Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவி பதிப்பில் குறைந்த CSS ஆதரவு உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்). இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்ய, ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் தளத்தை ரெண்டர் செய்வோம்.
திரவ உயிரியல் பரிசோதனை (LB) என்பது உயிரி மருத்துவத் துறையில் வேகமாகப் பிரபலமடைந்து வரும் ஒரு கருத்தாகும். இந்த கருத்து முக்கியமாக பல்வேறு திசுக்களில் செல் இறப்புக்குப் பிறகு சிறிய துண்டுகளாக வெளியிடப்படும் சுற்றும் புற-செல்லுலார் DNA (ccfDNA) துண்டுகளைக் கண்டறிவதை அடிப்படையாகக் கொண்டது. இந்த துண்டுகளில் ஒரு சிறிய விகிதம் வெளிநாட்டு (வெளிநாட்டு) திசுக்கள் அல்லது உயிரினங்களிலிருந்து உருவாகிறது. தற்போதைய வேலையில், அதிக கடல் நீர் வடிகட்டுதல் திறனுக்கு பெயர் பெற்ற ஒரு காவலாளி இனமான மஸ்ஸல்களுக்கு இந்த கருத்தை நாங்கள் பயன்படுத்தியுள்ளோம். கடல் கடலோர சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளின் பல்லுயிர் பற்றிய தகவல்களை வழங்க பல்வேறு மூலங்களிலிருந்து சுற்றுச்சூழல் DNA துண்டுகளைப் பிடிக்க இயற்கை வடிகட்டிகளாக செயல்படும் மஸ்ஸல்களின் திறனை நாங்கள் பயன்படுத்துகிறோம். மஸ்ஸல் ஹீமோலிம்பில் 1 முதல் 5 kb வரை அளவில் பெரிதும் மாறுபடும் DNA துண்டுகள் உள்ளன என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன. ஷாட்கன் வரிசைமுறை அதிக எண்ணிக்கையிலான DNA துண்டுகள் வெளிநாட்டு நுண்ணுயிர் தோற்றம் கொண்டவை என்பதைக் காட்டியது. அவற்றில், பாக்டீரியா, ஆர்க்கியா மற்றும் வைரஸ்களிலிருந்து DNA துண்டுகளைக் கண்டறிந்தோம், இதில் கடலோர கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் பொதுவாகக் காணப்படும் பல்வேறு ஹோஸ்ட்களைப் பாதிக்கும் வைரஸ்கள் அடங்கும். முடிவில், கடல்சார் கடலோர சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் நுண்ணுயிர் பன்முகத்தன்மை பற்றிய அறிவின் வளமான ஆனால் இன்னும் ஆராயப்படாத மூலத்தை மஸல்களுக்குப் பயன்படுத்தப்படும் LB என்ற கருத்து பிரதிபலிக்கிறது என்பதை எங்கள் ஆய்வு நிரூபிக்கிறது.
கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளின் பல்லுயிர் பெருக்கத்தில் காலநிலை மாற்றத்தின் தாக்கம் (CC) வேகமாக வளர்ந்து வரும் ஆராய்ச்சிப் பகுதியாகும். புவி வெப்பமடைதல் முக்கியமான உடலியல் அழுத்தங்களை ஏற்படுத்துவதோடு மட்டுமல்லாமல், கடல் உயிரினங்களின் வெப்ப நிலைத்தன்மையின் பரிணாம வரம்புகளையும் தள்ளுகிறது, இது பல உயிரினங்களின் வாழ்விடத்தை பாதிக்கிறது, மேலும் அவை மிகவும் சாதகமான நிலைமைகளைத் தேடத் தூண்டுகிறது [1, 2]. மெட்டாசோவான்களின் பல்லுயிர் பெருக்கத்தை பாதிப்பதோடு மட்டுமல்லாமல், CC ஹோஸ்ட்-நுண்ணுயிர் தொடர்புகளின் நுட்பமான சமநிலையை சீர்குலைக்கிறது. இந்த நுண்ணுயிர் டிஸ்பாக்டீரியோசிஸ் கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளுக்கு கடுமையான அச்சுறுத்தலை ஏற்படுத்துகிறது, ஏனெனில் இது கடல் உயிரினங்களை தொற்று நோய்க்கிருமிகளுக்கு அதிக வாய்ப்புள்ளதாக ஆக்குகிறது [3, 4]. வெகுஜன இறப்புகளில் SS முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது என்று நம்பப்படுகிறது, இது உலகளாவிய கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளின் மேலாண்மைக்கு ஒரு கடுமையான பிரச்சனையாகும் [5, 6]. பல கடல் உயிரினங்களின் பொருளாதார, சுற்றுச்சூழல் மற்றும் ஊட்டச்சத்து தாக்கங்களைக் கருத்தில் கொண்டு இது ஒரு முக்கியமான பிரச்சினை. CK இன் விளைவுகள் மிகவும் உடனடி மற்றும் கடுமையானதாக இருக்கும் துருவப் பகுதிகளில் வாழும் இருவால்வுகளுக்கு இது குறிப்பாக உண்மை [6, 7]. உண்மையில், மைட்டிலஸ் spp போன்ற இருவால்வுகள். கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் CC இன் விளைவுகளை கண்காணிக்க பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. ஆச்சரியப்படுவதற்கில்லை, அவற்றின் ஆரோக்கியத்தைக் கண்காணிக்க ஒப்பீட்டளவில் அதிக எண்ணிக்கையிலான பயோமார்க்ஸர்கள் உருவாக்கப்பட்டுள்ளன, பெரும்பாலும் நொதி செயல்பாடு அல்லது செல் நம்பகத்தன்மை மற்றும் பாகோசைடிக் செயல்பாடு போன்ற செல்லுலார் செயல்பாடுகளை அடிப்படையாகக் கொண்ட செயல்பாட்டு பயோமார்க்ஸர்களை உள்ளடக்கிய இரண்டு-நிலை அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்துகின்றன [8]. அதிக அளவு கடல் நீரை உறிஞ்சிய பிறகு மென்மையான திசுக்களில் குவிக்கும் குறிப்பிட்ட அழுத்த குறிகாட்டிகளின் செறிவை அளவிடுவதும் இந்த முறைகளில் அடங்கும். இருப்பினும், இருவால்வுகளின் அதிக வடிகட்டுதல் திறன் மற்றும் அரை-திறந்த சுற்றோட்ட அமைப்பு, நோயாளி மேலாண்மைக்கான எளிய மற்றும் குறைந்தபட்ச ஊடுருவும் அணுகுமுறையான திரவ பயாப்ஸி (LB) என்ற கருத்தைப் பயன்படுத்தி புதிய ஹீமோலிம்ப் பயோமார்க்ஸர்களை உருவாக்க ஒரு வாய்ப்பை வழங்குகிறது. இரத்த மாதிரிகள் [9, 10]. மனித LB இல் பல வகையான சுற்றும் மூலக்கூறுகளைக் காண முடிந்தாலும், இந்த கருத்து முதன்மையாக பிளாஸ்மாவில் சுற்றும் புற-செல்லுலார் DNA (ccfDNA) துண்டுகளின் DNA வரிசைமுறை பகுப்பாய்வை அடிப்படையாகக் கொண்டது. உண்மையில், மனித பிளாஸ்மாவில் சுற்றும் டிஎன்ஏ இருப்பது 20 ஆம் நூற்றாண்டின் நடுப்பகுதியில் இருந்து அறியப்படுகிறது [11], ஆனால் சமீபத்திய ஆண்டுகளில்தான் உயர்-செயல்திறன் வரிசைமுறை முறைகளின் வருகை ccfDNA அடிப்படையிலான மருத்துவ நோயறிதலுக்கு வழிவகுத்தது. இந்த சுற்றும் டிஎன்ஏ துண்டுகளின் இருப்பு, செல் இறப்புக்குப் பிறகு மரபணு டிஎன்ஏ (அணு மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல்) செயலற்ற வெளியீட்டின் ஒரு பகுதியாகும். ஆரோக்கியமான நபர்களில், ccfDNA இன் செறிவு பொதுவாக குறைவாக இருக்கும் (<10 ng/mL) ஆனால் பல்வேறு நோய்க்குறியீடுகளால் பாதிக்கப்பட்ட அல்லது மன அழுத்தத்திற்கு ஆளான நோயாளிகளில் 5-10 மடங்கு அதிகரிக்கலாம், இதன் விளைவாக திசு சேதம் ஏற்படும். ஆரோக்கியமான நபர்களில், ccfDNA இன் செறிவு பொதுவாக குறைவாக இருக்கும் (<10 ng/mL) ஆனால் பல்வேறு நோய்க்குறியீடுகளால் பாதிக்கப்பட்ட அல்லது மன அழுத்தத்திற்கு ஆளான நோயாளிகளில் 5-10 மடங்கு அதிகரிக்கலாம், இதன் விளைவாக திசு சேதம் ஏற்படும். У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5-10 в 5-10 ராஸ்லிச்னோய் படோலாஜி அல்லது போட்வெர்கயுஷியா ஸ்ட்ரெஸ்ஸு, பிரைவோட்யாஷெமு கே பொவ்ரேஜ்டெனியு டகானே. ஆரோக்கியமான மக்களில், cccDNA இன் செறிவு பொதுவாக குறைவாக இருக்கும் (<10 ng/mL), ஆனால் பல்வேறு நோய்க்குறியியல் உள்ள நோயாளிகளில் அல்லது திசு சேதத்திற்கு வழிவகுக்கும் மன அழுத்தத்தில் உள்ள நோயாளிகளில் இது 5-10 மடங்கு அதிகரிக்கும்.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）,但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织在 健康 个体 中 , ccfdna எடுத்துக்காட்டாக损伤கோன்சென்ட்ராசி ccfDNA நெறிமுறைகள் (<10 ng/ml) ராஸ்லிச்னிமி படோலோஜியாமி அல்லது ஸ்ட்ரெஸ்ஸோம் ஆரோக்கியமான நபர்களில் ccfDNA செறிவுகள் பொதுவாக குறைவாகவே இருக்கும் (<10 ng/ml), ஆனால் பல்வேறு நோய்க்குறியியல் அல்லது மன அழுத்தம் உள்ள நோயாளிகளில் 5-10 மடங்கு அதிகரிக்கலாம், இதன் விளைவாக திசு சேதம் ஏற்படும்.ccfDNA துண்டுகளின் அளவு பரவலாக வேறுபடுகிறது, ஆனால் பொதுவாக 150 முதல் 200 bp வரை இருக்கும். [12]. சுயமாக பெறப்பட்ட ccfDNA பகுப்பாய்வு, அதாவது, சாதாரண அல்லது மாற்றப்பட்ட ஹோஸ்ட் செல்களிலிருந்து ccfDNA, அணுக்கரு மற்றும்/அல்லது மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணுவில் உள்ள மரபணு மற்றும் எபிஜெனெடிக் மாற்றங்களைக் கண்டறியப் பயன்படுகிறது, இதன் மூலம் மருத்துவர்கள் குறிப்பிட்ட மூலக்கூறு-இலக்கு சிகிச்சைகளைத் தேர்ந்தெடுக்க உதவுகிறது [13]. இருப்பினும், கர்ப்ப காலத்தில் கரு செல்களிலிருந்து அல்லது இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட உறுப்புகளிலிருந்து ccfDNA போன்ற வெளிநாட்டு மூலங்களிலிருந்து ccfDNA ஐப் பெறலாம் [14,15,16,17]. ccfDNA என்பது ஒரு தொற்று முகவரின் (வெளிநாட்டு) நியூக்ளிக் அமிலங்கள் இருப்பதைக் கண்டறிவதற்கான தகவல்களின் முக்கிய ஆதாரமாகும், இது இரத்த கலாச்சாரங்களால் அடையாளம் காணப்படாத பரவலான தொற்றுகளை ஊடுருவாமல் கண்டறிவதை அனுமதிக்கிறது, பாதிக்கப்பட்ட திசுக்களின் ஊடுருவும் பயாப்ஸியைத் தவிர்க்கிறது [18]. வைரஸ் மற்றும் பாக்டீரியா நோய்க்கிருமிகளை அடையாளம் காணப் பயன்படுத்தக்கூடிய தகவல்களின் வளமான ஆதாரத்தை மனித இரத்தம் கொண்டுள்ளது என்பதையும், மனித பிளாஸ்மாவில் காணப்படும் ccfDNA இல் சுமார் 1% வெளிநாட்டு தோற்றம் கொண்டது என்பதையும் சமீபத்திய ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன [19]. இந்த ஆய்வுகள், ஒரு உயிரினத்தின் சுற்றும் நுண்ணுயிரியலின் பல்லுயிரியலை ccfDNA பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி மதிப்பிட முடியும் என்பதை நிரூபிக்கின்றன. இருப்பினும், சமீப காலம் வரை, இந்தக் கருத்து மனிதர்களில் மட்டுமே பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் குறைந்த அளவிற்கு, பிற முதுகெலும்புகளில் பயன்படுத்தப்பட்டது [20, 21].
