Nature.comని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు.మీరు పరిమిత CSS మద్దతుతో బ్రౌజర్ సంస్కరణను ఉపయోగిస్తున్నారు.ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాల్సిందిగా మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా Internet Explorerలో అనుకూలత మోడ్‌ని నిలిపివేయండి).అదనంగా, కొనసాగుతున్న మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ని చూపుతాము.
ఒకేసారి మూడు స్లయిడ్‌ల రంగులరాట్నం ప్రదర్శిస్తుంది.ఒకేసారి మూడు స్లయిడ్‌ల ద్వారా తరలించడానికి మునుపటి మరియు తదుపరి బటన్‌లను ఉపయోగించండి లేదా ఒకేసారి మూడు స్లయిడ్‌ల ద్వారా తరలించడానికి చివర ఉన్న స్లయిడర్ బటన్‌లను ఉపయోగించండి.
రక్త-మెదడు అవరోధం మరియు రక్త-మెదడు అవరోధం బయోథెరపీటిక్ ఏజెంట్లను కేంద్ర నాడీ వ్యవస్థలో వారి లక్ష్యాలను చేరుకోకుండా నిరోధిస్తుంది, తద్వారా నాడీ సంబంధిత వ్యాధుల ప్రభావవంతమైన చికిత్సకు ఆటంకం కలిగిస్తుంది.వివోలో నావెల్ బ్రెయిన్ ట్రాన్స్‌పోర్టర్‌లను కనుగొనడానికి, మేము T7 ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీని పరిచయం చేసాము మరియు ఎలుకల కాన్యులేటెడ్ కాన్షియస్ లార్జ్ పూల్ మోడల్‌ని ఉపయోగించి రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ (CSF)ను సీరియల్‌గా సేకరించాము.నాలుగు రౌండ్‌ల ఎంపిక తర్వాత నిర్దిష్ట ఫేజ్ క్లోన్‌లు CSFలో బాగా సంపన్నం చేయబడ్డాయి.వ్యక్తిగత అభ్యర్థి పెప్టైడ్‌ల పరీక్ష CSFలో 1000 రెట్లు ఎక్కువ వృద్ధిని వెల్లడించింది.గుర్తించబడిన నవల ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్‌తో అనుసంధానించబడిన BACE1 పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్‌ను ఉపయోగించి సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో అమిలాయిడ్-β స్థాయిని 40% తగ్గించడం ద్వారా మెదడుకు పెప్టైడ్-మధ్యవర్తిత్వ డెలివరీ యొక్క బయోయాక్టివిటీ నిర్ధారించబడింది.వివో ఫేజ్ ఎంపిక పద్ధతుల ద్వారా గుర్తించబడిన పెప్టైడ్‌లు చికిత్సా ప్రభావంతో మెదడుకు స్థూల కణాలను దైహిక డెలివరీ చేయడానికి ఉపయోగకరమైన వాహనాలు కావచ్చని ఈ ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.
సెంట్రల్ నాడీ వ్యవస్థ (CNS) టార్గెటెడ్ థెరపీ రీసెర్చ్ ఎక్కువగా మెదడుకు యాక్టివ్ డ్రగ్ డెలివరీని నడిపించే మెకానిజమ్‌లను కనుగొనడంలో తక్కువ ప్రయత్నంతో, CNS-టార్గెటింగ్ లక్షణాలను ప్రదర్శించే ఆప్టిమైజ్ చేసిన మందులు మరియు ఏజెంట్‌లను గుర్తించడంపై దృష్టి సారించింది.డ్రగ్ డెలివరీ, ముఖ్యంగా పెద్ద అణువులు, ఆధునిక న్యూరోసైన్స్ డ్రగ్ డెవలప్‌మెంట్‌లో అంతర్భాగమైనందున ఇది ఇప్పుడు మారడం ప్రారంభించింది.రక్త-మెదడు అవరోధం (BBB) ​​మరియు రక్త-మెదడు అవరోధం (BCBB) 1 లను కలిగి ఉన్న సెరెబ్రోవాస్కులర్ అవరోధ వ్యవస్థ ద్వారా కేంద్ర నాడీ వ్యవస్థ యొక్క పర్యావరణం బాగా రక్షించబడింది, ఇది మెదడుకు మందులు పంపిణీ చేయడం సవాలుగా మారుతుంది.దాదాపు అన్ని పెద్ద మాలిక్యూల్ డ్రగ్స్ మరియు 98% కంటే ఎక్కువ చిన్న మాలిక్యూల్ డ్రగ్స్ మెదడు నుండి తొలగించబడతాయని అంచనా వేయబడింది3.అందుకే CNS 4,5కి సమర్థవంతమైన మరియు నిర్దిష్టమైన చికిత్సా ఔషధాలను అందించే కొత్త మెదడు రవాణా వ్యవస్థలను గుర్తించడం చాలా ముఖ్యం.అయినప్పటికీ, BBB మరియు BCSFB కూడా డ్రగ్ డెలివరీకి అద్భుతమైన అవకాశాన్ని అందిస్తాయి, ఎందుకంటే అవి విస్తృతమైన వాస్కులేచర్ ద్వారా మెదడులోని అన్ని నిర్మాణాలలోకి చొచ్చుకుపోతాయి.అందువల్ల, మెదడుకు డెలివరీ చేసే నాన్-ఇన్వాసివ్ పద్ధతులను ఉపయోగించడానికి ప్రస్తుత ప్రయత్నాలు ఎక్కువగా ఎండోజెనస్ BBB6 రిసెప్టర్‌ను ఉపయోగించి రిసెప్టర్-మెడియేటెడ్ ట్రాన్స్‌పోర్ట్ (PMT) మెకానిజంపై ఆధారపడి ఉంటాయి.ట్రాన్స్‌ఫ్రిన్ రిసెప్టర్ పాత్‌వే 7,8ని ఉపయోగించి ఇటీవలి కీలక పురోగతి ఉన్నప్పటికీ, మెరుగైన లక్షణాలతో కొత్త డెలివరీ సిస్టమ్‌ల మరింత అభివృద్ధి అవసరం.ఈ క్రమంలో, CSF రవాణాకు మధ్యవర్తిత్వం వహించగల పెప్టైడ్‌లను గుర్తించడం మా లక్ష్యం, ఎందుకంటే అవి సూత్రప్రాయంగా CNSకి స్థూల కణాలను అందించడానికి లేదా కొత్త గ్రాహక మార్గాలను తెరవడానికి ఉపయోగించబడతాయి.ప్రత్యేకించి, సెరెబ్రోవాస్కులర్ సిస్టమ్ (BBB మరియు BSCFB) యొక్క నిర్దిష్ట గ్రాహకాలు మరియు రవాణాదారులు బయోథెరప్యూటిక్ ఔషధాల యొక్క క్రియాశీల మరియు నిర్దిష్ట డెలివరీకి సంభావ్య లక్ష్యాలుగా ఉపయోగపడతాయి.సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ (CSF) అనేది కోరోయిడ్ ప్లెక్సస్ (CS) యొక్క రహస్య ఉత్పత్తి మరియు సబ్‌అరాక్నోయిడ్ స్పేస్ మరియు వెంట్రిక్యులర్ స్పేస్ ద్వారా మెదడు యొక్క ఇంటర్‌స్టీషియల్ ఫ్లూయిడ్‌తో ప్రత్యక్ష సంబంధంలో ఉంటుంది.సబ్‌అరాక్నోయిడ్ సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ మెదడులోని ఇంటర్‌స్టిటియంలోకి విపరీతంగా వ్యాపిస్తుందని ఇటీవల తేలింది.మేము ఈ సబ్‌అరాక్నోయిడ్ ఇన్‌ఫ్లో ట్రాక్‌ను ఉపయోగించి లేదా నేరుగా BBB ద్వారా పరేన్‌చైమల్ స్పేస్‌ను యాక్సెస్ చేయాలని ఆశిస్తున్నాము.దీనిని సాధించడానికి, మేము ఈ రెండు విభిన్న మార్గాలలో దేని ద్వారా రవాణా చేయబడిన పెప్టైడ్‌లను ఆదర్శంగా గుర్తించే వివో ఫేజ్ ఎంపిక వ్యూహంలో బలమైన విధానాన్ని అమలు చేసాము.
అత్యధిక లైబ్రరీ వైవిధ్యంతో ప్రారంభ ఎంపిక రౌండ్‌లను పర్యవేక్షించడానికి మేము ఇప్పుడు CSF నమూనాతో కూడిన సీక్వెన్షియల్ ఇన్ వివో ఫేజ్ డిస్‌ప్లే స్క్రీనింగ్ పద్ధతిని హై త్రూపుట్ సీక్వెన్సింగ్ (HTS)తో వివరిస్తాము.రక్తం కలుషితం కాకుండా ఉండేందుకు శాశ్వతంగా అమర్చిన పెద్ద సిస్టెర్నా (CM) కాన్యులాతో చేతన ఎలుకలపై స్క్రీనింగ్ నిర్వహించబడింది.ముఖ్యముగా, ఈ విధానం సెరెబ్రోవాస్కులర్ అవరోధం అంతటా రవాణా కార్యకలాపాలతో మెదడు-లక్ష్య మరియు పెప్టైడ్‌లు రెండింటినీ ఎంపిక చేస్తుంది.మేము T7 ఫేజ్‌లను వాటి చిన్న పరిమాణం (~ 60 nm) 10 కారణంగా ఉపయోగించాము మరియు అవి ఎండోథెలియల్ మరియు/లేదా ఎపిథీలియల్-మెడుల్లా అవరోధం యొక్క ట్రాన్స్ సెల్యులార్ క్రాసింగ్‌ను అనుమతించే వెసికిల్స్ రవాణాకు అనుకూలంగా ఉన్నాయని సూచించాము.నాలుగు రౌండ్ల పానింగ్ తర్వాత, ఫేజ్ పాపులేషన్‌లు వివో CSF సుసంపన్నం మరియు సెరిబ్రల్ మైక్రోవేస్సెల్ అసోసియేషన్‌లో బలంగా ఉన్నట్లు చూపుతున్నాయి.ముఖ్యముగా, ఇష్టపడే మరియు రసాయనికంగా సంశ్లేషణ చేయబడిన ఉత్తమ అభ్యర్థి పెప్టైడ్‌లు ప్రోటీన్ కార్గోను సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలోకి రవాణా చేయగలవని ప్రదర్శించడం ద్వారా మేము మా పరిశోధనలను నిర్ధారించగలిగాము.మొదట, BACE1 పెప్టైడ్ యొక్క నిరోధకంతో ప్రముఖ ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్‌ను కలపడం ద్వారా CNS యొక్క ఫార్మాకోడైనమిక్ ప్రభావాలు స్థాపించబడ్డాయి.వివో ఫంక్షనల్ స్క్రీనింగ్ వ్యూహాలలో నవల మెదడు రవాణా పెప్టైడ్‌లను ప్రభావవంతమైన ప్రోటీన్ కార్గో క్యారియర్‌లుగా గుర్తించవచ్చని నిరూపించడంతో పాటు, నవల మెదడు రవాణా మార్గాలను గుర్తించడంలో ఇలాంటి ఫంక్షనల్ ఎంపిక విధానాలు కూడా ముఖ్యమైనవిగా మారుతాయని మేము ఆశిస్తున్నాము.
