Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி. நீங்கள் வரையறுக்கப்பட்ட CSS ஆதரவுடன் கூடிய உலாவி பதிப்பைப் பயன்படுத்துகிறீர்கள். சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்). கூடுதலாக, தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்ய, ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் தளத்தைக் காட்டுகிறோம்.
ஒரே நேரத்தில் மூன்று ஸ்லைடுகளின் கேரோசலைக் காட்டுகிறது. ஒரே நேரத்தில் மூன்று ஸ்லைடுகளின் வழியாக நகர்த்த முந்தைய மற்றும் அடுத்த பொத்தான்களைப் பயன்படுத்தவும் அல்லது ஒரே நேரத்தில் மூன்று ஸ்லைடுகளின் வழியாக நகர்த்த இறுதியில் உள்ள ஸ்லைடர் பொத்தான்களைப் பயன்படுத்தவும்.
இரத்த-மூளைத் தடை மற்றும் இரத்த-மூளைத் தடை ஆகியவை மத்திய நரம்பு மண்டலத்தில் உயிரி சிகிச்சை முகவர்கள் தங்கள் இலக்குகளை அடைவதைத் தடுக்கின்றன, இதனால் நரம்பியல் நோய்களுக்கான பயனுள்ள சிகிச்சையைத் தடுக்கின்றன. உயிரியல் ரீதியாக புதிய மூளை டிரான்ஸ்போர்ட்டர்களைக் கண்டறிய, நாங்கள் ஒரு T7 பேஜ் பெப்டைட் நூலகத்தை அறிமுகப்படுத்தினோம், மேலும் எலிகளின் கேனுலேட்டட் நனவான பெரிய பூல் மாதிரியைப் பயன்படுத்தி தொடர்ச்சியாக சேகரிக்கப்பட்ட இரத்தம் மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் (CSF) ஆகியவற்றை அறிமுகப்படுத்தினோம். நான்கு சுற்றுத் தேர்வுக்குப் பிறகு குறிப்பிட்ட பேஜ் குளோன்கள் CSF இல் அதிக அளவில் செறிவூட்டப்பட்டன. தனிப்பட்ட வேட்பாளர் பெப்டைட்களை சோதித்ததில் CSF இல் 1000 மடங்குக்கும் அதிகமான செறிவூட்டல் தெரியவந்தது. மூளைக்கு பெப்டைட்-மத்தியஸ்த விநியோகத்தின் உயிரியல் செயல்பாடு, அடையாளம் காணப்பட்ட நாவல் டிரான்சிட் பெப்டைடுடன் இணைக்கப்பட்ட BACE1 பெப்டைட் தடுப்பானைப் பயன்படுத்தி செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் அமிலாய்டு-β அளவை 40% குறைப்பதன் மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது. இந்த முடிவுகள், உயிரியல் ரீதியாக புதிய பேஜ் தேர்வு முறைகளால் அடையாளம் காணப்பட்ட பெப்டைடுகள், சிகிச்சை விளைவுடன் மூளைக்கு மேக்ரோமிகுலூல்களை முறையாக வழங்குவதற்கான பயனுள்ள வாகனங்களாக இருக்கலாம் என்று கூறுகின்றன.
மத்திய நரம்பு மண்டலம் (CNS) இலக்கு சிகிச்சை ஆராய்ச்சி, CNS-இலக்கு பண்புகளை வெளிப்படுத்தும் உகந்த மருந்துகள் மற்றும் முகவர்களை அடையாளம் காண்பதில் பெரும்பாலும் கவனம் செலுத்துகிறது, மூளைக்கு செயலில் மருந்து விநியோகத்தை இயக்கும் வழிமுறைகளைக் கண்டுபிடிப்பதில் குறைந்த முயற்சி. மருந்து விநியோகம், குறிப்பாக பெரிய மூலக்கூறுகள், நவீன நரம்பியல் மருந்து வளர்ச்சியின் ஒருங்கிணைந்த பகுதியாக இருப்பதால் இது இப்போது மாறத் தொடங்குகிறது. மத்திய நரம்பு மண்டலத்தின் சூழல், இரத்த-மூளைத் தடை (BBB) ​​மற்றும் இரத்த-மூளைத் தடை (BCBB)1 ஆகியவற்றைக் கொண்ட பெருமூளை இரத்த நாளத் தடை அமைப்பால் நன்கு பாதுகாக்கப்படுகிறது, இது மூளைக்கு மருந்துகளை வழங்குவதை சவாலாக ஆக்குகிறது1,2. கிட்டத்தட்ட அனைத்து பெரிய மூலக்கூறு மருந்துகளும் 98% க்கும் அதிகமான சிறிய மூலக்கூறு மருந்துகளும் மூளையிலிருந்து அகற்றப்படுகின்றன என்று மதிப்பிடப்பட்டுள்ளது3. அதனால்தான் CNS 4,5 க்கு சிகிச்சை மருந்துகளின் திறமையான மற்றும் குறிப்பிட்ட விநியோகத்தை வழங்கும் புதிய மூளை போக்குவரத்து அமைப்புகளை அடையாளம் காண்பது மிகவும் முக்கியம். இருப்பினும், BBB மற்றும் BCSFB ஆகியவை அதன் விரிவான வாஸ்குலேச்சர் மூலம் மூளையின் அனைத்து கட்டமைப்புகளிலும் ஊடுருவி நுழையும் போது மருந்து விநியோகத்திற்கான சிறந்த வாய்ப்பையும் வழங்குகின்றன. எனவே, மூளைக்கு ஊடுருவாத விநியோக முறைகளைப் பயன்படுத்துவதற்கான தற்போதைய முயற்சிகள் பெரும்பாலும் எண்டோஜெனஸ் BBB6 ஏற்பியைப் பயன்படுத்தி ஏற்பி-மத்தியஸ்த போக்குவரத்து (PMT) பொறிமுறையை அடிப்படையாகக் கொண்டவை. டிரான்ஸ்ஃபெரின் ஏற்பி பாதையைப் பயன்படுத்தி சமீபத்திய முக்கிய முன்னேற்றங்கள் இருந்தபோதிலும்7,8, மேம்படுத்தப்பட்ட பண்புகளுடன் புதிய விநியோக அமைப்புகளின் மேலும் வளர்ச்சி தேவைப்படுகிறது. இந்த நோக்கத்திற்காக, CSF போக்குவரத்தை மத்தியஸ்தம் செய்யக்கூடிய பெப்டைட்களை அடையாளம் காண்பதே எங்கள் குறிக்கோளாக இருந்தது, ஏனெனில் அவை கொள்கையளவில் CNS க்கு மேக்ரோமிகுலூல்களை வழங்க அல்லது புதிய ஏற்பி பாதைகளைத் திறக்கப் பயன்படுத்தப்படலாம். குறிப்பாக, செரிப்ரோவாஸ்குலர் அமைப்பின் (BBB மற்றும் BSCFB) குறிப்பிட்ட ஏற்பிகள் மற்றும் டிரான்ஸ்போர்ட்டர்கள் உயிரி சிகிச்சை மருந்துகளின் செயலில் மற்றும் குறிப்பிட்ட விநியோகத்திற்கான சாத்தியமான இலக்குகளாக செயல்பட முடியும். செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் (CSF) என்பது கோராய்டு பிளெக்ஸஸின் (CS) ஒரு சுரப்பு தயாரிப்பு ஆகும், மேலும் இது சப்அரக்னாய்டு இடம் மற்றும் வென்ட்ரிகுலர் இடம்4 வழியாக மூளையின் இடைநிலை திரவத்துடன் நேரடி தொடர்பில் உள்ளது. சமீபத்தில் சப்அரக்னாய்டு செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் மூளையின் இடைநிலைக்குள் அதிகமாக பரவுகிறது என்பது காட்டப்பட்டுள்ளது9. இந்த சப்அரக்னாய்டு உள்வரும் பாதையைப் பயன்படுத்தி அல்லது நேரடியாக BBB வழியாக பாரன்கிமல் இடத்தை அணுக நாங்கள் நம்புகிறோம். இதை அடைய, இந்த இரண்டு தனித்துவமான பாதைகளில் ஏதேனும் ஒன்றின் மூலம் கொண்டு செல்லப்படும் பெப்டைட்களை சிறந்த முறையில் அடையாளம் காணும் ஒரு வலுவான இன் விவோ பேஜ் தேர்வு உத்தியை நாங்கள் செயல்படுத்தினோம்.
உயர் லைப்ரரி பன்முகத்தன்மையுடன் ஆரம்ப தேர்வு சுற்றுகளை கண்காணிக்க, உயர் த்ரோபுட் சீக்வென்சிங் (HTS) உடன் இணைந்து CSF மாதிரியுடன் கூடிய தொடர்ச்சியற்ற இன் விவோ பேஜ் டிஸ்ப்ளே ஸ்கிரீனிங் முறையை இப்போது நாங்கள் விவரிக்கிறோம். இரத்த மாசுபாட்டைத் தவிர்ப்பதற்காக நிரந்தரமாக பொருத்தப்பட்ட பெரிய சிஸ்டெர்னா (CM) கேனுலாவுடன் நனவான எலிகளில் ஸ்கிரீனிங் செய்யப்பட்டது. முக்கியமாக, இந்த அணுகுமுறை மூளை-இலக்கு மற்றும் பெருமூளை வாஸ்குலர் தடை முழுவதும் போக்குவரத்து செயல்பாடு கொண்ட பெப்டைடுகள் இரண்டையும் தேர்ந்தெடுக்கிறது. அவற்றின் சிறிய அளவு (~60 nm)10 காரணமாக T7 பேஜ்களைப் பயன்படுத்தினோம், மேலும் அவை எண்டோடெலியல் மற்றும்/அல்லது எபிதீலியல்-மெடுல்லா தடையின் டிரான்ஸ்செல்லுலர் கடக்க அனுமதிக்கும் வெசிகிள்களின் போக்குவரத்துக்கு ஏற்றவை என்று பரிந்துரைத்தோம். நான்கு சுற்று பேனிங்கிற்குப் பிறகு, பேஜ் மக்கள்தொகை தனிமைப்படுத்தப்பட்டு, விவோவில் CSF செறிவூட்டல் மற்றும் பெருமூளை நுண்ணுயிரி தொடர்பைக் காட்டுகிறது. முக்கியமாக, விருப்பமான மற்றும் வேதியியல் ரீதியாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட சிறந்த வேட்பாளர் பெப்டைடுகள் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்திற்குள் புரத சரக்குகளை கொண்டு செல்ல முடியும் என்பதை நிரூபிப்பதன் மூலம் எங்கள் கண்டுபிடிப்புகளை உறுதிப்படுத்த முடிந்தது. முதலாவதாக, ஒரு முன்னணி டிரான்சிட் பெப்டைடை BACE1 பெப்டைடின் தடுப்பானுடன் இணைப்பதன் மூலம் CNS இன் மருந்தியல் விளைவுகள் நிறுவப்பட்டன. இன் விவோ செயல்பாட்டுத் திரையிடல் உத்திகள் புதிய மூளை போக்குவரத்து பெப்டைட்களை பயனுள்ள புரத சரக்கு கேரியர்களாக அடையாளம் காண முடியும் என்பதை நிரூபிப்பதோடு மட்டுமல்லாமல், புதிய மூளை போக்குவரத்து பாதைகளை அடையாளம் காண்பதில் இதேபோன்ற செயல்பாட்டுத் தேர்வு அணுகுமுறைகளும் முக்கியமானதாக மாறும் என்று நாங்கள் எதிர்பார்க்கிறோம்.