தற்போதைய ஆய்வறிக்கையில், 35 மில்லியன் ஆண்டுகளுக்கு முன்பு உருவான ஒரு பெரிய பீடபூமியின் மேல் உள்ள தீவுகளின் குழுவான சபாண்டார்டிக் கெர்குலென் தீவுகளில் பொதுவாகக் காணப்படும் தெற்கு இனமான ஆலகோமியா அட்ராவின் ccfDNA ஐ பகுப்பாய்வு செய்ய LB திறனைப் பயன்படுத்துகிறோம். எரிமலை வெடிப்பு. ஒரு இன் விட்ரோ சோதனை முறையைப் பயன்படுத்தி, கடல் நீரில் உள்ள DNA துண்டுகள் மஸ்ஸல்களால் விரைவாக எடுக்கப்பட்டு ஹீமோலிம்ப் பெட்டியில் நுழைகின்றன என்பதைக் கண்டறிந்தோம். ஷாட்கன் வரிசைமுறை, மஸ்ஸல் ஹீமோலிம்ப் ccfDNA அதன் சொந்த மற்றும் சுய-தோற்றம் இல்லாத DNA துண்டுகளைக் கொண்டுள்ளது என்பதைக் காட்டுகிறது, இதில் சிம்பியோடிக் பாக்டீரியா மற்றும் குளிர் எரிமலை கடல் கடலோர சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளின் பொதுவான பயோம்களிலிருந்து DNA துண்டுகள் அடங்கும். ஹீமோலிம்ப் ccfDNA வெவ்வேறு ஹோஸ்ட் வரம்புகளைக் கொண்ட வைரஸ்களிலிருந்து பெறப்பட்ட வைரஸ் வரிசைகளையும் கொண்டுள்ளது. எலும்பு மீன், கடல் அனிமோன்கள், பாசிகள் மற்றும் பூச்சிகள் போன்ற பலசெல்லுலார் விலங்குகளிடமிருந்து DNA துண்டுகளையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம். முடிவில், கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் வளமான மரபணு தொகுப்பை உருவாக்க கடல் முதுகெலும்பில்லாதவர்களுக்கு LB கருத்தை வெற்றிகரமாகப் பயன்படுத்தலாம் என்பதை எங்கள் ஆய்வு நிரூபிக்கிறது.
முதிர்ந்த மீன்கள் (55-70 மிமீ நீளம்) மைட்டிலஸ் பிளாட்டென்சிஸ் (எம். பிளாட்டென்சிஸ்) மற்றும் ஆலகோமியா அட்ரா (ஏ. அட்ரா) ஆகியவை போர்ட்-ஓ-பிரான்ஸின் (049°21.235 தெற்கு, 070°13.490 கிழக்கு) அலைகளுக்கு இடையேயான பாறைக் கரையிலிருந்து சேகரிக்கப்பட்டன. டிசம்பர் 2018 இல் கெர்குலென் தீவுகள். பிற முதிர்ந்த நீல மஸல்கள் (மைட்டிலஸ் spp.) ஒரு வணிக சப்ளையரிடமிருந்து (PEI Mussel King Inc., பிரின்ஸ் எட்வர்ட் தீவு, கனடா) பெறப்பட்டு, 32‰ செயற்கை உப்புநீரில் 10–20 L கொண்ட வெப்பநிலை கட்டுப்படுத்தப்பட்ட (4°C) காற்றோட்டமான தொட்டியில் வைக்கப்பட்டன. (செயற்கை கடல் உப்பு ரீஃப் கிரிஸ்டல், உடனடி பெருங்கடல், வர்ஜீனியா, அமெரிக்கா). ஒவ்வொரு பரிசோதனைக்கும், தனிப்பட்ட ஓடுகளின் நீளம் மற்றும் எடை அளவிடப்பட்டது.
இந்த திட்டத்திற்கான இலவச திறந்த அணுகல் நெறிமுறை ஆன்லைனில் கிடைக்கிறது (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). சுருக்கமாக, LB ஹீமோலிம்ப், விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி [22], கடத்தும் தசைகளிலிருந்து சேகரிக்கப்பட்டது. ஹீமோலிம்ப் 1200×g இல் 3 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு மூலம் தெளிவுபடுத்தப்பட்டது, சூப்பர்நேட்டண்ட் பயன்படுத்தப்படும் வரை (-20°C) உறைந்திருந்தது. cfDNA ஐ தனிமைப்படுத்தி சுத்திகரிக்க, மாதிரிகள் (1.5-2.0 மில்லி) உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி நியூக்ளியோஸ்னாப் cfDNA கிட் (மச்செரி-நாகல், பெத்லஹென், PA) ஐப் பயன்படுத்தி உருக்கி பதப்படுத்தப்பட்டன. மேலும் பகுப்பாய்வு வரை ccfDNA -80°C இல் சேமிக்கப்பட்டது. சில சோதனைகளில், ccfDNA QIAamp DNA இன்வெஸ்டிகேட்டர் கிட் (QIAGEN, டொராண்டோ, ஒன்டாரியோ, கனடா) ஐப் பயன்படுத்தி தனிமைப்படுத்தப்பட்டு சுத்திகரிக்கப்பட்டது. சுத்திகரிக்கப்பட்ட DNA ஒரு நிலையான PicoGreen மதிப்பீட்டைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது. தனிமைப்படுத்தப்பட்ட ccfDNA வின் துண்டு பரவல், உயர் உணர்திறன் DNA கருவியைப் பயன்படுத்தி, Agilent 2100 உயிரியல் பகுப்பாய்வி (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ஐப் பயன்படுத்தி, கேபிலரி எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, ccfDNA மாதிரியின் 1 µl ஐப் பயன்படுத்தி இந்த மதிப்பீடு செய்யப்பட்டது.
ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA துண்டுகளை வரிசைப்படுத்துவதற்கு, ஜெனோம் கியூபெக் (மாண்ட்ரீல், கியூபெக், கனடா) இல்லுமினா மிசெக் PE75 கிட்டின் இல்லுமினா டிஎன்ஏ மிக்ஸ் கிட்டைப் பயன்படுத்தி ஷாட்கன் நூலகங்களைத் தயாரித்தது. ஒரு நிலையான அடாப்டர் (பயோஓ) பயன்படுத்தப்பட்டது. ரா டேட்டா கோப்புகள் NCBI சீக்வென்ஸ் ரீட் காப்பகத்திலிருந்து (SRR8924808 மற்றும் SRR8924809) கிடைக்கின்றன. அடிப்படை வாசிப்புத் தரம் FastQC [23] ஐப் பயன்படுத்தி மதிப்பிடப்பட்டது. கிளிப்பிங் அடாப்டர்கள் மற்றும் மோசமான தரமான வாசிப்புகளுக்கு டிரிம்மோமேடிக் [24] பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளது. பொருந்தாதவற்றைத் தவிர்க்க, ஜோடி முனைகளுடன் கூடிய ஷாட்கன் வாசிப்புகள் FLASH நீண்ட ஒற்றை வாசிப்புகளாக இணைக்கப்பட்டன, குறைந்தபட்சம் 20 bp மேலெழுதலுடன் [25]. இணைக்கப்பட்ட வாசிப்புகள் ஒரு இருவால்வு NCBI வகைபிரித்தல் தரவுத்தளத்தைப் பயன்படுத்தி BLASTN உடன் குறிப்புரை செய்யப்பட்டன (e மதிப்பு < 1e−3 மற்றும் 90% ஹோமோலஜி), மேலும் குறைந்த-சிக்கலான வரிசைகளின் மறைத்தல் DUST ஐப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டது [26]. இணைக்கப்பட்ட வாசிப்புகள் ஒரு இருவால்வு NCBI வகைபிரித்தல் தரவுத்தளத்தைப் பயன்படுத்தி BLASTN உடன் குறிப்புரை செய்யப்பட்டன (e மதிப்பு < 1e−3 மற்றும் 90% ஹோமோலஜி), மேலும் குறைந்த-சிக்கலான வரிசைகளின் மறைத்தல் DUST ஐப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டது [26]. ஒலிபெருக்கிகள் மோல்யுஸ்கோவ் என்சிபிஐ (ஜனாசெனி இ <1இ-3 மற்றும் 90% கோமோலோகி), அ மாஸ்கிரோவனி போஸ்லெடோவதேல்ட் இஸ்போல்சோவனிம் தூசி [26]. NCBI பைவால்வ் வகைபிரித்தல் தரவுத்தளத்தைப் (e மதிப்பு < 1e-3 மற்றும் 90% ஹோமோலஜி) பயன்படுத்தி BLASTN உடன் தொகுக்கப்பட்ட வாசிப்புகள் குறிப்புரை செய்யப்பட்டன, மேலும் DUST ஐப் பயன்படுத்தி குறைந்த சிக்கலான வரிசை மறைத்தல் செய்யப்பட்டது [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 மற்றும் 90%进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类进行 复杂度 序列 的。。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽ஒலிபெருக்கிகள் மோலிஸ்கோவ் என்சிபிஐ (பொதுவான இ <1e-3 மற்றும் 90% கோமோலோகி), அ மாஸ்கிரோவனி போஸ்லேடோவட்டேல்ட் இஸ்போல்சோவனிம் தூசி [26]. NCBI பைவால்வ் வகைபிரித்தல் தரவுத்தளத்தைப் (e மதிப்பு <1e-3 மற்றும் 90% ஹோமோலஜி) பயன்படுத்தி BLASTN உடன் தொகுக்கப்பட்ட வாசிப்புகள் குறிப்புரை செய்யப்பட்டன, மேலும் DUST ஐப் பயன்படுத்தி குறைந்த சிக்கலான வரிசை மறைத்தல் செய்யப்பட்டது [26].வாசிப்புகள் இரண்டு குழுக்களாகப் பிரிக்கப்பட்டன: இருவால்வு வரிசைகளுடன் தொடர்புடையவை (இங்கு சுய-வாசிப்புகள் என்று அழைக்கப்படுகின்றன) மற்றும் தொடர்பில்லாதவை (சுய-வாசிப்புகள் அல்லாதவை). இரண்டு குழுக்கள் MEGAHIT ஐப் பயன்படுத்தி கான்டிஜ்களை உருவாக்க தனித்தனியாக கூடியிருந்தன [27]. இதற்கிடையில், அன்னிய நுண்ணுயிரி வாசிப்புகளின் வகைபிரித்தல் பரவல் கிராக்கன்2 [28] ஐப் பயன்படுத்தி வகைப்படுத்தப்பட்டது மற்றும் கேலக்ஸி [29, 30] இல் உள்ள க்ரோனா பை விளக்கப்படத்தால் வரைபடமாக குறிப்பிடப்பட்டது. உகந்த kmers kmers-59 என்பது எங்கள் ஆரம்ப சோதனைகளிலிருந்து தீர்மானிக்கப்பட்டது. பின்னர் இறுதி குறிப்புக்காக BLASTN (இருவால்வு NCBI தரவுத்தளம், e மதிப்பு < 1e−10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) உடன் சீரமைப்பதன் மூலம் சுய கான்டிஜ்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன. பின்னர் இறுதி குறிப்புக்காக BLASTN (இருவால்வு NCBI தரவுத்தளம், e மதிப்பு < 1e−10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) உடன் சீரமைப்பதன் மூலம் சுய கான்டிஜ்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன. கேத்தம் சோப்ஸ்ட்வென்னி கான்டிகி பைலி ஐடென்டிஃபிசிரோவனி புடெம் சோபோஸ்டாவ்லேனியா மற்றும் பிளாஸ்ட்ன் NCBI, значение e <1e-10 மற்றும் 60%) இறுதி குறிப்புக்காக BLASTN (NCBI பைவால்வ் தரவுத்தளம், e மதிப்பு <1e-10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) உடன் பொருத்துவதன் மூலம் சுய-கான்டிஜ்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% கேத்தம் பைலி ஐடெண்டிஃபிட்கள் dannыh NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). பின்னர் BLASTN (NCBI பைவால்வ் தரவுத்தளம், e மதிப்பு <1e-10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) உடன் பொருத்துவதன் மூலம் இறுதி குறிப்புக்காக சுய-கான்டிஜ்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன. இணையாக, சுயமற்ற குழு கான்டிஜ்கள் BLASTN உடன் குறிப்புரை செய்யப்பட்டன (nt NCBI தரவுத்தளம், e மதிப்பு < 1e−10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி). இணையாக, சுயமற்ற குழு கான்டிஜ்கள் BLASTN உடன் குறிப்புரை செய்யப்பட்டன (nt NCBI தரவுத்தளம், e மதிப்பு < 1e−10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி). பாரல்லெல்னோ சுஜெரோட்னி க்ருப்போவி கான்டிகி பைலி அன்னோடிரோவனி எஸ் போமோஷியு பிளாஸ்ட்ன் (பாசா டான்சி என்சிபிஐ,
PCR-க்கு பயன்படுத்தப்படும் ப்ரைமர்கள் அட்டவணை S1-ல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. ccfDNA இலக்கு மரபணுக்களைப் பெருக்க Taq DNA பாலிமரேஸ் (பயோ பேசிக் கனடா, மார்க்கம், ON) பயன்படுத்தப்பட்டது. பின்வரும் எதிர்வினை நிலைமைகள் பயன்படுத்தப்பட்டன: 3 நிமிடங்களுக்கு 95°C இல் டினாடரேஷன், 1 நிமிடத்திற்கு 95°C இல், 1 நிமிடத்திற்கு அனீலிங் வெப்பநிலையை அமைத்தல், 1 நிமிடத்திற்கு 72°C இல் நீட்சி, 35 சுழற்சிகள் மற்றும் இறுதியாக 10 நிமிடங்களுக்குள் 72°C ஆக அமைத்தல். . PCR பொருட்கள் 95 V இல் SYBRTM சேஃப் DNA ஜெல் ஸ்டெயின் (இன்விட்ரஜன், பர்லிங்டன், ON, கனடா) கொண்ட அகரோஸ் ஜெல்களில் (1.5%) எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் பிரிக்கப்பட்டன.