ప్లేక్-ఫార్మింగ్ యూనిట్ల (PFU) ఆధారంగా, ఫేజ్ ప్యాకేజింగ్ దశ తర్వాత, యాదృచ్ఛిక 12-mer లీనియర్ T7 ఫేజ్ పెప్టైడ్‌ల లైబ్రరీ సుమారు 109 వైవిధ్యంతో రూపొందించబడింది మరియు సృష్టించబడింది (మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్ చూడండి).మేము ఈ లైబ్రరీని వివో పానింగ్‌లో ముందు జాగ్రత్తగా విశ్లేషించామని గమనించడం ముఖ్యం.సవరించిన ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి ఫేజ్ లైబ్రరీ నమూనాల PCR విస్తరణ నేరుగా HTSకి వర్తించే యాంప్లికాన్‌లను రూపొందించింది (అనుబంధ Fig. 1a).ఎ) HTS11 సీక్వెన్సింగ్ లోపాలు, బి) ప్రైమర్‌ల నాణ్యతపై ప్రభావం (NNK) 1-12, మరియు c) స్టాండ్‌బై లైబ్రరీలో వైల్డ్-టైప్ (wt) ఫేజ్ (అస్థిపంజరం ఇన్సర్ట్‌లు) ఉనికి కారణంగా, ధృవీకరించబడిన సీక్వెన్స్ సమాచారాన్ని మాత్రమే సేకరించేందుకు సీక్వెన్స్ ఫిల్టరింగ్ విధానం అమలు చేయబడింది (సప్లిమెంటరీ Fig. 1).ఈ ఫిల్టర్ దశలు అన్ని HTS సీక్వెన్సింగ్ లైబ్రరీలకు వర్తిస్తాయి.ప్రామాణిక లైబ్రరీ కోసం, మొత్తం 233,868 రీడ్‌లు పొందబడ్డాయి, వాటిలో 39% ఫిల్టర్ ప్రమాణాలను ఆమోదించాయి మరియు లైబ్రరీ విశ్లేషణ మరియు తదుపరి రౌండ్‌ల ఎంపిక కోసం ఉపయోగించబడ్డాయి (అనుబంధ మూర్తి 1c-e).లైబ్రరీ డిజైన్ (NNK) 1-12ను నిర్ధారిస్తూ 36 న్యూక్లియోటైడ్‌ల (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1c) వద్ద గరిష్టంగా ఉండే రీడ్‌లు ప్రధానంగా 3 బేస్ జతల పొడవుతో గుణిజాలుగా ఉంటాయి.ముఖ్యంగా, లైబ్రరీ సభ్యులలో సుమారు 11% మంది 12-డైమెన్షనల్ వైల్డ్-టైప్ (wt) బ్యాక్‌బోన్ PAGISRELVDKL ఇన్సర్ట్‌ను కలిగి ఉన్నారు మరియు దాదాపు సగం సీక్వెన్స్‌లు (49%) ఇన్‌సర్షన్‌లు లేదా తొలగింపులను కలిగి ఉన్నాయి.లైబ్రరీ లైబ్రరీ యొక్క HTS లైబ్రరీలోని పెప్టైడ్‌ల యొక్క అధిక వైవిధ్యాన్ని నిర్ధారించింది: 81% కంటే ఎక్కువ పెప్టైడ్ సీక్వెన్సులు ఒక్కసారి మాత్రమే కనుగొనబడ్డాయి మరియు ≥4 కాపీలలో 1.5% మాత్రమే సంభవించాయి (అనుబంధ Fig. 2a).కచేరీలలోని మొత్తం 12 స్థానాల వద్ద ఉన్న అమైనో ఆమ్లాల (aa) పౌనఃపున్యాలు క్షీణించిన NKK కచేరీల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన కోడన్‌ల సంఖ్యకు అంచనా వేసిన పౌనఃపున్యాలతో బాగా సంబంధం కలిగి ఉంటాయి (అనుబంధ Fig. 2b).ఈ ఇన్సర్ట్‌ల ద్వారా ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన aa అవశేషాల యొక్క గమనించిన ఫ్రీక్వెన్సీ, లెక్కించిన ఫ్రీక్వెన్సీ (r = 0.893) (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2c)తో బాగా సంబంధం కలిగి ఉంది.ఇంజెక్షన్ కోసం ఫేజ్ లైబ్రరీల తయారీలో ఎండోటాక్సిన్ యొక్క విస్తరణ మరియు తొలగింపు దశలు ఉంటాయి.ఇది ఫేజ్ లైబ్రరీల 12,13 వైవిధ్యాన్ని సమర్థవంతంగా తగ్గించగలదని గతంలో చూపబడింది.అందువల్ల, మేము ఎండోటాక్సిన్ తొలగింపుకు గురైన ప్లేట్-యాంప్లిఫైడ్ ఫేజ్ లైబ్రరీని క్రమం చేసాము మరియు AA యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీని అంచనా వేయడానికి అసలు లైబ్రరీతో పోల్చాము.అసలైన పూల్ మరియు యాంప్లిఫైడ్ మరియు ప్యూరిఫైడ్ పూల్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2d) మధ్య బలమైన సహసంబంధం (r = 0.995) గమనించబడింది, T7 ఫేజ్‌ని ఉపయోగించి ప్లేట్‌లపై విస్తరించిన క్లోన్‌ల మధ్య పోటీ పెద్ద పక్షపాతానికి కారణం కాదని సూచిస్తుంది.ఈ పోలిక ప్రతి లైబ్రరీలోని ట్రైపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌ల ఫ్రీక్వెన్సీపై ఆధారపడి ఉంటుంది, ఎందుకంటే లైబ్రరీల వైవిధ్యం (~109) HTSతో కూడా పూర్తిగా సంగ్రహించబడదు.ప్రతి స్థానం వద్ద aa యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీ విశ్లేషణ నమోదు చేయబడిన కచేరీల యొక్క చివరి మూడు స్థానాల్లో ఒక చిన్న స్థానం-ఆధారిత పక్షపాతాన్ని వెల్లడించింది (అనుబంధ Fig. 2e).ముగింపులో, లైబ్రరీ యొక్క నాణ్యత మరియు వైవిధ్యం ఆమోదయోగ్యమైనవని మేము నిర్ధారించాము మరియు అనేక రౌండ్ల ఎంపికల మధ్య ఫేజ్ లైబ్రరీల విస్తరణ మరియు తయారీ కారణంగా వైవిధ్యంలో చిన్న మార్పులు మాత్రమే గమనించబడ్డాయి.
BBB మరియు/లేదా BCSFB (Fig. 1a-b) ద్వారా ఇంట్రావీనస్‌గా (iv) ఇంజెక్ట్ చేయబడిన T7 ఫేజ్‌ను గుర్తించడానికి కాన్యులాను శస్త్రచికిత్స ద్వారా కాన్షియస్ ఎలుకల CM లోకి అమర్చడం ద్వారా సీరియల్ సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ నమూనాను నిర్వహించవచ్చు.మేము ఇన్ వివో ఎంపిక (Fig. 1c) యొక్క మొదటి మూడు రౌండ్‌లలో రెండు స్వతంత్ర ఎంపిక ఆయుధాలను (ఆర్మ్స్ A మరియు B) ఉపయోగించాము.మొదటి మూడు రౌండ్‌ల ఎంపికలో ప్రవేశపెట్టిన మొత్తం ఫేజ్‌ని తగ్గించడం ద్వారా మేము ఎంపిక యొక్క కఠినతను క్రమంగా పెంచాము.నాల్గవ రౌండ్ పానింగ్ కోసం, మేము A మరియు B శాఖల నుండి నమూనాలను కలిపి మూడు అదనపు స్వతంత్ర ఎంపికలను చేసాము.ఈ మోడల్‌లోని T7 ఫేజ్ కణాల ఇన్ వివో లక్షణాలను అధ్యయనం చేయడానికి, వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ (PAGISRELVDKL మాస్టర్ ఇన్సర్ట్) తోక సిర ద్వారా ఎలుకలలోకి ఇంజెక్ట్ చేయబడింది.వివిధ సమయ బిందువులలో సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ మరియు రక్తం నుండి ఫేజ్‌ల రికవరీ సాపేక్షంగా చిన్న T7 ఐకోసాహెడ్రల్ ఫేజ్‌లు రక్త కంపార్ట్‌మెంట్ నుండి వేగవంతమైన ప్రారంభ క్లియరెన్స్ దశను కలిగి ఉన్నాయని చూపించింది (అనుబంధ Fig. 3).నిర్వహించబడే టైటర్‌లు మరియు ఎలుకల రక్త పరిమాణం ఆధారంగా, మేము సుమారు 1% wt మాత్రమే లెక్కించాము.ఇంట్రావీనస్ ఇంజెక్షన్ తర్వాత 10 నిమిషాల తర్వాత రక్తంలో నిర్వహించబడిన మోతాదు నుండి ఫేజ్ కనుగొనబడింది.ఈ ప్రారంభ వేగవంతమైన క్షీణత తర్వాత, నెమ్మదిగా ప్రాధమిక క్లియరెన్స్ 27.7 నిమిషాల సగం-జీవితంతో కొలుస్తారు.ముఖ్యముగా, CSF కంపార్ట్‌మెంట్ నుండి చాలా తక్కువ ఫేజ్‌లు మాత్రమే తిరిగి పొందబడ్డాయి, ఇది CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ మైగ్రేషన్ కోసం తక్కువ నేపథ్యాన్ని సూచిస్తుంది (అనుబంధ Fig. 3).సగటున, మొత్తం నమూనా వ్యవధిలో (0-250 నిమిషాలు) సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్‌లో రక్తంలో T7 ఫేజ్ యొక్క 1 x 10-3% టైటర్‌లు మరియు ప్రారంభంలో 4 x 10-8% ఫేజ్‌లు మాత్రమే కనుగొనబడ్డాయి.ముఖ్యంగా, సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్‌లో వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ సగం జీవితం (25.7 నిమిషాలు) రక్తంలో గమనించినట్లే ఉంటుంది.రక్తం నుండి CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌ను వేరుచేసే అవరోధం CM-కాన్యులేటెడ్ ఎలుకలలో చెక్కుచెదరకుండా ఉందని ఈ డేటా నిరూపిస్తుంది, రక్తం నుండి CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి సులభంగా రవాణా చేయబడిన క్లోన్‌లను గుర్తించడానికి ఫేజ్ లైబ్రరీల యొక్క vivo ఎంపికను అనుమతిస్తుంది.
(ఎ) పెద్ద కొలను నుండి సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ (CSF)ని తిరిగి నమూనా చేయడానికి ఒక పద్ధతిని ఏర్పాటు చేయడం.(బి) కేంద్ర నాడీ వ్యవస్థ (CNS) అవరోధం యొక్క సెల్యులార్ స్థానాన్ని చూపే రేఖాచిత్రం మరియు రక్త-మెదడు అవరోధం (BBB) ​​మరియు రక్త-మెదడు అవరోధాన్ని దాటే పెప్టైడ్‌లను గుర్తించడానికి ఉపయోగించే ఎంపిక వ్యూహం.(సి) వివో ఫేజ్ డిస్‌ప్లే స్క్రీనింగ్ ఫ్లోచార్ట్‌లో.ప్రతి రౌండ్ ఎంపికలో, ఫేజ్‌లు (బాణాల లోపల జంతు ఐడెంటిఫైయర్‌లు) ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి.రెండు స్వతంత్ర ప్రత్యామ్నాయ శాఖలు (A, B) 4వ రౌండ్ ఎంపిక వరకు విడివిడిగా ఉంచబడతాయి.ఎంపిక రౌండ్లు 3 మరియు 4 కోసం, CSF నుండి సేకరించిన ప్రతి ఫేజ్ క్లోన్ మాన్యువల్‌గా క్రమం చేయబడింది.(d) T7 పెప్టైడ్ లైబ్రరీ (2 x 1012 ఫేజెస్/జంతువు) ఇంట్రావీనస్ ఇంజెక్షన్ తర్వాత రెండు క్యాన్యులేటెడ్ ఎలుకలలో మొదటి రౌండ్ ఎంపిక సమయంలో రక్తం (ఎరుపు వృత్తాలు) మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ (ఆకుపచ్చ త్రిభుజాలు) నుండి వేరుచేయబడిన ఫేజ్ యొక్క గతిశాస్త్రం.నీలి చతురస్రాలు రక్తంలో ఫేజ్ యొక్క సగటు ప్రారంభ సాంద్రతను సూచిస్తాయి, మొత్తం రక్త పరిమాణాన్ని పరిగణనలోకి తీసుకుని, ఇంజెక్ట్ చేయబడిన ఫేజ్ మొత్తం నుండి లెక్కించబడుతుంది.నలుపు చతురస్రాలు బ్లడ్ ఫేజ్ సాంద్రతల నుండి ఎక్స్‌ట్రాపోలేటెడ్ y లైన్ యొక్క ఖండన బిందువును సూచిస్తాయి.(e,f) పెప్టైడ్‌లో కనిపించే అన్ని అతివ్యాప్తి చెందుతున్న ట్రిపెప్టైడ్ మూలాంశాల సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీ మరియు పంపిణీని ప్రదర్శించండి.1000 రీడింగ్‌లలో కనుగొనబడిన మూలాంశాల సంఖ్య చూపబడింది.గణనీయంగా (p <0.001) సుసంపన్నమైన మూలాంశాలు ఎరుపు చుక్కలతో గుర్తించబడ్డాయి.(ఇ) ఇంజెక్ట్ చేయబడిన లైబ్రరీ యొక్క ట్రిపెప్టైడ్ మూలాంశం యొక్క సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీని జంతువుల నుండి రక్తం-ఉత్పన్నమైన ఫేజ్‌తో పోల్చడం సహసంబంధ స్కాటర్‌ప్లాట్ #1.1 మరియు #1.2.(ఎఫ్) రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్‌లో వేరుచేయబడిన యానిమల్ ఫేజ్ ట్రిపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌లు #1.1 మరియు #1.2 యొక్క సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీలను పోల్చిన సహసంబంధ స్కాటర్‌ప్లాట్.(g, h) రక్తం (g) వర్సెస్ ఇంజెక్ట్ చేయబడిన లైబ్రరీలు మరియు రెండు జంతువులలో ఒక రౌండ్ ఇన్ వివో ఎంపిక తర్వాత CSF (h) వర్సెస్ బ్లడ్‌లో ఫేజ్ సమృద్ధిగా ఉన్న ఫేజ్ యొక్క సీక్వెన్స్ ID ప్రాతినిధ్యం.ఒక-అక్షర కోడ్ యొక్క పరిమాణం ఆ స్థానంలో ఆ అమైనో ఆమ్లం ఎంత తరచుగా సంభవిస్తుందో సూచిస్తుంది.ఆకుపచ్చ = ధ్రువ, ఊదా = తటస్థ, నీలం = ప్రాథమిక, ఎరుపు = ఆమ్ల మరియు నలుపు = హైడ్రోఫోబిక్ అమైనో ఆమ్లాలు.మూర్తి 1a, b ఎడ్వర్డ్ ఉరిచ్ రూపొందించారు మరియు నిర్మించారు.