பிளேக்-உருவாக்கும் அலகுகளை (PFU) அடிப்படையாகக் கொண்டு, பேஜ் பேக்கேஜிங் படிக்குப் பிறகு, தோராயமாக 109 பன்முகத்தன்மை கொண்ட சீரற்ற 12-மெர் லீனியர் T7 பேஜ் பெப்டைட்களின் நூலகம் வடிவமைக்கப்பட்டு உருவாக்கப்பட்டது (பொருட்கள் மற்றும் முறைகளைப் பார்க்கவும்). இன் விவோ பேனிங்கிற்கு முன்பு இந்த நூலகத்தை நாங்கள் கவனமாக பகுப்பாய்வு செய்தோம் என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும். மாற்றியமைக்கப்பட்ட ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி பேஜ் நூலக மாதிரிகளின் PCR பெருக்கம் HTS க்கு நேரடியாகப் பொருந்தக்கூடிய ஆம்பிளிகான்களை உருவாக்கியது (துணை படம் 1a). a) HTS11 வரிசைமுறை பிழைகள், b) ப்ரைமர்களின் தரத்தில் தாக்கம் (NNK)1-12, மற்றும் c) காத்திருப்பு நூலகத்தில் காட்டு-வகை (wt) பேஜ் (எலும்புக்கூடு செருகல்கள்) இருப்பதால், சரிபார்க்கப்பட்ட வரிசைத் தகவலை மட்டுமே பிரித்தெடுக்க ஒரு வரிசை வடிகட்டுதல் செயல்முறை செயல்படுத்தப்பட்டது (துணை படம் 1b). இந்த வடிகட்டி படிகள் அனைத்து HTS வரிசைமுறை நூலகங்களுக்கும் பொருந்தும். நிலையான நூலகத்திற்கு, மொத்தம் 233,868 வாசிப்புகள் பெறப்பட்டன, அவற்றில் 39% வடிகட்டி அளவுகோல்களைக் கடந்துவிட்டன மற்றும் நூலக பகுப்பாய்வு மற்றும் அடுத்தடுத்த சுற்றுகளுக்கான தேர்வுக்கு பயன்படுத்தப்பட்டன (துணை படம் 1c–e). இந்த வாசிப்புகள் முக்கியமாக 3 அடிப்படை ஜோடிகளின் நீளத்தின் மடங்குகளாக இருந்தன, இதன் உச்சம் 36 நியூக்ளியோடைடுகள் (துணை படம் 1c), இது நூலக வடிவமைப்பை (NNK) 1-12 உறுதிப்படுத்துகிறது. குறிப்பிடத்தக்க வகையில், நூலக உறுப்பினர்களில் தோராயமாக 11% பேர் 12-பரிமாண காட்டு-வகை (wt) முதுகெலும்பு PAGISRELVDKL செருகலைக் கொண்டிருந்தனர், மேலும் கிட்டத்தட்ட பாதி வரிசைகள் (49%) செருகல்கள் அல்லது நீக்குதல்களைக் கொண்டிருந்தன. நூலக நூலகத்தின் HTS நூலகத்தில் பெப்டைட்களின் அதிக பன்முகத்தன்மையை உறுதிப்படுத்தியது: 81% க்கும் மேற்பட்ட பெப்டைட் வரிசைகள் ஒரு முறை மட்டுமே காணப்பட்டன, மேலும் ≥4 பிரதிகளில் 1.5% மட்டுமே நிகழ்ந்தன (துணை படம் 2a). தொகுப்பில் உள்ள 12 நிலைகளிலும் உள்ள அமினோ அமிலங்களின் (aa) அதிர்வெண்கள் சிதைந்த NKK தொகுப்பால் உருவாக்கப்பட்ட கோடன்களின் எண்ணிக்கைக்கு எதிர்பார்க்கப்படும் அதிர்வெண்களுடன் நன்கு தொடர்புடையவை (துணை படம் 2b). இந்த செருகல்களால் குறியிடப்பட்ட aa எச்சங்களின் கவனிக்கப்பட்ட அதிர்வெண் கணக்கிடப்பட்ட அதிர்வெண்ணுடன் (r = 0.893) (துணை படம் 2c) நன்கு தொடர்புடையது. உட்செலுத்தலுக்கான பேஜ் நூலகங்களைத் தயாரிப்பதில் எண்டோடாக்சின் பெருக்கம் மற்றும் நீக்குதல் படிகள் அடங்கும். இது பேஜ் நூலகங்களின் பன்முகத்தன்மையைக் குறைக்கும் என்று முன்னர் காட்டப்பட்டுள்ளது12,13. எனவே, எண்டோடாக்சின் அகற்றலுக்கு உட்பட்ட ஒரு தட்டு-பெருக்கப்பட்ட பேஜ் நூலகத்தை வரிசைப்படுத்தி, AA இன் அதிர்வெண்ணை மதிப்பிடுவதற்கு அசல் நூலகத்துடன் ஒப்பிட்டோம். அசல் குளத்திற்கும் பெருக்கப்பட்டு சுத்திகரிக்கப்பட்ட குளத்திற்கும் இடையே ஒரு வலுவான தொடர்பு (r = 0.995) காணப்பட்டது (துணை படம். 2d), T7 பேஜைப் பயன்படுத்தி தட்டுகளில் பெருக்கப்பட்ட குளோன்களுக்கு இடையிலான போட்டி பெரிய சார்பை ஏற்படுத்தவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. இந்த ஒப்பீடு ஒவ்வொரு நூலகத்திலும் உள்ள டிரிபெப்டைட் மையக்கருக்களின் அதிர்வெண்ணை அடிப்படையாகக் கொண்டது, ஏனெனில் நூலகங்களின் பன்முகத்தன்மையை (~109) HTS உடன் கூட முழுமையாகப் பிடிக்க முடியாது. ஒவ்வொரு நிலையிலும் aa இன் அதிர்வெண் பகுப்பாய்வு உள்ளிடப்பட்ட திறனாய்வின் கடைசி மூன்று நிலைகளில் ஒரு சிறிய நிலை சார்ந்த சார்பை வெளிப்படுத்தியது (துணை படம். 2e). முடிவில், நூலகத்தின் தரம் மற்றும் பன்முகத்தன்மை ஏற்றுக்கொள்ளத்தக்கது என்றும், பல சுற்றுத் தேர்வுகளுக்கு இடையில் பேஜ் நூலகங்களின் பெருக்கம் மற்றும் தயாரிப்பு காரணமாக பன்முகத்தன்மையில் சிறிய மாற்றங்கள் மட்டுமே காணப்பட்டன என்றும் நாங்கள் முடிவு செய்தோம்.
BBB மற்றும்/அல்லது BCSFB வழியாக நரம்பு வழியாக செலுத்தப்படும் T7 பேஜை அடையாளம் காண வசதியாக, சுயநினைவுள்ள எலிகளின் CM இல் அறுவை சிகிச்சை மூலம் ஒரு கேனுலாவை பொருத்துவதன் மூலம் தொடர் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவ மாதிரியைச் செய்யலாம் (படம் 1a-b). இன் விவோ தேர்வின் முதல் மூன்று சுற்றுகளில் (படம் 1c) இரண்டு சுயாதீன தேர்வு ஆயுதங்களை (கைகள் A மற்றும் B) பயன்படுத்தினோம். தேர்வின் முதல் மூன்று சுற்றுகளில் அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட பேஜின் மொத்த அளவைக் குறைப்பதன் மூலம் தேர்வின் இறுக்கத்தை படிப்படியாக அதிகரித்தோம். நான்காவது சுற்று பேனிங்கிற்கு, கிளைகள் A மற்றும் B இலிருந்து மாதிரிகளை இணைத்து, மூன்று கூடுதல் சுயாதீன தேர்வுகளைச் செய்தோம். இந்த மாதிரியில் T7 பேஜ் துகள்களின் இன் விவோ பண்புகளை ஆய்வு செய்ய, காட்டு-வகை பேஜ் (PAGISRELVDKL மாஸ்டர் இன்சர்ட்) வால் நரம்பு வழியாக எலிகளுக்கு செலுத்தப்பட்டது. வெவ்வேறு நேர புள்ளிகளில் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் மற்றும் இரத்தத்திலிருந்து பேஜ்களை மீட்டெடுப்பது ஒப்பீட்டளவில் சிறிய T7 ஐகோசஹெட்ரல் பேஜ்கள் இரத்தப் பெட்டியிலிருந்து விரைவான ஆரம்ப அனுமதி கட்டத்தைக் கொண்டிருப்பதைக் காட்டியது (துணை படம் 3). எலிகளுக்கு அளிக்கப்பட்ட டைட்டர்கள் மற்றும் இரத்த அளவை அடிப்படையாகக் கொண்டு, நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்ட 10 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு, நிர்வகிக்கப்பட்ட டோஸிலிருந்து தோராயமாக 1% wt. பேஜ் மட்டுமே இரத்தத்தில் கண்டறியப்பட்டதாகக் கணக்கிட்டோம். இந்த ஆரம்ப விரைவான சரிவுக்குப் பிறகு, 27.7 நிமிடங்கள் அரை ஆயுளுடன் மெதுவான முதன்மை அனுமதி அளவிடப்பட்டது. முக்கியமாக, CSF பெட்டியிலிருந்து மிகக் குறைந்த பேஜ்கள் மட்டுமே மீட்டெடுக்கப்பட்டன, இது CSF பெட்டியில் காட்டு-வகை பேஜ் இடம்பெயர்வுக்கான குறைந்த பின்னணியைக் குறிக்கிறது (துணை படம் 3). சராசரியாக, முழு மாதிரி காலத்திலும் (0-250 நிமிடங்கள்) செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் இரத்தத்தில் T7 பேஜின் சுமார் 1 x 10-3% டைட்டர்களும், ஆரம்பத்தில் உட்செலுத்தப்பட்ட பேஜ்களில் 4 x 10-8% டைட்டர்களும் மட்டுமே கண்டறியப்பட்டன. குறிப்பிடத்தக்க வகையில், செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் காட்டு-வகை பேஜின் அரை-வாழ்க்கை (25.7 நிமிடங்கள்) இரத்தத்தில் காணப்பட்டதைப் போன்றது. இந்தத் தரவுகள், CSF பெட்டியை இரத்தத்திலிருந்து பிரிக்கும் தடையானது CM-கேனுலேட்டட் எலிகளில் அப்படியே இருப்பதைக் காட்டுகின்றன, இது இரத்தத்திலிருந்து CSF பெட்டிக்கு உடனடியாகக் கொண்டு செல்லப்படும் குளோன்களை அடையாளம் காண பேஜ் நூலகங்களின் இன் விவோ தேர்வை அனுமதிக்கிறது.
(அ) ​​ஒரு பெரிய குளத்திலிருந்து செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தை (CSF) மீண்டும் மாதிரி எடுப்பதற்கான ஒரு முறையை அமைத்தல். (ஆ) மத்திய நரம்பு மண்டலம் (CNS) தடையின் செல்லுலார் இருப்பிடத்தையும், இரத்த-மூளைத் தடையை (BBB) ​​மற்றும் இரத்த-மூளைத் தடையைக் கடக்கும் பெப்டைட்களை அடையாளம் காணப் பயன்படுத்தப்படும் தேர்வு உத்தியையும் காட்டும் வரைபடம். (இ) இன் விவோ பேஜ் டிஸ்ப்ளே ஸ்கிரீனிங் பாய்வு விளக்கப்படம். தேர்வின் ஒவ்வொரு சுற்றிலும், பேஜ்கள் (அம்புகளுக்குள் விலங்கு அடையாளங்காட்டிகள்) நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டன. 4வது சுற்று தேர்வு வரை இரண்டு சுயாதீன மாற்று கிளைகள் (A, B) தனித்தனியாக வைக்கப்படுகின்றன. தேர்வு சுற்றுகள் 3 மற்றும் 4 க்கு, CSF இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு பேஜ் குளோனும் கைமுறையாக வரிசைப்படுத்தப்பட்டது. (ஈ) T7 பெப்டைட் நூலகத்தின் (2 x 1012 பேஜ்கள்/விலங்கு) நரம்பு ஊசிக்குப் பிறகு இரண்டு கேனுலேட்டட் எலிகளில் முதல் சுற்று தேர்வின் போது இரத்தம் (சிவப்பு வட்டங்கள்) மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் (பச்சை முக்கோணங்கள்) ஆகியவற்றிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட பேஜின் இயக்கவியல். நீல சதுரங்கள் இரத்தத்தில் உள்ள பேஜின் சராசரி ஆரம்ப செறிவைக் குறிக்கின்றன, இது மொத்த இரத்த அளவைக் கணக்கில் எடுத்துக்கொண்டு செலுத்தப்படும் பேஜின் அளவிலிருந்து கணக்கிடப்படுகிறது. கருப்பு சதுரங்கள் இரத்த பேஜ் செறிவுகளிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட y கோட்டின் குறுக்குவெட்டுப் புள்ளியைக் குறிக்கின்றன. (e,f) பெப்டைடில் காணப்படும் அனைத்து சாத்தியமான ஒன்றுடன் ஒன்று இணைந்த டிரிபெப்டைட் மையக்கருத்துகளின் ஒப்பீட்டு அதிர்வெண் மற்றும் பரவலை வழங்குகின்றன. 1000 அளவீடுகளில் காணப்படும் அனைத்து மையக்கருத்துகளின் எண்ணிக்கை காட்டப்பட்டுள்ளது. குறிப்பிடத்தக்க வகையில் (p < 0.001) செறிவூட்டப்பட்ட மையக்கருத்துகள் சிவப்பு புள்ளிகளால் குறிக்கப்பட்டுள்ளன. (e) ஊசி போடப்பட்ட நூலகத்தின் டிரிபெப்டைட் மையக்கருத்தின் ஒப்பீட்டு அதிர்வெண்ணை விலங்குகள் #1.1 மற்றும் #1.2 இலிருந்து இரத்தத்திலிருந்து பெறப்பட்ட பேஜுடன் ஒப்பிடும் தொடர்பு சிதறல் வரைபடம். (f) இரத்தம் மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட விலங்கு பேஜ் டிரிபெப்டைட் மையக்கருத்துகள் #1.1 மற்றும் #1.2 ஆகியவற்றின் ஒப்பீட்டு அதிர்வெண்களை ஒப்பிடும் தொடர்பு சிதறல் வரைபடம். (g, h) இரத்தத்தில் செறிவூட்டப்பட்ட பேஜ் (g) மற்றும் உட்செலுத்தப்பட்ட நூலகங்கள் மற்றும் CSF (h) இல் செறிவூட்டப்பட்ட பேஜ் மற்றும் இரத்தம் ஆகிய இரண்டிலும் ஒரு சுற்று இன் விவோ தேர்விற்குப் பிறகு வரிசை ஐடி பிரதிநிதித்துவம். ஒற்றை எழுத்து குறியீட்டின் அளவு அந்த அமினோ அமிலம் அந்த நிலையில் எவ்வளவு அடிக்கடி நிகழ்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. பச்சை = துருவ, ஊதா = நடுநிலை, நீலம் = அடிப்படை, சிவப்பு = அமிலத்தன்மை மற்றும் கருப்பு = ஹைட்ரோபோபிக் அமினோ அமிலங்கள். படம் 1a, b எட்வார்ட் யூரிச்சால் வடிவமைக்கப்பட்டு தயாரிக்கப்பட்டது.
