Nature.comని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు.మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ సంస్కరణ CSSకి పరిమిత మద్దతును కలిగి ఉంది.ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ని (లేదా Internet Explorerలో అనుకూలత మోడ్‌ని ఆఫ్ చేయండి)ని ఉపయోగించాలని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈలోపు, నిరంతర మద్దతుని నిర్ధారించడానికి, మేము స్టైల్స్ మరియు JavaScript లేకుండా సైట్‌ని ప్రదర్శిస్తాము.
హ్యూమన్ గట్ మోర్ఫోజెనిసిస్ 3D ఎపిథీలియల్ మైక్రోఆర్కిటెక్చర్ మరియు స్పేషియల్ ఆర్గనైజేషన్ యొక్క క్రిప్ట్-విల్లస్ లక్షణాలను ఏర్పరుస్తుంది. బేసల్ క్రిప్ట్‌లోని స్టెమ్ సెల్ సముచితాన్ని ఎక్సోజనస్ మైక్రోబియల్ యాంటిజెన్‌లు మరియు వాటి మెటాబోలైట్‌ల నుండి రక్షించడం ద్వారా గట్ హోమియోస్టాసిస్‌ను నిర్వహించడానికి ఈ ప్రత్యేకమైన నిర్మాణం అవసరం. శ్లేష్మ ఉపరితలం. అందువల్ల, ఇన్ విట్రో గట్ నమూనాల నిర్మాణానికి 3D ఎపిథీలియల్ నిర్మాణాలను పునఃసృష్టి చేయడం చాలా కీలకం. ముఖ్యంగా, ఆర్గానిక్ మైమెటిక్ గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ పేగు ఎపిథీలియం యొక్క ఆకస్మిక 3D మోర్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది. మైక్రోఫ్లూయిడ్ చిప్‌లో అలాగే ట్రాన్స్‌వెల్ ఎంబెడెడ్ హైబ్రిడ్ చిప్‌లో గట్‌లో టినాల్ మోర్ఫోజెనిసిస్. మేము పరికర తయారీ, కాకో-2 లేదా పేగు ఆర్గానోయిడ్ ఎపిథీలియల్ కణాలను సంప్రదాయ సెట్టింగులలో సంస్కృతి చేయడం, అలాగే మైక్రోఫ్లూయిడ్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లో ఎపిథీలియల్ సెల్‌ల గురించి వివరణాత్మక పద్ధతులను వివరిస్తాము. ప్రోటోకాల్ 5 d వరకు బాసోలేటరల్ ఫ్లూయిడ్ ప్రవాహాన్ని నియంత్రించడం ద్వారా ఫంక్షనల్ గట్ మైక్రోఆర్కిటెక్చర్ యొక్క పునరుత్పత్తిని సాధిస్తుంది. మా ఇన్ విట్రో మోర్ఫోజెనిసిస్ పద్ధతి శారీరకంగా సంబంధిత కోత ఒత్తిడి మరియు యాంత్రిక చలనాన్ని ఉపయోగిస్తుంది మరియు సంక్లిష్టమైన సెల్ ఇంజనీరింగ్ లేదా మానిప్యులేషన్ అవసరం లేదు, ఇది ఇప్పటికే ఉన్న ఇతర ఇతర పద్ధతులను అధిగమిస్తుందని మేము ఊహించాము. బయోమెడికల్, క్లినికల్ మరియు ఫార్మాస్యూటికల్ అప్లికేషన్‌ల కోసం ఎపిథీలియల్ లేయర్స్ ఇన్ విట్రో.
గట్-ఆన్-ఎ-చిప్1,2,3,4,5 లేదా బిలేయర్ మైక్రోఫ్లూయిడ్ పరికరాలు6,7లో కల్చర్ చేయబడిన పేగు ఎపిథీలియల్ కాకో-2 కణాలు అంతర్లీనంగా ఉన్న మెకానిజంపై స్పష్టమైన అవగాహన లేకుండా విట్రోలో ఆకస్మిక 3D మోర్ఫోజెనిసిస్‌కు గురవుతాయని ప్రయోగాలు చూపిస్తున్నాయి. డ్యూస్ 3D ఎపిథీలియల్ మోర్ఫోజెనిసిస్ ఇన్ విట్రో, ఇది కాకో-2 మరియు పేషెంట్-డెరైవ్డ్ పేగు ఆర్గానాయిడ్స్ ద్వారా ప్రదర్శించబడింది.ఎపిథీలియల్ కణాలు ధృవీకరించబడ్డాయి.ఈ అధ్యయనంలో, మేము ప్రత్యేకంగా "హైబ్రిడ్ చిప్" అని పిలువబడే ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లను కలిగి ఉన్న గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ మరియు సవరించిన మైక్రోఫ్లూయిడ్ పరికరాలలో శక్తివంతమైన Wnt విరోధి, Dickkopf-1 (DKK-1) యొక్క సెల్ ఉత్పత్తి మరియు ఏకాగ్రత పంపిణీపై ప్రత్యేకంగా దృష్టి సారించాము. 1, స్రవించే ఫ్రిజ్డ్-సంబంధిత ప్రోటీన్ 1, లేదా సోగ్గి-1) ఆన్-చిప్ గట్‌కు మోర్ఫోజెనిసిస్‌ను నిరోధిస్తుంది లేదా ముందస్తుగా రూపొందించబడిన 3D ఎపిథీలియల్ పొరను అంతరాయం కలిగిస్తుంది, సంస్కృతి సమయంలో విరోధి ఒత్తిడి పేగు స్వరూపానికి కారణమని సూచిస్తుంది. యాక్టివ్ ఫ్లషింగ్ (ఉదా., గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ లేదా హైబ్రిడ్-ఆన్-ఎ-చిప్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లలో) లేదా డిఫ్యూజన్ .బాసోలేటరల్ మీడియా (ఉదా, ట్రాన్స్‌వెల్ నుండి పెద్ద బాసోలేటరల్ రిజర్వాయర్‌లలోకి ఇన్సర్ట్ చేయడం) ద్వారా బాసోలేటరల్ కంపార్ట్‌మెంట్‌లోని Wnt విరోధుల స్థాయిలను నిర్వహించండి.
ఈ ప్రోటోకాల్‌లో, మేము పాలీడిమెథైల్‌సిలోక్సేన్ (PDMS) ఆధారిత పోరస్ పొరలపై (6A, 7A, 9A మెంబ్రాన్‌ల ట్రాన్స్‌ట్రాన్స్‌లో పాలీవెల్‌లస్ట్ స్టెప్స్) పేగు ఎపిథీలియల్ కణాలను కల్చర్ చేయడానికి గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ మైక్రోడివైస్‌లు మరియు ట్రాన్స్‌వెల్-ఇన్సర్టబుల్ హైబ్రిడ్ చిప్‌లను (దశలు 1-5) రూపొందించడానికి ఒక వివరణాత్మక పద్ధతిని అందిస్తాము. s 6B, 7B, 8, 9) మరియు ప్రేరేపిత 3D మోర్ఫోజెనిసిస్ ఇన్ విట్రో (స్టెప్ 10).మేము బహుళ ఇమేజింగ్ పద్ధతులను వర్తింపజేయడం ద్వారా కణజాల-నిర్దిష్ట హిస్టోజెనిసిస్ మరియు వంశ-ఆధారిత సెల్యులార్ డిఫరెన్సియేషన్‌ను సూచించే సెల్యులార్ మరియు మాలిక్యులర్ లక్షణాలను కూడా గుర్తించాము (దశలు 11-24 మానవ కణాలను ఉపయోగించి ఎపిసోజెనిస్ ఇన్‌డ్యూస్ 2. ఆల్ ఆర్గానాయిడ్స్, పోరస్ పొరల ఉపరితల మార్పు, 2డి మోనోలేయర్‌ల సృష్టి, మరియు బయోమెకానికల్ మైక్రో ఎన్విరాన్‌మెంట్ యొక్క పేగు జీవరసాయన మరియు పునరుత్పత్తి వంటి సాంకేతిక వివరాలతో కూడిన రెండు కల్చర్ ఫార్మాట్‌లలో. సంస్కృతి యొక్క కంపార్ట్మెంట్.చివరిగా, మేము మోర్ఫోజెన్-ఆధారిత ఎపిథీలియల్ పెరుగుదల, రేఖాంశ హోస్ట్-మైక్రోబయోమ్ సహ-సంస్కృతులు, వ్యాధికారక ఇన్ఫెక్షన్, ఇన్ఫ్లమేటరీ గాయం, ఎపిథీలియల్ అవరోధం పనిచేయకపోవడం మరియు ప్రోబయోటిక్ ఆధారిత చికిత్సలను మోడల్ చేయడానికి ఉపయోగించగల పునరుత్పాదక 3D ఎపిథీలియల్ లేయర్ యొక్క వినియోగాన్ని సూచిస్తాము.
