Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி.வரையறுக்கப்பட்ட CSS ஆதரவுடன் உலாவிப் பதிப்பைப் பயன்படுத்துகிறீர்கள்.சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்).கூடுதலாக, தொடர்ந்து ஆதரவை உறுதிப்படுத்த, தளத்தை பாணிகள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் காட்டுகிறோம்.
ஒரே நேரத்தில் மூன்று ஸ்லைடுகளின் கொணர்வியைக் காட்டுகிறது.ஒரே நேரத்தில் மூன்று ஸ்லைடுகளை நகர்த்துவதற்கு முந்தைய மற்றும் அடுத்த பொத்தான்களைப் பயன்படுத்தவும் அல்லது ஒரு நேரத்தில் மூன்று ஸ்லைடுகளை நகர்த்த முடிவில் உள்ள ஸ்லைடர் பொத்தான்களைப் பயன்படுத்தவும்.
இரத்த-மூளைத் தடை மற்றும் இரத்த-மூளைத் தடை ஆகியவை பயோதெரபியூடிக் முகவர்கள் மத்திய நரம்பு மண்டலத்தில் தங்கள் இலக்குகளை அடைவதைத் தடுக்கின்றன, இதனால் நரம்பியல் நோய்களுக்கான பயனுள்ள சிகிச்சையைத் தடுக்கிறது.விவோவில் புதிய மூளை டிரான்ஸ்போர்ட்டர்களைக் கண்டறிய, நாங்கள் T7 பேஜ் பெப்டைட் லைப்ரரியை அறிமுகப்படுத்தினோம் மற்றும் எலிகளின் பெரிய குளம் மாதிரியைப் பயன்படுத்தி இரத்தம் மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தை (CSF) தொடர்ச்சியாக சேகரித்தோம்.நான்கு சுற்று தேர்வுகளுக்குப் பிறகு குறிப்பிட்ட பேஜ் குளோன்கள் CSF இல் மிகவும் செறிவூட்டப்பட்டன.தனிப்பட்ட வேட்பாளர் பெப்டைட்களின் சோதனையானது CSF இல் 1000 மடங்குக்கும் அதிகமான செறிவூட்டலை வெளிப்படுத்தியது.அடையாளம் காணப்பட்ட நாவல் டிரான்சிட் பெப்டைடுடன் இணைக்கப்பட்ட BACE1 பெப்டைட் இன்ஹிபிட்டரைப் பயன்படுத்தி செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் அமிலாய்ட்-β இன் அளவை 40% குறைப்பதன் மூலம் மூளைக்கு பெப்டைட்-மத்தியஸ்த பிரசவத்தின் உயிர்ச் செயல்பாடு உறுதி செய்யப்பட்டது.இந்த முடிவுகள் விவோ பேஜ் தேர்வு முறைகளால் அடையாளம் காணப்பட்ட பெப்டைடுகள் மூளைக்கு மேக்ரோமோலிகுல்களை ஒரு சிகிச்சை விளைவுடன் முறையாக வழங்குவதற்கு பயனுள்ள வாகனங்களாக இருக்கலாம் என்று கூறுகின்றன.
மத்திய நரம்பு மண்டலத்தின் (CNS) இலக்கு சிகிச்சை ஆராய்ச்சியானது, CNS-இலக்கு பண்புகளை வெளிப்படுத்தும் உகந்த மருந்துகள் மற்றும் முகவர்களைக் கண்டறிவதில் கவனம் செலுத்துகிறது.மருந்து விநியோகம், குறிப்பாக பெரிய மூலக்கூறுகள், நவீன நரம்பியல் மருந்து வளர்ச்சியின் ஒருங்கிணைந்த பகுதியாக இருப்பதால் இது இப்போது மாறத் தொடங்குகிறது.மத்திய நரம்பு மண்டலத்தின் சூழல் செரிப்ரோவாஸ்குலர் தடுப்பு அமைப்பால் நன்கு பாதுகாக்கப்படுகிறது, இதில் இரத்த-மூளை தடை (BBB) ​​மற்றும் இரத்த-மூளை தடை (BCBB) 1 ஆகியவை அடங்கும், இது மூளைக்கு மருந்துகளை வழங்குவது சவாலானது.கிட்டத்தட்ட அனைத்து பெரிய மூலக்கூறு மருந்துகளும் 98% க்கும் அதிகமான சிறிய மூலக்கூறு மருந்துகளும் மூளையில் இருந்து வெளியேற்றப்படுவதாக மதிப்பிடப்பட்டுள்ளது3.அதனால்தான் சிஎன்எஸ் 4,5 க்கு திறமையான மற்றும் குறிப்பிட்ட சிகிச்சை மருந்துகளை வழங்கும் புதிய மூளை போக்குவரத்து அமைப்புகளை அடையாளம் காண்பது மிகவும் முக்கியம்.இருப்பினும், BBB மற்றும் BCSFB ஆகியவை மருந்து விநியோகத்திற்கான ஒரு சிறந்த வாய்ப்பை வழங்குகின்றன, ஏனெனில் அவை மூளையின் அனைத்து கட்டமைப்புகளையும் அதன் விரிவான வாஸ்குலேச்சர் மூலம் ஊடுருவி நுழைகின்றன.எனவே, மூளைக்கு வழங்குவதற்கான ஆக்கிரமிப்பு அல்லாத முறைகளைப் பயன்படுத்துவதற்கான தற்போதைய முயற்சிகள் பெரும்பாலும் எண்டோஜெனஸ் பிபிபி6 ஏற்பியைப் பயன்படுத்தி ஏற்பி-மத்தியஸ்த போக்குவரத்து (பிஎம்டி) பொறிமுறையை அடிப்படையாகக் கொண்டவை.டிரான்ஸ்ஃபெரின் ஏற்பி பாதை 7,8 ஐப் பயன்படுத்தி சமீபத்திய முக்கிய முன்னேற்றங்கள் இருந்தபோதிலும், மேம்படுத்தப்பட்ட பண்புகளுடன் புதிய விநியோக அமைப்புகளின் மேலும் மேம்பாடு தேவைப்படுகிறது.இந்த நோக்கத்திற்காக, CSF போக்குவரத்தை மத்தியஸ்தம் செய்யக்கூடிய பெப்டைட்களை அடையாளம் காண்பதே எங்கள் குறிக்கோளாக இருந்தது, ஏனெனில் அவை கொள்கையளவில் சிஎன்எஸ்க்கு மேக்ரோமோலிகுல்களை வழங்க அல்லது புதிய ஏற்பி பாதைகளைத் திறக்க பயன்படுத்தப்படலாம்.குறிப்பாக, செரிப்ரோவாஸ்குலர் அமைப்பின் (BBB மற்றும் BSCFB) குறிப்பிட்ட ஏற்பிகள் மற்றும் டிரான்ஸ்போர்ட்டர்கள் உயிரியல் சிகிச்சை மருந்துகளின் செயலில் மற்றும் குறிப்பிட்ட விநியோகத்திற்கான சாத்தியமான இலக்குகளாக செயல்பட முடியும்.செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் (சிஎஸ்எஃப்) என்பது கோரொய்டு பிளெக்ஸஸின் (சிஎஸ்) ஒரு சுரப்பு தயாரிப்பு ஆகும், மேலும் இது சப்அரக்னாய்டு ஸ்பேஸ் மற்றும் வென்ட்ரிகுலர் ஸ்பேஸ் வழியாக மூளையின் இடைநிலை திரவத்துடன் நேரடி தொடர்பில் உள்ளது.சப்அரக்னாய்டு செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் மூளையின் இடைவெளியில் அதிகமாகப் பரவுகிறது என்று சமீபத்தில் காட்டப்பட்டது9.இந்த சப்அரக்னாய்டு இன்ஃப்ளோ டிராக்டைப் பயன்படுத்தி அல்லது நேரடியாக BBB மூலம் பாரன்கிமல் இடத்தை அணுகுவோம் என்று நம்புகிறோம்.இதை அடைய, இந்த இரண்டு வெவ்வேறு பாதைகளில் ஒன்றின் மூலம் கொண்டு செல்லப்படும் பெப்டைட்களை சிறந்த முறையில் அடையாளம் காணும் ஒரு வலுவான விவோ பேஜ் தேர்வு உத்தியை நாங்கள் செயல்படுத்தினோம்.
மிக உயர்ந்த நூலகப் பன்முகத்தன்மையுடன் ஆரம்பத் தேர்வுச் சுற்றுகளைக் கண்காணிக்க, உயர் செயல்திறன் வரிசைமுறை (HTS) உடன் இணைந்து CSF மாதிரியுடன் கூடிய வரிசைமுறை இன் விவோ பேஜ் காட்சி திரையிடல் முறையை இப்போது விவரிக்கிறோம்.இரத்தம் மாசுபடுவதைத் தவிர்ப்பதற்காக நிரந்தரமாக பொருத்தப்பட்ட பெரிய சிஸ்டெர்னா (CM) கானுலாவுடன் நனவான எலிகளுக்கு ஸ்கிரீனிங் செய்யப்பட்டது.முக்கியமாக, இந்த அணுகுமுறை மூளை-இலக்கு மற்றும் பெப்டைடுகள் இரண்டையும் செரிப்ரோவாஸ்குலர் தடையின் குறுக்கே போக்குவரத்துச் செயல்பாடுகளுடன் தேர்ந்தெடுக்கிறது.T7 பேஜ்களின் சிறிய அளவு (~60 nm)10 காரணமாக நாங்கள் அவற்றைப் பயன்படுத்தினோம், மேலும் அவை எண்டோடெலியல் மற்றும்/அல்லது எபிடெலியல்-மெடுல்லா தடையை டிரான்ஸ்செல்லுலர் கிராசிங் அனுமதிக்கும் வெசிகல்களின் போக்குவரத்துக்கு ஏற்றது என்று பரிந்துரைத்தோம்.நான்கு சுற்றுப் பணிகளுக்குப் பிறகு, விவோ சிஎஸ்எஃப் செறிவூட்டல் மற்றும் பெருமூளை மைக்ரோவெசல் சங்கத்தில் வலுவாகக் காட்டப்படும் பேஜ் மக்கள் தனிமைப்படுத்தப்பட்டனர்.முக்கியமாக, விருப்பமான மற்றும் வேதியியல் ரீதியாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட சிறந்த வேட்பாளர் பெப்டைடுகள் புரத சரக்குகளை செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்திற்குள் கொண்டு செல்ல முடியும் என்பதை நிரூபிப்பதன் மூலம் எங்கள் கண்டுபிடிப்புகளை உறுதிப்படுத்த முடிந்தது.முதலாவதாக, BACE1 பெப்டைட்டின் தடுப்பானுடன் ஒரு முன்னணி டிரான்சிட் பெப்டைடை இணைப்பதன் மூலம் CNS இன் பார்மகோடைனமிக் விளைவுகள் நிறுவப்பட்டன.விவோ செயல்பாட்டு ஸ்கிரீனிங் உத்திகளில் நாவல் மூளை போக்குவரத்து பெப்டைட்களை பயனுள்ள புரத சரக்கு கேரியர்களாக அடையாளம் காண முடியும் என்பதை நிரூபிப்பதோடு, நாவல் மூளை போக்குவரத்து பாதைகளை அடையாளம் காண்பதில் இதேபோன்ற செயல்பாட்டு தேர்வு அணுகுமுறைகளும் முக்கியமானதாக இருக்கும் என்று நாங்கள் எதிர்பார்க்கிறோம்.
