ஒளிரும் கன்ஃபோகல் காட்சிப்படுத்தல். நடுத்தர திட்டவட்டத்தை சுட்டிக்காட்டும் அம்புகள் ஒவ்வொரு கன்ஃபோகல் பார்வைக்கும் குவிய விமானத்தின் இருப்பிடத்தைக் குறிக்கின்றன.d, 3, 7, 11 நாட்களில் கட்ட மாறுபாடு நுண்ணோக்கி மூலம் பெறப்பட்ட ஒரு சிப்பில் வளர்க்கப்பட்ட ஆர்கனாய்டுகளில் உருவவியல் மாற்றங்களின் நேரப் பாடம். நாள் 7.f இல் எடுக்கப்பட்ட ஸ்லைஸில் குடலில் நிறுவப்பட்ட ஆர்கனாய்டு 3D எபிட்டிலியத்தின் IC ஃபோட்டோமிக்ரோகிராஃப், ஸ்டெம் செல்களுக்கான குறிப்பான்களைக் காட்டும் மேலடுக்கு இம்யூனோஃப்ளோரசன்ஸ் படங்கள் (LGR5;மெஜந்தா), கோப்லெட் செல்கள் (MUC2; பச்சை), எஃப்-ஆக்டின் (சாம்பல்) மற்றும் கருக்கள் (சியான்) ஆகியவை குடல் சில்லுகளில் முறையே 3 நாட்களுக்கு (இடது) மற்றும் 13-நாள் (நடுத்தர) ஆர்கனாய்டுகள் எபிதீலியல் அடுக்கில் வளர்க்கப்படுகின்றன. மேலும் பார்க்கவும் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 3, எபிதீலியல் லேயரில் உள்ளது. கலாச்சாரத்தின் 13 ஆம் நாளில் CellMask சாயத்துடன் (வலது) பிளாஸ்மா சவ்வைக் கறைபடுத்துவதன் மூலம் ஒரு சிப்பில் குடலில் நிறுவப்பட்ட 3D ஆர்கனாய்டு எபிட்டிலியத்தின் நுண் கட்டமைப்பு (வலது).ஆக்ஸ்போர்டு யுனிவர்சிட்டி பிரஸ்;c குறிப்பின் அனுமதியுடன் தழுவல்.2.ஆக்ஸ்போர்டு யுனிவர்சிட்டி பிரஸ்;e மற்றும் f குறிப்பு மூலம் அனுமதியுடன் மாற்றியமைக்கப்பட்டது.12 கிரியேட்டிவ் காமன்ஸ் உரிமத்தின் கீழ் CC BY 4.0.
ஒரு சிப்பில் உள்ள குடலில், வெற்றிகரமான ECM பூச்சுக்கு PDMS நுண்ணிய சவ்வின் ஹைட்ரோபோபிக் மேற்பரப்பை மாற்றியமைப்பது அவசியம். இந்த நெறிமுறையில், PDMS சவ்வுகளின் ஹைட்ரோபோபிசிட்டியை மாற்ற இரண்டு வெவ்வேறு முறைகளைப் பயன்படுத்துகிறோம். Caco-2 செல்களை வளர்ப்பதற்கு, UV/ozone மேற்பரப்பைக் குறைக்க, UV/ozone மேற்பரப்பைக் குறைக்க போதுமானது. பி.டி.எம்.எஸ் மென்படலத்திற்கு Caco-2 செல்கள். இருப்பினும், ஆர்கனாய்டு எபிட்டிலியத்தின் மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் கலாச்சாரம் ECM புரதங்களின் திறமையான படிவுகளை அடைவதற்கு இரசாயன அடிப்படையிலான மேற்பரப்பு செயல்பாடு தேவைப்படுகிறது. oid epithelium. செல்கள் இணைக்கப்பட்ட பிறகு, மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் செல் கலாச்சாரம், செல்கள் ஒரு முழுமையான மோனோலேயரை உருவாக்கும் வரை, மேல் மைக்ரோசனலில் நடுத்தரத்தை மட்டும் ஊடுருவித் தொடங்குகிறது, அதே சமயம் கீழ் மைக்ரோ சேனல் நிலையான நிலைகளை பராமரிக்கிறது. மேற்பரப்பு செயல்படுத்தும் மற்றும் ECM பூச்சுக்கான இந்த உகந்த முறையானது, ஆர்கனாய்டு எபிதீலியத்தை மேற்பரப்பில் இணைக்க உதவுகிறது.