మా ప్రోటోకాల్ ప్రాథమిక (ఉదా, పేగు మ్యూకోసల్ బయాలజీ, స్టెమ్ సెల్ బయాలజీ మరియు డెవలప్‌మెంటల్ బయాలజీ) మరియు అనువర్తిత పరిశోధన (ఉదా., ప్రిలినికల్ డ్రగ్ టెస్టింగ్, డిసీజ్ మోడలింగ్, టిష్యూ ఇంజనీరింగ్ మరియు గ్యాస్ట్రోఎంటరాలజీ) విస్తృత శ్రేణి శాస్త్రవేత్తలకు ఉపయోగకరంగా ఉండవచ్చు. పేగు అభివృద్ధి, పునరుత్పత్తి లేదా హోమియోస్టాసిస్ సమయంలో సెల్ సిగ్నలింగ్ యొక్క డైనమిక్స్‌ను అధ్యయనం చేసే ప్రేక్షకులకు మా సాంకేతిక వ్యూహాన్ని వ్యాప్తి చేయవచ్చు .అంతేకాకుండా, నోరోవైరస్ 8, తీవ్రమైన అక్యూట్ రెస్పిరేటరీ సిండ్రోమ్ కొరోనావైరస్ 2 (SARS-9) వంటి వివిధ ఇన్ఫెక్షియస్ ఏజెంట్ల కింద సంక్రమణను ప్రశ్నించడానికి మా ప్రోటోకాల్ ఉపయోగపడుతుంది. బ్రియో కలరా.వ్యాధి పాథాలజీ మరియు పాథోజెనిసిస్ యొక్క ప్రేక్షకులు కూడా ఉపయోగకరంగా ఉంటారు. ఆన్-చిప్ గట్ మైక్రోఫిజియాలజీ సిస్టమ్ యొక్క ఉపయోగం రేఖాంశ సహ-సంస్కృతి 10 మరియు జీర్ణశయాంతర (GI) ట్రాక్ట్‌లో హోస్ట్ డిఫెన్స్, రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలు మరియు వ్యాధికారక-సంబంధిత గాయం మరమ్మత్తు 11 యొక్క తదుపరి అంచనాను అనుమతించవచ్చు . రోగి యొక్క 3D పేగు ఎపిథీలియల్ పొరలను ఉపయోగించి 3D పేగు ఎపిథీలియల్ పొరలను తయారు చేసినప్పుడు పెద్దప్రేగు శోథ, పౌచిటిస్ లేదా ప్రకోప ప్రేగు సిండ్రోమ్‌ను అనుకరించవచ్చు, ఈ వ్యాధులలో విల్లస్ అట్రోఫీ, క్రిప్ట్ షార్ట్నింగ్, మ్యూకోసల్ డ్యామేజ్ లేదా బలహీనమైన ఎపిథీలియల్ అవరోధం. వ్యాధి వాతావరణం యొక్క అధిక సంక్లిష్టత, పాఠకులు 3D పేగు విల్లస్-క్రిప్ట్ మైక్రోఆర్కిటెక్చర్‌లను కలిగి ఉన్న మోడళ్లకు రోగి పెరిఫెరల్ బ్లడ్ మోనోన్యూక్లియర్ సెల్స్ (PBMCలు) వంటి వ్యాధి-సంబంధిత కణాల రకాలను జోడించడాన్ని పరిగణించవచ్చు.కణజాల-నిర్దిష్ట రోగనిరోధక కణాలు, 5.
విభజన ప్రక్రియ లేకుండానే 3D ఎపిథీలియల్ మైక్రోస్ట్రక్చర్‌ని పరిష్కరించవచ్చు మరియు దృశ్యమానం చేయవచ్చు కాబట్టి, స్పేషియల్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్స్ మరియు హై-రిజల్యూషన్ లేదా సూపర్-రిజల్యూషన్ ఇమేజింగ్‌పై పని చేసే వీక్షకులు ఎపిథీలియల్ గూడులపై జన్యువులు మరియు ప్రోటీన్‌ల యొక్క స్పాటియోటెంపోరల్ డైనమిక్స్ యొక్క మా మ్యాపింగ్‌పై ఆసక్తి కలిగి ఉండవచ్చు.సాంకేతికతపై ఆసక్తి. సూక్ష్మజీవుల లేదా రోగనిరోధక ఉద్దీపనలకు ప్రతిస్పందన. ఇంకా, రేఖాంశ హోస్ట్-మైక్రోబయోమ్ క్రాస్‌స్టాక్ 10, 14 సమన్వయం చేసే గట్ హోమియోస్టాసిస్‌ను 3D పేగు శ్లేష్మ పొరలో వివిధ సూక్ష్మజీవుల జాతులు, సూక్ష్మజీవుల సంఘాలు లేదా మల-మైక్రోబయోటా సహ-సంస్కృతి చేయడం ద్వారా ఏర్పాటు చేయవచ్చు.ప్లాట్‌ఫారమ్‌లో. ఈ విధానం శ్లేష్మ నిరోధక శాస్త్రం, గ్యాస్ట్రోఎంటరాలజీ, హ్యూమన్ మైక్రోబయోమ్, కల్చురోమిక్స్ మరియు క్లినికల్ మైక్రోబయాలజీని అధ్యయనం చేసే ప్రేక్షకులకు ప్రత్యేకంగా ఆకర్షణీయంగా ఉంటుంది. ఇది ప్రయోగశాలలో గతంలో సంస్కృతి లేని గట్ మైక్రోబయోటాను పెంపొందించడానికి ప్రయత్నిస్తుంది. మా ఇన్ విట్రో మోర్ఫోజెనిసిస్ ప్రోటోకాల్‌ను స్కేలబుల్ కల్చర్ ఫార్మాట్‌లకు అనుగుణంగా మార్చగలిగితే. బేసోలేటరల్ కంపార్ట్‌మెంట్‌లను తిరిగి నింపడానికి, ప్రోటోకాల్‌ను ఆహార పరిశ్రమ కోసం ఫార్మాస్యూటికల్, బయోమెడికల్ లేదా హై-త్రూపుట్ స్క్రీనింగ్ లేదా ధ్రువీకరణ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లను అభివృద్ధి చేసే వారికి కూడా వ్యాప్తి చేయవచ్చు. సూత్రప్రాయంగా రుజువుగా, మేము ఇటీవల మల్టీప్లెక్స్ హై-త్రూపుట్ మోర్ఫోజెనిసిస్ సిస్టమ్‌లో మల్టీప్లెక్స్ హై-త్రూపుట్ మోర్ఫోజెనిసిస్ సిస్టమ్‌లో మల్టీప్లెక్స్ యొక్క సాధ్యాసాధ్యాలను ప్రదర్శించాము. 16,17,18 వాణిజ్యీకరించబడ్డాయి.అందుచేత, మా ఇన్ విట్రో మోర్ఫోజెనిసిస్ పద్ధతి యొక్క ధృవీకరణను వేగవంతం చేయవచ్చు మరియు అనేక పరిశోధనా ప్రయోగశాలలు, పరిశ్రమలు లేదా ప్రభుత్వం మరియు రెగ్యులేటరీ ఏజెన్సీలు ఇన్ విట్రో గట్ మోర్ఫోజెనిసిస్ యొక్క సెల్యులార్ రీప్రోగ్రామింగ్‌ను అర్థం చేసుకోవడానికి వీలుగా అవలంబించవచ్చు. గట్ మోర్ఫోజెనిసిస్ ప్రక్రియ యొక్క పునరుత్పత్తి సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి రోగేట్స్ లేదా కస్టమ్ లేదా కమర్షియల్ ఆర్గాన్-ఆన్-ఎ-చిప్ మోడల్‌లను ఉపయోగించడం.
పేగు ఎపిథీలియల్ మోర్ఫోజెనిసిస్‌ను అధ్యయనం చేయడానికి పరిమిత సంఖ్యలో మానవ-సంబంధిత ప్రయోగాత్మక నమూనాలు ఉపయోగించబడ్డాయి, ప్రధానంగా విట్రోలో 3D మోర్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి అమలు చేయగల ప్రోటోకాల్‌లు లేకపోవడం వల్ల. వాస్తవానికి, గట్ మోర్ఫోజెనిసిస్ గురించి ప్రస్తుత పరిజ్ఞానం చాలా వరకు జంతు అధ్యయనాలపై ఆధారపడి ఉంటుంది (ఉదా., జీబ్రాఫిష్ 20, కోడిపిల్లలు, శ్రామికుల ఖర్చులు, 200. నైతికంగా సందేహాస్పదంగా ఉండాలి మరియు ముఖ్యంగా, మానవ అభివృద్ధి ప్రక్రియలను ఖచ్చితంగా గుర్తించవద్దు. ఈ నమూనాలు బహుళ-మార్గం స్కేలబుల్ పద్ధతిలో పరీక్షించగల సామర్థ్యంలో కూడా చాలా పరిమితంగా ఉంటాయి. అందువల్ల, విట్రోలో 3D కణజాల నిర్మాణాలను పునరుత్పత్తి చేయడానికి మా ప్రోటోకాల్ vivo జంతు నమూనాలలో అలాగే ఇతర సాంప్రదాయ స్టాటిక్ 2D సెల్ కల్చర్‌లను గతంలో వివరించిన ఎపిలీ 2D సెల్ కల్చర్‌లను పరిశీలించింది. వివిధ శ్లేష్మ లేదా రోగనిరోధక ఉద్దీపనలకు ప్రతిస్పందనగా క్రిప్ట్-విల్లస్ అక్షంలోని విభిన్న కణాల ప్రాదేశిక స్థానికీకరణ. 3D ఎపిథీలియల్ పొరలు అతిధేయ కారకాలకు ప్రతిస్పందనగా సూక్ష్మజీవుల కణాలు ప్రాదేశిక సముదాయాలు మరియు పర్యావరణ పరిణామాన్ని ఏర్పరచడానికి ఎలా పోటీపడతాయో అధ్యయనం చేయడానికి ఒక స్థలాన్ని అందిస్తుంది (ఉదా, లోపలి వర్సెస్ బాహ్య శ్లేష్మ పొరలు, PEPTMOROBIGA మరియు యాంటీమోర్లియో స్రావము). గట్ మైక్రోబయోటా తన కమ్యూనిటీలను ఎలా నిర్మిస్తుంది మరియు సెల్యులార్ ఆర్గనైజేషన్ మరియు స్టెమ్ సెల్ గూళ్లను బేసల్ క్రిప్ట్‌లలో రూపొందించే సూక్ష్మజీవుల జీవక్రియలను (ఉదా, షార్ట్-చైన్ ఫ్యాటీ యాసిడ్స్) సినర్జిస్టిక్‌గా ఎలా ఉత్పత్తి చేస్తుందో అర్థం చేసుకోవడానికి ఫోలజీ అనుమతిస్తుంది. విట్రోలో 3D ఎపిథీలియల్ పొరలు స్థాపించబడినప్పుడు మాత్రమే ఈ లక్షణాలు ప్రదర్శించబడతాయి.