మేము ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీని రెండు CM ఇన్‌స్ట్రుమెంట్ ఎలుకలలోకి (క్లేడ్‌లు A మరియు B) ఇంజెక్ట్ చేసాము మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ మరియు రక్తం నుండి ఫేజ్‌ను వేరు చేసాము (మూర్తి 1d).వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్‌తో పోలిస్తే లైబ్రరీ యొక్క ప్రారంభ వేగవంతమైన క్లియరెన్స్ తక్కువగా ఉచ్ఛరించబడింది.రెండు జంతువులలో ఇంజెక్ట్ చేయబడిన లైబ్రరీ యొక్క సగటు సగం జీవితం రక్తంలో 24.8 నిమిషాలు, వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ మాదిరిగానే మరియు CSFలో 38.5 నిమిషాలు.ప్రతి జంతువు నుండి రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ ఫేజ్ నమూనాలు HTS కి లోబడి ఉంటాయి మరియు గుర్తించబడిన అన్ని పెప్టైడ్‌లు చిన్న ట్రిపెప్టైడ్ మూలాంశం ఉనికి కోసం విశ్లేషించబడ్డాయి.ట్రిపెప్టైడ్ మూలాంశాలు ఎంపిక చేయబడ్డాయి ఎందుకంటే అవి నిర్మాణ నిర్మాణం మరియు పెప్టైడ్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలకు కనీస ఆధారాన్ని అందిస్తాయి.ఇంజెక్ట్ చేయబడిన ఫేజ్ లైబ్రరీ మరియు రెండు జంతువుల రక్తం నుండి సేకరించిన క్లోన్‌ల మధ్య మూలాంశాల పంపిణీలో మేము మంచి సహసంబంధాన్ని కనుగొన్నాము (Fig. 1e).లైబ్రరీ కూర్పు రక్త కంపార్ట్‌మెంట్‌లో స్వల్పంగా మాత్రమే సమృద్ధిగా ఉందని డేటా సూచిస్తుంది.Weblogo16 సాఫ్ట్‌వేర్ యొక్క అనుసరణను ఉపయోగించి ప్రతి స్థానం వద్ద అమినో యాసిడ్ ఫ్రీక్వెన్సీలు మరియు ఏకాభిప్రాయ శ్రేణులు మరింత విశ్లేషించబడ్డాయి.ఆసక్తికరంగా, రక్తంలో గ్లైసిన్ అవశేషాలలో (Fig. 1g) బలమైన సుసంపన్నతను మేము కనుగొన్నాము.CSF నుండి ఎంపిక చేయబడిన క్లోన్‌లతో రక్తాన్ని పోల్చినప్పుడు, బలమైన ఎంపిక మరియు కొన్ని మూలాంశాల తొలగింపు గమనించబడ్డాయి (Fig. 1f), మరియు కొన్ని అమైనో ఆమ్లాలు 12-సభ్యుల (Fig. 1h)లో ముందుగా నిర్ణయించిన స్థానాల్లో ప్రాధాన్యతనిస్తాయి.ముఖ్యంగా, వ్యక్తిగత జంతువులు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్‌లో గణనీయంగా భిన్నంగా ఉంటాయి, అయితే రెండు జంతువులలో రక్త గ్లైసిన్ సుసంపన్నం గమనించబడింది (అనుబంధ Fig. 4a-j).జంతువులు #1.1 మరియు #1.2 యొక్క సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్‌లో సీక్వెన్స్ డేటా యొక్క కఠినమైన వడపోత తర్వాత, మొత్తం 964 మరియు 420 ప్రత్యేకమైన 12-మెర్ పెప్టైడ్‌లు పొందబడ్డాయి (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1d-e).వివివో ఎంపికలో వివిక్త ఫేజ్ క్లోన్‌లు విస్తరించబడ్డాయి మరియు రెండవ రౌండ్‌కు లోబడి ఉన్నాయి.రెండవ రౌండ్ ఎంపిక నుండి సంగ్రహించబడిన ఫేజ్ ప్రతి జంతువులో HTSకి లోబడి ఉంటుంది మరియు ట్రిపెప్టైడ్ మూలాంశాలు (Fig. 2a, b, ef) సంభవించడాన్ని విశ్లేషించడానికి గుర్తించబడిన అన్ని పెప్టైడ్‌లను మోటిఫ్ రికగ్నిషన్ ప్రోగ్రామ్‌కు ఇన్‌పుట్‌గా ఉపయోగించారు.CSF నుండి కోలుకున్న ఫేజ్ యొక్క మొదటి చక్రంతో పోలిస్తే, A మరియు B శాఖలలో CSFలో అనేక మూలాంశాల యొక్క తదుపరి ఎంపిక మరియు ఎంపికను మేము గమనించాము (Fig. 2).అవి స్థిరమైన క్రమం యొక్క విభిన్న నమూనాలను సూచిస్తాయో లేదో తెలుసుకోవడానికి నెట్‌వర్క్ గుర్తింపు అల్గోరిథం వర్తించబడింది.ప్రత్యామ్నాయ క్లాడ్ A (Fig. 2c, d) మరియు క్లాడ్ B (Fig. 2g, h)లో CSF ద్వారా పునరుద్ధరించబడిన 12-డైమెన్షనల్ సీక్వెన్స్‌ల మధ్య స్పష్టమైన సారూప్యత గమనించబడింది.ప్రతి శాఖలోని పూల్ చేయబడిన విశ్లేషణ 12-మెర్ పెప్టైడ్స్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 5 సి, డి) కోసం విభిన్న ఎంపిక ప్రొఫైల్‌లను వెల్లడించింది మరియు మొదటి రౌండ్ ఎంపికతో పోలిస్తే రెండవ రౌండ్ ఎంపిక తర్వాత పూల్ చేసిన క్లోన్‌ల కోసం కాలక్రమేణా CSF/బ్లడ్ టైటర్ నిష్పత్తిలో పెరుగుదల (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 5e).)
వివో ఫంక్షనల్ ఫేజ్ డిస్‌ప్లే ఎంపికలో రెండు వరుస రౌండ్‌ల ద్వారా సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్‌లోని మోటిఫ్‌లు మరియు పెప్టైడ్‌లను మెరుగుపరచడం.
ప్రతి జంతువు (జంతువులు #1.1 మరియు #1.2) మొదటి రౌండ్ నుండి కోలుకున్న అన్ని సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ ఫేజ్‌లు పూల్ చేయబడ్డాయి, విస్తరించబడ్డాయి, HT-సీక్వెన్స్ చేయబడ్డాయి మరియు తిరిగి ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి (2 x 1010 ఫేజెస్/జంతువు) 2 SM క్యాన్యులేటెడ్ ఎలుకలు (#1.1 → #).2.1 మరియు 2.2, 1.2 → 2.3 మరియు 2.4).(a,b,e,f) మొదటి మరియు రెండవ ఎంపిక రౌండ్‌లలో అన్ని CSF-ఉత్పన్నమైన ఫేజ్‌ల యొక్క ట్రిపెప్టైడ్ మూలాంశాల సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీని పోల్చిన సహసంబంధ స్కాటర్‌ప్లాట్‌లు.సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీ మరియు మోటిఫ్‌ల పంపిణీ రెండు ఓరియంటేషన్‌లలోని పెప్టైడ్‌లలో కనిపించే అన్ని అతివ్యాప్తి ట్రిపెప్టైడ్‌లను సూచిస్తుంది.1000 రీడింగ్‌లలో కనుగొనబడిన మూలాంశాల సంఖ్య చూపబడింది.పోల్చబడిన లైబ్రరీలలో ఒకదానిలో గణనీయంగా ఎంపిక చేయబడిన లేదా మినహాయించబడిన (p <0.001) మూలాంశాలు ఎరుపు చుక్కలతో హైలైట్ చేయబడ్డాయి.(c, d, g, h) vivo ఎంపికలో రౌండ్లు 2 మరియు 1 ఆధారంగా అన్ని CSF-రిచ్ 12 అమైనో యాసిడ్ లాంగ్ సీక్వెన్స్‌ల సీక్వెన్స్ లోగో ప్రాతినిధ్యం.ఒక-అక్షర కోడ్ యొక్క పరిమాణం ఆ స్థానంలో ఆ అమైనో ఆమ్లం ఎంత తరచుగా సంభవిస్తుందో సూచిస్తుంది.లోగోను సూచించడానికి, రెండు ఎంపిక రౌండ్‌ల మధ్య వ్యక్తిగత జంతువుల నుండి సంగ్రహించబడిన CSF సీక్వెన్స్‌ల ఫ్రీక్వెన్సీ పోల్చబడుతుంది మరియు రెండవ రౌండ్‌లోని సుసంపన్నమైన సీక్వెన్స్‌లు చూపబడతాయి: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 మరియు (h) #1.2–#2.4.(c, d) జంతువులలో ఇచ్చిన స్థానంలో అత్యంత సుసంపన్నమైన అమైనో ఆమ్లాలు సంఖ్య.2.1 మరియు నం.2.2 లేదా (g, h) జంతువులలో నం.2.3 మరియు సంఖ్య.2.4 రంగులో చూపబడ్డాయి.ఆకుపచ్చ = ధ్రువ, ఊదా = తటస్థ, నీలం = ప్రాథమిక, ఎరుపు = ఆమ్ల మరియు నలుపు = హైడ్రోఫోబిక్ అమైనో ఆమ్లాలు.
