Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி.நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவி பதிப்பில் CSS ஆதரவு குறைவாக உள்ளது.சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்).இதற்கிடையில், தொடர்ந்து ஆதரவை உறுதிப்படுத்த, தளத்தை ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் வழங்குவோம்.
திரவ பயாப்ஸி (LB) என்பது உயிரியல் மருத்துவ துறையில் வேகமாக பிரபலமடைந்து வரும் ஒரு கருத்தாகும்.இந்த கருத்து முக்கியமாக சுற்றும் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் டிஎன்ஏ (சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ) துண்டுகளை கண்டறிவதை அடிப்படையாகக் கொண்டது, அவை முக்கியமாக பல்வேறு திசுக்களில் செல் இறந்த பிறகு சிறிய துண்டுகளாக வெளியிடப்படுகின்றன.இந்த துண்டுகளின் ஒரு சிறிய பகுதி வெளிநாட்டு (வெளிநாட்டு) திசுக்கள் அல்லது உயிரினங்களிலிருந்து உருவாகிறது.தற்போதைய வேலையில், அதிக கடல்நீரை வடிகட்டுதல் திறனுக்காக அறியப்பட்ட செண்டினல் இனமான மஸ்ஸல்களுக்கு இந்தக் கருத்தைப் பயன்படுத்தியுள்ளோம்.கடல் கரையோர சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளின் பல்லுயிர் தன்மை பற்றிய தகவல்களை வழங்க பல்வேறு ஆதாரங்களில் இருந்து சுற்றுச்சூழல் டிஎன்ஏ துண்டுகளை கைப்பற்ற இயற்கை வடிகட்டிகளாக செயல்படும் மஸ்ஸல்களின் திறனைப் பயன்படுத்துகிறோம்.மஸ்ஸல் ஹீமோலிம்ப் 1 முதல் 5 கிபி வரை அளவுகளில் பெரிதும் மாறுபடும் டிஎன்ஏ துண்டுகளைக் கொண்டுள்ளது என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன.ஏராளமான டிஎன்ஏ துண்டுகள் வெளிநாட்டு நுண்ணுயிர் தோற்றம் கொண்டவை என்பதை ஷாட்கன் வரிசைமுறை காட்டுகிறது.அவற்றில், கடலோர கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் பொதுவாகக் காணப்படும் பல்வேறு புரவலர்களைப் பாதிக்கும் வைரஸ்கள் உட்பட பாக்டீரியா, ஆர்க்கியா மற்றும் வைரஸ்களிலிருந்து DNA துண்டுகளைக் கண்டறிந்தோம்.முடிவில், மஸ்ஸல்களுக்குப் பயன்படுத்தப்படும் எல்பி என்ற கருத்து, கடல் கரையோர சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் நுண்ணுயிர் பன்முகத்தன்மை பற்றிய அறிவின் வளமான ஆனால் இன்னும் ஆராயப்படாத ஆதாரத்தைக் குறிக்கிறது என்பதை எங்கள் ஆய்வு நிரூபிக்கிறது.
கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளின் பல்லுயிரியலில் காலநிலை மாற்றத்தின் தாக்கம் (CC) வேகமாக வளர்ந்து வரும் ஆராய்ச்சி பகுதியாகும்.புவி வெப்பமடைதல் முக்கியமான உடலியல் அழுத்தங்களை ஏற்படுத்துவது மட்டுமல்லாமல், கடல் உயிரினங்களின் வெப்ப நிலைத்தன்மையின் பரிணாம வரம்புகளைத் தள்ளுகிறது, பல உயிரினங்களின் வாழ்விடத்தை பாதிக்கிறது, மேலும் சாதகமான நிலைமைகளைத் தேடத் தூண்டுகிறது [1, 2].மெட்டாசோவான்களின் பல்லுயிரியலைப் பாதிப்பதோடு, ஹோஸ்ட்-நுண்ணுயிர் தொடர்புகளின் நுட்பமான சமநிலையை சிசி சீர்குலைக்கிறது.இந்த நுண்ணுயிர் டிஸ்பாக்டீரியோசிஸ் கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளுக்கு கடுமையான அச்சுறுத்தலை ஏற்படுத்துகிறது, ஏனெனில் இது கடல் உயிரினங்களை தொற்று நோய்க்கிருமிகளுக்கு மிகவும் எளிதில் பாதிக்கிறது [3, 4].வெகுஜன இறப்புகளில் SS முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது என்று நம்பப்படுகிறது, இது உலகளாவிய கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளை நிர்வகிப்பதற்கான ஒரு தீவிர பிரச்சனையாகும் [5, 6].பல கடல் உயிரினங்களின் பொருளாதார, சுற்றுச்சூழல் மற்றும் ஊட்டச்சத்து தாக்கங்களைக் கருத்தில் கொண்டு இது ஒரு முக்கியமான பிரச்சினை.துருவப் பகுதிகளில் வாழும் பிவால்வ்களுக்கு இது குறிப்பாக உண்மை, அங்கு CK இன் விளைவுகள் மிகவும் உடனடி மற்றும் கடுமையானவை [6, 7].உண்மையில், மைட்டிலஸ் எஸ்பிபி போன்ற இருவால்கள்.கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் CC இன் விளைவுகளை கண்காணிக்க பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.அவற்றின் ஆரோக்கியத்தைக் கண்காணிக்க ஒப்பீட்டளவில் அதிக எண்ணிக்கையிலான பயோமார்க்ஸர்கள் உருவாக்கப்பட்டதில் ஆச்சரியமில்லை, பெரும்பாலும் இரண்டு அடுக்கு அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்தி, நொதி செயல்பாடு அல்லது செல் நம்பகத்தன்மை மற்றும் பாகோசைடிக் செயல்பாடு [8] போன்ற செல்லுலார் செயல்பாடுகளின் அடிப்படையில் செயல்பாட்டு பயோமார்க்ஸர்களை உள்ளடக்கியது.இந்த முறைகளில் அதிக அளவு கடல் நீரை உறிஞ்சிய பிறகு மென்மையான திசுக்களில் குவியும் குறிப்பிட்ட அழுத்தம் குறிகாட்டிகளின் செறிவு அளவீடும் அடங்கும்.இருப்பினும், அதிக வடிகட்டுதல் திறன் மற்றும் பிவால்வுகளின் அரை-திறந்த சுற்றோட்ட அமைப்பு ஆகியவை நோயாளி நிர்வாகத்திற்கான எளிய மற்றும் குறைந்த ஊடுருவும் அணுகுமுறையான திரவ பயாப்ஸி (LB) என்ற கருத்தைப் பயன்படுத்தி புதிய ஹீமோலிம்ப் பயோமார்க்ஸர்களை உருவாக்குவதற்கான வாய்ப்பை வழங்குகிறது.இரத்த மாதிரிகள் [9, 10].மனித எல்பியில் பல வகையான சுற்றும் மூலக்கூறுகள் காணப்பட்டாலும், இந்தக் கருத்து முதன்மையாக பிளாஸ்மாவில் சுற்றும் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் டிஎன்ஏ (சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ) துண்டுகளின் டிஎன்ஏ வரிசைமுறை பகுப்பாய்வை அடிப்படையாகக் கொண்டது.உண்மையில், மனித பிளாஸ்மாவில் சுற்றும் டிஎன்ஏ இருப்பது 20 ஆம் நூற்றாண்டின் நடுப்பகுதியில் இருந்து அறியப்படுகிறது [11], ஆனால் சமீபத்திய ஆண்டுகளில் தான் உயர்-செயல்திறன் வரிசைமுறை முறைகளின் வருகை ccfDNA அடிப்படையில் மருத்துவ நோயறிதலுக்கு வழிவகுத்தது.இந்த சுற்றும் டிஎன்ஏ துண்டுகள் இருப்பது, உயிரணு இறப்பிற்குப் பிறகு மரபணு டிஎன்ஏ (நியூக்ளியர் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல்) செயலற்ற வெளியீட்டின் ஒரு பகுதியாகும். ஆரோக்கியமான நபர்களில், ccfDNA இன் செறிவு பொதுவாக குறைவாக இருக்கும் (<10 ng/mL) ஆனால் பல்வேறு நோய்களால் பாதிக்கப்பட்ட அல்லது மன அழுத்தத்திற்கு உள்ளான நோயாளிகளில் 5-10 மடங்கு அதிகரிக்கலாம், இதன் விளைவாக திசு சேதம் ஏற்படுகிறது. ஆரோக்கியமான நபர்களில், ccfDNA இன் செறிவு பொதுவாக குறைவாக இருக்கும் (<10 ng/mL) ஆனால் பல்வேறு நோய்களால் பாதிக்கப்பட்ட அல்லது மன அழுத்தத்திற்கு உள்ளான நோயாளிகளில் 5-10 மடங்கு அதிகரிக்கலாம், இதன் விளைவாக திசு சேதம் ஏற்படுகிறது. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5-10 в 5-10 NOY PATOLOGIей или подвергающихся Stressu, privodyashemu к повреждению tkaney. ஆரோக்கியமான மக்களில், cccDNA இன் செறிவு பொதுவாக குறைவாக இருக்கும் (<10 ng/mL), ஆனால் இது பல்வேறு நோய்க்குறியீடுகள் உள்ள நோயாளிகளில் அல்லது திசு சேதத்திற்கு வழிவகுக்கும் மன அழுத்தத்தில் 5-10 மடங்கு அதிகரிக்கும்.மேலும் -10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 , ccfdna增加 5-10 倍 , 从而 组 织。 。ccfDNA நெறிமுறைகள் (<10 ng/ml) nыmy patologiyami ili stressom, CHTO ப்ரிவோடிட் கே பொவ்ரேஜ்டெனியூ ட்கனேய். ஆரோக்கியமான நபர்களில் ccfDNA செறிவுகள் பொதுவாக குறைவாக இருக்கும் (<10 ng/ml), ஆனால் பல்வேறு நோய்க்குறியியல் அல்லது மன அழுத்தம் உள்ள நோயாளிகளில் 5-10 மடங்கு அதிகரிக்கலாம், இதன் விளைவாக திசு சேதம் ஏற்படுகிறது.ccfDNA துண்டுகளின் அளவு பரவலாக மாறுபடும், ஆனால் பொதுவாக 150 முதல் 200 bp வரை இருக்கும்.[12].சுயமாக பெறப்பட்ட ccfDNA பகுப்பாய்வு, அதாவது, சாதாரண அல்லது மாற்றப்பட்ட ஹோஸ்ட் செல்களிலிருந்து ccfDNA, அணுக்கரு மற்றும்/அல்லது மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணுவில் இருக்கும் மரபணு மற்றும் எபிஜெனெடிக் மாற்றங்களைக் கண்டறியப் பயன்படுகிறது, இதன் மூலம் மருத்துவர்களுக்கு குறிப்பிட்ட மூலக்கூறு-இலக்கு சிகிச்சைகளைத் தேர்ந்தெடுக்க உதவுகிறது [13] .இருப்பினும், ccfDNA ஐ ccfDNA போன்ற வெளிநாட்டு மூலங்களிலிருந்து கர்ப்ப காலத்தில் கரு உயிரணுக்களிலிருந்து அல்லது மாற்று உறுப்புகளிலிருந்து [14,15,16,17] பெறலாம்.ccfDNA ஒரு தொற்று முகவரின் (வெளிநாட்டு) நியூக்ளிக் அமிலங்களின் இருப்பைக் கண்டறிவதற்கான ஒரு முக்கிய தகவல் ஆதாரமாகும், இது இரத்த கலாச்சாரங்களால் அடையாளம் காணப்படாத பரவலான தொற்றுகளை ஊடுருவாமல் கண்டறிய அனுமதிக்கிறது, பாதிக்கப்பட்ட திசுக்களின் ஆக்கிரமிப்பு பயாப்ஸியைத் தவிர்க்கிறது [18].சமீபத்திய ஆய்வுகள் உண்மையில் மனித இரத்தத்தில் வைரஸ் மற்றும் பாக்டீரியா நோய்க்கிருமிகளைக் கண்டறியப் பயன்படும் தகவல்களின் வளமான ஆதாரம் உள்ளது என்றும், மனித பிளாஸ்மாவில் காணப்படும் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏவில் சுமார் 1% வெளிநாட்டு தோற்றம் கொண்டது என்றும் காட்டுகின்றன [19].ccfDNA பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி ஒரு உயிரினத்தின் சுற்றும் நுண்ணுயிரியின் பல்லுயிர்த்தன்மையை மதிப்பிட முடியும் என்பதை இந்த ஆய்வுகள் நிரூபிக்கின்றன.இருப்பினும், சமீப காலம் வரை, இந்த கருத்து மனிதர்களில் பிரத்தியேகமாக பயன்படுத்தப்பட்டது மற்றும் குறைந்த அளவிற்கு, பிற முதுகெலும்புகளில் [20, 21].