பிளேக்-உருவாக்கும் அலகுகளின் (PFU) அடிப்படையில், பேஜ் பேக்கேஜிங் படிக்குப் பிறகு, தோராயமாக 109 பன்முகத்தன்மை கொண்ட சீரற்ற 12-மெர் லீனியர் T7 பேஜ் பெப்டைட்களின் நூலகம் வடிவமைக்கப்பட்டு உருவாக்கப்பட்டது (பொருட்கள் மற்றும் முறைகளைப் பார்க்கவும்).விவோ பேனிங்கில் இதற்கு முன் இந்த நூலகத்தை கவனமாக பகுப்பாய்வு செய்தோம் என்பது குறிப்பிடத்தக்கது.மாற்றியமைக்கப்பட்ட ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி பேஜ் லைப்ரரி மாதிரிகளின் PCR பெருக்கம் HTS க்கு நேரடியாகப் பொருந்தும் ஆம்பிளிகான்களை உருவாக்கியது (துணை படம் 1a).அ) HTS11 சீக்வென்சிங் பிழைகள், b) ப்ரைமர்களின் தரத்தில் தாக்கம் (NNK)1-12, மற்றும் c) காத்திருப்பு நூலகத்தில் காட்டு-வகை (wt) பேஜ் (எலும்புக்கூட்டு செருகல்கள்) இருப்பதால், சரிபார்க்கப்பட்ட வரிசை தகவல்களை மட்டுமே பிரித்தெடுக்க ஒரு வரிசை வடிகட்டுதல் செயல்முறை செயல்படுத்தப்பட்டது (துணை 1).இந்த வடிகட்டி படிகள் அனைத்து HTS வரிசைமுறை நூலகங்களுக்கும் பொருந்தும்.நிலையான நூலகத்திற்கு, மொத்தம் 233,868 வாசிப்புகள் பெறப்பட்டன, அவற்றில் 39% வடிகட்டி அளவுகோல்களைக் கடந்து, நூலக பகுப்பாய்வு மற்றும் அடுத்தடுத்த சுற்றுகளுக்கான தேர்வுக்கு பயன்படுத்தப்பட்டன (துணை படம் 1c-e).36 நியூக்ளியோடைட்களில் (துணை படம். 1c) உச்சம் கொண்ட 3 அடிப்படை ஜோடிகளின் நீளம் கொண்ட ரீட்கள் முக்கியமாக பன்மடங்குகளாக இருந்தன, இது நூலக வடிவமைப்பை (NNK) 1-12 உறுதிப்படுத்துகிறது.குறிப்பிடத்தக்க வகையில், நூலக உறுப்பினர்களில் சுமார் 11% பேர் 12-பரிமாண காட்டு-வகை (wt) முதுகெலும்பு PAGISRELVDKL செருகலைக் கொண்டிருந்தனர், மேலும் கிட்டத்தட்ட பாதி வரிசைகளில் (49%) செருகல்கள் அல்லது நீக்குதல்கள் இருந்தன.நூலக நூலகத்தின் HTS ஆனது நூலகத்தில் உள்ள பெப்டைட்களின் உயர் பன்முகத்தன்மையை உறுதிப்படுத்தியது: 81% க்கும் அதிகமான பெப்டைட் வரிசைகள் ஒருமுறை மட்டுமே கண்டறியப்பட்டன மற்றும் 1.5% மட்டுமே ≥4 பிரதிகளில் நிகழ்ந்தன (துணை படம். 2a).தொகுப்பில் உள்ள அனைத்து 12 நிலைகளிலும் உள்ள அமினோ அமிலங்களின் (aa) அதிர்வெண்கள் சீரழிந்த NKK திறனாய்வினால் உருவாக்கப்பட்ட கோடான்களின் எண்ணிக்கையில் எதிர்பார்க்கப்படும் அதிர்வெண்களுடன் நன்கு தொடர்புபட்டன (துணை படம். 2b).இந்த செருகல்களால் குறியிடப்பட்ட aa எச்சங்களின் கவனிக்கப்பட்ட அதிர்வெண் கணக்கிடப்பட்ட அதிர்வெண்ணுடன் (r = 0.893) நன்கு தொடர்புடையது (துணை படம். 2c).உட்செலுத்தலுக்கான பேஜ் நூலகங்களைத் தயாரிப்பதில் எண்டோடாக்சின் பெருக்கம் மற்றும் அகற்றுதல் ஆகியவை அடங்கும்.இது பேஜ் நூலகங்களின் பன்முகத்தன்மையைக் குறைக்கும் என்று முன்பு காட்டப்பட்டது12,13.எனவே, எண்டோடாக்சின் அகற்றப்பட்ட ஒரு தட்டு-பெருக்கப்பட்ட பேஜ் நூலகத்தை நாங்கள் வரிசைப்படுத்தி, AA இன் அதிர்வெண்ணை மதிப்பிடுவதற்கு அசல் நூலகத்துடன் ஒப்பிட்டோம்.அசல் குளம் மற்றும் பெருக்கப்பட்ட மற்றும் சுத்திகரிக்கப்பட்ட குளம் (துணை படம். 2d) ஆகியவற்றுக்கு இடையே ஒரு வலுவான தொடர்பு (r = 0.995) காணப்பட்டது, T7 பேஜைப் பயன்படுத்தி தட்டுகளில் பெருக்கப்பட்ட குளோன்களுக்கு இடையேயான போட்டி பெரிய சார்புகளை ஏற்படுத்தவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது.இந்த ஒப்பீடு ஒவ்வொரு நூலகத்திலும் உள்ள டிரிபெப்டைட் மையக்கருத்துகளின் அதிர்வெண்ணை அடிப்படையாகக் கொண்டது, ஏனெனில் நூலகங்களின் பன்முகத்தன்மை (~109) HTS உடன் கூட முழுமையாகப் பிடிக்க முடியாது.ஒவ்வொரு நிலையிலும் aa இன் அதிர்வெண் பகுப்பாய்வு, உள்ளிடப்பட்ட திறனாய்வின் கடைசி மூன்று நிலைகளில் (துணை படம் 2e) ஒரு சிறிய நிலை சார்ந்த சார்புகளை வெளிப்படுத்தியது.முடிவில், நூலகத்தின் தரம் மற்றும் பன்முகத்தன்மை ஏற்றுக்கொள்ளத்தக்கது என்றும், பல சுற்று தேர்வுகளுக்கு இடையே பேஜ் நூலகங்களின் பெருக்கம் மற்றும் தயாரிப்பின் காரணமாக பன்முகத்தன்மையில் சிறிய மாற்றங்கள் மட்டுமே காணப்பட்டன என்றும் நாங்கள் முடிவு செய்தோம்.
BBB மற்றும்/அல்லது BCSFB (படம் 1a-b) வழியாக நரம்பு வழியாக (iv) செலுத்தப்பட்ட T7 பேஜை அடையாளம் காண வசதியாக, நனவான எலிகளின் CM இல் ஒரு கானுலாவை அறுவை சிகிச்சை மூலம் பொருத்துவதன் மூலம் தொடர் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவ மாதிரியை மேற்கொள்ளலாம்.விவோ தேர்வின் முதல் மூன்று சுற்றுகளில் (படம் 1c) இரண்டு சுயாதீன தேர்வு ஆயுதங்களை (ஆயுத A மற்றும் B) பயன்படுத்தினோம்.தேர்வின் முதல் மூன்று சுற்றுகளில் அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட பேஜின் மொத்த அளவைக் குறைத்து, தேர்வின் இறுக்கத்தை படிப்படியாக அதிகரித்தோம்.நான்காவது சுற்று அலசலுக்கு, A மற்றும் B கிளைகளிலிருந்து மாதிரிகளை இணைத்து மூன்று கூடுதல் சுயாதீன தேர்வுகளைச் செய்தோம்.இந்த மாதிரியில் T7 பேஜ் துகள்களின் இன் விவோ பண்புகளை ஆய்வு செய்ய, காட்டு-வகை பேஜ் (PAGISRELVDKL மாஸ்டர் இன்செர்ட்) வால் நரம்பு வழியாக எலிகளுக்குள் செலுத்தப்பட்டது.வெவ்வேறு நேர புள்ளிகளில் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் மற்றும் இரத்தத்தில் இருந்து பேஜ்களை மீட்டெடுப்பது ஒப்பீட்டளவில் சிறிய T7 ஐகோசஹெட்ரல் பேஜ்கள் இரத்தப் பிரிவிலிருந்து விரைவான ஆரம்ப அனுமதி கட்டத்தைக் கொண்டிருப்பதைக் காட்டுகிறது (துணை படம். 3).நிர்வகிக்கப்படும் டைட்டர்கள் மற்றும் எலிகளின் இரத்த அளவு ஆகியவற்றின் அடிப்படையில், தோராயமாக 1% wt மட்டுமே என்று கணக்கிட்டோம்.செலுத்தப்பட்ட டோஸில் இருந்து பேஜ் இரத்தத்தில் 10 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு நரம்பு ஊசி மூலம் கண்டறியப்பட்டது.இந்த ஆரம்ப விரைவான சரிவுக்குப் பிறகு, மெதுவான முதன்மை அனுமதி 27.7 நிமிடங்களின் அரை-வாழ்க்கையுடன் அளவிடப்பட்டது.முக்கியமாக, CSF பெட்டியில் இருந்து மிகக் குறைவான பேஜ்கள் மட்டுமே மீட்டெடுக்கப்பட்டன, இது CSF பெட்டியில் காட்டு-வகை பேஜ் இடம்பெயர்வுக்கான குறைந்த பின்னணியைக் குறிக்கிறது (துணை படம். 3).சராசரியாக, இரத்தத்தில் T7 பேஜின் 1 x 10-3% டைட்டர்கள் மற்றும் ஆரம்பத்தில் உட்செலுத்தப்பட்ட பேஜ்களில் 4 x 10-8% மட்டுமே செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் முழு மாதிரி காலத்திலும் (0-250 நிமிடம்) கண்டறியப்பட்டது.செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் உள்ள காட்டு வகை பேஜின் அரை-வாழ்க்கை (25.7 நிமிடம்) இரத்தத்தில் காணப்பட்டதைப் போலவே இருந்தது குறிப்பிடத்தக்கது.சி.எஸ்.எஃப் பிரிவை இரத்தத்திலிருந்து பிரிக்கும் தடையானது சி.எம்-கனுலேட்டட் எலிகளில் அப்படியே உள்ளது என்பதை இந்தத் தரவுகள் நிரூபிக்கின்றன, இது இரத்தத்தில் இருந்து சிஎஸ்எஃப் பெட்டிக்குள் உடனடியாக கொண்டு செல்லப்படும் குளோன்களை அடையாளம் காண பேஜ் நூலகங்களின் விவோ தேர்வை அனுமதிக்கிறது.
(அ) ​​ஒரு பெரிய குளத்தில் இருந்து செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தை (CSF) மறு மாதிரி எடுப்பதற்கான முறையை அமைத்தல்.(ஆ) மத்திய நரம்பு மண்டலத்தின் (சிஎன்எஸ்) தடையின் செல்லுலார் இருப்பிடத்தைக் காட்டும் வரைபடம் மற்றும் இரத்த-மூளைத் தடை (பிபிபி) மற்றும் இரத்த-மூளைத் தடையைக் கடக்கும் பெப்டைட்களை அடையாளம் காணப் பயன்படுத்தப்படும் தேர்வு உத்தி.(இ) இன் விவோ பேஜ் காட்சி திரையிடல் பாய்வு விளக்கப்படம்.ஒவ்வொரு சுற்று தேர்விலும், பேஜ்கள் (அம்புகளுக்குள் உள்ள விலங்கு அடையாளங்காட்டிகள்) நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டன.இரண்டு சுயாதீன மாற்று கிளைகள் (A, B) 4வது சுற்று தேர்வு வரை தனித்தனியாக வைக்கப்படும்.தேர்வு சுற்றுகள் 3 மற்றும் 4 க்கு, CSF இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு பேஜ் குளோனும் கைமுறையாக வரிசைப்படுத்தப்பட்டது.(ஈ) T7 பெப்டைட் லைப்ரரியில் (2 x 1012 பேஜ்கள்/விலங்குகள்) நரம்பு வழியாகச் செலுத்தப்பட்ட பிறகு இரண்டு கேனுலேட்டட் எலிகளில் முதல் சுற்று தேர்வின் போது இரத்தம் (சிவப்பு வட்டங்கள்) மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் (பச்சை முக்கோணங்கள்) ஆகியவற்றிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட பேஜின் இயக்கவியல்.நீல சதுரங்கள் இரத்தத்தில் உள்ள பேஜின் சராசரி ஆரம்ப செறிவைக் குறிக்கின்றன, மொத்த இரத்த அளவை கணக்கில் எடுத்துக்கொண்டு, உட்செலுத்தப்பட்ட பேஜின் அளவிலிருந்து கணக்கிடப்படுகிறது.கருப்பு சதுரங்கள் இரத்த பேஜ் செறிவுகளில் இருந்து விரிவுபடுத்தப்பட்ட y கோட்டின் குறுக்குவெட்டு புள்ளியைக் குறிக்கின்றன.(e,f) பெப்டைடில் காணப்படும் அனைத்து சாத்தியமான ஒன்றுடன் ஒன்று ட்ரைபெப்டைட் மையக்கருத்துகளின் ஒப்பீட்டு அதிர்வெண் மற்றும் விநியோகத்தை வழங்கவும்.1000 வாசிப்புகளில் காணப்படும் மையக்கருத்துகளின் எண்ணிக்கை காட்டப்பட்டுள்ளது.குறிப்பிடத்தக்க வகையில் (p <0.001) செறிவூட்டப்பட்ட மையக்கருத்துகள் சிவப்பு புள்ளிகளால் குறிக்கப்பட்டுள்ளன.(இ) உட்செலுத்தப்பட்ட நூலகத்தின் ட்ரைபெப்டைட் மையக்கருத்தின் ஒப்பீட்டு அதிர்வெண்ணை விலங்குகள் #1.1 மற்றும் #1.2 ஆகியவற்றிலிருந்து இரத்தத்தில் இருந்து பெறப்பட்ட பேஜுடன் ஒப்பிடும் தொடர்பு சிதறல்.(f) இரத்தம் மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட விலங்கு பேஜ் டிரிபெப்டைட் மையக்கருத்துகள் #1.1 மற்றும் #1.2 ஆகியவற்றின் தொடர்புடைய அதிர்வெண்களை ஒப்பிடும் தொடர்பு சிதறல்.(g, h) இரத்தத்தில் (g) செறிவூட்டப்பட்ட பேஜின் வரிசை ஐடி பிரதிநிதித்துவம் மற்றும் உட்செலுத்தப்பட்ட நூலகங்கள் மற்றும் CSF (h) இல் செறிவூட்டப்பட்ட பேஜ் மற்றும் இரண்டு விலங்குகளிலும் ஒரு சுற்று இன் விவோ தேர்வுக்குப் பிறகு இரத்தம்.ஒரு எழுத்து குறியீட்டின் அளவு, அந்த அமினோ அமிலம் அந்த நிலையில் எவ்வளவு அடிக்கடி ஏற்படுகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது.பச்சை = துருவம், ஊதா = நடுநிலை, நீலம் = அடிப்படை, சிவப்பு = அமிலம் மற்றும் கருப்பு = ஹைட்ரோபோபிக் அமினோ அமிலங்கள்.படம் 1a, b எட்வார்ட் யூரிச்சால் வடிவமைக்கப்பட்டு தயாரிக்கப்பட்டது.