మూడవ రౌండ్ ఎంపిక తర్వాత, మేము రెండు జంతువుల నుండి వేరుచేయబడిన 332 CSF-పునర్నిర్మించిన ఫేజ్ క్లోన్‌ల నుండి 124 ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్‌లను (#3.1 మరియు #3.2) గుర్తించాము (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 6a).క్రమం LGSVS (18.7%) అత్యధిక సాపేక్ష నిష్పత్తిని కలిగి ఉంది, తర్వాత వైల్డ్-టైప్ ఇన్సర్ట్‌లు PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), మరియు SARGSWREIVSLS (2.2%).చివరి నాల్గవ రౌండ్లో, మేము మూడు వేర్వేరు జంతువుల నుండి స్వతంత్రంగా ఎంచుకున్న రెండు శాఖలను పూల్ చేసాము (Fig. 1c).CSF నుండి కోలుకున్న 925 సీక్వెన్స్డ్ ఫేజ్ క్లోన్‌లలో, నాల్గవ రౌండ్‌లో మేము 64 ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్‌లను (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 6b) కనుగొన్నాము, వీటిలో వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ యొక్క సాపేక్ష నిష్పత్తి 0.8%కి పడిపోయింది.నాల్గవ రౌండ్‌లో అత్యంత సాధారణమైన CSF క్లోన్‌లు LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC మరియు RRPQKINGARVC (3.6%) SD.%)).NNK లైబ్రరీ డిజైన్ కోసం డీజెనరేట్ కోడన్‌లను ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు లైబ్రరీ ప్రైమర్‌లలో న్యూక్లియోటైడ్ ఇన్సర్షన్‌లు/తొలగింపులు లేదా అకాల స్టాప్ కోడన్‌ల కారణంగా ఎంచుకున్న పెప్టైడ్‌ల పొడవు పరిధి ఏర్పడుతుంది.ప్రీమెచ్యూర్ స్టాప్ కోడన్‌లు తక్కువ పెప్టైడ్‌లను ఉత్పత్తి చేస్తాయి మరియు అవి అనుకూలమైన aa మూలాంశాన్ని కలిగి ఉన్నందున ఎంపిక చేయబడతాయి.సింథటిక్ లైబ్రరీల ప్రైమర్‌లలో చొప్పించడం/తొలగింపుల వల్ల పొడవైన పెప్టైడ్‌లు ఏర్పడవచ్చు.ఇది డిజైన్ చేయబడిన స్టాప్ కోడాన్‌ను ఫ్రేమ్ వెలుపల ఉంచుతుంది మరియు దిగువన కొత్త స్టాప్ కోడాన్ కనిపించే వరకు దాన్ని చదువుతుంది.సాధారణంగా, మేము ఇన్‌పుట్ డేటాను నమూనా అవుట్‌పుట్ డేటాతో పోల్చడం ద్వారా మొత్తం నాలుగు ఎంపిక రౌండ్‌ల కోసం ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ కారకాలను లెక్కించాము.మొదటి రౌండ్ స్క్రీనింగ్ కోసం, మేము వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ టైటర్‌లను నిర్దిష్ట-కాని నేపథ్య సూచనగా ఉపయోగించాము.ఆసక్తికరంగా, మొదటి CSF చక్రంలో ప్రతికూల ఫేజ్ ఎంపిక చాలా బలంగా ఉంది, కానీ రక్తంలో కాదు (Fig. 3a), పెప్టైడ్ లైబ్రరీలోని చాలా మంది సభ్యులు CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి లేదా సంబంధిత ఫేజ్‌లలోకి నిష్క్రియంగా వ్యాపించే తక్కువ సంభావ్యత వల్ల కావచ్చు లేదా బాక్టీరియోఫేజ్‌ల కంటే రక్తప్రవాహం నుండి మరింత సమర్థవంతంగా నిలుపుకోవడం లేదా తొలగించడం జరుగుతుంది.అయినప్పటికీ, రెండవ రౌండ్ పానింగ్‌లో, CSFలోని ఫేజ్‌ల యొక్క బలమైన ఎంపిక రెండు క్లాడ్‌లలో గమనించబడింది, మునుపటి రౌండ్ CSF తీసుకోవడం ప్రోత్సహించే పెప్టైడ్‌లను ప్రదర్శించే ఫేజ్‌లలో సమృద్ధిగా ఉందని సూచిస్తుంది (Fig. 3a).మళ్ళీ, ముఖ్యమైన రక్త సుసంపన్నం లేకుండా.మూడవ మరియు నాల్గవ రౌండ్లలో, ఫేజ్ క్లోన్‌లు CSFలో గణనీయంగా వృద్ధి చెందాయి.ఎంపిక యొక్క చివరి రెండు రౌండ్ల మధ్య ప్రతి ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్ యొక్క సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీని పోల్చి చూస్తే, నాల్గవ రౌండ్ ఎంపికలో (Fig. 3b) సీక్వెన్సులు మరింత సమృద్ధిగా ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము.పెప్టైడ్ ఓరియంటేషన్‌లను ఉపయోగించి మొత్తం 64 ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్‌ల నుండి మొత్తం 931 ట్రిపెప్టైడ్ మూలాంశాలు సంగ్రహించబడ్డాయి.ఇంజెక్ట్ చేయబడిన లైబ్రరీ (కట్-ఆఫ్: 10% ఎన్‌రిచ్‌మెంట్) (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 6c)తో పోలిస్తే నాల్గవ రౌండ్‌లోని అత్యంత సుసంపన్నమైన మూలాంశాలు అన్ని రౌండ్‌లలో వాటి సుసంపన్నత ప్రొఫైల్‌ల కోసం మరింత నిశితంగా పరిశీలించబడ్డాయి.ఎంపిక యొక్క సాధారణ నమూనాలు రెండు ఎంపిక శాఖల యొక్క మునుపటి అన్ని రౌండ్‌లలో అధ్యయనం చేయబడిన ఉద్దేశ్యాలు చాలా వరకు సమృద్ధిగా ఉన్నాయని చూపించాయి.అయితే, కొన్ని మూలాంశాలు (ఉదా SGL, VSG, LGS GSV) ప్రధానంగా ప్రత్యామ్నాయ క్లాడ్ A నుండి, మరికొన్ని (ఉదా. FGW, RTN, WGF, NTR) ప్రత్యామ్నాయ క్లాడ్ Bతో సమృద్ధిగా ఉన్నాయి.
CSF-సుసంపన్నమైన ఫేజ్-డిస్ప్లేడ్ పెప్టైడ్‌లు మరియు స్ట్రెప్టావిడిన్ పేలోడ్‌లతో సంయోగం చేయబడిన బయోటైనిలేటెడ్ లీడర్ పెప్టైడ్‌ల యొక్క CSF రవాణా యొక్క ధ్రువీకరణ.
(ఎ) ఇంజెక్ట్ చేయబడిన (ఇన్‌పుట్ = I) ఫేజ్ (PFU) టైటర్‌లు మరియు నిర్ణయించబడిన CSF ఫేజ్ టైటర్‌ల (అవుట్‌పుట్ = O) ఆధారంగా మొత్తం నాలుగు రౌండ్‌లలో (R1-R4) సుసంపన్నత నిష్పత్తులు లెక్కించబడతాయి.గత మూడు రౌండ్‌లకు (R2-R4) సుసంపన్నత కారకాలు మునుపటి రౌండ్‌తో మరియు మొదటి రౌండ్ (R1) బరువు డేటాతో పోల్చడం ద్వారా లెక్కించబడ్డాయి.ఓపెన్ బార్‌లు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్, షేడెడ్ బార్‌లు ప్లాస్మా.(***p<0.001, విద్యార్థుల t-టెస్ట్ ఆధారంగా).(బి) అత్యంత సమృద్ధిగా ఉన్న ఫేజ్ పెప్టైడ్‌ల జాబితా, ఎంపిక యొక్క 4వ రౌండ్ తర్వాత CSFలో సేకరించిన అన్ని ఫేజ్‌లకు వాటి సాపేక్ష నిష్పత్తి ప్రకారం ర్యాంక్ చేయబడింది.ఆరు అత్యంత సాధారణ ఫేజ్ క్లోన్‌లు రంగు, సంఖ్యలు మరియు ఎంపిక యొక్క 3 మరియు 4 రౌండ్‌ల మధ్య (ఇన్‌సెట్‌లు) వాటి సుసంపన్నత కారకాలలో హైలైట్ చేయబడ్డాయి.(సి, డి) రౌండ్ 4 నుండి ఆరు అత్యంత సుసంపన్నమైన ఫేజ్ క్లోన్‌లు, ఖాళీ ఫేజ్ మరియు పేరెంటల్ ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీలు CSF నమూనా నమూనాలో ఒక్కొక్కటిగా విశ్లేషించబడ్డాయి.సూచించిన సమయ బిందువులలో CSF మరియు రక్త నమూనాలను సేకరించారు..ఇంజెక్ట్ చేయబడిన ప్రతి ఫేజ్ క్లోన్ మరియు ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీ యొక్క CSF ఫార్మకోకైనటిక్స్ కాలక్రమేణా చూపబడతాయి.(d) నమూనా సమయంలో కోలుకున్న అన్ని ఫేజ్‌లు/mL సగటు CSF/రక్త నిష్పత్తిని చూపుతుంది.(ఇ) నాలుగు సింథటిక్ లీడర్ పెప్టైడ్‌లు మరియు ఒక గిలకొట్టిన నియంత్రణను బయోటిన్‌తో స్ట్రెప్టావిడిన్‌తో వాటి N-టెర్మినస్ (టెట్రామర్ డిస్‌ప్లే) ద్వారా ఇంజెక్షన్ (టెయిల్ వెయిన్ iv, 10 mg స్ట్రెప్టావిడిన్/కేజీ) ద్వారా అనుసంధానించారు.కనీసం మూడు ఇంట్యూబేటెడ్ ఎలుకలు (N = 3).)సూచించిన సమయ బిందువుల వద్ద CSF నమూనాలు సేకరించబడ్డాయి మరియు స్ట్రెప్టావిడిన్ సాంద్రతలను CSF యాంటీ స్ట్రెప్టావిడిన్ ELISA (nd = కనుగొనబడలేదు) ద్వారా కొలుస్తారు.(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA పరీక్ష ఆధారంగా).(f) అత్యంత సుసంపన్నమైన ఫేజ్ పెప్టైడ్ క్లోన్ #2002 (పర్పుల్) యొక్క అమైనో ఆమ్ల శ్రేణిని 4వ రౌండ్ ఎంపిక నుండి ఎంచుకున్న ఇతర ఫేజ్ పెప్టైడ్ క్లోన్‌లతో పోల్చడం.ఒకేలాంటి మరియు సారూప్య అమైనో ఆమ్ల శకలాలు రంగు-కోడెడ్.