இரண்டு CM கருவி எலிகள் (கிளாடுகள் A மற்றும் B) மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் மற்றும் இரத்தத்திலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட பேஜை (படம் 1d) ஆகியவற்றில் ஒரு பேஜ் பெப்டைட் நூலகத்தை செலுத்தினோம். காட்டு-வகை பேஜுடன் ஒப்பிடும்போது நூலகத்தின் ஆரம்ப விரைவான அனுமதி குறைவாகவே இருந்தது. இரண்டு விலங்குகளிலும் செலுத்தப்பட்ட நூலகத்தின் சராசரி அரை ஆயுள் காட்டு-வகை பேஜைப் போலவே இரத்தத்தில் 24.8 நிமிடங்கள் மற்றும் CSF இல் 38.5 நிமிடங்கள் ஆகும். ஒவ்வொரு விலங்கிலிருந்தும் இரத்தம் மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவ பேஜ் மாதிரிகள் HTS க்கு உட்படுத்தப்பட்டன, மேலும் அடையாளம் காணப்பட்ட அனைத்து பெப்டைட்களும் ஒரு குறுகிய டிரிபெப்டைட் மையக்கருத்தின் இருப்புக்காக பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. டிரிபெப்டைட் மையக்கருக்கள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன, ஏனெனில் அவை கட்டமைப்பு உருவாக்கம் மற்றும் பெப்டைட்-புரத தொடர்புகளுக்கு குறைந்தபட்ச அடிப்படையை வழங்குகின்றன 14,15. உட்செலுத்தப்பட்ட பேஜ் நூலகத்திற்கும் இரண்டு விலங்குகளின் இரத்தத்திலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட குளோன்களுக்கும் இடையிலான மையக்கருக்களின் விநியோகத்தில் ஒரு நல்ல தொடர்பைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 1e). நூலகத்தின் கலவை இரத்தப் பெட்டியில் ஓரளவு மட்டுமே செறிவூட்டப்பட்டுள்ளது என்பதை தரவு குறிப்பிடுகிறது. Weblogo16 மென்பொருளின் தழுவலைப் பயன்படுத்தி ஒவ்வொரு நிலையிலும் அமினோ அமில அதிர்வெண்கள் மற்றும் ஒருமித்த வரிசைமுறைகள் மேலும் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. சுவாரஸ்யமாக, இரத்த கிளைசின் எச்சங்களில் வலுவான செறிவூட்டலைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 1g). CSF இலிருந்து தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட குளோன்களுடன் இரத்தத்தை ஒப்பிட்டுப் பார்த்தபோது, ​​வலுவான தேர்வு மற்றும் மையக்கருக்களின் சில தேர்வு நீக்கம் காணப்பட்டது (படம் 1f), மேலும் 12-உறுப்பினர்களில் முன்னரே தீர்மானிக்கப்பட்ட நிலைகளில் சில அமினோ அமிலங்கள் முன்னுரிமையாக இருந்தன (படம் 1h). குறிப்பாக, தனிப்பட்ட விலங்குகள் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் கணிசமாக வேறுபடுகின்றன, அதேசமயம் இரண்டு விலங்குகளிலும் இரத்த கிளைசின் செறிவூட்டல் காணப்பட்டது (துணை படம் 4a-j). #1.1 மற்றும் #1.2 விலங்குகளின் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் வரிசைத் தரவை கடுமையாக வடிகட்டிய பிறகு, மொத்தம் 964 மற்றும் 420 தனித்துவமான 12-மெர் பெப்டைடுகள் பெறப்பட்டன (துணை படம் 1d-e). தனிமைப்படுத்தப்பட்ட பேஜ் குளோன்கள் பெருக்கப்பட்டு இரண்டாவது சுற்று இன் விவோ தேர்வுக்கு உட்படுத்தப்பட்டன. இரண்டாவது சுற்று தேர்விலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட பேஜ் ஒவ்வொரு விலங்கிலும் HTS க்கு உட்படுத்தப்பட்டது, மேலும் அடையாளம் காணப்பட்ட அனைத்து பெப்டைட்களும் டிரிபெப்டைட் மையக்கருத்துகளின் நிகழ்வை பகுப்பாய்வு செய்ய ஒரு மையக்கரு அங்கீகார நிரலுக்கான உள்ளீடாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன (படம் 2a, b, ef). CSF இலிருந்து மீட்டெடுக்கப்பட்ட பேஜின் முதல் சுழற்சியுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​A மற்றும் B கிளைகளில் CSF இல் பல மையக்கருத்துகளின் மேலும் தேர்வு மற்றும் தேர்வு நீக்கத்தை நாங்கள் கவனித்தோம் (படம் 2). அவை நிலையான வரிசையின் வெவ்வேறு வடிவங்களைக் குறிக்கின்றனவா என்பதைத் தீர்மானிக்க ஒரு பிணைய அடையாள வழிமுறை பயன்படுத்தப்பட்டது. மாற்று கிளேட் A (படம் 2c, d) மற்றும் கிளேட் B (படம் 2g, h) இல் CSF ஆல் மீட்டெடுக்கப்பட்ட 12-பரிமாண வரிசைகளுக்கு இடையே ஒரு தெளிவான ஒற்றுமை காணப்பட்டது. ஒவ்வொரு கிளையிலும் தொகுக்கப்பட்ட பகுப்பாய்வு 12-மெர் பெப்டைட்களுக்கான வெவ்வேறு தேர்வு சுயவிவரங்களை வெளிப்படுத்தியது (துணை படம் 5c, d) மற்றும் இரண்டாவது சுற்று தேர்விற்குப் பிறகு தொகுக்கப்பட்ட குளோன்களுக்கு காலப்போக்கில் CSF/இரத்த டைட்டர் விகிதத்தில் அதிகரிப்பு முதல் சுற்று தேர்வோடு ஒப்பிடும்போது (துணை படம் 5e). ).
இரண்டு தொடர்ச்சியான சுற்றுகளில் இன் விவோ செயல்பாட்டு பேஜ் காட்சித் தேர்வு மூலம் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் மையக்கருக்கள் மற்றும் பெப்டைட்களின் செறிவூட்டல்.
ஒவ்வொரு விலங்கின் முதல் சுற்றிலிருந்தும் (விலங்குகள் #1.1 மற்றும் #1.2) மீட்கப்பட்ட அனைத்து செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவ பேஜ்களும் தொகுக்கப்பட்டு, பெருக்கப்பட்டு, HT-வரிசைப்படுத்தப்பட்டு, மீண்டும் ஒன்றாக செலுத்தப்பட்டன (2 x 1010 பேஜ்கள்/விலங்கு) 2 SM கேனுலேட்டட் எலிகள் (#1.1 → #). 2.1 மற்றும் 2.2, 1.2 → 2.3 மற்றும் 2.4). (a,b,e,f) முதல் மற்றும் இரண்டாவது தேர்வு சுற்றுகளில் உள்ள அனைத்து CSF-பெறப்பட்ட பேஜ்களின் டிரிபெப்டைட் மையக்கருக்களின் ஒப்பீட்டு அதிர்வெண்ணை ஒப்பிடும் தொடர்பு சிதறல் வரைபடங்கள். இரண்டு நோக்குநிலைகளிலும் பெப்டைட்களில் காணப்படும் அனைத்து சாத்தியமான ஒன்றுடன் ஒன்று டிரிபெப்டைட்களைக் குறிக்கும் மையக்கருக்களின் ஒப்பீட்டு அதிர்வெண் மற்றும் விநியோகம். 1000 அளவீடுகளில் காணப்படும் மையக்கருக்களின் எண்ணிக்கை காட்டப்பட்டுள்ளது. ஒப்பிடப்பட்ட நூலகங்களில் ஒன்றில் கணிசமாக (p < 0.001) தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட அல்லது விலக்கப்பட்ட மையக்கருக்கள் சிவப்பு புள்ளிகளால் சிறப்பிக்கப்பட்டுள்ளன. (c, d, g, h) இன் விவோ தேர்வின் சுற்றுகள் 2 மற்றும் 1 ஐ அடிப்படையாகக் கொண்ட அனைத்து CSF நிறைந்த 12 அமினோ அமில நீண்ட வரிசைகளின் வரிசை லோகோ பிரதிநிதித்துவம். ஒரு எழுத்து குறியீட்டின் அளவு, அந்த அமினோ அமிலம் அந்த நிலையில் எவ்வளவு அடிக்கடி நிகழ்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. லோகோவைக் குறிக்க, இரண்டு தேர்வு சுற்றுகளுக்கு இடையில் தனிப்பட்ட விலங்குகளிடமிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட CSF வரிசைகளின் அதிர்வெண் ஒப்பிடப்பட்டு, இரண்டாவது சுற்றில் செறிவூட்டப்பட்ட வரிசைகள் காட்டப்படுகின்றன: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 மற்றும் (h) #1.2–#2.4. விலங்குகள் எண். 2.3 மற்றும் எண். 2.4 இல் (c, d) விலங்குகள் எண். 2.1 மற்றும் எண். 2.2 அல்லது (g, h) இல் கொடுக்கப்பட்ட நிலையில் மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட அமினோ அமிலங்கள் நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன. பச்சை = துருவ, ஊதா = நடுநிலை, நீலம் = அடிப்படை, சிவப்பு = அமிலத்தன்மை மற்றும் கருப்பு = ஹைட்ரோபோபிக் அமினோ அமிலங்கள்.
மூன்றாவது சுற்றுத் தேர்விற்குப் பிறகு, இரண்டு விலங்குகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட 332 CSF- மறுகட்டமைக்கப்பட்ட பேஜ் குளோன்களிலிருந்து 124 தனித்துவமான பெப்டைட் வரிசைகளை (#3.1 மற்றும் #3.2) நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (துணை படம் 6a). LGSVS (18.7%) வரிசை மிக உயர்ந்த ஒப்பீட்டு விகிதத்தைக் கொண்டிருந்தது, அதைத் தொடர்ந்து காட்டு-வகை செருகல்கள் PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) மற்றும் SARGSWREIVSLS (2.2%). இறுதி நான்காவது சுற்றில், மூன்று தனித்தனி விலங்குகளிலிருந்து சுயாதீனமாக தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட இரண்டு கிளைகளை நாங்கள் தொகுத்தோம் (படம் 1c). CSF இலிருந்து மீட்கப்பட்ட 925 வரிசைப்படுத்தப்பட்ட பேஜ் குளோன்களில், நான்காவது சுற்றில் 64 தனித்துவமான பெப்டைட் வரிசைகளைக் கண்டறிந்தோம் (துணை படம் 6b), அவற்றில் காட்டு-வகை பேஜின் ஒப்பீட்டு விகிதம் 0.8% ஆகக் குறைந்தது. நான்காவது சுற்றில் மிகவும் பொதுவான CSF குளோன்கள் LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) மற்றும் RLSSVDSDLSGC (3, 2%). தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பெப்டைட்களின் நீள வரம்பு NNK நூலக வடிவமைப்பிற்கு சிதைந்த கோடன்களைப் பயன்படுத்தும் போது நூலக ப்ரைமர்களில் நியூக்ளியோடைடு செருகல்கள்/நீக்கங்கள் அல்லது முன்கூட்டிய நிறுத்த கோடன்கள் காரணமாகும். முன்கூட்டிய நிறுத்த கோடன்கள் குறுகிய பெப்டைட்களை உருவாக்குகின்றன மற்றும் அவை சாதகமான aa மையக்கருத்தைக் கொண்டிருப்பதால் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகின்றன. செயற்கை நூலகங்களின் ப்ரைமர்களில் செருகல்கள்/நீக்கங்கள் காரணமாக நீண்ட பெப்டைடுகள் ஏற்படலாம். இது வடிவமைக்கப்பட்ட நிறுத்த கோடனை சட்டகத்திற்கு வெளியே நிலைநிறுத்தி, கீழ்நோக்கி ஒரு புதிய நிறுத்த கோடன் தோன்றும் வரை அதைப் படிக்கிறது. பொதுவாக, உள்ளீட்டுத் தரவை மாதிரி வெளியீட்டுத் தரவுடன் ஒப்பிட்டு நான்கு தேர்வு சுற்றுகளுக்கும் செறிவூட்டல் காரணிகளைக் கணக்கிட்டோம். முதல் சுற்று ஸ்கிரீனிங்கிற்கு, குறிப்பிட்டதல்லாத பின்னணி குறிப்பாக காட்டு-வகை பேஜ் டைட்டர்களைப் பயன்படுத்தினோம். சுவாரஸ்யமாக, முதல் CSF சுழற்சியில் எதிர்மறை பேஜ் தேர்வு மிகவும் வலுவாக இருந்தது, ஆனால் இரத்தத்தில் இல்லை (படம் 3a), இது பெப்டைட் நூலகத்தின் பெரும்பாலான உறுப்பினர்களை CSF பெட்டியில் செயலற்ற பரவலுக்கான குறைந்த நிகழ்தகவு காரணமாக இருக்கலாம் அல்லது தொடர்புடைய பேஜ்கள் பாக்டீரியோபேஜ்களை விட இரத்த ஓட்டத்தில் இருந்து மிகவும் திறமையாக தக்கவைக்கப்படுகின்றன அல்லது அகற்றப்படுகின்றன. இருப்பினும், இரண்டாவது சுற்று பேனிங்கில், CSF இல் உள்ள பேஜ்களின் வலுவான தேர்வு இரண்டு கிளேடுகளிலும் காணப்பட்டது, இது முந்தைய சுற்று CSF உறிஞ்சுதலை ஊக்குவிக்கும் பெப்டைட்களைக் காட்டும் பேஜ்களில் செறிவூட்டப்பட்டதைக் குறிக்கிறது (படம் 3a). மீண்டும், குறிப்பிடத்தக்க இரத்த செறிவூட்டல் இல்லாமல். மூன்றாவது மற்றும் நான்காவது சுற்றுகளில், பேஜ் குளோன்கள் CSF இல் கணிசமாக செறிவூட்டப்பட்டன. கடைசி இரண்டு சுற்று தேர்வுகளுக்கு இடையில் ஒவ்வொரு தனித்துவமான பெப்டைட் வரிசையின் ஒப்பீட்டு அதிர்வெண்ணை ஒப்பிடுகையில், நான்காவது சுற்று தேர்வில் வரிசைகள் இன்னும் செறிவூட்டப்பட்டிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 3b). இரண்டு பெப்டைட் நோக்குநிலைகளையும் பயன்படுத்தி 64 தனித்துவமான பெப்டைட் வரிசைகளிலிருந்து மொத்தம் 931 டிரைபெப்டைட் மையக்கருக்கள் பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. நான்காவது சுற்றில் மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட மையக்கருக்கள், உட்செலுத்தப்பட்ட நூலகத்துடன் ஒப்பிடும்போது அனைத்து சுற்றுகளிலும் அவற்றின் செறிவூட்டல் சுயவிவரங்களுக்காக மிகவும் நெருக்கமாக ஆராயப்பட்டன (கட்-ஆஃப்: 10% செறிவூட்டல்) (துணை படம் 6c). தேர்வுக்கான பொதுவான வடிவங்கள், ஆய்வு செய்யப்பட்ட பெரும்பாலான நோக்கங்கள் இரண்டு தேர்வு கிளைகளின் முந்தைய அனைத்து சுற்றுகளிலும் செறிவூட்டப்பட்டிருப்பதைக் காட்டியது. இருப்பினும், சில மையக்கருக்கள் (எ.கா. SGL, VSG, LGS GSV) முக்கியமாக மாற்று கிளேட் A இலிருந்து வந்தன, மற்றவை (எ.கா. FGW, RTN, WGF, NTR) மாற்று கிளேட் B இல் செறிவூட்டப்பட்டன.
ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் பேலோடுகளுடன் இணைக்கப்பட்ட CSF-செறிவூட்டப்பட்ட பேஜ்-டிஸ்ப்ளே செய்யப்பட்ட பெப்டைடுகள் மற்றும் பயோடினைலேட்டட் லீடர் பெப்டைடுகளின் CSF போக்குவரத்தின் சரிபார்ப்பு.