டிரான்ஸ்வெல் கலாச்சாரங்களுக்கு செல் விதைப்புக்கு முன் ECM பூச்சு தேவைப்படுகிறது;இருப்பினும், நுண்ணிய செருகல்களின் மேற்பரப்பை செயல்படுத்துவதற்கு டிரான்ஸ்வெல் கலாச்சாரங்களுக்கு சிக்கலான முன் சிகிச்சை நடவடிக்கைகள் தேவையில்லை. டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களில் வளரும் Caco-2 செல்கள், நுண்ணிய செருகல்களில் ECM பூச்சு பிரிக்கப்பட்ட Caco-2 செல்கள் (<1 மணிநேரம்) மற்றும் இறுக்கமான சந்திப்பு தடை உருவாக்கம் (<1-2 நாட்களில் பார்க்கவும்) ECM-பூசப்பட்ட செருகல்களில், சவ்வு மேற்பரப்பில் (<3 h) இணைக்கப்பட்டு, ஆர்கனாய்டுகள் தடை ஒருமைப்பாட்டுடன் ஒரு முழுமையான மோனோலேயரை உருவாக்கும் வரை பராமரிக்கப்படுகின்றன
நிறுவப்பட்ட எபிடெலியல் லேயரின் பாசோலேட்டரல் அம்சத்திற்கு திரவ ஓட்டத்தைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் விட்ரோ 3D மார்போஜெனீசிஸைத் தொடங்கலாம். ஒரு சிப்பில் உள்ள குடலில், எபிடெலியல் மார்போஜெனீசிஸ் நடுத்தர மேல் மற்றும் கீழ் மைக்ரோ சேனல்களில் (படம். 3a) ஊடுருவியபோது தொடங்கியது. சுரக்கும் மார்போஜென் தடுப்பான்கள். நுண்துளை சவ்வுகளில் பிணைக்கப்பட்ட செல்களுக்கு போதுமான ஊட்டச்சத்துக்கள் மற்றும் சீரம் வழங்க மற்றும் லுமினல் வெட்டு அழுத்தத்தை உருவாக்க, நாம் பொதுவாக ஒரு சிப்பில் குடலில் இரட்டை ஓட்டத்தை பயன்படுத்துகிறோம். கலப்பின சில்லுகளில், எபிதீலியல் மோனோலேயர்களைக் கொண்ட டிரான்ஸ்வெல் செருகல்கள், டிரான்ஸ்போரின் நடுத்தர கலப்பினத்தில் செருகப்பட்டன. மைக்ரோ சேனல் மூலம் rt. இரண்டு கலாச்சார தளங்களிலும் பாசோலேட்டரல் ஓட்டம் தொடங்கிய 3-5 நாட்களுக்குப் பிறகு குடல் மார்போஜெனீசிஸ் ஏற்பட்டது.
மைக்ரோ என்ஜினீயரிங் செய்யப்பட்ட 3D எபிடெலியல் அடுக்குகளின் உருவவியல் அம்சங்களை பல்வேறு இமேஜிங் முறைகளைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யலாம், இதில் ஃபேஸ் கான்ட்ராஸ்ட் மைக்ரோஸ்கோபி, டிஃபரன்ஷியல் இன்டர்ஃபெரன்ஸ் கான்ட்ராஸ்ட் (டிஐசி) மைக்ரோஸ்கோபி, எஸ்இஎம், அல்லது இம்யூனோஃப்ளோரெசன்ஸ் கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோபி (புகைப்படங்கள் 3 மற்றும் 4) படிம மாறுபாட்டின் போது எந்த நேரத்திலும் டிஐசி பண்பாட்டின் போது எளிதாகவும் செய்ய முடியும். எபிதீலியல் அடுக்குகள்.PDMS மற்றும் பாலியஸ்டர் படங்களின் ஒளியியல் வெளிப்படைத்தன்மையின் காரணமாக, குட்-ஆன்-எ-சிப் மற்றும் ஹைப்ரிட் சிப் இயங்குதளங்கள் இரண்டும் சாதனத்தைப் பிரித்தல் அல்லது பிரித்தல் தேவையில்லாமல் நிகழ்நேரத்தில் சிட்டு இமேஜிங்கை வழங்க முடியும். டிஹைட் (PFA), அதைத் தொடர்ந்து