பேஜ் பெப்டைட் நூலகத்தை இரண்டு CM இன்ஸ்ட்ரூமென்ட் எலிகளில் (கிளாடுகள் A மற்றும் B) செலுத்தினோம் மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் மற்றும் இரத்தத்திலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட பேஜ் (படம் 1d).காட்டு-வகை பேஜுடன் ஒப்பிடும்போது நூலகத்தின் ஆரம்ப விரைவான அனுமதி குறைவாக உச்சரிக்கப்பட்டது.இரண்டு விலங்குகளிலும் உட்செலுத்தப்பட்ட நூலகத்தின் சராசரி அரை-வாழ்க்கை இரத்தத்தில் 24.8 நிமிடங்கள், காட்டு-வகை பேஜ் போன்றது, மற்றும் CSF இல் 38.5 நிமிடங்கள்.ஒவ்வொரு விலங்கிலிருந்தும் இரத்தம் மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவ பேஜ் மாதிரிகள் HTS க்கு உட்படுத்தப்பட்டன மற்றும் அனைத்து அடையாளம் காணப்பட்ட பெப்டைட்களும் ஒரு குறுகிய டிரிபெப்டைட் மையக்கருத்தின் முன்னிலையில் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.டிரிபெப்டைட் மையக்கருத்துகள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன, ஏனெனில் அவை கட்டமைப்பு உருவாக்கம் மற்றும் பெப்டைட்-புரத தொடர்புகளுக்கு குறைந்தபட்ச அடிப்படையை வழங்குகின்றன.உட்செலுத்தப்பட்ட பேஜ் நூலகம் மற்றும் இரு விலங்குகளின் இரத்தத்திலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட குளோன்களுக்கு இடையே உள்ள மையக்கருத்துகளின் விநியோகத்தில் ஒரு நல்ல தொடர்பு இருப்பதைக் கண்டோம் (படம் 1e).நூலகத்தின் கலவை இரத்தப் பெட்டியில் ஓரளவு மட்டுமே செறிவூட்டப்பட்டுள்ளது என்று தரவு குறிப்பிடுகிறது.Weblogo16 மென்பொருளின் தழுவலைப் பயன்படுத்தி ஒவ்வொரு நிலையிலும் அமினோ அமில அதிர்வெண்கள் மற்றும் ஒருமித்த வரிசைகள் மேலும் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.சுவாரஸ்யமாக, இரத்த கிளைசின் எச்சங்களில் (படம் 1 கிராம்) வலுவான செறிவூட்டலைக் கண்டோம்.CSF இலிருந்து தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட குளோன்களுடன் இரத்தத்தை ஒப்பிடும் போது, ​​வலுவான தேர்வு மற்றும் மையக்கருத்துகளின் சில நீக்கம் காணப்பட்டது (படம். 1f), மற்றும் சில அமினோ அமிலங்கள் 12-உறுப்பினர் (படம் 1h) இல் முன்னரே தீர்மானிக்கப்பட்ட நிலைகளில் முன்னுரிமை அளிக்கப்படுகின்றன.குறிப்பிடத்தக்க வகையில், செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் தனிப்பட்ட விலங்குகள் கணிசமாக வேறுபடுகின்றன, அதேசமயம் இரத்த கிளைசின் செறிவூட்டல் இரண்டு விலங்குகளிலும் காணப்பட்டது (துணை படம். 4a-j).விலங்குகளின் #1.1 மற்றும் #1.2 செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் வரிசைத் தரவைக் கடுமையாக வடிகட்டிய பிறகு, மொத்தம் 964 மற்றும் 420 தனித்துவமான 12-மெர் பெப்டைடுகள் பெறப்பட்டன (துணை படம். 1d-e).தனிமைப்படுத்தப்பட்ட பேஜ் குளோன்கள் பெருக்கப்பட்டு, விவோ தேர்வின் இரண்டாவது சுற்றுக்கு உட்படுத்தப்பட்டன.இரண்டாவது சுற்று தேர்வில் இருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட பேஜ் ஒவ்வொரு விலங்கிலும் HTS க்கு உட்படுத்தப்பட்டது மற்றும் அனைத்து அடையாளம் காணப்பட்ட பெப்டைட்களும் டிரிபெப்டைட் மையக்கருத்துகள் (படம். 2a, b, ef) நிகழ்வை ஆய்வு செய்ய ஒரு மையக்கருத்து அங்கீகார திட்டத்திற்கு உள்ளீடாக பயன்படுத்தப்பட்டன.CSF இலிருந்து மீட்டெடுக்கப்பட்ட பேஜின் முதல் சுழற்சியுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​CSF இல் உள்ள A மற்றும் B கிளைகளில் (படம் 2) மேலும் தேர்வு மற்றும் தேர்வு நீக்கத்தை நாங்கள் கவனித்தோம்.அவை சீரான வரிசையின் வெவ்வேறு வடிவங்களைப் பிரதிநிதித்துவப்படுத்துகின்றனவா என்பதைத் தீர்மானிக்க பிணைய அடையாள வழிமுறை பயன்படுத்தப்பட்டது.மாற்று கிளேட் A (Fig. 2c, d) மற்றும் clade B (Fig. 2g, h) ஆகியவற்றில் CSF ஆல் மீட்டெடுக்கப்பட்ட 12-பரிமாண வரிசைகளுக்கு இடையே ஒரு தெளிவான ஒற்றுமை காணப்பட்டது.ஒவ்வொரு கிளையிலும் சேகரிக்கப்பட்ட பகுப்பாய்வு 12-மெர் பெப்டைட்களுக்கான வெவ்வேறு தேர்வு சுயவிவரங்களை வெளிப்படுத்தியது (துணை படம். 5c,d) மற்றும் CSF/blood titer விகிதத்தில் பூல் செய்யப்பட்ட குளோன்களின் முதல் சுற்று தேர்வுடன் ஒப்பிடும்போது (துணை படம். 5e) இரண்டாவது சுற்று தேர்வுக்குப் பிறகு காலப்போக்கில் அதிகரிப்பு.)
செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் உள்ள மையக்கருத்துகள் மற்றும் பெப்டைட்களின் செறிவூட்டல், விவோ ஃபங்ஷனல் பேஜ் டிஸ்ப்ளே தேர்வின் இரண்டு தொடர்ச்சியான சுற்றுகள்.
ஒவ்வொரு விலங்கின் முதல் சுற்றில் இருந்து மீட்கப்பட்ட அனைத்து செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவ பேஜ்களும் (விலங்குகள் #1.1 மற்றும் #1.2) ஒருங்கிணைக்கப்பட்டு, பெருக்கி, HT-வரிசைப்படுத்தப்பட்டு மீண்டும் ஒன்றாகச் செலுத்தப்பட்டன (2 x 1010 பேஜ்கள்/விலங்கு) 2 SM கேனுலேட்டட் எலிகள் (#1.1 → #).2.1 மற்றும் 2.2, 1.2 → 2.3 மற்றும் 2.4).(a,b,e,f) முதல் மற்றும் இரண்டாவது தேர்வு சுற்றுகளில் அனைத்து CSF-பெறப்பட்ட பேஜ்களின் டிரிபெப்டைட் மையக்கருத்துகளின் ஒப்பீட்டு அதிர்வெண்ணை ஒப்பிடும் தொடர்பு சிதறல்கள்.இரண்டு நோக்குநிலைகளிலும் பெப்டைட்களில் காணப்படும் அனைத்து சாத்தியமான ஒன்றுடன் ஒன்று டிரிப்டைட்களைக் குறிக்கும் மையக்கருத்துகளின் ஒப்பீட்டு அதிர்வெண் மற்றும் விநியோகம்.1000 வாசிப்புகளில் காணப்படும் மையக்கருத்துகளின் எண்ணிக்கை காட்டப்பட்டுள்ளது.ஒப்பிடப்பட்ட நூலகங்களில் ஒன்றில் குறிப்பிடத்தக்க அளவு (p <0.001) தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட அல்லது விலக்கப்பட்ட மையக்கருத்துகள் சிவப்பு புள்ளிகளுடன் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன.(c, d, g, h) விவோ தேர்வில் 2 மற்றும் 1 சுற்றுகளின் அடிப்படையில் அனைத்து CSF நிறைந்த 12 அமினோ அமில நீண்ட வரிசைகளின் வரிசை லோகோ பிரதிநிதித்துவம்.ஒரு எழுத்து குறியீட்டின் அளவு, அந்த அமினோ அமிலம் அந்த நிலையில் எவ்வளவு அடிக்கடி ஏற்படுகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது.லோகோவைப் பிரதிநிதித்துவப்படுத்த, இரண்டு தேர்வுச் சுற்றுகளுக்கு இடையே தனிப்பட்ட விலங்குகளிடமிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட CSF வரிசைகளின் அதிர்வெண் ஒப்பிடப்பட்டு, இரண்டாவது சுற்றில் செறிவூட்டப்பட்ட வரிசைகள் காட்டப்படுகின்றன: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 மற்றும் (h) #1.2–#2.4.(c, d) விலங்குகளில் கொடுக்கப்பட்ட நிலையில் மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட அமினோ அமிலங்கள் எண்.2.1 மற்றும் எண்.2.2 அல்லது (g, h) விலங்குகளில் எண்.2.3 மற்றும் எண்.2.4 வண்ணத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது.பச்சை = துருவம், ஊதா = நடுநிலை, நீலம் = அடிப்படை, சிவப்பு = அமிலம் மற்றும் கருப்பு = ஹைட்ரோபோபிக் அமினோ அமிலங்கள்.
மூன்றாவது சுற்று தேர்வுக்குப் பிறகு, இரண்டு விலங்குகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட 332 CSF-மறுசீரமைக்கப்பட்ட பேஜ் குளோன்களில் இருந்து 124 தனிப்பட்ட பெப்டைட் வரிசைகளை (#3.1 மற்றும் #3.2) அடையாளம் கண்டோம் (துணை படம் 6a).LGSVS (18.7%) வரிசை மிக உயர்ந்த ஒப்பீட்டு விகிதத்தைக் கொண்டிருந்தது, அதைத் தொடர்ந்து PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), மற்றும் SARGSWREIVSLS (2.2%) போன்ற காட்டு வகை செருகல்கள் உள்ளன.இறுதி நான்காவது சுற்றில், மூன்று தனித்தனி விலங்குகளிலிருந்து (படம் 1c) இரண்டு சுயாதீனமாக தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட கிளைகளை நாங்கள் சேகரித்தோம்.CSF இலிருந்து மீட்கப்பட்ட 925 வரிசைப்படுத்தப்பட்ட பேஜ் குளோன்களில், நான்காவது சுற்றில் 64 தனித்துவமான பெப்டைட் வரிசைகளை (துணை படம் 6b) கண்டறிந்தோம், அவற்றில் காட்டு-வகை பேஜின் ஒப்பீட்டு விகிதம் 0.8% ஆகக் குறைந்தது.நான்காவது சுற்றில் மிகவும் பொதுவான CSF குளோன்கள் LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) மற்றும் RRPQKINGARVC (3.6%) SD.%)).NNK நூலக வடிவமைப்பிற்கு சிதைந்த கோடன்களைப் பயன்படுத்தும் போது, ​​நூலக ப்ரைமர்களில் நியூக்ளியோடைடு செருகல்கள்/நீக்கங்கள் அல்லது முன்கூட்டிய நிறுத்தக் கோடான்கள் காரணமாக தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பெப்டைட்களின் நீள வரம்பு ஏற்படுகிறது.முன்கூட்டிய நிறுத்தக் கோடான்கள் குறுகிய பெப்டைட்களை உருவாக்குகின்றன, மேலும் அவை சாதகமான aa மையக்கருத்தைக் கொண்டிருப்பதால் அவை தேர்ந்தெடுக்கப்படுகின்றன.செயற்கை நூலகங்களின் ப்ரைமர்களில் உள்ள செருகல்கள்/நீக்கங்களால் நீண்ட பெப்டைடுகள் ஏற்படலாம்.இது வடிவமைக்கப்பட்ட ஸ்டாப் கோடானை சட்டகத்திற்கு வெளியே நிலைநிறுத்தி, புதிய ஸ்டாப் கோடான் கீழ்நோக்கி தோன்றும் வரை படிக்கும்.பொதுவாக, மாதிரி வெளியீட்டுத் தரவுடன் உள்ளீட்டுத் தரவை ஒப்பிட்டு நான்கு தேர்வுச் சுற்றுகளுக்கும் செறிவூட்டல் காரணிகளைக் கணக்கிட்டோம்.ஸ்கிரீனிங்கின் முதல் சுற்றுக்கு, வைல்ட்-டைப் பேஜ் டைட்டர்களை குறிப்பிட்ட அல்லாத பின்னணிக் குறிப்பாகப் பயன்படுத்தினோம்.சுவாரஸ்யமாக, எதிர்மறை பேஜ் தேர்வு முதல் CSF சுழற்சியில் மிகவும் வலுவாக இருந்தது, ஆனால் இரத்தத்தில் இல்லை (படம். 3a), இது பெப்டைட் நூலகத்தின் பெரும்பாலான உறுப்பினர்களின் செயலற்ற பரவல் CSF பெட்டியில் அல்லது உறவினர் பேஜ்களில் குறைந்த நிகழ்தகவு காரணமாக இருக்கலாம்.இருப்பினும், இரண்டாவது சுற்றில் CSF இல் பேஜ்களின் வலுவான தேர்வு இரண்டு கிளேடுகளிலும் காணப்பட்டது, முந்தைய சுற்று CSF எடுப்பதை ஊக்குவிக்கும் பெப்டைட்களைக் காட்டும் பேஜ்களில் செறிவூட்டப்பட்டதாகக் கூறுகிறது (படம் 3a).மீண்டும், குறிப்பிடத்தக்க இரத்த செறிவூட்டல் இல்லாமல்.மூன்றாவது மற்றும் நான்காவது சுற்றுகளில், பேஜ் குளோன்கள் CSF இல் கணிசமாக செறிவூட்டப்பட்டன.கடைசி இரண்டு சுற்றுத் தேர்வுகளுக்கு இடையே உள்ள ஒவ்வொரு தனிப்பட்ட பெப்டைட் வரிசையின் ஒப்பீட்டு அதிர்வெண்ணையும் ஒப்பிடுகையில், நான்காவது சுற்று தேர்வில் (படம் 3 பி) தொடர்கள் இன்னும் செறிவூட்டப்பட்டிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம்.இரண்டு பெப்டைட் நோக்குநிலைகளைப் பயன்படுத்தி அனைத்து 64 தனிப்பட்ட பெப்டைட் வரிசைகளிலிருந்தும் மொத்தம் 931 டிரிப்டைட் மையக்கருத்துகள் பிரித்தெடுக்கப்பட்டன.உட்செலுத்தப்பட்ட நூலகத்துடன் (கட்-ஆஃப்: 10% செறிவூட்டல்) (துணை படம். 6c) ஒப்பிடும்போது நான்காவது சுற்றில் மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட மையக்கருத்துகள் அனைத்து சுற்றுகளிலும் அவற்றின் செறிவூட்டல் சுயவிவரங்களுக்காக மிகவும் நெருக்கமாக ஆராயப்பட்டன.தேர்வின் பொதுவான வடிவங்கள், இரண்டு தேர்வுக் கிளைகளின் முந்தைய அனைத்து சுற்றுகளிலும் பெரும்பாலான ஆய்வு நோக்கங்கள் செறிவூட்டப்பட்டிருப்பதைக் காட்டுகிறது.இருப்பினும், சில மையக்கருத்துகள் (எ.கா. SGL, VSG, LGS GSV) பெரும்பாலும் மாற்று கிளேடு A இலிருந்து, மற்றவை (எ.கா. FGW, RTN, WGF, NTR) மாற்று கிளேடு B இல் செறிவூட்டப்பட்டன.
CSF-செறிவூட்டப்பட்ட பேஜ்-டிஸ்ப்ளே செய்யப்பட்ட பெப்டைடுகள் மற்றும் ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் பேலோடுகளுடன் இணைந்த பயோடைனிலேட்டட் லீடர் பெப்டைட்களின் CSF போக்குவரத்தின் சரிபார்ப்பு.