3D పేగు ఎపిథీలియల్ నిర్మాణాలను రూపొందించే మా పద్ధతితో పాటు, అనేక ఇన్ విట్రో పద్ధతులు ఉన్నాయి. పేగు ఆర్గానోయిడ్ సంస్కృతి అనేది నిర్దిష్ట మోర్ఫోజెన్ పరిస్థితులలో పేగు మూలకణాల పెంపకంపై ఆధారపడిన అత్యాధునిక టిష్యూ ఇంజనీరింగ్ టెక్నిక్. ఆర్గానోయిడ్ లోపల పరివేష్టితమై, అందువల్ల, సూక్ష్మజీవుల కణాలు లేదా ఎక్సోజనస్ యాంటిజెన్‌ల వంటి లూమినల్ భాగాల పరిచయం పరిమితం చేయబడింది.మైక్రోఇంజెక్టర్,26,27ను ఉపయోగించి ఆర్గానోయిడ్ ల్యూమెన్‌లకు యాక్సెస్‌ను మెరుగుపరచవచ్చు, అయితే ఈ పద్ధతి ఇన్వాసివ్ మరియు శ్రమతో కూడుకున్నది మరియు నిర్వహించడానికి ప్రత్యేక జ్ఞానం అవసరం.అంతేకాకుండా, స్టాటిక్ పరిస్థితుల్లో హైడ్రోజెల్ పరంజాలో నిర్వహించబడే సాంప్రదాయ ఆర్గానోయిడ్ సంస్కృతులు వివో బయోమెకానిక్స్‌లో చురుకుగా ప్రతిబింబించవు.
అనేక పరిశోధనా బృందాలు ఉపయోగించే ఇతర విధానాలు జెల్ ఉపరితలంపై వివిక్త మానవ పేగు కణాలను కల్చర్ చేయడం ద్వారా గట్ ఎపిథీలియల్ నిర్మాణాన్ని అనుకరించడానికి ముందస్తుగా 3D హైడ్రోజెల్ పరంజాలను ఉపయోగిస్తాయి. లై సంబంధిత మోర్ఫోజెన్ ప్రవణతలు, పరంజాలో స్ట్రోమల్ కణాలను చేర్చడం ద్వారా అధిక కారక నిష్పత్తి ఎపిథీలియల్ నిర్మాణం మరియు స్ట్రోమా-ఎపిథీలియల్ క్రాస్‌స్టాక్‌ను ఏర్పాటు చేయడం. అయితే, ప్రీస్ట్రక్చర్డ్ స్కాఫోల్డ్‌ల స్వభావం ఆకస్మిక మోర్ఫోజెనెటిక్ ప్రక్రియ యొక్క ప్రదర్శనను నిరోధించవచ్చు. మోర్ఫోజెనిసిస్ మరియు ఫిజియోలాజికల్ పనితీరును పొందడం. మరొక ఇటీవలి అధ్యయనం హైడ్రోజెల్ స్కాఫోల్డ్‌లను మైక్రోఫ్లూయిడ్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లో ఉపయోగించింది మరియు లేజర్-ఎచింగ్ టెక్నిక్‌లను ఉపయోగించి పేగు ఎపిథీలియల్ నిర్మాణాలను రూపొందించింది. మౌస్ పేగు ఆర్గానాయిడ్స్ పేగు గొట్టపు నిర్మాణాలను ఏర్పరచడానికి చెక్కిన నమూనాలను అనుసరిస్తాయి మరియు ఇంట్రాలూమినల్ ఫ్లూయిడ్ ప్రవాహాన్ని మళ్లీ ఉపయోగించుకోవచ్చు. ఆకస్మిక మోర్ఫోజెనెటిక్ ప్రక్రియలు లేదా గట్ మెకానోబయోలాజికల్ కదలికలను కలిగి ఉండవు. అదే సమూహంలోని 3D ప్రింటింగ్ పద్ధతులు ఆకస్మిక మోర్ఫోజెనెటిక్ ప్రక్రియలతో సూక్ష్మ గట్ ట్యూబ్‌లను సృష్టించగలిగాయి. ట్యూబ్‌లోని వివిధ గట్ విభాగాల సంక్లిష్ట కల్పన ఉన్నప్పటికీ, ఈ మోడల్‌లో లూమినల్ ఫ్లూయిడ్ ఫ్లో మరియు యాంత్రిక వికృతీకరణ తర్వాత పరిమితంగా ఉంటుంది. బింగ్ ప్రయోగాత్మక పరిస్థితులు లేదా సెల్-టు-సెల్ పరస్పర చర్యలు. బదులుగా, మా ప్రతిపాదిత ప్రోటోకాల్ ఆకస్మిక గట్ మోర్ఫోజెనిసిస్, ఫిజియోలాజికల్ సంబంధిత కోత ఒత్తిడి, గట్ చలనశీలతను అనుకరించే బయోమెకానిక్స్, స్వతంత్ర ఎపికల్ మరియు బేసోలేటరల్ కంపార్ట్‌మెంట్‌ల ప్రాప్యత మరియు సంక్లిష్టమైన జీవ సూక్ష్మ పర్యావరణాల పునర్నిర్మాణాన్ని అందిస్తుంది. ఇప్పటికే ఉన్న పద్ధతుల సవాళ్లను అధిగమించడానికి పరిపూరకరమైన విధానాన్ని అందిస్తాయి.
మా ప్రోటోకాల్ పూర్తిగా 3D ఎపిథీలియల్ మోర్ఫోజెనిసిస్‌పై దృష్టి పెట్టింది, సంస్కృతిలో కేవలం ఎపిథీలియల్ కణాలు మాత్రమే ఉంటాయి మరియు మెసెన్‌చైమల్ కణాలు, ఎండోథెలియల్ కణాలు మరియు రోగనిరోధక కణాలు వంటి ఇతర రకాల పరిసర కణాలు లేవు. గతంలో వివరించినట్లుగా, మా ప్రోటోకాల్ యొక్క ప్రధాన అంశం ఎపిథీలియల్ మోర్ఫోజెనిసిస్‌ను తొలగించడం ద్వారా పరిచయం చేయబడింది. మా గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ మరియు హైబ్రిడ్-ఆన్-ఎ-చిప్ యొక్క మాడ్యులారిటీ, ఎపిథీలియల్-మెసెన్చైమల్ ఇంటరాక్షన్స్33,34, ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ మ్యాట్రిక్స్ (ECM) వంటి అదనపు జీవసంబంధమైన సంక్లిష్టతలను తిరిగి సృష్టించడానికి అనుమతిస్తుంది. మెసెన్‌చైమ్‌లోని ట్రోమల్ కణాలు (ఉదా, ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లు) ECM ప్రొటీన్‌ల ఉత్పత్తిలో కీలక పాత్ర పోషిస్తాయి మరియు vivo35,37,38లో పేగు మోర్ఫోజెనిసిస్ నియంత్రణలో ఉంటాయి. మా మోడల్‌కు మెసెన్‌చైమల్ కణాల జోడింపు మోర్ఫోజెనెటిక్ ప్రక్రియను మెరుగుపరిచింది మరియు సెల్ అటాచ్‌మెంట్ సామర్థ్యాన్ని మెరుగుపరిచింది. 9 మరియు గట్ మైక్రో ఎన్విరాన్‌మెంట్‌లో రోగనిరోధక కణాల నియామకం40. ఇంకా, కణజాల నమూనాలు బహుళ-అవయవాల పరస్పర చర్యలను ప్రదర్శించడానికి రూపొందించబడినప్పుడు కణజాల నమూనాల మధ్య అనుసంధానించబడే వాస్కులేచర్ భాగాలు ఒక అవసరం. అందువల్ల, ఎండోథెలియల్ కణాలను మరింత ఖచ్చితమైన శారీరక లక్షణాలను మోడల్ చేయడానికి చేర్చవలసి ఉంటుంది. పేగు వ్యాధిని అనుకరించే సందర్భంలో అనుకూల రోగనిరోధక క్రాస్‌స్టాక్ మరియు కణజాల-నిర్దిష్ట రోగనిరోధక శక్తిని తిన్నారు.
హైబ్రిడ్ చిప్‌ల ఉపయోగం గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ కంటే చాలా సూటిగా ఉంటుంది, ఎందుకంటే పరికర సెటప్ సరళమైనది మరియు ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌ల ఉపయోగం గట్ ఎపిథీలియం యొక్క స్కేలబుల్ సంస్కృతిని అనుమతిస్తుంది. అయినప్పటికీ, వాణిజ్యపరంగా లభించే పాలిస్టర్ పొరలతో కూడిన ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లు సాగేవి కావు మరియు పెరిస్టాల్టిక్-వంటి కదలికలను అనుకరించలేవు. హైబ్రిడ్ చిప్ ఎపికల్ వైపు ఎటువంటి కోత ఒత్తిడి లేకుండా నిశ్చలంగా ఉంది. స్పష్టంగా, ఎపికల్ కంపార్ట్‌మెంట్‌లోని స్టాటిక్ లక్షణాలు హైబ్రిడ్ చిప్‌లలో దీర్ఘకాలిక బ్యాక్టీరియా సహ-సంస్కృతిని చాలా అరుదుగా ప్రారంభిస్తాయి. అయితే ట్రాన్స్‌వెల్‌లో 3D మోర్ఫోజెనిసిస్‌ను బలంగా ప్రేరేపించగలము, అయితే జీవసంబంధమైన ద్రవాలను ఉపయోగించినప్పుడు సంకర పరిమితిని తగ్గించవచ్చు. సంభావ్య అనువర్తనాల కోసం హైబ్రిడ్ చిప్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌ల సాధ్యత.
గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ మరియు హైబ్రిడ్-ఆన్-ఎ-చిప్ సంస్కృతులలో మానవ క్రిప్ట్-విల్లస్ అక్షం యొక్క పూర్తి-స్థాయి పునర్నిర్మాణాలు పూర్తిగా స్థాపించబడలేదు. మోర్ఫోజెనిసిస్ ఒక ఎపిథీలియల్ మోనోలేయర్ నుండి ప్రారంభమవుతుంది కాబట్టి, 3D మైక్రోఆర్కిటెక్చర్‌లు క్రిప్ట్‌ల క్రిప్ట్-జీవితానికి సమీపంలోని క్రిప్ట్‌ల జీవన సారూప్యతను అందించాల్సిన అవసరం లేదు. మైక్రోఇంజినీర్డ్ 3D ఎపిథీలియంలోని డొమైన్, క్రిప్ట్ మరియు విల్లస్ ప్రాంతాలు స్పష్టంగా గుర్తించబడలేదు. చిప్‌లోని ఎగువ ఛానెల్‌లు మైక్రో ఇంజనీర్డ్ ఎపిథీలియం యొక్క ఎత్తును పెంచడానికి దారితీసినప్పటికీ, గరిష్ట ఎత్తు ఇప్పటికీ ~300–400 µm వరకు పరిమితం చేయబడింది. మానవ ప్రేగులలోని అసలు లోతు 30 మరియు 30 చిన్న ప్రేగులలో ~ 5 ~ 0 ~ µm, వరుసగా, మరియు చిన్న ప్రేగు విల్లీ ఎత్తు ~600 µm41.
ఇమేజింగ్ దృక్కోణం నుండి, 3D మైక్రోఆర్కిటెక్చర్‌ల యొక్క సిటు సూపర్-రిజల్యూషన్ ఇమేజింగ్ చిప్‌లోని గట్‌కు పరిమితం కావచ్చు, ఎందుకంటే ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ నుండి ఎపిథీలియల్ లేయర్‌కు అవసరమైన పని దూరం కొన్ని మిల్లీమీటర్ల క్రమంలో ఉంటుంది. ఈ సమస్యను అధిగమించడానికి, ఈ సమస్యను అధిగమించడానికి, సన్నటి విభాగాన్ని తయారు చేయడానికి సుదూర లక్ష్యం అవసరం కావచ్చు. DMS.ఇంకా, చిప్‌పై గట్ యొక్క లేయర్-బై-లేయర్ మైక్రోఫ్యాబ్రికేషన్ ప్రతి పొర మధ్య శాశ్వత సంశ్లేషణను కలిగి ఉంటుంది కాబట్టి, ఎపిథీలియల్ పొర యొక్క ఉపరితల నిర్మాణాన్ని పరిశీలించడానికి పై పొరను తెరవడం లేదా తీసివేయడం చాలా సవాలుగా ఉంటుంది. ఉదాహరణకు, స్కానింగ్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్ (SEM)ని ఉపయోగించడం ద్వారా.
హైడ్రోఫోబిక్ చిన్న అణువులతో వ్యవహరించే మైక్రోఫ్లూయిడ్-ఆధారిత అధ్యయనాలలో PDMS యొక్క హైడ్రోఫోబిసిటీ ఒక పరిమితి కారకంగా ఉంది, ఎందుకంటే PDMS అటువంటి హైడ్రోఫోబిక్ అణువులను నిర్ధిష్టంగా శోషించగలదు. PDMSకి ప్రత్యామ్నాయాలు ఇతర పాలీమెరిక్ పదార్థాలతో పరిగణించబడతాయి. ప్రత్యామ్నాయంగా, PDMS యొక్క ఉపరితల మార్పు 43) హైడ్రోఫోబిక్ అణువుల శోషణను తగ్గించడానికి పరిగణించవచ్చు.
చివరగా, అధిక-నిర్గమాంశ స్క్రీనింగ్ లేదా "ఒక-పరిమాణం-సరిపోయే-అందరికీ" వినియోగదారు-స్నేహపూర్వక ప్రయోగాత్మక ప్లాట్‌ఫారమ్‌ను అందించే విషయంలో మా పద్ధతి బాగా వర్ణించబడలేదు. ప్రస్తుత ప్రోటోకాల్‌కు మైక్రో డివైస్‌కు సిరంజి పంప్ అవసరం, ఇది CO2 ఇంక్యుబేటర్‌లో స్థలాన్ని తీసుకుంటుంది మరియు పెద్ద-స్థాయి ప్రయోగాలను నిరోధిస్తుంది. ఈ పరిమితి గణనీయంగా మెరుగుపడుతుంది (ఉదా. 384-బాసోలేటరల్ మీడియా యొక్క నిరంతర భర్తీ మరియు తొలగింపును అనుమతించే బాగా పోరస్ ఇన్సర్ట్‌లు).
విట్రోలో మానవ పేగు ఎపిథీలియం యొక్క 3D మోర్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి, మేము ఒక ల్యూమన్-కేశనాళిక ఇంటర్‌ఫేస్‌ను రూపొందించడానికి రెండు సమాంతర మైక్రోచానెల్‌లు మరియు మధ్యలో సాగే పోరస్ పొరను కలిగి ఉన్న మైక్రోఫ్లూయిడ్ చిప్ ఇంటెస్టినల్ పరికరాన్ని ఉపయోగించాము. మేము ఏక-ఛానల్ (పొసోల్ మైక్రోఫ్లూయిడ్) నిరంతర మైక్రోఫ్లూయిడ్ పరికరం యొక్క ఉపయోగాన్ని కూడా ప్రదర్శిస్తాము. ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లపై పెరిగిన ఎపిథీలియల్ పొరలు.రెండు ప్లాట్‌ఫారమ్‌లలో, బాసోలేటరల్ కంపార్ట్‌మెంట్ నుండి మోర్ఫోజెన్ విరోధులను తొలగించడానికి ప్రవాహం యొక్క దిశాత్మక తారుమారుని వర్తింపజేయడం ద్వారా వివిధ మానవ పేగు ఎపిథీలియల్ కణాల మోర్ఫోజెనిసిస్ ప్రదర్శించబడుతుంది. మొత్తం ప్రయోగాత్మక విధానం (మూర్తి 1) ఐదు భాగాలను కలిగి ఉంటుంది (చిత్రం 1) eps 1-5; బాక్స్ 1), (ii) పేగు ఎపిథీలియల్ కణాలు (కాకో-2 కణాలు) లేదా మానవ పేగు ఆర్గానాయిడ్స్ తయారీ;పెట్టెలు 2-5), (iii) పేగు చిప్స్ లేదా హైబ్రిడ్ చిప్‌లపై పేగు ఎపిథీలియల్ కణాల సంస్కృతి (దశలు 6-9), (iv) 3D మోర్ఫోజెనిసిస్ ఇన్ విట్రో (స్టెప్ 10) మరియు (v) ) యొక్క ఇండక్షన్ 3D ఎపిథీలియల్ గ్రూప్‌ను వర్గీకరించడానికి (వి) ) ఎపిథీలియల్ మోర్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రాదేశిక, తాత్కాలిక, షరతులతో కూడిన లేదా విధానపరమైన నియంత్రణలతో పోల్చడం ద్వారా ఇన్ విట్రో మోర్ఫోజెనిసిస్ యొక్క ప్రభావాన్ని ధృవీకరించడానికి రూపొందించబడింది.
మేము రెండు విభిన్న కల్చర్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లను ఉపయోగించాము: గట్-ఆన్-ఎ-చిప్‌తో స్ట్రెయిట్ ఛానెల్‌లు లేదా నాన్‌లీనియర్ మెలికలు తిరిగిన ఛానెల్‌లు లేదా మైక్రోఫ్లూయిడ్ పరికరంలో ట్రాన్స్‌వెల్ (TW) ఇన్‌సర్ట్‌లను కలిగి ఉన్న హైబ్రిడ్ చిప్‌లు, బాక్స్ 1లో వివరించిన విధంగా రూపొందించబడ్డాయి మరియు దశ 1 -5.”డివైస్ ఫ్యాబ్రికేషన్” ఒకే హైబ్రిడ్ చిప్ తయారీలో ప్రధాన దశలను చూపుతుంది. ఈ ప్రోటోకాల్‌లో ఉపయోగించిన సెల్ సోర్స్ (కాకో-2 లేదా హ్యూమన్ పేగు ఆర్గానాయిడ్స్) మరియు కల్చర్ విధానం.”ఇన్ విట్రో మోర్ఫోజెనిసిస్” మొత్తం దశలను చూపుతుంది, దీనిలో కాకో-2 లేదా ఆర్గానోయిడ్-ఉత్పన్నమైన ఎపిథీలియల్ కణాలు పేగు చిప్‌పై లేదా ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లపై కల్చర్ చేయబడి ఉంటాయి. ప్రతి బాణం క్రింద దశ సంఖ్య లేదా పెట్టె సంఖ్య ప్రదర్శించబడుతుంది. అప్లికేషన్ స్థాపించబడిన పేగు ఎపిథీలియల్ పొరలను ఎలా ఉపయోగించవచ్చో ఉదాహరణలను అందిస్తుంది, ఉదాహరణకు, సెల్ డిఫరెన్సియేషన్ క్యారెక్టరైజేషన్, గట్ ఫిజియాలజీ స్టడీస్, హోస్ట్-మైక్రోబయోమ్ ఎకోసిస్టమ్స్ స్థాపన మరియు డిసీజ్ మోడలింగ్. గట్ చిప్‌పై ఏర్పడిన అల్ పొర.MUC2 సిగ్నలింగ్ గోబ్లెట్ కణాలు మరియు శ్లేష్మ ఉపరితలాల నుండి స్రవించే శ్లేష్మంలో ఉంటుంది. గట్ ఫిజియాలజీలోని ఫ్లోరోసెంట్ చిత్రాలు సియాలిక్ యాసిడ్ మరియు N-ఎసిటైల్గ్లూకోసమైన్ అవశేషాల కోసం మరక ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన శ్లేష్మాన్ని చూపుతాయి. చిప్‌పై గట్‌లో యాక్టివ్ హోస్ట్-మైక్రోబయోమ్ సహ-సంస్కృతులు. ఎడమ పానెల్ మైక్రోఇంజనీర్డ్ 3D కాకో-2 ఎపిథీలియల్ కణాలతో గ్రీన్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (GFP)ని వ్యక్తీకరించే E. కోలి యొక్క సహ-సంస్కృతిని చూపిస్తుంది. కుడి పానెల్ GFP E. coli యొక్క స్థానికీకరణను చూపుతుంది, దీని తర్వాత Flureed caco-2 ) మరియు న్యూక్లియైలు (నీలం) మరియు బాక్టీరియల్ యాంటిజెన్‌లు (ఉదా, లిపోపాలిసాకరైడ్, LPS) మరియు రోగనిరోధక కణాలతో (ఉదా, PBMC) శారీరక సవాలు కింద గట్ ఇన్‌ఫ్లమేషన్ చిప్స్‌లో ఆరోగ్యకరమైన వర్సెస్ లీకే గట్‌ను వ్యాధి మోడలింగ్ వివరిస్తుంది.పచ్చ).ఆక్స్‌ఫర్డ్ యూనివర్సిటీ ప్రెస్;Ref.5 నుండి అనుమతితో పునరుత్పత్తి చేయబడింది.NAS;"హోస్ట్-మైక్రోబ్ కో-కల్చర్" ref.3 నుండి అనుమతితో స్వీకరించబడింది.NAS;"డిసీజ్ మోడలింగ్" సూచన నుండి అనుమతితో స్వీకరించబడింది.5.NAS.