ட்ரைடன் X-100 மற்றும் 2% (wt/vol) ) போவின் சீரம் அல்புமின் (BSA), வரிசையாக. செல் வகையைப் பொறுத்து, வெவ்வேறு ஃபிக்ஸேடிவ்கள், பெர்மபிலைசர்கள் மற்றும் தடுப்பு முகவர்கள் பயன்படுத்தப்படலாம். முதன்மையான ஆன்டிபாடிகளை இலக்காகக் கொண்ட பரம்பரை சார்ந்த செல் அல்லது பிராந்திய குறிப்பான்கள் இரண்டாவதாக உட்செலுத்தப்பட்ட செல்கள், எதிரெதிர் செல்கள் மூலம் எதிரெதிர் உயிரணுக்களில் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. கருவைக் குறிவைக்கும் சாயம் (எ.கா., 4′,6-diamidino-2-phenylene) இண்டோல், DAPI) அல்லது F-ஆக்டின் (எ.கா., ஃப்ளோரசன்ட் லேபிளிடப்பட்ட ஃபாலோடின்) சளி உற்பத்தியைக் கண்டறிய, ஃப்ளோரசன்ஸ் அடிப்படையிலான நேரடி இமேஜிங் இடத்திலும் செய்யப்படலாம் (படம்.1, "செல் வேறுபாடு" மற்றும் "குடல் உடலியல்"), நுண்ணுயிர் உயிரணுக்களின் சீரற்ற காலனித்துவம் (படம். 1, "ஹோஸ்ட்-நுண்ணுயிர் இணை கலாச்சாரம்"), நோயெதிர்ப்பு உயிரணுக்களின் ஆட்சேர்ப்பு (படம். 1, 'நோய் மாதிரியாக்கம்') அல்லது 3D எபிடெலியல் உருவவியல், 4 modicify இல் 3D எபிதீலியல் உருவவியல், படம். ref இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி கீழ் மைக்ரோ சேனல் லேயரில் இருந்து மேல் அடுக்கை பிரிக்கவும். படம் 2 இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, 3D எபிடெலியல் உருவவியல் மற்றும் நுனி தூரிகையின் எல்லையில் உள்ள மைக்ரோவில்லி ஆகியவற்றை SEM (படம் 3b) மூலம் காட்சிப்படுத்தலாம் ut சில்லுகள் அல்லது கலப்பின சில்லுகள் டிரிப்சினைசேஷன் மூலம் அறுவடை செய்யப்பட்டு பின்னர் மூலக்கூறு அல்லது மரபணு பகுப்பாய்வுக்கு பயன்படுத்தப்படுகின்றன.
a, ஒரு கலப்பின சிப்பில் குடல் மார்போஜெனீசிஸின் தூண்டுதலுக்கான பணிப்பாய்வு. ஒரு கலப்பின சிப் மேடையில் 3D மார்போஜெனீசிஸை நிரூபிக்க இந்த நெறிமுறையில் காகோ-2 மற்றும் குடல் ஆர்கனாய்டுகள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. டிஸோசியேட்டட் எபிடெலியல் செல்கள் தயாரிக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்வெல்லில் விதைக்கப்பட்டுள்ளன. டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களில் உள்ள சவ்வுகளில், அனைத்து செல்களும் நிலையான நிலைமைகளின் கீழ் (TW கலாச்சாரம்) வளர்க்கப்பட்டன. 7 நாட்களுக்குப் பிறகு, 2D மோனோலேயர் எபிடெலியல் செல்களைக் கொண்ட ஒரு ஒற்றை டிரான்ஸ்வெல் செருகும் ஒரு கலப்பின சிப்பில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது. சாதாரண நன்கொடையாளர் (C103 கோடு) இருந்து பெறப்பட்ட மனித உறுப்பு