Nature.com ని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు పరిమిత CSS మద్దతు ఉన్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌ను ఉపయోగిస్తున్నారు. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాలని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో అనుకూలత మోడ్‌ను నిలిపివేయండి). అదనంగా, కొనసాగుతున్న మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము శైలులు మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ను చూపుతాము.
ఒకేసారి మూడు స్లయిడ్‌ల కారౌసెల్‌ను ప్రదర్శిస్తుంది. ఒకేసారి మూడు స్లయిడ్‌ల ద్వారా కదలడానికి మునుపటి మరియు తదుపరి బటన్‌లను ఉపయోగించండి లేదా ఒకేసారి మూడు స్లయిడ్‌ల ద్వారా కదలడానికి చివర ఉన్న స్లయిడర్ బటన్‌లను ఉపయోగించండి.
రక్త-మెదడు అవరోధం మరియు రక్త-మెదడు అవరోధం కేంద్ర నాడీ వ్యవస్థలో బయోథెరపీటిక్ ఏజెంట్లు తమ లక్ష్యాలను చేరుకోకుండా నిరోధిస్తాయి, తద్వారా నాడీ సంబంధిత వ్యాధుల ప్రభావవంతమైన చికిత్సకు ఆటంకం కలిగిస్తాయి. ఇన్ వివోలో నవల మెదడు రవాణాదారులను కనుగొనడానికి, మేము T7 ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీని ప్రవేశపెట్టాము మరియు ఎలుకల కాన్యులేటెడ్ కాన్షియస్ లార్జ్ పూల్ మోడల్‌ను ఉపయోగించి సీరియల్‌గా సేకరించిన రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ (CSF)ను ప్రవేశపెట్టాము. నాలుగు రౌండ్ల ఎంపిక తర్వాత నిర్దిష్ట ఫేజ్ క్లోన్‌లు CSFలో బాగా సమృద్ధిగా ఉన్నాయి. వ్యక్తిగత అభ్యర్థి పెప్టైడ్‌ల పరీక్ష CSFలో 1000 రెట్లు ఎక్కువ సుసంపన్నతను వెల్లడించింది. గుర్తించబడిన నవల ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్‌తో అనుసంధానించబడిన BACE1 పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్‌ను ఉపయోగించి సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో అమిలాయిడ్-β స్థాయిలో 40% తగ్గింపు ద్వారా మెదడుకు పెప్టైడ్-మధ్యవర్తిత్వ డెలివరీ యొక్క బయోయాక్టివిటీ నిర్ధారించబడింది. ఇన్ వివో ఫేజ్ ఎంపిక పద్ధతుల ద్వారా గుర్తించబడిన పెప్టైడ్‌లు చికిత్సా ప్రభావంతో మెదడుకు స్థూల కణాలను క్రమబద్ధంగా పంపిణీ చేయడానికి ఉపయోగకరమైన వాహనాలుగా ఉండవచ్చని ఈ ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.
కేంద్ర నాడీ వ్యవస్థ (CNS) లక్ష్య చికిత్స పరిశోధన ఎక్కువగా CNS- లక్ష్య లక్షణాలను ప్రదర్శించే ఆప్టిమైజ్ చేసిన మందులు మరియు ఏజెంట్లను గుర్తించడంపై దృష్టి సారించింది, మెదడుకు చురుకైన ఔషధ డెలివరీని నడిపించే విధానాలను కనుగొనడంలో తక్కువ ప్రయత్నం. ఔషధ డెలివరీ, ముఖ్యంగా పెద్ద అణువులు, ఆధునిక న్యూరోసైన్స్ ఔషధ అభివృద్ధిలో అంతర్భాగంగా ఉన్నందున ఇది ఇప్పుడు మారడం ప్రారంభమైంది. రక్త-మెదడు అవరోధం (BBB) ​​మరియు రక్త-మెదడు అవరోధం (BCBB)1 లతో కూడిన సెరెబ్రోవాస్కులర్ అవరోధ వ్యవస్థ ద్వారా కేంద్ర నాడీ వ్యవస్థ యొక్క పర్యావరణం బాగా రక్షించబడింది, ఇది మెదడుకు ఔషధాలను పంపిణీ చేయడం సవాలుగా చేస్తుంది1,2. దాదాపు అన్ని పెద్ద అణువుల మందులు మరియు 98% కంటే ఎక్కువ చిన్న అణువుల మందులు మెదడు నుండి తొలగించబడుతున్నాయని అంచనా వేయబడింది3. అందుకే CNS 4,5 కు చికిత్సా ఔషధాల సమర్థవంతమైన మరియు నిర్దిష్ట డెలివరీని అందించే కొత్త మెదడు రవాణా వ్యవస్థలను గుర్తించడం చాలా ముఖ్యం. అయితే, BBB మరియు BCSFB కూడా ఔషధ డెలివరీకి అద్భుతమైన అవకాశాన్ని అందిస్తాయి ఎందుకంటే అవి దాని విస్తృతమైన వాస్కులేచర్ ద్వారా మెదడు యొక్క అన్ని నిర్మాణాలలోకి చొచ్చుకుపోయి ప్రవేశిస్తాయి. అందువల్ల, మెదడుకు డెలివరీ చేయడానికి నాన్-ఇన్వాసివ్ పద్ధతులను ఉపయోగించే ప్రస్తుత ప్రయత్నాలు ఎక్కువగా ఎండోజెనస్ BBB6 రిసెప్టర్‌ను ఉపయోగించి రిసెప్టర్-మెడియేటెడ్ ట్రాన్స్‌పోర్ట్ (PMT) యొక్క యంత్రాంగంపై ఆధారపడి ఉన్నాయి. ట్రాన్స్‌ఫ్రిన్ రిసెప్టర్ పాత్‌వే7,8 ఉపయోగించి ఇటీవలి కీలక పురోగతులు ఉన్నప్పటికీ, మెరుగైన లక్షణాలతో కొత్త డెలివరీ సిస్టమ్‌ల మరింత అభివృద్ధి అవసరం. ఈ లక్ష్యం కోసం, CSF రవాణాకు మధ్యవర్తిత్వం వహించగల పెప్టైడ్‌లను గుర్తించడం, ఎందుకంటే అవి సూత్రప్రాయంగా CNSకి స్థూల కణాలను అందించడానికి లేదా కొత్త రిసెప్టర్ మార్గాలను తెరవడానికి ఉపయోగించబడతాయి. ముఖ్యంగా, సెరెబ్రోవాస్కులర్ సిస్టమ్ (BBB మరియు BSCFB) యొక్క నిర్దిష్ట గ్రాహకాలు మరియు ట్రాన్స్‌పోర్టర్లు బయోథెరపీటిక్ ఔషధాల క్రియాశీల మరియు నిర్దిష్ట డెలివరీకి సంభావ్య లక్ష్యాలుగా ఉపయోగపడతాయి. సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ (CSF) అనేది కోరాయిడ్ ప్లెక్సస్ (CS) యొక్క స్రావ ఉత్పత్తి మరియు సబ్‌అరాక్నాయిడ్ స్పేస్ మరియు వెంట్రిక్యులర్ స్పేస్4 ద్వారా మెదడు యొక్క ఇంటర్‌స్టీషియల్ ద్రవంతో ప్రత్యక్ష సంబంధంలో ఉంటుంది. ఇటీవల సబ్‌అరాక్నాయిడ్ సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవం మెదడు యొక్క ఇంటర్‌స్టీటియంలోకి అధికంగా వ్యాపిస్తుందని తేలింది9. ఈ సబ్‌అరాక్నాయిడ్ ఇన్‌ఫ్లో ట్రాక్ట్‌ను ఉపయోగించి లేదా నేరుగా BBB ద్వారా పరేన్‌చైమల్ స్పేస్‌ను యాక్సెస్ చేయాలని మేము ఆశిస్తున్నాము. దీనిని సాధించడానికి, ఈ రెండు విభిన్న మార్గాల ద్వారా రవాణా చేయబడిన పెప్టైడ్‌లను ఆదర్శంగా గుర్తించే బలమైన ఇన్ వివో ఫేజ్ ఎంపిక వ్యూహాన్ని మేము అమలు చేసాము.
అత్యధిక లైబ్రరీ వైవిధ్యంతో ప్రారంభ ఎంపిక రౌండ్లను పర్యవేక్షించడానికి CSF నమూనాతో కలిపి అధిక త్రూపుట్ సీక్వెన్సింగ్ (HTS)తో కూడిన సీక్వెన్షియల్ ఇన్ వివో ఫేజ్ డిస్ప్లే స్క్రీనింగ్ పద్ధతిని మేము ఇప్పుడు వివరిస్తాము. రక్త కాలుష్యాన్ని నివారించడానికి శాశ్వతంగా అమర్చబడిన పెద్ద సిస్టెర్నా (CM) కాన్యులాతో స్పృహ ఉన్న ఎలుకలపై స్క్రీనింగ్ నిర్వహించబడింది. ముఖ్యంగా, ఈ విధానం సెరెబ్రోవాస్కులర్ అవరోధం అంతటా రవాణా కార్యకలాపాలతో మెదడు-లక్ష్యంగా మరియు పెప్టైడ్‌లు రెండింటినీ ఎంచుకుంటుంది. వాటి చిన్న పరిమాణం (~60 nm)10 కారణంగా మేము T7 ఫేజ్‌లను ఉపయోగించాము మరియు ఎండోథెలియల్ మరియు/లేదా ఎపిథీలియల్-మెడుల్లా అవరోధం యొక్క ట్రాన్స్‌సెల్యులార్ క్రాసింగ్‌ను అనుమతించే వెసికిల్స్ రవాణాకు అవి అనుకూలంగా ఉన్నాయని సూచించాము. నాలుగు రౌండ్ల పానింగ్ తర్వాత, ఫేజ్ జనాభాను వేరుచేసి వివో CSF సుసంపన్నం మరియు సెరిబ్రల్ మైక్రోవెసెల్ అసోసియేషన్‌ను బలంగా చూపించారు. ముఖ్యంగా, ఇష్టపడే మరియు రసాయనికంగా సంశ్లేషణ చేయబడిన ఉత్తమ అభ్యర్థి పెప్టైడ్‌లు సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలోకి ప్రోటీన్ కార్గోను రవాణా చేయగలవని ప్రదర్శించడం ద్వారా మేము మా ఫలితాలను నిర్ధారించగలిగాము. మొదట, BACE1 పెప్టైడ్ యొక్క నిరోధకంతో ఒక ప్రముఖ ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్‌ను కలపడం ద్వారా CNS యొక్క ఫార్మకోడైనమిక్ ప్రభావాలు స్థాపించబడ్డాయి. ఇన్ వివో ఫంక్షనల్ స్క్రీనింగ్ వ్యూహాలు నవల మెదడు రవాణా పెప్టైడ్‌లను ప్రభావవంతమైన ప్రోటీన్ కార్గో క్యారియర్‌లుగా గుర్తించగలవని నిరూపించడంతో పాటు, నవల మెదడు రవాణా మార్గాలను గుర్తించడంలో ఇలాంటి క్రియాత్మక ఎంపిక విధానాలు కూడా ముఖ్యమైనవిగా మారతాయని మేము ఆశిస్తున్నాము.
ప్లేక్-ఫార్మింగ్ యూనిట్స్ (PFU) ఆధారంగా, ఫేజ్ ప్యాకేజింగ్ దశ తర్వాత, దాదాపు 109 వైవిధ్యం కలిగిన యాదృచ్ఛిక 12-మెర్ లీనియర్ T7 ఫేజ్ పెప్టైడ్‌ల లైబ్రరీని రూపొందించారు మరియు సృష్టించారు (మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్ చూడండి). ఇన్ వివో ప్యానింగ్‌కు ముందు మేము ఈ లైబ్రరీని జాగ్రత్తగా విశ్లేషించామని గమనించడం ముఖ్యం. సవరించిన ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి ఫేజ్ లైబ్రరీ నమూనాల PCR యాంప్లిఫికేషన్ HTSకి నేరుగా వర్తించే యాంప్లికాన్‌లను ఉత్పత్తి చేసింది (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1a). a) HTS11 సీక్వెన్సింగ్ లోపాలు, b) ప్రైమర్‌ల నాణ్యతపై ప్రభావం (NNK)1-12, మరియు c) స్టాండ్‌బై లైబ్రరీలో వైల్డ్-టైప్ (wt) ఫేజ్ (స్కెలిటన్ ఇన్సర్ట్‌లు) ఉండటం వల్ల, ధృవీకరించబడిన సీక్వెన్స్ సమాచారాన్ని మాత్రమే సేకరించేందుకు సీక్వెన్స్ ఫిల్టరింగ్ విధానాన్ని అమలు చేశారు (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1b). ఈ ఫిల్టర్ దశలు అన్ని HTS సీక్వెన్సింగ్ లైబ్రరీలకు వర్తిస్తాయి. ప్రామాణిక లైబ్రరీ కోసం, మొత్తం 233,868 రీడ్‌లు పొందబడ్డాయి, వీటిలో 39% ఫిల్టర్ ప్రమాణాలను ఆమోదించాయి మరియు లైబ్రరీ విశ్లేషణ మరియు తదుపరి రౌండ్ల కోసం ఎంపిక కోసం ఉపయోగించబడ్డాయి (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1c–e). ఈ రీడ్‌లు ప్రధానంగా 3 బేస్ జతల పొడవు యొక్క గుణిజాలుగా ఉన్నాయి, దీని గరిష్ట స్థాయి 36 న్యూక్లియోటైడ్‌లు (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1c), లైబ్రరీ డిజైన్ (NNK) 1-12 అని నిర్ధారిస్తుంది. ముఖ్యంగా, లైబ్రరీ సభ్యులలో సుమారు 11% మంది 12-డైమెన్షనల్ వైల్డ్-టైప్ (wt) బ్యాక్‌బోన్ PAGISRELVDKL ఇన్సర్ట్‌ను కలిగి ఉన్నారు మరియు దాదాపు సగం సీక్వెన్స్‌లు (49%) ఇన్సర్షన్‌లు లేదా తొలగింపులను కలిగి ఉన్నాయి. లైబ్రరీ లైబ్రరీ యొక్క HTS లైబ్రరీలో పెప్టైడ్‌ల యొక్క అధిక వైవిధ్యాన్ని నిర్ధారించింది: 81% కంటే ఎక్కువ పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్‌లు ఒక్కసారి మాత్రమే కనుగొనబడ్డాయి మరియు ≥4 కాపీలలో 1.5% మాత్రమే సంభవించాయి (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2a). రిపర్టరైటీలోని 12 స్థానాల్లోని అమైనో ఆమ్లాల (aa) ఫ్రీక్వెన్సీలు క్షీణించిన NKK రిపర్టరైటీ ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన కోడాన్‌ల సంఖ్యకు అంచనా వేసిన ఫ్రీక్వెన్సీలతో బాగా సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2b). ఈ ఇన్సర్ట్‌ల ద్వారా ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన aa అవశేషాల యొక్క గమనించిన ఫ్రీక్వెన్సీ లెక్కించిన ఫ్రీక్వెన్సీ (r = 0.893) (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2c)తో బాగా సంబంధం కలిగి ఉంది. ఇంజెక్షన్ కోసం ఫేజ్ లైబ్రరీల తయారీలో ఎండోటాక్సిన్ యొక్క విస్తరణ మరియు తొలగింపు దశలు ఉంటాయి. ఇది ఫేజ్ లైబ్రరీల వైవిధ్యాన్ని సమర్థవంతంగా తగ్గిస్తుందని గతంలో చూపబడింది 12,13. అందువల్ల, ఎండోటాక్సిన్ తొలగింపుకు గురైన ప్లేట్-యాంప్లిఫైడ్ ఫేజ్ లైబ్రరీని మేము క్రమం చేసాము మరియు AA యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీని అంచనా వేయడానికి దానిని అసలు లైబ్రరీతో పోల్చాము. అసలు పూల్ మరియు యాంప్లిఫైడ్ మరియు ప్యూరిఫైడ్ పూల్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2d) మధ్య బలమైన సహసంబంధం (r = 0.995) గమనించబడింది, ఇది T7 ఫేజ్ ఉపయోగించి ప్లేట్లపై విస్తరించిన క్లోన్‌ల మధ్య పోటీ ప్రధాన పక్షపాతానికి కారణం కాదని సూచిస్తుంది. ఈ పోలిక ప్రతి లైబ్రరీలోని ట్రిపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌ల ఫ్రీక్వెన్సీపై ఆధారపడి ఉంటుంది, ఎందుకంటే లైబ్రరీల వైవిధ్యం (~109) HTSతో కూడా పూర్తిగా సంగ్రహించబడదు. ప్రతి స్థానంలో aa యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీ విశ్లేషణ ఎంటర్ చేసిన రిపర్టరైటీ యొక్క చివరి మూడు స్థానాల్లో ఒక చిన్న స్థాన-ఆధారిత పక్షపాతాన్ని వెల్లడించింది (అనుబంధ ఫిగ్. 2e). ముగింపులో, లైబ్రరీ యొక్క నాణ్యత మరియు వైవిధ్యం ఆమోదయోగ్యమైనదని మరియు ఎంపిక యొక్క అనేక రౌండ్ల మధ్య ఫేజ్ లైబ్రరీల విస్తరణ మరియు తయారీ కారణంగా వైవిధ్యంలో చిన్న మార్పులు మాత్రమే గమనించబడ్డాయని మేము నిర్ధారించాము.