(a) நான்கு சுற்றுகளிலும் (R1-R4) கணக்கிடப்பட்ட செறிவூட்டல் விகிதங்கள், உட்செலுத்தப்பட்ட (உள்ளீடு = I) பேஜ் (PFU) டைட்டர்கள் மற்றும் தீர்மானிக்கப்பட்ட CSF பேஜ் டைட்டர்கள் (வெளியீடு = O) அடிப்படையில் கணக்கிடப்பட்டன. கடைசி மூன்று சுற்றுகளுக்கான (R2-R4) செறிவூட்டல் காரணிகள் முந்தைய சுற்று மற்றும் முதல் சுற்று (R1) உடன் எடைத் தரவுகளுடன் ஒப்பிடுவதன் மூலம் கணக்கிடப்பட்டன. திறந்த பார்கள் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம், நிழலாடிய பார்கள் பிளாஸ்மா. (***p<0.001, மாணவரின் t-சோதனையின் அடிப்படையில்). (b) தேர்வின் சுற்று 4 க்குப் பிறகு CSF இல் சேகரிக்கப்பட்ட அனைத்து பேஜ்களுக்கும் அவற்றின் ஒப்பீட்டு விகிதத்தின் படி தரவரிசைப்படுத்தப்பட்ட, மிகுதியான பேஜ் பெப்டைட்களின் பட்டியல். மிகவும் பொதுவான ஆறு பேஜ் குளோன்கள் வண்ணத்தில் சிறப்பிக்கப்பட்டுள்ளன, எண்ணப்பட்டுள்ளன மற்றும் தேர்வின் சுற்று 3 மற்றும் 4 க்கு இடையில் அவற்றின் செறிவூட்டல் காரணிகள் (இன்செட்கள்). (c,d) சுற்று 4 இலிருந்து ஆறு மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட பேஜ் குளோன்கள், வெற்று பேஜ் மற்றும் பெற்றோர் பேஜ் பெப்டைட் நூலகங்கள் CSF மாதிரி மாதிரியில் தனித்தனியாக பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. குறிப்பிடப்பட்ட நேரப் புள்ளிகளில் CSF மற்றும் இரத்த மாதிரிகள் சேகரிக்கப்பட்டன. (c) சம அளவு 6 வேட்பாளர் பேஜ் குளோன்கள் (2 x 1010 பேஜ்கள்/விலங்குகள்), வெற்று பேஜ்கள் (#1779) (2 x 1010 பேஜ்கள்/விலங்குகள்) மற்றும் ஸ்டாக் பேஜ் பெப்டைட் நூலகங்கள் (2 x 1012 பேஜ்கள்/விலங்குகள்) ஊசி போடுதல் குறைந்தது 3 CM கேனுலேட்டட் விலங்குக்கு வால் நரம்பு வழியாக தனித்தனியாக செலுத்தப்படுகிறது. காலப்போக்கில் ஒவ்வொரு ஊசி போடப்பட்ட பேஜ் குளோன் மற்றும் பேஜ் பெப்டைட் நூலகத்தின் CSF மருந்தியக்கவியல் காட்டப்பட்டுள்ளது. (d) மாதிரி நேரத்தில் அனைத்து மீட்கப்பட்ட பேஜ்கள்/மிலிக்குமான சராசரி CSF/இரத்த விகிதத்தைக் காட்டுகிறது. (e) நான்கு செயற்கைத் தலைவர் பெப்டைடுகள் மற்றும் ஒரு ஸ்க்ராம்பிள்டு கட்டுப்பாடு ஆகியவை அவற்றின் N-டெர்மினஸ் (டெட்ராமர் டிஸ்ப்ளே) மூலம் பயோட்டினுடன் ஸ்ட்ரெப்டாவிடினுடன் இணைக்கப்பட்டன, அதைத் தொடர்ந்து ஊசி (வால் நரம்பு iv, 10 மி.கி ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்/கிலோ). குறைந்தது மூன்று இன்ட்யூபேட்டட் எலிகள் (N = 3). குறிப்பிடப்பட்ட நேரப் புள்ளிகளில் CSF மாதிரிகள் சேகரிக்கப்பட்டன, மேலும் ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் செறிவுகள் CSF எதிர்ப்பு ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் ELISA (nd = கண்டறியப்படவில்லை) மூலம் அளவிடப்பட்டன. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA சோதனையின் அடிப்படையில்). (f) மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட பேஜ் பெப்டைட் குளோன் #2002 (ஊதா) இன் அமினோ அமில வரிசையை 4வது சுற்று தேர்விலிருந்து தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பேஜ் பெப்டைட் குளோன்களுடன் ஒப்பிடுதல். ஒரே மாதிரியான மற்றும் ஒத்த அமினோ அமிலத் துண்டுகள் வண்ண-குறியிடப்பட்டுள்ளன.
நான்காவது சுற்றில் (படம் 3b) உள்ள அனைத்து செறிவூட்டப்பட்ட பேஜ்களிலும், CSF மாதிரி மாதிரியில் மேலும் தனிப்பட்ட பகுப்பாய்விற்கு ஆறு கேண்டிடேட் குளோன்கள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன. மூன்று கேனுலேட்டட் CM விலங்குகளில் சம அளவு ஆறு கேண்டிடேட் பேஜ், வெற்று பேஜ் (செருகு இல்லை) மற்றும் புரோபேஜ் பெப்டைட் நூலகங்கள் செலுத்தப்பட்டன, மேலும் CSF (படம் 3c) மற்றும் இரத்த (துணை படம் 7) மதிப்பீடுகளில் மருந்தியக்கவியல் தீர்மானிக்கப்பட்டது. சோதனை செய்யப்பட்ட அனைத்து பேஜ் குளோன்களும் வெற்று கட்டுப்பாட்டு பேஜை (#1779) விட 10-1000 மடங்கு அதிக அளவில் CSF பெட்டியை குறிவைத்தன. எடுத்துக்காட்டாக, குளோன்கள் #2020 மற்றும் #2077 கட்டுப்பாட்டு பேஜை விட சுமார் 1000 மடங்கு அதிக CSF டைட்டர்களைக் கொண்டிருந்தன. தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு பெப்டைட்டின் பார்மகோகினெடிக் சுயவிவரமும் வேறுபட்டது, ஆனால் அவை அனைத்தும் அதிக CSF ஹோமிங் திறனைக் கொண்டுள்ளன. குளோன்கள் #1903 மற்றும் #2011 க்கு காலப்போக்கில் ஒரு நிலையான குறைவை நாங்கள் கவனித்தோம், அதே நேரத்தில் குளோன்கள் #2077, #2002 மற்றும் #2009 க்கு முதல் 10 நிமிடங்களில் அதிகரிப்பு செயலில் உள்ள போக்குவரத்தைக் குறிக்கலாம், ஆனால் சரிபார்க்கப்பட வேண்டும். குளோன்கள் #2020, #2002, மற்றும் #2077 அதிக அளவில் நிலைப்படுத்தப்பட்டன, அதே நேரத்தில் குளோன் #2009 இன் CSF செறிவு ஆரம்ப அதிகரிப்புக்குப் பிறகு மெதுவாகக் குறைந்தது. பின்னர் ஒவ்வொரு CSF வேட்பாளரின் ஒப்பீட்டு அதிர்வெண்ணை அதன் இரத்த செறிவுடன் ஒப்பிட்டுப் பார்த்தோம் (படம் 3d). ஒவ்வொரு CSF வேட்பாளரின் சராசரி டைட்டருக்கும் அதன் இரத்த டைட்டருக்கும் உள்ள தொடர்பு, ஆறு வேட்பாளர்களில் மூன்று பேர் இரத்த CSF இல் கணிசமாக செறிவூட்டப்பட்டிருப்பதைக் காட்டியது. சுவாரஸ்யமாக, குளோன் #2077 அதிக இரத்த நிலைத்தன்மையைக் காட்டியது (துணை படம் 7). பெப்டைடுகள் தாங்களாகவே பேஜ் துகள்களைத் தவிர மற்ற சரக்குகளை CSF பெட்டியில் தீவிரமாக கொண்டு செல்லும் திறன் கொண்டவை என்பதை உறுதிப்படுத்த, பெப்டைடுகள் பேஜ் துகளுடன் இணைக்கப்படும் N-டெர்மினஸில் பயோட்டினுடன் பெறப்பட்ட நான்கு லீடர் பெப்டைட்களை நாங்கள் ஒருங்கிணைத்தோம். பயோடைனிலேட்டட் பெப்டைடுகள் (எண். 2002, 2009, 2020 மற்றும் 2077) ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் (SA) உடன் இணைக்கப்பட்டு, பேஜ் வடிவவியலை ஓரளவு பிரதிபலிக்கும் மல்டிமெரிக் வடிவங்களைப் பெற்றன. இந்த வடிவம், சரக்கு-போக்குவரத்து புரத பெப்டைடுகளாக இரத்தத்திலும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்திலும் SA வெளிப்பாட்டை அளவிடவும் எங்களுக்கு அனுமதித்தது. முக்கியமாக, இந்த SA-இணைந்த வடிவத்தில் செயற்கை பெப்டைடுகள் நிர்வகிக்கப்படும் போது பேஜ் தரவை பெரும்பாலும் மீண்டும் உருவாக்க முடியும் (படம். 3e). ஸ்க்ராம்பிள்டு பெப்டைடுகள் 48 மணி நேரத்திற்குள் கண்டறிய முடியாத அளவுகளுடன் குறைவான ஆரம்ப வெளிப்பாடு மற்றும் வேகமான CSF அனுமதியைக் கொண்டிருந்தன. இந்த பெப்டைட் பேஜ் குளோன்களை CSF இடத்திற்குள் வழங்கும் பாதைகளைப் பற்றிய நுண்ணறிவைப் பெற, இன்ட்ரெவனஸ் இன் இன்ஜினியரிங் இன் விவோவில் பேஜ் துகள்களை நேரடியாகக் கண்டறிய இம்யூனோஹிஸ்டோ கெமிஸ்ட்ரி (IHC) ஐப் பயன்படுத்தி தனிப்பட்ட பேஜ் பெப்டைட் தாக்கங்களின் உள்ளூர்மயமாக்கலை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். குறிப்பாக, குளோன்கள் #2002, #2077, மற்றும் #2009 ஆகியவை மூளை நுண்குழாய்களில் வலுவான கறை படிதல் மூலம் கண்டறியப்படலாம், அதே நேரத்தில் கட்டுப்பாட்டு பேஜ் (#1779) மற்றும் குளோன் #2020 ஆகியவை கண்டறியப்படவில்லை (துணை படம் 8). இந்த பெப்டைடுகள் BBB ஐ துல்லியமாக கடப்பதன் மூலம் மூளையில் ஏற்படும் விளைவுக்கு பங்களிக்கின்றன என்பதை இது குறிக்கிறது. BSCFB வழியும் இதில் ஈடுபடக்கூடும் என்பதால், இந்த கருதுகோளை சோதிக்க மேலும் விரிவான பகுப்பாய்வு தேவைப்படுகிறது. மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட குளோனின் (#2002) அமினோ அமில வரிசையை மற்ற தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பெப்டைடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​அவற்றில் சில ஒத்த அமினோ அமில நீட்டிப்புகளைக் கொண்டிருப்பது குறிப்பிடத்தக்கது, இது ஒத்த போக்குவரத்து பொறிமுறையைக் குறிக்கலாம் (படம் 3f).
அதன் தனித்துவமான பிளாஸ்மா சுயவிவரம் மற்றும் காலப்போக்கில் CSF இல் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பு காரணமாக, phage display clone #2077 நீண்ட 48 மணி நேர காலத்திற்கு மேலும் ஆராயப்பட்டது மற்றும் நிலையான SA அளவுகளுடன் இணைந்து காணப்பட்ட CSF இல் விரைவான அதிகரிப்பை மீண்டும் உருவாக்க முடிந்தது (படம் 4a). மற்ற அடையாளம் காணப்பட்ட phage cloneகளைப் பொறுத்தவரை, #2077 மூளை நுண்குழாய்களுக்கு வலுவாக கறை படிந்துள்ளது மற்றும் அதிக தெளிவுத்திறனில் பார்க்கும்போது கேபிலரி மார்க்கர் லெக்டினுடன் குறிப்பிடத்தக்க கோலோகலைசேஷனைக் காட்டியது மற்றும் பாரன்கிமல் இடத்தில் சில கறை படிந்திருக்கலாம் (படம் 4b). CNS இல் பெப்டைட்-மத்தியஸ்த மருந்தியல் விளைவுகளைப் பெற முடியுமா என்பதை ஆராய, i) #2077 டிரான்சிட் பெப்டைட் மற்றும் ii) BACE1 இன்ஹிபிட்டர் பெப்டைடின் பயோடினைலேட்டட் பதிப்புகள் SA உடன் இரண்டு வெவ்வேறு விகிதங்களில் கலக்கப்பட்ட ஒரு பரிசோதனையை நாங்கள் செய்தோம். ஒரு சேர்க்கைக்கு நாங்கள் BACE1 பெப்டைட் இன்ஹிபிட்டரை மட்டுமே பயன்படுத்தினோம், மற்றொன்றுக்கு BACE1 பெப்டைட் இன்ஹிபிட்டரின் 1:3 விகிதத்தை #2077 பெப்டைடுக்கு பயன்படுத்தினோம். இரண்டு மாதிரிகளும் நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டன, மேலும் பீட்டா-அமிலாய்டு பெப்டைட் 40 (Abeta40) இன் இரத்தம் மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவ அளவுகள் காலப்போக்கில் அளவிடப்பட்டன. மூளை பாரன்கிமாவில் BACE1 தடுப்பை பிரதிபலிப்பதால் Abeta40 CSF இல் அளவிடப்பட்டது. எதிர்பார்த்தபடி, இரண்டு வளாகங்களும் Abeta40 இன் இரத்த அளவைக் கணிசமாகக் குறைத்தன (படம் 4c, d). இருப்பினும், பெப்டைட் எண். 2077 மற்றும் SA உடன் இணைக்கப்பட்ட BACE1 பெப்டைட்டின் தடுப்பானின் கலவையைக் கொண்ட மாதிரிகள் மட்டுமே செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் Abeta40 இல் குறிப்பிடத்தக்க குறைவை ஏற்படுத்தியது (படம் 4c). பெப்டைட் எண். 2077 60 kDa SA புரதத்தை CNS க்குள் கொண்டு செல்ல முடியும் என்றும் BACE1 பெப்டைட்டின் SA-இணைந்த தடுப்பான்களுடன் மருந்தியல் விளைவுகளையும் தூண்டுகிறது என்றும் தரவு காட்டுகிறது.