தற்போதைய தாளில், 35 மில்லியன் ஆண்டுகளுக்கு முன்பு உருவான ஒரு பெரிய பீடபூமியின் மேல் உள்ள தீவுகளின் குழுவான சபாண்டார்டிக் கெர்குலென் தீவுகளில் பொதுவாகக் காணப்படும் தெற்கு இனமான ஆலகோமியா அட்ராவின் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏவை பகுப்பாய்வு செய்ய எல்பி திறனைப் பயன்படுத்துகிறோம்.எரிமலை வெடிப்பு.இன் விட்ரோ பரிசோதனை முறையைப் பயன்படுத்தி, கடல்நீரில் உள்ள டிஎன்ஏ துண்டுகள் மஸ்ஸல்களால் விரைவாக எடுக்கப்பட்டு ஹீமோலிம்ப் பெட்டிக்குள் நுழைவதைக் கண்டறிந்தோம்.மஸ்ஸல் ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ அதன் சொந்த மற்றும் சுயமற்ற தோற்றம் கொண்ட டிஎன்ஏ துண்டுகளை கொண்டுள்ளது என்பதை ஷாட்கன் சீக்வென்சிங் காட்டுகிறது, இதில் சிம்பயோடிக் பாக்டீரியா மற்றும் குளிர் எரிமலை கடல் கரையோர சுற்றுச்சூழலின் பொதுவான உயிரியங்களில் இருந்து டிஎன்ஏ துண்டுகள் அடங்கும்.ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ பல்வேறு ஹோஸ்ட் வரம்புகளைக் கொண்ட வைரஸ்களிலிருந்து பெறப்பட்ட வைரஸ் தொடர்களையும் கொண்டுள்ளது.எலும்பு மீன், கடல் அனிமோன்கள், பாசிகள் மற்றும் பூச்சிகள் போன்ற பல்லுயிர் விலங்குகளின் டிஎன்ஏ துண்டுகளையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம்.முடிவில், கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் வளமான மரபணு திறனை உருவாக்க கடல் முதுகெலும்பில்லாதவர்களுக்கு எல்பி கருத்தை வெற்றிகரமாகப் பயன்படுத்த முடியும் என்பதை எங்கள் ஆய்வு நிரூபிக்கிறது.
பெரியவர்கள் (55-70 மிமீ நீளம்) மைட்டிலஸ் பிளாட்டென்சிஸ் (எம். பிளாடென்சிஸ்) மற்றும் ஆலகோம்யா அட்ரா (ஏ. அட்ரா) போர்ட்-ஓ-பிரான்ஸின் இடைப்பட்ட பாறைக் கரையிலிருந்து (049°21.235 எஸ், 070°13.490 ஈ.) சேகரிக்கப்பட்டது.டிசம்பர் 2018 இல் Kerguelen Islands. மற்ற வயதுவந்த நீல மட்டிகள் (Mytilus spp.) வணிக சப்ளையர் (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) ஒருவரிடமிருந்து பெறப்பட்டு, 10-20 L 32‰ செயற்கை உப்புநீரைக் கொண்ட வெப்பநிலை கட்டுப்படுத்தப்பட்ட (4°C) காற்றோட்டமான தொட்டியில் வைக்கப்பட்டது.(செயற்கை கடல் உப்பு ரீஃப் கிரிஸ்டல், உடனடி கடல், வர்ஜீனியா, அமெரிக்கா).ஒவ்வொரு சோதனைக்கும், தனிப்பட்ட குண்டுகளின் நீளம் மற்றும் எடை அளவிடப்பட்டது.
இந்த திட்டத்திற்கான இலவச திறந்த அணுகல் நெறிமுறை ஆன்லைனில் கிடைக்கிறது (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).சுருக்கமாக, எல்பி ஹீமோலிம்ப் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி கடத்தல் தசைகளிலிருந்து சேகரிக்கப்பட்டது [22].ஹீமோலிம்ப் 3 நிமிடங்களுக்கு 1200×g இல் மையவிலக்கு மூலம் தெளிவுபடுத்தப்பட்டது.சிஎஃப்டிஎன்ஏவை தனிமைப்படுத்துவதற்கும் சுத்திகரிப்பதற்கும், உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி மாதிரிகள் (1.5-2.0 மிலி) நியூக்ளியோஸ்னாப் சிஎஃப்டிஎன்ஏ கிட் (மச்செரி-நாகல், பெத்லஹென், பிஏ) ஐப் பயன்படுத்தி கரைக்கப்பட்டு செயலாக்கப்பட்டன.ccfDNA மேலும் பகுப்பாய்வு செய்யும் வரை -80 ° C இல் சேமிக்கப்பட்டது.சில சோதனைகளில், ccfDNA QIAamp DNA இன்வெஸ்டிகேட்டர் கிட் (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada) பயன்படுத்தி தனிமைப்படுத்தப்பட்டு சுத்திகரிக்கப்பட்டது.ஒரு நிலையான PicoGreen மதிப்பீட்டைப் பயன்படுத்தி சுத்திகரிக்கப்பட்ட DNA அளவிடப்பட்டது.தனிமைப்படுத்தப்பட்ட ccfDNA யின் துண்டு விநியோகம், உயர் உணர்திறன் டிஎன்ஏ கிட்டைப் பயன்படுத்தி அஜிலன்ட் 2100 பயோஅனாலைசர் (அஜிலன்ட் டெக்னாலஜிஸ் இன்க்., சாண்டா கிளாரா, CA) ஐப் பயன்படுத்தி கேபிலரி எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி ccfDNA மாதிரியின் 1 µl ஐப் பயன்படுத்தி மதிப்பீடு செய்யப்பட்டது.
ஹீமோலிம்ப் ccfDNA துண்டுகளை வரிசைப்படுத்த, Génome Québec (மாண்ட்ரீல், கியூபெக், கனடா) Illumina MiSeq PE75 கிட்டின் இல்லுமினா டிஎன்ஏ மிக்ஸ் கிட்டைப் பயன்படுத்தி ஷாட்கன் நூலகங்களைத் தயாரித்தது.ஒரு நிலையான அடாப்டர் (BioO) பயன்படுத்தப்பட்டது.NCBI வரிசை வாசிப்பு காப்பகத்தில் (SRR8924808 மற்றும் SRR8924809) மூல தரவு கோப்புகள் கிடைக்கின்றன.அடிப்படை வாசிப்புத் தரம் FastQC ஐப் பயன்படுத்தி மதிப்பிடப்பட்டது [23].டிரிமோமேட்டிக் [24] அடாப்டர்களை கிளிப்பிங் செய்வதற்கும் தரம் குறைந்த வாசிப்புக்கும் பயன்படுத்தப்படுகிறது.ஜோடி முனைகளுடன் கூடிய ஷாட்கன் ரீட்கள் பொருந்தாததைத் தவிர்க்க குறைந்தபட்சம் 20 பிபி ஒன்றுடன் ஒன்று நீண்ட ஒற்றை வாசிப்புகளாக ஃப்ளாஷ் இணைக்கப்பட்டது [25]. பிவால்வ் NCBI வகைபிரித்தல் தரவுத்தளத்தைப் (e மதிப்பு <1e−3 மற்றும் 90% ஹோமோலஜி) பயன்படுத்தி BLASTN உடன் இணைக்கப்பட்ட வாசிப்புகள் சிறுகுறிப்பு செய்யப்பட்டன, மேலும் DUST ஐப் பயன்படுத்தி குறைந்த-சிக்கலான வரிசைகளை மறைத்தல் [26] செய்யப்பட்டது. பிவால்வ் NCBI வகைபிரித்தல் தரவுத்தளத்தைப் (e மதிப்பு <1e−3 மற்றும் 90% ஹோமோலஜி) பயன்படுத்தி BLASTN உடன் இணைக்கப்பட்ட வாசிப்புகள் சிறுகுறிப்பு செய்யப்பட்டன, மேலும் DUST ஐப் பயன்படுத்தி குறைந்த-சிக்கலான வரிசைகளை மறைத்தல் [26] செய்யப்பட்டது. ஒலிபெருக்கிகள் BI (பொதுவான இ <1e-3 மற்றும் 90% கோமோலோஜி), ஒரு மாஸ்கிரோவனி போஸ்லேடோவட்டேல் நியோஸ்டெயி டிஸ்கொய் сложности 26]. NCBI bivalve வகைபிரித்தல் தரவுத்தளத்தைப் (e மதிப்பு <1e-3 மற்றும் 90% ஹோமோலஜி) பயன்படுத்தி BLASTN உடன் பூல் செய்யப்பட்ட ரீட்கள் சிறுகுறிப்பு செய்யப்பட்டன, மேலும் DUST ஐப் பயன்படுத்தி குறைந்த சிக்கலான வரிசை மறைத்தல் செய்யப்பட்டது [26].நீங்கள் NCBI低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类复杂度序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽ஒலிபெருக்கிகள் என்சிபிஐ தூசி [26]. NCBI பைவால்வ் வகைபிரித்தல் தரவுத்தளத்தைப் (e மதிப்பு <1e-3 மற்றும் 90% ஹோமோலஜி) பயன்படுத்தி BLASTN உடன் பூல் செய்யப்பட்ட வாசிப்புகள் சிறுகுறிப்பு செய்யப்பட்டன, மேலும் DUST ஐப் பயன்படுத்தி குறைந்த சிக்கலான வரிசை மறைத்தல் செய்யப்பட்டது [26].வாசிப்புகள் இரண்டு குழுக்களாகப் பிரிக்கப்பட்டன: பிவால்வ் தொடர்களுடன் தொடர்புடையது (இங்கு சுய வாசிப்பு என்று அழைக்கப்படுகிறது) மற்றும் தொடர்பில்லாதது (சுய-வாசிப்புகள் அல்லாதது).இரண்டு குழுக்கள் தனித்தனியாக MEGAHIT ஐப் பயன்படுத்தி கான்டிஜ்களை உருவாக்குகின்றன [27].இதற்கிடையில், ஏலியன் நுண்ணுயிர் வாசிப்புகளின் வகைபிரித்தல் விநியோகம் கிராகன்2 [28] ஐப் பயன்படுத்தி வகைப்படுத்தப்பட்டது மற்றும் கேலக்ஸி [29, 30] இல் உள்ள க்ரோனா பை விளக்கப்படத்தால் வரைபடமாக குறிப்பிடப்படுகிறது.எங்கள் பூர்வாங்க சோதனைகளில் இருந்து உகந்த கிலோமீட்டர்கள் kmers-59 என தீர்மானிக்கப்பட்டது. BLASTN (பிவால்வ் NCBI தரவுத்தளம், e மதிப்பு <1e−10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) உடன் சீரமைப்பதன் மூலம் சுய கான்டிஜ்கள் இறுதி சிறுகுறிப்புக்காக அடையாளம் காணப்பட்டன. BLASTN (பிவால்வ் NCBI தரவுத்தளம், e மதிப்பு <1e−10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) உடன் சீரமைப்பதன் மூலம் சுய கான்டிஜ்கள் இறுதி சிறுகுறிப்புக்காக அடையாளம் காணப்பட்டன. கேத்தம் சோப்ஸ்ட்வென்னி கான்டிகி பைலி ஐடென்டிஃபிசிரோவனி புடெம் சோபோஸ்டாவ்லேனியா மற்றும் பிளாஸ்ட்ன் ение e <1e-10 மற்றும் 60%) для окончательной аннотации. BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 மற்றும் 60% homology) உடன் இறுதி சிறுகுறிப்புக்காக பொருத்துவதன் மூலம் சுய-கான்டிஜ்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别軏别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% கேத்தம் பைலி ஐடெண்டிஃபிட்கள் для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 மற்றும் 60% homology) உடன் பொருத்துவதன் மூலம் இறுதி சிறுகுறிப்புக்காக சுய-கான்டிஜ்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன. இணையாக, BLASTN (nt NCBI தரவுத்தளம், e மதிப்பு <1e−10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) உடன் சுயமரியாதை குழு கான்டிஜ்கள் சிறுகுறிப்பு செய்யப்பட்டன. இணையாக, BLASTN (nt NCBI தரவுத்தளம், e மதிப்பு <1e−10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) உடன் சுயமரியாதை குழு கான்டிஜ்கள் சிறுகுறிப்பு செய்யப்பட்டன. பாரல்லெல்னோ சுஜெரோட்னி க்ரூப்போவ் கான்டிகி பிலி அன்னோடிரோவனி எஸ் போமோஷியு பிளாஸ்ட்ன் (பாசா டான்சி nt NCBI, 10 60%). இணையாக, BLASTN (NT NCBI தரவுத்தளம், e மதிப்பு <1e-10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) உடன் வெளிநாட்டு குழு கான்டிஜ்கள் சிறுகுறிப்பு செய்யப்பட்டன.