BBB మరియు/లేదా BCSFB (Fig. 1a-b) ద్వారా ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేయబడిన T7 ఫేజ్‌ను గుర్తించడం సులభతరం చేయడానికి స్పృహలో ఉన్న ఎలుకల CMలోకి శస్త్రచికిత్స ద్వారా కాన్యులాను అమర్చడం ద్వారా సీరియల్ సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ శాంప్లింగ్‌ను నిర్వహించవచ్చు (Fig. 1a-b). ఇన్ వివో సెలెక్షన్ యొక్క మొదటి మూడు రౌండ్లలో (Fig. 1c) మేము రెండు స్వతంత్ర ఎంపిక ఆయుధాలను (ఆర్మ్స్ A మరియు B) ఉపయోగించాము. ఎంపిక యొక్క మొదటి మూడు రౌండ్లలో ప్రవేశపెట్టిన ఫేజ్ మొత్తం మొత్తాన్ని తగ్గించడం ద్వారా మేము ఎంపిక యొక్క దృఢత్వాన్ని క్రమంగా పెంచాము. నాల్గవ రౌండ్ పానింగ్ కోసం, మేము A మరియు B శాఖల నుండి నమూనాలను కలిపి మూడు అదనపు స్వతంత్ర ఎంపికలను నిర్వహించాము. ఈ నమూనాలో T7 ఫేజ్ కణాల యొక్క ఇన్ వివో లక్షణాలను అధ్యయనం చేయడానికి, వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ (PAGISRELVDKL మాస్టర్ ఇన్సర్ట్) ను టెయిల్ సిర ద్వారా ఎలుకలలోకి ఇంజెక్ట్ చేశారు. వేర్వేరు సమయ బిందువులలో సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ మరియు రక్తం నుండి ఫేజ్‌లను పునరుద్ధరించడం వలన సాపేక్షంగా చిన్న T7 ఐకోసాహెడ్రల్ ఫేజ్‌లు రక్త కంపార్ట్‌మెంట్ నుండి వేగవంతమైన ప్రారంభ క్లియరెన్స్ దశను కలిగి ఉన్నాయని చూపించింది (అనుబంధ చిత్రం 3). ఎలుకలకు ఇచ్చిన టైటర్లు మరియు రక్త పరిమాణం ఆధారంగా, ఇంట్రావీనస్ ఇంజెక్షన్ తర్వాత 10 నిమిషాల తర్వాత రక్తంలో ఇచ్చిన మోతాదు నుండి సుమారు 1% wt. ఫేజ్ మాత్రమే కనుగొనబడిందని మేము లెక్కించాము. ఈ ప్రారంభ వేగవంతమైన క్షీణత తర్వాత, 27.7 నిమిషాల సగం జీవితకాలంతో నెమ్మదిగా ప్రాథమిక క్లియరెన్స్‌ను కొలుస్తారు. ముఖ్యంగా, CSF కంపార్ట్‌మెంట్ నుండి చాలా తక్కువ ఫేజ్‌లను మాత్రమే తిరిగి పొందారు, ఇది CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ వలసకు తక్కువ నేపథ్యాన్ని సూచిస్తుంది (అనుబంధ చిత్రం 3). సగటున, మొత్తం నమూనా వ్యవధిలో (0-250 నిమిషాలు) సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో రక్తంలో T7 ఫేజ్ యొక్క 1 x 10-3% టైటర్లు మరియు ప్రారంభంలో ఇన్ఫ్యూజ్ చేయబడిన ఫేజ్‌లలో 4 x 10-8% మాత్రమే కనుగొనబడ్డాయి. ముఖ్యంగా, సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ యొక్క సగం జీవితం (25.7 నిమిషాలు) రక్తంలో గమనించిన దానితో సమానంగా ఉంటుంది. ఈ డేటా CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌ను రక్తం నుండి వేరు చేసే అవరోధం CM-క్యాన్యులేటెడ్ ఎలుకలలో చెక్కుచెదరకుండా ఉందని నిరూపిస్తుంది, ఇది రక్తం నుండి CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి సులభంగా రవాణా చేయబడే క్లోన్‌లను గుర్తించడానికి ఫేజ్ లైబ్రరీల యొక్క వివో ఎంపికను అనుమతిస్తుంది.
(ఎ) పెద్ద కొలను నుండి సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ (CSF) ను తిరిగి నమూనా చేయడానికి ఒక పద్ధతిని ఏర్పాటు చేయడం. (బి) కేంద్ర నాడీ వ్యవస్థ (CNS) అవరోధం యొక్క సెల్యులార్ స్థానాన్ని మరియు రక్త-మెదడు అవరోధం (BBB) ​​మరియు రక్త-మెదడు అవరోధాన్ని దాటే పెప్టైడ్‌లను గుర్తించడానికి ఉపయోగించే ఎంపిక వ్యూహాన్ని చూపించే రేఖాచిత్రం. (సి) ఇన్ వివో ఫేజ్ డిస్ప్లే స్క్రీనింగ్ ఫ్లోచార్ట్. ఎంపిక యొక్క ప్రతి రౌండ్‌లో, ఫేజ్‌లు (బాణాల లోపల జంతువుల గుర్తింపుదారులు) ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి. 4వ రౌండ్ ఎంపిక వరకు రెండు స్వతంత్ర ప్రత్యామ్నాయ శాఖలు (A, B) విడిగా ఉంచబడతాయి. ఎంపిక రౌండ్లు 3 మరియు 4 కోసం, CSF నుండి సేకరించిన ప్రతి ఫేజ్ క్లోన్ మానవీయంగా క్రమం చేయబడింది. (డి) T7 పెప్టైడ్ లైబ్రరీ (2 x 1012 ఫేజ్‌లు/జంతువు) యొక్క ఇంట్రావీనస్ ఇంజెక్షన్ తర్వాత రెండు క్యాన్యులేటెడ్ ఎలుకలలో మొదటి రౌండ్ ఎంపిక సమయంలో రక్తం (ఎరుపు వృత్తాలు) మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ (ఆకుపచ్చ త్రిభుజాలు) నుండి వేరుచేయబడిన ఫేజ్ యొక్క కైనటిక్స్. నీలి చతురస్రాలు రక్తంలో ఫేజ్ యొక్క సగటు ప్రారంభ సాంద్రతను సూచిస్తాయి, మొత్తం రక్త పరిమాణాన్ని పరిగణనలోకి తీసుకుని, ఇంజెక్ట్ చేయబడిన ఫేజ్ మొత్తం నుండి లెక్కించబడతాయి. నల్ల చతురస్రాలు రక్త ఫేజ్ సాంద్రతల నుండి ఎక్స్‌ట్రాపోలేట్ చేయబడిన y లైన్ యొక్క ఖండన బిందువును సూచిస్తాయి. (e,f) పెప్టైడ్‌లో కనిపించే అన్ని సాధ్యమైన అతివ్యాప్తి చెందుతున్న ట్రిపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌ల సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీ మరియు పంపిణీని ప్రదర్శించండి. 1000 రీడింగ్‌లలో కనుగొనబడిన అన్ని మోటిఫ్‌ల సంఖ్య చూపబడింది. గణనీయంగా (p < 0.001) సుసంపన్నమైన మోటిఫ్‌లు ఎరుపు చుక్కలతో గుర్తించబడ్డాయి. (e) ఇంజెక్ట్ చేయబడిన లైబ్రరీ యొక్క ట్రిపెప్టైడ్ మోటిఫ్ యొక్క సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీని జంతువుల నుండి రక్తం-ఉత్పన్నమైన ఫేజ్‌తో పోల్చిన సహసంబంధ స్కాటర్‌ప్లాట్ #1.1 మరియు #1.2. (f) రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో వేరుచేయబడిన జంతువుల ఫేజ్ ట్రిపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌లు #1.1 మరియు #1.2 యొక్క సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీలను పోల్చిన సహసంబంధ స్కాటర్‌ప్లాట్. (g, h) రెండు జంతువులలో ఇన్ వివో ఎంపిక రౌండ్ తర్వాత రక్తంలో సమృద్ధిగా ఉన్న ఫేజ్ (g) మరియు ఇంజెక్ట్ చేయబడిన లైబ్రరీలలో సమృద్ధిగా ఉన్న ఫేజ్ వర్సెస్ రక్తం యొక్క సీక్వెన్స్ ID ప్రాతినిధ్యం. ఒకే అక్షర కోడ్ పరిమాణం ఆ అమైనో ఆమ్లం ఆ స్థానంలో ఎంత తరచుగా సంభవిస్తుందో సూచిస్తుంది. ఆకుపచ్చ = ధ్రువ, ఊదా = తటస్థ, నీలం = ప్రాథమిక, ఎరుపు = ఆమ్ల మరియు నలుపు = హైడ్రోఫోబిక్ అమైనో ఆమ్లాలు. చిత్రం 1a, b ను ఎడ్వర్డ్ ఉరిచ్ రూపొందించారు మరియు ఉత్పత్తి చేశారు.
మేము రెండు CM ఇన్స్ట్రుమెంట్ ఎలుకలలోకి (క్లాడ్‌లు A మరియు B) ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీని మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ మరియు రక్తం నుండి వివిక్త ఫేజ్‌ను ఇంజెక్ట్ చేసాము (మూర్తి 1d). వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్‌తో పోలిస్తే లైబ్రరీ యొక్క ప్రారంభ వేగవంతమైన క్లియరెన్స్ తక్కువగా ఉంది. రెండు జంతువులలో ఇంజెక్ట్ చేయబడిన లైబ్రరీ యొక్క సగటు సగం జీవితం వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ మాదిరిగానే రక్తంలో 24.8 నిమిషాలు మరియు CSFలో 38.5 నిమిషాలు. ప్రతి జంతువు నుండి రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ ఫేజ్ నమూనాలను HTSకి గురి చేశారు మరియు గుర్తించబడిన అన్ని పెప్టైడ్‌లను చిన్న ట్రిపెప్టైడ్ మోటిఫ్ ఉనికి కోసం విశ్లేషించారు. ట్రిపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌లు నిర్మాణ నిర్మాణం మరియు పెప్టైడ్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలకు కనీస ఆధారాన్ని అందిస్తాయి కాబట్టి వాటిని ఎంచుకున్నారు. ఇంజెక్ట్ చేయబడిన ఫేజ్ లైబ్రరీ మరియు రెండు జంతువుల రక్తం నుండి సేకరించిన క్లోన్‌ల మధ్య మోటిఫ్‌ల పంపిణీలో మేము మంచి సహసంబంధాన్ని కనుగొన్నాము (మూర్తి 1e). లైబ్రరీ యొక్క కూర్పు రక్త విభాగంలో స్వల్పంగా మాత్రమే సమృద్ధిగా ఉందని డేటా సూచిస్తుంది. Weblogo16 సాఫ్ట్‌వేర్ యొక్క అనుసరణను ఉపయోగించి ప్రతి స్థానంలో అమైనో ఆమ్ల పౌనఃపున్యాలు మరియు ఏకాభిప్రాయ శ్రేణులను మరింత విశ్లేషించారు. ఆసక్తికరంగా, మేము రక్త గ్లైసిన్ అవశేషాలలో బలమైన సుసంపన్నతను కనుగొన్నాము (Fig. 1g). CSF నుండి ఎంపిక చేయబడిన క్లోన్‌లతో రక్తాన్ని పోల్చినప్పుడు, బలమైన ఎంపిక మరియు మోటిఫ్‌ల ఎంపికను తొలగించడం గమనించబడింది (Fig. 1f), మరియు 12-సభ్యులలో ముందుగా నిర్ణయించిన స్థానాల్లో కొన్ని అమైనో ఆమ్లాలు ప్రాధాన్యతగా ఉన్నాయి (Fig. 1h). ముఖ్యంగా, వ్యక్తిగత జంతువులు సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో గణనీయంగా భిన్నంగా ఉన్నాయి, అయితే రెండు జంతువులలో రక్త గ్లైసిన్ సుసంపన్నత గమనించబడింది (అనుబంధ Fig. 4a-j). #1.1 మరియు #1.2 జంతువుల సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో సీక్వెన్స్ డేటాను కఠినంగా వడపోత చేసిన తర్వాత, మొత్తం 964 మరియు 420 ప్రత్యేకమైన 12-మెర్ పెప్టైడ్‌లను పొందారు (అనుబంధ Fig. 1d-e). వివిక్త ఫేజ్ క్లోన్‌లను విస్తరించారు మరియు రెండవ రౌండ్ ఇన్ వివో ఎంపికకు గురిచేశారు. రెండవ రౌండ్ ఎంపిక నుండి సేకరించిన ఫేజ్‌ను ప్రతి జంతువులో HTSకి గురి చేశారు మరియు గుర్తించబడిన అన్ని పెప్టైడ్‌లను ట్రైపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌ల సంభవనీయతను విశ్లేషించడానికి మోటిఫ్ గుర్తింపు ప్రోగ్రామ్‌కు ఇన్‌పుట్‌గా ఉపయోగించారు (Fig. 2a, b, ef). CSF నుండి కోలుకున్న ఫేజ్ యొక్క మొదటి చక్రంతో పోలిస్తే, A మరియు B శాఖలలో CSFలోని అనేక మోటిఫ్‌ల యొక్క మరింత ఎంపిక మరియు ఎంపికను తీసివేయడాన్ని మేము గమనించాము (Fig. 2). అవి స్థిరమైన క్రమం యొక్క విభిన్న నమూనాలను సూచిస్తాయో లేదో తెలుసుకోవడానికి నెట్‌వర్క్ గుర్తింపు అల్గోరిథం వర్తించబడింది. ప్రత్యామ్నాయ క్లాడ్ A (Fig. 2c, d) మరియు క్లాడ్ B (Fig. 2g, h)లో CSF ద్వారా కోలుకున్న 12-డైమెన్షనల్ సీక్వెన్స్‌ల మధ్య స్పష్టమైన సారూప్యత గమనించబడింది. ప్రతి శాఖలోని పూల్ చేయబడిన విశ్లేషణ 12-మెర్ పెప్టైడ్‌ల కోసం వేర్వేరు ఎంపిక ప్రొఫైల్‌లను (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 5c,d) వెల్లడించింది మరియు రెండవ రౌండ్ ఎంపిక తర్వాత పూల్ చేయబడిన క్లోన్‌ల కోసం కాలక్రమేణా CSF/బ్లడ్ టైటర్ నిష్పత్తిలో పెరుగుదల మొదటి రౌండ్ ఎంపికతో పోలిస్తే (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 5e). ).