గట్-ఆన్-చిప్ మరియు హైబ్రిడ్ చిప్‌లు రెండూ PDMS ప్రతిరూపాలను ఉపయోగించి సిలికాన్ అచ్చుల నుండి మృదువైన లితోగ్రఫీ1,44 ద్వారా డీమోల్డ్ చేయబడ్డాయి మరియు SU-8తో నమూనా చేయబడ్డాయి. ప్రతి చిప్‌లోని మైక్రోచానెల్‌ల రూపకల్పన షీర్ స్ట్రెస్ మరియు హైడ్రోడైనమిక్ ప్రెజర్ వంటి హైడ్రోడైనమిక్‌లను పరిగణనలోకి తీసుకోవడం ద్వారా నిర్ణయించబడుతుంది. ఇది రెండు జతచేయబడిన సమాంతర స్ట్రెయిట్ మైక్రోచానెల్‌లను కలిగి ఉంటుంది, ఇది సంక్లిష్టమైన గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ (ఎక్స్‌టెండెడ్ డేటా Fig. 1b)గా పరిణామం చెందింది, ఇందులో ఒక జత వక్ర మైక్రోచానెల్‌లను కలిగి ఉంటుంది, ఇది పెరిగిన ద్రవ నివాస సమయం, నాన్‌లీనియర్ ఫ్లో ప్యాటర్న్‌లు మరియు కల్చర్డ్ సెల్‌ల యొక్క బహుళ అక్షసంబంధ వైకల్యాలు తిరిగి 1 జీవ-Wfhen అవసరం. , కాంప్లెక్స్ గట్-ఆన్-ఎ-చిప్‌లను ఎంచుకోవచ్చు. కల్చర్డ్ సెల్ రకంతో సంబంధం లేకుండా, ఒరిజినల్ గట్-చిప్‌తో పోలిస్తే, ఎపిథీలియల్ పెరుగుదల యొక్క సారూప్య స్థాయితో, మెలికలు తిరిగిన గట్-చిప్ కూడా అదే సమయ వ్యవధిలో 3D మోర్ఫోజెనిసిస్‌ను బలంగా ప్రేరేపిస్తుందని మేము నిరూపించాము. SU-8 నమూనాలతో సిలికాన్ అచ్చులపై నయం చేయబడిన లికాస్ డీమోల్డింగ్ తర్వాత ప్రతికూల లక్షణాలను అందించాయి (Fig.2a).చిప్‌పై గట్‌ను రూపొందించడానికి, తయారుచేయబడిన ఎగువ PDMS పొరను ఒక పోరస్ PDMS ఫిల్మ్‌తో వరుసగా బంధించి, ఆపై కరోనా ట్రీటర్‌ని (Fig. 2b-f) ఉపయోగించి కోలుకోలేని బంధం ద్వారా దిగువ PDMS పొరతో సమలేఖనం చేయబడింది. కమోడేట్ ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్‌సర్ట్‌లు (Fig. 2h మరియు ఎక్స్‌టెండెడ్ డేటా Fig. 2). PDMS ప్రతిరూపం మరియు గాజు ఉపరితలాలను ఆక్సిజన్ ప్లాస్మా లేదా కరోనా ట్రీట్‌మెంట్‌తో ట్రీట్ చేయడం ద్వారా బంధం ప్రక్రియ నిర్వహించబడుతుంది. సిలికాన్ ట్యూబ్‌కు జోడించిన మైక్రోఫ్యాబ్రికేటెడ్ పరికరాన్ని స్టెరిలైజేషన్ చేసిన తర్వాత, ఫిగ్యూర్ 2లో పరికరం సెటప్ చేయడానికి సిద్ధంగా ఉంది.
a, SU-8 నమూనా గల సిలికాన్ అచ్చుల నుండి PDMS భాగాల తయారీకి సంబంధించిన స్కీమాటిక్ ఇలస్ట్రేషన్. శుద్ధి చేయని PDMS ద్రావణాన్ని ఒక సిలికాన్ అచ్చు (ఎడమ) మీద పోసి, 60 °C (మధ్య) మరియు డీమోల్డ్ (కుడి) తీయబడింది. డీమోల్డ్ చేయబడిన PDMS ను ముక్కలుగా కట్ చేసి, పైభాగంలో ఉపయోగించే PDMS పొరను మరింతగా ఉపయోగించేందుకు, ఫోటోగ్రాఫ్ యొక్క ఫోటో, M. PDMS పోరస్ మెంబ్రేన్‌ను రూపొందించడానికి ఉపయోగించే సిలికాన్ అచ్చు, ఎగువ మరియు దిగువ PDMS భాగాల యొక్క ఛాయాచిత్రాల శ్రేణి మరియు సమీకరించబడిన ఆన్-చిప్ పేగు పరికరం.e, ఎగువ, పొర మరియు దిగువ PDMS భాగాల అమరిక యొక్క స్కీమాటిక్. సూపర్‌మోస్డ్ మెలికలు తిరిగిన మైక్రోచానెల్స్ మరియు వాక్యూమ్ ఛాంబర్‌లతో.g, మైక్రోఫ్లూయిడ్ సెల్ కల్చర్ కోసం గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ సెటప్. సిలికాన్ ట్యూబ్ మరియు సిరంజితో అసెంబుల్ చేయబడిన చిప్‌లోని ఫ్యాబ్రికేటెడ్ గట్ కవర్‌స్లిప్‌పై ఉంచబడింది. ఈ చిప్ పరికరం 150 మి.మీ. డిస్హ్ ట్యూబ్ యొక్క మూతపై ఉంచబడింది. హైబ్రిడ్ చిప్ ఫాబ్రికేషన్ మరియు హైబ్రిడ్ చిప్‌లను ఉపయోగించి 3D మోర్ఫోజెనిసిస్ యొక్క స్నాప్‌షాట్‌లు. సంస్కృతికి స్వతంత్రంగా తయారు చేయబడిన ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లు 2D పేగు ఎపిథీలియల్ కణాల మోనోలేయర్‌లను హైబ్రిడ్ చిప్‌లోకి చొప్పించబడ్డాయి. బార్, 1 cm.h సూచన నుండి అనుమతితో పునఃముద్రించబడింది.4.ఎల్సెవియర్.
ఈ ప్రోటోకాల్‌లో, కాకో-2 సెల్ లైన్ మరియు పేగు ఆర్గానాయిడ్‌లు ఎపిథీలియల్ మూలాలుగా ఉపయోగించబడ్డాయి (Fig. 3a).రెండు రకాల కణాలు స్వతంత్రంగా కల్చర్ చేయబడ్డాయి (బాక్స్ 2 మరియు బాక్స్ 5) మరియు ఆన్-చిప్ గట్ లేదా ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌ల యొక్క ECM-కోటెడ్ మైక్రోచానెల్‌లను సీడ్ చేయడానికి ఉపయోగించబడ్డాయి. 10 మరియు 50 భాగాల మధ్య) T-ఫ్లాస్క్‌లలో ట్రిప్సినైజేషన్ ఫ్లూయిడ్ (బాక్స్ 2) ద్వారా డిస్సోసియేటెడ్ సెల్ సస్పెన్షన్‌లను సిద్ధం చేయడానికి సేకరిస్తారు. పేగు జీవాణుపరీక్షలు లేదా సర్జికల్ రెసెక్షన్‌ల నుండి మానవ పేగు ఆర్గానాయిడ్స్ 24-బావిలో ఉండే మైక్రోఫెన్‌టూరల్ ప్లేట్‌లలో మెట్రిజెల్ స్కాఫోల్డ్ డోమ్‌లలో కల్చర్ చేయబడ్డాయి. nt, R-spondin, మరియు Noggin) మరియు బాక్స్ 3లో వివరించిన విధంగా తయారుచేసిన వృద్ధి కారకాలు ఆర్గానాయిడ్లు ~500 µm వ్యాసం కలిగినంత వరకు ప్రతిరోజూ అనుబంధంగా ఉంటాయి. పూర్తిగా పెరిగిన ఆర్గానాయిడ్స్‌ను కోయడం మరియు గట్‌పై విత్తడం కోసం ఒకే కణాలలో విడదీయడం లేదా గట్ లేదా ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లు మునుపటి రకం 1 ప్రకారం, చిప్‌లో 1 రకంగా ఉండవచ్చు. ఉదా వ్రణోత్పత్తి పెద్దప్రేగు శోథ, క్రోన్'స్ వ్యాధి, కొలొరెక్టల్ క్యాన్సర్ లేదా సాధారణ దాత), గాయం ఉన్న ప్రదేశం (ఉదా, గాయం వర్సెస్ నాన్-లెసియోన్డ్ ఏరియా) మరియు ట్రాక్ట్‌లోని జీర్ణశయాంతర స్థానం (ఉదా, డ్యూడెనమ్, జెజునం, ఇలియం, సెకమ్, కోలన్, లేదా రెక్టమ్) చిన్న పేగు ఆర్గానాయిడ్‌ల కంటే మోర్ఫోజెన్‌ల అధిక సాంద్రతలు అవసరం.