(அ) ​​குறைந்தபட்சம் மூன்று CM-இன்ட்யூபேட்டட் எலிகளில் CSF பெப்டைட் #2077 (RLSSVDSDLSGC) மற்றும் ஊசி போடப்படாத கட்டுப்பாட்டு பேஜ் (#1779) ஆகியவற்றின் நீண்டகால மருந்தியல் சுயவிவரங்களைக் காட்டும் T7 பேஜின் குளோனல் ஊசி (2 × 10 பேஜ்கள்/விலங்கு). (ஆ) பேஜ்-இன்ட் செய்யப்பட்ட எலிகளில் (2 × 10 பேஜ்கள்/விலங்கு) பிரதிநிதி கார்டிகல் மைக்ரோவெசல்களின் கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோபிக் படம், பெப்டைட் #2077 மற்றும் நாளங்கள் (லெக்டின்) ஆகியவற்றின் எதிர் கறையைக் காட்டுகிறது. இந்த பேஜ் குளோன்கள் 3 எலிகளுக்கு வழங்கப்பட்டு, துளையிடுவதற்கு முன் 1 மணி நேரம் புழக்கத்தில் விடப்பட்டன. மூளைகள் பிரிக்கப்பட்டு, T7 பேஜ் கேப்சிடிற்கு எதிராக பாலிகுளோனல் FITC-லேபிளிடப்பட்ட ஆன்டிபாடிகளால் கறை படிந்தன. துளையிடுதல் மற்றும் அடுத்தடுத்த சரிசெய்தலுக்கு பத்து நிமிடங்களுக்கு முன்பு, DyLight594-லேபிளிடப்பட்ட லெக்டின் நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டது. நுண்குழாய்கள் மற்றும் பெரிவாஸ்குலர் மூளை திசுக்களின் லுமினில் உள்ள நுண்குழாய்கள் மற்றும் பேஜ்களின் (பச்சை) லுமினல் பக்கத்தின் லெக்டின் கறை (சிவப்பு) காட்டும் ஃப்ளோரசன்ட் படங்கள். அளவுகோல் பட்டி 10 µm க்கு ஒத்திருக்கிறது. (c, d) பயோட்டினைலேட்டட் BACE1 இன்ஹிபிட்டரி பெப்டைடு தனியாகவோ அல்லது பயோட்டினைலேட்டட் டிரான்சிட் பெப்டைடு #2077 உடன் இணைந்து ஸ்ட்ரெப்டாவிடினுடன் இணைக்கப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து குறைந்தது மூன்று கேனுலேட்டட் CM எலிகள் (10 மி.கி ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்/கிலோ) நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டன. Aβ40 இல் BACE1 பெப்டைட் இன்ஹிபிட்டர்-மத்தியஸ்த குறைப்பு இரத்தத்தில் (சிவப்பு) மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் (ஆரஞ்சு) Aβ1-40 ELISA ஆல் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட நேர புள்ளிகளில் அளவிடப்பட்டது. சிறந்த தெளிவுக்காக, வரைபடத்தில் 100% அளவில் ஒரு புள்ளியிடப்பட்ட கோடு வரையப்பட்டுள்ளது. (இ) 3:1 விகிதத்தில் டிரான்சிட் பெப்டைட் #2077 மற்றும் BACE1 இன்ஹிபிட்டரி பெப்டைடுடன் இணைக்கப்பட்ட ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் மூலம் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட எலிகளில் இரத்தத்தில் (சிவப்பு முக்கோணங்கள்) மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் (ஆரஞ்சு முக்கோணங்கள்) Aβ40 சதவீதக் குறைப்பு. (ஈ) BACE1 இன்ஹிபிட்டரி பெப்டைடுடன் மட்டும் இணைக்கப்பட்ட ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் மூலம் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட எலிகளில் இரத்தத்தில் Aβ40 (சிவப்பு வட்டங்கள்) மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் (ஆரஞ்சு வட்டங்கள்) சதவீதக் குறைப்பு. கட்டுப்பாட்டில் Aβ செறிவு 420 pg/ml (நிலையான விலகல் = 101 pg/ml).
உயிரி மருத்துவ ஆராய்ச்சியின் பல பகுதிகளில் பேஜ் காட்சி வெற்றிகரமாகப் பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளது17. இந்த முறை இன் விவோ வாஸ்குலர் பன்முகத்தன்மை ஆய்வுகள்18,19 மற்றும் பெருமூளை நாளங்களை இலக்காகக் கொண்ட ஆய்வுகள்20,21,22,23,24,25,26 ஆகியவற்றுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளது. இந்த ஆய்வில், பெருமூளை நாளங்களை இலக்காகக் கொண்ட பெப்டைட்களை நேரடியாக அடையாளம் காண்பதற்கு மட்டுமல்லாமல், இரத்த-மூளைத் தடையைக் கடக்க செயலில் போக்குவரத்து பண்புகளைக் கொண்ட வேட்பாளர்களைக் கண்டுபிடிப்பதற்கும் இந்த தேர்வு முறையின் பயன்பாட்டை நாங்கள் விரிவுபடுத்தினோம். CM இன்ட்யூபேட்டட் எலிகளில் இன் விவோ தேர்வு நடைமுறையின் வளர்ச்சியை நாங்கள் இப்போது விவரிக்கிறோம் மற்றும் CSF ஹோமிங் பண்புகளுடன் பெப்டைட்களை அடையாளம் காணும் அதன் திறனை நிரூபிக்கிறோம். 12-மெர் சீரற்ற பெப்டைட்களின் நூலகத்தைக் காண்பிக்கும் T7 பேஜைப் பயன்படுத்தி, T7 பேஜ் இரத்த-மூளைத் தடைக்கு ஏற்றவாறு (தோராயமாக 60 nm விட்டம்)10 சிறியது என்பதை நிரூபிக்க முடிந்தது, இதன் மூலம் இரத்த-மூளைத் தடை அல்லது கோராய்டு பிளெக்ஸஸை நேரடியாகக் கடக்கிறது. கேனுலேட்டட் CM எலிகளிடமிருந்து CSF அறுவடை நன்கு கட்டுப்படுத்தப்பட்ட இன் விவோ செயல்பாட்டு ஸ்கிரீனிங் முறையாகும் என்பதையும், பிரித்தெடுக்கப்பட்ட பேஜ் வாஸ்குலேச்சருடன் பிணைக்கப்படுவது மட்டுமல்லாமல், இரத்த-மூளைத் தடையைத் தாண்டி ஒரு டிரான்ஸ்போர்ட்டராகவும் செயல்படுகிறது என்பதையும் நாங்கள் கவனித்தோம். மேலும், ஒரே நேரத்தில் இரத்தத்தைச் சேகரித்து, CSF மற்றும் இரத்தத்திலிருந்து பெறப்பட்ட பேஜ்களுக்கு HTS ஐப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், CSF இன் எங்கள் தேர்வு இரத்த செறிவூட்டல் அல்லது தேர்வு சுற்றுகளுக்கு இடையில் விரிவாக்கத்திற்கான தகுதியால் பாதிக்கப்படவில்லை என்பதை உறுதிப்படுத்தினோம். இருப்பினும், CSF பெட்டியை அடையக்கூடிய பேஜ்கள் மூளையில் தங்களை வளப்படுத்த போதுமான அளவு உயிர்வாழ வேண்டும் மற்றும் இரத்த ஓட்டத்தில் பரவ வேண்டும் என்பதால், இரத்தப் பெட்டி தேர்வு நடைமுறையின் ஒரு பகுதியாகும். மூல HTS தரவிலிருந்து நம்பகமான வரிசைத் தகவலைப் பிரித்தெடுக்க, பகுப்பாய்வு பணிப்பாய்வில் தளம்-குறிப்பிட்ட வரிசைமுறை பிழைகளுக்கு ஏற்ற வடிகட்டிகளை நாங்கள் செயல்படுத்தினோம். ஸ்கிரீனிங் முறையில் இயக்கவியல் அளவுருக்களை இணைப்பதன் மூலம், இரத்தத்தில் காட்டு-வகை T7 பேஜ்களின் (t½ ~ 28 நிமிடம்) விரைவான மருந்தியக்கவியலை நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம், மேலும் நிமிடத்திற்கு செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் (t½ ~ 26 நிமிடம்) அவற்றின் அரை ஆயுளையும் தீர்மானித்தோம். இரத்தம் மற்றும் CSF இல் இதேபோன்ற பார்மகோகினெடிக் சுயவிவரங்கள் இருந்தபோதிலும், CSF இல் பேஜின் இரத்த செறிவில் 0.001% மட்டுமே கண்டறியப்பட்டது, இது இரத்த-மூளைத் தடையில் காட்டு-வகை T7 பேஜின் குறைந்த பின்னணி இயக்கத்தைக் குறிக்கிறது. இந்த வேலை, இன் விவோ பேனிங் உத்திகளைப் பயன்படுத்தும் போது முதல் சுற்று தேர்வின் முக்கியத்துவத்தை எடுத்துக்காட்டுகிறது, குறிப்பாக சுழற்சியில் இருந்து விரைவாக அழிக்கப்படும் பேஜ் அமைப்புகளுக்கு, சில குளோன்கள் CNS பெட்டியை அடைய முடிகிறது. எனவே, முதல் சுற்றில், நூலக பன்முகத்தன்மையில் குறைப்பு மிகப் பெரியதாக இருந்தது, ஏனெனில் இந்த மிகக் கடுமையான CSF மாதிரியில் குறைந்த எண்ணிக்கையிலான குளோன்கள் மட்டுமே சேகரிக்கப்பட்டன. இந்த இன் விவோ பேனிங் உத்தியில் CSF பெட்டியில் செயலில் குவிப்பு, இரத்தப் பெட்டியில் குளோன் உயிர்வாழ்வு மற்றும் முதல் 10 நிமிடங்களுக்குள் இரத்தத்திலிருந்து T7 பேஜ் குளோன்களை விரைவாக அகற்றுதல் போன்ற பல தேர்வு படிகள் அடங்கும் (படம் 1d மற்றும் துணை படம் 4M). எனவே, முதல் சுற்றுக்குப் பிறகு, CSF இல் வெவ்வேறு பேஜ் குளோன்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன, இருப்பினும் அதே ஆரம்பக் குளம் தனிப்பட்ட விலங்குகளுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது. அதிக எண்ணிக்கையிலான நூலக உறுப்பினர்களைக் கொண்ட மூல நூலகங்களுக்கான பல கடுமையான தேர்வு படிகள் பன்முகத்தன்மையில் குறிப்பிடத்தக்க குறைப்பை ஏற்படுத்துகின்றன என்பதை இது குறிக்கிறது. எனவே, சீரற்ற நிகழ்வுகள் ஆரம்ப தேர்வு செயல்முறையின் ஒருங்கிணைந்த பகுதியாக மாறும், இது முடிவை பெரிதும் பாதிக்கும். அசல் நூலகத்தில் உள்ள பல குளோன்கள் மிகவும் ஒத்த CSF செறிவூட்டல் போக்கைக் கொண்டிருந்திருக்கலாம். இருப்பினும், அதே சோதனை நிலைமைகளின் கீழ் கூட, ஆரம்பக் குளத்தில் உள்ள ஒவ்வொரு குறிப்பிட்ட குளோனின் சிறிய எண்ணிக்கையின் காரணமாக தேர்வு முடிவுகள் வேறுபடலாம்.
CSF இல் செறிவூட்டப்பட்ட மையக்கருக்கள் இரத்தத்தில் உள்ளவற்றிலிருந்து வேறுபடுகின்றன. சுவாரஸ்யமாக, தனிப்பட்ட விலங்குகளின் இரத்தத்தில் கிளைசின் நிறைந்த பெப்டைட்களை நோக்கிய முதல் மாற்றத்தை நாங்கள் கவனித்தோம். (படம் 1g, துணை படங்கள் 4e, 4f). கிளைசின் பெப்டைட்களைக் கொண்ட பேஜ் மிகவும் நிலையானதாகவும், சுழற்சியில் இருந்து அகற்றப்படுவதற்கான வாய்ப்புகள் குறைவாகவும் இருக்கலாம். இருப்பினும், இந்த கிளைசின் நிறைந்த பெப்டைடுகள் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவ மாதிரிகளில் கண்டறியப்படவில்லை, இது நிர்வகிக்கப்பட்ட நூலகங்கள் இரண்டு வெவ்வேறு தேர்வு படிகளை கடந்து சென்றதைக் குறிக்கிறது: ஒன்று இரத்தத்தில் மற்றும் மற்றொன்று செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் குவிக்க அனுமதிக்கப்பட்டது. நான்காவது சுற்று தேர்வின் விளைவாக CSF-செறிவூட்டப்பட்ட குளோன்கள் விரிவாக சோதிக்கப்பட்டுள்ளன. வெற்று கட்டுப்பாட்டு பேஜுடன் ஒப்பிடும்போது தனித்தனியாக சோதிக்கப்பட்ட குளோன்கள் அனைத்தும் CSF இல் செறிவூட்டப்பட்டிருப்பது உறுதி செய்யப்பட்டது. ஒரு பெப்டைட் ஹிட் (#2077) இன்னும் விரிவாக ஆராயப்பட்டது. மற்ற வெற்றிகளுடன் ஒப்பிடும்போது இது நீண்ட பிளாஸ்மா அரை ஆயுளைக் காட்டியது (படம் 3d மற்றும் துணை படம் 7), மேலும் சுவாரஸ்யமாக, இந்த பெப்டைடில் C-டெர்மினஸில் ஒரு சிஸ்டைன் எச்சத்தைக் கொண்டிருந்தது. பெப்டைடுகளுடன் சிஸ்டைனைச் சேர்ப்பது ஆல்புமின் 29 உடன் பிணைப்பதன் மூலம் அவற்றின் மருந்தியல் பண்புகளை மேம்படுத்த முடியும் என்று சமீபத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது. இது தற்போது பெப்டைட் #2077 க்கு தெரியவில்லை மற்றும் மேலும் ஆய்வு தேவைப்படுகிறது. சில பெப்டைடுகள் CSF செறிவூட்டலில் ஒரு வேலன்ஸ்-சார்புநிலையைக் காட்டின (தரவு காட்டப்படவில்லை), இது T7 கேப்சிட்டின் காட்டப்பட்ட மேற்பரப்பு வடிவவியலுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம். நாங்கள் பயன்படுத்திய T7 அமைப்பு ஒரு பேஜ் துகள் ஒன்றுக்கு ஒவ்வொரு பெப்டைட்டின் 5-15 நகல்களைக் காட்டியது. எலிகளின் பெருமூளைப் புறணிக்குள் நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்ட வேட்பாளர் லீட் பேஜ் குளோன்களில் IHC செய்யப்பட்டது (துணை படம் 8). தரவு குறைந்தது மூன்று குளோன்கள் (எண். 2002, எண். 2009 மற்றும் எண். 2077) BBB உடன் தொடர்பு கொண்டதாகக் காட்டியது. இந்த BBB தொடர்பு CSF குவிவதற்கு வழிவகுக்குமா அல்லது இந்த குளோன்களை நேரடியாக BCSFB க்கு நகர்த்துவதா என்பது இன்னும் தீர்மானிக்கப்படவில்லை. முக்கியமாக, தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் தொகுக்கப்பட்டு புரத சரக்குடன் பிணைக்கப்படும்போது அவற்றின் CSF போக்குவரத்து திறனைத் தக்கவைத்துக்கொள்கின்றன என்பதைக் காட்டுகிறோம். N-முனைய பயோடினைலேட்டட் பெப்டைட்களை SA உடன் பிணைப்பது அடிப்படையில் இரத்தத்திலும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்திலும் உள்ள அந்தந்த பேஜ் குளோன்களுடன் பெறப்பட்ட முடிவுகளை மீண்டும் செய்கிறது (படம் 3e). இறுதியாக, லீட் பெப்டைட் #2077, SA உடன் இணைக்கப்பட்ட BACE1 இன் பயோடினைலேட்டட் பெப்டைட் தடுப்பானின் மூளை செயல்பாட்டை ஊக்குவிக்க முடியும் என்பதைக் காட்டுகிறோம், இது CSF இல் Abeta40 அளவைக் கணிசமாகக் குறைப்பதன் மூலம் CNS இல் உச்சரிக்கப்படும் மருந்தியல் விளைவுகளை ஏற்படுத்துகிறது (படம் 4). அனைத்து வெற்றிகளின் பெப்டைட் வரிசை ஹோமோலாஜி தேடலைச் செய்வதன் மூலம் தரவுத்தளத்தில் எந்த ஹோமோலாக்களையும் எங்களால் அடையாளம் காண முடியவில்லை. T7 நூலகத்தின் அளவு தோராயமாக 109 ஆகவும், 12-மெர்களுக்கான கோட்பாட்டு நூலக அளவு 4 x 1015 ஆகவும் இருப்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும். எனவே, 12-மெர் பெப்டைட் நூலகத்தின் பன்முகத்தன்மை இடத்தின் ஒரு சிறிய பகுதியை மட்டுமே நாங்கள் தேர்ந்தெடுத்தோம், அதாவது இந்த அடையாளம் காணப்பட்ட வெற்றிகளின் அருகிலுள்ள வரிசை இடத்தை மதிப்பிடுவதன் மூலம் அதிக உகந்த பெப்டைட்களை அடையாளம் காண முடியும். அனுமானமாக, இந்த பெப்டைட்களின் எந்த இயற்கையான ஹோமோலாக்களையும் நாம் கண்டுபிடிக்காததற்கான காரணங்களில் ஒன்று, மூளைக்குள் சில பெப்டைட் மையக்கருக்கள் கட்டுப்பாடில்லாமல் நுழைவதைத் தடுக்க பரிணாம வளர்ச்சியின் போது தேர்வு நீக்கம் செய்யப்பட்டிருக்கலாம்.
ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், எங்கள் முடிவுகள், செரிப்ரோவாஸ்குலர் தடையின் போக்குவரத்து அமைப்புகளை இன் விவோவில் இன்னும் விரிவாக அடையாளம் காணவும் வகைப்படுத்தவும் எதிர்கால வேலைகளுக்கு ஒரு அடிப்படையை வழங்குகின்றன. இந்த முறையின் அடிப்படை அமைப்பு, பெருமூளை வாஸ்குலர் பிணைப்பு பண்புகளைக் கொண்ட குளோன்களை அடையாளம் காண்பது மட்டுமல்லாமல், வெற்றிகரமான குளோன்கள் இன் விவோவில் உயிரியல் தடைகளைக் கடந்து சிஎன்எஸ் பெட்டிக்குள் செல்ல உள்ளார்ந்த செயல்பாட்டைக் கொண்ட ஒரு முக்கியமான படியையும் உள்ளடக்கியது. இந்த பெப்டைட்களின் போக்குவரத்தின் பொறிமுறையையும், மூளைப் பகுதிக்கு குறிப்பிட்ட மைக்ரோவாஸ்குலேச்சருடன் பிணைப்பதற்கான அவற்றின் விருப்பத்தையும் தெளிவுபடுத்துவதாகும். இது BBB மற்றும் ஏற்பிகளின் போக்குவரத்திற்கான புதிய பாதைகளைக் கண்டறிய வழிவகுக்கும். அடையாளம் காணப்பட்ட பெப்டைடுகள் நேரடியாக செரிப்ரோவாஸ்குலர் ஏற்பிகளுடன் அல்லது BBB அல்லது BCSFB மூலம் கொண்டு செல்லப்படும் சுற்றும் லிகண்ட்களுடன் பிணைக்க முடியும் என்று நாங்கள் எதிர்பார்க்கிறோம். இந்த வேலையில் கண்டுபிடிக்கப்பட்ட CSF போக்குவரத்து செயல்பாட்டைக் கொண்ட பெப்டைட் திசையன்கள் மேலும் ஆராயப்படும். BBB மற்றும்/அல்லது BCSFB ஐ கடக்கும் திறனுக்காக இந்த பெப்டைட்களின் மூளைத் தனித்துவத்தை நாங்கள் தற்போது ஆராய்ந்து வருகிறோம். இந்த புதிய பெப்டைடுகள் புதிய ஏற்பிகள் அல்லது பாதைகளின் சாத்தியமான கண்டுபிடிப்புக்கும், உயிரியல் போன்ற பெரிய மூலக்கூறுகளை மூளைக்கு வழங்குவதற்கான புதிய மிகவும் திறமையான தளங்களை உருவாக்குவதற்கும் மிகவும் மதிப்புமிக்க கருவிகளாக இருக்கும்.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட முறையை மாற்றியமைத்து பெரிய சிஸ்டெர்னாவை (CM) கேனுலேட் செய்யவும். மயக்க மருந்து செய்யப்பட்ட விஸ்டார் எலிகள் (200-350 கிராம்) ஒரு ஸ்டீரியோடாக்சிக் கருவியில் பொருத்தப்பட்டு, மண்டை ஓட்டை வெளிப்படுத்த மொட்டையடிக்கப்பட்ட மற்றும் அசெப்டிகலாக தயாரிக்கப்பட்ட உச்சந்தலையில் ஒரு சராசரி கீறல் செய்யப்பட்டது. மேல் புடவையின் பகுதியில் இரண்டு துளைகளை துளைத்து, துளைகளில் உள்ள பொருத்துதல் திருகுகளை கட்டவும். CM இல் ஒரு துருப்பிடிக்காத எஃகு கேனுலாவின் ஸ்டீரியோடாக்டிக் வழிகாட்டுதலுக்காக பக்கவாட்டு ஆக்ஸிபிடல் க்ரெஸ்டில் கூடுதல் துளை துளைக்கப்பட்டது. கேனுலாவைச் சுற்றி பல் சிமெண்டைப் பூசி திருகுகளால் பாதுகாக்கவும். புகைப்படக் குணப்படுத்துதல் மற்றும் சிமென்ட் கடினப்படுத்தலுக்குப் பிறகு, தோல் காயம் 4/0 சூப்பர்மிட் தையல் மூலம் மூடப்பட்டது. கேனுலாவின் சரியான இடம் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தின் (CSF) தன்னிச்சையான கசிவால் உறுதிப்படுத்தப்படுகிறது. ஸ்டீரியோடாக்சிக் கருவியிலிருந்து எலியை அகற்றி, பொருத்தமான அறுவை சிகிச்சைக்குப் பின் பராமரிப்பு மற்றும் வலி மேலாண்மையைப் பெற்று, செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் இரத்தத்தின் அறிகுறிகள் காணப்படும் வரை குறைந்தது ஒரு வாரமாவது அதை மீட்க அனுமதிக்கவும். விஸ்டார் எலிகள் (Crl:WI/Han) சார்லஸ் நதியிலிருந்து (பிரான்ஸ்) பெறப்பட்டன. அனைத்து எலிகளும் குறிப்பிட்ட நோய்க்கிருமி இல்லாத சூழ்நிலையில் வைக்கப்பட்டன. அனைத்து விலங்கு பரிசோதனைகளும் சுவிட்சர்லாந்தின் பாஸல் நகரத்தின் கால்நடை அலுவலகத்தால் அங்கீகரிக்கப்பட்டன, மேலும் அவை விலங்கு உரிமம் எண். 2474 இன் படி செய்யப்பட்டன (எலியின் மூளை மற்றும் மூளையில் சிகிச்சை வேட்பாளர்களின் அளவை அளவிடுவதன் மூலம் செயலில் மூளை போக்குவரத்தின் மதிப்பீடு).
எலியை மெதுவாக சுயநினைவுடன் வைத்திருக்க CM கேனுலாவை கையில் வைத்திருங்கள். கேனுலாவிலிருந்து டதுராவை அகற்றி, தன்னிச்சையாக பாயும் 10 µl செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தை சேகரிக்கவும். கேனுலாவின் காப்புரிமை இறுதியில் பாதிக்கப்பட்டதால், இரத்த மாசுபாடு அல்லது நிறமாற்றம் ஏற்பட்டதற்கான எந்த ஆதாரமும் இல்லாத தெளிவான செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவ மாதிரிகள் மட்டுமே இந்த ஆய்வில் சேர்க்கப்பட்டன. இணையாக, வால் நுனியில் ஒரு சிறிய கீறலில் இருந்து ஹெப்பரின் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) கொண்ட குழாய்களில் தோராயமாக 10-20 μl இரத்தம் எடுக்கப்பட்டது. T7 பேஜை நரம்பு வழியாக செலுத்திய பிறகு பல்வேறு நேர புள்ளிகளில் CSF மற்றும் இரத்தம் சேகரிக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு CSF மாதிரியும் சேகரிக்கப்படுவதற்கு முன்பு தோராயமாக 5-10 μl திரவம் நிராகரிக்கப்பட்டது, இது வடிகுழாயின் இறந்த அளவிற்கு ஒத்திருக்கிறது.
T7Select அமைப்பு கையேட்டில் (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி T7Select 10-3b திசையனைப் பயன்படுத்தி நூலகங்கள் உருவாக்கப்பட்டன. சுருக்கமாக, ஒரு சீரற்ற 12-mer DNA செருகல் பின்வரும் வடிவத்தில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது:
இரட்டை நிறுத்த கோடன்கள் மற்றும் அமினோ அமில அதிகப்படியான வெளிப்பாட்டைச் செருகலில் தவிர்க்க NNK கோடன் பயன்படுத்தப்பட்டது. N என்பது ஒவ்வொரு நியூக்ளியோடைட்டின் கைமுறையாகக் கலந்த சமமோலார் விகிதமாகும், மேலும் K என்பது அடினீன் மற்றும் சைட்டோசின் நியூக்ளியோடைடுகளின் கைமுறையாகக் கலந்த சமமோலார் விகிதமாகும். 37°C வெப்பநிலையில் 3 மணி நேரம் க்ளெனோ பஃபரில் (நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்) dNTP (நோவேஜன்) மற்றும் க்ளெனோ என்சைம் (நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்) உடன் மேலும் அடைகாப்பதன் மூலம் ஒற்றை ஸ்ட்ராண்டட் பகுதிகள் இரட்டை ஸ்ட்ராண்டட் DNA ஆக மாற்றப்பட்டன. எதிர்வினைக்குப் பிறகு, இரட்டை ஸ்ட்ராண்டட் DNA EtOH மழைப்பொழிவால் மீட்டெடுக்கப்பட்டது. இதன் விளைவாக வரும் DNA கட்டுப்பாட்டு நொதிகளான EcoRI மற்றும் HindIII (இரண்டும் ரோச்சிலிருந்து) மூலம் செரிக்கப்பட்டது. பிளவுபடுத்தப்பட்ட மற்றும் சுத்திகரிக்கப்பட்ட (QIAquick, Qiagen) செருகல் (T4 ligase, New England Biolabs) பின்னர் 10B கேப்சிட் மரபணுவின் அமினோ அமிலம் 348 க்குப் பிறகு முன்-பிளக்கப்பட்ட T7 வெக்டரில் சட்டத்தில் லிகேட் செய்யப்பட்டது. இன் விட்ரோ பேக்கேஜிங்கிற்கு 18 மணி நேரத்திற்கு முன்பு 16° செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் பிணைப்பு எதிர்வினைகள் அடைகாக்கப்பட்டன. T7Select 10-3b குளோனிங் கிட் (நோவஜென்) உடன் வழங்கப்பட்ட வழிமுறைகளின்படி பேஜ் பேக்கேஜிங் இன் விட்ரோ செய்யப்பட்டது மற்றும் எஸ்கெரிச்சியா கோலி (BLT5615, நோவஜென்) ஐப் பயன்படுத்தி பேக்கேஜிங் கரைசல் ஒரு முறை லிசிஸுக்கு பெருக்கப்பட்டது. லைசேட்டுகள் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டு, டைட்ரேட் செய்யப்பட்டு -80° செல்சியஸில் கிளிசராலின் ஸ்டாக் கரைசலாக உறைந்தன.
தனியுரிம 454/ரோச்-ஆம்ப்ளிகான் இணைவு ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி குழம்பு அல்லது தட்டில் பெருக்கப்பட்ட பேஜ் மாறி பகுதிகளின் நேரடி PCR பெருக்கம். முன்னோக்கி இணைவு ப்ரைமரில் மாறி பகுதி (NNK) 12 (வார்ப்புரு-குறிப்பிட்டது), GS FLX டைட்டானியம் அடாப்டர் A மற்றும் நான்கு-அடிப்படை நூலக விசை வரிசை (TCAG) ஆகியவற்றைச் சுற்றியுள்ள வரிசைகள் உள்ளன (துணை படம் 1a):
தலைகீழ் இணைவு ப்ரைமரில் மணிகளைப் பிடிக்க இணைக்கப்பட்ட பயோட்டின் மற்றும் எமல்ஷன் PCR இன் போது குளோனல் பெருக்கத்திற்குத் தேவையான GS FLX டைட்டானியம் அடாப்டர் B ஆகியவை உள்ளன:
பின்னர் 454 GS-FLX டைட்டானியம் நெறிமுறையின்படி ஆம்பிளிகான்கள் 454/ரோச் பைரோசீக்வென்சிங்கிற்கு உட்படுத்தப்பட்டன. கையேடு சாங்கர் வரிசைமுறைக்கு (அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸ் ஹிட்டாச்சி 3730 xl டிஎன்ஏ அனலைசர்), T7 பேஜ் டிஎன்ஏ PCR ஆல் பெருக்கப்பட்டு பின்வரும் ப்ரைமர் ஜோடிகளுடன் வரிசைப்படுத்தப்பட்டது:
ரோச் ஃபாஸ்ட் ஸ்டார்ட் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் கிட் (உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி) பயன்படுத்தி தனிப்பட்ட பிளேக்குகளிலிருந்து செருகல்கள் PCR பெருக்கத்திற்கு உட்படுத்தப்பட்டன. சூடான தொடக்கத்தை (95 °C இல் 10 நிமிடம்) மற்றும் 35 பூஸ்ட் சுழற்சிகளை (95 °C இல் 50 வினாடிகள், 50 °C இல் 1 நிமிடம் மற்றும் 72 °C இல் 1 நிமிடம்) செய்யவும்.