ఇన్ వివో ఫంక్షనల్ ఫేజ్ డిస్ప్లే ఎంపిక యొక్క రెండు వరుస రౌండ్ల ద్వారా సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో మోటిఫ్‌లు మరియు పెప్టైడ్‌ల సుసంపన్నత.
ప్రతి జంతువు యొక్క మొదటి రౌండ్ నుండి (జంతువులు #1.1 మరియు #1.2) కోలుకున్న అన్ని సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ ఫేజ్‌లను పూల్ చేసి, యాంప్లిఫైడ్ చేసి, HT-సీక్వెన్స్ చేసి, కలిసి తిరిగి ఇంజెక్ట్ చేశారు (2 x 1010 ఫేజ్‌లు/జంతువు) 2 SM క్యాన్యులేటెడ్ ఎలుకలు (#1.1 → #). 2.1 మరియు 2.2, 1.2 → 2.3 మరియు 2.4). (a,b,e,f) మొదటి మరియు రెండవ ఎంపిక రౌండ్లలోని అన్ని CSF-ఉత్పన్న ఫేజ్‌ల యొక్క ట్రిపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌ల సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీని పోల్చిన సహసంబంధ స్కాటర్‌ప్లాట్‌లు. రెండు ఓరియంటేషన్‌లలో పెప్టైడ్‌లలో కనిపించే అన్ని సాధ్యమైన అతివ్యాప్తి చెందుతున్న ట్రిపెప్టైడ్‌లను సూచించే మోటిఫ్‌ల సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీ మరియు పంపిణీ. 1000 రీడింగ్‌లలో కనుగొనబడిన మోటిఫ్‌ల సంఖ్య చూపబడింది. పోల్చబడిన లైబ్రరీలలో ఒకదానిలో గణనీయంగా (p < 0.001) ఎంచుకున్న లేదా మినహాయించబడిన మోటిఫ్‌లు ఎరుపు చుక్కలతో హైలైట్ చేయబడ్డాయి. (c, d, g, h) ఇన్ వివో ఎంపిక యొక్క రౌండ్లు 2 మరియు 1 ఆధారంగా అన్ని CSF-రిచ్ 12 అమైనో ఆమ్ల దీర్ఘ శ్రేణుల శ్రేణి లోగో ప్రాతినిధ్యం. ఒక-అక్షర కోడ్ యొక్క పరిమాణం ఆ అమైనో ఆమ్లం ఆ స్థానంలో ఎంత తరచుగా సంభవిస్తుందో సూచిస్తుంది. లోగోను సూచించడానికి, రెండు ఎంపిక రౌండ్ల మధ్య వ్యక్తిగత జంతువుల నుండి సేకరించిన CSF శ్రేణుల ఫ్రీక్వెన్సీని పోల్చారు మరియు రెండవ రౌండ్‌లోని సుసంపన్నమైన శ్రేణులు చూపబడ్డాయి: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 మరియు (h) #1.2–#2.4. జంతువుల సంఖ్య 2.3 మరియు సంఖ్య 2.4 లో (c, d) జంతువుల సంఖ్య 2.1 మరియు సంఖ్య 2.2 లేదా (g, h) ఇచ్చిన స్థానంలో అత్యంత సుసంపన్నమైన అమైనో ఆమ్లాలు రంగులో చూపబడ్డాయి. ఆకుపచ్చ = ధ్రువ, ఊదా = తటస్థ, నీలం = ప్రాథమిక, ఎరుపు = ఆమ్ల మరియు నలుపు = హైడ్రోఫోబిక్ అమైనో ఆమ్లాలు.
మూడవ రౌండ్ ఎంపిక తర్వాత, రెండు జంతువుల నుండి వేరుచేయబడిన 332 CSF-పునర్నిర్మించిన ఫేజ్ క్లోన్‌ల నుండి 124 ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్‌లను (#3.1 మరియు #3.2) మేము గుర్తించాము (అనుబంధ చిత్రం 6a). LGSVS (18.7%) సీక్వెన్స్ అత్యధిక సాపేక్ష నిష్పత్తిని కలిగి ఉంది, తరువాత వైల్డ్-టైప్ ఇన్సర్ట్‌లు PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) మరియు SARGSWREIVSLS (2.2%) ఉన్నాయి. చివరి నాల్గవ రౌండ్‌లో, మేము మూడు వేర్వేరు జంతువుల నుండి స్వతంత్రంగా ఎంచుకున్న రెండు శాఖలను పూల్ చేసాము (చిత్రం 1c). CSF నుండి కోలుకున్న 925 సీక్వెన్స్డ్ ఫేజ్ క్లోన్‌లలో, నాల్గవ రౌండ్‌లో మేము 64 ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్‌లను కనుగొన్నాము (అనుబంధ చిత్రం 6b), వీటిలో వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ యొక్క సాపేక్ష నిష్పత్తి 0.8%కి పడిపోయింది. నాల్గవ రౌండ్‌లో అత్యంత సాధారణ CSF క్లోన్‌లు LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) మరియు RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). NNK లైబ్రరీ డిజైన్ కోసం డీజెనరేట్ కోడాన్‌లను ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు ఎంచుకున్న పెప్టైడ్‌ల పొడవు పరిధి లైబ్రరీ ప్రైమర్‌లలో న్యూక్లియోటైడ్ ఇన్సర్షన్‌లు/తొలగింపులు లేదా అకాల స్టాప్ కోడాన్‌ల కారణంగా ఉంటుంది. అకాల స్టాప్ కోడాన్‌లు తక్కువ పెప్టైడ్‌లను ఉత్పత్తి చేస్తాయి మరియు అవి అనుకూలమైన aa మోటిఫ్‌ను కలిగి ఉన్నందున ఎంపిక చేయబడతాయి. సింథటిక్ లైబ్రరీల ప్రైమర్‌లలో ఇన్సర్షన్‌లు/తొలగింపుల వల్ల పొడవైన పెప్టైడ్‌లు సంభవించవచ్చు. ఇది రూపొందించిన స్టాప్ కోడాన్‌ను ఫ్రేమ్ వెలుపల ఉంచుతుంది మరియు కొత్త స్టాప్ కోడాన్ దిగువన కనిపించే వరకు దానిని చదువుతుంది. సాధారణంగా, ఇన్‌పుట్ డేటాను నమూనా అవుట్‌పుట్ డేటాతో పోల్చడం ద్వారా మేము నాలుగు ఎంపిక రౌండ్‌ల కోసం సుసంపన్న కారకాలను లెక్కించాము. మొదటి రౌండ్ స్క్రీనింగ్ కోసం, మేము వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ టైటర్‌లను నాన్-స్పెసిఫిక్ బ్యాక్‌గ్రౌండ్ రిఫరెన్స్‌గా ఉపయోగించాము. ఆసక్తికరంగా, మొదటి CSF చక్రంలో నెగటివ్ ఫేజ్ ఎంపిక చాలా బలంగా ఉంది, కానీ రక్తంలో కాదు (Fig. 3a), ఇది పెప్టైడ్ లైబ్రరీలోని చాలా మంది సభ్యులను CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి నిష్క్రియాత్మక వ్యాప్తి చెందే తక్కువ సంభావ్యత లేదా సాపేక్ష ఫేజ్‌లు బాక్టీరియోఫేజ్‌ల కంటే రక్తప్రవాహం నుండి మరింత సమర్థవంతంగా నిలుపుకోబడతాయి లేదా తొలగించబడతాయి. అయితే, రెండవ రౌండ్ ప్యానింగ్‌లో, CSFలో ఫేజ్‌ల బలమైన ఎంపిక రెండు క్లాడ్‌లలో గమనించబడింది, మునుపటి రౌండ్ CSF తీసుకోవడం ప్రోత్సహించే పెప్టైడ్‌లను ప్రదర్శించే ఫేజ్‌లలో సమృద్ధిగా ఉందని సూచిస్తుంది (Fig. 3a). మళ్ళీ, గణనీయమైన రక్త సుసంపన్నత లేకుండా. మూడవ మరియు నాల్గవ రౌండ్లలో కూడా, ఫేజ్ క్లోన్‌లు CSFలో గణనీయంగా సమృద్ధిగా ఉన్నాయి. చివరి రెండు రౌండ్ల ఎంపిక మధ్య ప్రతి ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్ యొక్క సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీని పోల్చినప్పుడు, నాల్గవ రౌండ్ ఎంపికలో సీక్వెన్స్‌లు మరింత సమృద్ధిగా ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము (Fig. 3b). రెండు పెప్టైడ్ ధోరణులను ఉపయోగించి మొత్తం 64 ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్ సీక్వెన్సుల నుండి మొత్తం 931 ట్రిపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌లను సంగ్రహించారు. ఇంజెక్ట్ చేయబడిన లైబ్రరీతో పోలిస్తే (కట్-ఆఫ్: 10% ఎన్రిచ్‌మెంట్) అన్ని రౌండ్లలో వాటి ఎన్రిచ్‌మెంట్ ప్రొఫైల్‌ల కోసం నాల్గవ రౌండ్‌లోని అత్యంత ఎన్రిచ్‌మెంట్ మోటిఫ్‌లను మరింత నిశితంగా పరిశీలించారు (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 6c). ఎంపిక యొక్క సాధారణ నమూనాలు అధ్యయనం చేయబడిన మోటిఫ్‌లలో ఎక్కువ భాగం రెండు ఎంపిక శాఖల యొక్క అన్ని మునుపటి రౌండ్లలో సమృద్ధిగా ఉన్నాయని చూపించాయి. అయితే, కొన్ని మోటిఫ్‌లు (ఉదా. SGL, VSG, LGS GSV) ప్రధానంగా ప్రత్యామ్నాయ క్లాడ్ A నుండి వచ్చాయి, మరికొన్ని (ఉదా. FGW, RTN, WGF, NTR) ప్రత్యామ్నాయ క్లాడ్ B లో సమృద్ధిగా ఉన్నాయి.
స్ట్రెప్టావిడిన్ పేలోడ్‌లతో సంయోగం చేయబడిన CSF-సుసంపన్నమైన ఫేజ్-డిస్ప్లేడ్ పెప్టైడ్‌లు మరియు బయోటినిలేటెడ్ లీడర్ పెప్టైడ్‌ల CSF రవాణా యొక్క ధ్రువీకరణ.