a, గట్ చిప్‌లో గట్ మోర్ఫోజెనిసిస్ యొక్క ఇండక్షన్ కోసం వర్క్‌ఫ్లో. కాకో-2 హ్యూమన్ ఇంటెస్టినల్ ఎపిథీలియం మరియు పేగు ఆర్గానాయిడ్స్ 3D మోర్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రదర్శించడానికి ఈ ప్రోటోకాల్‌లో ఉపయోగించబడతాయి. వివిక్త ఎపిథీలియల్ కణాలు తయారు చేయబడిన గట్-ఆన్-ఎ-చిప్‌లో సీడ్ చేయబడ్డాయి. రోజు 0 (D0)లో DMS పోరస్ మెంబ్రేన్, ఎపికల్ (AP) ప్రవాహం మొదటి 2 రోజులు (ప్రవాహం, AP, D0-D2) ప్రారంభించబడుతుంది మరియు నిర్వహించబడుతుంది. 2D మోనోలేయర్ పూర్తిగా ఏర్పడిన తర్వాత చక్రీయ సాగతీత కదలికలతో పాటు (స్ట్రెచ్, ఫ్లో, AP మరియు BL) బాసోలేటరల్ (BL) ప్రవాహం కూడా ప్రారంభించబడుతుంది. 5 రోజుల మైక్రోఫ్లూయిడ్ సంస్కృతి (మోర్ఫోజెనిసిస్, D5).దశ కాంట్రాస్ట్ ఇమేజ్‌లు ప్రతి ప్రయోగాత్మక దశ లేదా సమయ బిందువు వద్ద కాకో-2 కణాల ప్రాతినిధ్య స్వరూపాన్ని చూపుతాయి (బార్ గ్రాఫ్, 100 µm). గట్ మోర్ఫోజెనిసిస్ యొక్క సంబంధిత క్యాస్కేడ్‌లను వివరించే నాలుగు స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రాలు. స్థాపించబడిన 3D కాకో-2 ఎపిథీలియం (ఎడమవైపు).మాగ్నిఫైడ్ ఏరియా (వైట్ డాష్డ్ బాక్స్)ని హైలైట్ చేసే ఇన్‌సెట్ 3D కాకో-2 లేయర్ (కుడి)పై పునరుత్పత్తి చేయబడిన మైక్రోవిల్లిని చూపిస్తుంది (కుడివైపు).c, స్థాపించబడిన కాకో-2 3D, క్లాడిన్ (ZO-1, ఎరుపు) యొక్క క్షితిజసమాంతర వీక్షణ, క్లాడిన్ (ZO-1, ఎరుపు) మరియు నిరంతర బ్రష్‌బ్రెడ్ మెంబ్రాన్ (బ్రష్‌బ్రెడ్ మెంబ్రాన్) పేగు చిప్స్‌పై ఎపిథీలియల్ కణాల ఫ్లోరోసెన్స్ కన్ఫోకల్ విజువలైజేషన్. మధ్య స్కీమాటిక్‌కు సూచించే బాణాలు ప్రతి కన్ఫోకల్ వీక్షణకు ఫోకల్ ప్లేన్ స్థానాన్ని సూచిస్తాయి.d, ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా పొందిన చిప్‌లో కల్చర్ చేయబడిన ఆర్గానాయిడ్స్‌లోని పదనిర్మాణ మార్పుల సమయ కోర్సు 3, 7, 11 రోజులలో అందించబడింది. ఆర్గానోయిడ్ 3D ఎపిథీలియం యొక్క IC ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్ రోజు 7.f నాడు తీసిన స్లైస్‌పై గట్‌లో స్థాపించబడింది, మూలకణాల కోసం గుర్తులను చూపే ఓవర్‌లేడ్ ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ చిత్రాలు (LGR5;మెజెంటా), గోబ్లెట్ కణాలు (MUC2; ఆకుపచ్చ), ఎఫ్-ఆక్టిన్ (బూడిద) మరియు ఎపిథీలియల్ లేయర్‌పై వరుసగా 3 రోజులు (ఎడమ) మరియు 13-రోజుల (మధ్య) ఆర్గానాయిడ్‌లు పెరిగిన ఎఫ్-ఆక్టిన్ (గ్రే) మరియు న్యూక్లియైలు కల్చర్ యొక్క 13వ రోజున సెల్‌మాస్క్ డై (కుడివైపు)తో ప్లాస్మా పొరను మరక చేయడం ద్వారా చిప్‌లో 3D ఆర్గానోయిడ్ ఎపిథీలియం యొక్క మైక్రోస్ట్రక్చర్ (కుడివైపు) ఏర్పాటు చేయబడింది. స్కేల్ బార్ 50 μm ఉంటుంది.ఆక్స్‌ఫర్డ్ యూనివర్సిటీ ప్రెస్;c సూచన.2 నుండి అనుమతితో స్వీకరించబడింది.ఆక్స్‌ఫర్డ్ యూనివర్సిటీ ప్రెస్;e మరియు f సూచన ద్వారా అనుమతితో స్వీకరించబడింది.12 క్రియేటివ్ కామన్స్ లైసెన్స్ CC BY 4.0 క్రింద.
చిప్‌లోని గట్‌లో, విజయవంతమైన ECM పూత కోసం PDMS పోరస్ పొర యొక్క హైడ్రోఫోబిక్ ఉపరితలాన్ని సవరించడం అవసరం. ఈ ప్రోటోకాల్‌లో, PDMS పొరల యొక్క హైడ్రోఫోబిసిటీని సవరించడానికి మేము రెండు వేర్వేరు పద్ధతులను వర్తింపజేస్తాము. Caco-2 కణాలను పెంపొందించడానికి, UV/ozone ఉపరితలాన్ని తగ్గించడానికి, UV/ozone ఉపరితలాన్ని తగ్గించడానికి UV/ozone ఉపరితలాన్ని తగ్గించడానికి సరిపోతుంది. PDMS పొరకు Caco-2 కణాలు. అయితే, ఆర్గానోయిడ్ ఎపిథీలియం యొక్క మైక్రోఫ్లూయిడ్ సంస్కృతికి PDMS మైక్రోచానెల్‌లకు పాలిథిలిన్ (PEI) మరియు గ్లూటరాల్డిహైడ్‌లను వరుసగా వర్తింపజేయడం ద్వారా ECM ప్రోటీన్‌ల సమర్థవంతమైన నిక్షేపణను సాధించడానికి రసాయన-ఆధారిత ఉపరితల కార్యాచరణ అవసరం. oid epithelium.కణాలు జతచేయబడిన తర్వాత, మైక్రోఫ్లూయిడ్ సెల్ కల్చర్ అనేది కణాలు పూర్తి మోనోలేయర్‌గా ఏర్పడే వరకు మీడియంను మాత్రమే ఎగువ మైక్రోచానెల్‌లోకి పెర్ఫ్యూజ్ చేయడం ద్వారా ప్రారంభమవుతుంది, అయితే దిగువ మైక్రోచానెల్ స్థిరమైన పరిస్థితులను నిర్వహిస్తుంది. ఉపరితల క్రియాశీలత మరియు ECM పూత కోసం ఈ ఆప్టిమైజ్ చేసిన పద్దతి ఆర్గానాయిడ్ ఎపిథీలియం యొక్క అటాచ్మెంట్‌ను అనుమతిస్తుంది.
ట్రాన్స్‌వెల్ సంస్కృతులకు సెల్ సీడింగ్‌కు ముందు ECM పూత అవసరం;అయితే, ట్రాన్స్‌వెల్ కల్చర్‌లకు పోరస్ ఇన్సర్ట్‌ల ఉపరితలాన్ని సక్రియం చేయడానికి సంక్లిష్టమైన ముందస్తు చికిత్స దశలు అవసరం లేదు. ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లపై కాకో-2 కణాలను పెంచడం కోసం, పోరస్ ఇన్సర్ట్‌లపై ECM పూత విడదీయబడిన కాకో-2 కణాల జోడింపును వేగవంతం చేస్తుంది (<1 గంట) మరియు గట్టి జంక్షన్ అవరోధం ఏర్పడటం (<1-2 రోజులలో ఆర్గాన్ కల్చర్ ఏర్పడుతుంది). ECM-కోటెడ్ ఇన్సర్ట్‌లపై, మెమ్బ్రేన్ ఉపరితలం (<3 h)కి జోడించబడి, ఆర్గానాయిడ్స్ అవరోధ సమగ్రతతో పూర్తి మోనోలేయర్‌ను ఏర్పరుచుకునే వరకు నిర్వహించబడతాయి. ట్రాన్స్‌వెల్ కల్చర్‌లు హైబ్రిడ్ చిప్‌లను ఉపయోగించకుండా 24-వెల్ ప్లేట్‌లలో నిర్వహించబడతాయి.