平行地, NCBI平行地, NCBI பரல்லல்னோ காண்டிகி, சப்ஸ்ட்வென்னோய் க்ரூப்பே இல்லை <1e-10 и гомология 60%). இணையாக, BLASTN (nt NCBI தரவுத்தளம், இ மதிப்பு <1e-10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) உடன் சுய குழு அல்லாத கான்டிஜ்கள் சிறுகுறிப்பு செய்யப்பட்டன. nr மற்றும் RefSeq புரதம் NCBI தரவுத்தளங்கள் (e மதிப்பு <1e−10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி BLASTX ஆனது nonself contigகளிலும் நடத்தப்பட்டது. nr மற்றும் RefSeq புரதம் NCBI தரவுத்தளங்கள் (e மதிப்பு <1e−10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி BLASTX ஆனது nonself contigகளிலும் நடத்தப்பட்டது. BLASTX TAKJE BYL ப்ரோவேடனில் NESAMOSTOYATELINYH CONTIGAH SE ISPOLIZOVANIEM BAZ dannыh belka nr-Nr-10 ஒலோஜியா 60%). nr மற்றும் RefSeq NCBI புரதத் தரவுத்தளங்களைப் (e மதிப்பு <1e-10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) பயன்படுத்தி சுயமில்லாத கான்டிஜ்களிலும் BLASTX செய்யப்பட்டது.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI BLASTX டெக்ஜெக் 60%). nr மற்றும் RefSeq NCBI புரதத் தரவுத்தளங்களைப் (e மதிப்பு <1e-10 மற்றும் 60% ஹோமோலஜி) பயன்படுத்தி சுயமில்லாத கான்டிஜ்களிலும் BLASTX செய்யப்பட்டது.BLASTN மற்றும் BLASTX பூல்ஸ் அல்லாத சுய-கான்டிஜ்கள் இறுதிப் பகுதிகளைக் குறிக்கின்றன (துணைக் கோப்பைப் பார்க்கவும்).
PCR க்கு பயன்படுத்தப்படும் ப்ரைமர்கள் அட்டவணை S1 இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன.ccfDNA இலக்கு மரபணுக்களை பெருக்க Taq DNA பாலிமரேஸ் (பயோ பேசிக் கனடா, Markham, ON) பயன்படுத்தப்பட்டது.பின்வரும் எதிர்வினை நிலைமைகள் பயன்படுத்தப்பட்டன: 3 நிமிடங்களுக்கு 95 ° C, 1 நிமிடத்திற்கு 95 ° C, அனீலிங் வெப்பநிலையை 1 நிமிடம், 72 ° C இல் 1 நிமிடத்திற்கு நீட்டித்தல், 35 சுழற்சிகள் மற்றும் இறுதியாக 10 நிமிடங்களுக்குள் 72 ° C..PCR தயாரிப்புகள் 95 V இல் SYBRTM சேஃப் டிஎன்ஏ ஜெல் ஸ்டைன் (இன்விட்ரஜன், பர்லிங்டன், ஆன், கனடா) கொண்ட அகரோஸ் ஜெல்களில் (1.5%) எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் பிரிக்கப்பட்டன.
மஸ்ஸல்ஸ் (Mytilus spp.) 500 மில்லி ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட கடல் நீரில் (32 PSU) 24 மணிநேரத்திற்கு 4 ° C இல் பழக்கப்படுத்தப்பட்டது.மனித கலெக்டின்-7 cDNA வரிசையை (NCBI அணுகல் எண் L07769) குறியாக்கம் செய்யும் ஒரு செருகலைக் கொண்ட பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ 190 μg/μl என்ற இறுதி செறிவில் குப்பியில் சேர்க்கப்பட்டது.டிஎன்ஏ சேர்க்காமல் அதே நிலைமைகளின் கீழ் அடைகாக்கப்பட்ட மஸ்ஸல்கள் கட்டுப்பாட்டில் இருந்தன.மூன்றாவது கட்டுப்பாட்டு தொட்டியில் மட்டிகள் இல்லாமல் டிஎன்ஏ இருந்தது.கடல்நீரில் டிஎன்ஏ தரத்தை கண்காணிக்க, ஒவ்வொரு தொட்டியிலிருந்தும் குறிப்பிட்ட நேரத்தில் கடல்நீர் மாதிரிகள் (20 μl; மூன்று முறை) எடுக்கப்பட்டன.பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ டிரேசபிலிட்டிக்காக, எல்பி மஸ்ஸல்கள் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட நேரத்தில் அறுவடை செய்யப்பட்டு qPCR மற்றும் ddPCR ஆல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.கடல்நீரில் அதிக உப்பு இருப்பதால், அனைத்து PCR மதிப்பீடுகளுக்கும் முன்னதாகவே அலிகோட்கள் PCR தர நீரில் (1:10) நீர்த்தப்பட்டன.
டிஜிட்டல் துளி PCR (ddPCR) BioRad QX200 நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி (மிசிசாகா, ஒன்டாரியோ, கனடா) செய்யப்பட்டது.உகந்த வெப்பநிலையைத் தீர்மானிக்க வெப்பநிலை சுயவிவரத்தைப் பயன்படுத்தவும் (அட்டவணை S1).QX200 துளி ஜெனரேட்டரை (பயோராட்) பயன்படுத்தி துளிகள் உருவாக்கப்பட்டன.ddPCR பின்வருமாறு மேற்கொள்ளப்பட்டது: 5 நிமிடங்களுக்கு 95 ° C, 30 வினாடிகளுக்கு 95 ° C இன் 50 சுழற்சிகள் மற்றும் கொடுக்கப்பட்ட அனீலிங் வெப்பநிலை 1 நிமிடம் மற்றும் 72 ° C 30 வினாடிகள், 4 ° C 5 நிமிடம் மற்றும் 90 ° C 5 நிமிடங்களுக்குள்.துளிகள் மற்றும் நேர்மறை எதிர்வினைகளின் எண்ணிக்கை (நகல்கள் எண்ணிக்கை/µl) QX200 டிராப் ரீடரை (பயோராட்) பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது.10,000 துளிகளுக்கும் குறைவான மாதிரிகள் நிராகரிக்கப்பட்டன.ஒவ்வொரு முறை ddPCR இயக்கப்படும்போதும் பேட்டர்ன் கட்டுப்பாடு செய்யப்படவில்லை.
qPCR ஆனது Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) மற்றும் LGALS7 குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டது.QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) ஐப் பயன்படுத்தி அனைத்து அளவு PCRகளும் 20 μl இல் செய்யப்பட்டன.qPCR ஆனது 95°C வெப்பநிலையில் 15 நிமிட அடைகாப்புடன் தொடங்கப்பட்டது, அதன்பின் 40 சுழற்சிகள் 95°C இல் 10 வினாடிகள் மற்றும் 60 விநாடிகளுக்கு 60°C இல் ஒரு தரவு சேகரிப்புடன் தொடங்கப்பட்டது.5 வினாடிகளுக்கு 95 டிகிரி செல்சியஸ், 60 வினாடிகளுக்கு 65 டிகிரி செல்சியஸ் மற்றும் qPCR இன் முடிவில் 97 டிகிரி செல்சியஸ் என அடுத்தடுத்த அளவீடுகளைப் பயன்படுத்தி உருகும் வளைவுகள் உருவாக்கப்பட்டன.கட்டுப்பாட்டு மாதிரிகள் தவிர, ஒவ்வொரு qPCR மூன்று மடங்காக செய்யப்பட்டது.
மட்டிகள் அதிக வடிகட்டுதல் விகிதத்திற்கு பெயர் பெற்றவை என்பதால், கடல்நீரில் இருக்கும் டிஎன்ஏ துண்டுகளை வடிகட்டவும் தக்கவைத்துக்கொள்ளவும் முடியுமா என்பதை நாங்கள் முதலில் ஆராய்ந்தோம்.இந்த துண்டுகள் அவற்றின் அரை-திறந்த நிணநீர் அமைப்பில் குவிகின்றனவா என்பதில் நாங்கள் ஆர்வமாக இருந்தோம்.நீல மஸ்ஸல் தொட்டிகளில் சேர்க்கப்பட்ட கரையக்கூடிய டிஎன்ஏ துண்டுகளின் தலைவிதியை கண்டுபிடிப்பதன் மூலம் இந்த சிக்கலை நாங்கள் சோதனை ரீதியாக தீர்த்தோம்.டிஎன்ஏ துண்டுகளைக் கண்காணிப்பதை எளிதாக்க, மனித கலெக்டின்-7 மரபணுவைக் கொண்ட வெளிநாட்டு (சுயமாக அல்ல) பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏவைப் பயன்படுத்தினோம்.ddPCR கடல் நீர் மற்றும் மட்டிகளில் உள்ள பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ துண்டுகளை கண்டுபிடிக்கிறது.கடல் நீரில் உள்ள டிஎன்ஏ துண்டுகளின் அளவு மட்டி இல்லாத நிலையில் (7 நாட்கள் வரை) ஒப்பீட்டளவில் நிலையானதாக இருந்தால், மஸ்ஸல்களின் முன்னிலையில் இந்த நிலை 8 மணி நேரத்திற்குள் முற்றிலும் மறைந்துவிடும் என்று எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன (படம் 1a,b).வெளிப்புற டிஎன்ஏவின் துண்டுகள் 15 நிமிடங்களுக்குள் ஊடுருவல் திரவம் மற்றும் ஹீமோலிம்ப் (படம் 1c) ஆகியவற்றில் எளிதில் கண்டறியப்பட்டது.இந்த துண்டுகள் வெளிப்பட்ட பிறகும் 4 மணிநேரம் வரை கண்டறியப்படலாம்.டிஎன்ஏ துண்டுகளைப் பொறுத்து இந்த வடிகட்டுதல் செயல்பாடு பாக்டீரியா மற்றும் பாசிகளின் வடிகட்டுதல் நடவடிக்கையுடன் ஒப்பிடத்தக்கது [31].இந்த முடிவுகள் மஸ்ஸல்கள் தங்கள் திரவப் பெட்டிகளில் வெளிநாட்டு டிஎன்ஏவை வடிகட்டலாம் மற்றும் குவிக்கலாம் என்று கூறுகின்றன.