மஸ்ஸல்கள் (மைட்டிலஸ் spp.) 500 மில்லி ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட கடல் நீரில் (32 PSU) 24 மணி நேரம் 4°C வெப்பநிலையில் பழக்கப்படுத்தப்பட்டன. மனித கேலக்டின்-7 cDNA வரிசையை (NCBI அணுகல் எண் L07769) குறியாக்கம் செய்யும் செருகலைக் கொண்ட பிளாஸ்மிட் DNA 190 μg/μl இறுதி செறிவில் குப்பியில் சேர்க்கப்பட்டது. DNA சேர்க்காமல் அதே நிலைமைகளின் கீழ் அடைகாக்கப்பட்ட மஸ்ஸல்கள் கட்டுப்பாட்டாக இருந்தன. மூன்றாவது கட்டுப்பாட்டு தொட்டியில் மஸ்ஸல்கள் இல்லாத DNA இருந்தது. கடல் நீரில் உள்ள DNA வின் தரத்தை கண்காணிக்க, குறிப்பிட்ட நேரத்தில் ஒவ்வொரு தொட்டியிலிருந்தும் கடல் நீர் மாதிரிகள் (20 μl; மூன்று மறுபடியும்) எடுக்கப்பட்டன. பிளாஸ்மிட் DNA கண்டறியும் தன்மைக்காக, LB மஸ்ஸல்கள் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட நேரங்களில் அறுவடை செய்யப்பட்டு qPCR மற்றும் ddPCR மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. கடல் நீரில் அதிக உப்பு உள்ளடக்கம் இருப்பதால், அனைத்து PCR மதிப்பீடுகளுக்கும் முன்பு அலிகோட்கள் PCR தர நீரில் (1:10) நீர்த்தப்பட்டன.
டிஜிட்டல் துளி PCR (ddPCR) பயோராட் QX200 நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி (மிசிசாகா, ஒன்டாரியோ, கனடா) செய்யப்பட்டது. உகந்த வெப்பநிலையை தீர்மானிக்க வெப்பநிலை சுயவிவரத்தைப் பயன்படுத்தவும் (அட்டவணை S1). QX200 துளி ஜெனரேட்டரை (பயோராட்) பயன்படுத்தி துளிகள் உருவாக்கப்பட்டன. ddPCR பின்வருமாறு மேற்கொள்ளப்பட்டது: 5 நிமிடங்களுக்கு 95°C, 30 வினாடிகளுக்கு 95°C இன் 50 சுழற்சிகள் மற்றும் 1 நிமிடத்திற்கு கொடுக்கப்பட்ட அனீலிங் வெப்பநிலை மற்றும் 30 வினாடிகளுக்கு 72°C, 5 நிமிடங்களுக்கு 4°C மற்றும் 5 நிமிடங்களுக்குள் 90°C. துளிகளின் எண்ணிக்கை மற்றும் நேர்மறை எதிர்வினைகள் (நகல்கள்/µl) QX200 துளி ரீடரை (பயோராட்) பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டன. 10,000 துளிகளுக்கும் குறைவான மாதிரிகள் நிராகரிக்கப்பட்டன. ddPCR இயக்கப்படும் ஒவ்வொரு முறையும் வடிவக் கட்டுப்பாடு செய்யப்படவில்லை.
qPCR, Rotor-Gene® 3000 (கார்பெட் ஆராய்ச்சி, சிட்னி, ஆஸ்திரேலியா) மற்றும் LGALS7 குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது. QuantiFast SYBR கிரீன் PCR கிட் (QIAGEN) ஐப் பயன்படுத்தி அனைத்து அளவு PCRகளும் 20 µl இல் செய்யப்பட்டன. qPCR 95°C இல் 15 நிமிட அடைகாப்புடன் தொடங்கப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து 95°C இல் 10 வினாடிகளுக்கு 40 சுழற்சிகளும், 60°C இல் 60 வினாடிகளுக்கு 60 வினாடிகளுக்கு 40 சுழற்சிகளும் ஒரு தரவு சேகரிப்புடன் தொடங்கப்பட்டன. 5 வினாடிகளுக்கு 95°C, 60 வினாடிகளுக்கு 65°C மற்றும் qPCR இன் முடிவில் 97°C இல் தொடர்ச்சியான அளவீடுகளைப் பயன்படுத்தி உருகும் வளைவுகள் உருவாக்கப்பட்டன. கட்டுப்பாட்டு மாதிரிகளைத் தவிர, ஒவ்வொரு qPCR மும்மடங்காக செய்யப்பட்டது.
மஸல்கள் அதிக வடிகட்டுதல் விகிதத்திற்கு பெயர் பெற்றவை என்பதால், கடல் நீரில் உள்ள டிஎன்ஏ துண்டுகளை வடிகட்டி தக்கவைக்க முடியுமா என்பதை முதலில் நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். இந்த துண்டுகள் அவற்றின் அரை-திறந்த நிணநீர் மண்டலத்தில் குவிகின்றனவா என்பதையும் நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். நீல மஸல் தொட்டிகளில் சேர்க்கப்படும் கரையக்கூடிய டிஎன்ஏ துண்டுகளின் தலைவிதியைக் கண்டுபிடிப்பதன் மூலம் இந்த சிக்கலை நாங்கள் சோதனை ரீதியாக தீர்த்தோம். டிஎன்ஏ துண்டுகளைக் கண்காணிக்க வசதியாக, மனித கேலக்டின்-7 மரபணுவைக் கொண்ட வெளிநாட்டு (சுயமாக அல்ல) பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏவைப் பயன்படுத்தினோம். ddPCR கடல் நீர் மற்றும் மஸல்களில் பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ துண்டுகளைக் கண்டறிந்தது. மஸல்கள் இல்லாதபோது கடல் நீரில் டிஎன்ஏ துண்டுகளின் அளவு காலப்போக்கில் (7 நாட்கள் வரை) ஒப்பீட்டளவில் மாறாமல் இருந்தால், மஸல்கள் முன்னிலையில் இந்த நிலை 8 மணி நேரத்திற்குள் கிட்டத்தட்ட முற்றிலும் மறைந்துவிடும் என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன (படம் 1a,b). வெளிப்புற டிஎன்ஏவின் துண்டுகள் இன்ட்ராவால்வுலர் திரவம் மற்றும் ஹீமோலிம்பில் 15 நிமிடங்களுக்குள் எளிதாகக் கண்டறியப்பட்டன (படம் 1c). வெளிப்பட்ட 4 மணி நேரத்திற்குப் பிறகும் இந்த துண்டுகளைக் கண்டறிய முடியும். டி.என்.ஏ துண்டுகளைப் பொறுத்தவரை இந்த வடிகட்டுதல் செயல்பாடு பாக்டீரியா மற்றும் பாசிகளின் வடிகட்டுதல் செயல்பாட்டுடன் ஒப்பிடத்தக்கது [31]. இந்த முடிவுகள் மஸல்கள் அவற்றின் திரவப் பெட்டிகளில் வெளிநாட்டு டி.என்.ஏவை வடிகட்டி குவிக்க முடியும் என்பதைக் குறிக்கின்றன.
மஸல்களின் முன்னிலையில் (A) அல்லது இல்லாத நிலையில் (B) கடல் நீரில் பிளாஸ்மிட் DNA வின் ஒப்பீட்டு செறிவுகள், ddPCR ஆல் அளவிடப்படுகின்றன. A இல், முடிவுகள் சதவீதங்களாக வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன, பெட்டிகளின் எல்லைகள் 75வது மற்றும் 25வது சதவீதங்களைக் குறிக்கின்றன. பொருத்தப்பட்ட மடக்கை வளைவு சிவப்பு நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது, மேலும் சாம்பல் நிறத்தில் நிழலிடப்பட்ட பகுதி 95% நம்பிக்கை இடைவெளியைக் குறிக்கிறது. B இல், சிவப்பு கோடு சராசரியைக் குறிக்கிறது மற்றும் நீல கோடு செறிவுக்கான 95% நம்பிக்கை இடைவெளியைக் குறிக்கிறது. C பிளாஸ்மிட் DNA சேர்க்கப்பட்ட பிறகு வெவ்வேறு நேரங்களில் மஸல்களின் ஹீமோலிம்ப் மற்றும் வால்வுலர் திரவத்தில் பிளாஸ்மிட் DNA வின் குவிப்பு. முடிவுகள் கண்டறியப்பட்ட முழுமையான பிரதிகள்/mL (±SE) ஆக வழங்கப்படுகின்றன.
