Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவி பதிப்பில் குறைந்த CSS ஆதரவு உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்). இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்ய, ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் தளத்தை ரெண்டர் செய்வோம்.
AFEX உடன் முன்கூட்டியே சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட சோள அடுப்பில் உள்ள நிலையான ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் சிக்கலான பகுப்பாய்விற்கான புதிய நோயெதிர்ப்பு மற்றும் நிறை நிறமாலை முறைகள். லிக்னோசெல்லுலோசிக் பயோமாஸ் என்பது புதைபடிவ எரிபொருட்களுக்கு ஒரு நிலையான மாற்றாகும், மேலும் உணவு, தீவனம், எரிபொருள்கள் மற்றும் இரசாயனங்கள் போன்ற பொருட்களின் உற்பத்திக்கான உயிரி தொழில்நுட்பங்களை உருவாக்க பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. தாவர செல் சுவர்களில் இருக்கும் சிக்கலான கார்போஹைட்ரேட்டுகளை குளுக்கோஸ், சைலோஸ் மற்றும் அராபினோஸ் போன்ற எளிய சர்க்கரைகளாக மாற்றுவதற்கான செலவு-போட்டி செயல்முறைகளின் வளர்ச்சியே இந்த தொழில்நுட்பங்களின் திறவுகோலாகும். லிக்னோசெல்லுலோசிக் பயோமாஸ் மிகவும் பிடிவாதமாக இருப்பதால், விரும்பிய பொருளைப் பெறுவதற்கு இது வெப்ப வேதியியல் சிகிச்சைகள் (எ.கா., அம்மோனியா ஃபைபர் உரித்தல் (AFEX), நீர்த்த அமிலங்கள் (DA), அயனி திரவங்கள் (IL)) மற்றும் உயிரியல் சிகிச்சைகள் (எ.கா., நொதி நீராற்பகுப்பு மற்றும் நுண்ணுயிர் நொதித்தல்) ஆகியவற்றிற்கு உட்படுத்தப்பட வேண்டும். இருப்பினும், வணிக பூஞ்சை நொதிகள் நீராற்பகுப்பு செயல்பாட்டில் பயன்படுத்தப்படும்போது, ​​உருவாகும் கரையக்கூடிய சர்க்கரைகளில் 75-85% மட்டுமே மோனோசாக்கரைடுகள், மீதமுள்ள 15-25% கரையக்கூடிய, எளிதில் உறிஞ்சக்கூடிய ஒலிகோசாக்கரைடுகள், இவை நுண்ணுயிரிகளுக்கு எப்போதும் கிடைக்காது. முன்னதாக, கார்பன் மற்றும் டைட்டோமேசியஸ் பூமி பிரிப்பு மற்றும் அளவு விலக்கு குரோமடோகிராஃபி ஆகியவற்றின் கலவையைப் பயன்படுத்தி கரையக்கூடிய பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளை வெற்றிகரமாக தனிமைப்படுத்தி சுத்திகரித்துள்ளோம், மேலும் அவற்றின் நொதி தடுப்பு பண்புகளையும் ஆராய்ந்தோம். குறைந்த DP மற்றும் நடுநிலை ஒலிகோசாக்கரைடுகளை விட அதிக அளவு பாலிமரைசேஷன் (DP) மெத்திலேட்டட் யூரோனிக் அமில மாற்றுகளைக் கொண்ட ஒலிகோசாக்கரைடுகள் வணிக நொதி கலவைகளுடன் செயலாக்குவது மிகவும் கடினம் என்பதைக் கண்டறிந்துள்ளோம். தாவர உயிரி உயிரி கிளைக்கான்களுக்கு குறிப்பிட்ட மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகள் (mAbs) பயன்படுத்தி கிளைக்கான் விவரக்குறிப்பு உள்ளிட்ட பல கூடுதல் முறைகளைப் பயன்படுத்துவதை இங்கே நாங்கள் தெரிவிக்கிறோம். தாவர செல் சுவர்கள் மற்றும் நொதி ஹைட்ரோலைசேட்டுகளில் உள்ள கிளைக்கான் பிணைப்புகளை வகைப்படுத்த, மேட்ரிக்ஸ்-உதவி லேசர் உறிஞ்சுதல் அயனியாக்கம், விமானத்தின் நேர மாஸ்-ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி. . எதிர்மறை அயனிகளின் இரண்டாம் நிலை சிதைவுக்குப் பிறகு நிறமாலையியல் மூலம் பெறப்பட்ட கட்டமைப்பு-தகவல் கண்டறியும் சிகரங்களை, வாயு குரோமடோகிராபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (GC-MS) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி, வழித்தோன்றலுடன் மற்றும் இல்லாமல் ஒலிகோசாக்கரைடு பிணைப்புகளை வகைப்படுத்துகிறது. ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் சிறிய அளவு (DP 4–20) காரணமாக, இந்த மூலக்கூறுகள் mAb பிணைப்பு மற்றும் குணாதிசயத்திற்குப் பயன்படுத்துவது கடினம். இந்தச் சிக்கலைச் சமாளிக்க, மைக்ரோபிளேட் மேற்பரப்பில் பெரும்பாலான குறைந்த DP கரையக்கூடிய ஒலிகோசாக்கரைடுகளை வெற்றிகரமாக லேபிளிடும் ஒரு புதிய பயோட்டின் இணைத்தல் அடிப்படையிலான ஒலிகோசாக்கரைடு அசையாமை முறையைப் பயன்படுத்தினோம், இது பின்னர் குறிப்பிட்ட பிணைப்பு பகுப்பாய்விற்காக உயர் செயல்திறன் mAb அமைப்பில் பயன்படுத்தப்பட்டது. இந்த புதிய முறை எதிர்காலத்தில் மிகவும் மேம்பட்ட உயர் செயல்திறன் கிளைகோம் மதிப்பீடுகளை உருவாக்க உதவும், இது நோயறிதல் நோக்கங்களுக்காக பயோமார்க்ஸர்களில் இருக்கும் ஒலிகோசாக்கரைடுகளை தனிமைப்படுத்தவும் வகைப்படுத்தவும் பயன்படுத்தப்படலாம்.
வேளாண்மை, வனவியல், புல் மற்றும் மரப் பொருட்களால் ஆன லிக்னோசெல்லுலோசிக் பயோமாஸ், அதிக மதிப்புள்ள பொருட்களை உற்பத்தி செய்ய உணவு, தீவனம், எரிபொருள் மற்றும் வேதியியல் முன்னோடிகள் உள்ளிட்ட உயிரி அடிப்படையிலான தயாரிப்புகளின் உற்பத்திக்கு ஒரு சாத்தியமான மூலப்பொருளாகும். தாவர செல் சுவர்களில் இருக்கும் கார்போஹைட்ரேட்டுகள் (செல்லுலோஸ் மற்றும் ஹெமிசெல்லுலோஸ் போன்றவை) வேதியியல் செயலாக்கம் மற்றும் உயிர் உருமாற்றம் (என்சைமடிக் ஹைட்ரோலிசிஸ் மற்றும் நுண்ணுயிர் நொதித்தல் போன்றவை) மூலம் மோனோசாக்கரைடுகளாக டிபாலிமரைஸ் செய்யப்படுகின்றன. பொதுவான முன் சிகிச்சைகளில் அம்மோனியா ஃபைபர் விரிவாக்கம் (AFEX), நீர்த்த அமிலம் (DA), அயனி திரவம் (IL) மற்றும் நீராவி வெடிப்பு (SE) ஆகியவை அடங்கும், அவை தாவர செல் சுவர்களைத் திறப்பதன் மூலம் லிக்னோசெல்லுலோஸ் உற்பத்தியைக் குறைக்க இரசாயனங்கள் மற்றும் வெப்பத்தின் கலவையைப் பயன்படுத்துகின்றன3,4. பொருளின் பிடிவாதம், 5. வணிக ரீதியாக செயல்படும் கார்போஹைட்ரேட் கொண்ட நொதிகள் (CAZymes) மற்றும் உயிர் அடிப்படையிலான எரிபொருள்கள் மற்றும் ரசாயனங்களை உற்பத்தி செய்ய டிரான்ஸ்ஜெனிக் ஈஸ்ட்கள் அல்லது பாக்டீரியாக்களைப் பயன்படுத்தி நுண்ணுயிர் நொதித்தல் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி அதிக திடப்பொருட்களில் நொதி நீர்ப்பகுப்பு மேற்கொள்ளப்படுகிறது 6.
