Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவி பதிப்பில் குறைந்த CSS ஆதரவு உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்). இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்ய, ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் தளத்தை ரெண்டர் செய்வோம்.
மருந்து சோதனைக்காக இதயத்தின் உடலியல் சூழலை துல்லியமாக இனப்பெருக்கம் செய்யக்கூடிய நம்பகமான இன் விட்ரோ அமைப்பின் தேவை உள்ளது. மனித இதய திசு வளர்ப்பு அமைப்புகளின் வரம்பு குறைவாக இருப்பதால், இதய மருந்து விளைவுகளின் தவறான விளக்கங்கள் ஏற்பட்டுள்ளன. இங்கே, இதயத் துண்டுகளை மின் இயந்திர ரீதியாகத் தூண்டும் மற்றும் இதய சுழற்சியின் சிஸ்டாலிக் மற்றும் டயஸ்டாலிக் கட்டங்களின் போது உடலியல் நீட்சிக்கு உட்படும் ஒரு இதய திசு வளர்ப்பு மாதிரியை (CTCM) நாங்கள் உருவாக்கியுள்ளோம். 12 நாட்கள் வளர்ப்பிற்குப் பிறகு, இந்த அணுகுமுறை இதயப் பிரிவுகளின் நம்பகத்தன்மையை ஓரளவு மேம்படுத்தியது, ஆனால் அவற்றின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை முழுமையாகப் பாதுகாக்கவில்லை. எனவே, சிறிய மூலக்கூறு பரிசோதனைக்குப் பிறகு, எங்கள் ஊடகத்தில் 100 nM ட்ரையோடோதைரோனைன் (T3) மற்றும் 1 μM டெக்ஸாமெதாசோன் (Dex) ஆகியவற்றைச் சேர்ப்பது பிரிவுகளின் நுண் கட்டமைப்பை 12 நாட்களுக்குப் பராமரித்தது என்பதைக் கண்டறிந்தோம். T3/Dex சிகிச்சையுடன் இணைந்து, CTCM அமைப்பு டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் சுயவிவரங்கள், நம்பகத்தன்மை, வளர்சிதை மாற்ற செயல்பாடு மற்றும் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை 12 நாட்களுக்கு புதிய இதய திசுக்களின் அதே மட்டத்தில் பராமரித்தது. கூடுதலாக, கலாச்சாரத்தில் இதய திசுக்களின் அதிகப்படியான நீட்சி ஹைபர்டிராஃபிக் இதய சமிக்ஞையைத் தூண்டுகிறது, இது இதய நீட்சியால் தூண்டப்பட்ட ஹைபர்டிராஃபிக் நிலைமைகளைப் பிரதிபலிக்கும் CTCM இன் திறனுக்கான சான்றுகளை வழங்குகிறது. முடிவில், CTCM நீண்ட காலத்திற்கு கலாச்சாரத்தில் இதயத்தின் உடலியல் மற்றும் நோயியல் இயற்பியலை மாதிரியாகக் கொண்டு, நம்பகமான மருந்து பரிசோதனையை செயல்படுத்துகிறது.
மருத்துவ ஆராய்ச்சிக்கு முன், மனித இதயத்தின் உடலியல் சூழலை துல்லியமாக இனப்பெருக்கம் செய்யக்கூடிய நம்பகமான இன் விட்ரோ அமைப்புகள் தேவை. இத்தகைய அமைப்புகள் மாற்றப்பட்ட இயந்திர நீட்சி, இதய துடிப்பு மற்றும் மின் இயற்பியல் பண்புகளைப் பிரதிபலிக்க வேண்டும். மனித இதயத்தில் மருந்துகளின் விளைவுகளை பிரதிபலிப்பதில் வரையறுக்கப்பட்ட நம்பகத்தன்மையுடன் இதய உடலியலுக்கான ஒரு திரையிடல் தளமாக விலங்கு மாதிரிகள் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன1,2. இறுதியில், ஐடியல் கார்டியாக் டிஷ்யூ கல்ச்சர் எக்ஸ்பெரிமென்டல் மாடல் (CTCM) என்பது பல்வேறு சிகிச்சை மற்றும் மருந்தியல் தலையீடுகளுக்கு மிகவும் உணர்திறன் மற்றும் குறிப்பிட்ட ஒரு மாதிரியாகும், இது மனித இதயத்தின் உடலியல் மற்றும் நோயியல் இயற்பியலை துல்லியமாக இனப்பெருக்கம் செய்கிறது3. அத்தகைய அமைப்பு இல்லாதது இதய செயலிழப்புக்கான புதிய சிகிச்சைகளின் கண்டுபிடிப்பை கட்டுப்படுத்துகிறது4,5 மேலும் சந்தையிலிருந்து வெளியேறுவதற்கு மருந்து கார்டியோடாக்சிசிட்டி ஒரு முக்கிய காரணமாக உள்ளது6.
கடந்த பத்தாண்டுகளில், எட்டு இருதய-வாஸ்குலர் அல்லாத மருந்துகள் மருத்துவ பயன்பாட்டிலிருந்து விலக்கப்பட்டுள்ளன, ஏனெனில் அவை QT இடைவெளி நீடிப்பை ஏற்படுத்துகின்றன, இது வென்ட்ரிகுலர் அரித்மியாக்கள் மற்றும் திடீர் மரணத்திற்கு வழிவகுக்கிறது. எனவே, இருதய செயல்திறன் மற்றும் நச்சுத்தன்மையை மதிப்பிடுவதற்கு நம்பகமான முன் மருத்துவ பரிசோதனை உத்திகளுக்கான தேவை அதிகரித்து வருகிறது. மருந்து பரிசோதனை மற்றும் நச்சுத்தன்மை சோதனையில் மனிதனால் தூண்டப்பட்ட ப்ளூரிபோடென்ட் ஸ்டெம் செல்-பெறப்பட்ட கார்டியோமயோசைட்டுகளின் (hiPS-CM) சமீபத்திய பயன்பாடு இந்த சிக்கலுக்கு ஒரு பகுதி தீர்வை வழங்குகிறது. இருப்பினும், hiPS-CM களின் முதிர்ச்சியற்ற தன்மை மற்றும் இதய திசுக்களின் பலசெல்லுலார் சிக்கலான தன்மை இல்லாதது இந்த முறையின் முக்கிய வரம்புகள் ஆகும். தன்னிச்சையான சுருக்கங்கள் தொடங்கிய சிறிது நேரத்திலேயே இதய திசு ஹைட்ரோஜெல்களை உருவாக்குவதற்கும் காலப்போக்கில் படிப்படியாக அதிகரிக்கும் மின் தூண்டுதலுக்கும் ஆரம்பகால hiPS-CM ஐப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் இந்த வரம்பை ஓரளவு சமாளிக்க முடியும் என்று சமீபத்திய ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன. இருப்பினும், இந்த hiPS-CM நுண் திசுக்களில் வயதுவந்த மையோகார்டியத்தின் முதிர்ந்த மின் இயற்பியல் மற்றும் சுருக்க பண்புகள் இல்லை. கூடுதலாக, மனித இதய திசுக்கள் மிகவும் சிக்கலான அமைப்பைக் கொண்டுள்ளன, எண்டோடெலியல் செல்கள், நியூரான்கள் மற்றும் ஸ்ட்ரோமல் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் உள்ளிட்ட பல்வேறு உயிரணு வகைகளின் பன்முகத்தன்மை கொண்ட கலவையைக் கொண்டுள்ளன, அவை குறிப்பிட்ட செல் புற-செல்லுலார் மேட்ரிக்ஸ் புரதங்களால் ஒன்றோடொன்று இணைக்கப்பட்டுள்ளன. வயதுவந்த பாலூட்டிகளின் இதயத்தில் உள்ள கார்டியோமயோசைட் அல்லாத மக்கள்தொகையின் இந்த பன்முகத்தன்மை, தனிப்பட்ட செல் வகைகளைப் பயன்படுத்தி இதய திசுக்களை மாதிரியாக்குவதற்கு ஒரு முக்கிய தடையாகும். இந்த முக்கிய வரம்புகள் உடலியல் மற்றும் நோயியல் நிலைமைகளின் கீழ் அப்படியே மாரடைப்பு திசுக்களை வளர்ப்பதற்கான முறைகளை வளர்ப்பதன் முக்கியத்துவத்தை வலியுறுத்துகின்றன.
மனித இதயத்தின் மெல்லிய (300 µm) வளர்ப்பு பிரிவுகள், அப்படியே மனித மையோகார்டியத்தின் ஒரு நம்பிக்கைக்குரிய மாதிரியாக நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளன. இந்த முறை மனித இதய திசுக்களைப் போன்ற முழுமையான 3D பலசெல்லுலார் அமைப்புக்கான அணுகலை வழங்குகிறது. இருப்பினும், 2019 வரை, வளர்ப்பு இதயப் பிரிவுகளின் பயன்பாடு குறுகிய (24 மணிநேரம்) வளர்ப்பு உயிர்வாழ்வால் மட்டுப்படுத்தப்பட்டது. இது இயற்பியல்-இயந்திர நீட்சி இல்லாமை, காற்று-திரவ இடைமுகம் மற்றும் இதய திசுக்களின் தேவைகளை ஆதரிக்காத எளிய ஊடகங்களின் பயன்பாடு உள்ளிட்ட பல காரணிகளால் ஏற்படுகிறது. 2019 ஆம் ஆண்டில், பல ஆராய்ச்சி குழுக்கள் இதய திசு வளர்ப்பு அமைப்புகளில் இயந்திர காரணிகளை இணைப்பது கலாச்சார ஆயுளை நீட்டிக்கவும், இதய வெளிப்பாட்டை மேம்படுத்தவும், இதய நோயியலைப் பிரதிபலிக்கவும் முடியும் என்பதை நிரூபித்தன. இரண்டு நேர்த்தியான ஆய்வுகள் 17 மற்றும் 18, ஒற்றை அச்சு இயந்திர ஏற்றுதல் கலாச்சாரத்தின் போது இதய பினோடைப்பில் நேர்மறையான விளைவைக் கொண்டிருப்பதைக் காட்டுகின்றன. இருப்பினும், இந்த ஆய்வுகள் இதய சுழற்சியின் மாறும் முப்பரிமாண இயற்பியல்-இயந்திர ஏற்றுதலைப் பயன்படுத்தவில்லை, ஏனெனில் இதயப் பிரிவுகள் ஐசோமெட்ரிக் இழுவிசை விசைகள் 17 அல்லது நேரியல் ஆக்சோடோனிக் ஏற்றுதல் 18 உடன் ஏற்றப்பட்டன. இந்த திசு நீட்சி முறைகள் பல இதய மரபணுக்களை அடக்குவதற்கு அல்லது அசாதாரண நீட்சி பதில்களுடன் தொடர்புடைய மரபணுக்களின் அதிகப்படியான வெளிப்பாட்டிற்கு வழிவகுத்தன. குறிப்பாக, பிடோலிஸ் மற்றும் பலர். 19 ஃபோர்ஸ் டிரான்ஸ்யூசர் பின்னூட்டம் மற்றும் பதற்ற இயக்கிகளைப் பயன்படுத்தி இதய சுழற்சி மறுகட்டமைப்புக்கான ஒரு டைனமிக் இதய துண்டு கலாச்சார குளியல் ஒன்றை உருவாக்கினர். இந்த அமைப்பு மிகவும் துல்லியமான இன் விட்ரோ கார்டியாக் சுழற்சி மாதிரியை அனுமதித்தாலும், முறையின் சிக்கலான தன்மை மற்றும் குறைந்த செயல்திறன் இந்த அமைப்பின் பயன்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்துகிறது. எங்கள் ஆய்வகம் சமீபத்தில் பன்றி இறைச்சி மற்றும் மனித இதய திசுக்களின் பிரிவுகளின் நம்பகத்தன்மையை 6 நாட்கள் வரை பராமரிக்க மின் தூண்டுதல் மற்றும் உகந்த ஊடகத்தைப் பயன்படுத்தி ஒரு எளிமைப்படுத்தப்பட்ட கலாச்சார அமைப்பை உருவாக்கியுள்ளது20,21.
தற்போதைய கையெழுத்துப் பிரதியில், இதய சுழற்சியின் போது முப்பரிமாண இதய உடலியல் மற்றும் நோய்க்குறியியல் விரிவை மீண்டும் ஒருங்கிணைக்க, நகைச்சுவை குறிப்புகளை உள்ளடக்கிய பன்றி இதயத்தின் பிரிவுகளைப் பயன்படுத்தி ஒரு இதய திசு வளர்ப்பு மாதிரியை (CTCM) நாங்கள் விவரிக்கிறோம். இந்த CTCM, முன்-மருந்து சோதனைக்காக பாலூட்டிகளின் இதயத்தின் உடலியல்/நோய் இயற்பியலைப் பிரதிபலிக்கும் செலவு குறைந்த, நடுத்தர-செயல்திறன் இருதய அமைப்பை வழங்குவதன் மூலம், முன்-மருந்து கணிப்பின் துல்லியத்தை இதற்கு முன் அடைய முடியாத அளவிற்கு அதிகரிக்க முடியும்.
ஹீமோடைனமிக் மெக்கானிக்கல் சிக்னல்கள் இன் விட்ரோ 22,23,24 கார்டியோமயோசைட் செயல்பாட்டை பராமரிப்பதில் முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன. தற்போதைய கையெழுத்துப் பிரதியில், உடலியல் அதிர்வெண்களில் (1.2 ஹெர்ட்ஸ், நிமிடத்திற்கு 72 துடிப்புகள்) மின் மற்றும் இயந்திர தூண்டுதலைத் தூண்டுவதன் மூலம் வயது வந்தோரின் இதய சூழலைப் பிரதிபலிக்கும் ஒரு CTCM (படம் 1a) ஐ நாங்கள் உருவாக்கியுள்ளோம். டயஸ்டோலின் போது அதிகப்படியான திசு நீட்சியைத் தவிர்க்க, திசு அளவை 25% அதிகரிக்க ஒரு 3D அச்சிடும் சாதனம் பயன்படுத்தப்பட்டது (படம் 1b). இதய சுழற்சியை முழுமையாக இனப்பெருக்கம் செய்ய தரவு கையகப்படுத்தல் அமைப்பைப் பயன்படுத்தி சிஸ்டோலுக்கு முன் 100 எம்எஸ் தொடங்குவதற்கு C-PACE அமைப்பால் தூண்டப்பட்ட மின் வேகக்கட்டுப்பாடு நேரம் நிர்ணயிக்கப்பட்டது. திசு வளர்ப்பு அமைப்பு மேல் அறையில் இதயத் துண்டுகளை விரிவாக்க ஒரு நெகிழ்வான சிலிகான் சவ்வை சுழற்சி முறையில் விரிவுபடுத்த ஒரு நிரல்படுத்தக்கூடிய நியூமேடிக் ஆக்சுவேட்டரை (LB பொறியியல், ஜெர்மனி) பயன்படுத்துகிறது. இந்த அமைப்பு ஒரு அழுத்த மின்மாற்றி மூலம் வெளிப்புற காற்றுக் கோட்டுடன் இணைக்கப்பட்டது, இது அழுத்தம் (± 1 mmHg) மற்றும் நேரத்தை (± 1 ms) துல்லியமாக சரிசெய்ய முடிந்தது (படம் 1c).
a சாதனத்தின் கலாச்சார அறைக்குள் நீல நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ள 7 மிமீ ஆதரவு வளையத்துடன் திசுப் பகுதியை இணைக்கவும். கலாச்சார அறை காற்று அறையிலிருந்து ஒரு மெல்லிய நெகிழ்வான சிலிகான் சவ்வு மூலம் பிரிக்கப்பட்டுள்ளது. கசிவுகளைத் தடுக்க ஒவ்வொரு அறைக்கும் இடையில் ஒரு கேஸ்கெட்டை வைக்கவும். சாதனத்தின் மூடியில் மின் தூண்டுதலை வழங்கும் கிராஃபைட் மின்முனைகள் உள்ளன. b பெரிய திசு சாதனம், வழிகாட்டி வளையம் மற்றும் ஆதரவு வளையத்தின் திட்டவட்டமான பிரதிநிதித்துவம். திசுப் பிரிவுகள் (பழுப்பு) சாதனத்தின் வெளிப்புற விளிம்பில் உள்ள பள்ளத்தில் வழிகாட்டி வளையத்துடன் பெரிதாக்கப்பட்ட சாதனத்தில் வைக்கப்பட்டுள்ளன. வழிகாட்டியைப் பயன்படுத்தி, திசு அக்ரிலிக் பிசின் பூசப்பட்ட ஆதரவு வளையத்தை இதய திசுக்களின் பகுதியின் மீது கவனமாக வைக்கவும். c நிரல்படுத்தக்கூடிய நியூமேடிக் ஆக்சுவேட்டர் (PPD) மூலம் கட்டுப்படுத்தப்படும் காற்று அறை அழுத்தத்தின் செயல்பாடாக மின் தூண்டுதலின் நேரத்தைக் காட்டும் வரைபடம். அழுத்த உணரிகளைப் பயன்படுத்தி மின் தூண்டுதலை ஒத்திசைக்க ஒரு தரவு கையகப்படுத்தல் சாதனம் பயன்படுத்தப்பட்டது. கலாச்சார அறையில் உள்ள அழுத்தம் நிர்ணயிக்கப்பட்ட வரம்பை அடையும் போது, ​​மின் தூண்டுதலைத் தூண்டுவதற்கு C-PACE-EM க்கு ஒரு துடிப்பு சமிக்ஞை அனுப்பப்படுகிறது. d ஒரு இன்குபேட்டர் அலமாரியில் வைக்கப்பட்டுள்ள நான்கு CTCM களின் படம். ஒரு நியூமேடிக் சுற்று வழியாக நான்கு சாதனங்கள் ஒரு PPD உடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளன, மேலும் நியூமேடிக் சுற்றுகளில் உள்ள அழுத்தத்தைக் கண்காணிக்க அழுத்த உணரிகள் ஹீமோஸ்டேடிக் வால்வில் செருகப்படுகின்றன. ஒவ்வொரு சாதனத்திலும் ஆறு திசுப் பிரிவுகள் உள்ளன.