(அ) ​​உட்செலுத்தப்பட்ட (உள்ளீடு = I) பேஜ் (PFU) டைட்டர்கள் மற்றும் தீர்மானிக்கப்பட்ட CSF பேஜ் டைட்டர்கள் (வெளியீடு = O) ஆகியவற்றின் அடிப்படையில் நான்கு சுற்றுகளிலும் (R1-R4) செறிவூட்டல் விகிதங்கள் கணக்கிடப்படுகின்றன.கடந்த மூன்று சுற்றுகளுக்கான (R2-R4) செறிவூட்டல் காரணிகள் முந்தைய சுற்று மற்றும் முதல் சுற்று (R1) எடை தரவுகளுடன் ஒப்பிடுவதன் மூலம் கணக்கிடப்பட்டது.திறந்த பார்கள் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம், ஷேடட் பார்கள் பிளாஸ்மா.(***p<0.001, மாணவர்களின் t-test அடிப்படையில்).(ஆ) 4 வது சுற்றுக்குப் பிறகு CSF இல் சேகரிக்கப்பட்ட அனைத்து பேஜ்களுக்கும் அவற்றின் ஒப்பீட்டு விகிதாச்சாரத்தின்படி வரிசைப்படுத்தப்பட்ட, மிக அதிகமான பேஜ் பெப்டைடுகளின் பட்டியல்.மிகவும் பொதுவான ஆறு பேஜ் குளோன்கள், 3 மற்றும் 4 சுற்றுகளுக்கு இடையே வண்ணம், எண்ணிடப்பட்டவை மற்றும் அவற்றின் செறிவூட்டல் காரணிகள் (இன்செட்டுகள்) ஆகியவற்றில் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன.(c, d) சுற்று 4 இலிருந்து ஆறு மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட பேஜ் குளோன்கள், வெற்று பேஜ் மற்றும் பெற்றோர் பேஜ் பெப்டைட் நூலகங்கள் ஒரு CSF மாதிரி மாதிரியில் தனித்தனியாக பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.CSF மற்றும் இரத்த மாதிரிகள் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட நேர புள்ளிகளில் சேகரிக்கப்பட்டன..ஒவ்வொரு செலுத்தப்பட்ட பேஜ் குளோன் மற்றும் பேஜ் பெப்டைட் லைப்ரரியின் CSF பார்மகோகினெடிக்ஸ் காலப்போக்கில் காட்டப்படுகிறது.(ஈ) மாதிரி நேரத்தில் மீட்கப்பட்ட அனைத்து பேஜ்கள்/எம்எல்களுக்கான சராசரி CSF/இரத்த விகிதத்தைக் காட்டுகிறது.(இ) நான்கு செயற்கை லீடர் பெப்டைடுகள் மற்றும் ஒரு துருவல் கட்டுப்பாடு ஆகியவை பயோட்டினுடன் ஸ்ட்ரெப்டாவிடினுடன் அவற்றின் N-டெர்மினஸ் (டெட்ராமர் டிஸ்ப்ளே) மூலம் இணைக்கப்பட்டன, அதைத் தொடர்ந்து ஊசி (வால் நரம்பு iv, 10 mg ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்/கிலோ).குறைந்தது மூன்று உட்புகுந்த எலிகள் (N = 3).)CSF மாதிரிகள் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட நேரப் புள்ளிகளில் சேகரிக்கப்பட்டன மற்றும் ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் செறிவுகள் CSF எதிர்ப்பு ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் ELISA ஆல் அளவிடப்பட்டன (nd = கண்டறியப்படவில்லை).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA சோதனை அடிப்படையில்).(எஃப்) மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட பேஜ் பெப்டைட் குளோன் #2002 (ஊதா) இன் அமினோ அமில வரிசையை 4வது சுற்று தேர்வில் இருந்து தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பிற பேஜ் பெப்டைட் குளோன்களுடன் ஒப்பிடுதல்.ஒரே மாதிரியான மற்றும் ஒத்த அமினோ அமிலத் துண்டுகள் வண்ணக் குறியிடப்பட்டவை.
நான்காவது சுற்றில் உள்ள அனைத்து செறிவூட்டப்பட்ட பேஜ்களில் (படம் 3 பி), CSF மாதிரி மாதிரியில் மேலும் தனிப்பட்ட பகுப்பாய்விற்கு ஆறு வேட்பாளர் குளோன்கள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன.ஆறு வேட்பாளர் பேஜ், வெற்று பேஜ் (செருகல் இல்லை) மற்றும் புரோபேஜ் பெப்டைட் நூலகங்களின் சம அளவுகள் மூன்று கேனுலேட்டட் CM விலங்குகளுக்குள் செலுத்தப்பட்டன, மேலும் CSF (படம். 3c) மற்றும் இரத்தம் (துணை படம் 7) மதிப்பீடுகளில் மருந்தியக்கவியல் தீர்மானிக்கப்பட்டது.சோதனை செய்யப்பட்ட அனைத்து பேஜ் குளோன்களும் வெற்று கட்டுப்பாட்டு பேஜை விட 10-1000 மடங்கு அதிக அளவில் CSF பெட்டியை குறிவைத்தன (#1779).எடுத்துக்காட்டாக, #2020 மற்றும் #2077 குளோன்கள் கண்ட்ரோல் பேஜை விட சுமார் 1000 மடங்கு அதிகமான CSF டைட்டர்களைக் கொண்டிருந்தன.தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு பெப்டைட்டின் பார்மகோகினெடிக் சுயவிவரம் வேறுபட்டது, ஆனால் அவை அனைத்தும் அதிக CSF ஹோமிங் திறனைக் கொண்டுள்ளன.#1903 மற்றும் #2011 குளோன்களுக்கு காலப்போக்கில் தொடர்ந்து குறைவதை நாங்கள் கவனித்தோம், அதே நேரத்தில் #2077, #2002 மற்றும் #2009 குளோன்களுக்கு முதல் 10 நிமிடங்களில் அதிகரிப்பு செயலில் உள்ள போக்குவரத்தைக் குறிக்கலாம் ஆனால் சரிபார்க்கப்பட வேண்டும்.குளோன்கள் #2020, #2002, மற்றும் #2077 உயர் மட்டங்களில் நிலைப்படுத்தப்பட்டது, அதே சமயம் ஆரம்ப அதிகரிப்புக்குப் பிறகு குளோன் #2009 இன் CSF செறிவு மெதுவாகக் குறைந்தது.ஒவ்வொரு CSF வேட்பாளரின் ஒப்பீட்டு அதிர்வெண்ணையும் அதன் இரத்த செறிவுடன் ஒப்பிட்டோம் (படம் 3d).ஒவ்வொரு CSF வேட்பாளரின் சராசரி டைட்டரின் அனைத்து மாதிரி நேரங்களிலும் அதன் இரத்த டைட்டரின் தொடர்பு, ஆறு வேட்பாளர்களில் மூன்று பேர் இரத்த CSF இல் கணிசமாக செறிவூட்டப்பட்டுள்ளனர் என்பதைக் காட்டுகிறது.சுவாரஸ்யமாக, குளோன் #2077 அதிக இரத்த நிலைத்தன்மையைக் காட்டியது (துணை படம் 7).பேஜ் துகள்களைத் தவிர மற்ற சரக்குகளை CSF பெட்டியில் கொண்டு செல்லும் திறன் பெப்டைட்களே என்பதை உறுதிப்படுத்த, பெப்டைடுகள் பேஜ் துகள்களுடன் இணைக்கும் N-டெர்மினஸில் பயோட்டின் மூலம் பெறப்பட்ட நான்கு லீடர் பெப்டைட்களை ஒருங்கிணைத்தோம்.பயோடைனிலேட்டட் பெப்டைடுகள் (எண். 2002, 2009, 2020 மற்றும் 2077) பேஜ் வடிவவியலைப் பிரதிபலிக்கும் மல்டிமெரிக் வடிவங்களைப் பெற ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் (எஸ்ஏ) உடன் இணைக்கப்பட்டன.இந்த வடிவம் இரத்தம் மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் உள்ள SA வெளிப்பாட்டை சரக்கு-போக்குவரத்து புரத பெப்டைட்களாக அளவிட அனுமதித்தது.முக்கியமாக, செயற்கை பெப்டைடுகள் இந்த SA-இணைந்த வடிவத்தில் (படம் 3e) நிர்வகிக்கப்படும் போது பேஜ் தரவு அடிக்கடி மீண்டும் உருவாக்கப்படும்.துருவிய பெப்டைடுகள் குறைவான ஆரம்ப வெளிப்பாடு மற்றும் 48 மணி நேரத்திற்குள் கண்டறிய முடியாத அளவுகளுடன் கூடிய வேகமான CSF அனுமதியைக் கொண்டிருந்தன.இந்த பெப்டைட் பேஜ் குளோன்களை CSF விண்வெளியில் விநியோகிக்கும் பாதைகளைப் பற்றிய நுண்ணறிவைப் பெற, விவோவில் நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்ட 1 மணிநேரத்திற்குப் பிறகு பேஜ் துகள்களை நேரடியாகக் கண்டறிய இம்யூனோஹிஸ்டோ கெமிஸ்ட்ரி (IHC) ஐப் பயன்படுத்தி தனிப்பட்ட பேஜ் பெப்டைட் வெற்றிகளின் உள்ளூர்மயமாக்கலை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம்.குறிப்பிடத்தக்க வகையில், #2002, #2077, மற்றும் #2009 ஆகிய குளோன்கள் மூளை நுண்குழாய்களில் வலுவான கறை படிந்ததன் மூலம் கண்டறியப்படலாம், அதே நேரத்தில் கட்டுப்பாட்டு பேஜ் (#1779) மற்றும் குளோன் #2020 கண்டறியப்படவில்லை (துணை படம் 8).இந்த பெப்டைடுகள் BBB ஐக் கடப்பதன் மூலம் துல்லியமாக மூளையின் தாக்கத்திற்கு பங்களிக்கின்றன என்று இது அறிவுறுத்துகிறது.இந்த கருதுகோளை சோதிக்க மேலும் விரிவான பகுப்பாய்வு தேவைப்படுகிறது, ஏனெனில் BSCFB வழியும் இதில் ஈடுபடலாம்.மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட குளோனின் (#2002) அமினோ அமில வரிசையை மற்ற தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பெப்டைட்களுடன் ஒப்பிடும் போது, ​​அவற்றில் சில ஒத்த அமினோ அமில நீட்டிப்புகளைக் கொண்டிருப்பதைக் குறிப்பிடுகிறது, இது ஒரே மாதிரியான போக்குவரத்து இயக்கமுறையைக் குறிக்கலாம் (படம். 3f).
அதன் தனித்துவமான பிளாஸ்மா சுயவிவரம் மற்றும் காலப்போக்கில் CSF இல் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பு காரணமாக, பேஜ் டிஸ்ப்ளே குளோன் #2077 நீண்ட 48-மணி நேரத்தில் மேலும் ஆராயப்பட்டது மற்றும் நீடித்த SA அளவுகளுடன் (படம் 4a) இணைந்து காணப்பட்ட CSF இன் விரைவான அதிகரிப்பை மீண்டும் உருவாக்க முடிந்தது.மற்ற அடையாளம் காணப்பட்ட பேஜ் குளோன்களைப் பொறுத்தவரை, #2077 மூளை நுண்குழாய்களுக்கு வலுவாக படிந்துள்ளது மற்றும் அதிக தெளிவுத்திறனில் பார்க்கும்போது தந்துகி மார்க்கர் லெக்டினுடன் குறிப்பிடத்தக்க கோலோகலைசேஷனைக் காட்டியது மற்றும் பாரன்கிமல் இடத்தில் சில கறைகள் இருக்கலாம் (படம் 4 பி).சிஎன்எஸ்ஸில் பெப்டைட்-மத்தியஸ்த மருந்தியல் விளைவுகளைப் பெற முடியுமா என்பதை ஆராய்வதற்காக, i) #2077 டிரான்சிட் பெப்டைட் மற்றும் ii) BACE1 இன்ஹிபிட்டர் பெப்டைட் ஆகியவற்றின் பயோடைனிலேட்டட் பதிப்புகள் SA உடன் இரண்டு வெவ்வேறு விகிதங்களில் கலக்கப்பட்ட ஒரு பரிசோதனையை நாங்கள் செய்தோம்.ஒரு கலவைக்கு BACE1 பெப்டைட் தடுப்பானை மட்டுமே பயன்படுத்தினோம், மற்றொன்றுக்கு BACE1 பெப்டைட் இன்ஹிபிட்டரின் 1:3 விகிதத்தை #2077 பெப்டைடைப் பயன்படுத்தினோம்.இரண்டு மாதிரிகளும் நரம்பு வழியாக நிர்வகிக்கப்பட்டன மற்றும் பீட்டா-அமிலாய்டு பெப்டைட் 40 (Abeta40) இன் இரத்தம் மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவ அளவுகள் காலப்போக்கில் அளவிடப்பட்டன.Abeta40 CSF இல் அளவிடப்பட்டது, ஏனெனில் இது மூளை பாரன்கிமாவில் BACE1 தடுப்பை பிரதிபலிக்கிறது.எதிர்பார்த்தபடி, இரண்டு வளாகங்களும் Abeta40 இன் இரத்த அளவைக் கணிசமாகக் குறைத்தன (படம் 4c, d).இருப்பினும், பெப்டைட் எண் கலவையைக் கொண்ட மாதிரிகள் மட்டுமே.2077 மற்றும் SA உடன் இணைந்த BACE1 பெப்டைட்டின் தடுப்பானானது செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் Abeta40 இல் குறிப்பிடத்தக்க குறைவை ஏற்படுத்தியது (படம் 4c).பெப்டைட் எண் என்று தரவு காட்டுகிறது.2077 ஆனது 60 kDa SA புரதத்தை CNS க்குள் கொண்டு செல்ல முடியும் மற்றும் BACE1 பெப்டைட்டின் SA- இணைந்த தடுப்பான்களுடன் மருந்தியல் விளைவுகளையும் தூண்டுகிறது.