வணிக நொதிகளில் உள்ள CAZymes, சிக்கலான கார்போஹைட்ரேட்-சர்க்கரை பிணைப்புகளை ஒருங்கிணைவாகப் பிரித்து மோனோசாக்கரைடுகளை உருவாக்கும் நொதிகளின் சிக்கலான கலவையால் ஆனது. 2,7. நாம் முன்னர் குறிப்பிட்டது போல, லிக்னினுடன் கார்போஹைட்ரேட்டுகளின் நறுமண பாலிமர்களின் சிக்கலான வலையமைப்பு அவற்றை மிகவும் எளிதில் உறிஞ்ச முடியாததாக ஆக்குகிறது, இது முழுமையடையாத சர்க்கரை மாற்றத்திற்கு வழிவகுக்கிறது, முன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட உயிரியலின் நொதி நீராற்பகுப்பின் போது உற்பத்தி செய்யப்படாத 15-25% பாலியல் ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் குவிக்கிறது. பல்வேறு உயிரியக்க முன் சிகிச்சை முறைகளில் இது ஒரு பொதுவான பிரச்சனையாகும். இந்த இடையூறுக்கான சில காரணங்கள் நீராற்பகுப்பின் போது நொதி தடுப்பு அல்லது தாவர உயிரியலில் சர்க்கரை பிணைப்புகளை உடைக்கத் தேவையான அத்தியாவசிய அத்தியாவசிய நொதிகள் இல்லாதது அல்லது குறைந்த அளவுகள் ஆகியவை அடங்கும். ஒலிகோசாக்கரைடுகளில் உள்ள சர்க்கரை பிணைப்புகள் போன்ற சர்க்கரைகளின் கலவை மற்றும் கட்டமைப்பு பண்புகளைப் புரிந்துகொள்வது, நீராற்பகுப்பின் போது சர்க்கரை மாற்றத்தை மேம்படுத்த உதவும், உயிரி தொழில்நுட்ப செயல்முறைகளை பெட்ரோலியத்திலிருந்து பெறப்பட்ட பொருட்களுடன் செலவு குறைந்த போட்டித்தன்மையுடன் மாற்றும்.
கார்போஹைட்ரேட்டுகளின் கட்டமைப்பைத் தீர்மானிப்பது சவாலானது மற்றும் திரவ குரோமடோகிராபி (LC)11,12, நியூக்ளியர் காந்த அதிர்வு நிறமாலை (NMR)13, கேபிலரி எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் (CE)14,15,16 மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (MS)17 போன்ற முறைகளின் கலவை தேவைப்படுகிறது. ,பதினெட்டு. லேசர் உறிஞ்சுதலுடன் கூடிய டைம்-ஆஃப்-ஃப்ளைட் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி மற்றும் மேட்ரிக்ஸைப் பயன்படுத்தி அயனியாக்கம் (MALDI-TOF-MS) போன்ற MS முறைகள் கார்போஹைட்ரேட் கட்டமைப்புகளை அடையாளம் காண்பதற்கான ஒரு பல்துறை முறையாகும். சமீபத்தில், சோடியம் அயன் சேர்க்கைகளின் மோதல்-தூண்டப்பட்ட விலகல் (CID) டேன்டெம் MS, ஒலிகோசாக்கரைடு இணைப்பு நிலைகள், அனோமெரிக் உள்ளமைவுகள், வரிசைகள் மற்றும் கிளை நிலைகள் 20, 21 ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடைய கைரேகைகளை அடையாளம் காண மிகவும் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.
கிளைக்கான் பகுப்பாய்வு என்பது கார்போஹைட்ரேட் பிணைப்புகளை ஆழமாக அடையாளம் காண ஒரு சிறந்த கருவியாகும். இந்த முறை சிக்கலான கார்போஹைட்ரேட் இணைப்புகளைப் புரிந்துகொள்ள தாவர செல் சுவர் கிளைக்கானுக்கு இயக்கப்பட்ட மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகளை (mAbs) ஆய்வுகளாகப் பயன்படுத்துகிறது. பல்வேறு நேரியல் மற்றும் கிளைத்த ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கு எதிராக பல்வேறு சாக்கரைடுகளைப் பயன்படுத்தி வடிவமைக்கப்பட்ட 250 mAbs உலகளவில் கிடைக்கின்றன. தாவர செல் வகை, உறுப்பு, வயது, வளர்ச்சி நிலை மற்றும் வளர்ச்சி சூழல் ஆகியவற்றைப் பொறுத்து குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகள் இருப்பதால், தாவர செல் சுவரின் அமைப்பு, கலவை மற்றும் மாற்றங்களை வகைப்படுத்த பல mAbs பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. மிக சமீபத்தில், இந்த முறை தாவர மற்றும் விலங்கு அமைப்புகளில் உள்ள வெசிகல் மக்கள்தொகையைப் புரிந்துகொள்வதற்கும், துணை செல்லுலார் குறிப்பான்கள், வளர்ச்சி நிலைகள் அல்லது சுற்றுச்சூழல் தூண்டுதல்களால் தீர்மானிக்கப்படும் கிளைக்கான் போக்குவரத்தில் அவற்றின் பங்குகளைப் புரிந்துகொள்வதற்கும், நொதி செயல்பாட்டைத் தீர்மானிப்பதற்கும் பயன்படுத்தப்படுகிறது. கிளைக்கான்கள் மற்றும் சைலான்களின் பல்வேறு கட்டமைப்புகளில் பெக்டின் (P), சைலான் (X), மன்னன் (M), சைலோகுளுக்கான்கள் (XylG), கலப்பு பிணைப்பு குளுக்கான்கள் (MLG), அராபினாக்ஸிலன் (ArbX), கேலக்டோமன்னன் (GalG), குளுகுரோனிக் அமிலம்-அராபினாக்ஸிலன் (GArbX) மற்றும் அராபினோ-கேலக்டன் (ArbG) ஆகியவை அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளன.
இருப்பினும், இந்த அனைத்து ஆராய்ச்சி முயற்சிகள் இருந்தபோதிலும், அதிக திடப்பொருள் சுமை (HSL) நீராற்பகுப்பின் போது ஒலிகோசாக்கரைடு குவிப்பின் தன்மையில் ஒரு சில ஆய்வுகள் மட்டுமே கவனம் செலுத்தியுள்ளன, இதில் ஒலிகோசாக்கரைடு வெளியீடு, நீராற்பகுப்பின் போது ஒலிகோமெரிக் சங்கிலி நீள மாற்றங்கள், பல்வேறு குறைந்த DP பாலிமர்கள் மற்றும் அவற்றின் வளைவுகள் ஆகியவை அடங்கும். விநியோகங்கள் 30,31,32. இதற்கிடையில், கிளைக்கான் பகுப்பாய்வு கிளைக்கான் கட்டமைப்பின் விரிவான பகுப்பாய்விற்கு ஒரு பயனுள்ள கருவியாக நிரூபிக்கப்பட்டிருந்தாலும், ஆன்டிபாடி முறைகளைப் பயன்படுத்தி நீரில் கரையக்கூடிய குறைந்த DP ஒலிகோசாக்கரைடுகளை மதிப்பிடுவது கடினம். 5-10 kDa க்கும் குறைவான மூலக்கூறு எடை கொண்ட சிறிய DP ஒலிகோசாக்கரைடுகள் ELISA தகடுகள் 33, 34 உடன் பிணைக்கப்படுவதில்லை மற்றும் ஆன்டிபாடி சேர்ப்பதற்கு முன்பு கழுவப்படுகின்றன.
இங்கே, முதன்முறையாக, மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகளைப் பயன்படுத்தி அவிடின்-பூசப்பட்ட தட்டுகளில் ஒரு ELISA மதிப்பீட்டை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம், கரையக்கூடிய பயனற்ற ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கான ஒரு-படி பயோடினைலேஷன் செயல்முறையை கிளைகோம் பகுப்பாய்வோடு இணைக்கிறோம். கிளைகோம் பகுப்பாய்விற்கான எங்கள் அணுகுமுறை MALDI-TOF-MS மற்றும் GC-MS அடிப்படையிலான ஹைட்ரோலைஸ் செய்யப்பட்ட சர்க்கரை கலவைகளின் டிரைமெதில்சிலைல் (TMS) வழித்தோன்றலைப் பயன்படுத்தி நிரப்பு ஒலிகோசாக்கரைடு இணைப்புகளின் பகுப்பாய்வு மூலம் சரிபார்க்கப்பட்டது. இந்த புதுமையான அணுகுமுறை எதிர்காலத்தில் ஒரு உயர்-செயல்திறன் முறையாக உருவாக்கப்படலாம் மற்றும் உயிரி மருத்துவ ஆராய்ச்சியில் பரந்த பயன்பாட்டைக் காணலாம்35.
மொழிபெயர்ப்புக்குப் பிந்தைய நொதிகள் மற்றும் ஆன்டிபாடிகள், கிளைகோசைலேஷன் போன்றவை, 36 அவற்றின் உயிரியல் செயல்பாட்டை பாதிக்கின்றன. எடுத்துக்காட்டாக, சீரம் புரதங்களின் கிளைகோசைலேஷனில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் அழற்சி மூட்டுவலிக்கு முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன, மேலும் கிளைகோசைலேஷனில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் கண்டறியும் குறிப்பான்களாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன37. இரைப்பை குடல் மற்றும் கல்லீரலின் நாள்பட்ட அழற்சி நோய்கள், வைரஸ் தொற்றுகள், கருப்பை, மார்பகம் மற்றும் புரோஸ்டேட் புற்றுநோய்கள் உட்பட பல்வேறு நோய்களில் பல்வேறு கிளைக்கான்கள் உடனடியாகத் தோன்றுவதாக இலக்கியத்தில் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது38,39,40. ஆன்டிபாடி அடிப்படையிலான கிளைக்கான் ELISA முறைகளைப் பயன்படுத்தி கிளைக்கான்களின் கட்டமைப்பைப் புரிந்துகொள்வது சிக்கலான MS முறைகளைப் பயன்படுத்தாமல் நோய் கண்டறிதலில் கூடுதல் நம்பிக்கையை வழங்கும்.