கடல்நீரில் உள்ள பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏவின் ஒப்பீட்டு செறிவுகள் (A) அல்லது மஸ்ஸல் இல்லாமை (B) இல், ddPCR மூலம் அளவிடப்படுகிறது.A இல், முடிவுகள் சதவீதங்களாக வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன, பெட்டிகளின் எல்லைகள் 75வது மற்றும் 25வது சதவீதங்களைக் குறிக்கும்.பொருத்தப்பட்ட மடக்கை வளைவு சிவப்பு நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது, மேலும் சாம்பல் நிறத்தில் நிழலாடிய பகுதி 95% நம்பிக்கை இடைவெளியைக் குறிக்கிறது.B இல், சிவப்புக் கோடு சராசரியைக் குறிக்கிறது மற்றும் நீலக் கோடு செறிவுக்கான 95% நம்பிக்கை இடைவெளியைக் குறிக்கிறது.C பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏவைச் சேர்த்த பிறகு வெவ்வேறு நேரங்களில் மஸ்ஸல்களின் ஹீமோலிம்ப் மற்றும் வால்வுலர் திரவத்தில் பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ குவிதல்.முடிவுகள் கண்டறியப்பட்ட முழுமையான நகல்களாக வழங்கப்படுகின்றன/mL (±SE).
அடுத்து, மட்டுப்படுத்தப்பட்ட மானுடவியல் செல்வாக்கு கொண்ட தீவுகளின் தொலைதூரக் குழுவான கெர்குலென் தீவுகளில் உள்ள மஸ்ஸல் படுக்கைகளில் இருந்து சேகரிக்கப்பட்ட மஸ்ஸல்களில் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ தோற்றம் குறித்து ஆராய்ந்தோம்.இந்த நோக்கத்திற்காக, மனித cccDNA [32, 33] சுத்திகரிக்க பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் முறைகளால் மஸ்ஸல் ஹீமோலிம்ப்களில் இருந்து cccDNA தனிமைப்படுத்தப்பட்டு சுத்திகரிக்கப்பட்டது.மஸ்ஸல்களில் சராசரி ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ செறிவுகள் ஒரு மில்லி ஹீமோலிம்ப் வரம்பில் குறைந்த மைக்ரோகிராம்களில் இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (அட்டவணை S2, துணைத் தகவலைப் பார்க்கவும்).செறிவுகளின் இந்த வரம்பு ஆரோக்கியமான நபர்களை விட அதிகமாக உள்ளது (ஒரு மில்லிலிட்டருக்கு குறைந்த நானோகிராம்கள்), ஆனால் அரிதான சந்தர்ப்பங்களில், புற்றுநோய் நோயாளிகளில், ccfDNA இன் அளவு ஒரு மில்லிலிட்டருக்கு பல மைக்ரோகிராம்களை எட்டும் [34, 35].ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏவின் அளவு விநியோகத்தின் பகுப்பாய்வு, இந்த துண்டுகள் 1000 பிபி முதல் 1000 பிபி வரை அளவுகளில் பெரிதும் வேறுபடுகின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது.5000 bp வரை (படம் 2).சிலிக்கா அடிப்படையிலான QIAamp இன்வெஸ்டிகேட்டர் கிட்டைப் பயன்படுத்தி இதே போன்ற முடிவுகள் பெறப்பட்டன, இது தடயவியல் அறிவியலில் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் முறையானது, ccfDNA [36] உட்பட குறைந்த செறிவு DNA மாதிரிகளிலிருந்து மரபணு DNAவை விரைவாகத் தனிமைப்படுத்தி சுத்திகரிக்க பயன்படுகிறது.
மஸ்ஸல் ஹீமோலிம்பின் பிரதிநிதி ccfDNA எலக்ட்ரோபோரேகிராம்.நியூக்ளியோஸ்னாப் பிளாஸ்மா கிட் (மேல்) மற்றும் QIAamp DNA இன்வெஸ்டிகேட்டர் கிட் மூலம் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது.பி வயலின் சதி, மஸ்ஸல்களில் ஹீமோலிம்ப் ccfDNA செறிவுகளின் (±SE) பரவலைக் காட்டுகிறது.கருப்பு மற்றும் சிவப்பு கோடுகள் முறையே சராசரி மற்றும் முதல் மற்றும் மூன்றாவது காலாண்டுகளைக் குறிக்கின்றன.
மனிதர்கள் மற்றும் விலங்குகளில் தோராயமாக 1% ccfDNA வெளிநாட்டு மூலத்தைக் கொண்டுள்ளது [21, 37].பிவால்வுகளின் அரை-திறந்த சுற்றோட்ட அமைப்பு, நுண்ணுயிர் நிறைந்த கடல் நீர் மற்றும் மஸ்ஸல் ccfDNA இன் அளவு விநியோகம் ஆகியவற்றைக் கருத்தில் கொண்டு, மஸ்ஸல் ஹீமோலிம்ப் ccfDNA நுண்ணுயிர் டிஎன்ஏவின் வளமான மற்றும் மாறுபட்ட தொகுப்பைக் கொண்டிருக்கலாம் என்று நாங்கள் கருதுகிறோம்.இந்தக் கருதுகோளைச் சோதிக்க, கெர்குலென் தீவுகளில் இருந்து சேகரிக்கப்பட்ட ஆலகோம்யா அட்ரா மாதிரிகளிலிருந்து ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏவை வரிசைப்படுத்தினோம், 10 மில்லியனுக்கும் அதிகமான வாசிப்புகளைக் கொடுத்தோம், அதில் 97.6% தரக் கட்டுப்பாட்டை நிறைவேற்றியது.BLASTN மற்றும் NCBI பிவால்வ் தரவுத்தளங்களைப் பயன்படுத்தி சுய மற்றும் சுயமற்ற ஆதாரங்களின்படி அளவீடுகள் வகைப்படுத்தப்பட்டன (படம். S1, துணைத் தகவல்).
மனிதர்களில், அணு மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் DNA இரண்டையும் இரத்த ஓட்டத்தில் வெளியிடலாம் [38].இருப்பினும், தற்போதைய ஆய்வில், A. அட்ரா மரபணு வரிசைப்படுத்தப்படவில்லை அல்லது விவரிக்கப்படவில்லை என்பதால், மஸ்ஸல்களின் அணுக்கரு மரபணு டிஎன்ஏவை விரிவாக விவரிக்க முடியவில்லை.எவ்வாறாயினும், பைவால்வ் நூலகத்தைப் பயன்படுத்தி எங்கள் சொந்த தோற்றத்தின் பல ccfDNA துண்டுகளை அடையாளம் காண முடிந்தது (படம். S2, துணைத் தகவல்).வரிசைப்படுத்தப்பட்ட அந்த A. அட்ரா மரபணுக்களின் இயக்கிய PCR பெருக்கத்தின் மூலம் எங்கள் சொந்த தோற்றத்தின் DNA துண்டுகள் இருப்பதையும் உறுதி செய்தோம் (படம் 3).இதேபோல், A. அட்ராவின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணு பொது தரவுத்தளங்களில் கிடைக்கிறது, A. அட்ராவின் ஹீமோலிம்பில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் ccfDNA துண்டுகள் இருப்பதற்கான ஆதாரங்களைக் காணலாம்.பிசிஆர் பெருக்கம் (படம் 3) மூலம் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ துண்டுகள் இருப்பது உறுதி செய்யப்பட்டது.
பல்வேறு மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணுக்கள் A. அட்ராவின் ஹீமோலிம்பில் இருந்தன (சிவப்பு புள்ளிகள் - பங்கு எண்: SRX5705969) மற்றும் M. பிளாடென்சிஸ் (நீல புள்ளிகள் - பங்கு எண்: SRX5705968) PCR ஆல் பெருக்கப்பட்டது.பிரெட்டன் மற்றும் பலர், 2011 பி எஃப்.டி.ஏ தாளில் சேமிக்கப்பட்ட A. அட்ராவிலிருந்து ஹீமோலிம்ப் சூப்பர்நேட்டண்டின் பெருக்கம்.PCR கலவையைக் கொண்ட PCR குழாயில் நேரடியாகச் சேர்க்க 3 மிமீ பஞ்சைப் பயன்படுத்தவும்.
கடல் நீரில் ஏராளமான நுண்ணுயிர் உள்ளடக்கம் இருப்பதால், ஹீமோலிம்பில் உள்ள நுண்ணுயிர் டிஎன்ஏ வரிசைகளின் குணாதிசயத்தில் நாங்கள் ஆரம்பத்தில் கவனம் செலுத்தினோம்.இதைச் செய்ய, நாங்கள் இரண்டு வெவ்வேறு உத்திகளைப் பயன்படுத்துகிறோம்.BLAST மற்றும் பிற கருவிகளுடன் ஒப்பிடக்கூடிய துல்லியத்துடன் நுண்ணுயிர் வரிசைகளை அடையாளம் காணக்கூடிய ஒரு அல்காரிதம் அடிப்படையிலான வரிசை வகைப்பாடு நிரலான Kraken2 ஐப் பயன்படுத்தியது முதல் மூலோபாயம் [28].6719 க்கும் மேற்பட்ட வாசிப்புகள் பாக்டீரியா தோற்றம் என்று தீர்மானிக்கப்பட்டது, அதே சமயம் 124 மற்றும் 64 முறையே ஆர்க்கியா மற்றும் வைரஸ்கள் (படம் 4).ஃபிர்மிகியூட்ஸ் (46%), புரோட்டியோபாக்டீரியா (27%), மற்றும் பாக்டீராய்டுகள் (17%) (படம் 4a) ஆகியவை மிக அதிகமான பாக்டீரியா டிஎன்ஏ துண்டுகள்.இந்த விநியோகம் கடல் நீல மஸ்ஸல் நுண்ணுயிரியின் முந்தைய ஆய்வுகளுடன் ஒத்துப்போகிறது [39, 40].காமாப்ரோட்டியோபாக்டீரியா என்பது புரோட்டியோபாக்டீரியாவின் முக்கிய வகுப்பாகும் (44%), இதில் பல விப்ரியோனல்கள் (படம் 4 பி) அடங்கும்.ddPCR முறை A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41] இன் ccfDNA இல் Vibrio DNA துண்டுகள் இருப்பதை உறுதிப்படுத்தியது.ccfDNA இன் பாக்டீரியா தோற்றம் பற்றிய கூடுதல் தகவல்களைப் பெற, கூடுதல் அணுகுமுறை எடுக்கப்பட்டது (படம். S2, துணைத் தகவல்). இந்த வழக்கில், ஒன்றுடன் ஒன்று இணைக்கப்பட்ட ரீட்கள் ஜோடி-இறுதி வாசிப்புகளாகச் சேகரிக்கப்பட்டு, BLASTN மற்றும் 1e−3 இன் மின் மதிப்பு மற்றும் > 90% ஹோமோலஜியைப் பயன்படுத்தி சுய (பிவால்வ்ஸ்) அல்லது சுயமற்ற தோற்றம் என வகைப்படுத்தப்படுகின்றன. இந்த வழக்கில், ஒன்றுடன் ஒன்று இணைக்கப்பட்ட ரீட்கள் ஜோடி-இறுதி வாசிப்புகளாகச் சேகரிக்கப்பட்டு, BLASTN மற்றும் 1e−3 இன் மின் மதிப்பு மற்றும் > 90% ஹோமோலஜியைப் பயன்படுத்தி சுய (பிவால்வ்ஸ்) அல்லது சுயமற்ற தோற்றம் என வகைப்படுத்தப்படுகின்றன. எடோம் ஸ்லுச்சே பெரெக்ரிவசியஸ் சட்டீனியா பைலி சோப்ரானி காக் செக்டெனியா எஸ் பார்னிமி கோன்சமி மற்றும் பைலி கிளாஸ்ஸிஸ் ye (டிவஸ்போர்ச்சட் மோலிஸ்கி) அல்லது சுசி போ ப்ரோயிஸ்ஹோட்டெனியூ எஸ் இஸ்போல்சோவனிம் பிளாஸ்ட்ன் மற்றும் ஜானசெனியா இ 1இ-3 0% இந்த வழக்கில், ஒன்றுடன் ஒன்று இணைக்கப்பட்ட வாசிப்புகளாக சேகரிக்கப்பட்டு, BLASTN மற்றும் e மதிப்பு 1e-3 மற்றும் கட்ஆஃப் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி நேட்டிவ் (பிவால்வ்) அல்லது அசல் அல்லாதவை என வகைப்படுத்தப்பட்டன.மேலும்分类为自身（双壳类）或非自身来源。மேலும் 0% 同源性 的 分类 自身 எடோம் ஸ்லுச்சே பெரெக்ரிவயுசிய சட்டீனியா பைலி சோப்ரானி காக் செட்னியா எஸ் பார்னிமி கோன்சமி மற்றும் கிளாசிவ்ஸ் உஸ்ட்வோர்ச்சட் மோலிஸ்கி) அல்லது நேசோப்ஸ்ட்வென்னி போ ப்ரோயிஸ்ஹோஜெடனியூ எஸ் இஸ்போல்சோவனிம் சாசனம் மற்றும் பிளாஸ்ட்ன் மற்றும் 1e-3. இந்த வழக்கில், ஒன்றுடன் ஒன்று இணைக்கப்பட்ட ரீட்களாக சேகரிக்கப்பட்டு, சொந்தமாக (பிவால்வ்ஸ்) அல்லது அசல் அல்லாதவை என e BLASTN மற்றும் 1e-3 மதிப்புகள் மற்றும் ஹோமோலஜி வரம்பு >90% ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி வகைப்படுத்தப்பட்டது.A. atra மரபணு இன்னும் வரிசைப்படுத்தப்படாததால், MEGAHIT நெக்ஸ்ட் ஜெனரேஷன் சீக்வென்சிங் (NGS) அசெம்பிளரின் டி நோவோ அசெம்பிளி உத்தியைப் பயன்படுத்தினோம்.மொத்தம் 147,188 கான்டிஜ்கள் பிறப்பிடத்தை சார்ந்து (பிவால்வ்ஸ்) அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளன.BLASTN மற்றும் BLASTX ஐப் பயன்படுத்தி 1e-10 மின் மதிப்புகளுடன் இந்த கான்டிஜ்கள் வெடித்தன.இந்த மூலோபாயம் A. atra ccfDNA இல் உள்ள 482 பிவால்வ் அல்லாத துண்டுகளை அடையாளம் காண அனுமதித்தது.இந்த டிஎன்ஏ துண்டுகளில் பாதிக்கும் மேற்பட்டவை (57%) பாக்டீரியாவிலிருந்து பெறப்பட்டன, முக்கியமாக சல்போட்ரோபிக் சிம்பியன்ட்கள் உட்பட கில் சிம்பியன்ட்கள் மற்றும் கில் சிம்பியன்ட்களான சோலேமியா வேலம் (படம் 5) ஆகியவற்றிலிருந்து.