(அ) ​​T7 பேஜின் குளோனல் ஊசி (2 × 10 பேஜ்கள்/விலங்கு) CSF பெப்டைட் #2077 (RLSSVDSDLSGC) மற்றும் உட்செலுத்தப்படாத கண்ட்ரோல் பேஜ் (#1779) இன் நீண்ட கால பார்மகோகினெடிக் சுயவிவரங்களைக் காட்டுகிறது.(ஆ) பேஜ்-இன்ஜெக்ட் செய்யப்பட்ட எலிகளில் (2 × 10 10 பேஜ்கள்/விலங்குகள்) பிரதிநிதித்துவ கார்டிகல் மைக்ரோவெசல்களின் கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோபிக் படம் பெப்டைட் #2077 மற்றும் பாத்திரங்களின் (லெக்டின்) எதிர்ப்பைக் காட்டுகிறது.இந்த பேஜ் குளோன்கள் 3 எலிகளுக்கு செலுத்தப்பட்டு, 1 மணிநேரம் புழக்கத்திற்கு விடப்பட்டது.T7 பேஜ் கேப்சிடிற்கு எதிராக பாலிகுளோனல் FITC-லேபிளிடப்பட்ட ஆன்டிபாடிகளால் மூளைகள் பிரிக்கப்பட்டு கறை படிந்தன.பெர்ஃப்யூஷன் மற்றும் அதைத் தொடர்ந்து சரிசெய்வதற்கு பத்து நிமிடங்களுக்கு முன்பு, DyLight594-லேபிளிடப்பட்ட லெக்டின் நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டது.நுண்குழாய்களின் லுமினல் பக்கத்தின் லெக்டின் கறை (சிவப்பு) மற்றும் நுண்குழாய்கள் மற்றும் பெரிவாஸ்குலர் மூளை திசுக்களின் லுமினில் உள்ள பேஜ்கள் (பச்சை) ஆகியவற்றைக் காட்டும் ஒளிரும் படங்கள்.அளவுகோல் 10 µm க்கு ஒத்திருக்கிறது.(c, d) Biotinylated BACE1 இன்ஹிபிட்டரி பெப்டைட் தனியாக அல்லது பயோடைனிலேட்டட் டிரான்சிட் பெப்டைட் #2077 உடன் இணைந்து ஸ்ட்ரெப்டாவிடினுடன் இணைக்கப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து குறைந்தது மூன்று கேனுலேட்டட் CM எலிகள் (10 mg streptavidin/kg) நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டது.Aβ40 இல் BACE1 பெப்டைட் இன்ஹிபிட்டர்-மத்தியஸ்த குறைப்பு Aβ1-40 ELISA மூலம் இரத்தம் (சிவப்பு) மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் (ஆரஞ்சு) ஆகியவற்றால் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட நேர புள்ளிகளில் அளவிடப்பட்டது.சிறந்த தெளிவுக்காக, 100% அளவில் வரைபடத்தில் ஒரு புள்ளியிடப்பட்ட கோடு வரையப்படுகிறது.(இ) 3:1 விகிதத்தில் டிரான்சிட் பெப்டைட் #2077 மற்றும் BACE1 இன்ஹிபிட்டரி பெப்டைடுடன் இணைக்கப்பட்ட ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் மூலம் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட எலிகளில் Aβ40 இரத்தத்தில் (சிவப்பு முக்கோணங்கள்) மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் (ஆரஞ்சு முக்கோணங்கள்) சதவீதக் குறைப்பு.(ஈ) இரத்தத்தில் Aβ40 (சிவப்பு வட்டங்கள்) மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் (ஆரஞ்சு வட்டங்கள்) எலிகளில் ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் மூலம் BACE1 இன்ஹிபிட்டரி பெப்டைடுடன் மட்டும் இணைக்கப்பட்டது.கட்டுப்பாட்டில் Aβ செறிவு 420 pg/ml (நிலையான விலகல் = 101 pg/ml).
உயிரியல் மருத்துவ ஆராய்ச்சியின் பல பகுதிகளில் பேஜ் டிஸ்ப்ளே வெற்றிகரமாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது17.இந்த முறை விவோ வாஸ்குலர் பன்முகத்தன்மை ஆய்வுகள் 18,19 மற்றும் பெருமூளைக் குழாய்களைக் குறிவைக்கும் ஆய்வுகள்20,21,22,23,24,25,26 ஆகியவற்றில் பயன்படுத்தப்பட்டது.இந்த ஆய்வில், பெருமூளைக் குழாய்களைக் குறிவைக்கும் பெப்டைட்களை நேரடியாகக் கண்டறிவதற்கு மட்டுமல்லாமல், இரத்த-மூளைத் தடையைக் கடக்க செயலில் போக்குவரத்து பண்புகளைக் கொண்ட வேட்பாளர்களைக் கண்டுபிடிப்பதற்கும் இந்தத் தேர்வு முறையின் பயன்பாட்டை விரிவுபடுத்தினோம்.CM intubated எலிகளில் in vivo தேர்வு செயல்முறையின் வளர்ச்சியை நாங்கள் இப்போது விவரிக்கிறோம் மற்றும் CSF ஹோமிங் பண்புகளுடன் பெப்டைட்களை அடையாளம் காணும் திறனைக் காட்டுகிறோம்.12-மெர் ரேண்டம் பெப்டைட்களின் நூலகத்தைக் காண்பிக்கும் T7 பேஜைப் பயன்படுத்தி, T7 பேஜ் போதுமான அளவு சிறியது (சுமார் 60 nm விட்டம்) 10 இரத்த-மூளைத் தடைக்கு ஏற்றவாறு, அதன் மூலம் நேரடியாக இரத்த-மூளைத் தடையை அல்லது choroid plexus ஐக் கடக்கிறது என்பதை நிரூபிக்க முடிந்தது.கேனுலேட்டட் CM எலிகளிலிருந்து CSF அறுவடை செய்வது விவோ செயல்பாட்டுத் திரையிடல் முறையில் நன்கு கட்டுப்படுத்தப்பட்டதையும், பிரித்தெடுக்கப்பட்ட பேஜ் வாஸ்குலேச்சருடன் மட்டும் பிணைக்கப்படவில்லை, ஆனால் இரத்த-மூளைத் தடையின் குறுக்கே ஒரு டிரான்ஸ்போர்ட்டராக செயல்படுவதையும் நாங்கள் கவனித்தோம்.மேலும், ஒரே நேரத்தில் இரத்தத்தை சேகரித்து, CSF மற்றும் இரத்தத்தில் இருந்து பெறப்பட்ட பேஜ்களுக்கு HTS ஐப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், CSF இன் எங்கள் தேர்வு இரத்த செறிவூட்டல் அல்லது தேர்வு சுற்றுகளுக்கு இடையே விரிவாக்கத்திற்கான உடற்தகுதி ஆகியவற்றால் பாதிக்கப்படவில்லை என்பதை உறுதிப்படுத்தினோம்.இருப்பினும், இரத்தப் பிரிவு தேர்வு செயல்முறையின் ஒரு பகுதியாகும், ஏனெனில் CSF பெட்டியை அடையும் திறன் கொண்ட பேஜ்கள் மூளையில் தங்களைச் செழுமைப்படுத்துவதற்கு போதுமான அளவு இரத்த ஓட்டத்தில் உயிர்வாழ வேண்டும்.மூல HTS தரவிலிருந்து நம்பகமான வரிசைத் தகவலைப் பிரித்தெடுப்பதற்காக, பகுப்பாய்வு பணிப்பாய்வுகளில் இயங்குதளம் சார்ந்த வரிசைமுறை பிழைகளுக்கு ஏற்ற வடிப்பான்களை நாங்கள் செயல்படுத்தினோம்.ஸ்கிரீனிங் முறையில் இயக்க அளவுருக்களை இணைப்பதன் மூலம், 24, 27, 28 இல் காட்டு-வகை T7 பேஜ்களின் (t½ ~ 28 நிமிடம்) விரைவான மருந்தியக்கவியலை உறுதிசெய்தோம், மேலும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் (t½ ~ 26 நிமிடம்) நிமிடத்திற்கு அவற்றின் அரை ஆயுளையும் தீர்மானித்தோம்.இரத்தம் மற்றும் CSF இல் ஒரே மாதிரியான பார்மகோகினெடிக் சுயவிவரங்கள் இருந்தபோதிலும், CSF இல் 0.001% பேஜின் இரத்த செறிவு மட்டுமே கண்டறியப்பட்டது, இது இரத்த-மூளைத் தடை முழுவதும் காட்டு-வகை T7 பேஜின் குறைந்த பின்னணி இயக்கத்தைக் குறிக்கிறது.விவோ பேனிங் உத்திகளில் பயன்படுத்தும் போது முதல் சுற்று தேர்வின் முக்கியத்துவத்தை இந்த வேலை எடுத்துக்காட்டுகிறது, குறிப்பாக சில குளோன்கள் சிஎன்எஸ் பெட்டியை அடைய முடியும் என்பதால், புழக்கத்தில் இருந்து விரைவாக அழிக்கப்படும் பேஜ் அமைப்புகளுக்கு.எனவே, முதல் சுற்றில், நூலகப் பன்முகத்தன்மையின் குறைப்பு மிகப் பெரியதாக இருந்தது, ஏனெனில் இந்த மிகக் கடுமையான CSF மாதிரியில் ஒரு குறிப்பிட்ட எண்ணிக்கையிலான குளோன்கள் மட்டுமே இறுதியில் சேகரிக்கப்பட்டன.இந்த விவோ பேனிங் உத்தியில், CSF பெட்டியில் செயலில் குவிப்பு, இரத்தப் பிரிவில் குளோன் உயிர்வாழ்வது மற்றும் முதல் 10 நிமிடங்களுக்குள் T7 பேஜ் குளோன்களை இரத்தத்திலிருந்து விரைவாக அகற்றுவது போன்ற பல தேர்வுப் படிகள் அடங்கும் (படம். 1d மற்றும் துணைப் படம். 4M).)எனவே, முதல் சுற்றுக்குப் பிறகு, CSF இல் வெவ்வேறு பேஜ் குளோன்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன, இருப்பினும் அதே ஆரம்பக் குளம் தனிப்பட்ட விலங்குகளுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது.அதிக எண்ணிக்கையிலான நூலக உறுப்பினர்களைக் கொண்ட மூல நூலகங்களுக்கான பல கண்டிப்பான தேர்வு படிகள் பன்முகத்தன்மையில் குறிப்பிடத்தக்க குறைப்பை ஏற்படுத்துகிறது என்று இது அறிவுறுத்துகிறது.எனவே, சீரற்ற நிகழ்வுகள் ஆரம்ப தேர்வு செயல்முறையின் ஒருங்கிணைந்த பகுதியாக மாறும், இது முடிவை பெரிதும் பாதிக்கும்.அசல் நூலகத்தில் உள்ள பல குளோன்கள் மிகவும் ஒத்த CSF செறிவூட்டல் முனைப்பைக் கொண்டிருந்திருக்கலாம்.இருப்பினும், அதே சோதனை நிலைமைகளின் கீழ் கூட, ஆரம்பக் குளத்தில் ஒவ்வொரு குறிப்பிட்ட குளோனின் சிறிய எண்ணிக்கையின் காரணமாக தேர்வு முடிவுகள் வேறுபடலாம்.
CSF இல் செறிவூட்டப்பட்ட கருக்கள் இரத்தத்தில் உள்ளவற்றிலிருந்து வேறுபடுகின்றன.சுவாரஸ்யமாக, தனிப்பட்ட விலங்குகளின் இரத்தத்தில் கிளைசின் நிறைந்த பெப்டைட்களை நோக்கிய முதல் மாற்றத்தை நாங்கள் குறிப்பிட்டோம்.(படம். 1g, துணைப் படம். 4e, 4f).கிளைசின் பெப்டைடுகள் கொண்ட பேஜ் மிகவும் நிலையானதாகவும், புழக்கத்தில் இருந்து வெளியே எடுக்கப்படுவதற்கான வாய்ப்பு குறைவாகவும் இருக்கலாம்.இருப்பினும், இந்த கிளைசின் நிறைந்த பெப்டைடுகள் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவ மாதிரிகளில் கண்டறியப்படவில்லை, க்யூரேட்டட் நூலகங்கள் இரண்டு வெவ்வேறு தேர்வு படிகளை கடந்து சென்றன: ஒன்று இரத்தத்தில் மற்றும் மற்றொன்று செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் குவிக்க அனுமதிக்கப்படுகிறது.நான்காவது சுற்று தேர்வின் விளைவாக CSF-செறிவூட்டப்பட்ட குளோன்கள் விரிவாக சோதிக்கப்பட்டன.வெற்று கட்டுப்பாட்டு பேஜுடன் ஒப்பிடும்போது தனித்தனியாக சோதிக்கப்பட்ட அனைத்து குளோன்களும் CSF இல் செறிவூட்டப்பட்டதாக உறுதிப்படுத்தப்பட்டது.ஒரு பெப்டைட் வெற்றி (#2077) இன்னும் விரிவாக ஆராயப்பட்டது.இது மற்ற வெற்றிகளுடன் ஒப்பிடும்போது நீண்ட பிளாஸ்மா அரை-வாழ்க்கைக் காட்டியது (படம் 3d மற்றும் துணைப் படம் 7), சுவாரஸ்யமாக, இந்த பெப்டைடில் சி-டெர்மினஸில் சிஸ்டைன் எச்சம் இருந்தது.பெப்டைட்களுடன் சிஸ்டைனை சேர்ப்பது அல்புமின் 29 உடன் பிணைப்பதன் மூலம் அவற்றின் பார்மகோகினெடிக் பண்புகளை மேம்படுத்த முடியும் என்று சமீபத்தில் நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது.இது தற்போது பெப்டைட் #2077 க்கு அறியப்படவில்லை, மேலும் ஆய்வு தேவைப்படுகிறது.சில பெப்டைடுகள் CSF செறிவூட்டலில் வேலன்ஸ்-சார்புநிலையைக் காட்டின (தரவு காட்டப்படவில்லை), இது T7 கேப்சிட்டின் காட்டப்படும் மேற்பரப்பு வடிவவியலுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம்.நாங்கள் பயன்படுத்திய T7 அமைப்பு ஒரு பேஜ் துகளுக்கு ஒவ்வொரு பெப்டைட்டின் 5-15 நகல்களைக் காட்டியது.எலிகளின் பெருமூளைப் புறணிக்குள் உட்செலுத்தப்பட்ட வேட்பாளர் லீட் பேஜ் குளோன்களில் IHC செய்யப்பட்டது (துணை படம் 8).BBB உடன் குறைந்தது மூன்று குளோன்கள் (எண். 2002, எண். 2009 மற்றும் எண். 2077) தொடர்பு கொண்டதாக தரவு காட்டுகிறது.இந்த BBB தொடர்பு CSF திரட்சியில் விளைகிறதா அல்லது இந்த குளோன்களை நேரடியாக BCSFB க்கு நகர்த்துகிறதா என்பது தீர்மானிக்கப்பட உள்ளது.முக்கியமாக, தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டு புரத சரக்குகளுடன் பிணைக்கப்படும்போது அவற்றின் CSF போக்குவரத்து திறனைத் தக்கவைத்துக்கொள்கின்றன என்பதைக் காட்டுகிறோம்.N-டெர்மினல் பயோடைனிலேட்டட் பெப்டைட்களை SA உடன் பிணைப்பது, இரத்தம் மற்றும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் (படம் 3e) அந்தந்த பேஜ் குளோன்களுடன் பெறப்பட்ட முடிவுகளை மீண்டும் மீண்டும் செய்கிறது.இறுதியாக, ஈய பெப்டைட் #2077 ஆனது SA உடன் இணைக்கப்பட்ட BACE1 இன் பயோடைனிலேட்டட் பெப்டைட் தடுப்பானின் மூளை செயல்பாட்டை ஊக்குவிக்க முடியும் என்பதைக் காட்டுகிறோம், இது CSF இல் Abeta40 அளவைக் கணிசமாகக் குறைப்பதன் மூலம் CNS இல் உச்சரிக்கப்படும் மருந்தியல் விளைவுகளை ஏற்படுத்துகிறது (படம் 4).அனைத்து வெற்றிகளின் பெப்டைட் சீக்வென்ஸ் ஹோமோலஜி தேடலைச் செய்வதன் மூலம் தரவுத்தளத்தில் எந்த ஹோமோலாக்ஸையும் எங்களால் அடையாளம் காண முடியவில்லை.T7 நூலகத்தின் அளவு தோராயமாக 109, அதே சமயம் 12-மெர்களுக்கான கோட்பாட்டு நூலக அளவு 4 x 1015. எனவே, 12-மெர் பெப்டைட் லைப்ரரியின் பன்முகத்தன்மையின் ஒரு சிறிய பகுதியை மட்டுமே நாங்கள் தேர்ந்தெடுத்துள்ளோம்.அனுமானமாக, இந்த பெப்டைட்களின் எந்த இயற்கையான ஹோமோலாக்ஸையும் நாம் கண்டுபிடிக்காததற்கு ஒரு காரணம், மூளைக்குள் சில பெப்டைட் மையக்கருத்துகளின் கட்டுப்பாடற்ற நுழைவைத் தடுக்க பரிணாம வளர்ச்சியின் போது நீக்கப்பட்டதாக இருக்கலாம்.
ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், விவோவில் உள்ள செரிப்ரோவாஸ்குலர் தடையின் போக்குவரத்து அமைப்புகளை இன்னும் விரிவாகக் கண்டறிந்து வகைப்படுத்துவதற்கான எதிர்கால வேலைகளுக்கான அடிப்படையை எங்கள் முடிவுகள் வழங்குகின்றன.இந்த முறையின் அடிப்படை அமைப்பு செயல்பாட்டுத் தேர்வு உத்தியை அடிப்படையாகக் கொண்டது, இது பெருமூளை வாஸ்குலர் பிணைப்பு பண்புகளைக் கொண்ட குளோன்களை அடையாளம் காண்பது மட்டுமல்லாமல், வெற்றிகரமான குளோன்கள் உயிரியல் தடைகளை CNS பெட்டியில் கடக்க உள்ளார்ந்த செயல்பாட்டைக் கொண்ட ஒரு முக்கியமான படியையும் உள்ளடக்கியது.இந்த பெப்டைட்களின் போக்குவரத்தின் பொறிமுறையையும், மூளைப் பகுதிக்கு குறிப்பிட்ட மைக்ரோவாஸ்குலேச்சருடன் பிணைப்பதற்கான அவற்றின் விருப்பத்தையும் தெளிவுபடுத்துவதாகும்.இது BBB மற்றும் ஏற்பிகளின் போக்குவரத்துக்கான புதிய பாதைகளைக் கண்டறிய வழிவகுக்கும்.அடையாளம் காணப்பட்ட பெப்டைடுகள் நேரடியாக செரிப்ரோவாஸ்குலர் ஏற்பிகளுடன் அல்லது பிபிபி அல்லது பிசிஎஸ்எஃப்பி மூலம் கடத்தப்படும் லிகண்ட்களுடன் நேரடியாக பிணைக்கப்படலாம் என்று நாங்கள் எதிர்பார்க்கிறோம்.இந்த வேலையில் கண்டுபிடிக்கப்பட்ட CSF போக்குவரத்து செயல்பாடு கொண்ட பெப்டைட் வெக்டர்கள் மேலும் ஆராயப்படும்.BBB மற்றும்/அல்லது BCSFB ஐக் கடக்கும் திறனுக்காக இந்த பெப்டைட்களின் மூளைத் தன்மையை நாங்கள் தற்போது ஆராய்ந்து வருகிறோம்.இந்த புதிய பெப்டைடுகள் புதிய ஏற்பிகள் அல்லது பாதைகளின் சாத்தியமான கண்டுபிடிப்பு மற்றும் உயிரியல் போன்ற மேக்ரோமிகுலூக்களை மூளைக்கு வழங்குவதற்கான புதிய மிகவும் திறமையான தளங்களை உருவாக்குவதற்கு மிகவும் மதிப்புமிக்க கருவிகளாக இருக்கும்.
முன்பு விவரிக்கப்பட்ட முறையின் மாற்றத்தைப் பயன்படுத்தி பெரிய சிஸ்டெர்னாவை (CM) கேனுலேட் செய்யவும்.மயக்க மருந்து செய்யப்பட்ட விஸ்டார் எலிகள் (200-350 கிராம்) ஒரு ஸ்டீரியோடாக்சிக் கருவியில் பொருத்தப்பட்டு, மண்டை ஓட்டை வெளிப்படுத்தும் வகையில் மொட்டையடித்து, அசெப்டிக் முறையில் தயாரிக்கப்பட்ட உச்சந்தலையில் ஒரு இடைநிலை கீறல் செய்யப்பட்டது.மேல் சாஷின் பகுதியில் இரண்டு துளைகளைத் துளைத்து, துளைகளில் சரிசெய்யும் திருகுகளை இணைக்கவும்.துருப்பிடிக்காத எஃகு கேனுலாவின் ஸ்டீரியோடாக்டிக் வழிகாட்டுதலுக்காக பக்கவாட்டு ஆக்ஸிபிடல் முகட்டில் கூடுதல் துளை துளையிடப்பட்டது.கானுலாவைச் சுற்றி பல் சிமெண்ட் தடவி திருகுகள் மூலம் பாதுகாக்கவும்.புகைப்படக் குணப்படுத்துதல் மற்றும் சிமென்ட் கடினப்படுத்துதலுக்குப் பிறகு, தோல் காயம் 4/0 supramid தையல் மூலம் மூடப்பட்டது.செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தின் (CSF) தன்னிச்சையான கசிவு மூலம் கானுலாவின் சரியான இடம் உறுதி செய்யப்படுகிறது.ஸ்டீரியோடாக்சிக் கருவியில் இருந்து எலியை அகற்றவும், அறுவை சிகிச்சைக்குப் பின் பொருத்தமான பராமரிப்பு மற்றும் வலி மேலாண்மையைப் பெறவும், மேலும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தில் இரத்தத்தின் அறிகுறிகள் தோன்றும் வரை குறைந்தது ஒரு வாரமாவது அதை மீட்க அனுமதிக்கவும்.விஸ்டார் எலிகள் (Crl:WI/Han) சார்லஸ் நதியிலிருந்து (பிரான்ஸ்) பெறப்பட்டது.அனைத்து எலிகளும் குறிப்பிட்ட நோய்க்கிருமி இல்லாத நிலைமைகளின் கீழ் வைக்கப்பட்டன.அனைத்து விலங்கு பரிசோதனைகளும் சுவிட்சர்லாந்தின் பாசல் நகரத்தின் கால்நடை அலுவலகத்தால் அங்கீகரிக்கப்பட்டன, மேலும் அவை விலங்கு உரிமம் எண். 2474 (செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம் மற்றும் எலியின் மூளையில் சிகிச்சை வேட்பாளர்களின் அளவை அளவிடுவதன் மூலம் செயலில் உள்ள மூளை போக்குவரத்தை மதிப்பீடு செய்தல்) இணங்க செய்யப்பட்டது.
சிஎம் கேனுலாவை கையில் வைத்துக்கொண்டு எலியை மெதுவாக வையுங்கள்.கானுலாவிலிருந்து டதுராவை அகற்றி, 10 µl தன்னிச்சையாக பாயும் செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவத்தை சேகரிக்கவும்.கானுலாவின் காப்புரிமை இறுதியில் சமரசம் செய்யப்பட்டதால், இரத்த மாசு அல்லது நிறமாற்றத்திற்கான எந்த ஆதாரமும் இல்லாத தெளிவான செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவ மாதிரிகள் மட்டுமே இந்த ஆய்வில் சேர்க்கப்பட்டுள்ளன.இணையாக, தோராயமாக 10-20 μl இரத்தம் வால் நுனியில் ஒரு சிறிய கீறலில் இருந்து ஹெப்பரின் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) குழாய்களில் எடுக்கப்பட்டது.CSF மற்றும் இரத்தம் T7 பேஜின் நரம்பு ஊசிக்குப் பிறகு பல்வேறு நேர புள்ளிகளில் சேகரிக்கப்பட்டன.ஒவ்வொரு CSF மாதிரியும் சேகரிக்கப்படுவதற்கு முன்பு தோராயமாக 5-10 μl திரவம் நிராகரிக்கப்பட்டது, இது வடிகுழாயின் இறந்த அளவை ஒத்துள்ளது.
T7Select அமைப்பு கையேட்டில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி T7Select 10-3b வெக்டரைப் பயன்படுத்தி நூலகங்கள் உருவாக்கப்பட்டன (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).சுருக்கமாக, ஒரு சீரற்ற 12-மெர் டிஎன்ஏ செருகல் பின்வரும் வடிவத்தில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது:
NNK கோடான் இரட்டை நிறுத்தக் கோடான்கள் மற்றும் செருகலில் அமினோ அமிலம் அதிகப்படியான அழுத்தத்தைத் தவிர்க்கப் பயன்படுத்தப்பட்டது.N என்பது ஒவ்வொரு நியூக்ளியோடைட்டின் கைமுறையாகக் கலந்த சமநிலை விகிதமாகும், மேலும் K என்பது அடினைன் மற்றும் சைட்டோசின் நியூக்ளியோடைடுகளின் கைமுறையாகக் கலந்த சமநிலை விகிதமாகும்.37 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 3 மணி நேரம் க்ளெனோ பஃபரில் (நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்) டிஎன்டிபி (நோவஜென்) மற்றும் க்ளெனோ என்சைம் (நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்) ஆகியவற்றுடன் மேலும் அடைகாப்பதன் மூலம் ஒற்றை தனிமைப்படுத்தப்பட்ட பகுதிகள் இரட்டை இழை DNAவாக மாற்றப்பட்டன.எதிர்வினைக்குப் பிறகு, EtOH மழைப்பொழிவு மூலம் இரட்டை இழை DNA மீட்கப்பட்டது.இதன் விளைவாக டிஎன்ஏ கட்டுப்பாடு என்சைம்கள் EcoRI மற்றும் HindIII (இரண்டும் Roche இருந்து) செரிக்கப்பட்டது.பிளவுபடுத்தப்பட்ட மற்றும் சுத்திகரிக்கப்பட்ட (QIAquick, Qiagen) செருகல் (T4 லிகேஸ், நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்) பின்னர் 10B கேப்சிட் மரபணுவின் அமினோ அமிலம் 348 க்குப் பிறகு ஒரு முன்-பிளவு செய்யப்பட்ட T7 வெக்டருக்குள் சட்டத்தில் இணைக்கப்பட்டது.விட்ரோ பேக்கேஜிங்கிற்கு முன் 18 மணி நேரத்திற்கு 16° C. வெப்பநிலையில் லிகேஷன் எதிர்வினைகள் அடைகாத்தன.T7Select 10-3b குளோனிங் கிட் (நோவஜென்) உடன் வழங்கப்பட்ட வழிமுறைகளின்படி பேஜ் பேக்கேஜிங் இன் விட்ரோ செய்யப்பட்டது மற்றும் பேக்கேஜிங் கரைசல் எஸ்கெரிச்சியா கோலி (BLT5615, நோவஜென்) ஐப் பயன்படுத்தி லிசிஸ் செய்ய ஒரு முறை பெருக்கப்பட்டது.லைசேட்டுகள் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டு, டைட்ரேட் செய்யப்பட்டு -80° C. வெப்பநிலையில் கிளிசராலின் இருப்புத் தீர்வாக உறைந்தன.
தனியுரிம 454/Roche-amplicon ஃப்யூஷன் ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி குழம்பு அல்லது தட்டில் பெருக்கப்படும் பேஜ் மாறி பகுதிகளின் நேரடி PCR பெருக்கம்.ஃபார்வர்ட் ஃப்யூஷன் ப்ரைமரில் மாறி மண்டலம் (என்என்கே) 12 (வார்ப்புரு-குறிப்பிட்ட), ஜிஎஸ் எஃப்எல்எக்ஸ் டைட்டானியம் அடாப்டர் ஏ மற்றும் நான்கு-அடிப்படை லைப்ரரி கீ சீக்வென்ஸ் (டிசிஏஜி) (துணை படம் 1a) ஆகியவை உள்ளன:
ரிவர்ஸ் ஃப்யூஷன் ப்ரைமரில் மணிகளைப் பிடிக்க இணைக்கப்பட்ட பயோட்டின் மற்றும் குழம்பு PCR இன் போது குளோனல் பெருக்கத்திற்குத் தேவையான GS FLX டைட்டானியம் அடாப்டர் B உள்ளது:
454 ஜிஎஸ்-எஃப்எல்எக்ஸ் டைட்டானியம் நெறிமுறையின்படி ஆம்பிளிகான்கள் 454/ரோச் பைரோசென்சிங்கிற்கு உட்படுத்தப்பட்டன.கையேடு சாங்கர் சீக்வென்சிங்கிற்கு (அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸ் ஹிட்டாச்சி 3730 எக்ஸ்எல் டிஎன்ஏ அனலைசர்), டி7 பேஜ் டிஎன்ஏ பிசிஆர் மூலம் பெருக்கப்பட்டு பின்வரும் ப்ரைமர் ஜோடிகளுடன் வரிசைப்படுத்தப்பட்டது:
ரோச் ஃபாஸ்ட் ஸ்டார்ட் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் கிட் (உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி) பயன்படுத்தி தனிப்பட்ட பிளேக்குகளில் இருந்து செருகல்கள் PCR பெருக்கத்திற்கு உட்படுத்தப்பட்டன.சூடான தொடக்கம் (95 °C இல் 10 நிமிடம்) மற்றும் 35 பூஸ்ட் சுழற்சிகள் (95 °C இல் 50 வி, 50 °C இல் 1 நிமிடம் மற்றும் 72 °C இல் 1 நிமிடம்) செய்யவும்.