எங்கள் முந்தைய ஆய்வு, முன் சிகிச்சை மற்றும் நொதி நீர்ப்பகுப்புக்குப் பிறகு பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகள் நீராற்பகுப்பு செய்யப்படாமல் இருப்பதைக் காட்டியது (படம் 1). எங்கள் முன்னர் வெளியிடப்பட்ட படைப்பில், AFEX-முன் சிகிச்சை பெற்ற சோள அடுப்பு ஹைட்ரோலைசேட் (ACSH) 8 இலிருந்து ஒலிகோசாக்கரைடுகளை தனிமைப்படுத்த ஒரு செயல்படுத்தப்பட்ட கரி திட-கட்ட பிரித்தெடுக்கும் முறையை நாங்கள் உருவாக்கினோம். ஆரம்ப பிரித்தெடுத்தல் மற்றும் பிரித்தெடுத்தலுக்குப் பிறகு, ஒலிகோசாக்கரைடுகள் அளவு விலக்கு குரோமடோகிராபி (SEC) மூலம் மேலும் பின்னம் செய்யப்பட்டு மூலக்கூறு எடையின் வரிசையில் சேகரிக்கப்பட்டன. பல்வேறு முன் சிகிச்சைகளிலிருந்து வெளியிடப்பட்ட சர்க்கரை மோனோமர்கள் மற்றும் ஒலிகோமர்கள் சர்க்கரை கலவை பகுப்பாய்வு மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. பல்வேறு முன் சிகிச்சை முறைகளால் பெறப்பட்ட சர்க்கரை ஒலிகோமர்களின் உள்ளடக்கத்தை ஒப்பிடும் போது, ​​பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் இருப்பு உயிரித் தொகுதியை மோனோசாக்கரைடுகளாக மாற்றுவதில் ஒரு பொதுவான பிரச்சனையாகும், மேலும் இது குறைந்தபட்சம் 10-15% மற்றும் 18% வரை சர்க்கரை விளைச்சலைக் குறைக்க வழிவகுக்கும். US. இந்த முறை ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னங்களின் பெரிய அளவிலான உற்பத்திக்கு பயன்படுத்தப்படுகிறது. இதன் விளைவாக வரும் ACH மற்றும் வெவ்வேறு மூலக்கூறு எடைகளைக் கொண்ட அதன் அடுத்தடுத்த பின்னங்கள் இந்த வேலையில் ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் தன்மைக்கு சோதனைப் பொருளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன.
முன் சிகிச்சை மற்றும் நொதி நீராற்பகுப்புக்குப் பிறகு, நிலையான ஒலிகோசாக்கரைடுகள் நீராற்பகுப்பு செய்யப்படாமல் இருந்தன. இங்கே (A) என்பது ஒரு ஒலிகோசாக்கரைடு பிரிப்பு முறையாகும், இதில் ஒலிகோசாக்கரைடுகள் AFEX-முன் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட சோள அடுப்பு ஹைட்ரோலைசேட் (ACSH) இலிருந்து செயல்படுத்தப்பட்ட கார்பன் மற்றும் டயட்டோமேசியஸ் பூமியின் நிரம்பிய படுக்கையைப் பயன்படுத்தி தனிமைப்படுத்தப்படுகின்றன; (B) ஒலிகோசாக்கரைடுகளைப் பிரிப்பதற்கான முறை. ஒலிகோசாக்கரைடுகள் அளவு விலக்கு குரோமடோகிராபி (SEC) மூலம் மேலும் பிரிக்கப்பட்டன; (C) பல்வேறு முன் சிகிச்சைகளிலிருந்து வெளியிடப்பட்ட சாக்கரைடு மோனோமர்கள் மற்றும் ஒலிகோமர்கள் (நீர்த்த அமிலம்: DA, அயனி திரவம்: IL மற்றும் AFEX). நொதி நீராற்பகுப்பு நிலைமைகள்: 25% (w/w) அதிக திடப்பொருட்களை ஏற்றுதல் (தோராயமாக 8% குளுக்கன் ஏற்றுதல்), 96 மணிநேர நீராற்பகுப்பு, 20 மி.கி/கிராம் வணிக நொதி ஏற்றுதல் (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 விகிதம்) மற்றும் (D) AFEX முன் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட சோள அடுப்பு (ACS) இலிருந்து வெளியிடப்பட்ட குளுக்கோஸ், சைலோஸ் மற்றும் அராபினோஸின் சர்க்கரை மோனோமர்கள் மற்றும் ஒலிகோமர்கள்.
திடமான உயிரி எச்சங்களிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட சாறுகளில் கிளைக்கான்களின் விரிவான கட்டமைப்பு பகுப்பாய்விற்கு கிளைக்கான் பகுப்பாய்வு ஒரு பயனுள்ள கருவியாக நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது. இருப்பினும், இந்த பாரம்பரிய முறையைப் பயன்படுத்தி நீரில் கரையக்கூடிய சாக்கரைடுகள் குறைவாகவே குறிப்பிடப்படுகின்றன41 ஏனெனில் குறைந்த மூலக்கூறு எடை ஒலிகோசாக்கரைடுகள் ELISA தகடுகளில் அசையாமல் இருப்பது கடினம் மற்றும் ஆன்டிபாடி சேர்ப்பதற்கு முன்பு கழுவப்படுகின்றன. எனவே, ஆன்டிபாடி பிணைப்பு மற்றும் குணாதிசயத்திற்கு, அவிடின்-பூசப்பட்ட ELISA தகடுகளில் கரையக்கூடிய, இணக்கமற்ற ஒலிகோசாக்கரைடுகளை பூச ஒரு-படி பயோடினைலேஷன் முறை பயன்படுத்தப்பட்டது. இந்த முறை எங்கள் முன்னர் தயாரிக்கப்பட்ட ACSH மற்றும் அதன் மூலக்கூறு எடை (அல்லது பாலிமரைசேஷன் அளவு, DP) அடிப்படையில் ஒரு பகுதியைப் பயன்படுத்தி சோதிக்கப்பட்டது. கார்போஹைட்ரேட்டின் குறைக்கும் முனையில் பயோட்டின்-LC-ஹைட்ராசைடைச் சேர்ப்பதன் மூலம் ஒலிகோசாக்கரைடு பிணைப்பு உறவை அதிகரிக்க ஒரு-படி பயோடினைலேஷன் பயன்படுத்தப்பட்டது (படம் 2). கரைசலில், குறைக்கும் முனையில் உள்ள ஹெமியாசெட்டல் குழு பயோட்டின்-LC-ஹைட்ராசைட்டின் ஹைட்ராசைடு குழுவுடன் வினைபுரிந்து ஹைட்ராசோன் பிணைப்பை உருவாக்குகிறது. குறைக்கும் முகவர் NaCNBH3 முன்னிலையில், ஹைட்ராசோன் பிணைப்பு ஒரு நிலையான பயோட்டினைலேட்டட் இறுதிப் பொருளாகக் குறைக்கப்படுகிறது. சர்க்கரை குறைக்கும் முனையின் மாற்றத்துடன், குறைந்த DP ஒலிகோசாக்கரைடுகளை ELISA தகடுகளுடன் பிணைப்பது சாத்தியமானது, மேலும் எங்கள் ஆய்வில் இது கிளைக்கான்-இலக்கு mAbs ஐப் பயன்படுத்தி அவிடின்-பூசப்பட்ட தட்டுகளில் செய்யப்பட்டது.
பயோடினைலேட்டட் ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கு ELISA அடிப்படையிலான மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகளின் திரையிடல். இங்கே (A) நியூட்ர்அவிடின் பூசப்பட்ட தகடுகளில் கிளைக்கான்-இலக்கு வைக்கப்பட்ட mAbs உடன் ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் ஒருங்கிணைந்த பயோடினைலேஷன் மற்றும் அதைத் தொடர்ந்து ELISA திரையிடல் மற்றும் (B) எதிர்வினை தயாரிப்புகளின் பயோடினைலேஷனுக்கான ஒரு-படி செயல்முறையைக் காட்டுகிறது.
பின்னர் ஒலிகோசாக்கரைடு-இணைந்த ஆன்டிபாடிகளைக் கொண்ட அவிடின்-பூசப்பட்ட தட்டுகள் முதன்மை மற்றும் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகளுடன் சேர்க்கப்பட்டு ஒளி மற்றும் நேர உணர்திறன் ஊடகத்தில் கழுவப்பட்டன. ஆன்டிபாடி பிணைப்பு முடிந்ததும், தட்டில் அடைகாக்க TMB அடி மூலக்கூறைச் சேர்க்கவும். எதிர்வினை இறுதியாக சல்பூரிக் அமிலத்துடன் நிறுத்தப்பட்டது. ஆன்டிபாடி-குறிப்பிட்ட குறுக்கு-இணைப்பைக் கண்டறிய ஒவ்வொரு ஆன்டிபாடியின் பிணைப்பு வலிமையையும் தீர்மானிக்க, அடைகாக்கப்பட்ட தட்டுகள் ELISA ரீடரைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. பரிசோதனையின் விவரங்கள் மற்றும் அளவுருக்களுக்கு, தொடர்புடைய பிரிவான "பொருட்கள் மற்றும் முறைகள்" ஐப் பார்க்கவும்.