(ఎ) ఇంజెక్ట్ చేయబడిన (ఇన్‌పుట్ = I) ఫేజ్ (PFU) టైటర్‌లు మరియు నిర్ణయించబడిన CSF ఫేజ్ టైటర్‌లు (అవుట్‌పుట్ = O) ఆధారంగా నాలుగు రౌండ్‌లలో లెక్కించబడిన ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ నిష్పత్తులు. చివరి మూడు రౌండ్‌ల (R2-R4) కోసం ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ కారకాలను మునుపటి రౌండ్ మరియు మొదటి రౌండ్ (R1) తో బరువు డేటాతో పోల్చడం ద్వారా లెక్కించారు. ఓపెన్ బార్‌లు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్, షేడెడ్ బార్‌లు ప్లాస్మా. (***p<0.001, స్టూడెంట్స్ టి-టెస్ట్ ఆధారంగా). (బి) ఎంపిక యొక్క రౌండ్ 4 తర్వాత CSFలో సేకరించిన అన్ని ఫేజ్‌లకు వాటి సాపేక్ష నిష్పత్తి ప్రకారం ర్యాంక్ చేయబడిన అత్యంత సమృద్ధిగా ఉన్న ఫేజ్ పెప్టైడ్‌ల జాబితా. ఎంపిక యొక్క రౌండ్ 3 మరియు 4 (ఇన్‌సెట్‌లు) మధ్య ఆరు అత్యంత సుసంపన్నమైన ఫేజ్ క్లోన్‌లు, ఖాళీ ఫేజ్ మరియు పేరెంటల్ ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీలు రంగులో హైలైట్ చేయబడ్డాయి, సంఖ్యాపరంగా మరియు వాటి సుసంపన్న కారకాలలో హైలైట్ చేయబడ్డాయి. (సి,డి) రౌండ్ 4 నుండి ఆరు అత్యంత సుసంపన్నమైన ఫేజ్ క్లోన్‌లు, ఖాళీ ఫేజ్ మరియు పేరెంటల్ ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీలు CSF నమూనా నమూనాలో వ్యక్తిగతంగా విశ్లేషించబడ్డాయి. సూచించిన సమయ బిందువుల వద్ద CSF మరియు రక్త నమూనాలను సేకరించారు. (సి) సమాన మొత్తంలో 6 అభ్యర్థి ఫేజ్ క్లోన్‌లు (2 x 1010 ఫేజ్‌లు/జంతువులు), ఖాళీ ఫేజ్‌లు (#1779) (2 x 1010 ఫేజ్‌లు/జంతువులు) మరియు స్టాక్ ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీలు (2 x 1012 ఫేజ్‌లు/జంతువులు) ఇంజెక్ట్ చేయండి కనీసం 3 CMలను టెయిల్ సిర ద్వారా విడిగా క్యాన్యులేటెడ్ జంతువుకు ఇంజెక్ట్ చేస్తారు. కాలక్రమేణా ప్రతి ఇంజెక్ట్ చేయబడిన ఫేజ్ క్లోన్ మరియు ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీ యొక్క CSF ఫార్మకోకైనటిక్స్ చూపబడ్డాయి. (డి) నమూనా సమయంలో అన్ని కోలుకున్న ఫేజ్‌లు/mL కోసం సగటు CSF/రక్త నిష్పత్తిని చూపిస్తుంది. (ఇ) నాలుగు సింథటిక్ లీడర్ పెప్టైడ్‌లు మరియు ఒక స్క్రాంబుల్డ్ కంట్రోల్‌ను బయోటిన్‌తో స్ట్రెప్టావిడిన్‌కు వాటి N-టెర్మినస్ (టెట్రామర్ డిస్‌ప్లే) ద్వారా అనుసంధానించారు, తరువాత ఇంజెక్షన్ (టెయిల్ సిర iv, 10 mg స్ట్రెప్టావిడిన్/kg). కనీసం మూడు ఇంట్యూబేటెడ్ ఎలుకలు (N = 3). ). సూచించిన సమయ బిందువుల వద్ద CSF నమూనాలను సేకరించారు మరియు స్ట్రెప్టావిడిన్ సాంద్రతలను CSF యాంటీ-స్ట్రెప్టావిడిన్ ELISA (nd = కనుగొనబడలేదు) ద్వారా కొలుస్తారు. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA పరీక్ష ఆధారంగా). (f) అత్యంత సుసంపన్నమైన ఫేజ్ పెప్టైడ్ క్లోన్ #2002 (ఊదా) యొక్క అమైనో ఆమ్ల శ్రేణిని 4వ రౌండ్ ఎంపిక నుండి ఇతర ఎంచుకున్న ఫేజ్ పెప్టైడ్ క్లోన్‌లతో పోల్చడం. ఒకేలాంటి మరియు సారూప్యమైన అమైనో ఆమ్ల శకలాలు రంగు-కోడ్ చేయబడ్డాయి.
నాల్గవ రౌండ్‌లోని అన్ని సుసంపన్నమైన ఫేజ్‌లలో (Fig. 3b), CSF నమూనా నమూనాలో తదుపరి వ్యక్తిగత విశ్లేషణ కోసం ఆరు అభ్యర్థి క్లోన్‌లను ఎంపిక చేశారు. సమాన మొత్తంలో ఆరు అభ్యర్థి ఫేజ్, ఖాళీ ఫేజ్ (ఇన్సర్ట్ లేదు) మరియు ప్రొఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీలను మూడు క్యాన్యులేటెడ్ CM జంతువులలోకి ఇంజెక్ట్ చేశారు మరియు CSF (Fig. 3c) మరియు రక్తం (సప్లిమెంటరీ Fig. 7) పరీక్షలలో ఫార్మకోకైనటిక్స్ నిర్ణయించబడ్డాయి. పరీక్షించిన అన్ని ఫేజ్ క్లోన్‌లు ఖాళీ నియంత్రణ ఫేజ్ (#1779) కంటే 10-1000 రెట్లు ఎక్కువ స్థాయిలో CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌ను లక్ష్యంగా చేసుకున్నాయి. ఉదాహరణకు, క్లోన్‌లు #2020 మరియు #2077 కంట్రోల్ ఫేజ్ కంటే 1000 రెట్లు ఎక్కువ CSF టైటర్‌లను కలిగి ఉన్నాయి. ఎంచుకున్న ప్రతి పెప్టైడ్ యొక్క ఫార్మకోకైనటిక్ ప్రొఫైల్ భిన్నంగా ఉంటుంది, కానీ అవన్నీ అధిక CSF హోమింగ్ సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటాయి. #1903 మరియు #2011 క్లోన్‌లకు కాలక్రమేణా స్థిరమైన తగ్గుదలని మేము గమనించాము, అయితే #2077, #2002 మరియు #2009 క్లోన్‌లకు మొదటి 10 నిమిషాలలో పెరుగుదల క్రియాశీల రవాణాను సూచిస్తుందని కానీ ధృవీకరించాల్సిన అవసరం ఉంది. క్లోన్‌లు #2020, #2002, మరియు #2077 అధిక స్థాయిలో స్థిరీకరించబడ్డాయి, అయితే క్లోన్ #2009 యొక్క CSF సాంద్రత ప్రారంభ పెరుగుదల తర్వాత నెమ్మదిగా తగ్గింది. అప్పుడు మేము ప్రతి CSF అభ్యర్థి యొక్క సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీని దాని రక్త సాంద్రతతో పోల్చాము (Fig. 3d). అన్ని నమూనా సమయాల్లో ప్రతి CSF అభ్యర్థి యొక్క సగటు టైటర్ దాని రక్త టైటర్‌తో సహసంబంధం ఆరు అభ్యర్థులలో ముగ్గురు రక్త CSFలో గణనీయంగా సమృద్ధిగా ఉన్నారని చూపించింది. ఆసక్తికరంగా, క్లోన్ #2077 అధిక రక్త స్థిరత్వాన్ని చూపించింది (అనుబంధ చిత్రం 7). పెప్టైడ్‌లు ఫేజ్ కణాల కంటే ఇతర సరుకును CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి చురుకుగా రవాణా చేయగలవని నిర్ధారించడానికి, పెప్టైడ్‌లు ఫేజ్ కణానికి జతచేయబడిన N-టెర్మినస్ వద్ద బయోటిన్‌తో ఉత్పన్నమైన నాలుగు లీడర్ పెప్టైడ్‌లను మేము సంశ్లేషణ చేసాము. బయోటైనిలేటెడ్ పెప్టైడ్‌లను (సంఖ్యలు 2002, 2009, 2020 మరియు 2077) స్ట్రెప్టావిడిన్ (SA)తో సంయోగం చేసి ఫేజ్ జ్యామితిని కొంతవరకు అనుకరించే మల్టీమెరిక్ రూపాలను పొందారు. ఈ ఫార్మాట్ రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో SA ఎక్స్‌పోజర్‌ను కార్గో-ట్రాన్స్‌పోర్టింగ్ ప్రోటీన్ పెప్టైడ్‌లుగా కొలవడానికి కూడా మాకు వీలు కల్పించింది. ముఖ్యంగా, ఈ SA-కంజుగేటెడ్ ఫార్మాట్‌లో సింథటిక్ పెప్టైడ్‌లను నిర్వహించినప్పుడు ఫేజ్ డేటాను తరచుగా పునరుత్పత్తి చేయవచ్చు (Fig. 3e). స్క్రాంబుల్డ్ పెప్టైడ్‌లు 48 గంటల్లోపు గుర్తించలేని స్థాయిలతో తక్కువ ప్రారంభ ఎక్స్‌పోజర్ మరియు వేగవంతమైన CSF క్లియరెన్స్‌ను కలిగి ఉన్నాయి. ఈ పెప్టైడ్ ఫేజ్ క్లోన్‌ల డెలివరీ మార్గాలపై అంతర్దృష్టిని పొందడానికి, CSF స్థలంలో ఇంట్రావీనస్ ఇంజెక్షన్ తర్వాత 1 గంట తర్వాత ఫేజ్ కణాలను నేరుగా గుర్తించడానికి ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ (IHC)ని ఉపయోగించి వ్యక్తిగత ఫేజ్ పెప్టైడ్ హిట్‌ల స్థానికీకరణను మేము విశ్లేషించాము. ముఖ్యంగా, క్లోన్లు #2002, #2077, మరియు #2009 మెదడు కేశనాళికలలో బలమైన మరకలు వేయడం ద్వారా గుర్తించబడవచ్చు, అయితే నియంత్రణ ఫేజ్ (#1779) మరియు క్లోన్ #2020 కనుగొనబడలేదు (అనుబంధ చిత్రం 8). ఈ పెప్టైడ్‌లు BBBని దాటడం ద్వారా మెదడుపై ప్రభావానికి దోహదం చేస్తాయని ఇది సూచిస్తుంది. ఈ పరికల్పనను పరీక్షించడానికి మరింత వివరణాత్మక విశ్లేషణ అవసరం, ఎందుకంటే BSCFB మార్గం కూడా ఇందులో ఉండవచ్చు. అత్యంత సుసంపన్నమైన క్లోన్ (#2002) యొక్క అమైనో ఆమ్ల శ్రేణిని ఇతర ఎంచుకున్న పెప్టైడ్‌లతో పోల్చినప్పుడు, వాటిలో కొన్ని సారూప్య అమైనో ఆమ్ల పొడిగింపులను కలిగి ఉన్నాయని గమనించబడింది, ఇది సారూప్య రవాణా విధానాన్ని సూచిస్తుంది (చిత్రం 3f).
దాని ప్రత్యేకమైన ప్లాస్మా ప్రొఫైల్ మరియు కాలక్రమేణా CSFలో గణనీయమైన పెరుగుదల కారణంగా, ఫేజ్ డిస్ప్లే క్లోన్ #2077 48 గంటల పాటు మరింతగా అన్వేషించబడింది మరియు స్థిరమైన SA స్థాయిలతో అనుబంధంగా గమనించిన CSFలో వేగవంతమైన పెరుగుదలను పునరుత్పత్తి చేయగలిగింది (Fig. 4a). గుర్తించబడిన ఇతర ఫేజ్ క్లోన్‌లకు సంబంధించి, #2077 మెదడు కేశనాళికల కోసం బలంగా మరకలు పడ్డాయి మరియు అధిక రిజల్యూషన్‌లో చూసినప్పుడు కేశనాళిక మార్కర్ లెక్టిన్‌తో గణనీయమైన కోలోకలైజేషన్‌ను చూపించింది మరియు బహుశా పరేన్‌చైమల్ స్పేస్‌లో కొంత మరకలు కనిపించవచ్చు (Fig. 4b). CNSలో పెప్టైడ్-మధ్యవర్తిత్వ ఔషధ ప్రభావాలను పొందవచ్చో లేదో పరిశోధించడానికి, మేము i) #2077 ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్ మరియు ii) యొక్క బయోటినిలేటెడ్ వెర్షన్‌లు BACE1 ఇన్హిబిటర్ పెప్టైడ్‌ను రెండు వేర్వేరు నిష్పత్తులలో SAతో కలిపిన ఒక ప్రయోగాన్ని నిర్వహించాము. ఒక కలయిక కోసం మేము BACE1 పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్‌ను మాత్రమే ఉపయోగించాము మరియు మరొకదానికి మేము 1:3 నిష్పత్తి BACE1 పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్‌ను #2077 పెప్టైడ్‌కు ఉపయోగించాము. రెండు నమూనాలను ఇంట్రావీనస్‌గా ఇచ్చారు మరియు బీటా-అమిలాయిడ్ పెప్టైడ్ 40 (అబెటా40) యొక్క రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవ స్థాయిలను కాలక్రమేణా కొలుస్తారు. మెదడు పరేన్చైమాలో BACE1 నిరోధాన్ని ప్రతిబింబిస్తుంది కాబట్టి అబెటా40 ను CSF లో కొలుస్తారు. ఊహించినట్లుగా, రెండు కాంప్లెక్స్‌లు అబెటా40 యొక్క రక్త స్థాయిలను గణనీయంగా తగ్గించాయి (Fig. 4c, d). అయితే, పెప్టైడ్ నం. 2077 మిశ్రమం మరియు SA తో సంయోగం చేయబడిన BACE1 పెప్టైడ్ యొక్క నిరోధకం కలిగిన నమూనాలు మాత్రమే సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో అబెటా40 లో గణనీయమైన తగ్గుదలకు కారణమయ్యాయి (Fig. 4c). పెప్టైడ్ నం. 2077 60 kDa SA ప్రోటీన్‌ను CNS లోకి రవాణా చేయగలదని మరియు BACE1 పెప్టైడ్ యొక్క SA-సంయోగ నిరోధకాలతో ఔషధ ప్రభావాలను కూడా ప్రేరేపిస్తుందని డేటా చూపిస్తుంది.