நூலகங்களில் இருந்து பேஜ், காட்டு வகை பேஜ், CSF மற்றும் இரத்தத்தில் இருந்து மீட்கப்பட்ட பேஜ் அல்லது தனிப்பட்ட குளோன்கள் Escherichia coli BL5615 இல் TB குழம்பில் (சிக்மா ஆல்ட்ரிச்) அல்லது 500 cm2 உணவுகளில் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்) 4 மணிநேரத்திற்கு 37 ° C இல் பெருக்கப்பட்டது.டிரிஸ்-இடிடிஏ பஃபர் (ஃப்ளூகா அனலிட்டிகல்) மூலம் தகடுகளை துவைப்பதன் மூலம் அல்லது மலட்டு பைப்பெட் குறிப்புகள் மூலம் பிளேக்குகளை சேகரிப்பதன் மூலம் தகடுகளில் இருந்து பேஜ் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது.ஒரு சுற்று பாலிஎதிலீன் கிளைகோல் (PEG 8000) மழைப்பொழிவு (ப்ரோமேகா) மூலம் கலாச்சார சூப்பர்நேட்டன்ட் அல்லது பிரித்தெடுத்தல் இடையகத்திலிருந்து பேஜ் தனிமைப்படுத்தப்பட்டது மற்றும் டிரிஸ்-இடிடிஏ பஃப்பரில் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டது.
பெருக்கப்பட்ட பேஜ், நரம்புவழி (IV) ஊசி (500 μl/விலங்கு) க்கு முன் எண்டோடாக்சின் அகற்றும் மணிகளை (Miltenyi Biotec) பயன்படுத்தி 2-3 சுற்று எண்டோடாக்சின் அகற்றலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டது.முதல் சுற்றில், 2×1012 பேஜ்கள் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டன;இரண்டாவது, 2×1010 பேஜ்கள்;மூன்றாவது மற்றும் நான்காவது தேர்வு சுற்றுகளில், ஒரு விலங்குக்கு 2×109 பேஜ்கள்.CSF இல் உள்ள பேஜ் உள்ளடக்கம் மற்றும் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட நேர புள்ளிகளில் சேகரிக்கப்பட்ட இரத்த மாதிரிகள் உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி பிளேக் எண்ணிக்கையால் தீர்மானிக்கப்பட்டது (T7Select அமைப்பு கையேடு).வால் நரம்புக்குள் சுத்திகரிக்கப்பட்ட நூலகங்களை நரம்பு வழியாக செலுத்துவதன் மூலம் அல்லது முந்தைய தேர்வு சுற்றில் இருந்து CSF இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட பேஜை மீண்டும் செலுத்துவதன் மூலம் பேஜ் தேர்வு செய்யப்பட்டது, மேலும் அடுத்தடுத்த அறுவடைகள் முறையே 10 நிமிடம், 30 நிமிடம், 60 நிமிடம், 90 நிமிடம், 120 நிமிடம், CSF மற்றும் இரத்த மாதிரி முறையே 18040 நிமிடம்.மொத்தம் நான்கு சுற்றுகள் in vivo panning நடத்தப்பட்டது, இதில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட இரண்டு கிளைகளும் தனித்தனியாக சேமிக்கப்பட்டு முதல் மூன்று சுற்று தேர்வின் போது பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.தேர்வின் முதல் இரண்டு சுற்றுகளிலிருந்து CSF இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட அனைத்து பேஜ் செருகல்களும் 454/ரோச் பைரோசென்சிங்கிற்கு உட்படுத்தப்பட்டன, அதே நேரத்தில் CSF இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட அனைத்து குளோன்களும் கைமுறையாக வரிசைப்படுத்தப்பட்டன.முதல் சுற்று தேர்விலிருந்து அனைத்து இரத்த பேஜ்களும் 454/ரோச் பைரோசென்சிங்கிற்கு உட்படுத்தப்பட்டன.பேஜ் குளோன்களை உட்செலுத்துவதற்காக, தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பேஜ்கள் E. coli (BL5615) இல் 500 செ.மீ 2 தகடுகளில் 37 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 4 மணி நேரம் பெருக்கப்பட்டது.காசநோய் ஊடகத்தில் தனித்தனியாக தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட மற்றும் கைமுறையாக வரிசைப்படுத்தப்பட்ட குளோன்கள் பரப்பப்பட்டன.பேஜ் பிரித்தெடுத்தல், சுத்திகரிப்பு மற்றும் எண்டோடாக்சின் அகற்றுதல் (மேலே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி), 300 μl இல் உள்ள 2×1010 பேஜ்கள்/விலங்குகள் ஒரு வால் நரம்புக்குள் நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டன.
வரிசை தரவுகளின் முன் செயலாக்கம் மற்றும் தரமான வடிகட்டுதல்.ரா 454/ரோச் தரவு பைனரி நிலையான ஸ்ட்ரீம் வரைபட வடிவமைப்பிலிருந்து (sff) விற்பனையாளர் மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி பியர்சன் மனிதனால் படிக்கக்கூடிய வடிவமாக (ஃபாஸ்டா) மாற்றப்பட்டது.நியூக்ளியோடைடு வரிசையின் மேலும் செயலாக்கமானது கீழே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி தனியுரிம C நிரல்கள் மற்றும் ஸ்கிரிப்ட்களை (வெளியிடப்படாத மென்பொருள் தொகுப்பு) பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டது.முதன்மை தரவுகளின் பகுப்பாய்வு கடுமையான பல-நிலை வடிகட்டுதல் நடைமுறைகளை உள்ளடக்கியது.செல்லுபடியாகும் 12மெர் இன்செர்ட் டிஎன்ஏ சீக்வென்ஸ் இல்லாத ரீட்களை வடிகட்ட, ரீட்கள் ஸ்டார்ட் லேபிள் (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), ஸ்டாப் லேபிள் (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) மற்றும் பின்புலச் செருகல் (CCCTGCAGGGATATCGGGLEM ஐப் பயன்படுத்தி உலகளாவிய சோதனை)ஒரு சீரமைப்புக்கு 2 முரண்பாடுகள் வரை அனுமதிக்கும் சீரமைப்பு31.எனவே, தொடக்க மற்றும் நிறுத்த குறிச்சொற்கள் இல்லாத வாசிப்புகள் மற்றும் பின்னணி செருகல்களைக் கொண்ட ரீட்கள், அதாவது, அனுமதிக்கப்பட்ட பொருந்தாத எண்ணிக்கையை மீறும் சீரமைப்புகள், நூலகத்திலிருந்து அகற்றப்பட்டன.மீதமுள்ள வாசிப்புகளைப் பொறுத்தவரை, N-mer DNA வரிசை தொடக்கக் குறியிலிருந்து நீண்டு, நிறுத்தக் குறிக்கு முன் முடிவடையும் அசல் வாசிப்பு வரிசையிலிருந்து நீக்கப்பட்டு மேலும் செயலாக்கப்பட்டது (இனி "செருகு" என குறிப்பிடப்படுகிறது).செருகலின் மொழிபெயர்ப்பிற்குப் பிறகு, ப்ரைமரின் 5′ முடிவில் உள்ள முதல் நிறுத்தக் கோடனுக்குப் பிறகு உள்ள பகுதி செருகலில் இருந்து அகற்றப்படும்.கூடுதலாக, ப்ரைமரின் 3′ முடிவில் முழுமையற்ற கோடான்களுக்கு வழிவகுக்கும் நியூக்ளியோடைடுகளும் அகற்றப்பட்டன.பின்னணி வரிசைகளை மட்டுமே கொண்ட செருகல்களை விலக்க, "PAG" என்ற அமினோ அமில வடிவத்துடன் தொடங்கும் மொழிபெயர்க்கப்பட்ட செருகல்களும் அகற்றப்பட்டன.3 அமினோ அமிலங்களுக்கும் குறைவான மொழிபெயர்ப்பின் நீளம் கொண்ட பெப்டைடுகள் நூலகத்திலிருந்து அகற்றப்பட்டன.இறுதியாக, செருகும் குளத்தில் உள்ள பணிநீக்கத்தை அகற்றி, ஒவ்வொரு தனிப்பட்ட செருகலின் அதிர்வெண்ணையும் தீர்மானிக்கவும்.இந்த பகுப்பாய்வின் முடிவுகளில் நியூக்ளியோடைடு வரிசைகளின் பட்டியல் (செருகுகள்) மற்றும் அவற்றின் (படிக்க) அதிர்வெண்கள் (துணை புள்ளிவிவரங்கள் 1c மற்றும் 2) ஆகியவை அடங்கும்.
வரிசை ஒற்றுமை மூலம் குழு N-mer டிஎன்ஏ செருகல்கள்: 454/ரோச்-குறிப்பிட்ட வரிசைமுறை பிழைகளை (ஹோமோபாலிமர் நீட்டிப்புகளை வரிசைப்படுத்துவதில் உள்ள சிக்கல்கள் போன்றவை) மற்றும் குறைவான முக்கிய பணிநீக்கங்களை அகற்ற, முன்பு வடிகட்டப்பட்ட N-mer DNA வரிசை செருகல்கள் (செருகுகள்) ஒற்றுமையால் வரிசைப்படுத்தப்படுகின்றன.பின்வருபவையாக வரையறுக்கப்பட்ட ஒரு செயல்பாட்டு வழிமுறையைப் பயன்படுத்தி செருகல்கள் (2 பொருந்தாத அடிப்படைகள் வரை அனுமதிக்கப்படுகின்றன): செருகல்கள் முதலில் அவற்றின் அதிர்வெண் (அதிகமானது முதல் குறைந்தது) மற்றும் ஒரே மாதிரியாக இருந்தால், அவற்றின் இரண்டாம் நிலை நீளம் (நீண்டது முதல் குறுகியது) மூலம் வரிசைப்படுத்தப்படும்.எனவே, மிகவும் அடிக்கடி மற்றும் நீண்ட செருகல்கள் முதல் "குழுவை" வரையறுக்கின்றன.குழு அதிர்வெண் முக்கிய அலைவரிசைக்கு அமைக்கப்பட்டுள்ளது.பின்னர், வரிசைப்படுத்தப்பட்ட பட்டியலில் மீதமுள்ள ஒவ்வொரு செருகும் ஜோடிவரிசை நீடில்மேன்-வுன்ச் சீரமைப்பு மூலம் குழுவில் சேர்க்க முயற்சிக்கப்பட்டது.ஒரு சீரமைப்பில் பொருந்தாத, செருகல்கள் அல்லது நீக்குதல்களின் எண்ணிக்கை 2 வரம்பை மீறவில்லை என்றால், குழுவில் ஒரு செருகல் சேர்க்கப்படும், மேலும் மொத்த குழு அதிர்வெண் எவ்வளவு அடிக்கடி செருகப்பட்டது என்பதைப் பொறுத்து அதிகரிக்கப்படும்.ஒரு குழுவில் சேர்க்கப்பட்ட செருகல்கள் பயன்படுத்தப்பட்டதாகக் குறிக்கப்பட்டு மேலும் செயலாக்கத்திலிருந்து விலக்கப்படும்.ஏற்கனவே உள்ள குழுவில் செருகும் வரிசையைச் சேர்க்க முடியாவிட்டால், பொருத்தமான செருகும் அதிர்வெண்ணுடன் ஒரு புதிய குழுவை உருவாக்க செருகு வரிசை பயன்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் பயன்படுத்தப்பட்டதாகக் குறிக்கப்படும்.ஒவ்வொரு செருகும் வரிசையும் ஒரு புதிய குழுவை உருவாக்க பயன்படுத்தப்படும்போது அல்லது ஏற்கனவே இருக்கும் குழுவில் சேர்க்கப்படும்போது மறு செய்கை முடிவடைகிறது.எல்லாவற்றிற்கும் மேலாக, நியூக்ளியோடைடுகளைக் கொண்ட குழுப்படுத்தப்பட்ட செருகல்கள் இறுதியில் பெப்டைட் வரிசைகளாக (பெப்டைட் நூலகங்கள்) மொழிபெயர்க்கப்படுகின்றன.இந்த பகுப்பாய்வின் விளைவாக, தொடர்ச்சியான வாசிப்புகளின் எண்ணிக்கையை உருவாக்கும் செருகல்கள் மற்றும் அவற்றின் தொடர்புடைய அதிர்வெண்களின் தொகுப்பாகும் (துணை படம். 2).
மையக்கரு உருவாக்கம்: தனித்துவமான பெப்டைட்களின் பட்டியலின் அடிப்படையில், கீழே காட்டப்பட்டுள்ளபடி சாத்தியமான அனைத்து அமினோ அமில வடிவங்களையும் (aa) கொண்ட ஒரு நூலகம் உருவாக்கப்பட்டது.3 நீளத்தின் சாத்தியமான ஒவ்வொரு வடிவமும் பெப்டைடில் இருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்டது மற்றும் அதன் தலைகீழ் வடிவமானது அனைத்து வடிவங்களையும் (டிரிபெப்டைடுகள்) கொண்ட பொதுவான மையக்கரு நூலகத்துடன் சேர்க்கப்பட்டது.மிகவும் மீண்டும் மீண்டும் நிகழும் மையக்கருத்துகளின் நூலகங்கள் வரிசைப்படுத்தப்பட்டு பணிநீக்கம் நீக்கப்பட்டது.பின்னர், மையக்கரு நூலகத்தில் உள்ள ஒவ்வொரு டிரிபெப்டைடிற்கும், கணக்கீட்டு கருவிகளைப் பயன்படுத்தி நூலகத்தில் அதன் இருப்பை நாங்கள் சோதித்தோம்.இந்த வழக்கில், கண்டுபிடிக்கப்பட்ட மையக்கருத்து டிரிபெப்டைடைக் கொண்ட பெப்டைட்டின் அதிர்வெண் சேர்க்கப்பட்டு, மையக்கருத்து நூலகத்தில் உள்ள மையக்கருத்திற்கு ("மோடிஃப்களின் எண்ணிக்கை") ஒதுக்கப்படுகிறது.மையக்கரு உருவாக்கத்தின் விளைவாக, டிரிபெப்டைடுகள் (மோடிஃப்கள்) மற்றும் அவற்றின் மதிப்புகள் ஆகியவற்றின் அனைத்து நிகழ்வுகளையும் கொண்ட இரு பரிமாண வரிசை ஆகும், அவை ரீட்கள் வடிகட்டப்பட்டு, குழுவாக மற்றும் மொழிபெயர்க்கப்படும் போது தொடர்புடைய மையக்கருத்தை விளைவிக்கும் வரிசைமுறை வாசிப்புகளின் எண்ணிக்கையாகும்.மேலே விரிவாக விவரிக்கப்பட்டுள்ள அளவீடுகள்.