வகை மட்டத்தில் ஒப்பீட்டு மிகுதி.B இரண்டு முக்கிய பைலாவின் நுண்ணுயிர் பன்முகத்தன்மை (உறுதிகள் மற்றும் புரோட்டியோபாக்டீரியா).ddPCR C Vibrio spp இன் பிரதிநிதித்துவ பெருக்கம்.A. மூன்று அட்ரா ஹீமோலிம்ப்களில் உள்ள 16S rRNA மரபணுவின் (நீலம்) துண்டுகள்.
மொத்தம் 482 சேகரிக்கப்பட்ட கான்டிஜ்கள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.மெட்டஜெனோமிக் கான்டிக் சிறுகுறிப்புகளின் (புரோகாரியோட்டுகள் மற்றும் யூகாரியோட்டுகள்) வகைபிரித்தல் விநியோகத்தின் பொதுவான விவரம்.பி BLASTN மற்றும் BLASTX ஆல் அடையாளம் காணப்பட்ட பாக்டீரியா டிஎன்ஏ துண்டுகளின் விரிவான விநியோகம்.
கிராகன்2 பகுப்பாய்வு, மஸ்ஸல் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏவில் தொல்பொருள் டிஎன்ஏ துண்டுகள் இருப்பதாகவும், யூரியார்சியோட்டா (65%), கிரெனார்சியோட்டா (24%), மற்றும் தார்மார்ச்சியோட்டா (11%) (படம் 6a) ஆகியவற்றின் டிஎன்ஏ துண்டுகள் அடங்கும்.கலிஃபோர்னிய மஸ்ஸல்களின் நுண்ணுயிர் சமூகத்தில் முன்னர் கண்டறியப்பட்ட யூரியார்சியோட்டா மற்றும் கிரெனார்சியோட்டா ஆகியவற்றிலிருந்து பெறப்பட்ட டிஎன்ஏ துண்டுகள் இருப்பது ஆச்சரியத்தை ஏற்படுத்தாது [42].Euryarchaeota பெரும்பாலும் தீவிர நிலைமைகளுடன் தொடர்புடையது என்றாலும், Euryarchaeota மற்றும் Crenarcheota இரண்டும் கடல்சார் கிரையோஜெனிக் சூழலில் மிகவும் பொதுவான புரோகாரியோட்டுகளில் உள்ளன என்பது இப்போது அங்கீகரிக்கப்பட்டுள்ளது [43, 44].மஸ்ஸல்களில் மெத்தனோஜெனிக் நுண்ணுயிரிகள் இருப்பது ஆச்சரியமல்ல, கெர்குலென் பீடபூமி [45] மற்றும் கெர்குலென் தீவுகளின் கரையோரத்தில் காணப்பட்ட நுண்ணுயிர் மீத்தேன் உற்பத்தி சாத்தியமானது [46].
டிஎன்ஏ வைரஸ்களின் வாசிப்புகளுக்கு எங்கள் கவனம் திரும்பியது.எங்கள் அறிவின் மிகச்சிறந்த வகையில், இது மட்டிகளின் வைரஸ் உள்ளடக்கம் பற்றிய முதல் இலக்கற்ற ஆய்வு ஆகும்.எதிர்பார்த்தபடி, பாக்டீரியோபேஜ்களின் டிஎன்ஏ துண்டுகளை (காடோவைரல்ஸ்) கண்டுபிடித்தோம் (படம் 6 பி).இருப்பினும், மிகவும் பொதுவான வைரஸ் டிஎன்ஏ, நியூக்ளியோசைட்டோவைரஸ்களின் ஃபைலத்திலிருந்து வருகிறது, இது நியூக்ளியர் சைட்டோபிளாஸ்மிக் பெரிய டிஎன்ஏ வைரஸ் (என்சிஎல்டிவி) என்றும் அழைக்கப்படுகிறது, இது எந்த வைரஸின் மிகப்பெரிய மரபணுவையும் கொண்டுள்ளது.இந்த தொகுதிக்குள், பெரும்பாலான DNA வரிசைகள் Mimimidoviridae (58%) மற்றும் Poxviridae (21%) குடும்பங்களைச் சேர்ந்தவை, இவற்றின் இயற்கையான புரவலன்கள் முதுகெலும்புகள் மற்றும் கணுக்காலிகள் அடங்கும், அதே சமயம் இந்த DNA வரிசைகளில் ஒரு சிறிய பகுதி அறியப்பட்ட வைராலஜிக்கல் ஆல்காவைச் சேர்ந்தது.கடல் யூகாரியோடிக் ஆல்காவை பாதிக்கிறது.அறியப்பட்ட எந்த வைரஸ் வகைகளிலும் மிகப்பெரிய மரபணு அளவைக் கொண்ட மாபெரும் வைரஸான பண்டோரா வைரஸிலிருந்தும் வரிசைகள் பெறப்பட்டன.சுவாரஸ்யமாக, ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ வரிசைமுறையால் தீர்மானிக்கப்பட்ட வைரஸால் பாதிக்கப்பட்டதாக அறியப்பட்ட ஹோஸ்ட்களின் வரம்பு ஒப்பீட்டளவில் பெரியதாக இருந்தது (படம் எஸ் 3, துணைத் தகவல்).இதில் Baculoviridae மற்றும் Iridoviridae போன்ற பூச்சிகளை பாதிக்கும் வைரஸ்கள், அமீபா, பாசிகள் மற்றும் முதுகெலும்புகளை பாதிக்கும் வைரஸ்களும் அடங்கும்.பித்தோவைரஸ் சைபெரிகம் மரபணுவுடன் பொருந்தக்கூடிய தொடர்களையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம்.பிட்டோவைரஸ்கள் ("ஜாம்பி வைரஸ்கள்" என்றும் அழைக்கப்படுகின்றன) சைபீரியாவில் 30,000 ஆண்டுகள் பழமையான பெர்மாஃப்ரோஸ்டில் இருந்து முதலில் தனிமைப்படுத்தப்பட்டன [47].எனவே, இந்த வைரஸ்களின் அனைத்து நவீன இனங்களும் அழிந்துவிடவில்லை [48] மற்றும் இந்த வைரஸ்கள் தொலைதூர சபார்க்டிக் கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் இருக்கலாம் என்பதைக் காட்டும் முந்தைய அறிக்கைகளுடன் எங்கள் முடிவுகள் ஒத்துப்போகின்றன.
இறுதியாக, மற்ற பல்லுயிர் விலங்குகளிடமிருந்து டிஎன்ஏ துண்டுகளை கண்டுபிடிக்க முடியுமா என்று சோதித்தோம்.nt, nr மற்றும் RefSeq நூலகங்களுடன் (மரபணு மற்றும் புரதம்) BLASTN மற்றும் BLASTX ஆல் மொத்தம் 482 வெளிநாட்டு கான்டிஜ்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன.பலசெல்லுலார் விலங்குகளின் ccfDNA இன் வெளிநாட்டுத் துண்டுகள் மத்தியில் எலும்பு எலும்புகளின் DNA முதன்மையானது (படம் 5) என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன.பூச்சிகள் மற்றும் பிற இனங்களின் DNA துண்டுகளும் கண்டுபிடிக்கப்பட்டுள்ளன.டிஎன்ஏ துண்டுகளின் ஒப்பீட்டளவில் பெரிய பகுதி அடையாளம் காணப்படவில்லை, ஒருவேளை நிலப்பரப்பு இனங்களுடன் ஒப்பிடும்போது மரபணு தரவுத்தளங்களில் அதிக எண்ணிக்கையிலான கடல் உயிரினங்களின் குறைவான பிரதிநிதித்துவம் காரணமாக இருக்கலாம் [49].