నాల్గవ రౌండ్‌లోని అన్ని సుసంపన్నమైన ఫేజ్‌లలో (Fig. 3b), CSF నమూనా నమూనాలో తదుపరి వ్యక్తిగత విశ్లేషణ కోసం ఆరు అభ్యర్థుల క్లోన్‌లు ఎంపిక చేయబడ్డాయి.ఆరు క్యాండిడేట్ ఫేజ్, ఖాళీ ఫేజ్ (ఇన్సర్ట్ లేదు) మరియు ప్రొఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీలకు సమానమైన మొత్తంలో మూడు క్యాన్యులేటెడ్ CM జంతువులు ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి మరియు ఫార్మకోకైనటిక్స్ CSF (Fig. 3c) మరియు రక్తం (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 7) పరీక్షలలో నిర్ణయించబడ్డాయి.పరీక్షించిన అన్ని ఫేజ్ క్లోన్‌లు ఖాళీ నియంత్రణ ఫేజ్ (#1779) కంటే 10-1000 రెట్లు ఎక్కువ స్థాయిలో CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌ను లక్ష్యంగా చేసుకున్నాయి.ఉదాహరణకు, #2020 మరియు #2077 క్లోన్‌లు కంట్రోల్ ఫేజ్ కంటే దాదాపు 1000 రెట్లు ఎక్కువ CSF టైటర్‌లను కలిగి ఉన్నాయి.ఎంచుకున్న ప్రతి పెప్టైడ్ యొక్క ఫార్మకోకైనటిక్ ప్రొఫైల్ భిన్నంగా ఉంటుంది, అయితే అవన్నీ అధిక CSF హోమింగ్ సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటాయి.క్లోన్ #1903 మరియు #2011 కోసం కాలక్రమేణా స్థిరమైన తగ్గుదలని మేము గమనించాము, అయితే #2077, #2002 మరియు #2009 క్లోన్‌ల కోసం మొదటి 10 నిమిషాలలో పెరుగుదల సక్రియ రవాణాను సూచించవచ్చు కానీ ధృవీకరించబడాలి.క్లోన్ #2020, #2002 మరియు #2077 అధిక స్థాయిలలో స్థిరీకరించబడ్డాయి, అయితే క్లోన్ #2009 యొక్క CSF గాఢత ప్రారంభ పెరుగుదల తర్వాత నెమ్మదిగా తగ్గింది.మేము ప్రతి CSF అభ్యర్థి యొక్క సాపేక్ష ఫ్రీక్వెన్సీని దాని రక్త సాంద్రతతో పోల్చాము (Fig. 3d).ప్రతి CSF అభ్యర్థి యొక్క సగటు టైటర్ మరియు అన్ని నమూనా సమయాల్లో దాని బ్లడ్ టైటర్ యొక్క సహసంబంధం ఆరుగురు అభ్యర్థులలో ముగ్గురు రక్త CSFలో గణనీయంగా సమృద్ధిగా ఉన్నట్లు చూపించింది.ఆసక్తికరంగా, క్లోన్ #2077 అధిక రక్త స్థిరత్వాన్ని చూపించింది (అనుబంధ మూర్తి 7).పెప్టైడ్‌లు CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి ఫేజ్ కణాలు కాకుండా ఇతర సరుకులను చురుకుగా రవాణా చేయగలవని నిర్ధారించడానికి, మేము పెప్టైడ్‌లు ఫేజ్ కణంతో జతచేయబడిన N- టెర్మినస్ వద్ద బయోటిన్‌తో ఉత్పన్నం చేయబడిన నాలుగు లీడర్ పెప్టైడ్‌లను సంశ్లేషణ చేసాము.బయోటైనిలేటెడ్ పెప్టైడ్‌లు (నం. 2002, 2009, 2020 మరియు 2077) ఫేజ్ జ్యామితిని కొంతవరకు అనుకరించే మల్టీమెరిక్ రూపాలను పొందేందుకు స్ట్రెప్టావిడిన్ (SA)తో సంయోగం చేయబడ్డాయి.ఈ ఫార్మాట్ రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్‌లో SA ఎక్స్‌పోజర్‌ను కార్గో-ట్రాన్స్‌పోర్టింగ్ ప్రోటీన్ పెప్టైడ్‌లుగా కొలవడానికి కూడా మాకు అనుమతి ఇచ్చింది.ముఖ్యముగా, ఈ SA-సంయోగ ఆకృతిలో (Fig. 3e) సింథటిక్ పెప్టైడ్‌లు నిర్వహించబడినప్పుడు ఫేజ్ డేటా తరచుగా పునరుత్పత్తి చేయబడుతుంది.గిలకొట్టిన పెప్టైడ్‌లు తక్కువ ప్రారంభ బహిర్గతం మరియు 48 గంటల్లో గుర్తించలేని స్థాయిలతో వేగవంతమైన CSF క్లియరెన్స్‌ను కలిగి ఉన్నాయి.CSF స్పేస్‌లోకి ఈ పెప్టైడ్ ఫేజ్ క్లోన్‌ల డెలివరీ మార్గాలపై అంతర్దృష్టిని పొందడానికి, వివోలో ఇంట్రావీనస్ ఇంజెక్షన్ తర్వాత 1 గంట తర్వాత ఫేజ్ కణాలను నేరుగా గుర్తించడానికి ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ (IHC) ఉపయోగించి వ్యక్తిగత ఫేజ్ పెప్టైడ్ హిట్‌ల స్థానికీకరణను మేము విశ్లేషించాము.ముఖ్యంగా, #2002, #2077 మరియు #2009 క్లోన్‌లను మెదడు కేశనాళికలలో బలమైన మరక ద్వారా గుర్తించవచ్చు, అయితే కంట్రోల్ ఫేజ్ (#1779) మరియు క్లోన్ #2020 కనుగొనబడలేదు (అనుబంధ మూర్తి 8).ఈ పెప్టైడ్‌లు BBBని దాటడం ద్వారా మెదడుపై ప్రభావానికి దోహదం చేస్తాయని ఇది సూచిస్తుంది.ఈ పరికల్పనను పరీక్షించడానికి మరింత వివరణాత్మక విశ్లేషణ అవసరం, ఎందుకంటే BSCFB మార్గం కూడా చేరి ఉండవచ్చు.అత్యంత సుసంపన్నమైన క్లోన్ (#2002) యొక్క అమైనో ఆమ్ల క్రమాన్ని ఇతర ఎంపిక చేసిన పెప్టైడ్‌లతో పోల్చినప్పుడు, వాటిలో కొన్ని సారూప్యమైన అమైనో ఆమ్ల పొడిగింపులను కలిగి ఉన్నాయని గుర్తించబడింది, ఇది సారూప్య రవాణా యంత్రాంగాన్ని సూచిస్తుంది (Fig. 3f).
దాని ప్రత్యేకమైన ప్లాస్మా ప్రొఫైల్ మరియు కాలక్రమేణా CSFలో గణనీయమైన పెరుగుదల కారణంగా, ఫేజ్ డిస్‌ప్లే క్లోన్ #2077 సుదీర్ఘ 48-గంటల వ్యవధిలో మరింతగా అన్వేషించబడింది మరియు స్థిరమైన SA స్థాయిలతో (Fig. 4a) అనుబంధంగా గమనించిన CSFలో వేగవంతమైన పెరుగుదలను పునరుత్పత్తి చేయగలిగింది.ఇతర గుర్తించబడిన ఫేజ్ క్లోన్‌లకు సంబంధించి, #2077 మెదడు కేశనాళికల కోసం బలంగా తడిసినది మరియు అధిక రిజల్యూషన్‌లో చూసినప్పుడు క్యాపిల్లరీ మార్కర్ లెక్టిన్‌తో గణనీయమైన కోలోకలైజేషన్‌ను చూపించింది మరియు బహుశా పరేన్చైమల్ స్పేస్‌లో కొంత మరక ఉండవచ్చు (మూర్తి 4b).CNSలో పెప్టైడ్-మధ్యవర్తిత్వ ఔషధ ప్రభావాలను పొందవచ్చో లేదో పరిశోధించడానికి, మేము ఒక ప్రయోగాన్ని చేసాము, దీనిలో i) #2077 ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్ మరియు ii) BACE1 ఇన్హిబిటర్ పెప్టైడ్ యొక్క బయోటైనిలేటెడ్ వెర్షన్‌లు SAతో రెండు వేర్వేరు నిష్పత్తులలో మిళితం చేయబడ్డాయి.ఒక కలయిక కోసం మేము BACE1 పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్‌ను మాత్రమే ఉపయోగించాము మరియు మరొకదానికి మేము BACE1 పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్ యొక్క 1:3 నిష్పత్తిని #2077 పెప్టైడ్‌కు ఉపయోగించాము.రెండు నమూనాలు ఇంట్రావీనస్‌గా నిర్వహించబడ్డాయి మరియు బీటా-అమిలాయిడ్ పెప్టైడ్ 40 (అబెటా 40) యొక్క రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ స్థాయిలను కాలక్రమేణా కొలుస్తారు.మెదడు పరేన్చైమాలో BACE1 నిరోధాన్ని ప్రతిబింబిస్తుంది కాబట్టి Abeta40 CSFలో కొలుస్తారు.ఊహించినట్లుగా, రెండు సముదాయాలు Abeta40 (Fig. 4c, d) యొక్క రక్త స్థాయిలను గణనీయంగా తగ్గించాయి.అయినప్పటికీ, పెప్టైడ్ నెం. మిశ్రమాన్ని కలిగి ఉన్న నమూనాలు మాత్రమే.2077 మరియు SAతో సంయోగం చేయబడిన BACE1 పెప్టైడ్ యొక్క నిరోధకం సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్‌లో Abeta40లో గణనీయమైన తగ్గుదలకు కారణమైంది (Fig. 4c).డేటా పెప్టైడ్ నం.2077 60 kDa SA ప్రోటీన్‌ను CNSలోకి రవాణా చేయగలదు మరియు BACE1 పెప్టైడ్ యొక్క SA-సంయోగ నిరోధకాలతో ఔషధ ప్రభావాలను కూడా ప్రేరేపిస్తుంది.
(ఎ) T7 ఫేజ్ యొక్క క్లోనల్ ఇంజెక్షన్ (2 × 10 ఫేజ్‌లు/జంతువులు) CSF పెప్టైడ్ #2077 (RLSSVDSDLSGC) యొక్క దీర్ఘకాలిక ఫార్మకోకైనటిక్ ప్రొఫైల్‌లను చూపుతుంది మరియు కనీసం మూడు CM-ఇంట్యూబేటెడ్ ఎలుకలలో ఇంజెక్ట్ చేయని కంట్రోల్ ఫేజ్ (#1779).(బి) ఫేజ్-ఇంజెక్ట్ చేయబడిన ఎలుకలలో (2 × 10 10 ఫేజెస్/జంతువు) ప్రాతినిధ్య కార్టికల్ మైక్రోవేస్సెల్స్ యొక్క కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపిక్ ఇమేజ్ పెప్టైడ్ #2077 మరియు నాళాలు (లెక్టిన్) యొక్క ప్రతిఘటనను చూపుతుంది.ఈ ఫేజ్ క్లోన్‌లు 3 ఎలుకలకు అందించబడ్డాయి మరియు పెర్ఫ్యూజన్‌కు ముందు 1 గంట పాటు ప్రసరించడానికి అనుమతించబడ్డాయి.T7 ఫేజ్ క్యాప్సిడ్‌కు వ్యతిరేకంగా పాలిక్లోనల్ FITC-లేబుల్ చేయబడిన యాంటీబాడీస్‌తో మెదళ్ళు విభజించబడ్డాయి మరియు తడిసినవి.పెర్ఫ్యూజన్ మరియు తదుపరి స్థిరీకరణకు పది నిమిషాల ముందు, DyLight594-లేబుల్ చేయబడిన లెక్టిన్ ఇంట్రావీనస్‌గా నిర్వహించబడుతుంది.కేశనాళికల ల్యూమన్ మరియు పెరివాస్కులర్ మెదడు కణజాలంలో మైక్రోవేస్సెల్స్ మరియు ఫేజెస్ (ఆకుపచ్చ) యొక్క లూమినల్ సైడ్ యొక్క లెక్టిన్ స్టెయినింగ్ (ఎరుపు)ని చూపించే ఫ్లోరోసెంట్ చిత్రాలు.స్కేల్ బార్ 10 µmకి అనుగుణంగా ఉంటుంది.(c, d) బయోటైనిలేటెడ్ BACE1 ఇన్హిబిటరీ పెప్టైడ్ ఒంటరిగా లేదా బయోటైనిలేటెడ్ ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్ #2077తో కలిపి స్ట్రెప్టావిడిన్‌తో జతచేయబడింది, తర్వాత కనీసం మూడు కాన్యులేటెడ్ CM ఎలుకల (10 mg స్ట్రెప్టావిడిన్/కేజీ) ఇంట్రావీనస్ ఇంజెక్షన్ చేయబడింది.Aβ40లో BACE1 పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్-మధ్యవర్తిత్వ తగ్గింపు Aβ1-40 ELISA ద్వారా రక్తం (ఎరుపు) మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ (నారింజ) ద్వారా సూచించబడిన సమయ బిందువుల వద్ద కొలుస్తారు.మెరుగైన స్పష్టత కోసం, గ్రాఫ్‌పై 100% స్కేల్‌లో చుక్కల గీత గీస్తారు.(సి) 3:1 నిష్పత్తిలో ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్ #2077 మరియు BACE1 ఇన్హిబిటరీ పెప్టైడ్‌తో కలిపి స్ట్రెప్టావిడిన్‌తో చికిత్స చేయబడిన ఎలుకలలో రక్తం (ఎరుపు త్రిభుజాలు) మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ (నారింజ త్రిభుజాలు)లో Aβ40 శాతం తగ్గింపు.(డి) స్ట్రెప్టావిడిన్‌తో చికిత్స చేయబడిన ఎలుకల రక్తంలో Aβ40 (ఎరుపు వృత్తాలు) మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ (నారింజ వృత్తాలు) శాతం తగ్గింపు, BACE1 ఇన్హిబిటరీ పెప్టైడ్‌తో మాత్రమే.నియంత్రణలో Aβ గాఢత 420 pg/ml (ప్రామాణిక విచలనం = 101 pg/ml).