மையக்கருத்துகளின் எண்ணிக்கை மற்றும் தொடர்புடைய சிதறல்களின் எண்ணிக்கையை இயல்பாக்குதல்: ஒவ்வொரு மாதிரியின் மையக்கருத்துகளின் எண்ணிக்கையைப் பயன்படுத்தி இயல்பாக்கப்பட்டது
இங்கு ni என்பது தலைப்பு i உள்ள வாசிப்புகளின் எண்ணிக்கை.எனவே, vi என்பது மாதிரியில் உள்ள மையக்கருத்தைக் கொண்ட வாசிப்புகளின் (அல்லது பெப்டைடுகள்) சதவீத அதிர்வெண்ணைக் குறிக்கிறது.ஃபிஷரின் துல்லியமான சோதனையைப் பயன்படுத்தி, சாதாரணமாக்கப்படாத எண்ணிக்கையிலான மையக்கருத்துகளுக்கான பி-மதிப்புகள் கணக்கிடப்பட்டன.உள்நோக்கங்களின் எண்ணிக்கையின் இணை வரைபடங்களைப் பொறுத்தவரை, R உடன் இயல்பான நோக்கங்களின் எண்ணிக்கையைப் பயன்படுத்தி ஸ்பியர்மேனின் தொடர்புகள் கணக்கிடப்பட்டன.
பெப்டைட் லைப்ரரியில் ஒவ்வொரு நிலையிலும் அமினோ அமிலங்களின் உள்ளடக்கத்தைக் காட்சிப்படுத்த, வலை லோகோகிராம்கள் 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) உருவாக்கப்பட்டன.முதலில், 12-மெர் பெப்டைட்டின் ஒவ்வொரு நிலையிலும் உள்ள அமினோ அமிலங்களின் உள்ளடக்கம் 20×12 மேட்ரிக்ஸில் சேமிக்கப்படுகிறது.பின்னர், ஒவ்வொரு நிலையிலும் ஒரே மாதிரியான அமினோ அமில உள்ளடக்கம் கொண்ட 1000 பெப்டைட்களின் தொகுப்பு வேகமாக-வரிசை வடிவத்தில் உருவாக்கப்படுகிறது மற்றும் வலை-லோகோ 3 க்கு உள்ளீடாக வழங்கப்படுகிறது, இது ஒவ்வொரு நிலையிலும் தொடர்புடைய அமினோ அமில உள்ளடக்கத்தின் வரைகலை பிரதிநிதித்துவத்தை உருவாக்குகிறது.கொடுக்கப்பட்ட பெப்டைட் நூலகத்திற்கு.பல பரிமாண தரவுத்தொகுப்புகளைக் காட்சிப்படுத்த, R இல் உள்ளகமாக உருவாக்கப்பட்ட கருவியைப் பயன்படுத்தி வெப்ப வரைபடங்கள் உருவாக்கப்பட்டன (biosHeatmap, இன்னும் வெளியிடப்படாத R தொகுப்பு).வெப்ப வரைபடங்களில் வழங்கப்பட்ட டென்ட்ரோகிராம்கள் யூக்ளிடியன் தூர அளவீடு மூலம் வார்டின் படிநிலை கிளஸ்டரிங் முறையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது.மோட்டிஃப் ஸ்கோரிங் தரவின் புள்ளியியல் பகுப்பாய்விற்கு, ஃபிஷரின் சரியான சோதனையைப் பயன்படுத்தி இயல்பற்ற மதிப்பெண்களுக்கான P மதிப்புகள் கணக்கிடப்பட்டன.பிற தரவுத்தொகுப்புகளுக்கான பி-மதிப்புகள் மாணவர்களின் டி-டெஸ்ட் அல்லது ANOVA ஐப் பயன்படுத்தி R இல் கணக்கிடப்பட்டன.
தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பேஜ் குளோன்கள் மற்றும் செருகல்கள் இல்லாத பேஜ்கள் வால் நரம்பு வழியாக நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டன (300 μl PBS இல் 2×1010 பேஜ்கள்/விலங்கு).100 μl DyLight594-லேபிளிடப்பட்ட லெக்டின் (Vector Laboratories Inc., DL-1177) மூலம் அதே விலங்குகளுக்கு 100 μl ஊடுருவிச் செலுத்தப்பட்டது.பேஜ் உட்செலுத்தப்பட்ட 60 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு, எலிகள் 50 மில்லி பிபிஎஸ் மற்றும் 50 மிலி 4% பிஎஃப்ஏ/பிபிஎஸ் மூலம் இதயத்தின் வழியாக ஊடுருவப்பட்டன.மூளை மாதிரிகள் கூடுதலாக 4% PFA/PBS இல் ஒரே இரவில் சரி செய்யப்பட்டு 30% சுக்ரோஸில் ஒரே இரவில் 4 ° C இல் ஊறவைக்கப்பட்டது.OCT கலவையில் மாதிரிகள் ஃபிளாஷ் உறைந்திருக்கும்.உறைந்த மாதிரிகளின் இம்யூனோஹிஸ்டோகெமிக்கல் பகுப்பாய்வு அறை வெப்பநிலையில் 1% BSA உடன் தடுக்கப்பட்ட 30 µm கிரையோசெக்ஷன்களில் செய்யப்பட்டது மற்றும் 4 °C வெப்பநிலையில் T7 பேஜ் (Novus NB 600-376A) க்கு எதிராக பாலிகுளோனல் FITC-லேபிளிடப்பட்ட ஆன்டிபாடிகளுடன் அடைகாக்கப்பட்டது.ஒரே இரவில் அடைகாக்கவும்.இறுதியாக, பிரிவுகள் பிபிஎஸ் மூலம் 3 முறை கழுவப்பட்டு, கன்ஃபோகல் லேசர் நுண்ணோக்கி (லைக்கா டிசிஎஸ் எஸ்பி 5) மூலம் ஆய்வு செய்யப்பட்டன.
98% குறைந்தபட்ச தூய்மை கொண்ட அனைத்து பெப்டைட்களும் ஜென்ஸ்கிரிப்ட் USA ஆல் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டு, பயோடைனிலேட்டட் மற்றும் லியோபிலைஸ் செய்யப்பட்டன.பயோட்டின் என்-டெர்மினஸில் கூடுதல் டிரிபிள் கிளைசின் ஸ்பேசர் வழியாக பிணைக்கப்பட்டுள்ளது.மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரியைப் பயன்படுத்தி அனைத்து பெப்டைட்களையும் சரிபார்க்கவும்.
ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் (சிக்மா S0677) பயோடைனிலேட்டட் பெப்டைட், பயோடைனிலேட்டட் BACE1 இன்ஹிபிட்டரி பெப்டைட் அல்லது பயோடைனிலேட்டட் BACE1 இன்ஹிபிட்டரி பெப்டைட் மற்றும் BACE1 இன்ஹிபிட்டரி பெப்டைட் மற்றும் BACE1 இன்ஹிபிட்டரி பெப்டைட் 5.00-10% பெப்டின்சிபி.ஊசி போடுவதற்கு முன் அறை வெப்பநிலையில் 1 மணிநேரம்.ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-இணைந்த பெப்டைடுகள் 10 மி.கி./கி.கி என்ற அளவில் பெருமூளை குழி உள்ள எலிகளின் வால் நரம்புகளில் ஒன்றில் நரம்பு வழியாக செலுத்தப்பட்டது.
ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-பெப்டைட் வளாகங்களின் செறிவு ELISA ஆல் மதிப்பிடப்பட்டது.Nunc Maxisorp microtiter தகடுகள் (சிக்மா) 1.5 μg/ml மவுஸ் எதிர்ப்பு ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் ஆன்டிபாடி (தெர்மோ, MA1-20011) உடன் 4 ° C இல் ஒரே இரவில் பூசப்பட்டது.அறை வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் தடுத்த பிறகு (தடுப்பு இடையகம்: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ஜெலட்டின், 1% BSA), தட்டை 0.05% Tween-20/PBS (வாஷ் பஃபர்) கொண்டு துவைக்கவும். ma 1:10,000, CSF 1:115).கண்டறிதல் ஆன்டிபாடியுடன் (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) தகடு ஒரே இரவில் 4 ° C வெப்பநிலையில் அடைக்கப்பட்டது.மூன்று கழுவுதல் படிகளுக்குப் பிறகு, ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் TMB அடி மூலக்கூறு கரைசலில் (ரோச்) 20 நிமிடம் வரை அடைகாப்பதன் மூலம் கண்டறியப்பட்டது.1M H2SO4 உடன் வண்ண வளர்ச்சியை நிறுத்திய பிறகு, உறிஞ்சுதலை 450 nm இல் அளவிடவும்.
ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-பெப்டைட்-BACE1 இன்ஹிபிட்டர் வளாகத்தின் செயல்பாடு Aβ(1-40) ELISA ஆல் உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி (வாகோ, 294-64701) மதிப்பிடப்பட்டது.சுருக்கமாக, CSF மாதிரிகள் நிலையான நீர்த்தத்தில் (1:23) நீர்த்தப்பட்டு, BNT77 பிடிப்பு ஆன்டிபாடியுடன் பூசப்பட்ட 96-கிணறு தட்டுகளில் ஒரே இரவில் 4 ° C வெப்பநிலையில் அடைகாத்தன.ஐந்து சலவை படிகளுக்குப் பிறகு, HRP-இணைந்த BA27 ஆன்டிபாடி சேர்க்கப்பட்டு 2 மணிநேரம் 4 ° C இல் அடைகாக்கப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து ஐந்து சலவை படிகள்.அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு TMB கரைசலில் அடைகாப்பதன் மூலம் Aβ(1–40) கண்டறியப்பட்டது.ஸ்டாப் கரைசலுடன் வண்ண வளர்ச்சி நிறுத்தப்பட்ட பிறகு, உறிஞ்சுதலை 450 nm இல் அளவிடவும்.Aβ(1–40) ELISA க்கு முன் பிளாஸ்மா மாதிரிகள் திட கட்ட பிரித்தலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டன.பிளாஸ்மா 96-கிணறு தட்டுகளில் 0.2% DEA (சிக்மா) இல் சேர்க்கப்பட்டு அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டது.SPE தகடுகளை (ஓயாசிஸ், 186000679) தண்ணீர் மற்றும் 100% மெத்தனால் மூலம் கழுவிய பிறகு, பிளாஸ்மா மாதிரிகள் SPE தட்டுகளில் சேர்க்கப்பட்டு அனைத்து திரவங்களும் அகற்றப்பட்டன.மாதிரிகள் கழுவப்பட்டன (முதலில் 5% மெத்தனால் பின்னர் 30% மெத்தனால்) மற்றும் 2% NH4OH/90% மெத்தனால் மூலம் நீக்கப்பட்டது.நிலையான N2 மின்னோட்டத்தில் 99 நிமிடங்களுக்கு 55 ° C இல் எலுவேட்டை உலர்த்திய பிறகு, மாதிரிகள் நிலையான நீர்த்தங்களில் குறைக்கப்பட்டன மற்றும் மேலே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி Aβ (1-40) அளவிடப்பட்டது.
இந்தக் கட்டுரையை எப்படி மேற்கோள் காட்டுவது: யூரிச், ஈ. மற்றும் பலர்.விவோவில் அடையாளம் காணப்பட்ட டிரான்சிட் பெப்டைட்களைப் பயன்படுத்தி மூளைக்கு சரக்கு விநியோகம்.அறிவியல்.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB மற்றும் Moos T. இலக்கு சிகிச்சையைப் பயன்படுத்தி மூளைக்கு மேக்ரோமாலிகுலர் மருந்துகளை வழங்குதல்.நியூரோ கெமிஸ்ட்ரி ஜர்னல் 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., மற்றும் Martinez-Martinez, P. பெப்டைட் மற்றும் புரோட்டீன் மருந்துகளை இரத்த-மூளை தடை முழுவதும் விநியோகித்தல்.புரோக் நியூரோபயோல் 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
பார்ட்ரிட்ஜ், WM இரத்த-மூளை தடை: மூளை மருந்து வளர்ச்சியில் ஒரு இடையூறு.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
ஜோஹன்சன், கேஇ, டங்கன், ஜேஏ, ஸ்டோபா, இஜி, மற்றும் பைர்ட், ஏ. மேம்படுத்தப்பட்ட மருந்து விநியோகத்திற்கான வாய்ப்புகள் மற்றும் கொரோயிட் பிளெக்ஸஸ்-சிஎஸ்எஃப் பாதை வழியாக மூளைக்கு இலக்கு.மருந்து ஆராய்ச்சி 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
பார்ட்ரிட்ஜ், WM மூளை பிரசவத்திற்காக மூலக்கூறு ட்ரோஜன் ஹார்ஸுடன் உயிரி மருந்துகளின் நவீனமயமாக்கல்.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
பார்ட்ரிட்ஜ், இரத்த-மூளை தடை முழுவதும் WM ஏற்பி-மத்தியஸ்த பெப்டைட் போக்குவரத்து.எண்டோக்ர் ரெவ். 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.மோனோவலன்ட் மாலிகுலர் ஷட்டில்களைப் பயன்படுத்தி மூளை ஊடுருவல் மற்றும் சிகிச்சை ஆன்டிபாடிகளின் செயல்திறனை அதிகரிக்கவும்.நியூரான் 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
பைன்-லீ, என். மற்றும் பலர்.டிரான்ஸ்ஃபெரின் ஏற்பி (TfR) போக்குவரத்து TfR ஆன்டிபாடிகளின் தொடர்பு மாறுபாடுகளின் மூளை வளர்ச்சியைத் தீர்மானிக்கிறது.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).