தற்போதைய தாளில், ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ ஷாட் சீக்வென்சிங் கடல் கரையோர சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளின் கலவையைப் பற்றிய நுண்ணறிவை வழங்க முடியும் என்று வாதிடுவதன் மூலம், மஸ்ஸல்களுக்கு எல்பி கருத்தைப் பயன்படுத்துகிறோம்.குறிப்பாக, 1) மஸ்ஸல் ஹீமோலிம்பில் ஒப்பீட்டளவில் பெரிய (~1-5 kb) டிஎன்ஏ துண்டுகள் புழக்கத்தில் உள்ள ஒப்பீட்டளவில் அதிக செறிவுகள் (மைக்ரோகிராம் அளவுகள்) இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம்;2) இந்த டிஎன்ஏ துண்டுகள் சுயாதீனமானவை மற்றும் சுயாதீனமற்றவை 3) இந்த டிஎன்ஏ துண்டுகளின் வெளிநாட்டு ஆதாரங்களில், பாக்டீரியா, தொல்பொருள் மற்றும் வைரஸ் டிஎன்ஏ மற்றும் பிற பல்லுயிர் விலங்குகளின் டிஎன்ஏ ஆகியவற்றைக் கண்டறிந்தோம்;4) ஹீமோலிம்பில் இந்த வெளிநாட்டு ccfDNA துண்டுகளின் குவிப்பு விரைவாக நிகழ்கிறது மற்றும் மஸ்ஸல்களின் உள் வடிகட்டுதல் செயல்பாட்டிற்கு பங்களிக்கிறது.முடிவில், உயிரியல் மருத்துவத் துறையில் இதுவரை முக்கியமாகப் பயன்படுத்தப்பட்ட LB என்ற கருத்து, செண்டினல் இனங்கள் மற்றும் அவற்றின் சுற்றுச்சூழலுக்கு இடையிலான தொடர்புகளை நன்கு புரிந்துகொள்ளப் பயன்படும் வளமான ஆனால் ஆராயப்படாத அறிவின் ஆதாரத்தை குறியீடாக்குகிறது என்பதை எங்கள் ஆய்வு நிரூபிக்கிறது.
விலங்குகளுக்கு கூடுதலாக, எலிகள், நாய்கள், பூனைகள் மற்றும் குதிரைகள் [50, 51, 52] உள்ளிட்ட பாலூட்டிகளிலும் ccfDNA தனிமைப்படுத்தப்பட்டதாகப் புகாரளிக்கப்பட்டுள்ளது.எவ்வாறாயினும், எங்கள் அறிவைப் பொறுத்தவரை, திறந்த சுழற்சி அமைப்புடன் கடல் உயிரினங்களில் ccfDNA ஐக் கண்டறிந்து வரிசைப்படுத்துவதை எங்கள் ஆய்வு முதலில் தெரிவிக்கிறது.இந்த உடற்கூறியல் அம்சம் மற்றும் மஸ்ஸல்களின் வடிகட்டுதல் திறன் ஆகியவை, மற்ற உயிரினங்களுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​டிஎன்ஏ துண்டுகள் புழக்கத்தில் இருக்கும் வெவ்வேறு அளவு பண்புகளை விளக்கலாம்.மனிதர்களில், இரத்தத்தில் சுற்றும் பெரும்பாலான டிஎன்ஏ துண்டுகள் 150 முதல் 200 பிபி வரையிலான சிறிய துண்டுகளாகும்.அதிகபட்சமாக 167 பிபி [34, 53].டிஎன்ஏ துண்டுகளின் சிறிய ஆனால் குறிப்பிடத்தக்க பகுதியானது 300 மற்றும் 500 பிபி அளவில் இருக்கும், மேலும் சுமார் 5% 900 பிபியை விட நீளமானது.[54].இந்த அளவு விநியோகத்திற்கான காரணம் என்னவென்றால், பிளாஸ்மாவில் உள்ள ccfDNA இன் முக்கிய ஆதாரமானது உயிரணு இறப்பின் விளைவாக ஏற்படுகிறது, உயிரணு இறப்பு அல்லது ஆரோக்கியமான நபர்களில் இரத்த ஓட்டம் செல்களின் நசிவு காரணமாக அல்லது புற்றுநோயாளிகளின் கட்டி உயிரணுக்களின் அப்போப்டொசிஸ் (சுழற்சி கட்டி டிஎன்ஏ என அழைக்கப்படுகிறது)., ctDNA).மஸ்ஸல்களில் நாம் கண்டறிந்த ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏவின் அளவு விநியோகம் 1000 முதல் 5000 பிபி வரை இருந்தது, இது மஸ்ஸல் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ வேறுபட்ட தோற்றத்தைக் கொண்டுள்ளது என்று கூறுகிறது.இது ஒரு தர்க்கரீதியான கருதுகோள், ஏனெனில் மஸ்ஸல்கள் அரை-திறந்த வாஸ்குலர் அமைப்பைக் கொண்டிருப்பதால், நுண்ணுயிர் மரபணு DNAவின் அதிக செறிவுகளைக் கொண்ட கடல் நீர்வாழ் சூழலில் வாழ்கின்றன.உண்மையில், எக்ஸோஜனஸ் டிஎன்ஏவைப் பயன்படுத்தி எங்களின் ஆய்வகச் சோதனைகள், மஸ்ஸல்கள் டிஎன்ஏ துண்டுகளை கடல்நீரில் குவிப்பதைக் காட்டுகின்றன, குறைந்தபட்சம் சில மணிநேரங்களுக்குப் பிறகு அவை செல்லுலார் எடுத்துக்கொண்ட பிறகு மற்றும்/அல்லது வெளியிடப்பட்ட மற்றும்/அல்லது பல்வேறு நிறுவனங்களில் சேமிக்கப்பட்ட பிறகு சிதைந்துவிடும்.உயிரணுக்களின் அரிதான தன்மையைக் கருத்தில் கொண்டு (புரோகாரியோடிக் மற்றும் யூகாரியோடிக் இரண்டும்), இன்ட்ராவால்வுலர் பெட்டிகளைப் பயன்படுத்துவது சுய-ஆதாரங்களிலிருந்தும் வெளிநாட்டு மூலங்களிலிருந்தும் ccfDNA அளவைக் குறைக்கும்.பிவால்வ் உள்ளார்ந்த நோய் எதிர்ப்பு சக்தி மற்றும் அதிக எண்ணிக்கையிலான சுற்றும் பாகோசைட்டுகளின் முக்கியத்துவத்தைக் கருத்தில் கொண்டு, நுண்ணுயிரிகள் மற்றும்/அல்லது செல்லுலார் குப்பைகளை உட்கொள்வதன் மூலம் வெளிநாட்டு டிஎன்ஏவைக் குவிக்கும் பாகோசைட்டுகளில் வெளிநாட்டு ccfDNA கூட செறிவூட்டப்பட்டுள்ளது என்று நாங்கள் மேலும் அனுமானித்தோம்.ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், பிவால்வ் ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ என்பது மூலக்கூறு தகவலின் தனித்துவமான களஞ்சியமாகும் மற்றும் செண்டினல் இனமாக அவற்றின் நிலையை வலுப்படுத்துகிறது என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன.
பாக்டீரியாவால் பெறப்பட்ட ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ துண்டுகளை வரிசைப்படுத்துவதும் பகுப்பாய்வு செய்வதும் ஹோஸ்ட் பாக்டீரியா தாவரங்கள் மற்றும் சுற்றியுள்ள கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்பில் இருக்கும் பாக்டீரியாக்கள் பற்றிய முக்கிய தகவல்களை வழங்க முடியும் என்பதை எங்கள் தரவு குறிப்பிடுகிறது.ஷாட் சீக்வென்சிங் நுட்பங்கள், ஏ. அட்ரா கில்லின் ஆரம்ப பாக்டீரியாவின் தொடர்களை வெளிப்படுத்தியுள்ளன, இது வழக்கமான 16 எஸ் ஆர்ஆர்என்ஏ அடையாள முறைகளைப் பயன்படுத்தியிருந்தால், ஒரு குறிப்பிட்ட நூலக சார்பு காரணமாக தவறவிடப்பட்டிருக்கும்.உண்மையில், கெர்குலெனில் உள்ள அதே மஸ்ஸல் அடுக்கில் உள்ள எம். பிளாடென்சிஸிலிருந்து சேகரிக்கப்பட்ட எல்பி தரவை நாங்கள் பயன்படுத்துவது, இரண்டு மட்டி இனங்களுக்கும் (படம். எஸ் 4, துணைத் தகவல்) கில்-தொடர்புடைய பாக்டீரியா சிம்பியன்ட்களின் கலவை ஒரே மாதிரியாக இருப்பதைக் காட்டுகிறது.இரண்டு மரபணு ரீதியாக வேறுபட்ட மஸ்ஸல்களின் இந்த ஒற்றுமை, கெர்குலெனின் [55, 56, 57, 58] குளிர், கந்தகம் மற்றும் எரிமலை வைப்புகளில் பாக்டீரியா சமூகங்களின் கலவையை பிரதிபலிக்கக்கூடும்.கந்தகத்தைக் குறைக்கும் நுண்ணுயிரிகளின் அதிக அளவுகள், போர்ட்-ஓ-பிரான்ஸ் கடற்கரை போன்ற உயிரி டர்பேட்டட் கடலோரப் பகுதிகளிலிருந்து [59] மஸ்ஸல்களை அறுவடை செய்யும் போது நன்கு விவரிக்கப்பட்டுள்ளன.மற்றொரு சாத்தியம் என்னவென்றால், ஆரம்ப மஸ்ஸல் தாவரங்கள் கிடைமட்ட பரிமாற்றத்தால் பாதிக்கப்படலாம் [60, 61].கடல் சூழல், கடல் தரை மேற்பரப்பு மற்றும் மஸ்ஸல்களில் உள்ள சிம்பயோடிக் பாக்டீரியாவின் கலவை ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பைத் தீர்மானிக்க கூடுதல் ஆராய்ச்சி தேவை.இந்த ஆய்வுகள் தற்போது நடந்து வருகின்றன.
ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏவின் நீளம் மற்றும் செறிவு, அதன் சுத்திகரிப்பு எளிமை, மற்றும் விரைவான ஷாட்கன் வரிசைமுறையை அனுமதிக்கும் உயர் தரம் ஆகியவை கடல் கரையோர சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் பல்லுயிரியலை மதிப்பிடுவதற்கு மஸ்ஸல் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏவைப் பயன்படுத்துவதன் பல நன்மைகளில் சில.கொடுக்கப்பட்ட சுற்றுச்சூழல் அமைப்பில் வைரஸ் சமூகங்களை (வைரோம்கள்) வகைப்படுத்துவதற்கு இந்த அணுகுமுறை மிகவும் பயனுள்ளதாக இருக்கும் [62, 63].பாக்டீரியா, ஆர்க்கியா மற்றும் யூகாரியோட்கள் போலல்லாமல், வைரஸ் மரபணுக்கள் 16S வரிசைகள் போன்ற பைலோஜெனட்டிகல் முறையில் பாதுகாக்கப்பட்ட மரபணுக்களைக் கொண்டிருக்கவில்லை.பொதுவாக கடலோர கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் வசிக்கும் புரவலர்களைப் பாதிக்கக்கூடிய ஒப்பீட்டளவில் அதிக எண்ணிக்கையிலான சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ வைரஸ் துண்டுகளை அடையாளம் காண மஸ்ஸல் போன்ற காட்டி இனங்களிலிருந்து திரவ பயாப்ஸிகள் பயன்படுத்தப்படலாம் என்பதை எங்கள் முடிவுகள் குறிப்பிடுகின்றன.புரோட்டோசோவா, ஆர்த்ரோபாட்கள், பூச்சிகள், தாவரங்கள் மற்றும் பாக்டீரியா வைரஸ்கள் (எ.கா., பாக்டீரியோபேஜ்கள்) ஆகியவற்றைப் பாதிக்கும் வைரஸ்கள் இதில் அடங்கும்.கெர்குலெனில் (அட்டவணை S2, துணைத் தகவல்) அதே மஸ்ஸல் அடுக்கில் சேகரிக்கப்பட்ட நீல மஸ்ஸல்களின் (எம். பிளாடென்சிஸ்) ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ வைரோமை ஆய்வு செய்தபோது இதேபோன்ற விநியோகம் கண்டறியப்பட்டது.ccfDNA இன் ஷாட்கன் சீக்வென்சிங் என்பது மனிதர்கள் அல்லது பிற உயிரினங்களின் [21, 37, 64] வைரம் பற்றிய ஆய்வில் வேகத்தைப் பெறும் ஒரு புதிய அணுகுமுறையாகும்.பால்டிமோர் [65] இல் உள்ள மிகவும் மாறுபட்ட மற்றும் பரந்த வகை வைரஸ்களைக் குறிக்கும் அனைத்து இரட்டை இழை DNA வைரஸ்களிலும் எந்த ஒரு மரபணுவும் பாதுகாக்கப்படாததால், இந்த அணுகுமுறை இரட்டை இழை DNA வைரஸ்களைப் படிக்க மிகவும் பயனுள்ளதாக இருக்கும்.இந்த வைரஸ்களில் பெரும்பாலானவை வகைப்படுத்தப்படாதவையாக இருந்தாலும், வைரஸ் உலகின் முற்றிலும் அறியப்படாத பகுதியிலிருந்து வரும் வைரஸ்களையும் உள்ளடக்கியிருக்கலாம் [66], மஸ்ஸல்ஸ் ஏ. அட்ரா மற்றும் எம். பிளாட்டென்சிஸ் ஆகியவற்றின் வைரஸ்கள் மற்றும் ஹோஸ்ட் வரம்புகள் இரண்டு இனங்களுக்கு இடையே விழுவதைக் கண்டறிந்தோம்.இதேபோல் (படம் S3, கூடுதல் தகவலைப் பார்க்கவும்).இந்த ஒற்றுமை ஆச்சரியப்படுவதற்கில்லை, ஏனெனில் இது சுற்றுச்சூழலில் இருக்கும் டிஎன்ஏவை எடுத்துக்கொள்வதில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட குறைபாட்டை பிரதிபலிக்கக்கூடும்.சுத்திகரிக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏவைப் பயன்படுத்தி எதிர்கால ஆய்வுகள் தற்போது ஆர்என்ஏ வைரோமை வகைப்படுத்த வேண்டும்.