எபிடெலியல் செல்களின் உருவவியல் அம்சங்களைக் காட்டும் வரைபடங்கள், ஒவ்வொரு சோதனைப் படியிலும் அல்லது நேரப் புள்ளியிலும் பெருங்குடலின் ஏறுவரிசையில் இருந்து பெறப்படுகின்றன. மேல் அடுக்குகளில் உள்ள திட்டவட்டங்கள் ஒவ்வொரு படிநிலையிலும் சோதனை கட்டமைப்பை விளக்குகின்றன.b, ஹைப்ரிட் சில்லுகள் (இடது ஸ்கீமாடிக்) 3D ஆர்கன் டாப் ஸ்க்மாடிக் எபிதீலிகல் வியூவில் எடுக்கப்பட்ட மார்போஜெனின் மேல்நோக்கி செல்கள் நிலைகள் (மேல், நடுத்தர மற்றும் கீழ்;சரியான திட்டவட்டமான மற்றும் தொடர்புடைய புள்ளியிடப்பட்ட கோடுகளைப் பார்க்கவும்).வெளிப்படையான உருவவியல் பண்புகளைக் காட்டியது.F-ஆக்டின் (சியான்), நியூக்ளியஸ் (சாம்பல்).c, ஃப்ளோரசன்ஸ் கன்ஃபோகல் மைக்ரோகிராஃப்கள் (3D கோணக் காட்சி) ஆர்கனாய்டு-பெறப்பட்ட எபிடெலியல் செல்கள் நிலையான டிரான்ஸ்வெல்லில் வளர்க்கப்பட்டது (TW; வெள்ளைக் கோடு பெட்டிக்குள் உள்ளீடு) மற்றும் கலப்பின சிப் (3D ஃபுல் ஷாட், 3D முழு ஷாட்) ஒப்பிடுகையில் ical குறுக்கு வெட்டு காட்சிகள் (மேல் வலது மூலையில் உள்ளீடு; "XZ") 2D மற்றும் 3D அம்சங்களையும் காட்டுகின்றன. அளவுகோல், 100 µm.c குறிப்பு அனுமதியுடன் மறுபதிப்பு.4.எல்சேவியர்.
வழக்கமான நிலையான கலாச்சார நிலைமைகளின் கீழ் அதே செல்களை (Caco-2 அல்லது குடல் ஆர்கனாய்டு எபிடெலியல் செல்கள்) இரு பரிமாண மோனோலேயர்களாக வளர்ப்பதன் மூலம் கட்டுப்பாடுகள் தயார் செய்யப்படலாம்.குறிப்பாக, மைக்ரோ சேனல்களின் குறைந்த அளவு திறன் காரணமாக ஊட்டச்சத்து குறைதல் ஏற்படலாம் (அதாவது ~4 µL க்கு முன்பு. அடித்தள ஓட்டத்தையும் ஒப்பிடலாம்.
மென்மையான லித்தோகிராஃபி செயல்முறை ஒரு சுத்தமான அறையில் செய்யப்பட வேண்டும். சிப் (மேல் மற்றும் கீழ் அடுக்குகள் மற்றும் சவ்வுகள்) மற்றும் ஹைப்ரிட் சில்லுகளில் உள்ள ஒவ்வொரு அடுக்குக்கும், மைக்ரோ சேனல்களின் உயரம் வித்தியாசமாக இருந்ததால், தனித்தனி சிலிக்கான் செதில்களில் வெவ்வேறு போட்டோமாஸ்க்குகள் பயன்படுத்தப்பட்டு உருவாக்கப்பட்டன. கலப்பின சிப்பின் 200 μm.
அசிட்டோன் கொண்ட ஒரு பாத்திரத்தில் 3-இன்ச் சிலிக்கான் வேஃபரை வைக்கவும். தட்டை மெதுவாக 30 விநாடிகள் சுழற்றவும், பின்னர் செதில்களை காற்றில் உலர வைக்கவும். ஐபிஏ உள்ள தட்டுக்கு செதில்களை மாற்றி, பின்னர் 30 வினாடிகள் சுத்தம் செய்ய பிளேட்டை சுழற்றவும்.
ஒரு பிரன்ஹா கரைசல் (ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு மற்றும் செறிவூட்டப்பட்ட சல்பூரிக் அமிலத்தின் கலவை, 1:3 (தொகுதி/வால்)) சிலிக்கான் செதில் மேற்பரப்பில் இருந்து கரிம எச்சங்களை அகற்றுவதற்கு விருப்பமாக பயன்படுத்தப்படலாம்.