ஒற்றை நியூமேடிக் ஆக்சுவேட்டரைப் பயன்படுத்தி, 4 CTCM சாதனங்களைக் கட்டுப்படுத்த முடிந்தது, ஒவ்வொன்றும் 6 திசுப் பிரிவுகளைக் கொண்டிருக்கலாம் (படம் 1d). CTCM இல், காற்று அறையில் உள்ள காற்று அழுத்தம் திரவ அறையில் ஒத்திசைவான அழுத்தமாக மாற்றப்பட்டு இதயத் துண்டின் உடலியல் விரிவாக்கத்தைத் தூண்டுகிறது (படம் 2a மற்றும் துணை படம் 1). 80 மிமீ Hg இல் திசு நீட்சியின் மதிப்பீடு. கலை. திசுப் பிரிவுகளை 25% நீட்டிப்பதைக் காட்டியது (படம் 2b). இந்த சதவீத நீட்சி சாதாரண இதயப் பிரிவு சுருக்கத்திற்கு 2.2–2.3 µm உடலியல் சர்கோமியர் நீளத்திற்கு ஒத்திருப்பதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது. தனிப்பயன் கேமரா அமைப்புகளைப் பயன்படுத்தி திசு இயக்கம் மதிப்பிடப்பட்டது (துணை படம் 1). திசு இயக்கத்தின் வீச்சு மற்றும் வேகம் (படம் 2c, d) இதய சுழற்சியின் போது நீட்சி மற்றும் சிஸ்டோல் மற்றும் டயஸ்டோலின் போது நேரம் (படம் 2b) உடன் ஒத்திருந்தது. சுருக்கம் மற்றும் தளர்வின் போது இதய திசுக்களின் நீட்சி மற்றும் வேகம் கலாச்சாரத்தில் 12 நாட்களுக்கு மாறாமல் இருந்தது (படம் 2f). வளர்ப்பின் போது சுருங்குதலில் மின் தூண்டுதலின் விளைவை மதிப்பிடுவதற்கு, நிழல் வழிமுறையைப் பயன்படுத்தி செயலில் உள்ள சிதைவைத் தீர்மானிப்பதற்கான ஒரு முறையை நாங்கள் உருவாக்கினோம் (துணை படம் 2a,b) மேலும் மின் தூண்டுதலுடன் மற்றும் இல்லாமல் சிதைவுகளை வேறுபடுத்திப் பார்க்க முடிந்தது. இதயத்தின் அதே பிரிவு (படம் 2f). வெட்டப்பட்ட நகரக்கூடிய பகுதியில் (R6-9), மின் தூண்டுதலின் போது மின்னழுத்தம் மின் தூண்டுதல் இல்லாததை விட 20% அதிகமாக இருந்தது, இது சுருக்க செயல்பாட்டிற்கு மின் தூண்டுதலின் பங்களிப்பைக் குறிக்கிறது.
காற்று அறை அழுத்தம், திரவ அறை அழுத்தம் மற்றும் திசு இயக்க அளவீடுகளின் பிரதிநிதித்துவ தடயங்கள், அறை அழுத்தம் திரவ அறை அழுத்தத்தை மாற்றுகிறது என்பதை உறுதிப்படுத்துகிறது, இதனால் திசு துண்டின் தொடர்புடைய இயக்கம் ஏற்படுகிறது. b சதவீத நீட்சி (ஆரஞ்சு) உடன் தொடர்புடைய திசு பிரிவுகளின் சதவீத நீட்சி (நீலம்) பிரதிநிதித்துவ தடயங்கள். c இதய துண்டின் அளவிடப்பட்ட இயக்கம் இயக்கத்தின் அளவிடப்பட்ட வேகத்துடன் ஒத்துப்போகிறது. (d) இதயத்தின் ஒரு துண்டில் சுழற்சி இயக்கம் (நீல கோடு) மற்றும் வேகம் (ஆரஞ்சு புள்ளியிடப்பட்ட கோடு) ஆகியவற்றின் பிரதிநிதித்துவ பாதைகள். e சுழற்சி நேரத்தின் அளவு (n = 19 துண்டுகள், வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, சுருக்க நேரம் (n = 19 துண்டுகள், குழுவிலிருந்து, தளர்வு நேரம் (n = 19 துண்டுகள், வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து), திசு இயக்கம் (n = 25). வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து துண்டுகள்)/குழு), உச்ச சிஸ்டாலிக் வேகம் (n = 24(D0), 25(D12) துண்டுகள்/குழு வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து) மற்றும் உச்ச தளர்வு விகிதம் (n=24(D0), 25(D12) துண்டுகள்/குழு வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து). இரண்டு வால் கொண்ட மாணவரின் டி-சோதனை எந்த அளவுருவிலும் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாட்டைக் காட்டவில்லை. f பிரதிநிதித்துவ திரிபு பகுப்பாய்வு (சிவப்பு) மற்றும் (நீலம்) மின் தூண்டுதலுடன் கூடிய திசு பிரிவுகளின் தடயங்கள், ஒரே பிரிவிலிருந்து திசு பிரிவுகளின் பத்து பிராந்திய பகுதிகள். வெவ்வேறு பிரிவுகளிலிருந்து பத்து பகுதிகளில் மின் தூண்டுதலுடன் கூடிய மற்றும் இல்லாத திசு பிரிவுகளில் திரிபு சதவீத வேறுபாட்டின் அளவைக் கீழ் பேனல்கள் காட்டுகின்றன. (n = வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து 8 துண்டுகள்/குழு, இரண்டு வால் கொண்ட மாணவர் டி-சோதனை செய்யப்படுகிறது; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து 8 துண்டுகள்/குழு, இரண்டு வால் கொண்ட மாணவர் டி-சோதனை செய்யப்படுகிறது; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; **p<0,0001, **p<001, **,<00). (n = வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து 8 பிரிவுகள்/குழு, இரண்டு வால் கொண்ட மாணவர்களின் t-சோதனை; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05） n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 பிரிவுகள்/குழு, வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, இரண்டு வால் கொண்ட மாணவர்களின் t-சோதனை; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).பிழைப் பட்டைகள் சராசரி ± நிலையான விலகலைக் குறிக்கின்றன.
எங்கள் முந்தைய நிலையான உயிரிமிமெடிக் இதய துண்டு வளர்ப்பு அமைப்பில் [20, 21], மின் தூண்டுதலைப் பயன்படுத்துவதன் மூலமும், நடுத்தர கலவையை மேம்படுத்துவதன் மூலமும் 6 நாட்களுக்கு இதய துண்டுகளின் நம்பகத்தன்மை, செயல்பாடு மற்றும் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை நாங்கள் பராமரித்தோம். இருப்பினும், 10 நாட்களுக்குப் பிறகு, இந்த புள்ளிவிவரங்கள் கடுமையாகக் குறைந்துவிட்டன. எங்கள் முந்தைய நிலையான உயிரிமிமெடிக் கலாச்சார அமைப்பு 20, 21 கட்டுப்பாட்டு நிலைமைகளில் (Ctrl) வளர்க்கப்பட்ட பிரிவுகளை நாங்கள் குறிப்பிடுவோம், மேலும் எங்கள் முன்னர் மேம்படுத்தப்பட்ட ஊடகத்தை MC நிலைமைகள் மற்றும் ஒரே நேரத்தில் இயந்திர மற்றும் மின் தூண்டுதலின் கீழ் வளர்ப்பு (CTCM) எனப் பயன்படுத்துவோம். என்று அழைக்கப்படுகிறது. முதலில், மின் தூண்டுதல் இல்லாமல் இயந்திர தூண்டுதல் 6 நாட்களுக்கு திசு நம்பகத்தன்மையை பராமரிக்க போதுமானதாக இல்லை என்று நாங்கள் தீர்மானித்தோம் (துணை படம். 3a,b). சுவாரஸ்யமாக, STCM ஐப் பயன்படுத்தி இயற்பியல்-இயந்திர மற்றும் மின் தூண்டுதலை அறிமுகப்படுத்தியதன் மூலம், 12-நாள் இதயப் பிரிவுகளின் நம்பகத்தன்மை MS நிலைமைகளின் கீழ் புதிய இதயப் பிரிவுகளைப் போலவே இருந்தது, ஆனால் Ctrl நிலைமைகளின் கீழ் அல்ல, MTT பகுப்பாய்வு (படம். 1) மூலம் காட்டப்பட்டுள்ளது. 3a). இது, இயந்திர தூண்டுதல் மற்றும் இதய சுழற்சியின் உருவகப்படுத்துதல், நமது முந்தைய நிலையான கலாச்சார அமைப்பில் பதிவாகியுள்ளதை விட இரண்டு மடங்கு நீண்ட காலத்திற்கு திசு பிரிவுகளை சாத்தியமானதாக வைத்திருக்க முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது. இருப்பினும், இதய ட்ரோபோனின் T மற்றும் கனெக்சின் 43 இன் இம்யூனோலேபிளிங் மூலம் திசு பிரிவுகளின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை மதிப்பிடுவது, அதே நாளில் உள்ள கட்டுப்பாடுகளை விட 12 ஆம் நாளில் MC திசுக்களில் கனெக்சின் 43 வெளிப்பாடு கணிசமாக அதிகமாக இருந்தது என்பதைக் காட்டுகிறது. இருப்பினும், சீரான கனெக்சின் 43 வெளிப்பாடு மற்றும் Z-வட்டு உருவாக்கம் முழுமையாக பராமரிக்கப்படவில்லை (படம் 3b). திசு கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை அளவிட ஒரு செயற்கை நுண்ணறிவு (AI) கட்டமைப்பை நாங்கள் பயன்படுத்துகிறோம்26, உள்ளூர்மயமாக்கலின் வலிமையின் அடிப்படையில் இதய துண்டுகளின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு மற்றும் ஒளிரும் தன்மையை தானாகவே அளவிட ட்ரோபோனின்-T மற்றும் கனெக்சின் கறையை அடிப்படையாகக் கொண்ட பட அடிப்படையிலான ஆழமான கற்றல் குழாய்43. குறிப்பில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, தானியங்கி மற்றும் பாரபட்சமற்ற முறையில் இதய திசுக்களின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை நம்பத்தகுந்த முறையில் அளவிட இந்த முறை ஒரு கன்வல்யூஷனல் நியூரல் நெட்வொர்க் (CNN) மற்றும் ஆழமான கற்றல் கட்டமைப்பைப் பயன்படுத்துகிறது. 26. நிலையான கட்டுப்பாட்டு பிரிவுகளுடன் ஒப்பிடும்போது MC திசு நாள் 0 உடன் மேம்பட்ட கட்டமைப்பு ஒற்றுமையைக் காட்டியது. கூடுதலாக, மாஸனின் ட்ரைக்ரோம் சாயமிடுதல், MS நிலைமைகளின் கீழ் ஃபைப்ரோஸிஸின் சதவீதத்தை வளர்ப்பின் 12 ஆம் நாளில் கட்டுப்பாட்டு நிலைமைகளுடன் ஒப்பிடும்போது கணிசமாகக் குறைவாகக் காட்டியது (படம் 3c). CTCM இதய திசுப் பிரிவுகளின் நம்பகத்தன்மையை 12 ஆம் நாளில் புதிய இதய திசுக்களைப் போன்ற நிலைக்கு அதிகரித்தாலும், அது இதயப் பிரிவுகளின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை கணிசமாக மேம்படுத்தவில்லை.
நிலையான வளர்ப்பில் (D12 Ctrl) அல்லது CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) துண்டுகள்/குழுவில் வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து 12 நாட்களுக்கு புதிய இதயத் துண்டுகள் (D0) அல்லது இதயத் துண்டுகள் வளர்ப்பின் MTT நம்பகத்தன்மையின் அளவீட்டை ஒரு பார் வரைபடம் காட்டுகிறது, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; ####p < 0.0001 உடன் ஒப்பிடும்போது D0 மற்றும் **p < 0.01 உடன் ஒப்பிடும்போது D12 Ctrl). ஒரு பார் வரைபடம், புதிய இதயத் துண்டுகள் (D0) அல்லது இதயத் துண்டுகள் வளர்ப்பின் MTT நம்பகத்தன்மையை 12 நாட்களுக்கு நிலையான வளர்ப்பில் (D12 Ctrl) அல்லது CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) துண்டுகள்/குழுவில் வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; ####p < 0.0001 உடன் ஒப்பிடும்போது D0 மற்றும் **p < 0.01 உடன் ஒப்பிடும்போது D12 Ctrl).நிலையான வளர்ப்பு (D12 கட்டுப்பாடு) அல்லது CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 கட்டுப்பாடு) ஆகியவற்றில் 12 நாட்களுக்கு MTT புதிய இதயப் பிரிவுகள் (D0) அல்லது இதயப் பிரிவுகளின் வளர்ப்பின் நம்பகத்தன்மையின் அளவை ஹிஸ்டோகிராம் காட்டுகிறது. ) ), வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து 12 (D12 MC) பிரிவுகள்/குழுவில், ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது;####p <0,0001 по сравнению с D0 и **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் **p < 0.01 D12 உடன் ஒப்பிடும்போது Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(形心脏)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行测试；与D0 相比,####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p <0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(形心脏) ，来自不同猪的12 (D12 MC)புதிய இதயப் பிரிவுகளில் (D0) அல்லது நிலையான வளர்ப்பு (D12 கட்டுப்பாடு) அல்லது CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 கட்டுப்பாடு)), 12 (D12 MC) பிரிவுகள்/குழுவில் வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து 12 நாட்களுக்கு வளர்க்கப்பட்ட இதயப் பிரிவுகளில் MTT நம்பகத்தன்மையின் அளவைக் காட்டும் ஹிஸ்டோகிராம், ஒரு வழி ANOVA சோதனை;####p <0,0001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​**p < 0.01 D12 உடன் ஒப்பிடும்போது Ctrl).b புதிதாக தனிமைப்படுத்தப்பட்ட இதயப் பிரிவுகளில் (D0) அல்லது நிலையான நிலைமைகளின் கீழ் (Ctrl) அல்லது CTCM நிலைமைகளின் கீழ் (MC) 12 நாட்களுக்கு வளர்க்கப்பட்ட இதயப் பிரிவுகளில் ட்ரோபோனின்-T (பச்சை), கனெக்சின் 43 (சிவப்பு) மற்றும் DAPI (நீலம்) பிரதிநிதித்துவ இம்யூனோஃப்ளோரசன்ஸ் படங்கள் (வெற்று அளவுகோல் = 100 µm). இதய திசுக்களின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டின் செயற்கை நுண்ணறிவு அளவீடு (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) துண்டுகள்/குழுக்கள் ஒவ்வொன்றும் வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; ####p < 0.0001 உடன் ஒப்பிடும்போது D0 மற்றும் ****p < 0.0001 உடன் ஒப்பிடும்போது D12 Ctrl). இதய திசுக்களின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டின் செயற்கை நுண்ணறிவு அளவீடு (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) துண்டுகள்/குழுக்கள் ஒவ்வொன்றும் வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; ####p < 0.0001 உடன் ஒப்பிடும்போது D0 மற்றும் ****p < 0.0001 உடன் ஒப்பிடும்போது D12 Ctrl). கோலிசெஸ்ட்வென்னாயா ஓசென்கா ஸ்ட்ரக்டர்னோய் செலோஸ்ட்னோஸ்டி சர்டெச்னோய் டிகானி இஸ்கஸ்ட்வென்னிம் இன்டெலக்டோம் (n = 7D10), (n = 7D10), MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный TEST ANOVA; сравнению с D12 Ctrl). செயற்கை நுண்ணறிவு (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) பிரிவுகள்/குழுக்கள் மூலம் வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து இதய திசுக்களின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை அளவிடுதல், ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; ####p < 0.0001 vs. D0 மற்றும் ****p < 0.0001 உடன் ஒப்பிடும்போது D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ஸ்லைஸ்கள்/குரூப் ஒவ்வொன்றும் வெவ்வேறு பன்றிகள், ஒரு-வழி ANOVA சோதனை <#0#.相比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ஸ்லைஸ்கள்/குரூப் ஒவ்வொன்றும் வெவ்வேறு பன்றிகள், <##.#000 சோதனை;与D0相比,**p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный INTELLEKT для COLICHESTVENNOY OS STRUCTURNOY SELOSTNOSTI SERDECHNOY TKANI (120l) (n =7lD), (D12 MC) срезов/групу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ###p <0,0001 vs. D0 в сравнению с D12 Ctrl). இதய திசுக்களின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை அளவிடுவதற்கான செயற்கை நுண்ணறிவு (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) பிரிவுகள்/குழுக்கள் ஒவ்வொன்றும் வெவ்வேறு பன்றிகள், ஒரு வழி ANOVA சோதனை; ####p<0.0001 vs .D0 ஒப்பீட்டிற்கு ****p < 0.0001 D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது). c மாசனின் ட்ரைக்ரோம் கறையுடன் கறை படிந்த இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவ படங்கள் (இடது) மற்றும் அளவு (வலது) (அளவுகோல் வெற்று = 500 µm) (n = வெவ்வேறு பன்றியிலிருந்து ஒவ்வொன்றும் 10 துண்டுகள்/குழு, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; ####p < 0.0001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் ***p < 0.001 D12 உடன் ஒப்பிடும்போது Ctrl). c மாசனின் ட்ரைக்ரோம் கறையுடன் கறை படிந்த இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவ படங்கள் (இடது) மற்றும் அளவு (வலது) (அளவுகோல் வெற்று = 500 µm) (n = வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து ஒவ்வொன்றும் 10 துண்டுகள்/குழு, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; #### p < 0.0001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் ***p < 0.001 D12 உடன் ஒப்பிடும்போது Ctrl). c. கிராசிட்டேலம் மசோனா (மாஸ்ஷிடப் பெஸ் பொக்ரிட்டிய = 500 எம்.கே.எம்) (n = 10 ஸ்ரேசோவ்/கிருப்பு அல்லது ரஸ்னிக் ஸ்வினி, வைபோன்ட் тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c மாசனின் ட்ரைக்ரோம் கறையால் கறை படிந்த இதயப் பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ படங்கள் (இடது) மற்றும் அளவு (வலது) (பூசப்படாத அளவுகோல் = 500 µm) (n = 10 பிரிவுகள்/வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து குழு, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; #### p < 0 .0001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் ***p < 0.001 D12 உடன் ஒப்பிடும்போது Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（剳）（裸=5 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；### p <0.0001 与D0 相比, 10.00 相比). C 用 மாஸன் 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右裸尺度 = 500 மைமீ 0.0001 与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c. கிராசிட்டெலம் மசோனா (சிஸ்டய ஷகல = 500 எம்.கே.எம்) (n = 10 ஸ்ரேசோவ்/க்ருப்பா, கஜடியில் இருந்து டிருகோய் ஸ்வினிஸ், புரோட்டீஸ் однофакторного дисперсионного анализа ;### #p <0,0001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c மாசனின் ட்ரைக்ரோம் கறையால் கறை படிந்த இதயப் பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ படங்கள் (இடது) மற்றும் அளவு (வலது) (வெற்று = 500 µm) (n = 10 பிரிவுகள்/குழு, ஒவ்வொன்றும் வெவ்வேறு பன்றியிலிருந்து, மாறுபாட்டின் ஒரு வழி பகுப்பாய்வு மூலம் சோதிக்கப்பட்டது;### # p < 0.0001 உடன் ஒப்பிடும்போது D0, ***p < 0.001 உடன் ஒப்பிடும்போது D12 Ctrl).பிழைப் பட்டைகள் சராசரி ± நிலையான விலகலைக் குறிக்கின்றன.