எங்கள் ஆய்வில், கோவர்ஸ்கி மற்றும் சக ஊழியர்களின் [37] பணியிலிருந்து தழுவிய மிகக் கடுமையான பைப்லைனைப் பயன்படுத்தினோம், அவர்கள் நேட்டிவ் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏவைச் சேர்ப்பதற்கு முன்னும் பின்னும் பூல் செய்யப்பட்ட ரீட்கள் மற்றும் கான்டிஜ்களை இரண்டு-படி நீக்குவதைப் பயன்படுத்தினோம், இதன் விளைவாக மேப் செய்யப்படாத ரீட்களின் அதிக விகிதத்தில் இருந்தது.எனவே, மேப் செய்யப்படாத இந்த வாசிப்புகளில் சில இன்னும் அவற்றின் சொந்த தோற்றத்தைக் கொண்டிருக்கலாம் என்பதை நாம் நிராகரிக்க முடியாது, முதன்மையாக இந்த மஸ்ஸல் இனத்திற்கான குறிப்பு மரபணு நம்மிடம் இல்லை.இலுமினா MiSeq PE75 ஆல் உருவாக்கப்படும் சுய மற்றும் சுயமற்ற வாசிப்புகள் மற்றும் வாசிப்பு நீளம் ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான சிமிராக்கள் குறித்து நாங்கள் கவலைப்பட்டதால் இந்த பைப்லைனையும் பயன்படுத்தினோம்.பெரும்பாலான குறிப்பிடப்படாத அளவீடுகளுக்கு மற்றொரு காரணம், பெரும்பாலான கடல் நுண்ணுயிரிகள், குறிப்பாக கெர்குலென் போன்ற தொலைதூர பகுதிகளில், சிறுகுறிப்பு செய்யப்படவில்லை.மனித ccfDNA போன்ற ccfDNA துண்டு நீளம் என்று கருதி, Illumina MiSeq PE75 ஐப் பயன்படுத்தினோம்.எதிர்கால ஆய்வுகளுக்கு, மனிதர்கள் மற்றும்/அல்லது பாலூட்டிகளை விட ஹீமோலிம்ப் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ நீண்ட வாசிப்புகளைக் கொண்டுள்ளது என்பதைக் காட்டும் எங்கள் முடிவுகளைக் கருத்தில் கொண்டு, நீண்ட சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ துண்டுகளுக்கு மிகவும் பொருத்தமான வரிசைப்படுத்தல் தளத்தைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கிறோம்.இந்த நடைமுறையானது ஆழமான பகுப்பாய்விற்கான கூடுதல் அறிகுறிகளைக் கண்டறிவதை மிகவும் எளிதாக்கும்.தற்போது கிடைக்காத முழுமையான A. atra அணுக்கரு மரபணு வரிசையைப் பெறுவது, ccfDNA இன் சுய மற்றும் சுயமற்ற ஆதாரங்களில் இருந்து பாகுபாட்டைப் பெரிதும் எளிதாக்கும்.மஸ்ஸல்களுக்கு திரவ பயாப்ஸி என்ற கருத்தைப் பயன்படுத்துவதற்கான சாத்தியக்கூறுகளில் எங்கள் ஆராய்ச்சி கவனம் செலுத்துவதால், எதிர்கால ஆராய்ச்சியில் இந்தக் கருத்து பயன்படுத்தப்படுவதால், மஸ்ஸல்களின் நுண்ணுயிர் பன்முகத்தன்மையைப் படிக்க இந்த முறையின் திறனை அதிகரிக்க புதிய கருவிகள் மற்றும் குழாய்கள் உருவாக்கப்படும் என்று நம்புகிறோம்.கடல் சுற்றுச்சூழல்.
ஆக்கிரமிப்பு அல்லாத மருத்துவ பயோமார்க்கராக, ccfDNA இன் உயர்ந்த மனித பிளாஸ்மா அளவுகள் பல்வேறு நோய்கள், திசு சேதம் மற்றும் மன அழுத்த நிலைமைகளுடன் தொடர்புடையவை [67,68,69].இந்த அதிகரிப்பு திசு சேதத்திற்குப் பிறகு அதன் சொந்த தோற்றத்தின் டிஎன்ஏ துண்டுகளை வெளியிடுவதோடு தொடர்புடையது.கடுமையான வெப்ப அழுத்தத்தைப் பயன்படுத்தி இந்த சிக்கலை நாங்கள் கவனித்தோம், இதில் மஸ்ஸல்கள் 30 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் சுருக்கமாக வெளிப்படும்.மூன்று சுயாதீன சோதனைகளில் மூன்று வெவ்வேறு வகையான மஸ்ஸல்களில் இந்த பகுப்பாய்வை நாங்கள் செய்தோம்.இருப்பினும், கடுமையான வெப்ப அழுத்தத்திற்குப் பிறகு ccfDNA அளவுகளில் எந்த மாற்றத்தையும் நாங்கள் காணவில்லை (படம் S5, கூடுதல் தகவலைப் பார்க்கவும்).இந்த கண்டுபிடிப்பு, குறைந்த பட்சம், மஸ்ஸல்கள் அரை-திறந்த சுற்றோட்ட அமைப்பைக் கொண்டிருக்கின்றன மற்றும் அவற்றின் அதிக வடிகட்டுதல் செயல்பாடு காரணமாக அதிக அளவு வெளிநாட்டு டிஎன்ஏவைக் குவிக்கும் உண்மையை விளக்கலாம்.மறுபுறம், பல முதுகெலும்பில்லாத உயிரினங்களைப் போலவே, மஸ்ஸல்களும் மன அழுத்தத்தால் தூண்டப்பட்ட திசு சேதத்திற்கு அதிக எதிர்ப்புத் திறன் கொண்டவையாக இருக்கலாம், இதனால் அவற்றின் ஹீமோலிம்பில் ccfDNA வெளியீட்டைக் கட்டுப்படுத்துகிறது [70, 71].
இன்றுவரை, நீர்வாழ் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் பல்லுயிர்களின் DNA பகுப்பாய்வு முக்கியமாக சுற்றுச்சூழல் DNA (eDNA) மெட்டாபார்கோடிங்கில் கவனம் செலுத்துகிறது.இருப்பினும், ப்ரைமர்கள் பயன்படுத்தப்படும் போது இந்த முறை பொதுவாக பல்லுயிர் பகுப்பாய்வில் வரையறுக்கப்படுகிறது.ஷாட்கன் சீக்வென்சிங்கின் பயன்பாடு PCR இன் வரம்புகள் மற்றும் ப்ரைமர் செட்களின் பக்கச்சார்பான தேர்வைத் தவிர்க்கிறது.எனவே, ஒரு வகையில், எங்கள் முறை சமீபத்தில் பயன்படுத்தப்பட்ட உயர்-செயல்திறன் eDNA ஷாட்கன் வரிசைமுறை முறைக்கு நெருக்கமாக உள்ளது, இது துண்டு துண்டான டிஎன்ஏவை நேரடியாக வரிசைப்படுத்தி கிட்டத்தட்ட அனைத்து உயிரினங்களையும் பகுப்பாய்வு செய்ய முடியும் [72, 73].இருப்பினும், நிலையான eDNA முறைகளிலிருந்து LB ஐ வேறுபடுத்தும் பல அடிப்படை சிக்கல்கள் உள்ளன.நிச்சயமாக, eDNA மற்றும் LB க்கு இடையேயான முக்கிய வேறுபாடு இயற்கை வடிகட்டி ஹோஸ்ட்களின் பயன்பாடு ஆகும்.கடற்பாசிகள் மற்றும் பிவால்வ்ஸ் (Dresseina spp.) போன்ற கடல் இனங்கள் eDNA ஐப் படிப்பதற்கான ஒரு இயற்கை வடிகட்டியாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன [74, 75].இருப்பினும், டிரெஸ்சேனாவின் ஆய்வு திசு பயாப்ஸிகளைப் பயன்படுத்தியது, அதில் இருந்து டிஎன்ஏ பிரித்தெடுக்கப்பட்டது.LB இலிருந்து ccfDNA இன் பகுப்பாய்விற்கு திசு பயாப்ஸி, சிறப்பு மற்றும் சில நேரங்களில் விலையுயர்ந்த உபகரணங்கள் மற்றும் eDNA அல்லது திசு பயாப்ஸியுடன் தொடர்புடைய தளவாடங்கள் தேவையில்லை.உண்மையில், LB இலிருந்து ccfDNA ஐ குளிர் சங்கிலியை பராமரிக்காமல் FTA ஆதரவுடன் சேமித்து பகுப்பாய்வு செய்ய முடியும் என்று நாங்கள் சமீபத்தில் தெரிவித்தோம், இது தொலைதூர பகுதிகளில் ஆராய்ச்சிக்கு பெரும் சவாலாக உள்ளது [76].திரவ பயாப்ஸிகளில் இருந்து ccfDNA பிரித்தெடுக்கப்படுவதும் எளிமையானது மற்றும் ஷாட்கன் சீக்வென்சிங் மற்றும் PCR பகுப்பாய்வுக்கு உயர்தர டிஎன்ஏவை வழங்குகிறது.eDNA பகுப்பாய்வு [77] உடன் தொடர்புடைய சில தொழில்நுட்ப வரம்புகள் கொடுக்கப்பட்டால் இது ஒரு பெரிய நன்மை.மாதிரி முறையின் எளிமை மற்றும் குறைந்த விலை நீண்ட கால கண்காணிப்பு திட்டங்களுக்கு மிகவும் பொருத்தமானது.அவற்றின் உயர் வடிகட்டுதல் திறனுடன் கூடுதலாக, பிவால்வுகளின் மற்றொரு நன்கு அறியப்பட்ட அம்சம் அவற்றின் சளியின் இரசாயன மியூகோபாலிசாக்கரைடு கலவை ஆகும், இது வைரஸ்களை உறிஞ்சுவதை ஊக்குவிக்கிறது [78, 79].இது பல்லுயிர் மற்றும் கொடுக்கப்பட்ட நீர்வாழ் சுற்றுச்சூழல் அமைப்பில் காலநிலை மாற்றத்தின் தாக்கத்தை வகைப்படுத்துவதற்கு இருவால்வுகளை ஒரு சிறந்த இயற்கை வடிகட்டியாக ஆக்குகிறது.eDNA உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​ஹோஸ்ட்-பெறப்பட்ட DNA துண்டுகள் இருப்பது முறையின் வரம்பாகக் காணப்பட்டாலும், eDNA உடன் ஒப்பிடும்போது அத்தகைய நேட்டிவ் ccfDNA வைத்திருப்பது தொடர்பான செலவு, சுகாதார ஆய்வுகளுக்குக் கிடைக்கும் பரந்த அளவிலான தகவல்களுக்கு ஒரே நேரத்தில் புரியும்.ஆஃப்செட் ஹோஸ்ட்.ஹோஸ்ட் ஹோஸ்டின் மரபணுவில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட வைரஸ் தொடர்களின் இருப்பு இதில் அடங்கும்.