அடுத்து, கெர்குலென் தீவுகளில் உள்ள மஸ்ஸல் படுக்கைகளிலிருந்து சேகரிக்கப்பட்ட மஸ்ஸல்களில் ccfDNA இன் தோற்றத்தை ஆராய்ந்தோம், இது வரையறுக்கப்பட்ட மானுடவியல் செல்வாக்கு கொண்ட தீவுகளின் தொலைதூரக் குழுவாகும். இந்த நோக்கத்திற்காக, மஸ்ஸல் ஹீமோலிம்ப்களிலிருந்து cccDNA தனிமைப்படுத்தப்பட்டு, மனித cccDNA ஐ சுத்திகரிக்க பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் முறைகள் மூலம் சுத்திகரிக்கப்பட்டது [32, 33]. மஸ்ஸல்களில் சராசரி ஹீமோலிம்ப் ccfDNA செறிவுகள் ஒரு மில்லி ஹீமோலிம்ப் வரம்பில் குறைந்த மைக்ரோகிராம்களில் இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (அட்டவணை S2, துணைத் தகவலைப் பார்க்கவும்). இந்த செறிவு வரம்பு ஆரோக்கியமான மக்களை விட மிகப் பெரியது (ஒரு மில்லிலிட்டருக்கு குறைந்த நானோகிராம்கள்), ஆனால் அரிதான சந்தர்ப்பங்களில், புற்றுநோய் நோயாளிகளில், ccfDNA இன் அளவு மில்லிலிட்டருக்கு பல மைக்ரோகிராம்களை எட்டும் [34, 35]. ஹீமோலிம்ப் ccfDNA இன் அளவு விநியோகத்தின் பகுப்பாய்வு, இந்த துண்டுகள் 1000 bp முதல் 1000 bp வரை 5000 bp வரை (படம் 2) அளவில் பெரிதும் வேறுபடுகின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது. சிலிக்கா அடிப்படையிலான QIAamp இன்வெஸ்டிகேட்டர் கிட் ஐப் பயன்படுத்தி இதே போன்ற முடிவுகள் பெறப்பட்டன, இது தடயவியல் அறிவியலில் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு முறையாகும், இது ccfDNA உட்பட குறைந்த செறிவுள்ள DNA மாதிரிகளிலிருந்து மரபணு DNA ஐ விரைவாக தனிமைப்படுத்தி சுத்திகரிக்க பயன்படுகிறது [36].
மஸ்ஸல் ஹீமோலிம்பின் பிரதிநிதித்துவ ccfDNA எலக்ட்ரோபோரேகிராம். நியூக்ளியோஸ்னாப் பிளாஸ்மா கிட் (மேல்) மற்றும் QIAamp DNA இன்வெஸ்டிகேட்டர் கிட் மூலம் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. B மஸ்ஸல்களில் ஹீமோலிம்ப் ccfDNA செறிவுகளின் (±SE) பரவலைக் காட்டும் வயலின் வரைபடம். கருப்பு மற்றும் சிவப்பு கோடுகள் முறையே இடைநிலை மற்றும் முதல் மற்றும் மூன்றாவது காலாண்டுகளைக் குறிக்கின்றன.
மனிதர்கள் மற்றும் விலங்குகளில் உள்ள ccfDNA-வில் தோராயமாக 1% ஒரு வெளிநாட்டு மூலத்தைக் கொண்டுள்ளது [21, 37]. இருவால்வுகளின் அரை-திறந்த சுற்றோட்ட அமைப்பு, நுண்ணுயிர் நிறைந்த கடல் நீர் மற்றும் மஸ்ஸல் ccfDNA-வின் அளவு பரவல் ஆகியவற்றைக் கருத்தில் கொண்டு, மஸ்ஸல் ஹீமோலிம்ப் ccfDNA-வில் வளமான மற்றும் மாறுபட்ட நுண்ணுயிர் DNA இருக்கலாம் என்று நாங்கள் கருதுகிறோம். இந்தக் கருதுகோளைச் சோதிக்க, கெர்குலென் தீவுகளில் இருந்து சேகரிக்கப்பட்ட ஆலகோமியா அட்ரா மாதிரிகளிலிருந்து ஹீமோலிம்ப் ccfDNA-வை வரிசைப்படுத்தினோம், இது 10 மில்லியனுக்கும் அதிகமான வாசிப்புகளை அளித்தது, அவற்றில் 97.6% தரக் கட்டுப்பாட்டில் தேர்ச்சி பெற்றது. பின்னர் அளவீடுகள் BLASTN மற்றும் NCBI இருவால்வு தரவுத்தளங்களைப் பயன்படுத்தி சுய மற்றும் சுயமற்ற ஆதாரங்களின்படி வகைப்படுத்தப்பட்டன (படம் S1, துணைத் தகவல்).
மனிதர்களில், அணு மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ இரண்டையும் இரத்த ஓட்டத்தில் வெளியிடலாம் [38]. இருப்பினும், தற்போதைய ஆய்வில், ஏ. அட்ரா மரபணு வரிசைப்படுத்தப்படவில்லை அல்லது விவரிக்கப்படவில்லை என்பதால், மஸ்ஸல்களின் அணு மரபணு டிஎன்ஏவை விரிவாக விவரிக்க முடியவில்லை. இருப்பினும், பைவால்வ் நூலகத்தைப் பயன்படுத்தி நமது சொந்த தோற்றத்தின் பல ccfDNA துண்டுகளை அடையாளம் காண முடிந்தது (படம். S2, துணைத் தகவல்). வரிசைப்படுத்தப்பட்ட அந்த ஏ. அட்ரா மரபணுக்களின் நேரடி PCR பெருக்கம் மூலம் நமது சொந்த தோற்றத்தின் டிஎன்ஏ துண்டுகள் இருப்பதையும் நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம் (படம். 3). இதேபோல், ஏ. அட்ராவின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணு பொது தரவுத்தளங்களில் கிடைப்பதால், ஏ. அட்ராவின் ஹீமோலிம்பில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ துண்டுகள் இருப்பதற்கான ஆதாரங்களைக் காணலாம். மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ துண்டுகளின் இருப்பு PCR பெருக்கத்தால் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது (படம். 3).
PCR ஆல் பெருக்கப்பட்ட A. atra (சிவப்பு புள்ளிகள் - ஸ்டாக் எண்: SRX5705969) மற்றும் M. platensis (நீல புள்ளிகள் - ஸ்டாக் எண்: SRX5705968) ஆகியவற்றின் ஹீமோலிம்பில் பல்வேறு மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணுக்கள் இருந்தன. பிரெட்டன் மற்றும் பலர், 2011 இலிருந்து தழுவி எடுக்கப்பட்ட படம் B A. atra இலிருந்து ஹீமோலிம்ப் சூப்பர்நேட்டண்டின் பெருக்கம் FTA தாளில் சேமிக்கப்பட்டது. PCR கலவையைக் கொண்ட PCR குழாயில் நேரடியாகச் சேர்க்க 3 மிமீ பஞ்சைப் பயன்படுத்தவும்.
கடல் நீரில் ஏராளமான நுண்ணுயிர் உள்ளடக்கம் இருப்பதால், ஹீமோலிம்பில் உள்ள நுண்ணுயிர் டிஎன்ஏ வரிசைகளின் சிறப்பியல்புகளில் ஆரம்பத்தில் கவனம் செலுத்தினோம். இதைச் செய்ய, நாங்கள் இரண்டு வெவ்வேறு உத்திகளைப் பயன்படுத்துகிறோம். முதல் உத்தி, BLAST மற்றும் பிற கருவிகளுடன் ஒப்பிடக்கூடிய துல்லியத்துடன் நுண்ணுயிர் வரிசைகளை அடையாளம் காணக்கூடிய அல்காரிதம் அடிப்படையிலான வரிசை வகைப்பாடு திட்டமான கிராக்கன்2 ஐப் பயன்படுத்தியது [28]. 6719 க்கும் மேற்பட்ட வாசிப்புகள் பாக்டீரியா தோற்றம் கொண்டவை என்று தீர்மானிக்கப்பட்டன, அதே நேரத்தில் 124 மற்றும் 64 முறையே ஆர்க்கியா மற்றும் வைரஸ்களிலிருந்து வந்தவை (படம் 4). மிகவும் மிகுதியான பாக்டீரியா டிஎன்ஏ துண்டுகள் ஃபார்மிகியூட்ஸ் (46%), புரோட்டியோபாக்டீரியா (27%) மற்றும் பாக்டீராய்டுகள் (17%) (படம் 4a). இந்த விநியோகம் கடல் நீல மஸ்ஸல் நுண்ணுயிரி [39, 40] இன் முந்தைய ஆய்வுகளுடன் ஒத்துப்போகிறது. காமாப்ரோட்டியோபாக்டீரியா புரோட்டியோபாக்டீரியாவின் முக்கிய வகுப்பாகும் (44%), இதில் பல விப்ரியோனல்கள் (படம் 4b). ddPCR முறை, A. atra hemolymph (படம் 4c) [41] இன் ccfDNA இல் விப்ரியோ DNA துண்டுகள் இருப்பதை உறுதிப்படுத்தியது. ccfDNA இன் பாக்டீரியா தோற்றம் பற்றிய கூடுதல் தகவல்களைப் பெற, கூடுதல் அணுகுமுறை எடுக்கப்பட்டது (படம் S2, துணைத் தகவல்). இந்த நிகழ்வில், ஒன்றுடன் ஒன்று இணைக்கப்பட்ட வாசிப்புகள் ஜோடி-இறுதி வாசிப்புகளாக இணைக்கப்பட்டு, BLASTN மற்றும் 1e−3 e மதிப்பு மற்றும் >90% ஹோமோலஜியுடன் ஒரு கட்ஆஃப் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி சுய (இருவால்வுகள்) அல்லது சுயமற்ற தோற்றம் என வகைப்படுத்தப்பட்டன. இந்த நிகழ்வில், ஒன்றுடன் ஒன்று இணைக்கப்பட்ட வாசிப்புகள் ஜோடி-இறுதி வாசிப்புகளாக இணைக்கப்பட்டு, BLASTN மற்றும் 1e−3 e மதிப்பு மற்றும் >90% ஹோமோலஜியுடன் ஒரு கட்ஆஃப் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி சுய (இருவால்வுகள்) அல்லது சுயமற்ற தோற்றம் என வகைப்படுத்தப்பட்டன. எடோம் ஸ்லுச்சே பெரெக்ரிவயுசியஸ் பைலி சோப்ரானி காக் செக்டெனியா எஸ் பார்னிமி கோன்சமி மற்றும் பைலி கிளாஸ்ஸி собственные (dvustvorchatye mollyuski) с மொத்த> 90% இந்த வழக்கில், ஒன்றுடன் ஒன்று இணைந்த வாசிப்புகள் ஜோடி-முடிவு வாசிப்புகளாக சேகரிக்கப்பட்டு, BLASTN மற்றும் e மதிப்பு 1e-3 மற்றும் >90% ஹோமோலஜியுடன் கட்ஆஃப் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி சொந்த (இருவால்வு) அல்லது அசல் அல்லாதவை என வகைப்படுத்தப்பட்டன.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e>90%值和同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。மேலும்和> 90% 同源性 的 分类 自身 非 壳类） எடோம் ஸ்லுச்சே பெரெக்ரிவைசியஸ் பைலி சோப்ரானி காக் செட்னியா எஸ் பார்னிமி கோன்சமி மற்றும் கிளாசிக்விஷ்ஸ் собственные (двустворчатые моллюски) порога гомологии> 90%. இந்த வழக்கில், ஒன்றுடன் ஒன்று சேர்க்கப்பட்ட வாசிப்புகள் ஜோடி-முடிவு வாசிப்புகளாக சேகரிக்கப்பட்டு, e BLASTN மற்றும் 1e-3 மதிப்புகள் மற்றும் ஒரு ஹோமோலஜி வரம்பு >90% ஐப் பயன்படுத்தி சொந்த (இருவால்வுகள்) அல்லது அசல் அல்லாதவை என வகைப்படுத்தப்பட்டன.A. atra மரபணு இன்னும் வரிசைப்படுத்தப்படாததால், MEGAHIT அடுத்த தலைமுறை வரிசைமுறை (NGS) அசெம்பிளரின் de novo அசெம்பிளி உத்தியைப் பயன்படுத்தினோம். மொத்தம் 147,188 கான்டிஜ்கள் தோற்றத்தின் சார்பு (இருவால்வுகள்) என அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளன. இந்த கான்டிஜ்கள் பின்னர் BLASTN மற்றும் BLASTX ஐப் பயன்படுத்தி 1e-10 இன் e-மதிப்புகளுடன் வெடிக்கப்பட்டன. இந்த உத்தி A. atra ccfDNA இல் உள்ள 482 அல்லாத இருவால்வு துண்டுகளை அடையாளம் காண எங்களுக்கு அனுமதித்தது. இந்த டிஎன்ஏ துண்டுகளில் பாதிக்கும் மேற்பட்டவை (57%) பாக்டீரியாவிலிருந்து பெறப்பட்டன, முக்கியமாக சல்போட்ரோபிக் சிம்பியன்கள் உட்பட கில் சிம்பியன்கள் மற்றும் கில் சிம்பியன்கள் சோலெம்யா வேலம் (படம் 5).