CTCM வளர்ப்பு ஊடகத்தில் சிறிய மூலக்கூறுகளைச் சேர்ப்பதன் மூலம், கார்டியோமயோசைட் ஒருமைப்பாட்டை மேம்படுத்தலாம் மற்றும் ஃபைப்ரோஸிஸ் வளர்ச்சியைக் குறைக்கலாம் என்று நாங்கள் கருதுகிறோம். எனவே, சிறிய எண்ணிக்கையிலான குழப்பமான காரணிகள் காரணமாக, எங்கள் நிலையான கட்டுப்பாட்டு கலாச்சாரங்களைப் பயன்படுத்தி சிறிய மூலக்கூறுகளை நாங்கள் பரிசோதித்தோம். டெக்ஸாமெதாசோன் (டெக்ஸ்), ட்ரையோடோதைரோனைன் (T3), மற்றும் SB431542 (SB) ஆகியவை இந்தத் திரைக்குத் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன. சர்கோமியர் நீளம், டி-குழாய்கள் மற்றும் கடத்தல் வேகத்தை அதிகரிப்பதன் மூலம் கார்டியோமயோசைட்டுகளின் முதிர்ச்சியைத் தூண்டுவதற்கு இந்த சிறிய மூலக்கூறுகள் முன்னர் hiPSC-CM கலாச்சாரங்களில் பயன்படுத்தப்பட்டன. கூடுதலாக, டெக்ஸ் (ஒரு குளுக்கோகார்டிகாய்டு) மற்றும் SB இரண்டும் வீக்கத்தை அடக்குவதாக அறியப்படுகிறது29,30. எனவே, இந்த சிறிய மூலக்கூறுகளில் ஒன்றைச் சேர்ப்பது அல்லது இணைப்பது இதயப் பிரிவுகளின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை மேம்படுத்துமா என்பதை நாங்கள் சோதித்தோம். ஆரம்ப பரிசோதனைக்கு, செல் வளர்ப்பு மாதிரிகளில் (1 μM Dex27, 100 nM T327, மற்றும் 2.5 μM SB31) பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் செறிவுகளின் அடிப்படையில் ஒவ்வொரு சேர்மத்தின் அளவும் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது. 12 நாட்கள் வளர்ப்பிற்குப் பிறகு, T3 மற்றும் Dex ஆகியவற்றின் கலவையானது உகந்த கார்டியோமயோசைட் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு மற்றும் குறைந்தபட்ச நார்ச்சத்து மறுவடிவமைப்பை ஏற்படுத்தியது (துணை படங்கள் 4 மற்றும் 5). கூடுதலாக, T3 மற்றும் Dex இன் இந்த செறிவுகளை இரட்டிப்பாக்குவது அல்லது இரட்டிப்பாக்குவது சாதாரண செறிவுகளுடன் ஒப்பிடும்போது தீங்கு விளைவிக்கும் விளைவுகளை உருவாக்கியது (துணை படம் 6a,b).
ஆரம்ப பரிசோதனைக்குப் பிறகு, 4 கலாச்சார நிலைமைகளின் நேரடி ஒப்பீட்டை நாங்கள் செய்தோம் (படம் 4a): Ctrl: எங்கள் மேம்படுத்தப்பட்ட ஊடகத்தைப் பயன்படுத்தி முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட நிலையான கலாச்சாரத்தில் வளர்க்கப்பட்ட இதயப் பிரிவுகள்; புதன்கிழமை 20.21 TD: T3 மற்றும் Ctrl s சேர்க்கப்பட்ட Dex; MC: எங்கள் முன்னர் மேம்படுத்தப்பட்ட ஊடகத்தைப் பயன்படுத்தி CTCM இல் வளர்க்கப்பட்ட இதயப் பிரிவுகள்; மற்றும் MT: T3 மற்றும் Dex உடன் சேர்க்கப்பட்ட CTCM. 12 நாட்கள் சாகுபடிக்குப் பிறகு, MS மற்றும் MT திசுக்களின் நம்பகத்தன்மை MTT மதிப்பீட்டால் மதிப்பிடப்பட்ட புதிய திசுக்களில் இருந்ததைப் போலவே இருந்தது (படம் 4b). சுவாரஸ்யமாக, டிரான்ஸ்வெல் கலாச்சாரங்களில் (TD) T3 மற்றும் Dex ஐச் சேர்ப்பது Ctrl நிலைமைகளுடன் ஒப்பிடும்போது நம்பகத்தன்மையில் குறிப்பிடத்தக்க முன்னேற்றத்தை ஏற்படுத்தவில்லை, இது இதயப் பிரிவுகளின் நம்பகத்தன்மையைப் பராமரிப்பதில் இயந்திர தூண்டுதலின் முக்கிய பங்கைக் குறிக்கிறது.
12 நாட்களுக்கு நடுத்தரத்தில் இயந்திர தூண்டுதல் மற்றும் T3/Dex சப்ளிமெண்டேஷன் ஆகியவற்றின் விளைவுகளை மதிப்பிடுவதற்குப் பயன்படுத்தப்படும் நான்கு வளர்ப்பு நிலைமைகளை சித்தரிக்கும் ஒரு பரிசோதனை வடிவமைப்பு வரைபடம். b வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து புதிய இதயத் துண்டுகள் (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MT), 12 (D12 MC) துண்டுகள்/குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​4 வளர்ப்பு நிலைகளிலும் (Ctrl, TD, MC, மற்றும் MT) 12 நாட்களுக்குப் பிந்தைய வளர்ப்பு நம்பகத்தன்மையின் அளவை பார் வரைபடம் காட்டுகிறது, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் **p < 0.01 D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது). b வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து புதிய இதயத் துண்டுகள் (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MT), 12 (D12 MC) துண்டுகள்/குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​4 வளர்ப்பு நிலைகளிலும் (Ctrl, TD, MC, மற்றும் MT) 12 நாட்களுக்குப் பிந்தைய வளர்ப்பு நம்பகத்தன்மையின் அளவை பார் வரைபடம் காட்டுகிறது, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் **p < 0.01 D12 ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது). b ஜிஸ்டோகிராம்மா போகாஸிவாட் கோலிசெஸ்ட்வென்னுயூ ஒஷெங்கு ஜிஸ்னெஸ்போசோப்னோஸ்டி செரஸ் 12 நாள் போஸ்லே குல்டிவிங்4 условиях культивирования (கான்ட்ரோல், TD, MC மற்றும் MT) ஸ்ராவ்னேனியூ ஸ்டோ ஸ்வீஜிமி ஸ்ரேஜாமி டி.டி.டி.டி (டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி.டி. மற்றும் D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/grouppu от разных свиней, ப்ரோவோடிட்சியா ஒட்னோஸ்டோரோன்னி டெஸ்ட் ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0 и **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b பட்டை வரைபடம், புதிய இதயப் பிரிவுகள் (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, மற்றும் D12 MT), 12 (D12 MC) பிரிவுகள்/குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​12 நாட்களுக்குப் பிறகு வளர்ப்பு நிலைகளில் (கட்டுப்பாடு, TD, MC, மற்றும் MT) நம்பகத்தன்மையின் அளவைக் காட்டுகிறது, வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு வழி ANOVA சோதனை; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 மற்றும் **p < 0.01 by d12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது). b. Ctrl、D12 TD 和D12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p <0.相比，**p <0.01 与D12控制).பி 4 12 (டி 12 எம்சி) b ஜிஸ்டோகிராம்மா, போகாஸிவாயுஸ் 4 யூஸ்லோவிய குல்டிவிரோவானியா (கோன்ட்ரோல், டிடி, எம்சி மற்றும் எம்டி) மூலம் உருவாக்கம் செர்டா (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MT) <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b வெவ்வேறு பன்றிகள் 12 (D12 MC) பிரிவுகள்/குழுவிலிருந்து, ஒரு வழி ANOVA சோதனையிலிருந்து, புதிய இதயப் பிரிவுகளுடன் (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MT) ஒப்பிடும்போது 4 வளர்ப்பு நிலைகளையும் (கட்டுப்பாடு, TD, MC மற்றும் MT) காட்டும் ஹிஸ்டோகிராம்; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. கட்டுப்பாடு D12). c புதிய இதயத் துண்டுகளுடன் (D0) ஒப்பிடும்போது 4 வளர்ப்பு நிலைகளிலும் (Ctrl, TD, MC, மற்றும் MT) 12 நாட்களுக்குப் பிறகு குளுக்கோஸ் பாய்வின் அளவை பார் வரைபடம் காட்டுகிறது (n = வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து 6 துண்டுகள்/குழு, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; ###p < 0.001, D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் ***p < 0.001 D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது). c புதிய இதயத் துண்டுகளுடன் (D0) ஒப்பிடும்போது 4 வளர்ப்பு நிலைகளிலும் (Ctrl, TD, MC, மற்றும் MT) 12 நாட்களுக்குப் பிறகு குளுக்கோஸ் பாய்வின் அளவை பார் வரைபடம் காட்டுகிறது (n = வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து 6 துண்டுகள்/குழு, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; ###p < 0.001, D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் ***p < 0.001 D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது). c கிஸ்டோகிராம்மா போகாஸிவாட் கோலிசெஸ்ட்வென்னுயூ ஒஷெங்கு போடோகா கிளுகோஸி செரஸ் 12 நாள் போஸ்லே குல்டிவிரோவ்4 உஸ்லோவியக் குல்டிவிரோவானியா (கோண்ட்ரோல், டிடி, எம்சி மற்றும் எம்டி) ஸ்ராவ்னெனியூ மூலம் ஸ்வேஜிமி ஸ்ரேஜாமி சர்திஸ்யா (டி0) (n = 6 ரஜ்னி ஸ்வினி, односторонний Выpolnyaetsya test ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c ஹிஸ்டோகிராம், புதிய இதயப் பிரிவுகளுடன் (D0) ஒப்பிடும்போது, ​​4 வளர்ப்பு நிலைகளிலும் (கட்டுப்பாடு, TD, MC மற்றும் MT) 12 நாட்களுக்குப் பிறகு குளுக்கோஸ் பாய்வின் அளவைக் காட்டுகிறது (n = வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து 6 பிரிவுகள்/குழு, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; ###p < 0.001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் ***p < 0.001 D12 உடன் ஒப்பிடும்போது Ctrl). c.天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试0.001 与D12 Ctrl 相比). C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切 示 切 片மேலும்测试；###p < 0.001,与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）。 கேட்ச் கிஸ்டோகிராம்மா, போகாஸிவாயுஸ்யா கோலிசெஸ்ட்வென்னுயு ஓசென்கு போடோகா கிளுகோஸி செரஸ் 12 டிநேவ் போஸ்லே குல்டு4 условий культивирования (கான்ட்ரோல், TD, MC மற்றும் MT) ஸ்ராவ்னெனியூ மூலம் ஸ்வேஜிமி ஸ்ரேஜாமி சர்திஷா (D0) (n = 6 ரஜ்னி ஸ்வினி, அனோவா ###p <0,001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 (контроль). c புதிய இதயப் பிரிவுகளுடன் (D0) ஒப்பிடும்போது 4 வளர்ப்பு நிலைகளுக்கும் (கட்டுப்பாடு, TD, MC, மற்றும் MT) 12 நாட்களுக்குப் பிறகு குளுக்கோஸ் பாய்வின் அளவைக் காட்டும் ஹிஸ்டோகிராம் (n = 6 பிரிவுகள்/குழு, வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒருதலைப்பட்ச ANOVA சோதனைகள் செய்யப்பட்டனவா, ###p < 0.001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​***p < 0.001 D12 உடன் ஒப்பிடும்போது (கட்டுப்பாடு).d பத்து பிராந்திய திசு பிரிவு புள்ளிகளில் புதிய (நீலம்), நாள் 12 MC (பச்சை), மற்றும் நாள் 12 MT (சிவப்பு) திசுக்களின் திரிபு பகுப்பாய்வு வரைபடங்கள் (n = 4 துண்டுகள்/குழு, ஒரு வழி ANOVA சோதனை; குழுக்களுக்கு இடையே குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு இல்லை). e நிலையான நிலைமைகளின் கீழ் (Ctrl) அல்லது MT நிலைமைகளின் கீழ் (MT) 10-12 நாட்களுக்கு வளர்க்கப்பட்ட இதயப் பிரிவுகளுடன் ஒப்பிடும்போது புதிய இதயப் பிரிவுகளில் (D0) வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்களைக் காட்டும் எரிமலை வரைபடங்கள். f ஒவ்வொரு கலாச்சார நிலைமைகளின் கீழும் வளர்க்கப்பட்ட இதயப் பிரிவுகளுக்கான சர்கோமியர் மரபணுக்களின் வெப்ப வரைபடம். பிழை பார்கள் சராசரி ± நிலையான விலகலைக் குறிக்கின்றன.