(ఎ) కనీసం మూడు CM-ఇంట్యూబేటెడ్ ఎలుకలలో CSF పెప్టైడ్ #2077 (RLSSVDSDLSGC) మరియు ఇంజెక్ట్ చేయని కంట్రోల్ ఫేజ్ (#1779) యొక్క దీర్ఘకాలిక ఫార్మకోకైనటిక్ ప్రొఫైల్‌లను చూపించే T7 ఫేజ్ యొక్క క్లోనల్ ఇంజెక్షన్ (2 × 10 ఫేజ్‌లు/జంతువు). (బి) ఫేజ్-ఇంజెక్ట్ చేయబడిన ఎలుకలలో (2 × 10 10 ఫేజ్‌లు/జంతువు) ప్రాతినిధ్య కార్టికల్ మైక్రోవెసెల్స్ యొక్క కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపిక్ చిత్రం పెప్టైడ్ #2077 మరియు నాళాలు (లెక్టిన్) యొక్క ప్రతిరూప మరకను చూపిస్తుంది. ఈ ఫేజ్ క్లోన్‌లను 3 ఎలుకలకు అందించారు మరియు పెర్ఫ్యూజన్ చేయడానికి ముందు 1 గంట పాటు ప్రసరించనివ్వండి. మెదడులను విభజించి, T7 ఫేజ్ క్యాప్సిడ్‌కు వ్యతిరేకంగా పాలిక్లోనల్ FITC-లేబుల్ చేయబడిన యాంటీబాడీలతో మరకలు వేయబడ్డాయి. పెర్ఫ్యూజన్ మరియు తదుపరి స్థిరీకరణకు పది నిమిషాల ముందు, DyLight594-లేబుల్ చేయబడిన లెక్టిన్‌ను ఇంట్రావీనస్ ద్వారా ఇచ్చారు. కేశనాళికలు మరియు పెరివాస్కులర్ మెదడు కణజాలం యొక్క ల్యూమన్‌లో మైక్రోవెసెల్స్ మరియు ఫేజ్‌ల (ఆకుపచ్చ) యొక్క లూమినల్ వైపు లెక్టిన్ మరక (ఎరుపు)ను చూపించే ఫ్లోరోసెంట్ చిత్రాలు. స్కేల్ బార్ 10 µm కు అనుగుణంగా ఉంటుంది. (c, d) బయోటినిలేటెడ్ BACE1 ఇన్హిబిటరీ పెప్టైడ్‌ను ఒంటరిగా లేదా బయోటినిలేటెడ్ ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్ #2077 తో కలిపి స్ట్రెప్టావిడిన్‌కు జత చేశారు, తరువాత కనీసం మూడు క్యాన్యులేటెడ్ CM ఎలుకలను (10 mg స్ట్రెప్టావిడిన్/kg) ఇంట్రావీనస్ ఇంజెక్షన్ చేశారు. Aβ40లో BACE1 పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్-మధ్యవర్తిత్వ తగ్గింపును సూచించిన సమయ బిందువుల వద్ద రక్తం (ఎరుపు) మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవం (నారింజ)లో Aβ1-40 ELISA ద్వారా కొలుస్తారు. మెరుగైన స్పష్టత కోసం, గ్రాఫ్‌పై 100% స్కేల్‌లో చుక్కల రేఖను గీస్తారు. (సి) 3:1 నిష్పత్తిలో ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్ #2077 మరియు BACE1 ఇన్హిబిటరీ పెప్టైడ్‌తో కలిపి స్ట్రెప్టావిడిన్‌తో చికిత్స పొందిన ఎలుకలలో రక్తంలో (ఎరుపు త్రిభుజాలు) మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో (నారింజ త్రిభుజాలు) Aβ40 శాతం తగ్గింపు. (డి) BACE1 ఇన్హిబిటరీ పెప్టైడ్‌తో మాత్రమే కలిపి స్ట్రెప్టావిడిన్‌తో చికిత్స పొందిన ఎలుకలలో రక్తంలో Aβ40 (ఎరుపు వృత్తాలు) మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో (నారింజ వృత్తాలు) శాతం తగ్గింపు. నియంత్రణలో Aβ సాంద్రత 420 pg/ml (ప్రామాణిక విచలనం = 101 pg/ml).
బయోమెడికల్ పరిశోధనలోని అనేక రంగాలలో ఫేజ్ డిస్ప్లే విజయవంతంగా వర్తింపజేయబడింది17. ఈ పద్ధతిని ఇన్ వివో వాస్కులర్ వైవిధ్య అధ్యయనాలకు [18,19] అలాగే సెరిబ్రల్ నాళాలను లక్ష్యంగా చేసుకున్న అధ్యయనాలకు [20,21,22,23,24,25,26] ఉపయోగించారు. ఈ అధ్యయనంలో, సెరిబ్రల్ నాళాలను లక్ష్యంగా చేసుకున్న పెప్టైడ్‌ల ప్రత్యక్ష గుర్తింపుకు మాత్రమే కాకుండా, రక్త-మెదడు అవరోధాన్ని దాటడానికి క్రియాశీల రవాణా లక్షణాలు కలిగిన అభ్యర్థుల ఆవిష్కరణకు కూడా మేము ఈ ఎంపిక పద్ధతి యొక్క అనువర్తనాన్ని విస్తరించాము. CM ఇంట్యూబేటెడ్ ఎలుకలలో ఇన్ వివో ఎంపిక విధానం యొక్క అభివృద్ధిని మేము ఇప్పుడు వివరిస్తాము మరియు CSF హోమింగ్ లక్షణాలతో పెప్టైడ్‌లను గుర్తించే దాని సామర్థ్యాన్ని ప్రదర్శిస్తాము. 12-మెర్ యాదృచ్ఛిక పెప్టైడ్‌ల లైబ్రరీని ప్రదర్శించే T7 ఫేజ్‌ను ఉపయోగించి, T7 ఫేజ్ తగినంత చిన్నదని (సుమారు 60 nm వ్యాసం) [10] రక్త-మెదడు అవరోధానికి అనుగుణంగా ఉంటుందని మేము నిరూపించగలిగాము, తద్వారా రక్త-మెదడు అవరోధం లేదా కోరాయిడ్ ప్లెక్సస్‌ను నేరుగా దాటుతాము. కాన్యులేటెడ్ CM ఎలుకల నుండి CSF హార్వెస్టింగ్ బాగా నియంత్రించబడిన ఇన్ వివో ఫంక్షనల్ స్క్రీనింగ్ పద్ధతి అని మేము గమనించాము మరియు సేకరించిన ఫేజ్ వాస్కులేచర్‌కు కట్టుబడి ఉండటమే కాకుండా రక్త-మెదడు అవరోధం అంతటా ట్రాన్స్‌పోర్టర్‌గా కూడా పనిచేస్తుందని మేము గమనించాము. ఇంకా, ఏకకాలంలో రక్తాన్ని సేకరించి, CSF మరియు రక్తం-ఉత్పన్నమైన ఫేజ్‌లకు HTSని వర్తింపజేయడం ద్వారా, మా CSF ఎంపిక రక్త సుసంపన్నం లేదా ఎంపిక రౌండ్ల మధ్య విస్తరణకు ఫిట్‌నెస్ ద్వారా ప్రభావితం కాలేదని మేము నిర్ధారించాము. అయితే, రక్త కంపార్ట్‌మెంట్ ఎంపిక ప్రక్రియలో భాగం, ఎందుకంటే CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌కు చేరుకోగల ఫేజ్‌లు మెదడులో తమను తాము సుసంపన్నం చేసుకోవడానికి తగినంత కాలం రక్తప్రవాహంలో జీవించి ప్రసరించాలి. ముడి HTS డేటా నుండి నమ్మదగిన సీక్వెన్స్ సమాచారాన్ని సేకరించేందుకు, విశ్లేషణ వర్క్‌ఫ్లోలో ప్లాట్‌ఫామ్-నిర్దిష్ట సీక్వెన్సింగ్ లోపాలకు అనుగుణంగా ఫిల్టర్‌లను మేము అమలు చేసాము. స్క్రీనింగ్ పద్ధతిలో గతిశీల పారామితులను చేర్చడం ద్వారా, రక్తంలో వైల్డ్-టైప్ T7 ఫేజ్‌ల (t½ ~ 28 నిమిషాలు) వేగవంతమైన ఫార్మకోకైనటిక్స్‌ను మేము నిర్ధారించాము మరియు నిమిషానికి సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ (t½ ~ 26 నిమిషాలు)లో వాటి సగం జీవితాన్ని కూడా నిర్ణయించాము. రక్తం మరియు CSF లలో ఇలాంటి ఫార్మకోకైనటిక్ ప్రొఫైల్స్ ఉన్నప్పటికీ, CSF లో ఫేజ్ యొక్క రక్త సాంద్రతలో 0.001% మాత్రమే కనుగొనబడింది, ఇది రక్త-మెదడు అవరోధం అంతటా వైల్డ్-టైప్ T7 ఫేజ్ యొక్క తక్కువ నేపథ్య చలనశీలతను సూచిస్తుంది. ఈ పని ఇన్ వివో పానింగ్ వ్యూహాలను ఉపయోగించినప్పుడు మొదటి రౌండ్ ఎంపిక యొక్క ప్రాముఖ్యతను హైలైట్ చేస్తుంది, ముఖ్యంగా ప్రసరణ నుండి వేగంగా క్లియర్ చేయబడిన ఫేజ్ వ్యవస్థల కోసం, కొన్ని క్లోన్‌లు CNS కంపార్ట్‌మెంట్‌కు చేరుకోగలవు. అందువల్ల, మొదటి రౌండ్‌లో, లైబ్రరీ వైవిధ్యంలో తగ్గింపు చాలా పెద్దది, ఎందుకంటే ఈ చాలా కఠినమైన CSF మోడల్‌లో చివరికి పరిమిత సంఖ్యలో క్లోన్‌లు మాత్రమే సేకరించబడ్డాయి. ఈ ఇన్ వివో పానింగ్ వ్యూహంలో CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌లో క్రియాశీల సంచితం, రక్త కంపార్ట్‌మెంట్‌లో క్లోన్ మనుగడ మరియు మొదటి 10 నిమిషాల్లో రక్తం నుండి T7 ఫేజ్ క్లోన్‌లను వేగంగా తొలగించడం వంటి అనేక ఎంపిక దశలు ఉన్నాయి (Fig. 1d మరియు అనుబంధ Fig. 4M). అందువల్ల, మొదటి రౌండ్ తర్వాత, CSFలో వేర్వేరు ఫేజ్ క్లోన్‌లు గుర్తించబడ్డాయి, అయినప్పటికీ ఒకే ప్రారంభ పూల్ వ్యక్తిగత జంతువులకు ఉపయోగించబడింది. పెద్ద సంఖ్యలో లైబ్రరీ సభ్యులు ఉన్న సోర్స్ లైబ్రరీల కోసం బహుళ కఠినమైన ఎంపిక దశలు వైవిధ్యంలో గణనీయమైన తగ్గింపుకు దారితీస్తాయని ఇది సూచిస్తుంది. అందువల్ల, యాదృచ్ఛిక సంఘటనలు ప్రారంభ ఎంపిక ప్రక్రియలో అంతర్భాగంగా మారతాయి, ఫలితాన్ని బాగా ప్రభావితం చేస్తాయి. అసలు లైబ్రరీలోని అనేక క్లోన్‌లు చాలా సారూప్యమైన CSF సుసంపన్న ప్రవృత్తిని కలిగి ఉండే అవకాశం ఉంది. అయితే, అదే ప్రయోగాత్మక పరిస్థితులలో కూడా, ప్రారంభ పూల్‌లోని ప్రతి నిర్దిష్ట క్లోన్ యొక్క చిన్న సంఖ్య కారణంగా ఎంపిక ఫలితాలు భిన్నంగా ఉండవచ్చు.
CSF లో సమృద్ధిగా ఉన్న మూలాంశాలు రక్తంలో ఉన్న వాటికి భిన్నంగా ఉంటాయి. ఆసక్తికరంగా, వ్యక్తిగత జంతువుల రక్తంలో గ్లైసిన్ అధికంగా ఉండే పెప్టైడ్‌ల వైపు మొదటి మార్పును మేము గమనించాము. (Fig. 1g, అనుబంధ Figs. 4e, 4f). గ్లైసిన్ పెప్టైడ్‌లను కలిగి ఉన్న ఫేజ్ మరింత స్థిరంగా ఉండవచ్చు మరియు ప్రసరణ నుండి తొలగించబడే అవకాశం తక్కువగా ఉంటుంది. అయితే, ఈ గ్లైసిన్ అధికంగా ఉండే పెప్టైడ్‌లు సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవ నమూనాలలో కనుగొనబడలేదు, ఇది క్యూరేటెడ్ లైబ్రరీలు రెండు వేర్వేరు ఎంపిక దశల ద్వారా వెళ్ళాయని సూచిస్తున్నాయి: ఒకటి రక్తంలో మరియు మరొకటి సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో పేరుకుపోవడానికి అనుమతించబడ్డాయి. నాల్గవ రౌండ్ ఎంపిక ఫలితంగా వచ్చిన CSF-సుసంపన్నమైన క్లోన్‌లను విస్తృతంగా పరీక్షించారు. వ్యక్తిగతంగా పరీక్షించబడిన దాదాపు అన్ని క్లోన్‌లు ఖాళీ నియంత్రణ ఫేజ్‌తో పోలిస్తే CSFలో సమృద్ధిగా ఉన్నాయని నిర్ధారించబడ్డాయి. ఒక పెప్టైడ్ హిట్ (#2077) ను మరింత వివరంగా పరిశీలించారు. ఇది ఇతర హిట్‌లతో పోలిస్తే ఎక్కువ ప్లాస్మా సగం జీవితాన్ని చూపించింది (మూర్తి 3d మరియు అనుబంధ చిత్రం 7), మరియు ఆసక్తికరంగా, ఈ పెప్టైడ్ C-టెర్మినస్‌లో సిస్టీన్ అవశేషాన్ని కలిగి ఉంది. పెప్టైడ్‌లకు సిస్టీన్ జోడించడం వల్ల అల్బుమిన్ 29కి బంధించడం ద్వారా వాటి ఫార్మకోకైనటిక్ లక్షణాలను మెరుగుపరుస్తుందని ఇటీవల చూపబడింది. ఇది ప్రస్తుతం పెప్టైడ్ #2077కి తెలియదు మరియు మరింత అధ్యయనం అవసరం. కొన్ని పెప్టైడ్‌లు CSF సుసంపన్నతలో వాలెన్స్-డిపెండెన్సీని చూపించాయి (డేటా చూపబడలేదు), ఇది T7 క్యాప్సిడ్ యొక్క ప్రదర్శిత ఉపరితల జ్యామితికి సంబంధించినది కావచ్చు. మేము ఉపయోగించిన T7 వ్యవస్థ ఫేజ్ కణానికి ప్రతి పెప్టైడ్ యొక్క 5-15 కాపీలను చూపించింది. ఎలుకల సెరిబ్రల్ కార్టెక్స్‌లోకి ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేయబడిన అభ్యర్థి లీడ్ ఫేజ్ క్లోన్‌లపై IHC నిర్వహించబడింది (అనుబంధ చిత్రం 8). కనీసం మూడు క్లోన్‌లు (నం. 2002, నం. 2009 మరియు నం. 2077) BBBతో సంకర్షణ చెందాయని డేటా చూపించింది. ఈ BBB సంకర్షణ CSF పేరుకుపోవడానికి దారితీస్తుందా లేదా ఈ క్లోన్‌లను నేరుగా BCSFBకి తరలించడానికి దారితీస్తుందా అనేది ఇంకా నిర్ణయించాల్సి ఉంది. ముఖ్యంగా, ఎంచుకున్న పెప్టైడ్‌లు సంశ్లేషణ చేయబడినప్పుడు మరియు ప్రోటీన్ కార్గోకు కట్టుబడి ఉన్నప్పుడు వాటి CSF రవాణా సామర్థ్యాన్ని నిలుపుకుంటాయని మేము చూపిస్తాము. N-టెర్మినల్ బయోటినిలేటెడ్ పెప్టైడ్‌లను SAకి బంధించడం వలన రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో వాటి సంబంధిత ఫేజ్ క్లోన్‌లతో పొందిన ఫలితాలు తప్పనిసరిగా పునరావృతమవుతాయి (Fig. 3e). చివరగా, లెడ్ పెప్టైడ్ #2077 SAకి సంయోగం చేయబడిన BACE1 యొక్క బయోటినిలేటెడ్ పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్ యొక్క మెదడు చర్యను ప్రోత్సహించగలదని, CSFలో Abeta40 స్థాయిలను గణనీయంగా తగ్గించడం ద్వారా CNSలో ఉచ్ఛరించబడిన ఫార్మాకోడైనమిక్ ప్రభావాలను కలిగిస్తుందని మేము చూపిస్తాము (Fig. 4). అన్ని హిట్‌ల యొక్క పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్ హోమోలజీ శోధనను నిర్వహించడం ద్వారా మేము డేటాబేస్‌లో ఏ హోమోలాగ్‌లను గుర్తించలేకపోయాము. T7 లైబ్రరీ పరిమాణం సుమారు 109 అని గమనించడం ముఖ్యం, అయితే 12-మెర్స్ కోసం సైద్ధాంతిక లైబ్రరీ పరిమాణం 4 x 1015. అందువల్ల, మేము 12-మెర్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీ యొక్క వైవిధ్య స్థలంలో ఒక చిన్న భాగాన్ని మాత్రమే ఎంచుకున్నాము, అంటే ఈ గుర్తించబడిన హిట్‌ల ప్రక్కనే ఉన్న సీక్వెన్స్ స్థలాన్ని మూల్యాంకనం చేయడం ద్వారా మరింత ఆప్టిమైజ్ చేయబడిన పెప్టైడ్‌లను గుర్తించవచ్చు. ఊహాత్మకంగా, ఈ పెప్టైడ్‌ల యొక్క సహజ హోమోలాగ్‌లను మనం కనుగొనకపోవడానికి ఒక కారణం మెదడులోకి కొన్ని పెప్టైడ్ మోటిఫ్‌ల అనియంత్రిత ప్రవేశాన్ని నిరోధించడానికి పరిణామ సమయంలో ఎంపికను తీసివేయడం కావచ్చు.