வகை மட்டத்தில் ஒப்பீட்டு மிகுதி. B இரண்டு முக்கிய பைலாவின் (ஃபிர்மிகியூட்ஸ் மற்றும் புரோட்டியோபாக்டீரியா) நுண்ணுயிர் பன்முகத்தன்மை. ddPCR இன் பிரதிநிதித்துவ பெருக்கம் C விப்ரியோ spp. A. மூன்று அட்ரா ஹீமோலிம்ப்களில் 16S rRNA மரபணுவின் (நீலம்) துண்டுகள்.
மொத்தம் 482 சேகரிக்கப்பட்ட காண்டிக்கள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. மெட்டஜெனோமிக் காண்டிக் குறிப்புகளின் (புரோகாரியோட்டுகள் மற்றும் யூகாரியோட்டுகள்) வகைபிரித்தல் பரவலின் பொதுவான சுயவிவரம். BLASTN மற்றும் BLASTX ஆல் அடையாளம் காணப்பட்ட பாக்டீரியா டிஎன்ஏ துண்டுகளின் விரிவான பரவல்.
கிராகன்2 பகுப்பாய்வு, மஸ்ஸல் ccfDNA-வில் யூரியார்ச்சியோட்டா (65%), க்ரெனார்ச்சியோட்டா (24%) மற்றும் தௌர்மார்ச்சியோட்டா (11%) (படம் 6a) ஆகியவற்றின் DNA துண்டுகள் உட்பட தொல்பொருள் DNA துண்டுகள் இருப்பதையும் காட்டியது. கலிஃபோர்னிய மஸ்ஸல்களின் நுண்ணுயிர் சமூகத்தில் முன்னர் காணப்பட்ட யூரியார்ச்சியோட்டா மற்றும் க்ரெனார்ச்சியோட்டாவிலிருந்து பெறப்பட்ட DNA துண்டுகள் இருப்பது ஆச்சரியமாக இருக்கக்கூடாது [42]. யூரியார்ச்சியோட்டா பெரும்பாலும் தீவிர நிலைமைகளுடன் தொடர்புடையது என்றாலும், யூரியார்ச்சியோட்டா மற்றும் க்ரெனார்ச்சியோட்டா இரண்டும் கடல் கிரையோஜெனிக் சூழலில் மிகவும் பொதுவான புரோகாரியோட்டுகளில் ஒன்றாகும் என்பது இப்போது அங்கீகரிக்கப்பட்டுள்ளது [43, 44]. கெர்குலென் பீடபூமியில் [45] அடிப்பகுதியில் இருந்து விரிவான மீத்தேன் கசிவுகள் மற்றும் கெர்குலென் தீவுகளின் கடற்கரையில் காணப்பட்ட நுண்ணுயிர் மீத்தேன் உற்பத்தியின் சாத்தியமான அறிக்கைகள் [46] ஆகியவற்றின் சமீபத்திய அறிக்கைகளின்படி, மஸ்ஸல்களில் மெத்தனோஜெனிக் நுண்ணுயிரிகளின் இருப்பு ஆச்சரியமல்ல.
பின்னர் எங்கள் கவனம் டிஎன்ஏ வைரஸ்களின் அளவீடுகளுக்கு மாறியது. எங்களுக்குத் தெரிந்தவரை, இது மஸல்களின் வைரஸ் உள்ளடக்கம் குறித்த முதல் இலக்கு அல்லாத ஆய்வு ஆகும். எதிர்பார்த்தபடி, பாக்டீரியோபேஜ்களின் (காடோவைரல்ஸ்) டிஎன்ஏ துண்டுகளைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 6b). இருப்பினும், மிகவும் பொதுவான வைரஸ் டிஎன்ஏ நியூக்ளியோசைட்டோவைரஸ்களின் பைலத்திலிருந்து வருகிறது, இது நியூக்ளியர் சைட்டோபிளாஸ்மிக் லார்ஜ் டிஎன்ஏ வைரஸ் (NCLDV) என்றும் அழைக்கப்படுகிறது, இது எந்த வைரஸின் மிகப்பெரிய மரபணுவையும் கொண்டுள்ளது. இந்த பைலத்திற்குள், பெரும்பாலான டிஎன்ஏ வரிசைகள் மிமிமிடோவிரிடே (58%) மற்றும் போக்ஸ்விரிடே (21%) குடும்பங்களைச் சேர்ந்தவை, அவற்றின் இயற்கையான ஹோஸ்ட்களில் முதுகெலும்புகள் மற்றும் ஆர்த்ரோபாட்கள் அடங்கும், அதே நேரத்தில் இந்த டிஎன்ஏ வரிசைகளில் ஒரு சிறிய விகிதம் அறியப்பட்ட வைராலஜிக்கல் ஆல்காவைச் சேர்ந்தவை. கடல் யூகாரியோடிக் ஆல்காவை பாதிக்கிறது. இந்த வரிசைகள் பண்டோரா வைரஸிலிருந்தும் பெறப்பட்டன, இது அறியப்பட்ட எந்த வைரஸ் இனத்திலும் மிகப்பெரிய மரபணு அளவைக் கொண்ட மாபெரும் வைரஸ் ஆகும். சுவாரஸ்யமாக, ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ வரிசைமுறையால் தீர்மானிக்கப்படும் வைரஸால் பாதிக்கப்பட்டதாக அறியப்பட்ட ஹோஸ்ட்களின் வரம்பு ஒப்பீட்டளவில் பெரியதாக இருந்தது (படம் எஸ் 3, துணைத் தகவல்). இதில் பாகுலோவிரிடே மற்றும் இரிடோவிரிடே போன்ற பூச்சிகளைப் பாதிக்கும் வைரஸ்களும், அமீபா, பாசிகள் மற்றும் முதுகெலும்புகளைப் பாதிக்கும் வைரஸ்களும் அடங்கும். பித்தோவைரஸ் சைபரிகம் மரபணுவுடன் பொருந்தக்கூடிய வரிசைகளையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம். பிட்டோவைரஸ்கள் ("ஜாம்பி வைரஸ்கள்" என்றும் அழைக்கப்படுகின்றன) முதன்முதலில் சைபீரியாவில் 30,000 ஆண்டுகள் பழமையான நிரந்தர உறைபனியிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டன [47]. எனவே, இந்த வைரஸ்களின் அனைத்து நவீன இனங்களும் அழிந்துவிடவில்லை [48] மற்றும் இந்த வைரஸ்கள் தொலைதூர துணை ஆர்க்டிக் கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் இருக்கலாம் என்பதைக் காட்டும் முந்தைய அறிக்கைகளுடன் எங்கள் முடிவுகள் ஒத்துப்போகின்றன.
இறுதியாக, பிற பலசெல்லுலார் விலங்குகளிடமிருந்து டி.என்.ஏ துண்டுகளைக் கண்டுபிடிக்க முடியுமா என்று சோதித்தோம். மொத்தம் 482 வெளிநாட்டு காண்டிக்களை nt, nr மற்றும் RefSeq நூலகங்களுடன் (மரபணு மற்றும் புரதம்) BLASTN மற்றும் BLASTX அடையாளம் கண்டன. பலசெல்லுலார் விலங்குகளின் ccfDNA இன் வெளிநாட்டு துண்டுகளில் எலும்பு எலும்புகளின் டி.என்.ஏ ஆதிக்கம் செலுத்துகிறது என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன (படம் 5). பூச்சிகள் மற்றும் பிற உயிரினங்களின் டி.என்.ஏ துண்டுகளும் கண்டுபிடிக்கப்பட்டுள்ளன. டி.என்.ஏ துண்டுகளில் ஒப்பீட்டளவில் பெரிய பகுதி அடையாளம் காணப்படவில்லை, ஒருவேளை நிலப்பரப்பு உயிரினங்களுடன் ஒப்பிடும்போது மரபணு தரவுத்தளங்களில் அதிக எண்ணிக்கையிலான கடல் இனங்கள் குறைவாக பிரதிநிதித்துவப்படுத்தப்படுவதால் [49].
இந்த ஆய்வறிக்கையில், ஹீமோலிம்ப் ccfDNA ஷாட் சீக்வென்சிங் கடல் கடலோர சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளின் கலவை பற்றிய நுண்ணறிவை வழங்க முடியும் என்று வாதிடுவதன் மூலம், LB கருத்தை மஸ்ஸல்களுக்குப் பயன்படுத்துகிறோம். குறிப்பாக, 1) மஸ்ஸல் ஹீமோலிம்பில் ஒப்பீட்டளவில் பெரிய (~1-5 kb) சுற்றும் DNA துண்டுகளின் ஒப்பீட்டளவில் அதிக செறிவுகள் (மைக்ரோகிராம் அளவுகள்) இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம்; 2) இந்த DNA துண்டுகள் சுயாதீனமானவை மற்றும் சுயாதீனமற்றவை 3) இந்த DNA துண்டுகளின் வெளிநாட்டு மூலங்களில், பாக்டீரியா, தொல்பொருள் மற்றும் வைரஸ் DNA, அத்துடன் பிற பலசெல்லுலார் விலங்குகளின் DNA ஆகியவற்றைக் கண்டறிந்தோம்; 4) ஹீமோலிம்பில் இந்த வெளிநாட்டு ccfDNA துண்டுகளின் குவிப்பு விரைவாக நிகழ்கிறது மற்றும் மஸ்ஸல்களின் உள் வடிகட்டுதல் செயல்பாட்டிற்கு பங்களிக்கிறது. முடிவில், இதுவரை முக்கியமாக உயிரி மருத்துவத் துறையில் பயன்படுத்தப்படும் LB என்ற கருத்து, செண்டினல் இனங்களுக்கும் அவற்றின் சூழலுக்கும் இடையிலான தொடர்புகளை நன்கு புரிந்துகொள்ளப் பயன்படுத்தக்கூடிய ஒரு வளமான ஆனால் ஆராயப்படாத அறிவு மூலத்தை குறியீடாக்குகிறது என்பதை எங்கள் ஆய்வு நிரூபிக்கிறது.