பிரன்ஹா கரைசல் மிகவும் அரிக்கும் மற்றும் வெப்பத்தை உருவாக்குகிறது. கூடுதல் பாதுகாப்பு முன்னெச்சரிக்கைகள் அவசியம்.கழிவுகளை அகற்றுவதற்கு, கரைசலை குளிர்ந்து சுத்தமான, உலர் கழிவு கொள்கலனுக்கு மாற்ற அனுமதிக்கவும். இரண்டாம் நிலை கொள்கலன்களை பயன்படுத்தவும் மற்றும் கழிவு கொள்கலன்களை சரியாக லேபிளிடவும். மேலும் விரிவான நடைமுறைகளுக்கு வசதியின் பாதுகாப்பு வழிகாட்டுதல்களைப் பின்பற்றவும்.
10 நிமிடங்களுக்கு 200 °C சூடான தட்டில் வைப்பதன் மூலம் செதில்களை டீஹைட்ரேட் செய்யவும். நீரிழப்புக்குப் பிறகு, குளிர்விக்க செதில் ஐந்து முறை காற்றில் அசைக்கப்பட்டது.
~10 கிராம் ஃபோட்டோரெசிஸ்ட் SU-8 2100ஐ சுத்தம் செய்யப்பட்ட சிலிக்கான் செதில்களின் மையத்தில் ஊற்றவும். ஃபோட்டோரெசிஸ்ட்டை செதில்களின் மீது சமமாகப் பரப்ப சாமணம் பயன்படுத்தவும். எப்போதாவது 65°C வெப்பத் தட்டில் செதில்களை வைக்கவும். ஃபோட்டோரெசிஸ்ட்டை ஒட்டும் தன்மை குறைவாகவும் பரவ எளிதாகவும் இருக்கும். சூடான தட்டில் நேரடியாக வைக்க வேண்டாம்.
சுழல் பூச்சு மூலம் செதில் மீது SU-8 சமமாக விநியோகிக்கப்பட்டது. SU-8 இன் உள்வரும் சுழற்சியை 5-10 வினாடிகளுக்கு 100 rpm/s முடுக்கத்தில் 500 rpm இல் பரப்புவதற்கு நிரல்படுத்தவும். முக்கிய சுழலை 200 µm/s தடிமன், 200 µm தடிமன் அல்லது 0 µm இல் அடைய வடிவமைத்தல் 1, 5m சிப்பில் உள்ள குடலின் மேல் அடுக்குக்கு 500 µm உயரம்; கீழே உள்ள "முக்கியமான படிகள்" பார்க்கவும்) 1,200 rpm இல் 300 rpm/s 30 வினாடிகள் முடுக்கத்தில் அமைக்கவும்.
சிலிக்கான் செதில்களில் உள்ள SU-8 வடிவத்தின் இலக்கு தடிமன் படி முக்கிய சுழல் வேகத்தை சரிசெய்யலாம்.
சிப்பில் உள்ள குடலின் மேல் அடுக்குக்கு 500 µm உயரம் கொண்ட SU-8 வடிவங்களை உருவாக்க, இந்த பெட்டியின் சுழல் பூச்சு மற்றும் மென்மையான சுடுதல் படிகள் (படிகள் 7 மற்றும் 8) தொடர்ச்சியாக மீண்டும் மீண்டும் (படி 9 ஐப் பார்க்கவும்) 250 µm ஒரு தடிமனான அடுக்கு SU-8 ஐ உருவாக்கி, UV 0 அடுக்கு 5 அடுக்குகளை உருவாக்கலாம். µm உயரம்.
SU-8 பூசப்பட்ட செதில்களை 5 நிமிடங்களுக்கு 65 °C வெப்பநிலையில் சூடான தட்டில் வைத்து கவனமாக சுடவும், பின்னர் அமைப்பை 95 °Cக்கு மாற்றி மேலும் 40 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கவும்.
மேல் மைக்ரோசனலில் SU-8 வடிவத்தின் 500 μm உயரத்தை அடைய, இரண்டு 250 μm தடிமன் கொண்ட SU-8 அடுக்குகளை உருவாக்க 7 மற்றும் 8 படிகளை மீண்டும் செய்யவும்.
UV Mask Aligner ஐப் பயன்படுத்தி, உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, செதில்களின் வெளிப்பாடு நேரத்தைக் கணக்கிடுவதற்கு விளக்குச் சோதனையைச் செய்யவும்.(வெளிப்பாடு நேரம், ms) = (வெளிப்பாடு அளவு, mJ/cm2)/(விளக்கு சக்தி, mW/cm2).