ACSH இல் உள்ள கரையக்கூடிய ஒலிகோசாக்கரைடுகள் மற்றும் லிக்னோசெல்லுலோசிக் ஹைட்ரோலைசேட்டுகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட கச்சா மற்றும் சுத்திகரிக்கப்பட்ட ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னங்களில் உள்ள கரையக்கூடிய ஒலிகோசாக்கரைடுகளை வகைப்படுத்துவதன் மூலம், குறிப்பிட்ட பயன்பாடுகளுக்கு இந்தப் புதிதாக உருவாக்கப்பட்ட முறையின் பயன்பாட்டை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம். படம் 3 இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, பயோஅசைலேட்டட் கிளைகோம் மதிப்பீட்டு முறைகளைப் பயன்படுத்தி ACSH இல் அடையாளம் காணப்பட்ட மிகவும் பொதுவான எபிடோப்-பதிலீடு செய்யப்பட்ட சைலான்கள் பொதுவாக யூரோனிக் (U) அல்லது மெத்திலூரோனிக் (MeU) மற்றும் பெக்டிக் அராபினோகாலக்டான்கள் ஆகும். அவற்றில் பெரும்பாலானவை ஹைட்ரோலைஸ் செய்யப்படாத திடப்பொருட்களின் (UHS) கிளைக்கான்களின் பகுப்பாய்வு குறித்த எங்கள் முந்தைய ஆய்விலும் காணப்பட்டன.
செல் சுவர் கிளைக்கானுக்கு இயக்கப்பட்ட மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடியைப் பயன்படுத்தி மறுசுழற்சி ஒலிகோசாக்கரைடு எபிடோப்களைக் கண்டறிதல். "நடுநிலை" பின்னம் ACN பின்னம் மற்றும் "அமில" பின்னம் FA பின்னம் ஆகும். வெப்ப வரைபடத்தில் பிரகாசமான சிவப்பு நிறங்கள் அதிக எபிடோப் உள்ளடக்கத்தைக் குறிக்கின்றன, மேலும் பிரகாசமான நீல நிறங்கள் வெற்று பின்னணியைக் குறிக்கின்றன. அளவுகோலில் உள்ள வண்ண மதிப்புகள் N=2 சூத்திரங்களுக்கான மூல OD மதிப்புகளை அடிப்படையாகக் கொண்டவை. ஆன்டிபாடிகளால் அங்கீகரிக்கப்பட்ட முக்கிய எபிடோப்கள் வலதுபுறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன.
இந்த செல்லுலோஸ் அல்லாத கட்டமைப்புகளை, சோதனை செய்யப்பட்ட வணிக நொதி கலவையில் மிகவும் பொதுவான செல்லுலேஸ்கள் மற்றும் ஹெமிசெல்லுலேஸ்களால் பிரிக்க முடியாது, இதில் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் வணிக நொதிகளும் அடங்கும். எனவே, அவற்றின் நீராற்பகுப்புக்கு புதிய துணை நொதிகள் தேவைப்படுகின்றன. தேவையான செல்லுலோஸ் அல்லாத துணை நொதிகள் இல்லாமல், இந்த செல்லுலோஸ் அல்லாத பிணைப்புகள் மோனோசாக்கரைடுகளாக முழுமையாக மாறுவதைத் தடுக்கின்றன, அவற்றின் தாய் சர்க்கரை பாலிமர்கள் குறுகிய துண்டுகளாக விரிவாக நீராற்பகுப்பு செய்யப்பட்டு வணிக நொதி கலவைகளைப் பயன்படுத்தி கரைக்கப்பட்டாலும் கூட.
சமிக்ஞை பரவல் மற்றும் அதன் பிணைப்பு வலிமை பற்றிய மேலும் ஆய்வில், டைமர்களில் குறைந்த DP பின்னங்களை (D, E, F, DP) விட அதிக DP சர்க்கரை பின்னங்களில் (A, B, C, DP 20+ வரை) பிணைப்பு எபிடோப்கள் குறைவாக இருப்பதைக் காட்டியது) (படம் 1). அமிலத் துண்டுகள் நடுநிலை துண்டுகளை விட செல்லுலோஸ் அல்லாத எபிடோப்களில் அதிகம் காணப்படுகின்றன. இந்த நிகழ்வுகள் எங்கள் முந்தைய ஆய்வில் காணப்பட்ட வடிவத்துடன் ஒத்துப்போகின்றன, அங்கு அதிக DP மற்றும் அமில தருணங்கள் நொதி நீராற்பகுப்புக்கு அதிக எதிர்ப்புத் திறன் கொண்டவை. எனவே, செல்லுலோஸ் அல்லாத கிளைக்கான் எபிடோப்கள் மற்றும் U மற்றும் MeU மாற்றீடுகள் இருப்பது ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் நிலைத்தன்மைக்கு பெரிதும் பங்களிக்கும். பிணைப்பு மற்றும் கண்டறிதல் செயல்திறன் குறைந்த DP ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கு சிக்கலாக இருக்கலாம் என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும், குறிப்பாக எபிடோப் ஒரு டைமெரிக் அல்லது ட்ரைமெரிக் ஒலிகோசாக்கரைடாக இருந்தால். வெவ்வேறு நீளங்களின் வணிக ஒலிகோசாக்கரைடுகளைப் பயன்படுத்தி இதைச் சோதிக்கலாம், ஒவ்வொன்றும் ஒரு குறிப்பிட்ட mAb உடன் பிணைக்கும் ஒரே ஒரு எபிடோப்பைக் கொண்டுள்ளது.
இவ்வாறு, கட்டமைப்பு-குறிப்பிட்ட ஆன்டிபாடிகளின் பயன்பாடு சில வகையான மறுசீரமைப்பு பிணைப்புகளை வெளிப்படுத்தியது. பயன்படுத்தப்படும் ஆன்டிபாடி வகை, பொருத்தமான பிணைப்பு முறை மற்றும் அது உருவாக்கும் சமிக்ஞையின் வலிமை (மிகவும் குறைவாகவும் ஏராளமாக) ஆகியவற்றைப் பொறுத்து, புதிய நொதிகளை அடையாளம் கண்டு, முழுமையான கிளைகோகன்வெர்ஷனுக்காக நொதி கலவையில் அரை அளவு அடிப்படையில் சேர்க்கலாம். ACSH ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் பகுப்பாய்வை உதாரணமாக எடுத்துக் கொண்டால், ஒவ்வொரு உயிரி பொருளுக்கும் கிளைக்கான் பிணைப்புகளின் தரவுத்தளத்தை உருவாக்கலாம். ஆன்டிபாடிகளின் வெவ்வேறு தொடர்பு கணக்கில் எடுத்துக்கொள்ளப்பட வேண்டும் என்பதையும், அவற்றின் தொடர்பு தெரியவில்லை என்றால், வெவ்வேறு ஆன்டிபாடிகளின் சமிக்ஞைகளை ஒப்பிடும் போது இது சில சிரமங்களை உருவாக்கும் என்பதையும் இங்கே கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும். கூடுதலாக, கிளைக்கான் பிணைப்புகளின் ஒப்பீடு ஒரே ஆன்டிபாடிக்கான மாதிரிகளுக்கு இடையில் சிறப்பாகச் செயல்படக்கூடும். இந்த பிடிவாதமான பிணைப்புகளை CAZyme தரவுத்தளத்துடன் இணைக்கலாம், இதிலிருந்து நாம் நொதிகளை அடையாளம் காணலாம், வேட்பாளர் நொதிகளைத் தேர்ந்தெடுக்கலாம் மற்றும் பிணைப்பு-உடைக்கும் நொதிகளை சோதிக்கலாம் அல்லது உயிரி சுத்திகரிப்பு நிலையங்களில் பயன்படுத்த இந்த நொதிகளை வெளிப்படுத்த நுண்ணுயிர் அமைப்புகளை உருவாக்கலாம்44.
லிக்னோசெல்லுலோசிக் ஹைட்ரோலைசேட்டுகளில் உள்ள குறைந்த மூலக்கூறு எடை ஒலிகோசாக்கரைடுகளை வகைப்படுத்துவதற்கான மாற்று முறைகளை நோயெதிர்ப்பு முறைகள் எவ்வாறு பூர்த்தி செய்கின்றன என்பதை மதிப்பிடுவதற்கு, அதே பலகத்தில் (படம் 5) ஒலிகோசாக்கரைடு பகுதியில் MALDI (படம் 4, S1-S8) மற்றும் GC-MS அடிப்படையிலான TMS-பெறப்பட்ட சாக்கரைடுகளின் பகுப்பாய்வைச் செய்தோம். ஒலிகோசாக்கரைடு மூலக்கூறுகளின் நிறை பரவல் நோக்கம் கொண்ட அமைப்புடன் பொருந்துமா என்பதை ஒப்பிடுவதற்கு MALDI பயன்படுத்தப்படுகிறது. படம் 4 இல் ACN-A மற்றும் ACN-B நடுநிலை கூறுகளின் MC ஐக் காட்டுகிறது. ACN-A பகுப்பாய்வு DP 4–8 (படம் 4) முதல் DP 22 (படம் S1) வரையிலான பென்டோஸ் சர்க்கரைகளின் வரம்பை உறுதிப்படுத்தியது, அதன் எடைகள் MeU-xylan ஒலிகோசாக்கரைடுகளுடன் ஒத்திருக்கும். ACN-B பகுப்பாய்வு DP 8-15 உடன் பென்டோஸ் மற்றும் குளுக்கோசிலன் தொடரை உறுதிப்படுத்தியது. படம் S3 போன்ற துணைப் பொருட்களில், FA-C அமிலப் பகுதி நிறை விநியோக வரைபடங்கள், ELISA- அடிப்படையிலான mAb திரையிடலில் காணப்படும் மாற்று சைலான்களுடன் ஒத்துப்போகும் 8-15 DP உடன் (Me)U மாற்று பென்டோஸ் சர்க்கரைகளின் வரம்பைக் காட்டுகின்றன. எபிடோப்கள் சீரானவை.