கொழுப்பு அமில ஆக்ஸிஜனேற்றத்திலிருந்து கிளைகோலிசிஸுக்கு மாறுவதில் வளர்சிதை மாற்ற சார்பு கார்டியோமயோசைட் டிஃபெரண்டேஷனுக்கான ஒரு அடையாளமாகும். முதிர்ச்சியடையாத கார்டியோமயோசைட்டுகள் முதன்மையாக ATP உற்பத்திக்கு குளுக்கோஸைப் பயன்படுத்துகின்றன மற்றும் சில கிறிஸ்டேவுடன் ஹைப்போபிளாஸ்டிக் மைட்டோகாண்ட்ரியாவைக் கொண்டுள்ளன5,32. குளுக்கோஸ் பயன்பாட்டு பகுப்பாய்வுகள் MC மற்றும் MT நிலைமைகளின் கீழ், குளுக்கோஸ் பயன்பாடு நாள் 0 திசுக்களில் இருந்ததைப் போலவே இருந்தது என்பதைக் காட்டியது (படம் 4c). இருப்பினும், Ctrl மாதிரிகள் புதிய திசுக்களுடன் ஒப்பிடும்போது குளுக்கோஸ் பயன்பாட்டில் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பைக் காட்டின. CTCM மற்றும் T3/Dex ஆகியவற்றின் கலவையானது திசு நம்பகத்தன்மையை மேம்படுத்துகிறது மற்றும் 12-நாள் வளர்ப்பு இதயப் பிரிவுகளின் வளர்சிதை மாற்ற பினோடைப்பைப் பாதுகாக்கிறது என்பதை இது குறிக்கிறது. கூடுதலாக, திரிபு பகுப்பாய்வு MT மற்றும் MS நிலைமைகளின் கீழ் 12 நாட்களுக்கு புதிய இதய திசுக்களில் உள்ளதைப் போலவே திரிபு அளவுகள் அப்படியே இருந்தன என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 4d).
கார்டியாக் ஸ்லைஸ் திசுக்களின் உலகளாவிய டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் நிலப்பரப்பில் CTCM மற்றும் T3/Dex இன் ஒட்டுமொத்த தாக்கத்தை பகுப்பாய்வு செய்ய, நான்கு வெவ்வேறு கலாச்சார நிலைகளிலிருந்தும் கார்டியாக் ஸ்லைஸ்களில் RNAseq ஐ நாங்கள் செய்தோம் (துணை தரவு 1). சுவாரஸ்யமாக, MT பிரிவுகள் புதிய இதய திசுக்களுடன் அதிக டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஒற்றுமையைக் காட்டின, 13,642 மரபணுக்களில் 16 மட்டுமே வித்தியாசமாக வெளிப்படுத்தப்பட்டன. இருப்பினும், நாங்கள் முன்பு காட்டியபடி, Ctrl துண்டுகள் கலாச்சாரத்தில் 10-12 நாட்களுக்குப் பிறகு 1229 வித்தியாசமாக வெளிப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்களைக் காட்டின (படம் 4e). இந்தத் தரவுகள் இதயம் மற்றும் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட் மரபணுக்களின் qRT-PCR ஆல் உறுதிப்படுத்தப்பட்டன (துணை படம் 7a-c). சுவாரஸ்யமாக, Ctrl பிரிவுகள் கார்டியாக் மற்றும் செல் சுழற்சி மரபணுக்களின் குறைப்பு மற்றும் அழற்சி மரபணு நிரல்களின் செயல்பாட்டைக் காட்டின. இந்தத் தரவுகள் பொதுவாக நீண்ட கால வளர்ப்பிற்குப் பிறகு நிகழும் டிடிஃபெரண்டேஷன், MT நிலைமைகளின் கீழ் முற்றிலும் பலவீனமடைகிறது என்பதைக் குறிக்கின்றன (துணை படம் 8a,b). சர்கோமியர் மரபணுக்களை கவனமாக ஆய்வு செய்ததில், MT நிலைமைகளின் கீழ் மட்டுமே சர்கோமியர் (படம் 4f) மற்றும் அயன் சேனல் (துணை படம் 9) ஆகியவற்றை குறியாக்கம் செய்யும் மரபணுக்கள் பாதுகாக்கப்படுகின்றன, அவை Ctrl, TD மற்றும் MC நிலைமைகளின் கீழ் அடக்குதலிலிருந்து பாதுகாக்கப்படுகின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது. இயந்திர மற்றும் நகைச்சுவை தூண்டுதலின் (T3/Dex) கலவையுடன், இதய துண்டு டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் 12 நாட்கள் கலாச்சாரத்திற்குப் பிறகு புதிய இதய துண்டுகளைப் போலவே இருக்க முடியும் என்பதை இந்தத் தரவுகள் நிரூபிக்கின்றன.
இதயப் பிரிவுகளில் உள்ள கார்டியோமயோசைட்டுகளின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு 12 நாட்களுக்கு MT நிலைமைகளின் கீழ் சிறப்பாகப் பாதுகாக்கப்படுகிறது என்பதன் மூலம் இந்த டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் கண்டுபிடிப்புகள் ஆதரிக்கப்படுகின்றன, இது அப்படியே மற்றும் உள்ளூர்மயமாக்கப்பட்ட கனெக்சின் 43 (படம் 5a) மூலம் காட்டப்பட்டுள்ளது. கூடுதலாக, MT நிலைமைகளின் கீழ் இதயப் பிரிவுகளில் ஃபைப்ரோஸிஸ் Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது கணிசமாகக் குறைக்கப்பட்டது மற்றும் புதிய இதயப் பிரிவுகளைப் போலவே இருந்தது (படம் 5b). இயந்திர தூண்டுதல் மற்றும் T3/Dex சிகிச்சையின் கலவையானது கலாச்சாரத்தில் இதயப் பிரிவுகளில் இதய அமைப்பை திறம்பட பாதுகாக்கிறது என்பதை இந்தத் தரவுகள் நிரூபிக்கின்றன.
புதிதாக தனிமைப்படுத்தப்பட்ட இதயப் பிரிவுகளில் (D0) அல்லது நான்கு இதயப் பிரிவு வளர்ப்பு நிலைகளிலும் 12 நாட்களுக்கு வளர்க்கப்பட்ட ட்ரோபோனின்-T (பச்சை), கனெக்சின் 43 (சிவப்பு) மற்றும் DAPI (நீலம்) ஆகியவற்றின் பிரதிநிதித்துவ இம்யூனோஃப்ளோரசன்ஸ் படங்கள் (அளவுகோல் = 100 µm). ). வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து இதய திசுக்களின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு (n = 7 (D0 மற்றும் D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC மற்றும் D12 MT) துண்டுகள்/குழுவின் செயற்கை நுண்ணறிவு அளவீடு, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; ####p < 0.0001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் *p < 0.05, அல்லது ****p < 0.0001 D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது). வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து இதய திசுக்களின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு (n = 7 (D0 மற்றும் D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC மற்றும் D12 MT) துண்டுகள்/குழுவின் செயற்கை நுண்ணறிவு அளவீடு, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; #### p < 0.0001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் *p < 0.05, அல்லது ****p < 0.0001 D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது). கோலிசெஸ்ட்வென்னாயா ஓசென்கா ஸ்ட்ரக்டர்னோய் செலோஸ்ட்னோஸ்டி ட்கானி செர்டிசா ஸ் போமோஷ்யு இஸ்குஸ்ட்வென்னோகோ (2000 டி.டி.எல். Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC மற்றும் D12 MT) срезов/групу от разных свиней, proveden однофакторный TEST ANOVA <#,#00; сравнению с D0 и *p <0,05 или ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). வெவ்வேறு பன்றிகளிடமிருந்து செயற்கை நுண்ணறிவு (n = 7 (D0 மற்றும் D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC மற்றும் D12 MT) பிரிவுகள்/குழுவைப் பயன்படுத்தி இதய திசுக்களின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டின் அளவீடு, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; #### p < 0.0001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் *p < 0.05 அல்லது ****p < 0.0001 D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD,D12 MC 和D12 எம்டி 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。மேலும்人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p <0.0001 与D0 和*p, <0.001 与D0 和*p, <0.0.0 0.0001 与D12 Ctrl 相比).வெவ்வேறு பன்றிகளில் (n = 7 (D0 மற்றும் D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC மற்றும் D12 MT) பிரிவுகள்/குழு) செயற்கை நுண்ணறிவைப் பயன்படுத்தி இதய திசுக்களின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை ஒரு வழி ANOVA சோதனை மூலம் அளவிடுதல்;#### p <0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் *p < 0.05 அல்லது ****p < 0.0001 D12 உடன் ஒப்பிடும்போது Ctrl). b மாசனின் ட்ரைக்ரோம் கறையுடன் கறை படிந்த இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவ படங்கள் மற்றும் அளவு (அளவுகோல் = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, மற்றும் D12 MC), வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து 9 (D12 MT) துண்டுகள்/குழு, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; ####p < 0.0001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் ***p < 0.001, அல்லது ****p < 0.0001 D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது). b மாசனின் ட்ரைக்ரோம் கறையுடன் கறை படிந்த இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவ படங்கள் மற்றும் அளவு (அளவுகோல் = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, மற்றும் D12 MC), வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து 9 (D12 MT) துண்டுகள்/குழு, ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; ####p < 0.0001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் ***p < 0.001, அல்லது ****p < 0.0001 D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது). b ரெப்ரெசென்டடிவ்ன்ய் இசோபிராஜெனியா மற்றும் கோலிசெஸ்ட்வென்னாயா ஓசென்கா ஸ்ரேசோவ் செர்டிசா, ஒக்ரசென்னிக் ட்ரைக்ரோம்ஸ்னாஸ் (மாசிட்டப் லைனிகா = 500 எம்.கே.எம்) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MC), 9 (D12 MT) односторонний TEST ANOVA; ####p <0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b மாசனின் ட்ரைக்ரோம் கறையால் கறை படிந்த இதயப் பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ படங்கள் மற்றும் அளவு (அளவுகோல் = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MC), 9 (D12 MT) பிரிவுகள்/குழு வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு வழி ANOVA செய்யப்பட்டது; ####p < 0.0001 vs. D0 மற்றும் ***p < 0.001 அல்லது ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比和量化（比例尺= 500m（n =201（n Ctrl.与D0 相比，***p < 0.001,或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 மாஸன் 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代 表性 和 量化 （比 尺 尺 尺 = 500 µn = 1m 、 d12 ctrl.切片 切片 மேலும்相比,***p <0.001,或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b ரெப்ரெசென்டடிவ்னி இசோபிராஜெனியா மற்றும் கோலிசெஸ்ட்வென்னயா ஓசென்கா ஸ்ரேசோவ் செர்ட்சா, ஆக்ரசென்னிஹ் ட்ரைக்ரோமோஸ்ம் линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MC), 9 (D12 MT) வரிசைப்படுத்துதல் 0,0001 PO сравнению с D0, ***p <0,001 или ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b மாசனின் ட்ரைக்ரோம் (அளவீட்டுப் பட்டை = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MC), வெவ்வேறு பன்றிகள்/குழுவிலிருந்து 9 (D12 MT) பிரிவுகள், ஒரு ANOVA முறையுடன் படிந்த இதயப் பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ படங்கள் மற்றும் அளவுப்படுத்தல்; ####p < 0.0001 உடன் ஒப்பிடும்போது D0, ***p < 0.001 அல்லது ****p < 0.0001 உடன் ஒப்பிடும்போது D12 Ctrl).பிழைப் பட்டைகள் சராசரி ± நிலையான விலகலைக் குறிக்கின்றன.
இறுதியாக, இதய திசுக்களின் நீட்சியை அதிகரிப்பதன் மூலம் இதய ஹைபர்டிராஃபியைப் பிரதிபலிக்கும் CTCM இன் திறன் மதிப்பிடப்பட்டது. CTCM இல், உச்ச காற்று அறை அழுத்தம் 80 mmHg இலிருந்து 80 mmHg ஆக அதிகரித்தது. கலை. (சாதாரண நீட்சி) 140 mmHg வரை கலை. (படம். 6a). இது நீட்சியில் 32% அதிகரிப்புக்கு ஒத்திருக்கிறது (படம். 6b), இது முன்னர் இதயப் பிரிவுகள் ஹைபர்டிராஃபியில் காணப்படுவதைப் போன்ற சர்கோமியர் நீளத்தை அடையத் தேவையான தொடர்புடைய சதவீத நீட்சியாகக் காட்டப்பட்டது. சுருக்கம் மற்றும் தளர்வின் போது இதய திசுக்களின் நீட்சி மற்றும் வேகம் ஆறு நாட்கள் வளர்ப்பின் போது மாறாமல் இருந்தது (படம். 6c). MT நிலைகளிலிருந்து வரும் இதய திசுக்கள் ஆறு நாட்களுக்கு சாதாரண நீட்சி (MT (சாதாரண)) அல்லது ஓவர் ஸ்ட்ரெட்ச் நிலைமைகளுக்கு (MT (OS)) உட்படுத்தப்பட்டன. கலாச்சாரத்தில் ஏற்கனவே நான்கு நாட்களுக்குப் பிறகு, MT (சாதாரண) நிலைமைகளுடன் ஒப்பிடும்போது MT (OS) நிலைமைகளின் கீழ் ஹைபர்டிராஃபிக் பயோமார்க்கர் NT-ProBNP ஊடகத்தில் கணிசமாக உயர்த்தப்பட்டது (படம். 7a). கூடுதலாக, ஆறு நாட்கள் வளர்ப்புக்குப் பிறகு, MT (OS) இல் உள்ள செல் அளவு (படம் 7b) MT இதயத்தின் பிரிவுகளுடன் ஒப்பிடும்போது (சாதாரணமானது) கணிசமாக அதிகரித்தது. கூடுதலாக, அதிகமாக நீட்டப்பட்ட திசுக்களில் NFATC4 அணுக்கரு இடமாற்றம் கணிசமாக அதிகரித்தது (படம் 7c). இந்த முடிவுகள் ஹைப்பர்டிஸ்டென்ஷனுக்குப் பிறகு நோயியல் மறுவடிவமைப்பின் முற்போக்கான வளர்ச்சியைக் காட்டுகின்றன மற்றும் CTCM சாதனத்தை நீட்சி-தூண்டப்பட்ட இதய ஹைபர்டிராபி சிக்னலைப் படிக்க ஒரு தளமாகப் பயன்படுத்தலாம் என்ற கருத்தை ஆதரிக்கின்றன.
காற்று அறை அழுத்தம், திரவ அறை அழுத்தம் மற்றும் திசு இயக்க அளவீடுகளின் பிரதிநிதித்துவ தடயங்கள், அறை அழுத்தம் திரவ அறை அழுத்தத்தை மாற்றுகிறது, இதனால் திசு துண்டின் தொடர்புடைய இயக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது என்பதை உறுதிப்படுத்துகின்றன. b பொதுவாக நீட்டப்பட்ட (ஆரஞ்சு) மற்றும் அதிகமாக நீட்டப்பட்ட (நீலம்) திசு பிரிவுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவ நீட்சி சதவீதம் மற்றும் நீட்சி விகித வளைவுகள். c சுழற்சி நேரத்தைக் காட்டும் பார் வரைபடம் (n = 19 துண்டுகள், வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, சுருக்க நேரம் (n = 18-19 துண்டுகள், வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து), தளர்வு நேரம் (n = 19 துண்டுகள், வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து) ), திசு இயக்கத்தின் வீச்சு (n = 14 துண்டுகள்/குழு, வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து), உச்ச சிஸ்டாலிக் வேகம் (n = 14 துண்டுகள்/குழு, வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து) மற்றும் உச்ச தளர்வு விகிதம் (n = 14 (D0), 15 (D6) ) வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து பிரிவுகள்/குழுக்கள்), இரண்டு வால் கொண்ட மாணவரின் t-சோதனை எந்த அளவுருவிலும் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாட்டைக் காட்டவில்லை, இந்த அளவுருக்கள் அதிக மின்னழுத்தத்துடன் 6 நாட்கள் கலாச்சாரத்தில் மாறாமல் இருப்பதைக் குறிக்கிறது. பிழை பார்கள் சராசரி ± நிலையான விலகலைக் குறிக்கின்றன.
வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து MT இயல்பான நீட்சி (Norm) அல்லது மிகை நீட்சி (OS) நிலைமைகளின் கீழ் வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளிலிருந்து (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, மற்றும் D4 MTOS) துண்டுகள்/குழுவிலிருந்து வளர்ப்பு ஊடகத்தில் NT-ProBNP செறிவின் பார் வரைபட அளவீடு, இருவழி ANOVA செய்யப்படுகிறது; **p < சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது 0.01). வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து MT இயல்பான நீட்சி (Norm) அல்லது மிகை நீட்சி (OS) நிலைமைகளின் கீழ் வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளிலிருந்து (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, மற்றும் D4 MTOS) துண்டுகள்/குழுவிலிருந்து வளர்ப்பு ஊடகத்தில் NT-ProBNP செறிவின் பார் வரைபட அளவீடு, இருவழி ANOVA செய்யப்படுகிறது; **p < 0.01 சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது).சாதாரண MT நீட்சி (விதிமுறை) அல்லது மிகை நீட்சி (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, மற்றும் D4).MTOS) வெவ்வேறு பன்றிகளின் துண்டுகள்/குழுவின் கீழ் வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளிலிருந்து வளர்ப்பு ஊடகத்தில் NT-ProBNP செறிவின் அளவு ஹிஸ்டோகிராம், மாறுபாட்டின் இரண்டு காரணி பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது). எ浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS,D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p < 0.01). MT நார்மல் ஸ்ட்ரெச் (Norm) அல்லது overstretch (OS) நிலைகளில் (n= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) ஆகியவற்றின் கீழ் வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளில் NT-ProBNP செறிவின் அளவு猪的切片/组，可以双向方方发发动, சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​ப <0.01).ஹிஸ்டோகிராம் சாதாரண MT நீட்சி (விதிமுறை) அல்லது மிகை நீட்சி (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) மற்றும் D4 MTOS) வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து துண்டுகள்/குழுவின் கீழ் வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளில் NT-ProBNP செறிவுகளின் அளவு, மாறுபாட்டின் இருவழி பகுப்பாய்வு;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது). b வெவ்வேறு பன்றிகளின் 10 வெவ்வேறு துண்டுகளிலிருந்து ட்ரோபோனின்-T மற்றும் WGA (இடது) மற்றும் செல் அளவு அளவீடு (வலது) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) செல்கள்/குழு ஆகியவற்றால் கறை படிந்த இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவ படங்கள், இரண்டு வால் கொண்ட மாணவர் டி-சோதனை செய்யப்படுகிறது; ****p < சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது 0.0001). b வெவ்வேறு பன்றிகளின் 10 வெவ்வேறு துண்டுகளிலிருந்து ட்ரோபோனின்-T மற்றும் WGA (இடது) மற்றும் செல் அளவு அளவீடு (வலது) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) செல்கள்/குழு ஆகியவற்றால் கறை படிந்த இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவ படங்கள், இரண்டு வால் கொண்ட மாணவர் டி-சோதனை செய்யப்படுகிறது; ****p < சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது 0.0001). b ரெப்ரெசென்டடிவ்னி இஸோப்ராஜெனியா ஸ்ரேசோவ் செர்டா, ஒக்ரசென்னிக் ட்ரோபோனிம்-டி மற்றும் அன்ஜிட் (ஸ்லேவா) மற்றும் கோஸ்டோல் ஆப்ரேடலினிய ராஸ்மேரா கிளெடோக் (ஸ்ப்ரவா) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) கிளெடோக்/கிருப்பு அல்லது 10 ராஸ்மேரா கிளெடோக் проводится хвостовой t-கிரிட்டரி ஸ்டேஷன்; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து 10 வெவ்வேறு பிரிவுகளிலிருந்து ட்ரோபோனின்-T மற்றும் AZP (இடது) மற்றும் செல் அளவு அளவீடு (வலது) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) செல்கள்/குழு ஆகியவற்றால் கறை படிந்த இதயப் பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ படங்கள், இரண்டு வால் கொண்ட மாணவரின் t-சோதனை செய்யப்பட்டது; ****p < 0.0001 சாதாரண திரிபுடன் ஒப்பிடும்போது). ப MTOS, 来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组,两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p <0.0001）。 b கால்கேரின்-T மற்றும் WGA (இடது) மற்றும் செல் அளவு (வலது) ஆகியவற்றால் கறை படிந்த இதயத் துண்டுகளின் பிரதிநிதித்துவ படங்கள் (n = 330 (D6 MTOS), 10 வெவ்வேறு துண்டுகளிலிருந்து 369 (D6 MTNorm)) செல்கள்/புள்ளிவிவரங்கள், சுருள் வடிவ நீர்ப்புகா சோதனை; சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது，***p < 0.0001). b ரெப்ரெசென்டடிவ்னி இஸோப்ராஜெனிய ஸ்ரேசோவ் செர்டிசா, ஒக்ரசென்னிக் ட்ரோபோனிம்-டி மற்றும் அன்காட் (ஸ்லேவா) மற்றும் கோஸ்டோல் ராஸ்மேரா கிளெடோக் (ஸ்ப்ராவா) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) அதாவது 10 ரேஸ்லிக் ஸ்ரேசோவ், ரஸ்னிக் ஸ்வினியர் கிளட், க்ளோட்க் கிரிட்டரி ஸ்டியுடெண்டா; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ட்ரோபோனின்-T மற்றும் AZP (இடது) ஆகியவற்றால் கறை படிந்த இதயப் பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ படங்கள் மற்றும் செல் அளவை அளவிடுதல் (வலது) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து 10 வெவ்வேறு பிரிவுகளிலிருந்து) செல்கள்/குழு, இரண்டு-வால் அளவுகோல் மாணவர்களின் t; ****p < 0.0001 சாதாரண திரிபுடன் ஒப்பிடும்போது). c ட்ரோபோனின்-T மற்றும் NFATC4 க்காக இம்யூனோலேபிளிடப்பட்ட நாள் 0 மற்றும் நாள் 6 MTOS இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவ படங்கள் மற்றும் வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து CM களின் கருக்களுக்கு (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) துண்டுகள்/குழுவிற்கு NFATC4 இன் இடமாற்றத்தின் அளவீடு, இரண்டு வால் கொண்ட மாணவர் t-சோதனை செய்யப்படுகிறது; *p < 0.05). c ட்ரோபோனின்-T மற்றும் NFATC4 க்காக இம்யூனோலேபிளிடப்பட்ட நாள் 0 மற்றும் நாள் 6 MTOS இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவ படங்கள் மற்றும் வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து CM களின் கருக்களுக்கு NFATC4 இன் இடமாற்றத்தின் அளவு (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) துண்டுகள்/குழு, இரண்டு வால் கொண்ட மாணவர் t-சோதனை செய்யப்படுகிறது; *p < 0.05). c ரெப்ரெசென்டடிவ்னி இசோபிராஜெனியா ஸ்ரேசோவ் செர்டிசா 0 மற்றும் 6 நாள் MTOS, இம்முனோமெசென்டிவ் டிலையா ட்ரோபோனினா-டிசிடி, கோலிசெஸ்ட்வென்னாயா ஒசென்கா டிரான்ஸ்லோகாசிகள் NFATC4 மற்றும் யாத்ரா காவேர்னோஸ்னிக் கிளெடாக் (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ஸ்ரேசோவ், க்ரூப்ஸ் வைபோல்னியட்சியா டி-கிரிடெரி ஸ்டேஷன்; *ப <0,05). c 0 மற்றும் 6 நாட்களில் இதயப் பிரிவுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவ படங்கள், ட்ரோபோனின்-T மற்றும் NFATC4 க்கு இம்யூனோலேபிளிடப்பட்டது, மற்றும் கேவர்னஸ் செல்களின் கருவில் NFATC4 இடமாற்றத்தின் அளவு (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) துண்டுகள்/வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து குழு) இரண்டு வால் கொண்ட மாணவர்களின் t-சோதனை செய்யப்பட்டது; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0.05)。 c calcanin-T மற்றும் NFATC4 இம்யூனோலேபிளிங் 第0天和第6天MTOS இதயத் துண்டுகள் மற்றும் NFATC4 ஆகியவற்றின் வெவ்வேறு NFATC4 易位至CM செல் நியூக்ளியஸ் 的quantity化 (n = 4 (D0TO)) ஆகியவற்றின் பிரதிநிதி படங்கள்切礼/组, 时间双尾学生et 电影；*p <0.05). கேட்ச் 0 மற்றும் 6 தேதிகளில் இம்முனோமார்கிரோவ்கி டிராபோனிம்-4. கோலிசெஸ்ட்வென்னாயா ஆசென்கா டிரான்ஸ்லோகாசிகள் NFATC4 ல் யட்ரா சிஎம் முதல் ரஜ்னிக் ஸ்வினி (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ஸ்ரேஸ்/குருப்பா, t-критерий Стьюдента; 0,05). c வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) துண்டுகள்/குழு, இரண்டு-வால் t - மாணவர்களின் அளவுகோல்; *p < 0.05) CM இன் கருவில் NFATC4 இடமாற்றத்தின் ட்ரோபோனின்-T மற்றும் NFATC4 இம்யூனோலேபிளிங் மற்றும் அளவீட்டுக்கான 0 மற்றும் 6 ஆம் நாட்களில் MTOS இதயத் துண்டுகளின் பிரதிநிதித்துவ படங்கள்.பிழைப் பட்டைகள் சராசரி ± நிலையான விலகலைக் குறிக்கின்றன.
மொழிபெயர்ப்பு இருதய ஆராய்ச்சிக்கு இதய சூழலை துல்லியமாக இனப்பெருக்கம் செய்யும் செல்லுலார் மாதிரிகள் தேவை. இந்த ஆய்வில், இதயத்தின் மிக மெல்லிய பகுதிகளைத் தூண்டக்கூடிய ஒரு CTCM சாதனம் உருவாக்கப்பட்டு வகைப்படுத்தப்பட்டது. CTCM அமைப்பில் உடலியல் ரீதியாக ஒத்திசைக்கப்பட்ட மின் இயந்திர தூண்டுதல் மற்றும் T3 மற்றும் டெக்ஸ் திரவ செறிவூட்டல் ஆகியவை அடங்கும். பன்றி இதயப் பகுதிகள் இந்த காரணிகளுக்கு ஆளானபோது, ​​அவற்றின் நம்பகத்தன்மை, கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு, வளர்சிதை மாற்ற செயல்பாடு மற்றும் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் வெளிப்பாடு ஆகியவை 12 நாட்கள் வளர்ப்பிற்குப் பிறகு புதிய இதய திசுக்களில் இருந்ததைப் போலவே இருந்தன. கூடுதலாக, இதய திசுக்களின் அதிகப்படியான நீட்சி ஹைப்பர் எக்ஸ்டென்ஷனால் ஏற்படும் இதயத்தின் ஹைபர்டிராஃபியை ஏற்படுத்தும். ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள் ஒரு சாதாரண இதய பினோடைப்பை பராமரிப்பதில் உடலியல் கலாச்சார நிலைமைகளின் முக்கிய பங்கை ஆதரிக்கின்றன மற்றும் மருந்து பரிசோதனைக்கு ஒரு தளத்தை வழங்குகின்றன.
கார்டியோமயோசைட்டுகளின் செயல்பாடு மற்றும் உயிர்வாழ்விற்கான உகந்த சூழலை உருவாக்குவதற்கு பல காரணிகள் பங்களிக்கின்றன. இந்த காரணிகளில் மிகவும் வெளிப்படையானவை (1) இன்டர்செல்லுலர் இடைவினைகள், (2) எலக்ட்ரோமெக்கானிக்கல் தூண்டுதல், (3) ஹ்யூமரல் காரணிகள் மற்றும் (4) வளர்சிதை மாற்ற அடி மூலக்கூறுகள் ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையவை. உடலியல் செல்-க்கு-செல் இடைவினைகளுக்கு ஒரு எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் மேட்ரிக்ஸால் ஆதரிக்கப்படும் பல செல் வகைகளின் சிக்கலான முப்பரிமாண நெட்வொர்க்குகள் தேவைப்படுகின்றன. இத்தகைய சிக்கலான செல்லுலார் இடைவினைகள் தனிப்பட்ட செல் வகைகளின் இணை-வளர்ச்சி மூலம் இன் விட்ரோவில் மறுகட்டமைப்பது கடினம், ஆனால் இதயப் பிரிவுகளின் ஆர்கனோடைபிக் தன்மையைப் பயன்படுத்தி எளிதாக அடைய முடியும்.
கார்டியோமயோசைட்டுகளின் இயந்திர நீட்சி மற்றும் மின் தூண்டுதல் இதய பினோடைப்பை பராமரிக்க மிகவும் முக்கியம்33,34,35. இயந்திர தூண்டுதல் hiPSC-CM கண்டிஷனிங் மற்றும் முதிர்ச்சிக்கு பரவலாகப் பயன்படுத்தப்பட்டாலும், பல நேர்த்தியான ஆய்வுகள் சமீபத்தில் ஒற்றை அச்சு ஏற்றுதலைப் பயன்படுத்தி கலாச்சாரத்தில் இதயத் துண்டுகளின் இயந்திர தூண்டுதலை முயற்சித்துள்ளன. இந்த ஆய்வுகள், 2D ஒற்றை அச்சு இயந்திர ஏற்றுதல் கலாச்சாரத்தின் போது இதயத்தின் பினோடைப்பில் நேர்மறையான விளைவைக் கொண்டிருப்பதைக் காட்டுகின்றன. இந்த ஆய்வுகளில், இதயத்தின் பகுதிகள் ஐசோமெட்ரிக் இழுவிசை விசைகள்17, நேரியல் ஆக்சோடோனிக் ஏற்றுதல்18 ஆகியவற்றால் ஏற்றப்பட்டன, அல்லது ஃபோர்ஸ் டிரான்ஸ்யூசர் பின்னூட்டம் மற்றும் பதற்ற இயக்கிகளைப் பயன்படுத்தி இதய சுழற்சி மீண்டும் உருவாக்கப்பட்டது. இருப்பினும், இந்த முறைகள் சுற்றுச்சூழல் மேம்படுத்தல் இல்லாமல் ஒற்றை அச்சு திசு நீட்சியைப் பயன்படுத்துகின்றன, இதன் விளைவாக பல இதய மரபணுக்கள் அடக்கப்படுகின்றன அல்லது அசாதாரண நீட்சி பதில்களுடன் தொடர்புடைய மரபணுக்களின் அதிகப்படியான வெளிப்பாடு ஏற்படுகிறது. இங்கு விவரிக்கப்பட்டுள்ள CTCM சுழற்சி நேரம் மற்றும் உடலியல் நீட்சி (25% நீட்சி, 40% சிஸ்டோல், 60% டயஸ்டோல் மற்றும் நிமிடத்திற்கு 72 துடிப்புகள்) அடிப்படையில் இயற்கையான இதய சுழற்சியைப் பிரதிபலிக்கும் ஒரு 3D மின் இயந்திர தூண்டுதலை வழங்குகிறது. இந்த முப்பரிமாண இயந்திர தூண்டுதல் மட்டும் திசு ஒருமைப்பாட்டைப் பராமரிக்க போதுமானதாக இல்லாவிட்டாலும், திசு நம்பகத்தன்மை, செயல்பாடு மற்றும் ஒருமைப்பாட்டைப் போதுமான அளவு பராமரிக்க T3/Dex ஐப் பயன்படுத்தி நகைச்சுவை மற்றும் இயந்திர தூண்டுதலின் கலவை தேவைப்படுகிறது.
வயதுவந்தோர் இதய பினோடைப்பை மாற்றியமைப்பதில் நகைச்சுவை காரணிகள் முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன. செல் முதிர்ச்சியை துரிதப்படுத்த கலாச்சார ஊடகங்களில் T3 மற்றும் Dex சேர்க்கப்பட்ட HiPS-CM ஆய்வுகளில் இது சிறப்பிக்கப்பட்டது. செல் சவ்வுகளில் அமினோ அமிலங்கள், சர்க்கரைகள் மற்றும் கால்சியம் போக்குவரத்தை T3 பாதிக்கலாம்36. கூடுதலாக, T3 MHC-α வெளிப்பாடு மற்றும் MHC-β குறைப்பு ஆகியவற்றை ஊக்குவிக்கிறது, இது கரு CM இல் மெதுவான இழுப்பு மயோபிரில்களுடன் ஒப்பிடும்போது முதிர்ந்த கார்டியோமயோசைட்டுகளில் வேகமான இழுப்பு மயோபிரில்களை உருவாக்குவதை ஊக்குவிக்கிறது. ஹைப்போ தைராய்டு நோயாளிகளில் T3 குறைபாடு மயோபிப்ரில்லர் பட்டைகள் இழப்பதற்கும் தொனி வளர்ச்சியின் விகிதத்தைக் குறைப்பதற்கும் வழிவகுக்கிறது37. டெக்ஸ் குளுக்கோகார்டிகாய்டு ஏற்பிகளில் செயல்படுகிறது மற்றும் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட துளையிடப்பட்ட இதயங்களில் மாரடைப்பு சுருக்கத்தை அதிகரிப்பதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது; 38 இந்த முன்னேற்றம் கால்சியம் வைப்புத்தொகையால் இயக்கப்படும் நுழைவு (SOCE) 39,40 மீதான விளைவுடன் தொடர்புடையதாகக் கருதப்படுகிறது. கூடுதலாக, டெக்ஸ் அதன் ஏற்பிகளுடன் பிணைக்கிறது, நோயெதிர்ப்பு செயல்பாடு மற்றும் வீக்கத்தை அடக்கும் ஒரு பரந்த உள்செல்லுலார் பதிலை ஏற்படுத்துகிறது30.