வெளிப்படும் நேரத்தைத் தீர்மானித்த பிறகு, UV மாஸ்க் அலைனரின் முகமூடி வைத்திருப்பவரின் மீது போட்டோமாஸ்க்கை வைத்து, SU-8 பூசப்பட்ட செதில் மீது போட்டோமாஸ்க்கை வைக்கவும்.
UV சிதறலைக் குறைக்க, புகைப்பட முகமூடியின் அச்சிடப்பட்ட மேற்பரப்பை நேரடியாக சிலிக்கான் செதில்களின் SU-8 பூசப்பட்ட பக்கத்தில் வைக்கவும்.
SU-8 பூசப்பட்ட செதில் மற்றும் ஃபோட்டோமாஸ்க்கை செங்குத்தாக 260 mJ/cm2 UV ஒளிக்கு முன்னரே தீர்மானிக்கப்பட்ட வெளிப்பாடு நேரத்திற்கு வெளிப்படுத்தவும் (இந்தப் பெட்டியின் படி 10 ஐப் பார்க்கவும்).
UV வெளிப்பாட்டிற்குப் பிறகு, SU-8-பூசப்பட்ட சிலிக்கான் செதில்கள் 200 μm உயரத்துடன் வடிவங்களை உருவாக்க ஒவ்வொரு சூடான தட்டில் 5 நிமிடம் 65 ° C மற்றும் 95 ° C 15 நிமிடம் சுடப்பட்டது.
டெவலப்பர் ஒரு கண்ணாடி பாத்திரத்தில் ஊற்றப்பட்டு, சுடப்பட்ட செதில் பாத்திரத்தில் வைக்கப்படும். SU-8 டெவலப்பரின் அளவு கண்ணாடித் தகட்டின் அளவைப் பொறுத்து மாறுபடும். போதுமான SU-8 டெவலப்பரைப் பயன்படுத்துவதை உறுதிசெய்து, முழுமையாக வெளிப்படாத SU-8 ஐப் பயன்படுத்தவும். எடுத்துக்காட்டாக, 150 மிமீ விட்டம் கொண்ட 150 மிமீ விட்டம் கொண்ட கண்ணாடி டிஷைப் பயன்படுத்தும் போது, ​​150 மிமீ 30 எல். அவ்வப்போது மென்மையான சுழற்சியுடன் நிமிடங்கள்.
ஒரு பைப்பெட்டைப் பயன்படுத்தி கரைசலை தெளிப்பதன் மூலம் ~10 மில்லி புதிய டெவலப்பரைத் தொடர்ந்து IPA ஐப் பயன்படுத்தி வளர்ந்த அச்சுகளை துவைக்கவும்.
பிளாஸ்மா கிளீனரில் செதில்களை வைத்து, ஆக்ஸிஜன் பிளாஸ்மாவில் (வளிமண்டல வாயு, இலக்கு அழுத்தம் 1 × 10−5 டோர், சக்தி 125 W) 1.5 நிமிடங்களுக்கு வெளிப்படுத்தவும்.
கண்ணாடி ஸ்லைடுடன் ஒரு வெற்றிட டெசிகேட்டரில் செதில்களை வைக்கவும். செதில்கள் மற்றும் ஸ்லைடுகளை அருகருகே வைக்கலாம். வெற்றிட டெசிக்கேட்டரை பல அடுக்குகளாகப் பிரித்தால், ஸ்லைடுகளை கீழ் அறையிலும் செதில்களை மேல் அறையிலும் வைக்கவும் ஒரு கண்ணாடி ஸ்லைடு மற்றும் சிலானைசேஷனுக்கான வெற்றிடத்தைப் பயன்படுத்துங்கள்.
உறைந்த Caco-2 செல்களின் குப்பியை 37°C தண்ணீர் குளியலில் கரைத்து, பின்னர் கரைந்த செல்களை 15 mL 37°C முன்னே சூடேற்றப்பட்ட Caco-2 மீடியம் கொண்ட T75 குடுவைக்கு மாற்றவும்.
~90% சங்கமத்தில் Caco-2 செல்களை அனுப்ப, முதலில் சூடான Caco-2 நடுத்தர, PBS மற்றும் 0.25% டிரிப்சின்/1 mM EDTA 37°C நீர் குளியல்.
வெற்றிட ஆஸ்பிரேஷன் மூலம் மீடியத்தை ஆஸ்பிரேட் செய்யவும். 5 மிலி சூடான பிபிஎஸ் மூலம் செல்களை இருமுறை கழுவவும்