ACS இல் கரையக்கூடிய இணக்கமற்ற ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் MALDI-MS நிறமாலை உள்ளது. இங்கே, (A) மெத்திலேட்டட் யூரோனிக் அமிலம் (DP 4-8) கொண்ட ACN-A குறைந்த எடை வரம்பு பின்னங்கள் குளுகுராக்ஸிலான் ஒலிகோசாக்கரைடுகளை மாற்றியமைத்தன மற்றும் (B) குளுகுராக்ஸிலானுடன் மாற்றியமைத்தன (DP 8-15) ACN-B சைலான் மற்றும் மெத்திலேட்டட் யூரோனிக் அமில ஒலிகோசாக்கரைடுகள்.
பயனற்ற ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் கிளைக்கான் எச்சத்தின் கலவையின் பகுப்பாய்வு. இங்கே (A) GC-MS பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி பெறப்பட்ட பல்வேறு ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னங்களின் TMS சாக்கரைடு கலவை. (B) ஒலிகோசாக்கரைடுகளில் உள்ள பல்வேறு TMS-பெறப்பட்ட சர்க்கரைகளின் கட்டமைப்புகள். ACN - நடுநிலை ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் கொண்ட அசிட்டோனிட்ரைல் பின்னம் மற்றும் FA - அமில ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் கொண்ட ஃபெருலிக் அமில பின்னம்.
படம் S9 இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னத்தின் LC-MS பகுப்பாய்விலிருந்து மற்றொரு சுவாரஸ்யமான முடிவு எடுக்கப்பட்டது (முறைகளை மின்னணு துணைப் பொருளில் காணலாம்). ACN-B பின்னத்தின் பிணைப்பின் போது ஹெக்ஸோஸ் மற்றும் -OAc குழுக்களின் துண்டுகள் மீண்டும் மீண்டும் காணப்பட்டன. இந்தக் கண்டுபிடிப்பு கிளைகோம் மற்றும் MALDI-TOF பகுப்பாய்வில் காணப்பட்ட துண்டு துண்டாக இருப்பதை உறுதிப்படுத்துவது மட்டுமல்லாமல், முன்கூட்டியே சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட லிக்னோசெல்லுலோசிக் பயோமாஸில் சாத்தியமான கார்போஹைட்ரேட் வழித்தோன்றல்கள் பற்றிய புதிய தகவல்களையும் வழங்குகிறது.
TMS சர்க்கரை வழித்தோன்றலைப் பயன்படுத்தி ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னத்தின் சர்க்கரை கலவையையும் நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். GC-MS ஐப் பயன்படுத்தி, ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னத்தில் உள்ள நரம்பியல் (வழித்தோன்றல் அல்லாத) மற்றும் அமில சர்க்கரைகளின் (GluA மற்றும் GalA) கலவையை நாங்கள் தீர்மானித்தோம் (படம் 5). குளுகுரோனிக் அமிலம் அமில கூறுகள் C மற்றும் D இல் காணப்படுகிறது, அதே நேரத்தில் கேலக்டூரோனிக் அமிலம் அமில கூறுகள் A மற்றும் B இல் காணப்படுகிறது, இவை இரண்டும் அமில சர்க்கரைகளின் உயர் DP கூறுகள். இந்த முடிவுகள் எங்கள் ELISA மற்றும் MALDI தரவை உறுதிப்படுத்துவது மட்டுமல்லாமல், ஒலிகோசாக்கரைடு குவிப்பு பற்றிய எங்கள் முந்தைய ஆய்வுகளுடனும் ஒத்துப்போகின்றன. எனவே, ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் பயோடினைலேஷன் மற்றும் அடுத்தடுத்த ELISA ஸ்கிரீனிங் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி நவீன நோயெதிர்ப்பு முறைகள் பல்வேறு உயிரியல் மாதிரிகளில் கரையக்கூடிய மறுசுழற்சி ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் கண்டறிய போதுமானது என்று நாங்கள் நம்புகிறோம்.
ELISA- அடிப்படையிலான mAb ஸ்கிரீனிங் முறைகள் பல்வேறு முறைகளால் சரிபார்க்கப்பட்டதால், இந்த புதிய அளவு முறையின் திறனை மேலும் ஆராய விரும்பினோம். இரண்டு வணிக ஒலிகோசாக்கரைடுகள், சைலோஹெக்ஸாசாக்கரைடு ஒலிகோசாக்கரைடு (XHE) மற்றும் 23-α-L-அராபினோஃபுரனோசில்-சைலோட்ரியோஸ் (A2XX) ஆகியவை செல் சுவர் கிளைக்கானை இலக்காகக் கொண்ட ஒரு புதிய mAb அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்தி வாங்கப்பட்டு சோதிக்கப்பட்டன. படம் 6, பயோடினைலேட்டட் பிணைப்பு சமிக்ஞைக்கும் ஒலிகோசாக்கரைடு செறிவின் பதிவு செறிவுக்கும் இடையே ஒரு நேரியல் தொடர்பைக் காட்டுகிறது, இது சாத்தியமான லாங்முயர் உறிஞ்சுதல் மாதிரியைக் குறிக்கிறது. mAbs இல், CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, மற்றும் CCRC-M151 ஆகியவை XHE உடன் தொடர்புடையவை, மற்றும் CCRC-M108, CCRC-M109, மற்றும் LM11 ஆகியவை 1 nm முதல் 100 நானோ வரம்பில் A2XX உடன் தொடர்புடையவை. பரிசோதனையின் போது ஆன்டிபாடிகளின் வரம்புக்குட்பட்ட கிடைக்கும் தன்மை காரணமாக, ஒவ்வொரு ஒலிகோசாக்கரைடு செறிவுடனும் வரையறுக்கப்பட்ட சோதனைகள் செய்யப்பட்டன. சில ஆன்டிபாடிகள் ஒரு அடி மூலக்கூறாக அதே ஒலிகோசாக்கரைடுக்கு மிகவும் வித்தியாசமாக வினைபுரிகின்றன என்பதை இங்கே கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும், ஏனெனில் அவை சற்று மாறுபட்ட எபிடோப்களுடன் பிணைக்கப்படுகின்றன மற்றும் மிகவும் மாறுபட்ட பிணைப்பு இணைப்புகளைக் கொண்டிருக்கலாம். புதிய mAb அணுகுமுறை உண்மையான மாதிரிகளுக்குப் பயன்படுத்தப்படும்போது துல்லியமான எபிடோப் அடையாளத்தின் வழிமுறைகள் மற்றும் தாக்கங்கள் மிகவும் சிக்கலானதாக இருக்கும்.
பல்வேறு கிளைக்கான்-இலக்கு mAbs இன் கண்டறிதல் வரம்பைத் தீர்மானிக்க இரண்டு வணிக ஒலிகோசாக்கரைடுகள் பயன்படுத்தப்பட்டன. இங்கே, ஒலிகோசாக்கரைடு செறிவின் பதிவு செறிவுடன் நேரியல் தொடர்புகள் (A) XHE க்கான mAb உடன் மற்றும் (B) A2XX க்கான mAb உடன் லாங்முயர் உறிஞ்சுதல் முறைகளைக் குறிக்கின்றன. தொடர்புடைய எபிடோப்கள் மதிப்பீட்டில் அடி மூலக்கூறுகளாகப் பயன்படுத்தப்படும் வணிக ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் கட்டமைப்புகளைக் குறிக்கின்றன.