ఇన్ విట్రో 3D మోర్ఫోజెనిసిస్ స్థాపించబడిన ఎపిథీలియల్ పొర యొక్క బాసోలేటరల్ అంశానికి ద్రవ ప్రవాహాన్ని వర్తింపజేయడం ద్వారా ప్రారంభించబడుతుంది. చిప్‌లోని గట్‌లో, మాధ్యమం ఎగువ మరియు దిగువ మైక్రోచానెల్స్‌లోకి (Fig. 3a) పెర్ఫ్యూజ్ చేయబడినప్పుడు ఎపిథీలియల్ మోర్ఫోజెనిసిస్ ప్రారంభమైంది. స్రవించే మోర్ఫోజెన్ ఇన్హిబిటర్లు.పోరస్ పొరలపై బంధించబడిన కణాలకు తగినంత పోషకాలు మరియు సీరం అందించడానికి మరియు లూమినల్ షీర్ ఒత్తిడిని ఉత్పత్తి చేయడానికి, మేము సాధారణంగా ఒక చిప్‌పై గట్‌లో ద్వంద్వ ప్రవాహాన్ని వర్తింపజేస్తాము. హైబ్రిడ్ చిప్‌లలో, ఎపిథీలియల్ మోనోలేయర్‌లను కలిగి ఉన్న ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లు ట్రాన్స్‌బాల్ సైడ్‌లో చొప్పించబడ్డాయి. మైక్రోచానెల్ ద్వారా rt. రెండు సంస్కృతి ప్లాట్‌ఫారమ్‌లలో బాసోలేటరల్ ప్రవాహాన్ని ప్రారంభించిన 3-5 రోజుల తర్వాత పేగుల మోర్ఫోజెనిసిస్ సంభవించింది.
ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ మైక్రోస్కోపీ, డిఫరెన్షియల్ ఇంటర్‌ఫరెన్స్ కాంట్రాస్ట్ (DIC) మైక్రోస్కోపీ, SEM లేదా ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ (గణాంకాలు 3 మరియు 4)తో సహా వివిధ ఇమేజింగ్ పద్ధతులను వర్తింపజేయడం ద్వారా మైక్రోఇంజనీర్డ్ 3D ఎపిథీలియల్ లేయర్‌ల యొక్క పదనిర్మాణ లక్షణాలను విశ్లేషించవచ్చు. ఎపిథీలియల్ పొరలు.PDMS మరియు పాలిస్టర్ ఫిల్మ్‌ల యొక్క ఆప్టికల్ పారదర్శకత కారణంగా, గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ మరియు హైబ్రిడ్ చిప్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లు రెండూ పరికరాన్ని విభజించడం లేదా విడదీయడం అవసరం లేకుండా సిటు ఇమేజింగ్‌లో నిజ-సమయం అందించగలవు. ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ ఇమేజింగ్ చేస్తున్నప్పుడు (గణాంకాలు 1, 3b మరియు c/4 వాల్యూమ్‌తో స్థిరంగా ఉండే సెల్‌లు) డీహైడ్ (PFA), తర్వాత ట్రిటాన్ X-100 మరియు 2% (wt/vol) ) బోవిన్ సీరం అల్బుమిన్ (BSA), క్రమంలో. సెల్ రకాన్ని బట్టి, వివిధ ఫిక్సేటివ్‌లు, పెర్మీబిలైజర్‌లు మరియు నిరోధించే ఏజెంట్‌లను ఉపయోగించవచ్చు. వంశం-ఆధారిత సెల్ లేదా రీజియన్ మార్కర్‌లను లక్ష్యంగా చేసుకునే ప్రాథమిక ప్రతిరోధకాలు, ప్రతిరోధక కణాలను హైలైట్ చేయడానికి ఉపయోగించబడతాయి. న్యూక్లియస్ (ఉదా, 4′,6-డయామిడినో-2-ఫెనిలీన్) ఇండోల్, DAPI) లేదా F-ఆక్టిన్ (ఉదా, ఫ్లోరోసెంట్‌గా లేబుల్ చేయబడిన ఫలోయిడిన్) టార్గెటింగ్ డై. శ్లేష్మ ఉత్పత్తిని గుర్తించడానికి ఫ్లోరోసెన్స్ ఆధారిత లైవ్ ఇమేజింగ్ కూడా సిటులో నిర్వహించబడుతుంది (Fig.1, “సెల్ డిఫరెన్సియేషన్” మరియు “గట్ ఫిజియాలజీ”), సూక్ష్మజీవుల కణాల యాదృచ్ఛిక వలసరాజ్యం (Fig. 1, “హోస్ట్-సూక్ష్మజీవుల సహ-సంస్కృతి”), రోగనిరోధక కణాల నియామకం (Fig. 1, 'డిసీజ్ మోడలింగ్') లేదా 3D ఎపిథీలియల్ మోర్ఫాలజీపై 3D యొక్క ఆకృతులు, Fig. దిగువ మైక్రోచానెల్ పొర నుండి పై పొరను వేరు చేయండి. refలో వివరించిన విధంగా. Fig. 2లో చూపిన విధంగా, 3D ఎపిథీలియల్ పదనిర్మాణ శాస్త్రం అలాగే ఎపికల్ బ్రష్ సరిహద్దులో ఉన్న మైక్రోవిల్లిని SEM (Fig. 3b) ద్వారా విజువలైజ్ చేయవచ్చు (Fig. 3b). భేదాత్మక మార్కర్ల వ్యక్తీకరణను పరిమాణాత్మక PCR5 లేదా ఏక-స్థాయి కణాల పెరుగుదల ద్వారా అంచనా వేయవచ్చు. ut చిప్స్ లేదా హైబ్రిడ్ చిప్స్ ట్రిప్సినైజేషన్ ద్వారా సేకరించబడతాయి మరియు తరువాత పరమాణు లేదా జన్యు విశ్లేషణ కోసం ఉపయోగిస్తారు.
a, హైబ్రిడ్ చిప్‌లో పేగు మోర్ఫోజెనిసిస్ యొక్క ఇండక్షన్ కోసం వర్క్‌ఫ్లో. హైబ్రిడ్ చిప్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లో 3D మోర్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రదర్శించడానికి ఈ ప్రోటోకాల్‌లో కాకో-2 మరియు పేగు ఆర్గానాయిడ్‌లు ఉపయోగించబడతాయి. డిసోసియేటెడ్ ఎపిథీలియల్ సెల్‌లు సిద్ధం చేయబడిన ట్రాన్స్‌వెల్‌లో అటాచ్ చేయబడ్డాయి (క్రింద చూడండి) ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లలోని పొరలు, అన్ని కణాలు స్టాటిక్ పరిస్థితులలో (TW కల్చర్) కల్చర్ చేయబడ్డాయి. 7 రోజుల తర్వాత, ఎపిథీలియల్ కణాల యొక్క 2D మోనోలేయర్‌ను కలిగి ఉన్న ఒక ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్ ఒక హైబ్రిడ్ చిప్‌లో విలీనం చేయబడింది, ఇది ఒక బేసోలేటరల్ ఫ్లో (ఫ్లో, BL), ఇది అంతిమంగా ఎపిథీలియల్ ప్రవాహాన్ని (ఫ్లో, BL) పరిచయం చేసింది. ప్రతి ప్రయోగాత్మక దశ లేదా సమయ బిందువు వద్ద సాధారణ దాత (C103 లైన్) ఆరోహణ పెద్దప్రేగు నుండి తీసుకోబడిన మానవ అవయవ ఎపిథీలియల్ కణాల యొక్క పదనిర్మాణ లక్షణాలను చూపే గ్రాఫ్‌లు స్థానాలు (ఎగువ, మధ్య మరియు దిగువ;కుడి స్కీమాటిక్ మరియు సంబంధిత చుక్కల పంక్తులను చూడండి).స్పష్టమైన పదనిర్మాణ లక్షణాలను చూపించింది. ical క్రాస్-కట్ వీక్షణలు (ఎగువ కుడి మూలలో ఇన్‌సెట్; "XZ") కూడా 2D మరియు 3D లక్షణాలను చూపుతాయి. స్కేల్ బార్, 100 µm.c సూచన నుండి అనుమతితో పునఃముద్రించబడింది.4.ఎల్సెవియర్.
సాంప్రదాయిక స్టాటిక్ కల్చర్ పరిస్థితులలో ఒకే కణాలను (కాకో-2 లేదా పేగు ఆర్గానోయిడ్ ఎపిథీలియల్ కణాలు) రెండు-డైమెన్షనల్ మోనోలేయర్‌లుగా కల్చర్ చేయడం ద్వారా నియంత్రణలను సిద్ధం చేయవచ్చు.ముఖ్యంగా, మైక్రోచానెల్‌ల పరిమిత వాల్యూమ్ సామర్థ్యం కారణంగా పోషకాల క్షీణత ఏర్పడవచ్చు (అంటే ~4 µL. బేసోలెటరల్ ప్రవాహాన్ని కూడా పోల్చవచ్చు.
మృదువైన లితోగ్రఫీ ప్రక్రియను శుభ్రమైన గదిలో నిర్వహించాలి. చిప్ (ఎగువ మరియు దిగువ పొరలు మరియు పొరలు) మరియు హైబ్రిడ్ చిప్‌లపై ఉన్న ప్రతి పొరకు, మైక్రోచానెల్‌ల ఎత్తులు వేర్వేరుగా ఉన్నందున వేర్వేరు ఫోటోమాస్క్‌లు ఉపయోగించబడ్డాయి మరియు రూపొందించబడ్డాయి. హైబ్రిడ్ చిప్ 200 µm.
అసిటోన్ ఉన్న డిష్‌లో 3-అంగుళాల సిలికాన్ పొరను ఉంచండి. ప్లేట్‌ను 30 సెకన్ల పాటు సున్నితంగా తిప్పండి, ఆపై పొరను గాలిలో ఆరబెట్టండి. పొరను IPA ఉన్న ప్లేట్‌కు బదిలీ చేయండి, ఆపై ప్లేట్‌ను శుభ్రం చేయడానికి 30 సెకన్ల పాటు తిప్పండి.