பிவால்வ்களில் கிடைமட்டமாக பரவும் லுகேமிக் ரெட்ரோவைரஸ்கள் இருப்பதால் இது மஸ்ஸல்களுக்கு மிகவும் முக்கியமானது [80, 81].eDNA ஐ விட LB இன் மற்றொரு நன்மை என்னவென்றால், இது நுண்ணுயிரிகளை (மற்றும் அவற்றின் மரபணுக்களை) மூழ்கடிக்கும் ஹீமோலிம்பில் இரத்த அணுக்களை சுற்றும் பாகோசைடிக் செயல்பாட்டைப் பயன்படுத்துகிறது.ஃபாகோசைடோசிஸ் என்பது பிவால்வுகளில் உள்ள இரத்த அணுக்களின் முக்கிய செயல்பாடு [82].இறுதியாக, இந்த முறை மஸ்ஸல்களின் உயர் வடிகட்டுதல் திறன் (சராசரியாக 1.5 எல்/எச் கடல்நீர்) மற்றும் இரண்டு நாள் சுழற்சியைப் பயன்படுத்திக் கொள்கிறது, இது கடல்நீரின் வெவ்வேறு அடுக்குகளின் கலவையை அதிகரிக்கிறது, இது பன்முகத்தன்மை வாய்ந்த eDNA ஐப் பிடிக்க அனுமதிக்கிறது.[83, 84].எனவே, மஸ்ஸல் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏ பகுப்பாய்வு என்பது மஸ்ஸல்களின் ஊட்டச்சத்து, பொருளாதாரம் மற்றும் சுற்றுச்சூழல் தாக்கங்களைக் கருத்தில் கொண்டு ஒரு சுவாரஸ்யமான வழி.மனிதர்களிடமிருந்து சேகரிக்கப்பட்ட எல்பியின் பகுப்பாய்வைப் போலவே, இந்த முறையானது வெளிப்புறப் பொருட்களுக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக ஹோஸ்ட் டிஎன்ஏவில் மரபணு மற்றும் எபிஜெனெடிக் மாற்றங்களை அளவிடுவதற்கான வாய்ப்பையும் திறக்கிறது.எடுத்துக்காட்டாக, நானோபோர் வரிசைமுறையைப் பயன்படுத்தி நேட்டிவ் சிசிஎஃப்டிஎன்ஏவில் மரபணு அளவிலான மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வைச் செய்ய மூன்றாம் தலைமுறை வரிசைமுறை தொழில்நுட்பங்கள் கருதப்படலாம்.மஸ்ஸல் ccfDNA துண்டுகளின் நீளம் நீண்ட வாசிப்பு வரிசைமுறை தளங்களுடன் மிகவும் இணக்கமாக இருப்பதால் இந்த செயல்முறை எளிதாக்கப்பட வேண்டும், இது இரசாயன மாற்றங்கள் தேவையில்லாமல் ஒரே வரிசைமுறையில் இருந்து மரபணு அளவிலான டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வை அனுமதிக்கிறது.எனவே, இது காலநிலை மாற்றம் அல்லது மாசுபாடுகளுக்கு வெளிப்பட்ட பிறகு பதிலை நிர்வகிக்கும் அடிப்படை வழிமுறைகள் பற்றிய மதிப்புமிக்க நுண்ணறிவை வழங்க முடியும் [87].இருப்பினும், LB இன் பயன்பாடு வரம்புகள் இல்லாமல் இல்லை.இதற்கு சுற்றுச்சூழல் அமைப்பில் காட்டி இனங்கள் இருப்பது அவசியம் என்று சொல்லத் தேவையில்லை.மேலே குறிப்பிட்டுள்ளபடி, கொடுக்கப்பட்ட சுற்றுச்சூழலின் பல்லுயிரியலை மதிப்பிடுவதற்கு LB ஐப் பயன்படுத்துவதற்கு, மூலத்திலிருந்து DNA துண்டுகள் இருப்பதைக் கணக்கில் எடுத்துக்கொள்ளும் கடுமையான உயிர் தகவலியல் பைப்லைன் தேவைப்படுகிறது.மற்றொரு பெரிய பிரச்சனை கடல் இனங்களுக்கான குறிப்பு மரபணுக்கள் கிடைப்பது ஆகும்.கடல் பாலூட்டி மரபணுக்கள் திட்டம் மற்றும் சமீபத்தில் நிறுவப்பட்ட Fish10k திட்டம் [88] போன்ற முன்முயற்சிகள் எதிர்காலத்தில் அத்தகைய பகுப்பாய்வுக்கு உதவும் என்று நம்பப்படுகிறது.கடல் வடிகட்டி-உணவூட்டும் உயிரினங்களுக்கு LB கருத்தாக்கத்தின் பயன்பாடு, வரிசைமுறை தொழில்நுட்பத்தில் சமீபத்திய முன்னேற்றங்களுடன் இணக்கமாக உள்ளது, இது சுற்றுச்சூழல் அழுத்தத்திற்கு பதிலளிக்கும் வகையில் கடல் வாழ்விடங்களின் ஆரோக்கியம் பற்றிய முக்கியமான தகவல்களை வழங்க பல-ஓம் பயோமார்க்ஸர்களின் வளர்ச்சிக்கு மிகவும் பொருத்தமானது.
ஜீனோம் சீக்வென்சிங் தரவு என்சிபிஐ சீக்வென்ஸ் ரீட் ஆர்க்கிவ் https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 இன் கீழ் பயோபிராஜெக்ட்ஸ் SRR8924808 இல் டெபாசிட் செய்யப்பட்டுள்ளது.
பிரைர்லி ஏஎஸ், கிங்ஸ்ஃபோர்ட் எம்ஜே கடல்வாழ் உயிரினங்கள் மற்றும் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் காலநிலை மாற்றத்தின் தாக்கம்.கோல் உயிரியல்.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, மற்றும் பலர்.கடல் சூழலில் காலநிலை மாற்றம் மற்றும் பிற உள்ளூர் அழுத்தங்களின் ஒருங்கிணைந்த தாக்கங்களைக் கவனியுங்கள்.பொது அறிவியல் சூழல்.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, மற்றும் பலர்.)மார்ச் முதல் அறிவியல்.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. மீண்டும் மீண்டும் வரும் வெப்ப அழுத்த நிலைமைகளின் கீழ் வெப்பத்தை தாங்கும் தன்மை குறைக்கப்பட்டது, நீல மஸ்ஸல்களின் கோடையில் அதிக இறப்பு விகிதத்தை விளக்குகிறது.அறிவியல் அறிக்கை 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, மற்றும் பலர்.விலங்கு இறப்புகளின் அதிர்வெண், காரணங்கள் மற்றும் அளவு ஆகியவற்றில் சமீபத்திய மாற்றங்கள்.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, மற்றும் பலர்.பல இனங்கள் அல்லாத குறிப்பிட்ட நோய்க்கிருமிகள் பின்னா நோபிலிஸின் வெகுஜன இறப்பை ஏற்படுத்தியிருக்கலாம்.வாழ்க்கை.2020;10:238.
பிராட்லி எம், கவுட்ஸ் எஸ்ஜே, ஜென்கின்ஸ் ஈ, ஓ'ஹாரா டிஎம்.ஆர்க்டிக் ஜூனோடிக் நோய்களில் காலநிலை மாற்றத்தின் சாத்தியமான தாக்கம்.இன்ட் ஜே சர்க்கம்போலார் ஆரோக்கியம்.2005;64:468–77.
பேயர் ஜே., கிரீன் NW, ப்ரூக்ஸ் எஸ்., ஆலன் ஐஜே, ரூஸ் ஏ., கோம்ஸ் டி. மற்றும் பலர்.நீல மஸ்ஸல்ஸ் (மைட்டிலஸ் எடுலிஸ் எஸ்பிபி.) கடலோர மாசு கண்காணிப்பில் சமிக்ஞை உயிரினங்களாக: ஒரு ஆய்வு.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
சிரவெக்னா ஜி, மார்சோனி எஸ், சியனா எஸ், பார்டெல்லி ஏ. புற்றுநோய் சிகிச்சையில் திரவ பயாப்ஸியின் ஒருங்கிணைப்பு.நாட் ரெவ் கிளீன் ஓன்கோல்.2017;14:531–48.
வான் ஜேசிஎம், மாஸ்ஸி சி, கார்சியா-கோர்பச்சோ ஜே, மௌலியர் எஃப், பிரென்டன் ஜேடி, கால்டாஸ் சி மற்றும் பலர்.திரவ பயாப்ஸி முதிர்வு: கட்டி டிஎன்ஏ புழக்கத்தை அனுமதிக்கிறது.நாட் ரெவ் புற்றுநோய்.2017;17:223–38.
மண்டேல் பி., மெட்டாய்ஸ் பி. மனித பிளாஸ்மாவில் நியூக்ளிக் அமிலங்கள்.Soc Biol துணை நிறுவனங்களின் சந்திப்பு நிமிடங்கள்.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. புற்றுநோய் சிகிச்சைக்கான மூலக்கூறு குறிப்பானாக உயிரணு இல்லாத டிஎன்ஏவுக்கான புதிய பங்கு.பயோமொலார் பகுப்பாய்வின் அளவு.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy கிளினிக்கிற்குள் நுழைகிறது - செயல்படுத்துவதில் சிக்கல்கள் மற்றும் எதிர்கால சவால்கள்.நாட் ரெவ் க்ளின் ஓன்கோல்.2021;18:297–312.
லோ ஒய்எம், கார்பெட்டா என்., சேம்பர்லைன் பிஎஃப், ராய் டபிள்யூ., சார்ஜென்ட் ஐஎல், ரெட்மேன் சிடபிள்யூ மற்றும் பலர்.கருவின் டிஎன்ஏ தாயின் பிளாஸ்மா மற்றும் சீரம் ஆகியவற்றில் உள்ளது.லான்செட்.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR கர்ப்பகாலத்தின் போக்கைப் பற்றிய ஆய்வு மற்றும் கர்ப்ப காலத்தில் பெண்களின் இரத்தத்தில் உள்ள எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் ஆர்என்ஏவைப் பயன்படுத்தி அதன் சிக்கல்கள்.டோபீடியாட்ரிக்ஸ்.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.திரவ பயாப்ஸி: நன்கொடையாளர் உயிரணு இல்லாத டிஎன்ஏ சிறுநீரக ஒட்டுதலில் உள்ள அலோஜெனிக் புண்களைக் கண்டறியப் பயன்படுகிறது.நாட் ரெவ் நெஃப்ரோல்.2021;17:591–603.
ஜுவான் எஃப்சி, லோ ஒய்எம் இன்னோவேஷன்ஸ் இன் ப்ரீநேட்டல் டயக்னாஸ்டிக்ஸ்: தாய்வழி பிளாஸ்மா மரபணு வரிசைமுறை.அண்ணா எம்.டி.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, மற்றும் பலர்.பாதிக்கப்பட்ட உடல் திரவங்களின் அடுத்த தலைமுறை மெட்டஜெனோமிக் வரிசைமுறையுடன் கூடிய விரைவான நோய்க்கிருமி கண்டறிதல்.நாட் மருத்துவம்.2021;27:115-24.