కలిసి చూస్తే, మా ఫలితాలు భవిష్యత్తులో సెరెబ్రోవాస్కులర్ అవరోధం ఇన్ వివో యొక్క రవాణా వ్యవస్థలను మరింత వివరంగా గుర్తించడానికి మరియు వర్గీకరించడానికి ఒక ఆధారాన్ని అందిస్తాయి. ఈ పద్ధతి యొక్క ప్రాథమిక సెటప్ సెరిబ్రల్ వాస్కులర్ బైండింగ్ లక్షణాలతో క్లోన్‌లను గుర్తించడమే కాకుండా, విజయవంతమైన క్లోన్‌లు ఇన్ వివోలో జీవసంబంధమైన అడ్డంకులను CNS కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి దాటడానికి అంతర్గత కార్యకలాపాలను కలిగి ఉన్న ఒక కీలకమైన దశను కూడా కలిగి ఉంటుంది. ఈ పెప్టైడ్‌ల రవాణా విధానం మరియు మెదడు ప్రాంతానికి ప్రత్యేకమైన మైక్రోవాస్కులేచర్‌కు బంధించడానికి వాటి ప్రాధాన్యతను వివరించడం. ఇది BBB మరియు గ్రాహకాల రవాణా కోసం కొత్త మార్గాల ఆవిష్కరణకు దారితీయవచ్చు. గుర్తించబడిన పెప్టైడ్‌లు నేరుగా సెరెబ్రోవాస్కులర్ గ్రాహకాలకు లేదా BBB లేదా BCSFB ద్వారా రవాణా చేయబడిన ప్రసరణ లిగాండ్‌లకు బంధించగలవని మేము ఆశిస్తున్నాము. ఈ పనిలో కనుగొనబడిన CSF రవాణా కార్యకలాపాలతో పెప్టైడ్ వెక్టర్‌లను మరింత పరిశీలిస్తాము. BBB మరియు/లేదా BCSFBని దాటగల సామర్థ్యం కోసం ఈ పెప్టైడ్‌ల మెదడు విశిష్టతను మేము ప్రస్తుతం పరిశీలిస్తున్నాము. ఈ కొత్త పెప్టైడ్‌లు కొత్త గ్రాహకాలు లేదా మార్గాల యొక్క సంభావ్య ఆవిష్కరణకు మరియు బయోలాజిక్స్ వంటి స్థూల కణాలను మెదడుకు అందించడానికి కొత్త అత్యంత సమర్థవంతమైన వేదికల అభివృద్ధికి చాలా విలువైన సాధనాలుగా ఉంటాయి.
గతంలో వివరించిన పద్ధతిని సవరించి పెద్ద సిస్టెర్నా (CM) ను కాన్యులేట్ చేయండి. అనస్థీషియా చేయబడిన విస్టార్ ఎలుకలను (200-350 గ్రా) స్టీరియోటాక్సిక్ ఉపకరణంపై అమర్చి, గుండు చేయబడిన మరియు అసెప్టిక్‌గా తయారుచేసిన నెత్తిపై మధ్యస్థ కోత చేసి, పుర్రెను బహిర్గతం చేశారు. పై సాష్ ప్రాంతంలో రెండు రంధ్రాలు చేసి, రంధ్రాలలోని ఫిక్సింగ్ స్క్రూలను బిగించండి. స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ కాన్యులాను CMలోకి స్టీరియోటాక్టిక్ మార్గదర్శకత్వం కోసం పార్శ్వ ఆక్సిపిటల్ క్రెస్ట్‌లో అదనపు రంధ్రం వేయబడింది. కాన్యులా చుట్టూ దంత సిమెంట్‌ను పూయండి మరియు స్క్రూలతో భద్రపరచండి. ఫోటో-క్యూరింగ్ మరియు సిమెంట్ గట్టిపడిన తర్వాత, చర్మ గాయాన్ని 4/0 సుప్రమిడ్ కుట్టుతో మూసివేయబడింది. కాన్యులా యొక్క సరైన స్థానం సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవం (CSF) యొక్క ఆకస్మిక లీకేజ్ ద్వారా నిర్ధారించబడింది. స్టీరియోటాక్సిక్ ఉపకరణం నుండి ఎలుకను తీసివేసి, తగిన శస్త్రచికిత్స తర్వాత సంరక్షణ మరియు నొప్పి నిర్వహణను పొందండి మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో రక్తం యొక్క సంకేతాలు గమనించబడే వరకు కనీసం ఒక వారం పాటు కోలుకోవడానికి అనుమతించండి. విస్టార్ ఎలుకలు (Crl:WI/Han) చార్లెస్ నది (ఫ్రాన్స్) నుండి పొందబడ్డాయి. అన్ని ఎలుకలను నిర్దిష్ట వ్యాధికారక రహిత పరిస్థితులలో ఉంచారు. అన్ని జంతు ప్రయోగాలను స్విట్జర్లాండ్‌లోని బాసెల్ నగరంలోని వెటర్నరీ కార్యాలయం ఆమోదించింది మరియు జంతు లైసెన్స్ నంబర్ 2474 (ఎలుక మెదడులోని సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ మరియు థెరప్యూటిక్ అభ్యర్థుల స్థాయిలను కొలవడం ద్వారా యాక్టివ్ బ్రెయిన్ ట్రాన్స్‌పోర్ట్ యొక్క అంచనా) ప్రకారం నిర్వహించబడ్డాయి.
CM కాన్యులాను చేతిలో పట్టుకుని ఎలుకను సున్నితంగా స్పృహలో ఉంచండి. కాన్యులా నుండి డాతురాను తీసివేసి, 10 µl ఆకస్మికంగా ప్రవహించే సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవాన్ని సేకరించండి. కాన్యులా యొక్క పేటెన్సీ చివరికి రాజీ పడినందున, రక్తం కలుషితం కావడం లేదా రంగు మారడం వంటి ఆధారాలు లేని స్పష్టమైన సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవ నమూనాలను మాత్రమే ఈ అధ్యయనంలో చేర్చారు. సమాంతరంగా, తోక కొన వద్ద ఉన్న చిన్న కోత నుండి హెపారిన్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) ఉన్న గొట్టాలలోకి సుమారు 10–20 μl రక్తాన్ని తీసుకున్నారు. T7 ఫేజ్ యొక్క ఇంట్రావీనస్ ఇంజెక్షన్ తర్వాత వివిధ సమయ బిందువులలో CSF మరియు రక్తాన్ని సేకరించారు. ప్రతి CSF నమూనాను సేకరించే ముందు సుమారు 5–10 μl ద్రవాన్ని విస్మరించారు, ఇది కాథెటర్ యొక్క డెడ్ వాల్యూమ్‌కు అనుగుణంగా ఉంటుంది.
T7Select సిస్టమ్ మాన్యువల్ (నోవాగెన్, రోసెన్‌బర్గ్ మరియు ఇతరులు, ఇన్‌నోవేషన్స్ 6, 1-6, 1996) లో వివరించిన విధంగా T7Select 10-3b వెక్టర్‌ను ఉపయోగించి లైబ్రరీలు రూపొందించబడ్డాయి. క్లుప్తంగా, యాదృచ్ఛిక 12-మెర్ DNA ఇన్సర్ట్ కింది ఫార్మాట్‌లో సంశ్లేషణ చేయబడింది:
ఇన్సర్ట్‌లో డబుల్ స్టాప్ కోడాన్‌లు మరియు అమైనో ఆమ్లం అతిగా వ్యక్తీకరణను నివారించడానికి NNK కోడాన్ ఉపయోగించబడింది. N అనేది ప్రతి న్యూక్లియోటైడ్ యొక్క మాన్యువల్‌గా మిశ్రమ ఈక్విమోలార్ నిష్పత్తి, మరియు K అనేది అడెనైన్ మరియు సైటోసిన్ న్యూక్లియోటైడ్‌ల యొక్క మాన్యువల్‌గా మిశ్రమ ఈక్విమోలార్ నిష్పత్తి. 37°C వద్ద 3 గంటల పాటు క్లెనో బఫర్ (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్)లో dNTP (నోవాగెన్) మరియు క్లెనో ఎంజైమ్ (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్)తో మరింత ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ ప్రాంతాలు డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNAగా మార్చబడ్డాయి. ప్రతిచర్య తర్వాత, డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA EtOH అవక్షేపణ ద్వారా తిరిగి పొందబడింది. ఫలితంగా వచ్చిన DNA ని నిరోధక ఎంజైమ్‌లైన EcoRI మరియు HindIII (రెండూ రోచె నుండి) జీర్ణం చేయబడ్డాయి. క్లీవ్డ్ మరియు ప్యూరిఫైడ్ (QIAquick, Qiagen) ఇన్సర్ట్ (T4 లిగేస్, న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్) 10B క్యాప్సిడ్ జన్యువులోని అమైనో ఆమ్లం 348 తర్వాత ప్రీ-క్లీవ్డ్ T7 వెక్టర్‌లోకి ఇన్-ఫ్రేమ్‌లోకి లిగేట్ చేయబడింది. ఇన్ విట్రో ప్యాకేజింగ్ కు ముందు 18 గంటలు 16° C వద్ద బంధన ప్రతిచర్యలు పొదిగేవి. T7Select 10-3b క్లోనింగ్ కిట్ (నోవాజెన్) తో అందించబడిన సూచనల ప్రకారం ఫేజ్ ప్యాకేజింగ్ ఇన్ విట్రో నిర్వహించబడింది మరియు ప్యాకేజింగ్ ద్రావణాన్ని ఎస్చెరిచియా కోలి (BLT5615, నోవాజెన్) ఉపయోగించి లైసిస్ కు ఒకసారి విస్తరించారు. లైసేట్లను సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, టైట్రేట్ చేసి, గ్లిసరాల్ యొక్క స్టాక్ ద్రావణం వలె -80° C వద్ద స్తంభింపజేసారు.
ప్రొప్రైటరీ 454/రోచె-యాంప్లికాన్ ఫ్యూజన్ ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి బ్రోత్ లేదా ప్లేట్‌లో విస్తరించిన ఫేజ్ వేరియబుల్ ప్రాంతాల యొక్క ప్రత్యక్ష PCR విస్తరణ. ఫార్వర్డ్ ఫ్యూజన్ ప్రైమర్‌లో వేరియబుల్ ప్రాంతం (NNK) 12 (టెంప్లేట్-స్పెసిఫిక్), GS FLX టైటానియం అడాప్టర్ A మరియు నాలుగు-బేస్ లైబ్రరీ కీ సీక్వెన్స్ (TCAG) (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 1a) చుట్టూ ఉన్న సీక్వెన్స్‌లు ఉంటాయి:
రివర్స్ ఫ్యూజన్ ప్రైమర్‌లో పూసలను సంగ్రహించడానికి జతచేయబడిన బయోటిన్ మరియు ఎమల్షన్ PCR సమయంలో క్లోనల్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు అవసరమైన GS FLX టైటానియం అడాప్టర్ B కూడా ఉన్నాయి:
తరువాత 454 GS-FLX టైటానియం ప్రోటోకాల్ ప్రకారం యాంప్లికాన్‌లను 454/రోచె పైరోక్సెన్సింగ్‌కు గురి చేశారు. మాన్యువల్ సాంగర్ సీక్వెన్సింగ్ (అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్ హిటాచీ 3730 xl DNA ఎనలైజర్) కోసం, T7 ఫేజ్ DNAను PCR ద్వారా విస్తరించి, కింది ప్రైమర్ జతలతో క్రమం చేశారు:
రోచె ఫాస్ట్ స్టార్ట్ DNA పాలిమరేస్ కిట్ (తయారీదారు సూచనల ప్రకారం) ఉపయోగించి వ్యక్తిగత ఫలకాల నుండి చొప్పించిన వాటిని PCR యాంప్లిఫికేషన్‌కు గురి చేశారు. హాట్ స్టార్ట్ (95 °C వద్ద 10 నిమిషాలు) మరియు 35 బూస్ట్ సైకిల్స్ (95 °C వద్ద 50 సెకన్లు, 50 °C వద్ద 1 నిమిషం మరియు 72 °C వద్ద 1 నిమిషం) చేయండి.