கிளைக்கான்-இலக்கு வைக்கப்பட்ட மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகளின் பயன்பாடு (கிளைகோகோமிக் பகுப்பாய்வு அல்லது ELISA- அடிப்படையிலான mAb ஸ்கிரீனிங்) தாவர உயிரியலை உருவாக்கும் பெரும்பாலான முக்கிய செல் சுவர் கிளைக்கான்களின் ஆழமான குணாதிசயத்திற்கு ஒரு சக்திவாய்ந்த கருவியாகும். இருப்பினும், கிளாசிக்கல் கிளைக்கான் பகுப்பாய்வு பெரிய செல் சுவர் கிளைக்கான்களை மட்டுமே வகைப்படுத்துகிறது, ஏனெனில் பெரும்பாலான ஒலிகோசாக்கரைடுகள் ELISA தட்டுகளில் திறமையாக அசையாமல் உள்ளன. இந்த ஆய்வில், AFEX-முன்கூட்டியே சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட சோள அடுப்பு அதிக திடப்பொருட்களின் உள்ளடக்கத்தில் நொதி ரீதியாக ஹைட்ரோலைஸ் செய்யப்பட்டது. ஹைட்ரோலைசேட்டில் உள்ள மறுசுழற்சி செல் சுவர் கார்போஹைட்ரேட்டுகளின் கலவையை தீர்மானிக்க சர்க்கரை பகுப்பாய்வு பயன்படுத்தப்பட்டது. இருப்பினும், ஹைட்ரோலைசேட்டுகளில் உள்ள சிறிய ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் mAb பகுப்பாய்வு குறைத்து மதிப்பிடப்படுகிறது, மேலும் ELISA தட்டுகளில் ஒலிகோசாக்கரைடுகளை திறம்பட அசையாமல் இருக்க கூடுதல் கருவிகள் தேவைப்படுகின்றன.
நியூட்ராஅவிடின்™ பூசப்பட்ட தட்டுகளில் ஒலிகோசாக்கரைடு பயோடினைலேஷனையும் அதைத் தொடர்ந்து ELISA ஸ்கிரீனிங்கையும் இணைப்பதன் மூலம் mAb ஸ்கிரீனிங்கிற்கான ஒரு புதுமையான மற்றும் திறமையான ஒலிகோசாக்கரைடு அசையாமை முறையை நாங்கள் இங்கு புகாரளிக்கிறோம். அசையாத பயோடினைலேட்டட் ஒலிகோசாக்கரைடுகள், மறுகால்சிட்ரான்ட் ஒலிகோசாக்கரைடுகளை விரைவாகவும் திறமையாகவும் கண்டறிவதை செயல்படுத்த ஆன்டிபாடிக்கு போதுமான ஈடுபாட்டைக் காட்டின. மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரியை அடிப்படையாகக் கொண்ட இந்த பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் கலவையின் பகுப்பாய்வு, இம்யூனோஸ்கிரீனிங்கிற்கான இந்த புதிய அணுகுமுறையின் முடிவுகளை உறுதிப்படுத்தியது. எனவே, இந்த ஆய்வுகள், கிளைக்கான்-இலக்கு மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகளுடன் ஒலிகோசாக்கரைடு பயோடினைலேஷனையும் ELISA ஸ்கிரீனிங்கையும் இணைப்பது ஒலிகோசாக்கரைடுகளில் குறுக்கு இணைப்புகளைக் கண்டறியப் பயன்படுத்தப்படலாம் என்பதையும், ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் கட்டமைப்பை வகைப்படுத்தும் பிற உயிர்வேதியியல் ஆய்வுகளில் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படலாம் என்பதையும் நிரூபிக்கின்றன.
இந்த பயோட்டின் அடிப்படையிலான கிளைக்கான் விவரக்குறிப்பு முறை, தாவர உயிரியலில் கரையக்கூடிய ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் மறுசுழற்சி கார்போஹைட்ரேட் பிணைப்புகளை ஆராயும் திறன் கொண்ட முதல் அறிக்கையாகும். உயிரி எரிபொருள் உற்பத்தியைப் பொறுத்தவரை உயிரியலின் சில பகுதிகள் ஏன் மிகவும் பிடிவாதமாக இருக்கின்றன என்பதைப் புரிந்துகொள்ள இது உதவுகிறது. இந்த முறை கிளைகோம் பகுப்பாய்வு முறைகளில் ஒரு முக்கியமான இடைவெளியை நிரப்புகிறது மற்றும் தாவர ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கு அப்பால் பரந்த அளவிலான அடி மூலக்கூறுகளுக்கு அதன் பயன்பாட்டை விரிவுபடுத்துகிறது. எதிர்காலத்தில், பயோடினைலேஷனுக்கு ரோபாட்டிக்ஸ் பயன்படுத்தலாம் மற்றும் ELISA ஐப் பயன்படுத்தி மாதிரிகளின் உயர்-செயல்திறன் பகுப்பாய்விற்கு நாங்கள் உருவாக்கிய முறையைப் பயன்படுத்தலாம்.
பயனியர் 33A14 கலப்பின விதைகளிலிருந்து வளர்க்கப்பட்ட சோள வைக்கோல் (CS) 2010 ஆம் ஆண்டு ரே, கொலராடோவில் உள்ள கிராமர் பண்ணைகளிலிருந்து அறுவடை செய்யப்பட்டது. நில உரிமையாளரின் அனுமதியுடன், இந்த உயிரித் தாவரத்தை ஆராய்ச்சிக்குப் பயன்படுத்தலாம். மாதிரிகள் அறை வெப்பநிலையில் ஜிப்-லாக் பைகளில் 6% ஈரப்பதத்திற்குக் கீழே உலர்ந்த நிலையில் சேமிக்கப்பட்டன. மாதிரிகள் அறை வெப்பநிலையில் ஜிப்-லாக் பைகளில் 6% ஈரப்பதத்திற்குக் கீழே உலர்ந்த நிலையில் சேமிக்கப்பட்டன. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежkoy-молнией при комнатной темпер. மாதிரிகள் அறை வெப்பநிலையில் ஜிப்பர் செய்யப்பட்ட பைகளில் <6% ஈரப்பதத்தில் உலர்ந்த நிலையில் சேமிக்கப்பட்டன.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежkoy-Molniey pri comnatnoy temperaturre s влажностью < 6%. மாதிரிகள் அறை வெப்பநிலையில் ஈரப்பதம் < 6% உடன் ஜிப்பர் பைகளில் சேமிக்கப்படும்.இந்த ஆய்வு உள்ளூர் மற்றும் தேசிய வழிகாட்டுதல்களுக்கு இணங்கியது. NREL நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி கலவை பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. கலவையில் 31.4% குளுக்கன், 18.7% சைலான், 3.3% அராபினன், 1.2% கேலக்டன், 2.2% அசிடைல், 14.3% லிக்னின், 1.7% புரதம் மற்றும் 13. 4% சாம்பல் இருப்பது கண்டறியப்பட்டது.
செல்லிக்® CTec2 (138 மி.கி புரதம்/மி.லி, லாட் VCNI 0001) என்பது நோவோசைம்களிலிருந்து (ஃபிராங்க்ளிண்டன், NC, USA) செல்லுலேஸ், β-குளுக்கோசிடேஸ் மற்றும் செல்லிக்® HTec2 (157 மி.கி புரதம்/மி.லி, லாட் VHN00001) ஆகியவற்றின் சிக்கலான கலவையாகும். பெக்டினை சிதைக்கும் என்சைம்களின் சிக்கலான கலவையான மல்டிஃபெக்ட் பெக்டினேஸ்® (72 மி.கி புரதம்/மி.லி), டுபாண்ட் இண்டஸ்ட்ரியல் பயோசயின்சஸ் (பாலோ ஆல்டோ, CA, USA) நன்கொடையாக வழங்கியது. கெல்டால் நைட்ரஜன் பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி புரத உள்ளடக்கத்தை மதிப்பிடுவதன் மூலம் (மற்றும் புரதம் அல்லாத நைட்ரஜனின் பங்களிப்பைக் கழிப்பதன் மூலம்) என்சைம் புரத செறிவுகள் தீர்மானிக்கப்பட்டன (AOAC முறை 2001.11, டெய்ரி ஒன் கூட்டுறவு இன்க்., இத்தாக்கா, NY, USA). டயட்டோமேசியஸ் எர்த் 545 EMD மில்லிபோரிடமிருந்து (பில்லெரிகா, MA) வாங்கப்பட்டது. செயல்படுத்தப்பட்ட கார்பன் (டார்கோ, 100 மெஷ் துகள்கள்), அவிசெல் (PH-101), பீச் சைலான் மற்றும் பிற அனைத்து இரசாயனங்களும் சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்சிலிருந்து (செயின்ட் லூயிஸ், MO) வாங்கப்பட்டன.
AFEX முன் சிகிச்சை GLBRC (பயோமாஸ் கன்வெர்ஷன் ரிசர்ச் லேபரட்டரி, MSU, லான்சிங், MI, USA) இல் செய்யப்பட்டது. முன் சிகிச்சை 140°C இல் 15 நிமிடங்களுக்கு மேற்கொள்ளப்பட்டது. 46 தங்கும் நேரம் 1:1 விகிதத்தில் நீரற்ற அம்மோனியா மற்றும் உயிரியக்கவியல் 60% (w/w) துருப்பிடிக்காத எஃகு பெஞ்ச்டாப் தொகுதி உலையில் (Parr Instruments Company) ஏற்றப்படுகிறது. இது 30 நிமிடங்கள் எடுத்தது. உலை 140°C க்கு கொண்டு வரப்பட்டது மற்றும் அம்மோனியா விரைவாக வெளியிடப்பட்டது, இதனால் உயிரியக்கம் விரைவாக அறை வெப்பநிலைக்குத் திரும்ப அனுமதித்தது. AFEX முன் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட சோள அடுப்பின் (ACS) கலவை சிகிச்சை அளிக்கப்படாத சோள அடுப்பின் (UT-CS) கலவைக்கு ஒத்ததாக இருந்தது.
ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் பெரிய அளவிலான உற்பத்திக்கான தொடக்கப் பொருளாக உயர் திடப்பொருள் ACSH 25% (w/w) (தோராயமாக 8% டெக்ஸ்ட்ரான் ஏற்றுதல்) தயாரிக்கப்பட்டது. ACS இன் நொதி நீராற்பகுப்பு, Cellic® Ctec2 10 mg புரதம்/g குளுக்கன் (முன் சிகிச்சை செய்யப்பட்ட உயிரியலில்), Htec2 (நோவோசைம்கள், பிராங்க்ளின்டன், NC), 5 mg புரதம்/g குளுக்கன் மற்றும் மல்டிஃபெக்ட் பெக்டினேஸ் (ஜெனென்கோர் இன்க், அமெரிக்கா) உள்ளிட்ட வணிக நொதி கலவையைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது. ), 5 mg புரதம்/g டெக்ஸ்ட்ரான். 3 லிட்டர், pH 4.8, 50°C மற்றும் 250 rpm வேலை செய்யும் அளவு கொண்ட 5-லிட்டர் உயிரியக்கக் கருவியில் நொதி நீராற்பகுப்பு மேற்கொள்ளப்பட்டது. 96 மணி நேரம் நீராற்பகுப்பு செய்த பிறகு, ஹைட்ரோலைசேட் 6000 rpm இல் 30 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு மூலம் சேகரிக்கப்பட்டு, பின்னர் 14000 rpm இல் 30 நிமிடங்களுக்கு நீராற்பகுப்பு செய்யப்படாத திடப்பொருட்களை நீக்கப்பட்டது. பின்னர் ஹைட்ரோலைசேட் 0.22 மிமீ வடிகட்டி பீக்கர் மூலம் மலட்டு வடிகட்டலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டது. வடிகட்டப்பட்ட ஹைட்ரோலைசேட் 4° செல்சியஸில் மலட்டு பாட்டில்களில் சேமிக்கப்பட்டு பின்னர் கார்பனில் பின்னமாக்கப்பட்டது.
NREL ஆய்வக பகுப்பாய்வு நடைமுறைகளின்படி சாறு அடிப்படையிலான உயிரி மாதிரிகளின் கலவையின் பகுப்பாய்வு: கலவை பகுப்பாய்விற்கான மாதிரிகளைத் தயாரித்தல் (NREL/TP-510-42620) மற்றும் உயிரித் தொகுதியில் கட்டமைப்பு கார்போஹைட்ரேட்டுகள் மற்றும் லிக்னின் ஆகியவற்றை தீர்மானித்தல் (NREL/TP-510 – 42618)47.
ஆட்டோகிளேவ் அடிப்படையிலான அமில நீராற்பகுப்பு முறையைப் பயன்படுத்தி 2 மில்லி அளவில் ஹைட்ரோலைசேட் நீரோட்டத்தின் ஒலிகோசாக்கரைடு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. 10 மில்லி திருகு மூடி வளர்ப்பு குழாயில் 69.7 µl 72% சல்பூரிக் அமிலத்துடன் ஹைட்ரோலைசேட் மாதிரியைக் கலந்து, 121 °C வெப்பநிலையில் ஒரு பெஞ்ச்டாப்பில் 1 மணிநேரம் அடைகாத்து, பனியில் குளிர்வித்து, உயர் செயல்திறன் கொண்ட திரவ குரோமடோகிராபி (HPLC) குப்பியில் வடிகட்டி வைக்கவும். அமில-ஹைட்ரோலைஸ் செய்யப்பட்ட மாதிரியில் உள்ள மொத்த சர்க்கரை செறிவிலிருந்து ஹைட்ரோலைஸ் செய்யப்படாத மாதிரியில் உள்ள மோனோசாக்கரைடுகளின் செறிவைக் கழிப்பதன் மூலம் ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் செறிவு தீர்மானிக்கப்பட்டது.
அமில நீராற்பகுப்பு செய்யப்பட்ட உயிரியலில் உள்ள குளுக்கோஸ், சைலோஸ் மற்றும் அராபினோஸ் செறிவுகள், பயோ-ராட் அமினெக்ஸ் HPX-87H நெடுவரிசையில் ஆட்டோசாம்ப்ளர், நெடுவரிசை ஹீட்டர், ஐசோக்ராடிக் பம்ப் மற்றும் ஒளிவிலகல் குறியீட்டு கண்டறிதல் ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஷிமாட்ஸு HPLC அமைப்பைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. நெடுவரிசை 50°C இல் பராமரிக்கப்பட்டு, 0.6 மிலி/நிமிடம் 5 மி.மீ. H2SO4 நீர் ஓட்டத்தில் நீக்கப்பட்டது.
ஹைட்ரோலைசேட் சூப்பர்நேட்டண்ட் நீர்த்தப்பட்டு மோனோமர் மற்றும் ஒலிகோசாக்கரைடு உள்ளடக்கத்திற்காக பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. நொதி நீராற்பகுப்புக்குப் பிறகு பெறப்பட்ட மோனோமெரிக் சர்க்கரைகள், பயோ-ராட் (ஹெர்குலஸ், CA) அமினெக்ஸ் HPX-87P நெடுவரிசை மற்றும் ஒரு சாம்பல் பாதுகாப்பு நெடுவரிசையுடன் பொருத்தப்பட்ட HPLC ஆல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. நெடுவரிசை வெப்பநிலை 80°C இல் பராமரிக்கப்பட்டது, நீர் 0.6 மிலி/நிமிட ஓட்ட விகிதத்துடன் மொபைல் கட்டமாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது. குறிப்புகள் 41, 48, 49 இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ள முறைகளின்படி 121°C இல் நீர்த்த அமிலத்தில் நீராற்பகுப்பு மூலம் ஒலிகோசாக்கரைடுகள் தீர்மானிக்கப்பட்டன.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட நடைமுறைகள் 27, 43, 50, 51 ஐப் பயன்படுத்தி, மூல, AFEX முன்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மற்றும் அனைத்து நீராற்பகுப்பு செய்யப்படாத உயிரி எச்சங்களிலும் (தொடர் செல் சுவர் சாறுகளின் உற்பத்தி மற்றும் அவற்றின் mAb திரையிடல் உட்பட) சாக்கரைடு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. கிளைகோம் பகுப்பாய்விற்கு, தாவர செல் சுவர் பொருளின் ஆல்கஹால்-கரையாத எச்சங்கள் உயிரி எச்சங்களிலிருந்து தயாரிக்கப்பட்டு, அம்மோனியம் ஆக்சலேட் (50 mM), சோடியம் கார்பனேட் (50 mM மற்றும் 0.5% w/v), CON. (1M மற்றும் 4M, இரண்டும் 1% w/v சோடியம் போரோஹைட்ரைடுடன்) மற்றும் முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி அமில குளோரைட் போன்ற அதிகரித்து வரும் ஆக்கிரமிப்பு வினைப்பொருட்களுடன் தொடர் பிரித்தெடுப்புக்கு உட்படுத்தப்படுகின்றன. பின்னர் சாறுகள் செல் சுவர் கிளைக்கானுக்கு இயக்கப்பட்ட mAb50களின் சிக்கலான பேனலுக்கு எதிராக ELISA க்கு உட்படுத்தப்பட்டன, மேலும் mAb பிணைப்பு எதிர்வினைகள் வெப்ப வரைபடமாக வழங்கப்பட்டன. தாவர செல் சுவர் கிளைக்கானை இலக்காகக் கொண்ட mAbs ஆய்வக பங்குகளிலிருந்து (CCRC, JIM மற்றும் MAC தொடர்) வாங்கப்பட்டன.
ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் ஒரு-படி பயோடினைலேஷன். பயோட்டின்-LC-ஹைட்ராசைடுடன் கார்போஹைட்ரேட்டுகளின் இணைவு பின்வரும் செயல்முறையைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது. பயோட்டின்-LC-ஹைட்ராசைடு (4.6 மி.கி/12 μmol) டைமெத்தில் சல்பாக்சைடில் (DMSO, 70 μl) 65° C வெப்பநிலையில் 1 நிமிடம் தீவிரமாகக் கிளறி சூடாக்குவதன் மூலம் கரைக்கப்பட்டது. பனிப்பாறை அசிட்டிக் அமிலம் (30 µl) சேர்க்கப்பட்டு, கலவை சோடியம் சயனோபோரோஹைட்ரைடு (6.4 மி.கி/100 µmol) மீது ஊற்றப்பட்டு, 65° C வெப்பநிலையில் சுமார் 1 நிமிடம் சூடாக்கிய பிறகு முழுமையாகக் கரைக்கப்பட்டது. பின்னர், எதிர்வினை கலவையின் 5 முதல் 8 μl வரை உலர்ந்த ஒலிகோசாக்கரைடுடன் (1-100 nmol) சேர்க்கப்பட்டு, குறைக்கும் முனையில் 10 மடங்கு அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட மோலார் அதிகப்படியான லேபிளைப் பெறப்பட்டது. எதிர்வினை 65°C இல் 2 மணிநேரம் மேற்கொள்ளப்பட்டது, அதன் பிறகு மாதிரிகள் உடனடியாக சுத்திகரிக்கப்பட்டன. குறைப்பு இல்லாமல் லேபிளிங் சோதனைகளில் சோடியம் சயனோபோரோஹைட்ரைடு பயன்படுத்தப்படவில்லை, மேலும் மாதிரிகள் 65° செல்சியஸில் 2.5 மணி நேரம் வினைபுரிந்தன.