விலங்குகளைத் தவிர, எலிகள், நாய்கள், பூனைகள் மற்றும் குதிரைகள் [50, 51, 52] உள்ளிட்ட பாலூட்டிகளிலும் ccfDNA தனிமைப்படுத்தல் பதிவாகியுள்ளது. இருப்பினும், எங்களுக்குத் தெரிந்தவரை, திறந்த சுழற்சி அமைப்பு கொண்ட கடல் உயிரினங்களில் ccfDNA இன் கண்டறிதல் மற்றும் வரிசைப்படுத்தலைப் புகாரளித்த முதல் ஆய்வு எங்கள் ஆய்வு ஆகும். மஸ்ஸல்களின் இந்த உடற்கூறியல் அம்சம் மற்றும் வடிகட்டுதல் திறன், குறைந்தபட்சம் ஓரளவுக்கு, மற்ற உயிரினங்களுடன் ஒப்பிடும்போது சுற்றும் DNA துண்டுகளின் வெவ்வேறு அளவு பண்புகளை விளக்கக்கூடும். மனிதர்களில், இரத்தத்தில் சுற்றும் பெரும்பாலான DNA துண்டுகள் 150 முதல் 200 bp வரையிலான சிறிய துண்டுகளாகும். அதிகபட்ச உச்சம் 167 bp [34, 53]. DNA துண்டுகளின் ஒரு சிறிய ஆனால் குறிப்பிடத்தக்க பகுதி 300 முதல் 500 bp வரை இருக்கும், மேலும் சுமார் 5% 900 bp ஐ விட நீளமானது. [54]. இந்த அளவு பரவலுக்கான காரணம், பிளாஸ்மாவில் ccfDNA இன் முக்கிய ஆதாரம் செல் இறப்பின் விளைவாக ஏற்படுகிறது, இது செல் இறப்பு காரணமாகவோ அல்லது ஆரோக்கியமான நபர்களில் சுற்றும் ஹீமாடோபாய்டிக் செல்களின் நசிவு காரணமாகவோ அல்லது புற்றுநோய் நோயாளிகளில் கட்டி செல்களின் அப்போப்டோசிஸ் காரணமாகவோ (சுழற்சி கட்டி DNA என அழைக்கப்படுகிறது). , ctDNA). மஸ்ஸல்களில் நாங்கள் கண்டறிந்த ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA இன் அளவு பரவல் 1000 முதல் 5000 bp வரை இருந்தது, இது மஸ்ஸல் ccfDNA வேறுபட்ட தோற்றத்தைக் கொண்டுள்ளது என்பதைக் குறிக்கிறது. மஸ்ஸல்கள் அரை-திறந்த வாஸ்குலர் அமைப்பைக் கொண்டிருப்பதாலும், அதிக செறிவுள்ள நுண்ணுயிர் மரபணு DNA கொண்ட கடல் நீர்வாழ் சூழல்களில் வாழ்வதாலும் இது ஒரு தர்க்கரீதியான கருதுகோள். உண்மையில், வெளிப்புற டிஎன்ஏவைப் பயன்படுத்தி எங்கள் ஆய்வக சோதனைகள், மஸ்ஸல்கள் கடல் நீரில் டிஎன்ஏ துண்டுகளைக் குவிக்கின்றன என்பதைக் காட்டுகின்றன, குறைந்தபட்சம் சில மணிநேரங்களுக்குப் பிறகு அவை செல்லுலார் உறிஞ்சுதல் மற்றும்/அல்லது வெளியிடப்பட்ட மற்றும்/அல்லது பல்வேறு நிறுவனங்களில் சேமிக்கப்பட்ட பிறகு அவை சிதைக்கப்படுகின்றன. செல்கள் (புரோகாரியோடிக் மற்றும் யூகாரியோடிக் இரண்டும்) அரிதானவை என்பதைக் கருத்தில் கொண்டு, இன்ட்ராவால்வுலர் பெட்டிகளைப் பயன்படுத்துவது சுய மூலங்களிலிருந்தும் வெளிநாட்டு மூலங்களிலிருந்தும் ccfDNA அளவைக் குறைக்கும். பைவால்வ் உள்ளார்ந்த நோய் எதிர்ப்பு சக்தியின் முக்கியத்துவத்தையும், அதிக எண்ணிக்கையிலான சுற்றும் பாகோசைட்டுகளையும் கருத்தில் கொண்டு, வெளிநாட்டு ccfDNA கூட நுண்ணுயிரிகள் மற்றும்/அல்லது செல்லுலார் குப்பைகளை உட்கொள்ளும்போது வெளிநாட்டு டிஎன்ஏவைக் குவிக்கும் சுற்றும் பாகோசைட்டுகளில் செறிவூட்டப்படுகிறது என்று நாங்கள் மேலும் கருதுகோள் செய்தோம். ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், பைவால்வ் ஹீமோலிம்ப் ccfDNA என்பது மூலக்கூறு தகவல்களின் தனித்துவமான களஞ்சியமாகும், மேலும் ஒரு செண்டினல் இனமாக அவற்றின் நிலையை வலுப்படுத்துகிறது என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன.
பாக்டீரியாவிலிருந்து பெறப்பட்ட ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA துண்டுகளின் வரிசைப்படுத்தல் மற்றும் பகுப்பாய்வு, ஹோஸ்ட் பாக்டீரியா தாவரங்கள் மற்றும் சுற்றியுள்ள கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்பில் உள்ள பாக்டீரியாக்கள் பற்றிய முக்கிய தகவல்களை வழங்க முடியும் என்பதை எங்கள் தரவு குறிப்பிடுகிறது. ஷாட் சீக்வென்சிங் நுட்பங்கள், வழக்கமான 16S rRNA அடையாள முறைகள் பயன்படுத்தப்பட்டிருந்தால் தவறவிடப்பட்டிருக்கக்கூடிய தொடக்க பாக்டீரியா A. atra gill இன் வரிசைகளை வெளிப்படுத்தியுள்ளன, இதற்கு ஒரு குறிப்பு நூலக சார்பு ஒரு பகுதியாகும். உண்மையில், கெர்குலெனில் உள்ள அதே மஸ்ஸல் அடுக்கில் M. பிளாட்டென்சிஸிலிருந்து சேகரிக்கப்பட்ட LB தரவைப் பயன்படுத்துவது, செவுள்-தொடர்புடைய பாக்டீரியா சிம்பியன்ட்களின் கலவை இரண்டு மஸ்ஸல் இனங்களுக்கும் ஒரே மாதிரியாக இருப்பதைக் காட்டியது (படம். S4, துணைத் தகவல்). இரண்டு மரபணு ரீதியாக வேறுபட்ட மஸ்ஸல்களின் இந்த ஒற்றுமை, கெர்குலெனின் குளிர், கந்தகம் மற்றும் எரிமலை படிவுகளில் பாக்டீரியா சமூகங்களின் கலவையை பிரதிபலிக்கக்கூடும் [55, 56, 57, 58]. போர்ட்-ஓ-பிரான்ஸின் கடற்கரை போன்ற பயோடர்பேட்டட் கடலோரப் பகுதிகளிலிருந்து [59] மஸ்ஸல்களை அறுவடை செய்யும் போது அதிக அளவு கந்தகத்தைக் குறைக்கும் நுண்ணுயிரிகள் நன்கு விவரிக்கப்பட்டுள்ளன. மற்றொரு சாத்தியக்கூறு என்னவென்றால், கிடைமட்ட பரவலால் [60, 61] ஆரம்ப மஸ்ஸல் தாவரங்கள் பாதிக்கப்படலாம். கடல் சூழல், கடலின் மேற்பரப்பு மற்றும் மஸ்ஸல்களில் உள்ள கூட்டுவாழ் பாக்டீரியாக்களின் கலவை ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பைத் தீர்மானிக்க கூடுதல் ஆராய்ச்சி தேவை. இந்த ஆய்வுகள் தற்போது நடந்து வருகின்றன.
ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA இன் நீளம் மற்றும் செறிவு, அதன் சுத்திகரிப்பு எளிமை மற்றும் விரைவான ஷாட்கன் வரிசைமுறையை அனுமதிக்கும் உயர் தரம் ஆகியவை கடல் கடலோர சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் பல்லுயிரியலை மதிப்பிடுவதற்கு மஸ்ஸல் ccfDNA ஐப் பயன்படுத்துவதன் பல நன்மைகளில் சில. கொடுக்கப்பட்ட சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் வைரஸ் சமூகங்களை (வைரோம்கள்) வகைப்படுத்துவதற்கு இந்த அணுகுமுறை மிகவும் பயனுள்ளதாக இருக்கும் [62, 63]. பாக்டீரியா, ஆர்க்கியா மற்றும் யூகாரியோட்டுகள் போலல்லாமல், வைரஸ் மரபணுக்களில் 16S வரிசைகள் போன்ற பைலோஜெனட்டிகல் பாதுகாக்கப்பட்ட மரபணுக்கள் இல்லை. மஸ்ஸல்கள் போன்ற காட்டி இனங்களிலிருந்து வரும் திரவ பயாப்ஸிகள், பொதுவாக கடலோர கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் வசிக்கும் ஹோஸ்ட்களைப் பாதிக்கத் தெரிந்த ஒப்பீட்டளவில் அதிக எண்ணிக்கையிலான ccfDNA வைரஸ் துண்டுகளை அடையாளம் காண பயன்படுத்தப்படலாம் என்பதை எங்கள் முடிவுகள் குறிப்பிடுகின்றன. இதில் புரோட்டோசோவா, ஆர்த்ரோபாட்கள், பூச்சிகள், தாவரங்கள் மற்றும் பாக்டீரியா வைரஸ்கள் (எ.கா., பாக்டீரியோபேஜ்கள்) ஆகியவற்றைப் பாதிக்கத் தெரிந்த வைரஸ்கள் அடங்கும். கெர்குலெனில் உள்ள அதே மஸ்ஸல் அடுக்கில் சேகரிக்கப்பட்ட நீல மஸ்ஸல்களின் (எம். பிளாட்டென்சிஸ்) ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA வைரமை நாங்கள் ஆய்வு செய்தபோது இதேபோன்ற பரவல் கண்டறியப்பட்டது (அட்டவணை S2, துணைத் தகவல்). மனிதர்கள் அல்லது பிற உயிரினங்களின் வைரோம் ஆய்வில் ccfDNA இன் ஷாட்கன் வரிசைமுறை உண்மையில் வேகத்தை அதிகரித்து வரும் ஒரு புதிய அணுகுமுறையாகும் [21, 37, 64]. இரட்டை இழைகள் கொண்ட DNA வைரஸ்களைப் படிப்பதற்கு இந்த அணுகுமுறை மிகவும் பயனுள்ளதாக இருக்கும், ஏனெனில் அனைத்து இரட்டை இழைகள் கொண்ட DNA வைரஸ்களிலும் எந்த ஒரு மரபணுவும் பாதுகாக்கப்படவில்லை, இது பால்டிமோரில் மிகவும் மாறுபட்ட மற்றும் பரந்த வகை வைரஸ்களைக் குறிக்கிறது [65]. இந்த வைரஸ்களில் பெரும்பாலானவை வகைப்படுத்தப்படாமல் உள்ளன மற்றும் வைரஸ் உலகின் முற்றிலும் அறியப்படாத பகுதியிலிருந்து வைரஸ்களை உள்ளடக்கியிருக்கலாம் [66], மஸ்ஸல்ஸ் A. atra மற்றும் M. platensis இன் வைரோம்கள் மற்றும் ஹோஸ்ட் வரம்புகள் இரண்டு இனங்களுக்கு இடையில் வருவதைக் கண்டறிந்தோம். இதேபோல் (படம் S3, கூடுதல் தகவலைப் பார்க்கவும்). இந்த ஒற்றுமை ஆச்சரியமல்ல, ஏனெனில் இது சூழலில் இருக்கும் DNA ஐ எடுத்துக்கொள்வதில் தேர்ந்தெடுக்கும் தன்மை இல்லாததை பிரதிபலிக்கக்கூடும். RNA வைரமை வகைப்படுத்த சுத்திகரிக்கப்பட்ட RNA ஐப் பயன்படுத்தி எதிர்கால ஆய்வுகள் தற்போது தேவைப்படுகின்றன.