లైబ్రరీల నుండి ఫేజ్, వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్, CSF మరియు రక్తం నుండి రక్షించబడిన ఫేజ్ లేదా వ్యక్తిగత క్లోన్‌లను TB రసంలో (సిగ్మా ఆల్డ్రిచ్) ఎస్చెరిచియా కోలి BL5615లో లేదా 500 సెం.మీ2 డిష్‌లలో (థర్మో సైంటిఫిక్) 37°C వద్ద 4 గంటలు విస్తరించారు. ట్రిస్-EDTA బఫర్ (ఫ్లూకా అనలిటికల్)తో ప్లేట్‌లను కడగడం ద్వారా లేదా స్టెరైల్ పైపెట్ చిట్కాలతో ప్లేక్‌లను సేకరించడం ద్వారా ప్లేట్‌ల నుండి ఫేజ్‌ను సేకరించారు. ఫేజ్‌ను కల్చర్ సూపర్‌నాటెంట్ లేదా ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ బఫర్ నుండి ఒక రౌండ్ పాలిథిలిన్ గ్లైకాల్ (PEG 8000) అవక్షేపణ (ప్రోమెగా)తో వేరుచేసి ట్రిస్-EDTA బఫర్‌లో తిరిగి అమర్చారు.
ఇంట్రావీనస్ (IV) ఇంజెక్షన్ (500 μl/జంతువు) కు ముందు, ఎండోటాక్సిన్ తొలగింపు పూసలు (మిల్టెని బయోటెక్) ఉపయోగించి యాంప్లిఫైడ్ ఫేజ్‌ను 2-3 రౌండ్ల ఎండోటాక్సిన్ తొలగింపుకు గురి చేశారు. మొదటి రౌండ్‌లో, 2×1012 ఫేజ్‌లు ప్రవేశపెట్టబడ్డాయి; రెండవ రౌండ్‌లో, 2×1010 ఫేజ్‌లు; మూడవ మరియు నాల్గవ ఎంపిక రౌండ్‌లలో, ప్రతి జంతువుకు 2×109 ఫేజ్‌లు. CSF మరియు సూచించిన సమయ బిందువులలో సేకరించిన రక్త నమూనాలలో ఫేజ్ కంటెంట్ తయారీదారు సూచనల ప్రకారం ఫలకం లెక్కింపు ద్వారా నిర్ణయించబడుతుంది (T7Select సిస్టమ్ మాన్యువల్). శుద్ధి చేసిన లైబ్రరీలను తోక సిరలోకి ఇంట్రావీనస్ ఇంజెక్షన్ చేయడం ద్వారా లేదా మునుపటి ఎంపిక రౌండ్ నుండి CSF నుండి సేకరించిన ఫేజ్‌ను తిరిగి ఇంజెక్షన్ చేయడం ద్వారా ఫేజ్ ఎంపికను నిర్వహించారు మరియు తదుపరి పంటలను వరుసగా CSF మరియు రక్త నమూనాలలో 10 నిమిషాలు, 30 నిమిషాలు, 60 నిమిషాలు, 90 నిమిషాలు, 120 నిమిషాలు, 180 నిమిషాలు మరియు 240 నిమిషాలలో నిర్వహించారు. మొత్తం నాలుగు రౌండ్ల ఇన్ వివో ప్యానింగ్ నిర్వహించబడింది, దీనిలో ఎంపిక చేసిన రెండు శాఖలను విడివిడిగా నిల్వ చేసి, మొదటి మూడు రౌండ్ల ఎంపిక సమయంలో విశ్లేషించారు. మొదటి రెండు రౌండ్ల ఎంపిక నుండి CSF నుండి సేకరించిన అన్ని ఫేజ్ ఇన్సర్ట్‌లు 454/రోచె పైరోసీక్వెన్సింగ్‌కు లోబడి ఉన్నాయి, అయితే చివరి రెండు రౌండ్ల ఎంపిక నుండి CSF నుండి సేకరించిన అన్ని క్లోన్‌లు మాన్యువల్‌గా క్రమం చేయబడ్డాయి. మొదటి రౌండ్ ఎంపిక నుండి అన్ని రక్త ఫేజ్‌లు కూడా 454/రోచె పైరోసీక్వెన్సింగ్‌కు లోబడి ఉన్నాయి. ఫేజ్ క్లోన్‌ల ఇంజెక్షన్ కోసం, ఎంచుకున్న ఫేజ్‌లను E. coli (BL5615)లో 500 cm2 ప్లేట్‌లపై 37°C వద్ద 4 గంటల పాటు విస్తరించారు. వ్యక్తిగతంగా ఎంపిక చేయబడిన మరియు మాన్యువల్‌గా క్రమం చేయబడిన క్లోన్‌లను TB మాధ్యమంలో ప్రచారం చేశారు. ఫేజ్ వెలికితీత, ఎండోటాక్సిన్ యొక్క శుద్దీకరణ మరియు తొలగింపు తర్వాత (పైన వివరించిన విధంగా), 300 μlలోని 2×1010 ఫేజ్‌లు/జంతువును ఒక తోక సిరలోకి ఇంజెక్ట్ చేశారు.
సీక్వెన్స్ డేటా యొక్క ప్రీప్రాసెసింగ్ మరియు గుణాత్మక వడపోత. రా 454/రోచ్ డేటా బైనరీ స్టాండర్డ్ స్ట్రీమ్ మ్యాప్ ఫార్మాట్ (sff) నుండి వెండర్ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి పియర్సన్ హ్యూమన్ రీడబుల్ ఫార్మాట్ (fasta)కి మార్చబడింది. న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్ యొక్క మరింత ప్రాసెసింగ్ క్రింద వివరించిన విధంగా యాజమాన్య C ప్రోగ్రామ్‌లు మరియు స్క్రిప్ట్‌లను (విడుదల చేయని సాఫ్ట్‌వేర్ ప్యాకేజీ) ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది. ప్రాథమిక డేటా యొక్క విశ్లేషణలో కఠినమైన బహుళ-దశల వడపోత విధానాలు ఉంటాయి. చెల్లుబాటు అయ్యే 12mer ఇన్సర్ట్ DNA సీక్వెన్స్ లేని రీడ్‌లను ఫిల్టర్ చేయడానికి, రీడ్‌లను గ్లోబల్ నీడిల్‌మాన్-వున్‌ష్ పరీక్షను ఉపయోగించి స్టార్ట్ లేబుల్ (GTGATGTCGGGATCCGAATTC), స్టాప్ లేబుల్ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCAGTA) మరియు బ్యాక్‌గ్రౌండ్ ఇన్సర్ట్ (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC)కి వరుసగా సమలేఖనం చేశారు. ప్రతి అలైన్‌మెంట్‌కు 2 అసమానతలను అనుమతించే అలైన్‌మెంట్31. అందువల్ల, స్టార్ట్ మరియు స్టాప్ ట్యాగ్‌లు లేని రీడ్‌లు మరియు బ్యాక్‌గ్రౌండ్ ఇన్సర్ట్‌లను కలిగి ఉన్న రీడ్‌లు, అంటే, అనుమతించబడిన అసమతుల్యతల సంఖ్యను మించిన అలైన్‌మెంట్‌లు లైబ్రరీ నుండి తీసివేయబడ్డాయి. మిగిలిన రీడ్‌ల విషయానికొస్తే, ప్రారంభ గుర్తు నుండి విస్తరించి స్టాప్ గుర్తుకు ముందు ముగిసే N-mer DNA శ్రేణిని అసలు రీడ్ సీక్వెన్స్ నుండి తొలగించి, మరింత ప్రాసెస్ చేయబడింది (ఇకపై దీనిని "ఇన్సర్ట్" అని పిలుస్తారు). ఇన్సర్ట్ అనువాదం తర్వాత, ప్రైమర్ యొక్క 5′ చివరన ఉన్న మొదటి స్టాప్ కోడాన్ తర్వాత భాగాన్ని ఇన్సర్ట్ నుండి తొలగిస్తారు. అదనంగా, ప్రైమర్ యొక్క 3′ చివరన అసంపూర్ణ కోడాన్‌లకు దారితీసే న్యూక్లియోటైడ్‌లు కూడా తొలగించబడ్డాయి. నేపథ్య శ్రేణులను మాత్రమే కలిగి ఉన్న ఇన్సర్ట్‌లను మినహాయించడానికి, అమైనో ఆమ్ల నమూనా "PAG"తో ప్రారంభమయ్యే అనువదించబడిన ఇన్సర్ట్‌లు కూడా తొలగించబడ్డాయి. 3 అమైనో ఆమ్లాల కంటే తక్కువ అనువాదానంతర పొడవు కలిగిన పెప్టైడ్‌లను లైబ్రరీ నుండి తొలగించారు. చివరగా, ఇన్సర్ట్ పూల్‌లోని రిడెండెన్సీని తొలగించి, ప్రతి ప్రత్యేక ఇన్సర్ట్ యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీని నిర్ణయించండి. ఈ విశ్లేషణ ఫలితాలలో న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్‌ల జాబితా (ఇన్సర్ట్‌లు) మరియు వాటి (చదివిన) ఫ్రీక్వెన్సీలు (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్‌లు 1c మరియు 2) ఉన్నాయి.
సీక్వెన్స్ సారూప్యత ద్వారా గ్రూప్ N-mer DNA ఇన్సర్ట్‌లు: 454/Roche-నిర్దిష్ట సీక్వెన్సింగ్ లోపాలను (సీక్వెన్సింగ్ హోమోపాలిమర్ ఎక్స్‌టెన్షన్‌లలో సమస్యలు వంటివి) తొలగించడానికి మరియు తక్కువ ముఖ్యమైన పునరావృతాలను తొలగించడానికి, గతంలో ఫిల్టర్ చేయబడిన N-mer DNA సీక్వెన్స్ ఇన్సర్ట్‌లు (ఇన్సర్ట్‌లు) సారూప్యత ద్వారా క్రమబద్ధీకరించబడతాయి. ఈ క్రింది విధంగా నిర్వచించబడిన పునరుక్తి అల్గోరిథం ఉపయోగించి ఇన్సర్షన్‌లు (2 సరిపోలని బేస్‌ల వరకు అనుమతించబడతాయి): ఇన్సర్షన్‌లు మొదట వాటి ఫ్రీక్వెన్సీ (అత్యధిక నుండి అత్యల్ప) ద్వారా క్రమబద్ధీకరించబడతాయి మరియు అవి ఒకేలా ఉంటే, వాటి ద్వితీయ క్రమబద్ధీకరణ పొడవు (పొడవైన నుండి చిన్నది) ద్వారా క్రమబద్ధీకరించబడతాయి. అందువల్ల, అత్యంత తరచుగా మరియు పొడవైన ఇన్సర్షన్‌లు మొదటి “సమూహం”ని నిర్వచిస్తాయి. గ్రూప్ ఫ్రీక్వెన్సీ కీ ఫ్రీక్వెన్సీకి సెట్ చేయబడింది. అప్పుడు, క్రమబద్ధీకరించబడిన జాబితాలో మిగిలి ఉన్న ప్రతి ఇన్సర్షన్‌ను జతగా నీడిల్‌మాన్-వున్ష్ అలైన్‌మెంట్ ద్వారా గ్రూప్‌కు జోడించడానికి ప్రయత్నించారు. ఒక అలైన్‌మెంట్‌లో అసమతుల్యతలు, ఇన్సర్షన్‌లు లేదా తొలగింపుల సంఖ్య 2 థ్రెషోల్డ్‌ను మించకపోతే, గ్రూప్‌కు ఒక ఇన్సర్షన్ జోడించబడుతుంది మరియు మొత్తం గ్రూప్ ఫ్రీక్వెన్సీ చొప్పించడం ఎంత తరచుగా జోడించబడిందనే దాని ద్వారా పెరుగుతుంది. ఒక సమూహానికి జోడించిన ఇన్సర్ట్‌లను ఉపయోగించినట్లుగా గుర్తించబడతాయి మరియు తదుపరి ప్రాసెసింగ్ నుండి మినహాయించబడతాయి. ఇప్పటికే ఉన్న సమూహానికి ఇన్సర్ట్ సీక్వెన్స్‌ను జోడించలేకపోతే, ఇన్సర్ట్ సీక్వెన్స్ తగిన ఇన్సర్ట్ ఫ్రీక్వెన్సీతో కొత్త సమూహాన్ని సృష్టించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది మరియు ఉపయోగించినట్లుగా గుర్తించబడుతుంది. ప్రతి ఇన్సర్షన్ సీక్వెన్స్ కొత్త సమూహాన్ని ఏర్పరచడానికి ఉపయోగించబడినప్పుడు లేదా ఇప్పటికే ఉన్న సమూహంలో చేర్చబడినప్పుడు పునరావృతం ముగుస్తుంది. అన్నింటికంటే, న్యూక్లియోటైడ్‌లతో కూడిన సమూహ ఇన్సర్ట్‌లు చివరికి పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్‌లుగా (పెప్టైడ్ లైబ్రరీలు) అనువదించబడతాయి. ఈ విశ్లేషణ ఫలితంగా ఇన్సర్ట్‌ల సమితి మరియు వాటి సంబంధిత ఫ్రీక్వెన్సీలు వరుస రీడ్‌ల సంఖ్యను ఏర్పరుస్తాయి (అనుబంధ చిత్రం 2).
మోటిఫ్ జనరేషన్: ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్‌ల జాబితా ఆధారంగా, క్రింద చూపిన విధంగా అన్ని సాధ్యమైన అమైనో ఆమ్ల నమూనాలను (aa) కలిగి ఉన్న లైబ్రరీ సృష్టించబడింది. పొడవు 3 యొక్క ప్రతి సాధ్యమైన నమూనా పెప్టైడ్ నుండి సంగ్రహించబడింది మరియు దాని విలోమ నమూనా అన్ని నమూనాలను (ట్రిపెప్టైడ్‌లు) కలిగి ఉన్న సాధారణ మోటిఫ్ లైబ్రరీతో పాటు జోడించబడింది. అధిక పునరావృత మోటిఫ్‌ల లైబ్రరీలను క్రమం చేసి, రిడెండెన్సీని తొలగించారు. అప్పుడు, మోటిఫ్ లైబ్రరీలోని ప్రతి ట్రిపెప్టైడ్ కోసం, గణన సాధనాలను ఉపయోగించి లైబ్రరీలో దాని ఉనికిని మేము తనిఖీ చేసాము. ఈ సందర్భంలో, కనుగొనబడిన మోటిఫ్ ట్రిపెప్టైడ్‌ను కలిగి ఉన్న పెప్టైడ్ యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీని జోడించి మోటిఫ్ లైబ్రరీలోని మోటిఫ్‌కు కేటాయించారు ("మోటిఫ్‌ల సంఖ్య"). మోటిఫ్ జనరేషన్ ఫలితం ట్రిపెప్టైడ్‌ల (మోటిఫ్‌లు) యొక్క అన్ని సంఘటనలు మరియు వాటి సంబంధిత విలువలను కలిగి ఉన్న రెండు-డైమెన్షనల్ శ్రేణి, ఇవి రీడ్‌లను ఫిల్టర్ చేసినప్పుడు, సమూహం చేసినప్పుడు మరియు అనువదించినప్పుడు సంబంధిత మోటిఫ్‌కు దారితీసే సీక్వెన్సింగ్ రీడ్‌ల సంఖ్య. పైన వివరంగా వివరించిన విధంగా మెట్రిక్‌లు.