நூலகங்களிலிருந்து பெறப்பட்ட பேஜ், காட்டு வகை பேஜ், CSF மற்றும் இரத்தத்திலிருந்து மீட்கப்பட்ட பேஜ் அல்லது தனிப்பட்ட குளோன்கள், Escherichia coli BL5615 இல் TB குழம்பில் (சிக்மா ஆல்ட்ரிச்) அல்லது 500 செ.மீ2 டிஷ்களில் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்) 37°C வெப்பநிலையில் 4 மணிநேரத்திற்கு பெருக்கப்பட்டன. டிரிஸ்-எடிடிஏ பஃபர் (ஃப்ளூகா அனலிட்டிகல்) மூலம் தட்டுகளை கழுவுவதன் மூலமோ அல்லது ஸ்டெரைல் பைப்பேட் முனைகளால் பிளேக்குகளை சேகரிப்பதன் மூலமோ பேஜ் தட்டுகளிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. பாலிஎதிலீன் கிளைகோல் (PEG 8000) வீழ்படிவு (ப்ரோமேகா) மூலம் ஒரு சுற்று கலாச்சார சூப்பர்நேட்டண்ட் அல்லது பிரித்தெடுத்தல் பஃபரிலிருந்து பேஜ் தனிமைப்படுத்தப்பட்டு டிரிஸ்-எடிடிஏ பஃபரில் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டது.
நரம்பு வழி (IV) ஊசிக்கு (500 μl/விலங்கு) முன், பெருக்கப்பட்ட பேஜை எண்டோடாக்சின் நீக்கும் மணிகள் (மில்டென்யி பயோடெக்) பயன்படுத்தி 2-3 சுற்றுகள் எண்டோடாக்சின் நீக்கத்திற்கு உட்படுத்தப்பட்டது. முதல் சுற்றில், 2×1012 பேஜ்கள் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டன; இரண்டாவது சுற்றில், 2×1010 பேஜ்கள்; மூன்றாவது மற்றும் நான்காவது தேர்வு சுற்றுகளில், ஒரு விலங்குக்கு 2×109 பேஜ்கள். CSF மற்றும் இரத்த மாதிரிகளில் உள்ள பேஜ் உள்ளடக்கம், குறிப்பிட்ட நேர புள்ளிகளில் சேகரிக்கப்பட்டது, உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி (T7Select அமைப்பு கையேடு) பிளேக் எண்ணிக்கை மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்டது. சுத்திகரிக்கப்பட்ட நூலகங்களை வால் நரம்புக்குள் நரம்பு வழியாக செலுத்துவதன் மூலமோ அல்லது முந்தைய தேர்வு சுற்றில் இருந்து CSF இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட பேஜை மீண்டும் செலுத்துவதன் மூலமோ பேஜ் தேர்வு செய்யப்பட்டது, மேலும் அடுத்தடுத்த அறுவடைகள் முறையே CSF மற்றும் இரத்த மாதிரிகள் 10 நிமிடங்கள், 30 நிமிடங்கள், 60 நிமிடங்கள், 90 நிமிடங்கள், 120 நிமிடங்கள், 180 நிமிடங்கள் மற்றும் 240 நிமிடங்களில் செய்யப்பட்டன. மொத்தம் நான்கு சுற்று இன் விவோ பேனிங் நடத்தப்பட்டது, இதில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட இரண்டு கிளைகளும் தனித்தனியாக சேமிக்கப்பட்டு முதல் மூன்று சுற்று தேர்வின் போது பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. முதல் இரண்டு சுற்று தேர்விலிருந்து CSF இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட அனைத்து பேஜ் செருகல்களும் 454/ரோச் பைரோசீக்வென்சிங்கிற்கு உட்படுத்தப்பட்டன, அதே நேரத்தில் கடைசி இரண்டு சுற்று தேர்விலிருந்து CSF இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட அனைத்து குளோன்களும் கைமுறையாக வரிசைப்படுத்தப்பட்டன. முதல் சுற்று தேர்விலிருந்து அனைத்து இரத்த பேஜ்களும் 454/ரோச் பைரோசீக்வென்சிங்கிற்கு உட்படுத்தப்பட்டன. பேஜ் குளோன்களை செலுத்துவதற்கு, தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பேஜ்கள் E. coli (BL5615) இல் 500 செ.மீ2 தட்டுகளில் 37°C இல் 4 மணி நேரம் பெருக்கப்பட்டன. தனித்தனியாக தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட மற்றும் கைமுறையாக வரிசைப்படுத்தப்பட்ட குளோன்கள் TB ஊடகத்தில் பரப்பப்பட்டன. பேஜ் பிரித்தெடுத்தல், சுத்திகரிப்பு மற்றும் எண்டோடாக்சின் அகற்றலுக்குப் பிறகு (மேலே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி), 300 μl இல் 2×1010 பேஜ்கள்/விலங்கு ஒரு வால் நரம்புக்குள் நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டன.
வரிசைத் தரவின் முன் செயலாக்கம் மற்றும் தரமான வடிகட்டுதல். Raw 454/Roche தரவு, விற்பனையாளர் மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி, பைனரி நிலையான ஸ்ட்ரீம் மேப் வடிவமைப்பிலிருந்து (sff) பியர்சன் மனித படிக்கக்கூடிய வடிவத்திற்கு (fasta) மாற்றப்பட்டது. நியூக்ளியோடைடு வரிசையின் மேலும் செயலாக்கம், கீழே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, தனியுரிம C நிரல்கள் மற்றும் ஸ்கிரிப்ட்களைப் (வெளியிடப்படாத மென்பொருள் தொகுப்பு) பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது. முதன்மைத் தரவின் பகுப்பாய்வில் கடுமையான பல-நிலை வடிகட்டுதல் நடைமுறைகள் அடங்கும். செல்லுபடியாகும் 12mer செருகும் DNA வரிசையைக் கொண்டிருக்காத வாசிப்புகளை வடிகட்ட, உலகளாவிய Needleman-Wunsch சோதனையைப் பயன்படுத்தி, தொடக்க லேபிள் (GTGATGTCGGGATCCGAATTC), நிறுத்த லேபிள் (TAAGCTTGCGGCCGCACTCAGTA) மற்றும் பின்னணி செருகல் (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ஆகியவற்றுடன் தொடர்ச்சியாக சீரமைக்கப்பட்டது. ஒரு சீரமைப்புக்கு 2 முரண்பாடுகள் வரை அனுமதிக்கும் சீரமைப்பு31. எனவே, தொடக்க மற்றும் நிறுத்த குறிச்சொற்கள் இல்லாத வாசிப்புகள் மற்றும் பின்னணி செருகல்களைக் கொண்ட வாசிப்புகள், அதாவது, அனுமதிக்கப்பட்ட பொருந்தாத எண்ணிக்கையை மீறும் சீரமைப்புகள், நூலகத்திலிருந்து அகற்றப்பட்டன. மீதமுள்ள வாசிப்புகளைப் பொறுத்தவரை, தொடக்கக் குறியிலிருந்து நீண்டு, நிறுத்தக் குறிக்கு முன் முடியும் N-mer DNA வரிசை, அசல் வாசிப்பு வரிசையிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்டு மேலும் செயலாக்கப்பட்டது (இனிமேல் "செருகு" என்று குறிப்பிடப்படுகிறது). செருகலை மொழிபெயர்த்த பிறகு, ப்ரைமரின் 5′ முனையில் உள்ள முதல் நிறுத்தக் கோடானுக்குப் பிறகு உள்ள பகுதி செருகலில் இருந்து அகற்றப்படுகிறது. கூடுதலாக, ப்ரைமரின் 3′ முனையில் முழுமையற்ற கோடான்களுக்கு வழிவகுக்கும் நியூக்ளியோடைடுகளும் அகற்றப்பட்டன. பின்னணி வரிசைகளை மட்டுமே கொண்ட செருகல்களை விலக்க, அமினோ அமில வடிவமான "PAG" உடன் தொடங்கும் மொழிபெயர்க்கப்பட்ட செருகல்களும் அகற்றப்பட்டன. 3 அமினோ அமிலங்களுக்கும் குறைவான மொழிபெயர்ப்புக்குப் பிந்தைய நீளம் கொண்ட பெப்டைடுகள் நூலகத்திலிருந்து அகற்றப்பட்டன. இறுதியாக, செருகு தொகுப்பில் உள்ள பணிநீக்கத்தை அகற்றி, ஒவ்வொரு தனித்துவமான செருகலின் அதிர்வெண்ணையும் தீர்மானிக்கவும். இந்த பகுப்பாய்வின் முடிவுகளில் நியூக்ளியோடைடு வரிசைகள் (செருகுகள்) மற்றும் அவற்றின் (படித்த) அதிர்வெண்களின் பட்டியல் (துணை படங்கள் 1c மற்றும் 2) ஆகியவை அடங்கும்.
வரிசை ஒற்றுமையின்படி குழு N-mer DNA செருகல்கள்: 454/Roche-குறிப்பிட்ட வரிசைமுறை பிழைகளை (ஹோமோபாலிமர் நீட்டிப்புகளை வரிசைப்படுத்துவதில் உள்ள சிக்கல்கள் போன்றவை) நீக்கவும், குறைவான முக்கியத்துவம் வாய்ந்த பணிநீக்கங்களை நீக்கவும், முன்னர் வடிகட்டப்பட்ட N-mer DNA வரிசை செருகல்கள் (செருகுகள்) ஒற்றுமையின்படி வரிசைப்படுத்தப்படுகின்றன. பின்வருமாறு வரையறுக்கப்பட்ட ஒரு மறு செய்கை வழிமுறையைப் பயன்படுத்தி செருகல்கள் (2 பொருந்தாத அடிப்படைகள் வரை அனுமதிக்கப்படுகின்றன): செருகல்கள் முதலில் அவற்றின் அதிர்வெண் (அதிகபட்சம் முதல் குறைந்தது) மூலம் வரிசைப்படுத்தப்படுகின்றன, மேலும் அவை ஒரே மாதிரியாக இருந்தால், அவற்றின் இரண்டாம் நிலை நீள வரிசை (நீண்டது முதல் குறுகியது) மூலம் வரிசைப்படுத்தப்படுகின்றன. இவ்வாறு, மிகவும் அடிக்கடி மற்றும் நீண்ட செருகல்கள் முதல் "குழுவை" வரையறுக்கின்றன. குழு அதிர்வெண் விசை அதிர்வெண்ணுக்கு அமைக்கப்படுகிறது. பின்னர், வரிசைப்படுத்தப்பட்ட பட்டியலில் மீதமுள்ள ஒவ்வொரு செருகலும் ஜோடிவரிசை Needleman-Wunsch சீரமைப்பு மூலம் குழுவில் சேர்க்க முயற்சிக்கப்பட்டது. ஒரு சீரமைப்பில் பொருந்தாதவைகள், செருகல்கள் அல்லது நீக்குதல்களின் எண்ணிக்கை 2 வரம்பை விட அதிகமாக இல்லாவிட்டால், குழுவில் ஒரு செருகல் சேர்க்கப்படும், மேலும் ஒட்டுமொத்த குழு அதிர்வெண் செருகல் எவ்வளவு அடிக்கடி சேர்க்கப்பட்டது என்பதன் மூலம் அதிகரிக்கப்படுகிறது. ஒரு குழுவில் சேர்க்கப்படும் செருகல்கள் பயன்படுத்தப்பட்டதாகக் குறிக்கப்பட்டு மேலும் செயலாக்கத்திலிருந்து விலக்கப்படுகின்றன. ஏற்கனவே உள்ள குழுவில் செருகு வரிசையைச் சேர்க்க முடியாவிட்டால், செருகு வரிசை பொருத்தமான செருகு அதிர்வெண் கொண்ட ஒரு புதிய குழுவை உருவாக்கப் பயன்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் பயன்படுத்தப்பட்டதாகக் குறிக்கப்படுகிறது. ஒவ்வொரு செருகு வரிசையும் ஒரு புதிய குழுவை உருவாக்கப் பயன்படுத்தப்படும்போது அல்லது ஏற்கனவே உள்ள குழுவில் சேர்க்கப்படும்போது மறு செய்கை முடிவடைகிறது. எல்லாவற்றிற்கும் மேலாக, நியூக்ளியோடைடுகளைக் கொண்ட தொகுக்கப்பட்ட செருகல்கள் இறுதியில் பெப்டைட் வரிசைகளாக (பெப்டைட் நூலகங்கள்) மொழிபெயர்க்கப்படுகின்றன. இந்த பகுப்பாய்வின் விளைவாக தொடர்ச்சியான வாசிப்புகளின் எண்ணிக்கையை உருவாக்கும் செருகல்களின் தொகுப்பு மற்றும் அவற்றின் தொடர்புடைய அதிர்வெண்கள் ஆகும் (துணை படம் 2).
மையக்கரு உருவாக்கம்: தனித்துவமான பெப்டைட்களின் பட்டியலின் அடிப்படையில், கீழே காட்டப்பட்டுள்ளபடி அனைத்து சாத்தியமான அமினோ அமில வடிவங்களையும் (aa) கொண்ட ஒரு நூலகம் உருவாக்கப்பட்டது. நீளம் 3 கொண்ட ஒவ்வொரு சாத்தியமான வடிவமும் பெப்டைடிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்டு, அதன் தலைகீழ் வடிவமும் அனைத்து வடிவங்களையும் (ட்ரைபெப்டைடுகள்) கொண்ட ஒரு பொதுவான மையக்கரு நூலகத்துடன் சேர்க்கப்பட்டது. அதிக திரும்பத் திரும்ப வரும் மையக்கருக்களின் நூலகங்கள் வரிசைப்படுத்தப்பட்டு, தேவையற்ற தன்மை அகற்றப்பட்டது. பின்னர், மையக்கரு நூலகத்தில் உள்ள ஒவ்வொரு டிரிபெப்டைடிற்கும், கணக்கீட்டு கருவிகளைப் பயன்படுத்தி நூலகத்தில் அதன் இருப்பை நாங்கள் சோதித்தோம். இந்த வழக்கில், காணப்படும் மையக்கரு ட்ரைபெப்டைடைக் கொண்ட பெப்டைடின் அதிர்வெண் சேர்க்கப்பட்டு மையக்கரு நூலகத்தில் உள்ள மையக்கருவுக்கு ஒதுக்கப்படுகிறது ("மைக்கருக்களின் எண்ணிக்கை"). மையக்கரு உருவாக்கத்தின் விளைவாக, டிரிபெப்டைட்களின் (மைக்கருக்கள்) அனைத்து நிகழ்வுகளையும் மற்றும் அவற்றின் மதிப்புகளையும் கொண்ட இரு பரிமாண வரிசை ஆகும், அவை வாசிப்புகள் வடிகட்டப்பட்டு, தொகுக்கப்பட்டு, மொழிபெயர்க்கப்படும்போது தொடர்புடைய மையக்கருவை விளைவிக்கும் வரிசைமுறை வாசிப்புகளின் எண்ணிக்கையாகும். மேலே விரிவாக விவரிக்கப்பட்டுள்ள அளவீடுகள்.