பயோடினைலேட்டட் ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் மாதிரிகளை ELISA பூச்சு மற்றும் கழுவுதல். அவிடின்-பூசப்பட்ட தட்டின் ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 25 μl பயோடினைலேட்டட் மாதிரிகள் (0.1 M டிரிஸ் பஃபர் கரைசலில் (TBS) 5 மில்லி நீர்த்த ஒவ்வொரு செறிவூட்டப்பட்ட மாதிரியின் 100 μl) சேர்க்கப்பட்டன. கட்டுப்பாட்டு கிணறுகள் 0.1 M TBS இல் 10 μg/ml செறிவில் 50 μl பயோட்டினுடன் பூசப்பட்டன. வெற்று அளவீடுகளுக்கு ஒரு பூச்சாக டீயோனைஸ் செய்யப்பட்ட நீர் பயன்படுத்தப்பட்டது. மாத்திரை இருட்டில் அறை வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. கிரெனியர் பிளாட் 3A க்கான நிரல் எண் 11 ஐப் பயன்படுத்தி 0.1 M TBS இல் 0.1% கொழுப்பு நீக்கப்பட்ட பாலுடன் தட்டை 3 முறை கழுவவும்.
முதன்மை ஆன்டிபாடிகளைச் சேர்த்தல் மற்றும் கழுவுதல். ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 40 µl முதன்மை ஆன்டிபாடியைச் சேர்க்கவும். இருட்டில் அறை வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் மைக்ரோபிளேட்டை அடைகாக்கவும். பின்னர் கிரெனியர் பிளாட் 3A க்கான கழுவும் நிரல் #11 ஐப் பயன்படுத்தி தட்டுகள் 0.1M TBS இல் 0.1% பாலுடன் 3 முறை கழுவப்பட்டன.
இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியைச் சேர்த்து கழுவவும். ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 50 µl எலி/எலி இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியைச் சேர்க்கவும் (0.1 M TBS இல் 0.1% பாலில் 1:5000 நீர்த்தப்பட்டது). இருட்டில் அறை வெப்பநிலையில் மைக்ரோபிளேட்டை 1 மணி நேரம் அடைகாக்கவும். பின்னர் கிரெனியர் பிளாட் 5A தட்டு கழுவும் திட்டம் #12 ஐப் பயன்படுத்தி மைக்ரோபிளேட்டுகள் 0.1 M TBS இல் 0.1% பாலுடன் 5 முறை கழுவப்பட்டன.
ஒரு அடி மூலக்கூறைச் சேர்த்தல். 3,3′,5,5′-டெட்ராமெதில்பென்சிடைன் (TMB) இன் 50 µl ஐ அடிப்படை அடி மூலக்கூறில் சேர்க்கவும் (15 மில்லி அயனியாக்கம் செய்யப்பட்ட தண்ணீரில் 2 சொட்டு பஃபர், 3 சொட்டு TMB, 2 சொட்டு ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு ஆகியவற்றைச் சேர்ப்பதன் மூலம்). TMB அடி மூலக்கூறைத் தயாரித்து, பயன்படுத்துவதற்கு முன் சுழல் செய்யவும்). மைக்ரோபிளேட்டை அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும். இருட்டில்.
படியை முடித்து மாத்திரையைப் படியுங்கள். ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 50 µl 1 N சல்பூரிக் அமிலத்தைச் சேர்த்து, ELISA ரீடரைப் பயன்படுத்தி 450 முதல் 655 nm வரையிலான உறிஞ்சுதலைப் பதிவு செய்யவும்.
அயனியாக்கம் செய்யப்பட்ட நீரில் இந்த அனலைட்டுகளின் 1 மி.கி/மி.லி கரைசல்களைத் தயாரிக்கவும்: அராபினோஸ், ராம்னோஸ், ஃபுகோஸ், சைலோஸ், கேலக்டூரோனிக் அமிலம் (GalA), குளுகுரோனிக் அமிலம் (GlcA), மேனோஸ், குளுக்கோஸ், கேலக்டோஸ், லாக்டோஸ், N-அசிடைல்மன்னோசமைன் (manNAc), N-அசிடைல்குளுகோசமைன். (glcNAc), N-அசிடைல்கலக்டோசமைன் (galNAc), இனோசிட்டால் (உள் தரநிலை). அட்டவணை 1 இல் காட்டப்பட்டுள்ள 1 மி.கி/மி.லி சர்க்கரை கரைசல்களைச் சேர்ப்பதன் மூலம் இரண்டு தரநிலைகள் தயாரிக்கப்பட்டன. மாதிரிகள் உறைந்து -80° செல்சியஸில் அனைத்து நீரும் அகற்றப்படும் வரை (பொதுவாக சுமார் 12-18 மணி நேரம்) லியோபிலிஸ் செய்யப்படுகின்றன.
ஒரு பகுப்பாய்வு சமநிலையில் திருகு மூடி குழாய்களில் 100–500 µg மாதிரியைச் சேர்க்கவும். சேர்க்கப்பட்ட அளவைப் பதிவு செய்யவும். மாதிரியை ஒரு குறிப்பிட்ட கரைப்பான் செறிவுள்ள கரைசலில் கரைத்து, அதை ஒரு திரவ அலிகோட்டாக குழாயில் சேர்ப்பது சிறந்தது. ஒவ்வொரு மாதிரி குழாயிலும் 20 µl 1 மி.கி/மி.லி இனோசிட்டால் உள் தரநிலையாகப் பயன்படுத்தவும். மாதிரியில் சேர்க்கப்படும் உள் தரநிலையின் அளவு நிலையான குழாயில் சேர்க்கப்படும் உள் தரநிலையின் அளவிற்கு சமமாக இருக்க வேண்டும்.
ஒரு திருகு மூடி குப்பியில் 8 மில்லி நீரற்ற மெத்தனாலைச் சேர்க்கவும். பின்னர் 4 மில்லி 3 N. மெத்தனாலிக் HCl கரைசலை மூடி குலுக்கவும். இந்த செயல்முறை தண்ணீரைப் பயன்படுத்துவதில்லை.
ஒலிகோசாக்கரைடு மாதிரிகள் மற்றும் நிலையான TMS குழாய்களில் 500 µl 1 M HCl மெத்தனால் கரைசலைச் சேர்க்கவும். மாதிரிகள் ஒரு வெப்பத் தொகுதியில் 80° C வெப்பநிலையில் இரவு முழுவதும் (168 மணிநேரம்) அடைகாக்கப்பட்டன. மெத்தனாலிசிஸ் தயாரிப்பை அறை வெப்பநிலையில் உலர்த்தும் மேனிஃபோல்டைப் பயன்படுத்தி உலர்த்தவும். 200 µl MeOH ஐச் சேர்த்து மீண்டும் உலர்த்தவும். இந்த செயல்முறை இரண்டு முறை மீண்டும் செய்யப்படுகிறது. மாதிரியில் 200 µl மெத்தனால், 100 µl பைரிடின் மற்றும் 100 µl அசிட்டிக் அன்ஹைட்ரைடைச் சேர்த்து நன்கு கலக்கவும். மாதிரிகள் அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டு உலர்த்தப்பட்டன. 200 µl மெத்தனால் சேர்த்து மீண்டும் உலர்த்தவும்.
200 µl ட்ரை-சில் சேர்த்து 20 நிமிடங்கள் சூடாக்கி மூடிய குழாயை 80°C வெப்பநிலையில் சூடாக்கி, பின்னர் அறை வெப்பநிலைக்கு குளிர்விக்கவும். மாதிரியை சுமார் 50 µl அளவிற்கு உலர்த்த ஒரு உலர்த்தும் மேனிஃபோல்டைப் பயன்படுத்தவும். மாதிரிகள் முழுமையாக உலர நாங்கள் அனுமதிக்கவில்லை என்பதை கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும்.
2 மில்லி ஹெக்ஸேன் சேர்த்து சுழல் மூலம் நன்கு கலக்கவும். 5-3/4 அங்குல விட்டம் கொண்ட பைப்பெட்டின் மேல் கண்ணாடி கம்பளியைச் செருகுவதன் மூலம் பாஸ்டர் பைப்பெட்டுகளின் (5-8 மிமீ) நுனிகளை கண்ணாடி கம்பளித் துண்டால் நிரப்பவும். மாதிரிகள் 3000 கிராம் அளவில் 2 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு செய்யப்பட்டன. கரையாத எச்சங்கள் வீழ்படிவாக்கப்படுகின்றன. மாதிரியை 100-150 µl ஆக உலர்த்தவும். 80 °C ஆரம்ப வெப்பநிலையிலும் 2.0 நிமிட ஆரம்ப நேரத்திலும் (அட்டவணை 2) தோராயமாக 1 μl அளவு GC-MS இல் செலுத்தப்பட்டது.