எங்கள் முடிவுகள், Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​உடல் இயந்திர தூண்டுதல் (MS) ஒட்டுமொத்த கலாச்சார செயல்திறனை மேம்படுத்தியுள்ளது, ஆனால் கலாச்சாரத்தில் 12 நாட்களுக்கு நம்பகத்தன்மை, கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு மற்றும் இதய வெளிப்பாட்டை பராமரிக்கத் தவறிவிட்டது என்பதைக் குறிக்கிறது. Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​CTCM (MT) கலாச்சாரங்களில் T3 மற்றும் Dex ஐச் சேர்ப்பது நம்பகத்தன்மையை மேம்படுத்தியது மற்றும் புதிய இதய திசுக்களுடன் 12 நாட்களுக்கு ஒத்த டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் சுயவிவரங்கள், கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற செயல்பாட்டை பராமரித்தது. கூடுதலாக, திசு நீட்சியின் அளவைக் கட்டுப்படுத்துவதன் மூலம், STCM ஐப் பயன்படுத்தி ஒரு ஹைப்பர் எக்ஸ்டென்ஷன்-தூண்டப்பட்ட இதய ஹைபர்டிராபி மாதிரி உருவாக்கப்பட்டது, இது STCM அமைப்பின் பல்துறைத்திறனை விளக்குகிறது. இதய மறுவடிவமைப்பு மற்றும் ஃபைப்ரோஸிஸ் பொதுவாக சுற்றும் செல்கள் பொருத்தமான சைட்டோகைன்கள் மற்றும் பாகோசைட்டோசிஸ் மற்றும் பிற மறுவடிவமைப்பு காரணிகளை வழங்கக்கூடிய அப்படியே உள்ள உறுப்புகளை உள்ளடக்கியது என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும், இதயத்தின் பகுதிகள் மன அழுத்தம் மற்றும் அதிர்ச்சிக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக ஃபைப்ரோடிக் செயல்முறையை இன்னும் பிரதிபலிக்க முடியும். மயோஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்களாக. இந்த இதய துண்டு மாதிரியில் இது முன்னர் மதிப்பிடப்பட்டுள்ளது. டாக்ரிக்கார்டியா, பிராடி கார்டியா மற்றும் இயந்திர சுற்றோட்ட ஆதரவு (மெக்கானிக்கல் அன்லோட் செய்யப்பட்ட இதயம்) போன்ற பல நிலைமைகளை உருவகப்படுத்த அழுத்தம்/மின் வீச்சு மற்றும் அதிர்வெண்ணை மாற்றுவதன் மூலம் CTCM அளவுருக்களை மாற்றியமைக்க முடியும் என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும். இது இந்த அமைப்பை மருந்து சோதனைக்கு ஒரு நடுத்தர செயல்திறன் கொண்டதாக ஆக்குகிறது. அதிகப்படியான உழைப்பால் தூண்டப்பட்ட இதய ஹைபர்டிராஃபியை மாதிரியாக்கும் CTCM இன் திறன், தனிப்பயனாக்கப்பட்ட சிகிச்சைக்காக இந்த அமைப்பைச் சோதிப்பதற்கு வழி வகுக்கிறது. முடிவில், இதய திசுப் பிரிவுகளின் கலாச்சாரத்தைப் பராமரிப்பதற்கு இயந்திர நீட்சி மற்றும் நகைச்சுவை தூண்டுதல் மிக முக்கியமானவை என்பதை தற்போதைய ஆய்வு நிரூபிக்கிறது.
இங்கு வழங்கப்பட்ட தரவு, CTCM என்பது அப்படியே இதயத் தசையை மாதிரியாக்குவதற்கு மிகவும் நம்பிக்கைக்குரிய தளம் என்பதைக் காட்டினாலும், இந்த வளர்ப்பு முறைக்கு சில வரம்புகள் உள்ளன. CTCM கலாச்சாரத்தின் முக்கிய வரம்பு என்னவென்றால், இது துண்டுகளில் தொடர்ச்சியான மாறும் இயந்திர அழுத்தங்களை விதிக்கிறது, இது ஒவ்வொரு சுழற்சியின் போதும் இதயத் துண்டு சுருக்கங்களை தீவிரமாகக் கண்காணிக்கும் திறனைத் தடுக்கிறது. கூடுதலாக, இதயப் பிரிவுகளின் சிறிய அளவு (7 மிமீ) காரணமாக, பாரம்பரிய விசை உணரிகளைப் பயன்படுத்தி கலாச்சார அமைப்புகளுக்கு வெளியே சிஸ்டாலிக் செயல்பாட்டை மதிப்பிடும் திறன் குறைவாக உள்ளது. தற்போதைய கையெழுத்துப் பிரதியில், சுருக்க செயல்பாட்டின் குறிகாட்டியாக ஆப்டிகல் மின்னழுத்தத்தை மதிப்பிடுவதன் மூலம் இந்த வரம்பை ஓரளவு கடக்கிறோம். இருப்பினும், இந்த வரம்புக்கு மேலும் வேலை தேவைப்படும், மேலும் கால்சியம் மற்றும் மின்னழுத்த-உணர்திறன் சாயங்களைப் பயன்படுத்தி ஆப்டிகல் மேப்பிங் போன்ற கலாச்சாரத்தில் இதயத் துண்டுகளின் செயல்பாட்டை ஒளியியல் கண்காணிப்பதற்கான முறைகளை அறிமுகப்படுத்துவதன் மூலம் எதிர்காலத்தில் நிவர்த்தி செய்யப்படலாம். CTCM இன் மற்றொரு வரம்பு என்னவென்றால், வேலை செய்யும் மாதிரி உடலியல் அழுத்தத்தை (முன் சுமை மற்றும் பின் சுமை) கையாளாது. CTCM இல், மிகப் பெரிய திசுக்களில் டயஸ்டோல் (முழு நீட்சி) மற்றும் சிஸ்டோல் (மின் தூண்டுதலின் போது சுருக்கத்தின் நீளம்) ஆகியவற்றில் 25% உடலியல் நீட்சியை இனப்பெருக்கம் செய்ய எதிர் திசைகளில் அழுத்தம் தூண்டப்பட்டது. எதிர்கால CTCM வடிவமைப்புகளில், இருபுறங்களிலிருந்தும் இதய திசுக்களின் மீது போதுமான அழுத்தத்தை செலுத்துவதன் மூலமும், இதய அறைகளில் ஏற்படும் சரியான அழுத்தம்-அளவிலான உறவுகளைப் பயன்படுத்துவதன் மூலமும் இந்த வரம்பு நீக்கப்பட வேண்டும்.
இந்த கையெழுத்துப் பிரதியில் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ள ஓவர்ஸ்ட்ரெட்ச்-தூண்டப்பட்ட மறுவடிவமைப்பு ஹைபர்டிராஃபிக் ஹைப்பர்ஸ்ட்ரெட்ச் சிக்னல்களைப் பிரதிபலிப்பதற்கு மட்டுமே. எனவே, இந்த மாதிரியானது நகைச்சுவை அல்லது நரம்பியல் காரணிகள் (இந்த அமைப்பில் இல்லாதவை) தேவையில்லாமல் நீட்சி-தூண்டப்பட்ட ஹைபர்டிராஃபிக் சிக்னலிங் பற்றிய ஆய்வில் உதவும். CTCM இன் பெருக்கத்தை அதிகரிக்க மேலும் ஆய்வுகள் தேவை, எடுத்துக்காட்டாக, நோயெதிர்ப்பு செல்களுடன் இணைந்து வளர்ப்பது, பிளாஸ்மா நகைச்சுவை காரணிகளை சுற்றுவது மற்றும் நரம்பியல் செல்களுடன் இணைந்து வளர்ப்பது போன்ற கண்டுபிடிப்புகள் CTCM உடன் நோய் மாதிரியாக்கத்தின் சாத்தியக்கூறுகளை மேம்படுத்தும்.
இந்த ஆய்வில் பதின்மூன்று பன்றிகள் பயன்படுத்தப்பட்டன. அனைத்து விலங்கு நடைமுறைகளும் நிறுவன வழிகாட்டுதல்களின்படி செய்யப்பட்டன, மேலும் லூயிஸ்வில் பல்கலைக்கழக நிறுவன விலங்கு பராமரிப்பு மற்றும் பயன்பாட்டுக் குழுவால் அங்கீகரிக்கப்பட்டன. பெருநாடி வளைவு இறுக்கப்பட்டு, இதயம் 1 லிட்டர் மலட்டு கார்டியோபிலீஜியாவால் (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL ஹெப்பரின், pH 7.4 வரை) துளைக்கப்பட்டது; வழக்கமாக <10 நிமிடங்களுக்குள் ஐஸ் மீது ஆய்வகத்திற்கு கொண்டு செல்லப்படும் வரை, இதயங்கள் ஐஸ்-குளிர் கார்டியோபிளெஜிக் கரைசலில் பாதுகாக்கப்பட்டன. வழக்கமாக <10 நிமிடங்களுக்குள் ஐஸ் மீது ஆய்வகத்திற்கு கொண்டு செல்லப்படும் வரை, இதயங்கள் ஐஸ்-குளிர் கார்டியோபிளெஜிக் கரைசலில் பாதுகாக்கப்பட்டன. செர்டிசா க்ரானிலி மற்றும் லெடியனோம் கார்டியோபிளேகிசெஸ்கோம் ராஸ்ட்வோரே டூ டிரான்ஸ்போர்டிரோவ்கி வ லாபோரடோரிசு ந லோடு, <10 நிமிடம். பொதுவாக 10 நிமிடங்களுக்குள் ஐஸ் மீது ஆய்வகத்திற்கு கொண்டு செல்லப்படும் வரை, இதயங்கள் ஐஸ்-குளிர் கார்டியோபிளெஜிக் கரைசலில் சேமிக்கப்பட்டன.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 டெர்சைட் செர்டிசா மற்றும் லெடியனோய் கார்டியோபிளேகி டோ டிரான்ஸ்போர்டிரோவ்கி வ லாபோரடோரியூ நா ல்டு, ஓபிசினோ <10 மணி. பொதுவாக 10 நிமிடங்களுக்குள், பனிக்கட்டியில் ஆய்வகத்திற்கு கொண்டு செல்லப்படும் வரை, இதயங்களை பனிக்கட்டி கார்டியோபிளெஜியாவில் வைத்திருங்கள்.
CTCM சாதனம் SolidWorks கணினி உதவி வடிவமைப்பு (CAD) மென்பொருளில் உருவாக்கப்பட்டது. கலாச்சார அறைகள், பிரிப்பான்கள் மற்றும் காற்று அறைகள் CNC தெளிவான அக்ரிலிக் பிளாஸ்டிக்கால் ஆனவை. 7 மிமீ விட்டம் கொண்ட காப்பு வளையம் மையத்தில் அதிக அடர்த்தி கொண்ட பாலிஎதிலினால் (HDPE) ஆனது மற்றும் கீழே உள்ள ஊடகத்தை மூடுவதற்குப் பயன்படுத்தப்படும் சிலிகான் o-வளையத்தை இடமளிக்க ஒரு o-வளைய பள்ளம் உள்ளது. ஒரு மெல்லிய சிலிக்கா சவ்வு கலாச்சார அறையை பிரிப்பு தட்டில் இருந்து பிரிக்கும். சிலிகான் சவ்வு 0.02″ தடிமனான சிலிகான் தாளில் இருந்து லேசர் வெட்டப்பட்டு 35A கடினத்தன்மை கொண்டது. கீழ் மற்றும் மேல் சிலிகான் கேஸ்கட்கள் 1/16″ தடிமனான சிலிகான் தாளில் இருந்து லேசர் வெட்டப்பட்டு 50A கடினத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளன. 316L துருப்பிடிக்காத எஃகு திருகுகள் மற்றும் இறக்கை கொட்டைகள் தொகுதியை கட்டுவதற்கும் காற்று புகாத முத்திரையை உருவாக்குவதற்கும் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.
C-PACE-EM அமைப்புடன் ஒருங்கிணைக்க ஒரு பிரத்யேக அச்சிடப்பட்ட சர்க்யூட் போர்டு (PCB) வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது. PCB-யில் உள்ள சுவிஸ் இயந்திர இணைப்பான் சாக்கெட்டுகள் வெள்ளி பூசப்பட்ட செப்பு கம்பிகள் மற்றும் வெண்கல 0-60 திருகுகள் மூலம் மின்முனைகளில் திருகப்பட்டு கிராஃபைட் மின்முனைகளுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளன. அச்சிடப்பட்ட சர்க்யூட் போர்டு 3D அச்சுப்பொறியின் அட்டையில் வைக்கப்பட்டுள்ளது.
CTCM சாதனம் ஒரு நிரல்படுத்தக்கூடிய நியூமேடிக் ஆக்சுவேட்டர் (PPD) மூலம் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது, இது இதய சுழற்சியைப் போன்ற கட்டுப்படுத்தப்பட்ட சுற்றோட்ட அழுத்தத்தை உருவாக்குகிறது. காற்று அறைக்குள் அழுத்தம் அதிகரிக்கும் போது, ​​நெகிழ்வான சிலிகான் சவ்வு மேல்நோக்கி விரிவடைந்து, திசு தளத்தின் கீழ் ஊடகத்தை கட்டாயப்படுத்துகிறது. பின்னர் திசுக்களின் பரப்பளவு திரவத்தை வெளியேற்றுவதன் மூலம் நீட்டிக்கப்படும், இது டயஸ்டோலின் போது இதயத்தின் உடலியல் விரிவாக்கத்தைப் பிரதிபலிக்கிறது. தளர்வின் உச்சத்தில், கிராஃபைட் மின்முனைகள் மூலம் மின் தூண்டுதல் பயன்படுத்தப்பட்டது, இது காற்று அறையில் அழுத்தத்தைக் குறைத்து திசு பிரிவுகளின் சுருக்கத்தை ஏற்படுத்தியது. குழாயின் உள்ளே காற்று அமைப்பில் உள்ள அழுத்தத்தைக் கண்டறிய அழுத்தம் சென்சார் கொண்ட ஒரு ஹீமோஸ்டேடிக் வால்வு உள்ளது. அழுத்தம் சென்சார் மூலம் உணரப்படும் அழுத்தம் மடிக்கணினியுடன் இணைக்கப்பட்ட தரவு சேகரிப்பாளருக்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. இது வாயு அறைக்குள் அழுத்தத்தை தொடர்ந்து கண்காணிக்க அனுமதிக்கிறது. அதிகபட்ச அறை அழுத்தத்தை அடைந்ததும் (நிலையான 80 mmHg, 140 mmHg OS), தரவு கையகப்படுத்தும் சாதனம் C-PACE-EM அமைப்புக்கு ஒரு சமிக்ஞையை அனுப்ப உத்தரவிடப்பட்டது, இது 2 ms க்கு பைபாசிக் மின்னழுத்த சமிக்ஞையை உருவாக்குகிறது, இது 4 V ஆக அமைக்கப்பட்டுள்ளது.
இதயப் பிரிவுகள் பெறப்பட்டு, 6 கிணறுகளில் வளர்ப்பு நிலைமைகள் பின்வருமாறு செய்யப்பட்டன: பரிமாற்றக் கப்பலில் இருந்து அறுவடை செய்யப்பட்ட இதயங்களை குளிர் (4° C) கார்டியோபிளீஜியா கொண்ட ஒரு தட்டிற்கு மாற்றவும். இடது வென்ட்ரிக்கிள் ஒரு மலட்டு பிளேடுடன் தனிமைப்படுத்தப்பட்டு 1-2 செ.மீ3 துண்டுகளாக வெட்டப்பட்டது. இந்த திசுத் தொகுதிகள் திசு ஒட்டும் தன்மையுடன் திசு ஆதரவுகளுடன் இணைக்கப்பட்டு டைரோடின் கரைசலைக் கொண்ட அதிர்வுறும் மைக்ரோடோம் திசு குளியலில் வைக்கப்பட்டு தொடர்ந்து ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்டன (3 கிராம்/லி 2,3-பியூட்டனெடியோன் மோனோஆக்சைம் (BDM), 140 mM NaCl (8.18 கிராம்). , 6 mM KCl (0.447 கிராம்), 10 mM D-குளுக்கோஸ் (1.86 கிராம்), 10 mM HEPES (2.38 கிராம்), 1 mM MgCl2 (1 மிலி 1 M கரைசல்), 1.8 mM CaCl2 (1.8 மிலி 1 M கரைசல்), 1 L ddH2O வரை. அதிர்வுறும் மைக்ரோடோம் 80 ஹெர்ட்ஸ் அதிர்வெண்ணில் 300 µm தடிமனான துண்டுகளையும், 2 மிமீ கிடைமட்ட அதிர்வு வீச்சு மற்றும் 0.03 மிமீ/வி முன்கூட்டியே விகிதத்தையும் வெட்ட அமைக்கப்பட்டது. திசு குளியல் கரைசலை குளிர்ச்சியாக வைத்திருக்க பனியால் சூழப்பட்டிருந்தது மற்றும் வெப்பநிலை 4°C இல் பராமரிக்கப்பட்டது. ஒரு வளர்ப்புத் தட்டுக்கு போதுமான பிரிவுகள் கிடைக்கும் வரை மைக்ரோடோம் குளியலில் இருந்து திசுப் பிரிவுகளை பனியில் தொடர்ந்து ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட டைரோட் கரைசலைக் கொண்ட ஒரு அடைகாக்கும் குளியலுக்கு மாற்றவும். டிரான்ஸ்வெல் கலாச்சாரங்களுக்கு, திசுப் பிரிவுகள் மலட்டுத்தன்மை கொண்ட 6 மிமீ அகல பாலியூரிதீன் ஆதரவுகளுடன் இணைக்கப்பட்டு 6 மில்லி உகந்த ஊடகத்தில் (199 நடுத்தரம், 1x ITS சப்ளிமெண்ட், 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-கார மற்றும் 2X ஆண்டிபயாடிக்-பூஞ்சை எதிர்ப்பு) வைக்கப்பட்டன. மின் தூண்டுதல் (10 V, அதிர்வெண் 1.2 Hz) C-Pace மூலம் திசுப் பிரிவுகளுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது. TD நிலைமைகளுக்கு, புதிய T3 மற்றும் Dex ஆகியவை 100 nM மற்றும் ஒவ்வொரு ஊடக மாற்றத்திலும் 1 μM இல் சேர்க்கப்பட்டன. ஒரு நாளைக்கு 3 முறை மாற்றுவதற்கு முன் ஊடகம் ஆக்ஸிஜனுடன் நிறைவுற்றது. திசுப் பிரிவுகள் 37°C மற்றும் 5% CO2 இல் ஒரு இன்குபேட்டரில் வளர்க்கப்பட்டன.