எங்கள் ஆய்வில், கோவர்ஸ்கி மற்றும் சக ஊழியர்களின் [37] பணிகளிலிருந்து தழுவி எடுக்கப்பட்ட மிகவும் கடுமையான குழாய்வழியைப் பயன்படுத்தினோம், அவர்கள் பூர்வீக ccfDNA ஐ இணைப்பதற்கு முன்னும் பின்னும் தொகுக்கப்பட்ட வாசிப்புகள் மற்றும் கான்டிஜ்களை இரண்டு-படி நீக்குதலைப் பயன்படுத்தினர், இதன் விளைவாக அதிக விகிதத்தில் வரைபடமாக்கப்படாத வாசிப்புகள் ஏற்பட்டன. எனவே, இந்த வரைபடமாக்கப்படாத வாசிப்புகளில் சில இன்னும் அவற்றின் சொந்த தோற்றத்தைக் கொண்டிருக்கலாம் என்பதை நாங்கள் நிராகரிக்க முடியாது, முதன்மையாக இந்த மஸ்ஸல் இனத்திற்கான குறிப்பு மரபணு எங்களிடம் இல்லாததால். சுய மற்றும் சுயமற்ற வாசிப்புகளுக்கு இடையிலான கைமராக்கள் மற்றும் இல்லுமினா மிசெக் PE75 ஆல் உருவாக்கப்பட்ட வாசிப்பு நீளம் குறித்து நாங்கள் கவலைப்பட்டதால் இந்த குழாய்வழியையும் பயன்படுத்தினோம். பெரும்பாலான பெயரிடப்படாத வாசிப்புகளுக்கு மற்றொரு காரணம், கடல் நுண்ணுயிரிகளில் பெரும்பாலானவை, குறிப்பாக கெர்குலென் போன்ற தொலைதூரப் பகுதிகளில், குறிப்புகள் செய்யப்படவில்லை. ccfDNA துண்டு நீளம் மனித ccfDNA ஐப் போலவே இருப்பதாகக் கருதி, இல்லுமினா மிசெக் PE75 ஐப் பயன்படுத்தினோம். எதிர்கால ஆய்வுகளுக்கு, ஹீமோலிம்ப் ccfDNA மனிதர்கள் மற்றும்/அல்லது பாலூட்டிகளை விட நீண்ட வாசிப்புகளைக் கொண்டுள்ளது என்பதைக் காட்டும் எங்கள் முடிவுகளைக் கருத்தில் கொண்டு, நீண்ட ccfDNA துண்டுகளுக்கு மிகவும் பொருத்தமான வரிசைமுறை தளத்தைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கிறோம். இந்த நடைமுறை ஆழமான பகுப்பாய்விற்கான கூடுதல் அறிகுறிகளை அடையாளம் காண்பதை மிகவும் எளிதாக்கும். தற்போது கிடைக்காத முழுமையான A. atra நியூக்ளியர் மரபணு வரிசையைப் பெறுவது, ccfDNA ஐ சுய மற்றும் சுயமற்ற மூலங்களிலிருந்து வேறுபடுத்துவதை பெரிதும் எளிதாக்கும். திரவ பயாப்ஸி என்ற கருத்தை மஸல்களுக்குப் பயன்படுத்துவதற்கான சாத்தியக்கூறுகளில் எங்கள் ஆராய்ச்சி கவனம் செலுத்தியுள்ளதால், எதிர்கால ஆராய்ச்சியில் இந்தக் கருத்து பயன்படுத்தப்படுவதால், மஸல்களின் நுண்ணுயிர் பன்முகத்தன்மையைப் படிக்க இந்த முறையின் திறனை அதிகரிக்க புதிய கருவிகள் மற்றும் குழாய்கள் உருவாக்கப்படும் என்று நாங்கள் நம்புகிறோம். கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்பு.
ஒரு ஊடுருவாத மருத்துவ உயிரியக்கவியலாளராக, மனித பிளாஸ்மாவில் ccfDNA இன் உயர்ந்த அளவுகள் பல்வேறு நோய்கள், திசு சேதம் மற்றும் மன அழுத்த நிலைமைகளுடன் தொடர்புடையவை [67,68,69]. இந்த அதிகரிப்பு திசு சேதத்திற்குப் பிறகு அதன் சொந்த தோற்றத்தின் DNA துண்டுகள் வெளியிடுவதோடு தொடர்புடையது. கடுமையான வெப்ப அழுத்தத்தைப் பயன்படுத்தி இந்தப் பிரச்சினையை நாங்கள் தீர்த்தோம், இதில் மஸல்கள் 30 °C வெப்பநிலைக்கு சுருக்கமாக வெளிப்படுத்தப்பட்டன. மூன்று சுயாதீன சோதனைகளில் மூன்று வெவ்வேறு வகையான மஸல்களில் இந்த பகுப்பாய்வைச் செய்தோம். இருப்பினும், கடுமையான வெப்ப அழுத்தத்திற்குப் பிறகு ccfDNA அளவுகளில் எந்த மாற்றத்தையும் நாங்கள் காணவில்லை (படம் S5, கூடுதல் தகவலைப் பார்க்கவும்). இந்த கண்டுபிடிப்பு, குறைந்தபட்சம் ஒரு பகுதியாக, மஸல்கள் அரை-திறந்த சுற்றோட்ட அமைப்பைக் கொண்டுள்ளன மற்றும் அவற்றின் அதிக வடிகட்டுதல் செயல்பாடு காரணமாக அதிக அளவு வெளிநாட்டு டிஎன்ஏவைக் குவிக்கின்றன என்பதை விளக்கக்கூடும். மறுபுறம், மஸல்கள், பல முதுகெலும்பில்லாத உயிரினங்களைப் போலவே, மன அழுத்தத்தால் தூண்டப்பட்ட திசு சேதத்திற்கு அதிக எதிர்ப்புத் திறன் கொண்டதாக இருக்கலாம், இதன் மூலம் அவற்றின் ஹீமோலிம்பில் ccfDNA வெளியீட்டைக் கட்டுப்படுத்தலாம் [70, 71].
இன்றுவரை, நீர்வாழ் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் பல்லுயிர் பெருக்கத்தின் டிஎன்ஏ பகுப்பாய்வு முக்கியமாக சுற்றுச்சூழல் டிஎன்ஏ (eDNA) மெட்டாபார்கோடிங்கில் கவனம் செலுத்துகிறது. இருப்பினும், ப்ரைமர்கள் பயன்படுத்தப்படும்போது பல்லுயிர் பகுப்பாய்வில் இந்த முறை பொதுவாக குறைவாகவே உள்ளது. ஷாட்கன் வரிசைமுறையின் பயன்பாடு PCR இன் வரம்புகளையும் ப்ரைமர் செட்களின் சார்புடைய தேர்வையும் மீறுகிறது. எனவே, ஒரு வகையில், எங்கள் முறை சமீபத்தில் பயன்படுத்தப்பட்ட உயர்-செயல்திறன் eDNA ஷாட்கன் வரிசைமுறை முறைக்கு நெருக்கமாக உள்ளது, இது துண்டு துண்டான டிஎன்ஏவை நேரடியாக வரிசைப்படுத்தவும் கிட்டத்தட்ட அனைத்து உயிரினங்களையும் பகுப்பாய்வு செய்யவும் முடியும் [72, 73]. இருப்பினும், நிலையான eDNA முறைகளிலிருந்து LB ஐ வேறுபடுத்தும் பல அடிப்படை சிக்கல்கள் உள்ளன. நிச்சயமாக, eDNA மற்றும் LB க்கு இடையிலான முக்கிய வேறுபாடு இயற்கை வடிகட்டி ஹோஸ்ட்களின் பயன்பாடு ஆகும். eDNA ஐப் படிப்பதற்கான இயற்கை வடிகட்டியாக கடற்பாசிகள் மற்றும் பிவால்வ்கள் (Dresseina spp.) போன்ற கடல் உயிரினங்களைப் பயன்படுத்துவது பதிவாகியுள்ளது [74, 75]. இருப்பினும், டிரீசேனாவின் ஆய்வு டிஎன்ஏ பிரித்தெடுக்கப்பட்ட திசு பயாப்ஸிகளைப் பயன்படுத்தியது. LB இலிருந்து ccfDNA பகுப்பாய்விற்கு திசு பயாப்ஸி, சிறப்பு மற்றும் சில நேரங்களில் விலையுயர்ந்த உபகரணங்கள் மற்றும் eDNA அல்லது திசு பயாப்ஸியுடன் தொடர்புடைய தளவாடங்கள் தேவையில்லை. உண்மையில், LB இலிருந்து ccfDNA ஐ குளிர் சங்கிலியைப் பராமரிக்காமல் FTA ஆதரவுடன் சேமித்து பகுப்பாய்வு செய்ய முடியும் என்று சமீபத்தில் நாங்கள் தெரிவித்தோம், இது தொலைதூரப் பகுதிகளில் ஆராய்ச்சிக்கு ஒரு பெரிய சவாலாகும் [76]. திரவ பயாப்ஸிகளிலிருந்து ccfDNA பிரித்தெடுப்பதும் எளிமையானது மற்றும் ஷாட்கன் வரிசைமுறை மற்றும் PCR பகுப்பாய்விற்கு உயர்தர DNA ஐ வழங்குகிறது. eDNA பகுப்பாய்வோடு தொடர்புடைய சில தொழில்நுட்ப வரம்புகளைக் கருத்தில் கொண்டு இது ஒரு சிறந்த நன்மையாகும் [77]. மாதிரி முறையின் எளிமை மற்றும் குறைந்த செலவு நீண்ட கால கண்காணிப்பு திட்டங்களுக்கும் குறிப்பாக பொருத்தமானது. அவற்றின் உயர் வடிகட்டுதல் திறனுடன் கூடுதலாக, இருவால்வுகளின் மற்றொரு நன்கு அறியப்பட்ட அம்சம் அவற்றின் சளியின் வேதியியல் மியூகோபோலிசாக்கரைடு கலவை ஆகும், இது வைரஸ்களை உறிஞ்சுவதை ஊக்குவிக்கிறது [78, 79]. இது இருவால்வுகளை ஒரு குறிப்பிட்ட நீர்வாழ் சுற்றுச்சூழல் அமைப்பில் பல்லுயிர் மற்றும் காலநிலை மாற்றத்தின் தாக்கத்தை வகைப்படுத்த ஒரு சிறந்த இயற்கை வடிகட்டியாக ஆக்குகிறது. eDNA உடன் ஒப்பிடும்போது ஹோஸ்ட்-பெறப்பட்ட DNA துண்டுகள் இருப்பதை முறையின் வரம்பாகக் காணலாம் என்றாலும், eDNA உடன் ஒப்பிடும்போது அத்தகைய பூர்வீக ccfDNA வைத்திருப்பதற்கான செலவு, சுகாதார ஆய்வுகளுக்குக் கிடைக்கும் பரந்த அளவிலான தகவல்களுக்கு ஒரே நேரத்தில் புரிந்துகொள்ளத்தக்கது. ஆஃப்செட் ஹோஸ்ட். ஹோஸ்ட் ஹோஸ்டின் மரபணுவில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட வைரஸ் வரிசைகளின் இருப்பும் இதில் அடங்கும். பிவால்வ்களில் கிடைமட்டமாக பரவும் லுகேமிக் ரெட்ரோவைரஸ்கள் இருப்பதால், இது மஸல்களுக்கு மிகவும் முக்கியமானது [80, 81]. eDNA ஐ விட LB இன் மற்றொரு நன்மை என்னவென்றால், இது ஹீமோலிம்பில் சுற்றும் இரத்த அணுக்களின் பாகோசைடிக் செயல்பாட்டைப் பயன்படுத்துகிறது, இது நுண்ணுயிரிகளை (மற்றும் அவற்றின் மரபணுக்களை) விழுங்குகிறது. பாகோசைட்டோசிஸ் என்பது பிவால்வ்களில் உள்ள இரத்த அணுக்களின் முக்கிய செயல்பாடாகும் [82]. இறுதியாக, இந்த முறை மஸல்களின் அதிக வடிகட்டுதல் திறன் (சராசரியாக 1.5 l/h