மையக்கருத்துகளின் எண்ணிக்கை மற்றும் தொடர்புடைய சிதறல் வரைபடங்களை இயல்பாக்குதல்: ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும் மையக்கருத்துகளின் எண்ணிக்கை
இங்கு ni என்பது தலைப்பு i ஐக் கொண்ட வாசிப்புகளின் எண்ணிக்கை. எனவே, vi என்பது மாதிரியில் மையக்கரு i ஐக் கொண்ட வாசிப்புகளின் (அல்லது பெப்டைடுகள்) சதவீத அதிர்வெண்ணைக் குறிக்கிறது. இயல்பாக்கப்படாத மையக்கருக்களின் எண்ணிக்கைக்கான P- மதிப்புகள் ஃபிஷரின் சரியான சோதனையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டன. நோக்கங்களின் எண்ணிக்கையின் கோரெலோகிராம்களைப் பொறுத்தவரை, ஸ்பியர்மேனின் தொடர்புகள் R உடன் இயல்பாக்கப்பட்ட நோக்கங்களின் எண்ணிக்கையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டன.
பெப்டைட் நூலகத்தில் ஒவ்வொரு நிலையிலும் உள்ள அமினோ அமிலங்களின் உள்ளடக்கத்தைக் காட்சிப்படுத்த, வலை லோகோகிராம்கள் 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) உருவாக்கப்பட்டன. முதலில், 12-மெர் பெப்டைட்டின் ஒவ்வொரு நிலையிலும் உள்ள அமினோ அமிலங்களின் உள்ளடக்கம் 20×12 மேட்ரிக்ஸில் சேமிக்கப்படுகிறது. பின்னர், ஒவ்வொரு நிலையிலும் ஒரே மாதிரியான தொடர்புடைய அமினோ அமில உள்ளடக்கத்தைக் கொண்ட 1000 பெப்டைட்களின் தொகுப்பு ஃபாஸ்டா-வரிசை வடிவத்தில் உருவாக்கப்பட்டு வலை-லோகோ 3 க்கு உள்ளீடாக வழங்கப்படுகிறது, இது ஒவ்வொரு நிலையிலும் தொடர்புடைய அமினோ அமில உள்ளடக்கத்தின் வரைகலை பிரதிநிதித்துவத்தை உருவாக்குகிறது. கொடுக்கப்பட்ட பெப்டைட் நூலகத்திற்கு. பல பரிமாண தரவுத்தொகுப்புகளைக் காட்சிப்படுத்த, R இல் உள்ளகமாக உருவாக்கப்பட்ட கருவியைப் பயன்படுத்தி வெப்ப வரைபடங்கள் உருவாக்கப்பட்டன (பயோஸ்ஹீட்மேப், இன்னும் வெளியிடப்படாத R தொகுப்பு). வெப்ப வரைபடங்களில் வழங்கப்பட்ட டென்ட்ரோகிராம்கள் யூக்ளிடியன் தூர அளவீட்டைப் பயன்படுத்தி வார்டின் படிநிலை கிளஸ்டரிங் முறையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டன. மையக்கரு மதிப்பெண் தரவின் புள்ளிவிவர பகுப்பாய்விற்கு, இயல்பற்ற மதிப்பெண்ணுக்கான P மதிப்புகள் ஃபிஷரின் சரியான சோதனையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டன. மற்ற தரவுத்தொகுப்புகளுக்கான P-மதிப்புகள் மாணவர்களின் t-சோதனை அல்லது ANOVA ஐப் பயன்படுத்தி R இல் கணக்கிடப்பட்டன.
தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பேஜ் குளோன்கள் மற்றும் செருகல்கள் இல்லாத பேஜ்கள் வால் நரம்பு வழியாக நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டன (300 μl PBS இல் 2×1010 பேஜ்கள்/விலங்கு). துளையிடுதல் மற்றும் அடுத்தடுத்த நிலைப்படுத்தலுக்கு பத்து நிமிடங்களுக்கு முன்பு, அதே விலங்குகளுக்கு 100 μl DyLight594-லேபிளிடப்பட்ட லெக்டின் (Vector Laboratories Inc., DL-1177) நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டது. பேஜ் ஊசி போட்ட 60 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு, எலிகளுக்கு 50 மில்லி PBS உடன் இதயத்தின் வழியாக துளையிடப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து 50 மில்லி 4% PFA/PBS. மூளை மாதிரிகள் கூடுதலாக 4% PFA/PBS இல் இரவு முழுவதும் சரி செய்யப்பட்டு 30% சுக்ரோஸில் இரவு முழுவதும் 4°C இல் ஊறவைக்கப்பட்டன. மாதிரிகள் OCT கலவையில் ஃபிளாஷ் ஃப்ரோசன் செய்யப்படுகின்றன. உறைந்த மாதிரிகளின் இம்யூனோஹிஸ்டோகெமிக்கல் பகுப்பாய்வு அறை வெப்பநிலையில் 1% BSA உடன் தடுக்கப்பட்ட 30 µm கிரையோசெக்ஷன்களில் செய்யப்பட்டது மற்றும் 4 °C இல் T7 பேஜுக்கு (நோவஸ் NB 600-376A) எதிராக பாலிக்ளோனல் FITC-லேபிளிடப்பட்ட ஆன்டிபாடிகளுடன் அடைகாக்கப்பட்டது. ஒரே இரவில் அடைகாக்கப்பட்டது. இறுதியாக, பிரிவுகள் PBS உடன் 3 முறை கழுவப்பட்டு, ஒரு கன்ஃபோகல் லேசர் நுண்ணோக்கி (Leica TCS SP5) மூலம் ஆய்வு செய்யப்பட்டன.
குறைந்தபட்சம் 98% தூய்மை கொண்ட அனைத்து பெப்டைடுகளும் GenScript USA ஆல் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டு, பயோட்டினைலேட்டட் செய்யப்பட்டு, லியோபிலைஸ் செய்யப்பட்டன. N-டெர்மினஸில் கூடுதல் டிரிபிள் கிளைசின் ஸ்பேசர் மூலம் பயோட்டின் பிணைக்கப்பட்டுள்ளது. மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரியைப் பயன்படுத்தி அனைத்து பெப்டைடுகளையும் சரிபார்க்கவும்.
ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் (சிக்மா S0677) 5 மடங்கு சமமான அதிகப்படியான பயோடினைலேட்டட் பெப்டைடு, பயோடினைலேட்டட் BACE1 இன்ஹிபிட்டரி பெப்டைடு அல்லது பயோடினைலேட்டட் BACE1 இன்ஹிபிட்டரி பெப்டைடு மற்றும் BACE1 இன்ஹிபிட்டரி பெப்டைடு ஆகியவற்றின் கலவையுடன் (3:1 விகிதம்) 5-10% DMSO/PBS இல் அடைகாக்கப்பட்டது. ஊசி போடுவதற்கு 1 மணி நேரத்திற்கு முன் அறை வெப்பநிலையில். ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-இணைந்த பெப்டைடுகள் மூளை குழி கொண்ட எலிகளின் வால் நரம்புகளில் ஒன்றில் 10 மி.கி/கி.கி என்ற அளவில் நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டன.
ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-பெப்டைட் வளாகங்களின் செறிவு ELISA ஆல் மதிப்பிடப்பட்டது. நன்க் மேக்சிசார்ப் மைக்ரோடைட்டர் தகடுகள் (சிக்மா) 4°C இல் 1.5 μg/ml மவுஸ் ஆன்டி-ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் ஆன்டிபாடியுடன் (தெர்மோ, MA1-20011) ஒரே இரவில் பூசப்பட்டன. அறை வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் தடுத்த பிறகு (தடுக்கும் இடையகம்: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ஜெலட்டின், 1% BSA), 3 மணி நேரம் தடுத்த பிறகு, தட்டை 0.05% ட்வீன்-20/PBS (வாஷ் பஃபர்) கொண்டு கழுவவும். இரண்டாவது முறையாக, CSF மற்றும் பிளாஸ்மா மாதிரிகள் தடுப்பு இடையகத்துடன் (பிளாஸ்மா 1:10,000, CSF 1:115) நீர்த்த கிணறுகளில் சேர்க்கப்பட்டன. பின்னர் தட்டு 4°C இல் கண்டறிதல் ஆன்டிபாடியுடன் (1 μg/ml, ஆன்டி-ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-HRP, நோவஸ் NB120-7239) ஒரே இரவில் அடைகாக்கப்பட்டது. மூன்று முறை கழுவிய பிறகு, TMB அடி மூலக்கூறு கரைசலில் (ரோச்) 20 நிமிடங்கள் வரை அடைகாத்ததன் மூலம் ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் கண்டறியப்பட்டது. 1M H2SO4 உடன் வண்ண வளர்ச்சியை நிறுத்திய பிறகு, உறிஞ்சுதலை 450 nm இல் அளவிடவும்.
ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-பெப்டைட்-BACE1 தடுப்பான் வளாகத்தின் செயல்பாடு உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி (Wako, 294-64701) Aβ(1-40) ELISA ஆல் மதிப்பிடப்பட்டது. சுருக்கமாக, CSF மாதிரிகள் நிலையான நீர்த்தத்தில் (1:23) நீர்த்தப்பட்டு, BNT77 பிடிப்பு ஆன்டிபாடியுடன் பூசப்பட்ட 96-கிணறு தகடுகளில் 4°C இல் ஒரே இரவில் அடைகாக்கப்பட்டன. ஐந்து கழுவும் படிகளுக்குப் பிறகு, HRP-இணைந்த BA27 ஆன்டிபாடி சேர்க்கப்பட்டு 4°C இல் 2 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. அதைத் தொடர்ந்து ஐந்து கழுவும் படிகள். அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் TMB கரைசலில் அடைகாப்பதன் மூலம் Aβ(1–40) கண்டறியப்பட்டது. ஸ்டாப் கரைசலுடன் வண்ண வளர்ச்சி நிறுத்தப்பட்ட பிறகு, 450 nm இல் உறிஞ்சுதலை அளவிடவும். Aβ(1–40) ELISA க்கு முன் பிளாஸ்மா மாதிரிகள் திட நிலை பிரித்தெடுத்தலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டன. 96-கிணறு தகடுகளில் பிளாஸ்மா 0.2% DEA (சிக்மா) உடன் சேர்க்கப்பட்டு அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டது. SPE தகடுகளை (Oasis, 186000679) தண்ணீர் மற்றும் 100% மெத்தனால் கொண்டு தொடர்ச்சியாகக் கழுவிய பிறகு, பிளாஸ்மா மாதிரிகள் SPE தகடுகளில் சேர்க்கப்பட்டு அனைத்து திரவமும் அகற்றப்பட்டன. மாதிரிகள் கழுவப்பட்டன (முதலில் 5% மெத்தனால், பின்னர் 30% மெத்தனால்) மற்றும் 2% NH4OH/90% மெத்தனால் கொண்டு நீக்கப்பட்டன. எல்யூயேட்டை 55°C இல் 99 நிமிடங்களுக்கு நிலையான N2 மின்னோட்டத்தில் உலர்த்திய பிறகு, மாதிரிகள் நிலையான நீர்த்தங்களில் குறைக்கப்பட்டு, மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி Aβ(1–40) அளவிடப்பட்டது.
இந்தக் கட்டுரையை எவ்வாறு மேற்கோள் காட்டுவது: யூரிச், இ. மற்றும் பலர். உயிரியல் ரீதியாக அடையாளம் காணப்பட்ட டிரான்ஸிட் பெப்டைடுகளைப் பயன்படுத்தி மூளைக்கு சரக்கு விநியோகம். அறிவியல். 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
லிகோட்டா ஜே., ஸ்க்ஜோரிங்கே டி., தாம்சன் எல்பி மற்றும் மூஸ் டி. இலக்கு சிகிச்சையைப் பயன்படுத்தி மூளைக்கு மேக்ரோமாலிகுலர் மருந்துகளை வழங்குதல். நியூரோ கெமிஸ்ட்ரி ஜர்னல் 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
பிராஸ்ன்ஜெவிக், ஐ., ஸ்டீன்புஷ், எச்.டபிள்யூ, ஷ்மிட்ஸ், சி., மற்றும் மார்டினெஸ்-மார்டினெஸ், பி. இரத்த-மூளைத் தடையைத் தாண்டி பெப்டைட் மற்றும் புரத மருந்துகளை வழங்குதல். ப்ரோக் நியூரோபயோல் 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
பார்ட்ரிட்ஜ், WM இரத்த-மூளைத் தடை: மூளை மருந்து வளர்ச்சியில் ஒரு சிக்கல். நியூரோஆர்எக்ஸ் 2, 3–14, 10.1602/நியூரோர்க்ஸ்.2.1.3 (2005).
ஜோஹன்சன், கே.இ, டங்கன், ஜே.ஏ, ஸ்டோபா, இ.ஜி, மற்றும் பைர்ட், ஏ. கோராய்டு பிளெக்ஸஸ்-சி.எஸ்.எஃப் பாதை வழியாக மூளைக்கு மேம்பட்ட மருந்து விநியோகம் மற்றும் இலக்கு வைப்பதற்கான வாய்ப்புகள். மருந்து ஆராய்ச்சி 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
மூளை விநியோகத்திற்காக மூலக்கூறு ட்ரோஜன் குதிரைகளுடன் உயிரி மருந்துகளின் நவீனமயமாக்கல். பயோகான்ஜக் கெம் 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
பார்ட்ரிட்ஜ், இரத்த-மூளைத் தடையின் குறுக்கே WM ஏற்பி-மத்தியஸ்த பெப்டைடு போக்குவரத்து. எண்டோக்ர் ரெவ். 7, 314–330 (1986).
நிவோனெர், ஜே. மற்றும் பலர். மோனோவேலண்ட் மூலக்கூறு ஷட்டில்களைப் பயன்படுத்தி சிகிச்சை ஆன்டிபாடிகளின் மூளை ஊடுருவல் மற்றும் செயல்திறனை அதிகரித்தல். நியூரான் 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
பியென்-லீ, என். மற்றும் பலர். டிரான்ஸ்ஃபெரின் ஏற்பி (TfR) போக்குவரத்து, TfR ஆன்டிபாடிகளின் அஃபினிட்டி மாறுபாடுகளின் மூளை உறிஞ்சுதலை தீர்மானிக்கிறது. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).