CTCM கலாச்சாரங்களுக்கு, மாற்றியமைக்கப்பட்ட டைரோடின் கரைசலைக் கொண்ட பெட்ரி டிஷில் உள்ள தனிப்பயன் 3D அச்சுப்பொறியில் திசுப் பிரிவுகள் வைக்கப்பட்டன. இந்த சாதனம் இதயத்தின் துண்டின் அளவை ஆதரவு வளையத்தின் பரப்பளவில் 25% அதிகரிக்க வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது. டைரோடின் கரைசலில் இருந்து ஊடகத்திற்கு மாற்றப்பட்ட பிறகு மற்றும் டயஸ்டோலின் போது இதயத்தின் பகுதிகள் நீட்டாதபடி இது செய்யப்படுகிறது. ஹிஸ்டோஅக்ரிலிக் பசையைப் பயன்படுத்தி, 300 µm தடிமன் கொண்ட பிரிவுகள் 7 மிமீ விட்டம் கொண்ட ஒரு ஆதரவு வளையத்தில் சரி செய்யப்பட்டன. திசுப் பிரிவுகளை ஆதரவு வளையத்துடன் இணைத்த பிறகு, அதிகப்படியான திசுப் பிரிவுகளை துண்டித்து, இணைக்கப்பட்ட திசுப் பிரிவுகளை ஒரு சாதனத்திற்கு போதுமான பிரிவுகள் தயாரிக்கப்படும் வரை பனியில் (4°C) டைரோட் கரைசலின் குளியலறையில் மீண்டும் வைக்கவும். அனைத்து சாதனங்களுக்கும் மொத்த செயலாக்க நேரம் 2 மணிநேரத்திற்கு மிகாமல் இருக்க வேண்டும். 6 திசுப் பிரிவுகள் அவற்றின் ஆதரவு வளையங்களுடன் இணைக்கப்பட்ட பிறகு, CTCM சாதனம் கூடியது. CTCM கலாச்சார அறை 21 மில்லி முன்-ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட ஊடகத்துடன் முன்கூட்டியே நிரப்பப்பட்டுள்ளது. திசுப் பகுதிகளை வளர்ப்பு அறைக்கு மாற்றி, பைப்பெட் மூலம் ஏதேனும் காற்று குமிழ்களை கவனமாக அகற்றவும். பின்னர் திசுப் பகுதி துளைக்குள் செலுத்தப்பட்டு மெதுவாக அழுத்தப்படுகிறது. இறுதியாக, சாதனத்தில் மின்முனை மூடியை வைத்து சாதனத்தை இன்குபேட்டருக்கு மாற்றவும். பின்னர் CTCM ஐ காற்றுக் குழாயுடன் இணைக்கவும், C-PACE-EM அமைப்பு. நியூமேடிக் ஆக்சுவேட்டர் திறக்கிறது மற்றும் காற்று வால்வு CTCM ஐத் திறக்கிறது. 2 ms க்கு பைபாசிக் வேகத்தின் போது 1.2 Hz இல் 4 V ஐ வழங்க C-PACE-EM அமைப்பு கட்டமைக்கப்பட்டது. ஊடகம் ஒரு நாளைக்கு இரண்டு முறை மாற்றப்பட்டது மற்றும் மின்முனைகளில் கிராஃபைட் குவிவதைத் தவிர்க்க மின்முனைகள் ஒரு நாளைக்கு ஒரு முறை மாற்றப்பட்டன. தேவைப்பட்டால், அவற்றின் கலாச்சாரக் கிணறுகளிலிருந்து திசுப் பகுதிகளை அகற்றி அவற்றின் கீழ் விழுந்திருக்கக்கூடிய காற்று குமிழ்களை வெளியேற்றலாம். MT சிகிச்சை நிலைமைகளுக்கு, 100 nM T3 மற்றும் 1 μM Dex உடன் ஒவ்வொரு நடுத்தர மாற்றத்துடன் T3/Dex புதிதாக சேர்க்கப்பட்டது. CTCM சாதனங்கள் 37°C மற்றும் 5% CO2 இல் ஒரு இன்குபேட்டரில் வளர்க்கப்பட்டன.
இதயத் துண்டுகளின் நீட்டப்பட்ட பாதைகளைப் பெற, ஒரு சிறப்பு கேமரா அமைப்பு உருவாக்கப்பட்டது. ஒரு SLR கேமரா (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) ஒரு Navitar Zoom 7000 18-108mm மேக்ரோ லென்ஸுடன் (Navitar, San Francisco, CA) பயன்படுத்தப்பட்டது. ஊடகத்தை புதிய ஊடகத்துடன் மாற்றிய பின் அறை வெப்பநிலையில் காட்சிப்படுத்தல் செய்யப்பட்டது. கேமரா 51° கோணத்தில் நிலைநிறுத்தப்பட்டுள்ளது மற்றும் வீடியோ வினாடிக்கு 30 பிரேம்களில் பதிவு செய்யப்படுகிறது. முதலில், இதயத் துண்டுகளின் இயக்கத்தை அளவிட திறந்த மூல மென்பொருள் (MUSCLEMOTION43) Image-J உடன் பயன்படுத்தப்பட்டது. சத்தத்தைத் தவிர்க்க இதயத் துண்டுகளை துடிப்பதற்கான ஆர்வமுள்ள பகுதிகளை வரையறுக்க MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) ஐப் பயன்படுத்தி முகமூடி உருவாக்கப்பட்டது. கைமுறையாகப் பிரிக்கப்பட்ட முகமூடிகள் ஒரு பிரேம் வரிசையில் அனைத்து படங்களுக்கும் பயன்படுத்தப்பட்டு பின்னர் MUSCLEMOTION செருகுநிரலுக்கு அனுப்பப்படுகின்றன. குறிப்பு சட்டத்துடன் ஒப்பிடும்போது அதன் இயக்கத்தை அளவிட தசை இயக்கம் ஒவ்வொரு சட்டகத்திலும் உள்ள பிக்சல்களின் சராசரி தீவிரத்தைப் பயன்படுத்துகிறது. தரவு பதிவு செய்யப்பட்டு, வடிகட்டப்பட்டு, சுழற்சி நேரத்தை அளவிடவும், இதய சுழற்சியின் போது திசு நீட்சியை மதிப்பிடவும் பயன்படுத்தப்பட்டது. பதிவுசெய்யப்பட்ட வீடியோ முதல்-வரிசை பூஜ்ஜிய-கட்ட டிஜிட்டல் வடிகட்டியைப் பயன்படுத்தி பிந்தைய செயலாக்கப்பட்டது. திசு நீட்சியை (உச்ச-க்கு-உச்ச) அளவிட, பதிவுசெய்யப்பட்ட சிக்னலில் சிகரங்கள் மற்றும் பள்ளங்களை வேறுபடுத்துவதற்கு உச்ச-க்கு-உச்ச பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. கூடுதலாக, சிக்னல் சறுக்கலை அகற்ற 6வது வரிசை பல்லுறுப்புக்கோவைப் பயன்படுத்தி டிட்ரெண்டிங் செய்யப்படுகிறது. உலகளாவிய திசு இயக்கம், சுழற்சி நேரம், தளர்வு நேரம் மற்றும் சுருக்க நேரம் (துணை நிரல் குறியீடு 44) ஆகியவற்றை தீர்மானிக்க MATLAB இல் நிரல் குறியீடு உருவாக்கப்பட்டது.
திரிபு பகுப்பாய்விற்கு, இயந்திர நீட்சி மதிப்பீட்டிற்காக உருவாக்கப்பட்ட அதே வீடியோக்களைப் பயன்படுத்தி, MUSCLEMOTION மென்பொருளின் படி இயக்க சிகரங்களைக் (மிக உயர்ந்த (மேல்) மற்றும் குறைந்த (கீழ்) இயக்கப் புள்ளிகள்) குறிக்கும் இரண்டு படங்களை முதலில் கண்டறிந்தோம். பின்னர் திசுப் பகுதிகளைப் பிரித்து, பிரிக்கப்பட்ட திசுக்களுக்கு நிழல் வழிமுறையின் வடிவத்தைப் பயன்படுத்தினோம் (துணை படம் 2a). பின்னர் பிரிக்கப்பட்ட திசு பத்து துணை மேற்பரப்புகளாகப் பிரிக்கப்பட்டது, மேலும் ஒவ்வொரு மேற்பரப்பிலும் உள்ள அழுத்தம் பின்வரும் சமன்பாட்டைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது: திரிபு = (மேல்-கீழ்)/கீழ், இங்கு துணை மற்றும் கீழ் என்பது முறையே துணியின் மேல் மற்றும் கீழ் நிழல்களிலிருந்து வடிவத்தின் தூரங்கள் (துணை படம் .2b).
இதயப் பிரிவுகள் 48 மணி நேரத்திற்கு 4% பாராஃபோர்மால்டிஹைடில் சரி செய்யப்பட்டன. நிலையான திசுக்கள் 10% மற்றும் 20% சுக்ரோஸில் 1 மணி நேரத்திற்கும், பின்னர் 30% சுக்ரோஸில் ஒரே இரவில் நீரிழப்பு செய்யப்பட்டன. பின்னர் பிரிவுகள் உகந்த வெட்டு வெப்பநிலை கலவையில் (OCT கலவை) பதிக்கப்பட்டு, படிப்படியாக ஐசோபென்டேன்/உலர்ந்த பனிக்கட்டி குளியலில் உறைந்தன. பிரிக்கும் வரை OCT உட்பொதித்தல் தொகுதிகளை -80 °C இல் சேமிக்கவும். 8 μm தடிமன் கொண்ட பிரிவுகளாக ஸ்லைடுகள் தயாரிக்கப்பட்டன.
இதயப் பிரிவுகளிலிருந்து OCT ஐ அகற்ற, ஸ்லைடுகளை 95 °C வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கு ஒரு வெப்பமூட்டும் தொகுதியில் சூடாக்கவும். ஒவ்வொரு ஸ்லைடிலும் 1 மில்லி PBS ஐச் சேர்த்து அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும், பின்னர் அறை வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு PBS இல் 0.1% ட்ரைட்டான்-எக்ஸை அமைப்பதன் மூலம் பிரிவுகளை ஊடுருவிச் செல்லவும். குறிப்பிட்ட அல்லாத ஆன்டிபாடிகள் மாதிரியுடன் பிணைக்கப்படுவதைத் தடுக்க, ஸ்லைடுகளில் 1 மில்லி 3% BSA கரைசலைச் சேர்த்து அறை வெப்பநிலையில் 1 மணிநேரம் அடைகாக்கவும். பின்னர் BSA அகற்றப்பட்டு, ஸ்லைடுகள் PBS மூலம் கழுவப்பட்டன. ஒவ்வொரு மாதிரியையும் பென்சிலால் குறிக்கவும். முதன்மை ஆன்டிபாடிகள் (1% BSA இல் நீர்த்த 1:200) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) மற்றும் ட்ரோபோனின்-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ஆகியவை 90 நிமிடங்களுக்கு மேல் சேர்க்கப்பட்டன, பின்னர் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகள் (1% BSA இல் 1:200 நீர்த்த) எலி அலெக்சா ஃப்ளூர் 488 (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்; #A16079), முயல் அலெக்சா ஃப்ளூர் 594 (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்; #T6391) க்கு எதிராக கூடுதலாக 90 நிமிடங்கள் PBS உடன் 3 முறை கழுவப்பட்டது இலக்கு கறையை பின்னணியிலிருந்து வேறுபடுத்த, இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியை மட்டுமே கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்தினோம். இறுதியாக, DAPI அணுக்கரு கறை சேர்க்கப்பட்டு, ஸ்லைடுகள் ஒரு வெக்டாஷீல்டில் (வெக்டர் ஆய்வகங்கள்) வைக்கப்பட்டு நெயில் பாலிஷ் மூலம் சீல் வைக்கப்பட்டன. -x உருப்பெருக்கம்) மற்றும் 40x உருப்பெருக்கம் கொண்ட கீயன்ஸ் நுண்ணோக்கி.
PBS இல் 5 μg/ml இல் WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) WGA சாயமிடுதலுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது மற்றும் அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு நிலையான பிரிவுகளில் பயன்படுத்தப்பட்டது. பின்னர் ஸ்லைடுகள் PBS உடன் கழுவப்பட்டு, ஒவ்வொரு ஸ்லைடிலும் சூடான் கருப்பு சேர்க்கப்பட்டு 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டது. பின்னர் ஸ்லைடுகள் PBS உடன் கழுவப்பட்டு, வெக்டாஷீல்ட் உட்பொதித்தல் ஊடகம் சேர்க்கப்பட்டது. கீயன்ஸ் நுண்ணோக்கியில் 40x உருப்பெருக்கத்தில் ஸ்லைடுகள் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன.
மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி மாதிரிகளிலிருந்து OCT அகற்றப்பட்டது. OCT ஐ அகற்றிய பிறகு, ஸ்லைடுகளை ஒரே இரவில் Bouin's கரைசலில் மூழ்க வைக்கவும். பின்னர் ஸ்லைடுகள் 1 மணி நேரம் காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரில் கழுவப்பட்டு, பின்னர் Bibrich அலோ அமில ஃபுச்சின் கரைசலில் 10 நிமிடங்கள் வைக்கப்பட்டன. பின்னர் ஸ்லைடுகள் காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரில் கழுவப்பட்டு 5% பாஸ்போமோலிப்டினம்/5% பாஸ்போடங்ஸ்டிக் அமிலம் கொண்ட கரைசலில் 10 நிமிடங்கள் வைக்கப்பட்டன. கழுவாமல், ஸ்லைடுகளை நேரடியாக அனிலின் நீலக் கரைசலில் 15 நிமிடங்கள் மாற்றவும். பின்னர் ஸ்லைடுகள் காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரில் கழுவப்பட்டு 1% அசிட்டிக் அமிலக் கரைசலில் 2 நிமிடங்கள் வைக்கப்பட்டன. ஸ்லைடுகள் 200 N எத்தனாலில் உலர்த்தப்பட்டு சைலீனுக்கு மாற்றப்பட்டன. கறை படிந்த ஸ்லைடுகள் 10x நோக்கத்துடன் கீயன்ஸ் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி காட்சிப்படுத்தப்பட்டன. கீயன்ஸ் அனலைசர் மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி ஃபைப்ரோஸிஸ் பகுதி சதவீதம் அளவிடப்பட்டது.