கடல் நீர்) மற்றும் இரண்டு நாள் சுழற்சியைப் பயன்படுத்திக் கொள்கிறது, இது கடல் நீரின் வெவ்வேறு அடுக்குகளின் கலவையை அதிகரிக்கிறது, இது ஹீட்டோரோலஜஸ் eDNA ஐப் பிடிக்க அனுமதிக்கிறது. [83, 84]. எனவே, மஸ்ஸல் ccfDNA பகுப்பாய்வு என்பது மஸ்ஸல்களின் ஊட்டச்சத்து, பொருளாதார மற்றும் சுற்றுச்சூழல் தாக்கங்களைக் கருத்தில் கொண்டு ஒரு சுவாரஸ்யமான வழியாகும். மனிதர்களிடமிருந்து சேகரிக்கப்பட்ட LB பகுப்பாய்வைப் போலவே, இந்த முறை வெளிப்புறப் பொருட்களுக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக ஹோஸ்ட் டிஎன்ஏவில் மரபணு மற்றும் எபிஜெனெடிக் மாற்றங்களை அளவிடுவதற்கான சாத்தியத்தையும் திறக்கிறது. எடுத்துக்காட்டாக, நானோபோர் வரிசைமுறையைப் பயன்படுத்தி பூர்வீக ccfDNA இல் மரபணு-அளவிலான மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வைச் செய்ய மூன்றாம் தலைமுறை வரிசைமுறை தொழில்நுட்பங்களை கற்பனை செய்யலாம். மஸ்ஸல் ccfDNA துண்டுகளின் நீளம் நீண்ட படிக்கப்பட்ட வரிசைமுறை தளங்களுடன் சிறந்த முறையில் இணக்கமாக இருப்பதால் இந்த செயல்முறை எளிதாக்கப்பட வேண்டும், இது வேதியியல் மாற்றங்கள் தேவையில்லாமல் ஒற்றை வரிசைமுறையிலிருந்து மரபணு-அளவிலான டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வை இயக்க அனுமதிக்கிறது. 85,86] இது ஒரு சுவாரஸ்யமான சாத்தியமாகும், ஏனெனில் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் வடிவங்கள் சுற்றுச்சூழல் அழுத்தத்திற்கு ஒரு பதிலை பிரதிபலிக்கின்றன மற்றும் பல தலைமுறைகளாக நீடிக்கின்றன என்பது காட்டப்பட்டுள்ளது. எனவே, காலநிலை மாற்றம் அல்லது மாசுபடுத்திகளுக்கு ஆளான பிறகு பதிலை நிர்வகிக்கும் அடிப்படை வழிமுறைகள் பற்றிய மதிப்புமிக்க நுண்ணறிவை இது வழங்க முடியும் [87]. இருப்பினும், LB இன் பயன்பாடு வரம்புகள் இல்லாமல் இல்லை. சுற்றுச்சூழல் அமைப்பில் காட்டி இனங்கள் இருப்பது இதற்குத் தேவை என்று சொல்லத் தேவையில்லை. மேலே குறிப்பிட்டுள்ளபடி, கொடுக்கப்பட்ட சுற்றுச்சூழல் அமைப்பின் பல்லுயிரியலை மதிப்பிடுவதற்கு LB ஐப் பயன்படுத்துவதற்கு மூலத்திலிருந்து DNA துண்டுகள் இருப்பதைக் கணக்கில் எடுத்துக்கொள்ளும் கடுமையான உயிரித் தகவலியல் குழாய் தேவைப்படுகிறது. மற்றொரு பெரிய பிரச்சனை கடல் உயிரினங்களுக்கான குறிப்பு மரபணுக்களின் கிடைக்கும் தன்மை ஆகும். கடல் பாலூட்டி மரபணு திட்டம் மற்றும் சமீபத்தில் நிறுவப்பட்ட Fish10k திட்டம் [88] போன்ற முயற்சிகள் எதிர்காலத்தில் அத்தகைய பகுப்பாய்வை எளிதாக்கும் என்று நம்பப்படுகிறது. கடல் வடிகட்டி-உணவு உயிரினங்களுக்கு LB கருத்தைப் பயன்படுத்துவது வரிசைமுறை தொழில்நுட்பத்தில் சமீபத்திய முன்னேற்றங்களுடன் இணக்கமாக உள்ளது, இது சுற்றுச்சூழல் அழுத்தத்திற்கு பதிலளிக்கும் விதமாக கடல் வாழ்விடங்களின் ஆரோக்கியம் பற்றிய முக்கியமான தகவல்களை வழங்க பல-ஓம் பயோமார்க்ஸர்களின் வளர்ச்சிக்கு மிகவும் பொருத்தமானதாக அமைகிறது.
மரபணு வரிசைமுறை தரவு NCBI வரிசைமுறை வாசிப்பு காப்பகத்தில் https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 இல் பயோபிராஜெக்ட்ஸ் SRR8924808 இன் கீழ் டெபாசிட் செய்யப்பட்டுள்ளது.
பிரையர்லி ஏஎஸ், கிங்ஸ்ஃபோர்ட் எம்ஜே. கடல்வாழ் உயிரினங்கள் மற்றும் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் காலநிலை மாற்றத்தின் தாக்கம். கோல் பயாலஜி. 2009; 19: பி602–பி614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, மற்றும் பலர். காலநிலை மாற்றம் மற்றும் பிற உள்ளூர் அழுத்தங்களின் ஒருங்கிணைந்த தாக்கங்களை கடல் சூழலில் கருத்தில் கொள்ளுங்கள். பொது அறிவியல் சூழல். 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, மற்றும் பலர். ) மார்ச் முதல் அறிவியல். 2020;7:48.
செரோன்ட் எல், நிகாஸ்ட்ரோ சிஆர், சர்டி ஜிஐ, கோபர்வில்லே இ. மீண்டும் மீண்டும் வெப்ப அழுத்த நிலைமைகளின் கீழ் குறைக்கப்பட்ட வெப்ப சகிப்புத்தன்மை நீல மஸல்களின் அதிக கோடைகால இறப்புக்குக் காரணம் என்று விளக்குகிறது. அறிவியல் அறிக்கை 2019; 9:17498.
ஃபே எஸ்.பி., சீபீல்ஸ்கி ஏ.எம்., நஸ்ஸல் எஸ்., செர்வாண்டஸ்-யோஷிடா கே., ஹ்வான் ஜே.எல்., ஹூபர் இ.ஆர்., மற்றும் பலர். விலங்கு இறப்புகளின் அதிர்வெண், காரணங்கள் மற்றும் அளவுகளில் சமீபத்திய மாற்றங்கள். ப்ரோக் நேட்ல் அகாட் சை யுஎஸ்ஏ. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, மற்றும் பலர். பல இனங்கள் அல்லாத குறிப்பிட்ட நோய்க்கிருமிகள் பின்னா நோபிலிஸின் வெகுஜன இறப்பை ஏற்படுத்தியிருக்கலாம். வாழ்க்கை. 2020;10:238.
பிராட்லி எம், கவுட்ஸ் எஸ்.ஜே., ஜென்கின்ஸ் இ, ஓ'ஹாரா டி.எம். ஆர்க்டிக் ஜூனோடிக் நோய்களில் காலநிலை மாற்றத்தின் சாத்தியமான தாக்கம். இன்ட் ஜே சர்க்கம்போலார் ஹெல்த். 2005; 64:468–77.
பேயர் ஜே., கிரீன் NW, ப்ரூக்ஸ் எஸ்., ஆலன் ஐஜே, ரூஸ் ஏ., கோம்ஸ் டி. மற்றும் பலர். கடலோர மாசுபாடு கண்காணிப்பில் சமிக்ஞை உயிரினங்களாக நீல மஸ்ஸல்கள் (மைட்டிலஸ் எடுலிஸ் எஸ்பிபி.): ஒரு மதிப்பாய்வு. மார்ச் சுற்றுச்சூழல் ரெஸ் 2017; 130:338-65.
சிரவெக்னா ஜி, மார்சோனி எஸ், சியனா எஸ், பார்டெல்லி ஏ. புற்றுநோய் சிகிச்சையில் திரவ பயாப்ஸியின் ஒருங்கிணைப்பு. நாட் ரெவ் கிளீன் ஓன்கோல். 2017; 14:531–48.
வான் ஜேசிஎம், மாஸி சி, கார்சியா-கோர்பாச்சோ ஜே, மௌலியர் எஃப், பிரெண்டன் ஜேடி, கால்டாஸ் சி, மற்றும் பலர். திரவ பயாப்ஸி முதிர்ச்சி: கட்டி டிஎன்ஏவை புழக்கத்தில் விட அனுமதிக்கிறது. நாட் ரெவ் புற்றுநோய். 2017;17:223–38.
மண்டேல் பி., மெட்டாய்ஸ் பி. மனித பிளாஸ்மாவில் உள்ள நியூக்ளிக் அமிலங்கள். சோக் பயோல் துணை நிறுவனங்களின் கூட்ட நிமிடங்கள். 1948; 142:241-3.
பிரான்கோர்ஸ்ட் ஏ.ஜே., உங்கரர் டபிள்யூ., ஹோல்டன்ரைடர் எஸ். புற்றுநோய் சிகிச்சைக்கான மூலக்கூறு குறிப்பானாக செல்-இலவச டி.என்.ஏ-விற்கான புதிய பங்கு. பயோமோலார் பகுப்பாய்வின் அளவு. 2019;17:100087.
இக்னாடியாடிஸ் எம்., ஸ்லெட்ஜ் ஜிடபிள்யூ, ஜெஃப்ரி எஸ்எஸ் லிக்விட் பயாப்ஸி கிளினிக்கில் நுழைகிறது - செயல்படுத்தல் சிக்கல்கள் மற்றும் எதிர்கால சவால்கள். நேட் ரெவ் கிளின் ஓன்கோல். 2021; 18:297–312.
லோ ஒய்எம், கோர்பெட்டா என்., சேம்பர்லெய்ன் பிஎஃப், ராய் டபிள்யூ., சார்ஜென்ட் ஐஎல், ரெட்மேன் சிடபிள்யூ மற்றும் பலர். கரு டிஎன்ஏ தாய்வழி பிளாஸ்மா மற்றும் சீரம் ஆகியவற்றில் உள்ளது. லான்செட். 1997; 350:485-7.
முஃபாரே எம்.என்., வோங் ஆர்.ஜே., ஷா ஜி.எம்., ஸ்டீவன்சன் டி.கே., குவேக் எஸ்.ஆர். கர்ப்ப காலத்தில் பெண்களின் இரத்தத்தில் சுற்றும் புற-செல்லுலார் ஆர்.என்.ஏவைப் பயன்படுத்தி கர்ப்பத்தின் போக்கையும் அதன் சிக்கல்களையும் பற்றிய ஆய்வு. டோபீடியாட்ரிக்ஸ். 2020;8:605219.
ஒல்லெரிச் எம், ஷெர்வுட் கே, கியோன் பி, ஷூட்ஸ் இ, பெக் ஜே, ஸ்டெக்பாயர் ஜே, மற்றும் பலர். திரவ பயாப்ஸி: சிறுநீரக ஒட்டுண்ணியில் அலோஜெனிக் புண்களைக் கண்டறிய நன்கொடையாளர் செல் இல்லாத டிஎன்ஏ பயன்படுத்தப்படுகிறது. நாட் ரெவ் நெஃப்ரோல். 2021; 17:591–603.
ஜுவான் எஃப்சி, லோ ஒய்எம் மகப்பேறுக்கு முற்பட்ட நோயறிதலில் புதுமைகள்: தாய்வழி பிளாஸ்மா மரபணு வரிசைமுறை. அன்னா எம்டி. 2016;67:419-32.
கு டபிள்யூ, டெங் எக்ஸ், லீ எம், சுகு ஒய்டி, அரேவலோ எஸ், ஸ்ட்ரைக் டி, மற்றும் பலர். பாதிக்கப்பட்ட உடல் திரவங்களின் அடுத்த தலைமுறை மெட்டஜெனோமிக் வரிசைமுறையுடன் விரைவான நோய்க்கிருமி கண்டறிதல். நாட் மெடிசின். 2021;27:115-24.
இடுகை நேரம்: ஆகஸ்ட்-14-2022