ఫేజ్ డిస్‌ప్లే బయోమెడికల్ రీసెర్చ్‌లోని అనేక రంగాలలో విజయవంతంగా వర్తించబడింది17.ఈ పద్ధతి వివో వాస్కులర్ డైవర్సిటీ స్టడీస్ 18,19లో అలాగే సెరిబ్రల్ నాళాలు 20,21,22,23,24,25,26 లక్ష్యంగా చేసుకున్న అధ్యయనాల్లో ఉపయోగించబడింది.ఈ అధ్యయనంలో, మేము ఈ ఎంపిక పద్ధతి యొక్క అనువర్తనాన్ని సెరిబ్రల్ నాళాలను లక్ష్యంగా చేసుకునే పెప్టైడ్‌ల యొక్క ప్రత్యక్ష గుర్తింపుకు మాత్రమే కాకుండా, రక్త-మెదడు అవరోధాన్ని దాటడానికి క్రియాశీల రవాణా లక్షణాలను కలిగి ఉన్న అభ్యర్థుల ఆవిష్కరణకు కూడా విస్తరించాము.మేము ఇప్పుడు CM ఇంట్యూబేటెడ్ ఎలుకలలో ఇన్ వివో ఎంపిక ప్రక్రియ యొక్క అభివృద్ధిని వివరిస్తాము మరియు CSF హోమింగ్ లక్షణాలతో పెప్టైడ్‌లను గుర్తించే సామర్థ్యాన్ని ప్రదర్శిస్తాము.12-మెర్ యాదృచ్ఛిక పెప్టైడ్‌ల లైబ్రరీని ప్రదర్శించే T7 ఫేజ్‌ను ఉపయోగించి, T7 ఫేజ్ రక్త-మెదడు అవరోధానికి అనుగుణంగా ఉండేలా (సుమారు 60 nm వ్యాసం) 10 చిన్నదని, తద్వారా నేరుగా రక్త-మెదడు అవరోధం లేదా కోరోయిడ్ ప్లెక్సస్‌ను దాటుతుందని మేము నిరూపించగలిగాము.కాన్యులేటెడ్ CM ఎలుకల నుండి CSF హార్వెస్టింగ్ వివో ఫంక్షనల్ స్క్రీనింగ్ పద్ధతిలో బాగా నియంత్రించబడిందని మరియు వెలికితీసిన ఫేజ్ వాస్కులేచర్‌కు కట్టుబడి ఉండటమే కాకుండా రక్త-మెదడు అవరోధం అంతటా ట్రాన్స్‌పోర్టర్‌గా కూడా పనిచేస్తుందని మేము గమనించాము.ఇంకా, ఏకకాలంలో రక్తాన్ని సేకరించడం ద్వారా మరియు CSF మరియు రక్తం-ఉత్పన్నమైన ఫేజ్‌లకు HTSని వర్తింపజేయడం ద్వారా, CSF యొక్క మా ఎంపిక రక్తాన్ని మెరుగుపరచడం లేదా ఎంపిక రౌండ్ల మధ్య విస్తరణ కోసం ఫిట్‌నెస్ ద్వారా ప్రభావితం కాలేదని మేము ధృవీకరించాము.అయినప్పటికీ, రక్త కంపార్ట్‌మెంట్ ఎంపిక ప్రక్రియలో భాగం, ఎందుకంటే CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌ను చేరుకోగల సామర్థ్యం ఉన్న ఫేజ్‌లు మెదడులో తమను తాము సుసంపన్నం చేసుకోవడానికి చాలా కాలం పాటు రక్తప్రవాహంలో జీవించి ఉండాలి.ముడి HTS డేటా నుండి నమ్మదగిన సీక్వెన్స్ సమాచారాన్ని సేకరించేందుకు, మేము విశ్లేషణ వర్క్‌ఫ్లో ప్లాట్‌ఫారమ్-నిర్దిష్ట సీక్వెన్సింగ్ ఎర్రర్‌లకు అనుగుణంగా ఫిల్టర్‌లను అమలు చేసాము.స్క్రీనింగ్ పద్ధతిలో గతి పారామితులను చేర్చడం ద్వారా, మేము రక్తం24, 27, 28లో వైల్డ్-టైప్ T7 ఫేజ్‌ల (t½ ~ 28 నిమి) యొక్క వేగవంతమైన ఫార్మకోకైనటిక్స్‌ను నిర్ధారించాము మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్‌లో (t½ ~ 26 నిమి) నిమిషానికి వాటి సగం జీవితాన్ని కూడా నిర్ణయించాము).రక్తం మరియు CSFలో ఒకే విధమైన ఫార్మకోకైనటిక్ ప్రొఫైల్‌లు ఉన్నప్పటికీ, CSFలో ఫేజ్ యొక్క రక్త సాంద్రతలో 0.001% మాత్రమే కనుగొనబడింది, ఇది రక్త-మెదడు అవరోధం అంతటా వైల్డ్-టైప్ T7 ఫేజ్ యొక్క తక్కువ నేపథ్య చలనశీలతను సూచిస్తుంది.కొన్ని క్లోన్‌లు CNS కంపార్ట్‌మెంట్‌ను చేరుకోగలవు కాబట్టి, ముఖ్యంగా సర్క్యులేషన్ నుండి వేగంగా తొలగించబడే ఫేజ్ సిస్టమ్‌ల కోసం, vivo పానింగ్ వ్యూహాలలో ఉపయోగించినప్పుడు మొదటి రౌండ్ ఎంపిక యొక్క ప్రాముఖ్యతను ఈ పని హైలైట్ చేస్తుంది.అందువల్ల, మొదటి రౌండ్‌లో, లైబ్రరీ వైవిధ్యంలో తగ్గింపు చాలా పెద్దది, ఎందుకంటే ఈ చాలా కఠినమైన CSF మోడల్‌లో చివరికి పరిమిత సంఖ్యలో క్లోన్‌లు మాత్రమే సేకరించబడ్డాయి.CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌లో క్రియాశీలంగా చేరడం, రక్తపు కంపార్ట్‌మెంట్‌లో క్లోన్ మనుగడ మరియు మొదటి 10 నిమిషాల్లో రక్తం నుండి T7 ఫేజ్ క్లోన్‌లను వేగంగా తొలగించడం వంటి అనేక ఎంపిక దశలను ఇది vivo పానింగ్ వ్యూహంలో చేర్చింది (Fig. 1d మరియు అనుబంధ Fig. 4M).)ఈ విధంగా, మొదటి రౌండ్ తర్వాత, CSFలో వేర్వేరు ఫేజ్ క్లోన్‌లు గుర్తించబడ్డాయి, అయినప్పటికీ అదే ప్రారంభ పూల్ వ్యక్తిగత జంతువులకు ఉపయోగించబడింది.పెద్ద సంఖ్యలో లైబ్రరీ సభ్యులు ఉన్న సోర్స్ లైబ్రరీల కోసం అనేక కఠినమైన ఎంపిక దశలు వైవిధ్యంలో గణనీయమైన తగ్గింపుకు దారితీస్తాయని ఇది సూచిస్తుంది.అందువల్ల, యాదృచ్ఛిక సంఘటనలు ప్రారంభ ఎంపిక ప్రక్రియలో అంతర్భాగంగా మారతాయి, ఇది ఫలితాన్ని బాగా ప్రభావితం చేస్తుంది.అసలు లైబ్రరీలోని చాలా క్లోన్‌లు చాలా సారూప్యమైన CSF సుసంపన్నత ప్రవృత్తిని కలిగి ఉండే అవకాశం ఉంది.అయినప్పటికీ, అదే ప్రయోగాత్మక పరిస్థితులలో కూడా, ప్రారంభ పూల్‌లోని ప్రతి నిర్దిష్ట క్లోన్ యొక్క చిన్న సంఖ్య కారణంగా ఎంపిక ఫలితాలు భిన్నంగా ఉండవచ్చు.
CSFలో సుసంపన్నమైన మూలాంశాలు రక్తంలో ఉన్న వాటికి భిన్నంగా ఉంటాయి.ఆసక్తికరంగా, వ్యక్తిగత జంతువుల రక్తంలో గ్లైసిన్ అధికంగా ఉండే పెప్టైడ్‌ల వైపు మొదటి మార్పును మేము గుర్తించాము.(Fig. 1g, సప్లిమెంటరీ ఫిగ్స్. 4e, 4f).గ్లైసిన్ పెప్టైడ్‌లను కలిగి ఉన్న ఫేజ్ మరింత స్థిరంగా ఉండవచ్చు మరియు ప్రసరణ నుండి బయటకు తీసే అవకాశం తక్కువగా ఉంటుంది.అయినప్పటికీ, ఈ గ్లైసిన్-రిచ్ పెప్టైడ్‌లు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ నమూనాలలో కనుగొనబడలేదు, క్యూరేటెడ్ లైబ్రరీలు రెండు వేర్వేరు ఎంపిక దశల ద్వారా వెళ్ళాయని సూచిస్తున్నాయి: ఒకటి రక్తంలో మరియు మరొకటి సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో పేరుకుపోవడానికి అనుమతించబడింది.నాల్గవ రౌండ్ ఎంపిక ఫలితంగా CSF-సుసంపన్నమైన క్లోన్‌లు విస్తృతంగా పరీక్షించబడ్డాయి.ఖాళీ నియంత్రణ ఫేజ్‌తో పోల్చితే దాదాపు అన్ని వ్యక్తిగతంగా పరీక్షించిన క్లోన్‌లు CSFలో సమృద్ధిగా ఉన్నట్లు నిర్ధారించబడింది.ఒక పెప్టైడ్ హిట్ (#2077) మరింత వివరంగా పరిశీలించబడింది.ఇది ఇతర హిట్‌లతో పోలిస్తే ఎక్కువ ప్లాస్మా సగం జీవితాన్ని చూపించింది (మూర్తి 3డి మరియు అనుబంధ మూర్తి 7), మరియు ఆసక్తికరంగా, ఈ పెప్టైడ్ సి-టెర్మినస్‌లో సిస్టీన్ అవశేషాలను కలిగి ఉంది.పెప్టైడ్‌లకు సిస్టీన్‌ను జోడించడం వల్ల అల్బుమిన్ 29కి బంధించడం ద్వారా వాటి ఫార్మకోకైనటిక్ లక్షణాలను మెరుగుపరుస్తుందని ఇటీవల తేలింది.ఇది ప్రస్తుతం పెప్టైడ్ #2077కి తెలియదు మరియు తదుపరి అధ్యయనం అవసరం.కొన్ని పెప్టైడ్‌లు CSF ఎన్‌రిచ్‌మెంట్‌లో వాలెన్స్-డిపెండెన్సీని చూపించాయి (డేటా చూపబడలేదు), ఇది T7 క్యాప్సిడ్ యొక్క ప్రదర్శిత ఉపరితల జ్యామితికి సంబంధించినది కావచ్చు.మేము ఉపయోగించిన T7 సిస్టమ్ ప్రతి ఫేజ్ కణానికి ప్రతి పెప్టైడ్ యొక్క 5-15 కాపీలను చూపించింది.ఎలుకల సెరిబ్రల్ కార్టెక్స్‌లోకి ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేయబడిన అభ్యర్థి లీడ్ ఫేజ్ క్లోన్‌లపై IHC ప్రదర్శించబడింది (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 8).BBBతో కనీసం మూడు క్లోన్‌లు (నం. 2002, నం. 2009 మరియు నం. 2077) సంకర్షణ చెందాయని డేటా చూపించింది.ఈ BBB పరస్పర చర్య CSF చేరడం లేదా ఈ క్లోన్‌ల కదలిక నేరుగా BCSFBకి దారితీస్తుందా అనేది నిర్ణయించాల్సి ఉంది.ముఖ్యముగా, ఎంచుకున్న పెప్టైడ్‌లు సంశ్లేషణ చేయబడినప్పుడు మరియు ప్రోటీన్ కార్గోకు కట్టుబడి ఉన్నప్పుడు వాటి CSF రవాణా సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉన్నాయని మేము చూపుతాము.N-టెర్మినల్ బయోటైనిలేటెడ్ పెప్టైడ్‌లను SAకి బంధించడం తప్పనిసరిగా రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్‌లో వాటి సంబంధిత ఫేజ్ క్లోన్‌లతో పొందిన ఫలితాలను పునరావృతం చేస్తుంది (Fig. 3e).చివరగా, లెడ్ పెప్టైడ్ #2077 SAతో సంయోగం చేయబడిన BACE1 యొక్క బయోటైనిలేటెడ్ పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్ యొక్క మెదడు చర్యను ప్రోత్సహించగలదని మేము చూపిస్తాము, CSFలో Abeta40 స్థాయిలను గణనీయంగా తగ్గించడం ద్వారా CNSలో ఫార్మాకోడైనమిక్ ప్రభావాలను ఉచ్ఛరిస్తారు (Fig. 4).మేము అన్ని హిట్‌ల పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్ హోమోలజీ శోధనను నిర్వహించడం ద్వారా డేటాబేస్‌లో ఏ హోమోలాగ్‌లను గుర్తించలేకపోయాము.T7 లైబ్రరీ పరిమాణం సుమారుగా 109 అని గమనించడం ముఖ్యం, అయితే 12-మెర్స్ కోసం సైద్ధాంతిక లైబ్రరీ పరిమాణం 4 x 1015. కాబట్టి, మేము 12-మెర్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీ యొక్క వైవిధ్య స్థలంలో ఒక చిన్న భాగాన్ని మాత్రమే ఎంచుకున్నాము, దీని అర్థం ఈ ideevas optimizes adpept ద్వారా గుర్తించవచ్చు.ఊహాత్మకంగా, ఈ పెప్టైడ్‌ల యొక్క సహజ హోమోలాగ్‌లను మనం కనుగొనకపోవడానికి ఒక కారణం మెదడులోకి కొన్ని పెప్టైడ్ మూలాంశాలు అనియంత్రిత ప్రవేశాన్ని నిరోధించడానికి పరిణామ సమయంలో ఎంపికను తీసివేయడం.