CyQUANT™ MTT செல் நம்பகத்தன்மை மதிப்பீடு (இன்விட்ரஜன், கார்ல்ஸ்பாட், CA), பட்டியல் எண் V13154, உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி சில மாற்றங்களுடன். குறிப்பாக, MTT பகுப்பாய்வின் போது சீரான திசு அளவை உறுதி செய்ய 6 மிமீ விட்டம் கொண்ட ஒரு அறுவை சிகிச்சை பஞ்ச் பயன்படுத்தப்பட்டது. உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி MTT அடி மூலக்கூறு கொண்ட 12-கிணறு தகட்டின் கிணறுகளில் திசுக்கள் தனித்தனியாக பூசப்பட்டன. பிரிவுகள் 37° C வெப்பநிலையில் 3 மணி நேரம் அடைகாக்கப்படுகின்றன, மேலும் உயிருள்ள திசுக்கள் MTT அடி மூலக்கூறை வளர்சிதைமாற்றம் செய்து ஊதா நிற ஃபார்மசான் கலவையை உருவாக்குகின்றன. MTT கரைசலை 1 மில்லி DMSO உடன் மாற்றவும், இதயப் பிரிவுகளிலிருந்து ஊதா நிற ஃபார்மசானைப் பிரித்தெடுக்க 37°C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும். மாதிரிகள் DMSO இல் 96-கிணறு தெளிவான அடிப்பகுதி தகடுகளில் 1:10 என்ற விகிதத்தில் நீர்த்தப்பட்டு, சைட்டேஷன் பிளேட் ரீடர் (பயோடெக்) ஐப் பயன்படுத்தி 570 nm இல் அளவிடப்பட்ட ஊதா நிற தீவிரம் கொண்டது. இதயத்தின் ஒவ்வொரு துண்டின் எடைக்கும் அளவீடுகள் இயல்பாக்கப்பட்டன.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி குளுக்கோஸ் பயன்பாட்டு மதிப்பீட்டிற்காக இதய துண்டு ஊடகம் 1 μCi/ml [5-3H]-குளுக்கோஸ் (மொராவெக் பயோகெமிக்கல்ஸ், ப்ரியா, CA, USA) கொண்ட ஊடகத்தால் மாற்றப்பட்டது. 4 மணிநேர அடைகாத்தலுக்குப் பிறகு, 100 µl 0.2 N HCl கொண்ட திறந்த மைக்ரோசென்ட்ரிஃபியூஜ் குழாயில் 100 µl நடுத்தரத்தைச் சேர்க்கவும். பின்னர் குழாய் 500 μl dH2O கொண்ட ஒரு சிண்டில்லேஷன் குழாயில் வைக்கப்பட்டு [3H]2O ஐ 37°C இல் 72 மணி நேரம் ஆவியாக்கியது. பின்னர் சிண்டில்லேஷன் குழாயிலிருந்து மைக்ரோசென்ட்ரிஃபியூஜ் குழாயை அகற்றி 10 மில்லி சிண்டில்லேஷன் திரவத்தைச் சேர்க்கவும். ட்ரை-கார்ப் 2900TR திரவ சிண்டில்லேஷன் பகுப்பாய்வியைப் பயன்படுத்தி சிண்டில்லேஷன் எண்ணிக்கைகள் செய்யப்பட்டன (பேக்கார்ட் பயோசயின்ஸ் கம்பெனி, மெரிடன், CT, USA). பின்னர் குளுக்கோஸ் பயன்பாடு [5-3H]-குளுக்கோஸ் சார்ந்த செயல்பாடு, முழுமையற்ற சமநிலை மற்றும் பின்னணி, [5-3H]-க்கு பெயரிடப்படாத குளுக்கோஸின் நீர்த்தல் மற்றும் சிண்டிலேஷன் கவுண்டர் செயல்திறன் ஆகியவற்றைக் கணக்கில் எடுத்துக்கொண்டு கணக்கிடப்பட்டது. தரவு இதயத்தின் பிரிவுகளின் நிறைக்கு இயல்பாக்கப்படுகிறது.
டிரைசோலில் திசு ஒருமைப்பாட்டிற்குப் பிறகு, உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி Qiagen miRNeasy மைக்ரோ கிட் #210874 ஐப் பயன்படுத்தி இதயப் பிரிவுகளிலிருந்து RNA தனிமைப்படுத்தப்பட்டது. RNAsec நூலக தயாரிப்பு, வரிசைப்படுத்துதல் மற்றும் தரவு பகுப்பாய்வு பின்வருமாறு செய்யப்பட்டன:
RNA நூலகத்தைத் தயாரிப்பதற்கு ஒரு மாதிரிக்கு 1 μg RNA தொடக்கப் பொருளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது. உற்பத்தியாளரின் பரிந்துரைகளைப் பின்பற்றி, இல்லுமினாவிற்கான NEBNext UltraTM RNA நூலக தயாரிப்பு கருவியைப் (NEB, USA) பயன்படுத்தி வரிசைமுறை நூலகங்கள் உருவாக்கப்பட்டன, மேலும் ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும் பண்புக்கூறு வரிசைகளில் குறியீட்டு குறியீடுகள் சேர்க்கப்பட்டன. சுருக்கமாக, பாலி-டி ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகளுடன் இணைக்கப்பட்ட காந்த மணிகளைப் பயன்படுத்தி மொத்த RNA இலிருந்து mRNA சுத்திகரிக்கப்பட்டது. NEBNext முதல் இழை தொகுப்பு எதிர்வினை இடையகத்தில் (5X) அதிக வெப்பநிலையில் இருவேல கேஷன்களைப் பயன்படுத்தி துண்டு துண்டாகப் பிரித்தல் மேற்கொள்ளப்படுகிறது. முதல் இழை cDNA சீரற்ற ஹெக்ஸாமர் ப்ரைமர்கள் மற்றும் M-MuLV தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் (RNase H-) பயன்படுத்தி ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது. இரண்டாவது இழை cDNA பின்னர் DNA பாலிமரேஸ் I மற்றும் RNase H ஐப் பயன்படுத்தி ஒருங்கிணைக்கப்படுகிறது. மீதமுள்ள ஓவர்ஹேங்குகள் எக்ஸோநியூக்ளியேஸ்/பாலிமரேஸ் செயல்பாட்டின் மூலம் மழுங்கிய முனைகளாக மாற்றப்படுகின்றன. DNA துண்டின் 3′ முனையின் அடினிலேஷனுக்குப் பிறகு, கலப்பினமாக்கலுக்குத் தயாராக ஹேர்பின் லூப் அமைப்பைக் கொண்ட ஒரு NEBNext அடாப்டர் அதனுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளது. 150-200 bp நீளமுள்ள cDNA துண்டுகளைத் தேர்ந்தெடுப்பதற்கு, AMPure XP அமைப்பைப் பயன்படுத்தி நூலகத் துண்டுகள் சுத்திகரிக்கப்பட்டன (பெக்மேன் கூல்டர், பெவர்லி, USA). பின்னர், அளவு-தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட cDNA உடன் அடாப்டருடன் இணைக்கப்பட்ட 3 μl USER என்சைம் (NEB, USA) 37°C இல் 15 நிமிடங்கள் பயன்படுத்தப்பட்டது, பின்னர் PCR க்கு முன் 95°C இல் 5 நிமிடங்கள் பயன்படுத்தப்பட்டது. பின்னர் PCR Phusion High-Fidelity DNA பாலிமரேஸ், யுனிவர்சல் PCR ப்ரைமர்கள் மற்றும் இன்டெக்ஸ் (X) ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டது. இறுதியாக, PCR தயாரிப்புகள் சுத்திகரிக்கப்பட்டன (AMPure XP அமைப்பு) மற்றும் Agilent Bioanalyzer 2100 அமைப்பில் நூலகத் தரம் மதிப்பிடப்பட்டது. பின்னர் cDNA நூலகம் Novaseq சீக்வென்சரைப் பயன்படுத்தி வரிசைப்படுத்தப்பட்டது. இல்லுமினாவிலிருந்து மூல படக் கோப்புகள் CASAVA அடிப்படை அழைப்பைப் பயன்படுத்தி மூல வாசிப்புகளாக மாற்றப்பட்டன. மூலத் தரவு FASTQ(fq) வடிவக் கோப்புகளில் சேமிக்கப்படுகிறது, அவை வாசிப்பு வரிசைகள் மற்றும் தொடர்புடைய அடிப்படை குணங்களைக் கொண்டுள்ளன. வடிகட்டப்பட்ட வரிசைமுறை வாசிப்புகளை Sscrofa11.1 குறிப்பு மரபணுவுடன் பொருத்த HISAT2 ஐத் தேர்ந்தெடுக்கவும். பொதுவாக, HISAT2 எந்த அளவிலான மரபணுக்களையும் ஆதரிக்கிறது, இதில் 4 பில்லியன் அடிப்படைகளை விட பெரிய மரபணுக்கள் அடங்கும், மேலும் பெரும்பாலான அளவுருக்களுக்கு இயல்புநிலை மதிப்புகள் அமைக்கப்படுகின்றன. RNA Seq தரவிலிருந்து படிக்கும் பிரிப்புகளை, தற்போது கிடைக்கக்கூடிய வேகமான அமைப்பான HISAT2 ஐப் பயன்படுத்தி திறமையாக சீரமைக்க முடியும், இது வேறு எந்த முறையையும் விட அதே அல்லது சிறந்த துல்லியத்துடன் இருக்கும்.
டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளின் மிகுதியானது மரபணு வெளிப்பாட்டின் அளவை நேரடியாக பிரதிபலிக்கிறது. மரபணு வெளிப்பாடு நிலைகள் மரபணு அல்லது எக்ஸான்களுடன் தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளின் மிகுதியால் (வரிசைமுறை எண்ணிக்கை) மதிப்பிடப்படுகின்றன. வாசிப்புகளின் எண்ணிக்கை மரபணு வெளிப்பாடு நிலைகள், மரபணு நீளம் மற்றும் வரிசைமுறை ஆழத்திற்கு விகிதாசாரமாகும். FPKM (ஒரு மில்லியன் அடிப்படை ஜோடிகளுக்கு வரிசைப்படுத்தப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்ட்டின் ஆயிரம் அடிப்படை ஜோடிகளுக்கு துண்டுகள்) கணக்கிடப்பட்டு, DESeq2 தொகுப்பைப் பயன்படுத்தி வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டின் P- மதிப்புகள் தீர்மானிக்கப்பட்டன. பின்னர் உள்ளமைக்கப்பட்ட R-செயல்பாடு "p.adjust" ஐ அடிப்படையாகக் கொண்ட பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் முறை9 ஐப் பயன்படுத்தி ஒவ்வொரு P மதிப்புக்கும் தவறான கண்டுபிடிப்பு விகிதத்தை (FDR) கணக்கிட்டோம்.
இதயப் பிரிவுகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட RNA, தெர்மோவிலிருந்து (தெர்மோ, பூனை எண். 11756050) சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட் IV விலோ மாஸ்டர் கலவையைப் பயன்படுத்தி 200 ng/μl செறிவில் cDNA ஆக மாற்றப்பட்டது. அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸ் எண்டூரா பிளேட் மைக்ரோஆம்ப் 384-கிணறு வெளிப்படையான எதிர்வினைத் தகடு (தெர்மோ, பூனை எண். 4483319) மற்றும் மைக்ரோஆம்ப் ஆப்டிகல் பிசின் (தெர்மோ, பூனை எண். 4311971) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி அளவு RT-PCR செய்யப்பட்டது. எதிர்வினை கலவையில் 5 µl தக்மான் ஃபாஸ்ட் அட்வான்ஸ்டு மாஸ்டர் கலவை (தெர்மோ, பூனை எண். 4444557), 0.5 µl தக்மான் ப்ரைமர் மற்றும் 3.5 µl H2O ஆகியவை ஒரு கிணற்றுக்கு கலக்கப்பட்டன. நிலையான qPCR சுழற்சிகள் இயக்கப்பட்டன மற்றும் CT மதிப்புகள் அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸ் குவாண்ட்ஸ்டுடியோ 5 நிகழ்நேர PCR கருவியைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டன (384-கிணறு தொகுதி; தயாரிப்பு எண். A28135). தக்மான் ப்ரைமர்கள் தெர்மோ (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) ஆகியவற்றிலிருந்து வாங்கப்பட்டன. அனைத்து மாதிரிகளின் CT மதிப்புகளும் வீட்டு பராமரிப்பு மரபணு GAPDH க்கு இயல்பாக்கப்பட்டன.
உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி NT-ProBNP கிட் (பன்றி) (பூனை எண். MBS2086979, MyBioSource) ஐப் பயன்படுத்தி NT-ProBNP இன் ஊடக வெளியீடு மதிப்பிடப்பட்டது. சுருக்கமாக, ஒவ்வொரு மாதிரியின் 250 µl மற்றும் தரநிலை ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் நகல்களில் சேர்க்கப்பட்டது. மாதிரியைச் சேர்த்த உடனேயே, ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 50 µl Assay Reagent A ஐச் சேர்க்கவும். தட்டை மெதுவாக அசைத்து சீலண்ட் மூலம் சீல் வைக்கவும். பின்னர் மாத்திரைகள் 37°C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டன. பின்னர் கரைசலை உறிஞ்சி, 350 µl 1X கழுவும் கரைசலுடன் கிணறுகளை 4 முறை கழுவி, ஒவ்வொரு முறையும் 1-2 நிமிடங்கள் கழுவும் கரைசலை அடைகாத்தன. பின்னர் ஒரு கிணற்றுக்கு 100 µl Assay Reagent B ஐச் சேர்த்து தட்டு சீலண்ட் மூலம் சீல் வைக்கவும். மாத்திரை மெதுவாக அசைக்கப்பட்டு 37°C வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டது. கரைசலை உறிஞ்சி, 350 µl 1X கழுவும் கரைசலைக் கொண்டு கிணறுகளை 5 முறை கழுவவும். ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 90 µl அடி மூலக்கூறு கரைசலைச் சேர்த்து தட்டை மூடவும். 37°C வெப்பநிலையில் 10-20 நிமிடங்கள் தட்டை அடைக்கவும். ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 50 µl நிறுத்தக் கரைசலைச் சேர்க்கவும். 450 nm இல் அமைக்கப்பட்ட சைட்டேஷன் (பயோடெக்) தகடு ரீடரைப் பயன்படுத்தி தட்டு உடனடியாக அளவிடப்பட்டது.
5% வகை I பிழை விகிதத்துடன் அளவுருவில் 10% முழுமையான மாற்றத்தைக் கண்டறிய 80% க்கும் அதிகமான சக்தியை வழங்கும் குழு அளவுகளைத் தேர்வுசெய்ய சக்தி பகுப்பாய்வுகள் செய்யப்பட்டன. 5% வகை I பிழை விகிதத்துடன் அளவுருவில் 10% முழுமையான மாற்றத்தைக் கண்டறிய 80% க்கும் அதிகமான சக்தியை வழங்கும் குழு அளவுகளைத் தேர்வுசெய்ய சக்தி பகுப்பாய்வுகள் செய்யப்பட்டன. அனாலிஸ் மோஸ்னோஸ்டி பைல் வைபோல்னென் டிலை வைபோரா ராஸ்மெரோவ் க்ரூப், கோட்டரி ஓபெஸ்பெச்சட் >80% மாஸ்னோஸ்டி டுலியா 10% அபிசோலிட்னோகோ இஸ்மெனினிய பராமெட்ரா மற்றும் 5% ஹாஸ்டோய் ஓஷிபோக் டிபா I. 5% வகை I பிழை விகிதத்துடன் 10% முழுமையான அளவுரு மாற்றத்தைக் கண்டறிய 80% க்கும் அதிகமான சக்தியை வழங்கும் குழு அளவுகளைத் தேர்ந்தெடுக்க சக்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝变化和5％I型错误率的组大小。 பைல் ப்ரோவேடன் அனாலிஸ் மோஸ்னோஸ்டி டிலியா வைபோரா ரஸ்மேரா க்ரூப்பி, கோடோரி ஆஸ்பெக்டில் பிய் > 80% மாஸ்டோஸ்டி %000 அபிசோலிட்னோகோ இஸ்மெனீனியா பராமெட்ரோவ் மற்றும் 5% சாஸ்டோட் ஓஷிபோக் டிபா I. 10% முழுமையான அளவுரு மாற்றத்தையும் 5% வகை I பிழை விகிதத்தையும் கண்டறிய 80% க்கும் அதிகமான சக்தியை வழங்கும் குழு அளவைத் தேர்ந்தெடுக்க ஒரு சக்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.பரிசோதனைக்கு முன்னர் திசுப் பிரிவுகள் சீரற்ற முறையில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன. அனைத்து பகுப்பாய்வுகளும் நிலைப் பார்வையற்றவையாக இருந்தன, மேலும் அனைத்து தரவுகளும் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட பின்னரே மாதிரிகள் டிகோட் செய்யப்பட்டன. அனைத்து புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வுகளையும் செய்ய கிராப்பேட் பிரிசம் மென்பொருள் (சான் டியாகோ, CA) பயன்படுத்தப்பட்டது. அனைத்து புள்ளிவிவரங்களுக்கும், <0.05 மதிப்புகளில் p-மதிப்புகள் குறிப்பிடத்தக்கதாகக் கருதப்பட்டன. அனைத்து புள்ளிவிவரங்களுக்கும், p-மதிப்புகள் மதிப்புகளில் குறிப்பிடத்தக்கதாகக் கருதப்பட்டன<0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. அனைத்து புள்ளிவிவரங்களுக்கும், p-மதிப்புகள் மதிப்புகளில் குறிப்பிடத்தக்கதாகக் கருதப்பட்டன<0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. அனைத்து புள்ளிவிவரங்களுக்கும், p-மதிப்புகள் மதிப்புகளில் குறிப்பிடத்தக்கதாகக் கருதப்பட்டன<0.05.இரண்டு வால் கொண்ட மாணவரின் t-சோதனை, 2 ஒப்பீடுகளை மட்டுமே கொண்ட தரவுகளில் செய்யப்பட்டது. பல குழுக்களுக்கு இடையேயான முக்கியத்துவத்தை தீர்மானிக்க ஒரு வழி அல்லது இரு வழி ANOVA பயன்படுத்தப்பட்டது. போஸ்ட் ஹாக் சோதனைகளைச் செய்யும்போது, ​​பல ஒப்பீடுகளைக் கணக்கிட டுகேயின் திருத்தம் பயன்படுத்தப்பட்டது. முறைகள் பிரிவில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி FDR மற்றும் p.adjust ஐக் கணக்கிடும்போது RNAsec தரவு சிறப்பு புள்ளிவிவரக் கருத்தாய்வுகளைக் கொண்டுள்ளது.
ஆய்வு வடிவமைப்பு பற்றிய கூடுதல் தகவலுக்கு, இந்தக் கட்டுரையுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ள இயற்கை ஆராய்ச்சி அறிக்கை சுருக்கத்தைப் பார்க்கவும்.