మోటిఫ్‌ల సంఖ్య మరియు సంబంధిత స్కాటర్‌ప్లాట్‌ల సాధారణీకరణ: ప్రతి నమూనా కోసం మోటిఫ్‌ల సంఖ్యను ఉపయోగించి సాధారణీకరించారు
ఇక్కడ ni అనేది టాపిక్ i కలిగి ఉన్న రీడ్‌ల సంఖ్య. అందువల్ల, vi నమూనాలో మోటిఫ్ i కలిగి ఉన్న రీడ్‌ల (లేదా పెప్టైడ్‌లు) శాతం ఫ్రీక్వెన్సీని సూచిస్తుంది. ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్షను ఉపయోగించి సాధారణీకరించబడని మోటిఫ్‌ల సంఖ్యకు P-విలువలు లెక్కించబడ్డాయి. మోటిఫ్‌ల సంఖ్య యొక్క కోరిలోగ్రామ్‌లకు సంబంధించి, స్పియర్‌మ్యాన్ యొక్క సహసంబంధాలను R తో సాధారణీకరించబడిన మోటిఫ్‌ల సంఖ్యను ఉపయోగించి లెక్కించారు.
పెప్టైడ్ లైబ్రరీలోని ప్రతి స్థానంలో అమైనో ఆమ్లాల కంటెంట్‌ను దృశ్యమానం చేయడానికి, వెబ్ లోగోగ్రామ్‌లు 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) సృష్టించబడ్డాయి. మొదట, 12-మెర్ పెప్టైడ్ యొక్క ప్రతి స్థానంలో అమైనో ఆమ్లాల కంటెంట్ 20×12 మ్యాట్రిక్స్‌లో నిల్వ చేయబడుతుంది. తరువాత, ప్రతి స్థానంలో ఒకే సాపేక్ష అమైనో ఆమ్ల కంటెంట్‌ను కలిగి ఉన్న 1000 పెప్టైడ్‌ల సమితి ఫాస్టా-సీక్వెన్స్ ఫార్మాట్‌లో ఉత్పత్తి చేయబడుతుంది మరియు వెబ్-లోగో 3కి ఇన్‌పుట్‌గా అందించబడుతుంది, ఇది ప్రతి స్థానంలో సాపేక్ష అమైనో ఆమ్ల కంటెంట్ యొక్క గ్రాఫికల్ ప్రాతినిధ్యాన్ని ఉత్పత్తి చేస్తుంది. ఇచ్చిన పెప్టైడ్ లైబ్రరీ కోసం. బహుళ డైమెన్షనల్ డేటాసెట్‌లను దృశ్యమానం చేయడానికి, R (బయోస్ హీట్‌మ్యాప్, ఇంకా విడుదల చేయని R ప్యాకేజీ)లో అంతర్గతంగా అభివృద్ధి చేయబడిన సాధనాన్ని ఉపయోగించి హీట్ మ్యాప్‌లు సృష్టించబడ్డాయి. హీట్ మ్యాప్‌లలో సమర్పించబడిన డెండ్రోగ్రామ్‌లను యూక్లిడియన్ దూర మెట్రిక్‌తో వార్డ్ యొక్క క్రమానుగత క్లస్టరింగ్ పద్ధతిని ఉపయోగించి లెక్కించారు. మోటిఫ్ స్కోరింగ్ డేటా యొక్క గణాంక విశ్లేషణ కోసం, అసాధారణమైన స్కోరింగ్ కోసం P విలువలు ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్షను ఉపయోగించి లెక్కించబడ్డాయి. ఇతర డేటాసెట్‌ల కోసం P-విలువలు Rలో స్టూడెంట్స్ t-టెస్ట్ లేదా ANOVA ఉపయోగించి లెక్కించబడ్డాయి.
ఇన్సర్ట్‌లు లేని ఎంపిక చేసిన ఫేజ్ క్లోన్‌లు మరియు ఫేజ్‌లను టెయిల్ సిర ద్వారా ఇంజెక్ట్ చేశారు (300 μl PBSలో 2×1010 ఫేజ్‌లు/జంతువు). పెర్ఫ్యూజన్ మరియు తదుపరి స్థిరీకరణకు పది నిమిషాల ముందు, అదే జంతువులకు 100 μl డైలైట్594-లేబుల్ చేయబడిన లెక్టిన్ (వెక్టర్ లాబొరేటరీస్ ఇంక్., DL-1177) ఇంజెక్ట్ చేశారు. ఫేజ్ ఇంజెక్షన్ తర్వాత 60 నిమిషాల తర్వాత, ఎలుకలను 50 ml PBSతో గుండె ద్వారా పెర్ఫ్యూజ్ చేశారు, ఆ తర్వాత 50 ml 4% PFA/PBS చేశారు. మెదడు నమూనాలను అదనంగా 4% PFA/PBSలో రాత్రిపూట అమర్చారు మరియు 4°C వద్ద రాత్రిపూట 30% సుక్రోజ్‌లో నానబెట్టారు. నమూనాలను OCT మిశ్రమంలో ఫ్లాష్ ఫ్రీజ్ చేస్తారు. స్తంభింపచేసిన నమూనాల ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ విశ్లేషణను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1% BSAతో నిరోధించబడిన 30 µm క్రయోసెక్షన్లపై నిర్వహించారు మరియు 4 °C వద్ద T7 ఫేజ్ (నోవస్ NB 600-376A)కి వ్యతిరేకంగా పాలిక్లోనల్ FITC-లేబుల్ చేయబడిన యాంటీబాడీలతో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. రాత్రిపూట ఇంక్యుబేట్ చేశారు. చివరగా, విభాగాలను PBSతో 3 సార్లు కడిగి, కాన్ఫోకల్ లేజర్ మైక్రోస్కోప్ (లైకా TCS SP5)తో పరిశీలించారు.
98% కనీస స్వచ్ఛత కలిగిన అన్ని పెప్టైడ్‌లను GenScript USA సంశ్లేషణ చేసి, బయోటైనిలేట్ చేసి, లైయోఫైలైజ్ చేసింది. బయోటిన్ N-టెర్మినస్ వద్ద అదనపు ట్రిపుల్ గ్లైసిన్ స్పేసర్ ద్వారా బంధించబడింది. మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీని ఉపయోగించి అన్ని పెప్టైడ్‌లను తనిఖీ చేయండి.
స్ట్రెప్టావిడిన్ (సిగ్మా S0677) ను 5 రెట్లు ఈక్విమోలార్ అదనపు బయోటినిలేటెడ్ పెప్టైడ్, బయోటినిలేటెడ్ BACE1 ఇన్హిబిటరీ పెప్టైడ్ లేదా బయోటినిలేటెడ్ BACE1 ఇన్హిబిటరీ పెప్టైడ్ మరియు BACE1 ఇన్హిబిటరీ పెప్టైడ్ కలయిక (3:1 నిష్పత్తి)తో 5–10% DMSO/PBSలో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. ఇంజెక్షన్ చేయడానికి 1 గంట ముందు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద. సెరిబ్రల్ కుహరం ఉన్న ఎలుకల తోక సిరల్లో ఒకదానిలోకి స్ట్రెప్టావిడిన్-కంజుగేటెడ్ పెప్టైడ్‌లను 10 mg/kg మోతాదులో ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేశారు.
స్ట్రెప్టావిడిన్-పెప్టైడ్ కాంప్లెక్స్‌ల సాంద్రతను ELISA అంచనా వేసింది. నంక్ మాక్సిసార్ప్ మైక్రోటైటర్ ప్లేట్‌లను (సిగ్మా) రాత్రిపూట 4°C వద్ద 1.5 μg/ml మౌస్ యాంటీ-స్ట్రెప్టావిడిన్ యాంటీబాడీ (థర్మో, MA1-20011)తో పూత పూశారు. గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2 గంటల పాటు బ్లాక్ చేసిన తర్వాత (బ్లాకింగ్ బఫర్: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% జెలటిన్, 1% BSA) ప్లేట్‌ను 0.05% ట్వీన్-20/PBS (వాష్ బఫర్)తో 3 సెకన్ల పాటు కడగాలి, బ్లాకింగ్ బఫర్ (ప్లాస్మా 1:10,000, CSF 1:115)తో పలుచన చేసిన బావులకు CSF మరియు ప్లాస్మా నమూనాలను జోడించారు. ఆ తర్వాత ప్లేట్‌ను డిటెక్షన్ యాంటీబాడీ (1 μg/ml, యాంటీ-స్ట్రెప్టావిడిన్-HRP, నోవస్ NB120-7239)తో రాత్రిపూట 4°C వద్ద ఇంక్యుబేట్ చేశారు. మూడు సార్లు కడిగిన తర్వాత, TMB సబ్‌స్ట్రేట్ ద్రావణం (రోచె)లో 20 నిమిషాల వరకు ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా స్ట్రెప్టావిడిన్ కనుగొనబడింది. 1M H2SO4తో రంగు అభివృద్ధిని ఆపివేసిన తర్వాత, శోషణను 450 nm వద్ద కొలవండి.
స్ట్రెప్టావిడిన్-పెప్టైడ్-BACE1 ఇన్హిబిటర్ కాంప్లెక్స్ యొక్క పనితీరును తయారీదారు ప్రోటోకాల్ (వాకో, 294-64701) ప్రకారం Aβ(1-40) ELISA అంచనా వేసింది. క్లుప్తంగా, CSF నమూనాలను ప్రామాణిక డైల్యూయెంట్ (1:23)లో కరిగించి, BNT77 క్యాప్చర్ యాంటీబాడీతో పూత పూసిన 96-బావి ప్లేట్లలో 4°C వద్ద రాత్రిపూట పొదిగించారు. ఐదు వాషింగ్ దశల తర్వాత, HRP-కంజుగేటెడ్ BA27 యాంటీబాడీని జోడించి 4°C వద్ద 2 గంటలు పొదిగించారు, తరువాత ఐదు వాషింగ్ దశలు అనుసరించారు. గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాలు TMB ద్రావణంలో ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా Aβ(1–40) కనుగొనబడింది. స్టాప్ ద్రావణంతో రంగు అభివృద్ధిని ఆపివేసిన తర్వాత, 450 nm వద్ద శోషణను కొలవండి. Aβ(1–40) ELISAకి ముందు ప్లాస్మా నమూనాలను ఘన దశ వెలికితీతకు గురి చేశారు. ప్లాస్మాను 96-బావి ప్లేట్లలో 0.2% DEA (సిగ్మా)కి జోడించారు మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాలు పొదిగించారు. SPE ప్లేట్లను (ఒయాసిస్, 186000679) నీరు మరియు 100% మిథనాల్‌తో వరుసగా కడిగిన తర్వాత, ప్లాస్మా నమూనాలను SPE ప్లేట్‌లకు జోడించారు మరియు అన్ని ద్రవాలను తొలగించారు. నమూనాలను కడిగి (ముందుగా 5% మిథనాల్‌తో తరువాత 30% మిథనాల్‌తో) 2% NH4OH/90% మిథనాల్‌తో తొలగించారు. ఎల్యుయేట్‌ను 55°C వద్ద 99 నిమిషాలు స్థిరమైన N2 కరెంట్ వద్ద ఎండబెట్టిన తర్వాత, నమూనాలను ప్రామాణిక విలీనకారకాలలో తగ్గించారు మరియు పైన వివరించిన విధంగా Aβ(1–40) కొలుస్తారు.
ఈ వ్యాసాన్ని ఎలా ఉదహరించాలి: ఉరిచ్, ఇ. మరియు ఇతరులు. వివోలో గుర్తించబడిన ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్‌లను ఉపయోగించి మెదడుకు కార్గో డెలివరీ. ది సైన్స్. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
లిఖోటా జె., స్క్జోరింజ్ టి., థామ్సెన్ ఎల్బి మరియు మూస్ టి. లక్ష్య చికిత్సను ఉపయోగించి మెదడుకు స్థూల కణ ఔషధాల డెలివరీ. జర్నల్ ఆఫ్ న్యూరోకెమిస్ట్రీ 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
బ్రాస్న్‌జెవిక్, ఐ., స్టెయిన్‌బుష్, హెచ్‌డబ్ల్యు, ష్మిత్జ్, సి., మరియు మార్టినెజ్-మార్టినెజ్, పి. రక్త-మెదడు అవరోధం అంతటా పెప్టైడ్ మరియు ప్రోటీన్ ఔషధాల డెలివరీ. ప్రోగ్ న్యూరోబియోల్ 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
పార్డ్రిడ్జ్, WM రక్త-మెదడు అవరోధం: మెదడు ఔషధ అభివృద్ధిలో ఒక అడ్డంకి. న్యూరోఆర్ఎక్స్ 2, 3–14, 10.1602/న్యూరోర్క్స్.2.1.3 (2005).
జోహన్సన్, KE, డంకన్, JA, స్టోపా, EG, మరియు బైర్డ్, A. కోరోయిడ్ ప్లెక్సస్-CSF మార్గం ద్వారా మెదడుకు మెరుగైన ఔషధ డెలివరీ మరియు లక్ష్యానికి అవకాశాలు. ఫార్మాస్యూటికల్ రీసెర్చ్ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
పార్డ్రిడ్జ్, WM మెదడు డెలివరీ కోసం మాలిక్యులర్ ట్రోజన్ హార్స్‌తో బయోఫార్మాస్యూటికల్స్ యొక్క ఆధునికీకరణ. బయోకాన్జగ్ కెమ్ 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
పార్డ్రిడ్జ్, రక్త-మెదడు అవరోధం అంతటా WM గ్రాహక-మధ్యవర్తిత్వ పెప్టైడ్ రవాణా. ఎండోక్రార్ రెవ్. 7, 314–330 (1986).
నీవోహ్నర్, జె. మరియు ఇతరులు. మోనోవాలెంట్ మాలిక్యులర్ షటిల్స్ ఉపయోగించి మెదడు వ్యాప్తి మరియు చికిత్సా ప్రతిరోధకాల సామర్థ్యాన్ని పెంచండి. న్యూరాన్ 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
బియెన్-లీ, ఎన్. మరియు ఇతరులు. ట్రాన్స్‌ఫెరిన్ రిసెప్టర్ (TfR) రవాణా TfR యాంటీబాడీస్ యొక్క అఫినిటీ వేరియంట్‌ల మెదడు శోషణను నిర్ణయిస్తుంది. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).