కలిసి చూస్తే, వివోలోని సెరెబ్రోవాస్కులర్ అవరోధం యొక్క రవాణా వ్యవస్థలను మరింత వివరంగా గుర్తించడానికి మరియు వర్గీకరించడానికి మా ఫలితాలు భవిష్యత్ పనికి ఆధారాన్ని అందిస్తాయి.ఈ పద్ధతి యొక్క ప్రాథమిక సెటప్ సెరిబ్రల్ వాస్కులర్ బైండింగ్ లక్షణాలతో క్లోన్‌లను గుర్తించడమే కాకుండా, CNS కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి వివోలోని జీవసంబంధమైన అడ్డంకులను దాటడానికి విజయవంతమైన క్లోన్‌లు అంతర్గత కార్యాచరణను కలిగి ఉండే కీలకమైన దశను కలిగి ఉండే ఫంక్షనల్ ఎంపిక వ్యూహంపై ఆధారపడి ఉంటుంది.ఈ పెప్టైడ్‌ల రవాణా యొక్క యంత్రాంగాన్ని మరియు మెదడు ప్రాంతానికి ప్రత్యేకమైన మైక్రోవాస్కులేచర్‌కు కట్టుబడి ఉండటానికి వాటి ప్రాధాన్యతను వివరించడం.ఇది BBB మరియు గ్రాహకాల రవాణా కోసం కొత్త మార్గాల ఆవిష్కరణకు దారితీయవచ్చు.గుర్తించబడిన పెప్టైడ్‌లు నేరుగా సెరెబ్రోవాస్కులర్ రిసెప్టర్‌లకు లేదా BBB లేదా BCSFB ద్వారా రవాణా చేయబడిన లిగాండ్‌లకు నేరుగా బంధించగలవని మేము ఆశిస్తున్నాము.ఈ పనిలో కనుగొనబడిన CSF రవాణా కార్యకలాపాలతో పెప్టైడ్ వెక్టర్స్ మరింత పరిశోధించబడతాయి.BBB మరియు/లేదా BCSFBని దాటగల సామర్థ్యం కోసం ఈ పెప్టైడ్‌ల మెదడు విశిష్టతను మేము ప్రస్తుతం పరిశీలిస్తున్నాము.ఈ కొత్త పెప్టైడ్‌లు కొత్త గ్రాహకాలు లేదా మార్గాల సంభావ్య ఆవిష్కరణకు మరియు బయోలాజిక్స్ వంటి స్థూల కణాలను మెదడుకు అందించడానికి కొత్త అత్యంత సమర్థవంతమైన ప్లాట్‌ఫారమ్‌ల అభివృద్ధికి అత్యంత విలువైన సాధనాలు.
మునుపు వివరించిన పద్ధతి యొక్క సవరణను ఉపయోగించి పెద్ద సిస్టెర్నా (CM)ని కాన్యులేట్ చేయండి.మత్తుమందు చేయబడిన విస్టార్ ఎలుకలను (200-350 గ్రా) స్టీరియోటాక్సిక్ ఉపకరణంపై అమర్చారు మరియు పుర్రెను బహిర్గతం చేయడానికి షేవ్ చేయబడిన మరియు అసెప్టిక్‌గా తయారు చేయబడిన తలపై మధ్యస్థ కోత చేయబడింది.ఎగువ సాష్ యొక్క ప్రాంతంలో రెండు రంధ్రాలు వేయండి మరియు రంధ్రాలలో ఫిక్సింగ్ స్క్రూలను కట్టుకోండి.CM లోకి స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ కాన్యులా యొక్క స్టీరియోటాక్టిక్ మార్గదర్శకత్వం కోసం పార్శ్వ ఆక్సిపిటల్ క్రెస్ట్‌లో అదనపు రంధ్రం వేయబడింది.కాన్యులా చుట్టూ డెంటల్ సిమెంట్‌ను పూయండి మరియు స్క్రూలతో భద్రపరచండి.ఫోటో-క్యూరింగ్ మరియు సిమెంట్ గట్టిపడటం తర్వాత, చర్మ గాయం 4/0 సుప్రమిడ్ కుట్టుతో మూసివేయబడింది.సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ (CSF) యొక్క ఆకస్మిక లీకేజ్ ద్వారా కాన్యులా యొక్క సరైన స్థానం నిర్ధారించబడింది.స్టీరియోటాక్సిక్ ఉపకరణం నుండి ఎలుకను తొలగించండి, తగిన శస్త్రచికిత్స అనంతర సంరక్షణ మరియు నొప్పి నిర్వహణను పొందండి మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవంలో రక్తం యొక్క సంకేతాలను గమనించే వరకు కనీసం ఒక వారం పాటు కోలుకోవడానికి అనుమతించండి.విస్టార్ ఎలుకలు (Crl:WI/Han) చార్లెస్ నది (ఫ్రాన్స్) నుండి పొందబడ్డాయి.అన్ని ఎలుకలు నిర్దిష్ట వ్యాధికారక రహిత పరిస్థితులలో ఉంచబడ్డాయి.అన్ని జంతు ప్రయోగాలు స్విట్జర్లాండ్‌లోని బాసెల్ నగరం యొక్క వెటర్నరీ ఆఫీస్ ద్వారా ఆమోదించబడ్డాయి మరియు జంతు లైసెన్స్ నం. 2474 (సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ మరియు బ్రెయిన్ ఆఫ్ ఎలుకలో చికిత్సా అభ్యర్థుల స్థాయిలను కొలవడం ద్వారా యాక్టివ్ బ్రెయిన్ ట్రాన్స్‌పోర్ట్ యొక్క అంచనా) ప్రకారం నిర్వహించబడ్డాయి.
చేతిలో సీఎం కాన్యులాతో ఎలుకను సున్నితంగా ఉంచాలి.కాన్యులా నుండి డాతురాను తీసివేసి, 10 µl ఆకస్మికంగా ప్రవహించే సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవాన్ని సేకరించండి.కాన్యులా యొక్క పేటెన్సీ అంతిమంగా రాజీ పడినందున, రక్త కాలుష్యం లేదా రంగు మారినట్లు ఎటువంటి ఆధారాలు లేని స్పష్టమైన సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్ నమూనాలు మాత్రమే ఈ అధ్యయనంలో చేర్చబడ్డాయి.సమాంతరంగా, సుమారు 10-20 μl రక్తం తోక యొక్క కొన వద్ద ఉన్న చిన్న కోత నుండి హెపారిన్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్)తో గొట్టాలలోకి తీసుకోబడింది.T7 ఫేజ్ యొక్క ఇంట్రావీనస్ ఇంజెక్షన్ తర్వాత CSF మరియు రక్తం వివిధ సమయ బిందువులలో సేకరించబడ్డాయి.ప్రతి CSF నమూనాను సేకరించే ముందు సుమారు 5-10 μl ద్రవం విస్మరించబడింది, ఇది కాథెటర్ యొక్క డెడ్ వాల్యూమ్‌కు అనుగుణంగా ఉంటుంది.
T7Select సిస్టమ్ మాన్యువల్‌లో వివరించిన విధంగా T7Select 10-3b వెక్టార్‌ని ఉపయోగించి లైబ్రరీలు రూపొందించబడ్డాయి (నోవాగెన్, రోసెన్‌బర్గ్ మరియు ఇతరులు, ఇన్నోవేషన్స్ 6, 1-6, 1996).క్లుప్తంగా, యాదృచ్ఛిక 12-mer DNA ఇన్సర్ట్ క్రింది ఆకృతిలో సంశ్లేషణ చేయబడింది:
ఇన్సర్ట్‌లో డబుల్ స్టాప్ కోడన్‌లు మరియు అమైనో యాసిడ్ ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెషన్‌ను నివారించడానికి NNK కోడాన్ ఉపయోగించబడింది.N అనేది ప్రతి న్యూక్లియోటైడ్ యొక్క మానవీయంగా మిశ్రమ ఈక్విమోలార్ నిష్పత్తి, మరియు K అనేది అడెనిన్ మరియు సైటోసిన్ న్యూక్లియోటైడ్‌ల యొక్క మానవీయంగా మిశ్రమ ఈక్విమోలార్ నిష్పత్తి.37°C వద్ద 3 గంటల పాటు క్లెనో బఫర్‌లో (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్) dNTP (నోవాజెన్) మరియు క్లెనో ఎంజైమ్ (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్)తో మరింత పొదిగించడం ద్వారా సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ ప్రాంతాలు డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNAగా మార్చబడ్డాయి.ప్రతిచర్య తరువాత, EtOH అవపాతం ద్వారా డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA తిరిగి పొందబడింది.ఫలితంగా వచ్చిన DNA పరిమితి ఎంజైమ్‌లతో EcoRI మరియు HindIII (రెండూ రోచె నుండి) జీర్ణం చేయబడింది.క్లీవ్డ్ మరియు ప్యూరిఫైడ్ (QIAquick, Qiagen) ఇన్సర్ట్ (T4 లిగేస్, న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్) 10B క్యాప్సిడ్ జన్యువు యొక్క అమినో యాసిడ్ 348 తర్వాత ప్రీ-క్లీవ్డ్ T7 వెక్టర్‌లోకి ఫ్రేమ్‌లో లిగేట్ చేయబడింది.ఇన్ విట్రో ప్యాకేజింగ్‌కు ముందు 18 గంటల పాటు బంధన ప్రతిచర్యలు 16 ° C. వద్ద పొదిగేవి.T7Select 10-3b క్లోనింగ్ కిట్ (నోవాగెన్)తో అందించబడిన సూచనల ప్రకారం ఫేజ్ ప్యాకేజింగ్ ఇన్ విట్రో నిర్వహించబడింది మరియు ఎస్చెరిచియా కోలి (BLT5615, నోవాజెన్) ఉపయోగించి లైసిస్‌కు ప్యాకేజింగ్ సొల్యూషన్ ఒకసారి విస్తరించబడింది.లైసేట్‌లు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడ్డాయి, టైట్రేట్ చేయబడ్డాయి మరియు గ్లిసరాల్ యొక్క స్టాక్ పరిష్కారంగా -80 ° C. వద్ద స్తంభింపజేయబడ్డాయి.