పిరాన్హా ద్రావణం (హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ మరియు సాంద్రీకృత సల్ఫ్యూరిక్ యాసిడ్ మిశ్రమం, 1:3 (వాల్యూమ్/వాల్యూమ్)) ఐచ్ఛికంగా సిలికాన్ పొర ఉపరితలం నుండి సేంద్రీయ అవశేషాల తొలగింపును పెంచడానికి ఉపయోగించవచ్చు.
పిరాన్హా ద్రావణం చాలా తినివేయడం మరియు వేడిని ఉత్పత్తి చేస్తుంది. అదనపు భద్రతా జాగ్రత్తలు అవసరం. వ్యర్థాలను పారవేయడం కోసం, ద్రావణాన్ని చల్లబరచడానికి మరియు శుభ్రమైన, పొడి చెత్త కంటైనర్‌కు బదిలీ చేయడానికి అనుమతించండి. సెకండరీ కంటైనర్‌లను ఉపయోగించండి మరియు వ్యర్థ కంటైనర్‌లను సరిగ్గా లేబుల్ చేయండి. దయచేసి మరింత వివరణాత్మక విధానాల కోసం సౌకర్యం యొక్క భద్రతా మార్గదర్శకాలను అనుసరించండి.
పొరలను 200 °C వేడి ప్లేట్‌లో 10 నిమిషాల పాటు ఉంచడం ద్వారా వాటిని డీహైడ్రేట్ చేయండి. డీహైడ్రేషన్ తర్వాత, పొరను చల్లబరచడానికి గాలిలో ఐదుసార్లు కదిలించారు.
శుభ్రం చేసిన సిలికాన్ పొర మధ్యలో ~10 గ్రా ఫోటోరేసిస్ట్ SU-8 2100ని పోయాలి. ఫోటోరేసిస్ట్‌ను పొరపై సమానంగా వ్యాప్తి చేయడానికి పట్టకార్లను ఉపయోగించండి. అప్పుడప్పుడు పొరను 65°C వేడి ప్లేట్‌పై ఉంచండి. ఫోటోరేసిస్ట్ తక్కువ జిగటగా మరియు సులభంగా వ్యాపించేలా చేయండి. నేరుగా హాట్‌వేఫర్‌పై ఉంచవద్దు.
స్పిన్ కోటింగ్‌ను అమలు చేయడం ద్వారా పొరపై SU-8 సమానంగా పంపిణీ చేయబడింది. SU-8 యొక్క ఇన్‌కమింగ్ రొటేషన్‌ను 5-10 సెకన్లకు ప్రోగ్రామ్ చేయండి. 500 rpm వద్ద 100 rpm/s త్వరణంతో ప్రచారం చేయండి. ప్రధాన స్పిన్‌ను 200 µm/s మందం కోసం సెట్ చేయండి (200 µm మందం లేదా 0 µm వద్ద ప్యాటర్నింగ్ 1, 50 కింగ్ చిప్‌పై గట్ పై పొర కోసం 500 µm ఎత్తు; దిగువన ఉన్న “క్రిటికల్ స్టెప్స్” చూడండి) 1,200 rpm వద్ద 300 rpm/s 30 సెకన్ల యాక్సిలరేషన్‌లో సెట్ చేయబడింది.
సిలికాన్ పొరపై SU-8 నమూనా యొక్క లక్ష్య మందం ప్రకారం ప్రధాన స్పిన్ వేగాన్ని సర్దుబాటు చేయవచ్చు.
చిప్‌పై గట్ పై పొర కోసం 500 µm ఎత్తు గల SU-8 నమూనాలను రూపొందించడానికి, ఈ పెట్టె యొక్క స్పిన్ కోటింగ్ మరియు సాఫ్ట్ బేక్ దశలు (స్టెప్స్ 7 మరియు 8) వరుసగా పునరావృతం చేయబడ్డాయి (దశ 9 చూడండి) 250 µm ఒక మందపాటి పొరను ఉత్పత్తి చేయడానికి, SU-8 యొక్క మందపాటి పొరను తయారు చేసి, 5 పొరల ద్వారా UV పొరను తయారు చేయవచ్చు. µm ఎత్తు.
65 °C వద్ద వేడి ప్లేట్‌లో 5 నిమిషాల పాటు వేఫర్‌లను జాగ్రత్తగా ఉంచడం ద్వారా SU-8 కోటెడ్ వేఫర్‌లను మెత్తగా కాల్చండి, ఆపై సెట్టింగ్‌ను 95 °Cకి మార్చండి మరియు అదనంగా 40 నిమిషాలు పొదిగేది.
ఎగువ మైక్రోచానెల్‌లో SU-8 నమూనా యొక్క 500 μm ఎత్తును సాధించడానికి, రెండు 250 μm మందపాటి SU-8 పొరలను రూపొందించడానికి 7 మరియు 8 దశలను పునరావృతం చేయండి.
UV మాస్క్ అలైన్‌నర్‌ని ఉపయోగించి, పొర యొక్క ఎక్స్‌పోజర్ సమయాన్ని లెక్కించడానికి తయారీదారు సూచనల ప్రకారం దీపం పరీక్షను నిర్వహించండి.(ఎక్స్‌పోజర్ సమయం, ms) = (ఎక్స్‌పోజర్ డోస్, mJ/cm2)/(లాంప్ పవర్, mW/cm2).
ఎక్స్‌పోజర్ సమయాన్ని నిర్ణయించిన తర్వాత, UV మాస్క్ అలైన్‌నర్ యొక్క మాస్క్ హోల్డర్‌పై ఫోటోమాస్క్‌ను ఉంచండి మరియు ఫోటోమాస్క్‌ను SU-8 కోటెడ్ పొరపై ఉంచండి.
UV వ్యాప్తిని తగ్గించడానికి ఫోటోమాస్క్ యొక్క ప్రింటెడ్ ఉపరితలాన్ని నేరుగా సిలికాన్ పొర యొక్క SU-8 పూత వైపున ఉంచండి.
ముందుగా నిర్ణయించిన ఎక్స్‌పోజర్ సమయం కోసం SU-8 కోటెడ్ వేఫర్ మరియు ఫోటోమాస్క్‌ను నిలువుగా 260 mJ/cm2 UV కాంతికి బహిర్గతం చేయండి (ఈ పెట్టె యొక్క దశ 10 చూడండి).
UV ఎక్స్పోజర్ తర్వాత, SU-8-కోటెడ్ సిలికాన్ పొరలను 200 μm ఎత్తుతో నమూనాలను రూపొందించడానికి ప్రతి హాట్ ప్లేట్‌పై 5 నిమిషాలు మరియు 95 ° C వద్ద 5 నిమిషాలు మరియు 95 ° C వద్ద 15 నిమిషాలు కాల్చారు.
డెవలపర్‌ను గ్లాస్ డిష్‌లో పోస్తారు మరియు కాల్చిన పొరను డిష్‌లో ఉంచుతారు. గ్లాస్ ప్లేట్ పరిమాణాన్ని బట్టి SU-8 డెవలపర్ వాల్యూమ్ మారవచ్చు. బహిర్గతం కాని SU-8ని పూర్తిగా తొలగించడానికి తగినంత SU-8 డెవలపర్‌ని ఉపయోగించాలని నిర్ధారించుకోండి. ఉదాహరణకు, 150 మిమీ వ్యాసం కలిగిన గ్లాస్ డిష్‌ను 150 మిల్లీమీటర్ల డయామీటర్‌తో ఉపయోగించినప్పుడు m20-వేఫర్ m20, అప్పుడప్పుడు సున్నితమైన భ్రమణంతో నిమిషాలు.
పైపెట్‌ని ఉపయోగించి ద్రావణాన్ని స్ప్రే చేయడం ద్వారా అభివృద్ధి చెందిన అచ్చును ~10 mL తాజా డెవలపర్‌తో IPA తర్వాత శుభ్రం చేయండి.
పొరను ప్లాస్మా క్లీనర్‌లో ఉంచండి మరియు 1.5 నిమిషాల పాటు ఆక్సిజన్ ప్లాస్మా (వాతావరణ వాయువు, లక్ష్య పీడనం 1 × 10−5 టోర్, పవర్ 125 W)కి బహిర్గతం చేయండి.
లోపల గ్లాస్ స్లయిడ్ ఉన్న వాక్యూమ్ డెసికేటర్‌లో పొరను ఉంచండి. పొరలు మరియు స్లయిడ్‌లను పక్కపక్కనే ఉంచవచ్చు. వాక్యూమ్ డెసికేటర్‌ను ప్లేట్ ద్వారా అనేక పొరలుగా విభజించినట్లయితే, స్లయిడ్‌లను దిగువ గదిలో మరియు పొరలను ఎగువ గదిలో ఉంచండి. ట్రైక్లోరో, 100 μL ద్రావణంలో, H2, 100 μL డ్రాప్, సిల్వర్ ఒక గ్లాస్ స్లయిడ్ మరియు సిలనైజేషన్ కోసం వాక్యూమ్ వర్తిస్తాయి.
37°C నీటి స్నానంలో ఘనీభవించిన కాకో-2 కణాల సీసాను కరిగించి, కరిగిన కణాలను 15 mL 37°C ముందుగా వేడిచేసిన కాకో-2 మాధ్యమం కలిగిన T75 ఫ్లాస్క్‌కి బదిలీ చేయండి.
~90% సంగమం వద్ద Caco-2 సెల్‌లను పాస్ చేయడానికి, మొదటి వెచ్చని Caco-2 మాధ్యమం, PBS మరియు 0.25% ట్రిప్సిన్/1 mM EDTA 37°C నీటి స్నానంలో.
వాక్యూమ్ ఆస్పిరేషన్ ద్వారా మాధ్యమాన్ని ఆశించండి.వాక్యూమ్ ఆస్పిరేషన్‌ను పునరావృతం చేయడం మరియు తాజా PBSని జోడించడం ద్వారా 5 mL వెచ్చని PBSతో కణాలను రెండుసార్లు కడగండి.