యాజమాన్య 454/రోచె-యాంప్లికాన్ ఫ్యూజన్ ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి ఉడకబెట్టిన పులుసు లేదా ప్లేట్‌లో విస్తరించిన ఫేజ్ వేరియబుల్ ప్రాంతాల ప్రత్యక్ష PCR విస్తరణ.ఫార్వర్డ్ ఫ్యూజన్ ప్రైమర్‌లో వేరియబుల్ రీజియన్ (NNK) 12 (టెంప్లేట్-నిర్దిష్ట), GS FLX టైటానియం అడాప్టర్ A మరియు నాలుగు-బేస్ లైబ్రరీ కీ సీక్వెన్స్ (TCAG) (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 1a):
రివర్స్ ఫ్యూజన్ ప్రైమర్‌లో క్యాప్చర్ పూసలకు జతచేయబడిన బయోటిన్ మరియు ఎమల్షన్ PCR సమయంలో క్లోనల్ యాంప్లిఫికేషన్ కోసం అవసరమైన GS FLX టైటానియం అడాప్టర్ B కూడా ఉంటుంది:
454 GS-FLX టైటానియం ప్రోటోకాల్ ప్రకారం యాంప్లికాన్‌లు 454/రోచె పైరోక్సెన్సింగ్‌కు లోబడి ఉన్నాయి.మాన్యువల్ సాంగర్ సీక్వెన్సింగ్ (అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్ హిటాచీ 3730 xl DNA ఎనలైజర్) కోసం, T7 ఫేజ్ DNA PCR ద్వారా విస్తరించబడింది మరియు క్రింది ప్రైమర్ జతలతో క్రమం చేయబడింది:
రోచె ఫాస్ట్ స్టార్ట్ DNA పాలిమరేస్ కిట్ (తయారీదారు సూచనల ప్రకారం) ఉపయోగించి వ్యక్తిగత ఫలకాల నుండి ఇన్సర్ట్‌లు PCR విస్తరణకు లోబడి ఉన్నాయి.హాట్ స్టార్ట్ (95 °C వద్ద 10 నిమిషాలు) మరియు 35 బూస్ట్ సైకిల్స్ (95 °C వద్ద 50 సె, 50 °C వద్ద 1 నిమి, మరియు 72 °C వద్ద 1 నిమి) చేయండి.
లైబ్రరీల నుండి ఫేజ్, వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్, CSF మరియు రక్తం నుండి రక్షించబడిన ఫేజ్ లేదా వ్యక్తిగత క్లోన్‌లు ఎస్చెరిచియా కోలి BL5615లో TB రసంలో (సిగ్మా ఆల్డ్రిచ్) లేదా 500 cm2 వంటలలో (థర్మో సైంటిఫిక్) 37 ° C వద్ద 4 గంటలకు విస్తరించబడ్డాయి.ట్రిస్-ఇడిటిఎ ​​బఫర్ (ఫ్లూకా అనలిటికల్)తో ప్లేట్‌లను శుభ్రం చేయడం ద్వారా లేదా శుభ్రమైన పైపెట్ చిట్కాలతో ఫలకాలను సేకరించడం ద్వారా ప్లేట్ల నుండి ఫేజ్ సంగ్రహించబడింది.ఫేజ్ ఒక రౌండ్ పాలిథిలిన్ గ్లైకాల్ (PEG 8000) అవపాతం (ప్రోమెగా)తో కల్చర్ సూపర్‌నాటెంట్ లేదా ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ బఫర్ నుండి వేరుచేయబడింది మరియు ట్రిస్-ఇడిటిఎ ​​బఫర్‌లో తిరిగి అమర్చబడింది.
ఇంట్రావీనస్ (IV) ఇంజెక్షన్ (500 μl/జంతువు) ముందు ఎండోటాక్సిన్ రిమూవల్ పూసలను (మిల్టెని బయోటెక్) ఉపయోగించి విస్తరించిన ఫేజ్ 2-3 రౌండ్ల ఎండోటాక్సిన్ తొలగింపుకు లోబడి ఉంది.మొదటి రౌండ్‌లో, 2×1012 ఫేజ్‌లు ప్రవేశపెట్టబడ్డాయి;రెండవది, 2×1010 ఫేజ్‌లు;మూడవ మరియు నాల్గవ ఎంపిక రౌండ్లలో, ఒక జంతువుకు 2×109 ఫేజ్‌లు.సూచించిన సమయ బిందువులలో సేకరించిన CSF మరియు రక్త నమూనాలలోని ఫేజ్ కంటెంట్ తయారీదారు సూచనల ప్రకారం ఫలకం లెక్కింపు ద్వారా నిర్ణయించబడుతుంది (T7Select సిస్టమ్ మాన్యువల్).ఫేజ్ ఎంపిక శుద్ధి చేయబడిన లైబ్రరీలను టెయిల్ సిరలోకి ఇంట్రావీనస్ ఇంజెక్షన్ ద్వారా లేదా మునుపటి ఎంపిక రౌండ్ నుండి CSF నుండి సేకరించిన ఫేజ్‌ని మళ్లీ ఇంజెక్షన్ చేయడం ద్వారా నిర్వహించబడింది మరియు తదుపరి పంటలు 10 నిమిషాలు, 30 నిమిషాలు, 60 నిమిషాలు, 90 నిమిషాలు, 120 నిమిషాలు, CSF మరియు 18040 నిమి, రక్త నమూనా వరుసగా జరిగాయి.మొత్తం నాలుగు రౌండ్ల ఇన్ వివో పానింగ్ నిర్వహించబడింది, దీనిలో ఎంపిక చేసిన రెండు శాఖలు విడివిడిగా నిల్వ చేయబడ్డాయి మరియు మొదటి మూడు రౌండ్ల ఎంపిక సమయంలో విశ్లేషించబడ్డాయి.మొదటి రెండు రౌండ్‌ల ఎంపిక నుండి CSF నుండి సంగ్రహించబడిన అన్ని ఫేజ్ ఇన్‌సర్ట్‌లు 454/రోచె పైరోక్సెన్సింగ్‌కు లోబడి ఉంటాయి, అయితే చివరి రెండు రౌండ్‌ల ఎంపిక నుండి CSF నుండి సేకరించిన అన్ని క్లోన్‌లు మానవీయంగా క్రమం చేయబడ్డాయి.మొదటి రౌండ్ ఎంపిక నుండి అన్ని రక్త ఫేజ్‌లు కూడా 454/రోచె పైరోక్సెన్సింగ్‌కు లోబడి ఉన్నాయి.ఫేజ్ క్లోన్‌ల ఇంజెక్షన్ కోసం, ఎంచుకున్న ఫేజ్‌లు E. coli (BL5615)లో 500 cm2 ప్లేట్‌లపై 37°C వద్ద 4 గంటలపాటు విస్తరించబడ్డాయి.వ్యక్తిగతంగా ఎంపిక చేయబడిన మరియు మానవీయంగా క్రమం చేయబడిన క్లోన్‌లు TB మాధ్యమంలో ప్రచారం చేయబడ్డాయి.ఫేజ్ వెలికితీత, ఎండోటాక్సిన్ యొక్క శుద్దీకరణ మరియు తొలగింపు (పైన వివరించిన విధంగా), 300 μlలో 2×1010 ఫేజెస్/జంతువులు ఒక తోక సిరలోకి ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి.
సీక్వెన్స్ డేటా యొక్క ప్రీప్రాసెసింగ్ మరియు గుణాత్మక వడపోత.రా 454/రోచె డేటా బైనరీ స్టాండర్డ్ స్ట్రీమ్ మ్యాప్ ఫార్మాట్ (sff) నుండి వెండర్ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి పియర్సన్ హ్యూమన్ రీడబుల్ ఫార్మాట్ (ఫాస్టా)కి మార్చబడింది.న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్ యొక్క తదుపరి ప్రాసెసింగ్ క్రింద వివరించిన విధంగా యాజమాన్య C ప్రోగ్రామ్‌లు మరియు స్క్రిప్ట్‌లను (విడుదల చేయని సాఫ్ట్‌వేర్ ప్యాకేజీ) ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది.ప్రాథమిక డేటా యొక్క విశ్లేషణ కఠినమైన బహుళ-దశల వడపోత విధానాలను కలిగి ఉంటుంది.చెల్లుబాటు అయ్యే 12mer ఇన్సర్ట్ DNA సీక్వెన్స్ లేని రీడ్‌లను ఫిల్టర్ చేయడానికి, రీడ్‌లు స్టార్ట్ లేబుల్ (GTGATGTCGGGGGATCCGAATTCT), స్టాప్ లేబుల్ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) మరియు బ్యాక్‌గ్రౌండ్ ఇన్సర్ట్ (CCCTGCAGGGAGATATCGGlemanని ఉపయోగించి గ్లోబల్ టెస్ట్)కి వరుసగా సమలేఖనం చేయబడ్డాయి.అమరికకు 2 అసమానతలను అనుమతించే అమరిక31.అందువల్ల, స్టార్ట్ మరియు స్టాప్ ట్యాగ్‌లు లేకుండా రీడ్‌లు మరియు బ్యాక్‌గ్రౌండ్ ఇన్‌సర్ట్‌లను కలిగి ఉన్న రీడ్‌లు, అంటే, అనుమతించబడిన అసమతుల్యతలను మించిన అమరికలు లైబ్రరీ నుండి తీసివేయబడ్డాయి.మిగిలిన రీడ్‌ల విషయానికొస్తే, స్టార్ట్ మార్క్ నుండి విస్తరించి, స్టాప్ మార్క్‌కు ముందు ముగిసే N-mer DNA సీక్వెన్స్ అసలు రీడ్ సీక్వెన్స్ నుండి తీసివేయబడింది మరియు తదుపరి ప్రాసెస్ చేయబడింది (ఇకపై "ఇన్సర్ట్" అని సూచిస్తారు).ఇన్సర్ట్ యొక్క అనువాదం తర్వాత, ప్రైమర్ యొక్క 5′ చివరిలో మొదటి స్టాప్ కోడాన్ తర్వాత భాగం ఇన్సర్ట్ నుండి తీసివేయబడుతుంది.అదనంగా, ప్రైమర్ యొక్క 3′ చివర అసంపూర్ణ కోడన్‌లకు దారితీసే న్యూక్లియోటైడ్‌లు కూడా తొలగించబడ్డాయి.బ్యాక్‌గ్రౌండ్ సీక్వెన్స్‌లను మాత్రమే కలిగి ఉన్న ఇన్‌సర్ట్‌లను మినహాయించడానికి, అమైనో యాసిడ్ నమూనా “PAG”తో ప్రారంభమయ్యే అనువాద ఇన్‌సర్ట్‌లు కూడా తీసివేయబడ్డాయి.3 అమైనో ఆమ్లాల కంటే తక్కువ అనువాద నిడివి ఉన్న పెప్టైడ్‌లు లైబ్రరీ నుండి తీసివేయబడ్డాయి.చివరగా, ఇన్సర్ట్ పూల్‌లో రిడెండెన్సీని తీసివేయండి మరియు ప్రతి ప్రత్యేక ఇన్సర్ట్ యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీని నిర్ణయించండి.ఈ విశ్లేషణ ఫలితాలలో న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్సులు (ఇన్సర్ట్‌లు) మరియు వాటి (చదవండి) ఫ్రీక్వెన్సీల జాబితా (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్స్ 1 సి మరియు 2) ఉన్నాయి.
సీక్వెన్స్ సారూప్యత ద్వారా గ్రూప్ N-mer DNA ఇన్సర్ట్‌లు: 454/రోచె-నిర్దిష్ట సీక్వెన్సింగ్ ఎర్రర్‌లను తొలగించడానికి (హోమోపాలిమర్ ఎక్స్‌టెన్షన్‌లను క్రమం చేయడంలో సమస్యలు వంటివి) మరియు తక్కువ ముఖ్యమైన రిడెండెన్సీలను తొలగించడానికి, గతంలో ఫిల్టర్ చేసిన N-mer DNA సీక్వెన్స్ ఇన్‌సర్ట్‌లు (ఇన్సర్ట్‌లు) సారూప్యత ద్వారా క్రమబద్ధీకరించబడతాయి.కింది విధంగా నిర్వచించబడిన పునరుత్పాదక అల్గారిథమ్‌ని ఉపయోగించి చొప్పించడం (2 సరిపోలని బేస్‌ల వరకు అనుమతించబడుతుంది): చొప్పింపులు ముందుగా వాటి పౌనఃపున్యం (ఎక్కువ నుండి తక్కువ) ద్వారా క్రమబద్ధీకరించబడతాయి మరియు అవి ఒకేలా ఉంటే, వాటి ద్వితీయ క్రమబద్ధమైన పొడవు (పొడవైన నుండి చిన్నది) ).అందువలన, అత్యంత తరచుగా మరియు పొడవైన చొప్పించడం మొదటి "సమూహాన్ని" నిర్వచిస్తుంది.సమూహ ఫ్రీక్వెన్సీ కీ ఫ్రీక్వెన్సీకి సెట్ చేయబడింది.తర్వాత, క్రమబద్ధీకరించబడిన జాబితాలో మిగిలి ఉన్న ప్రతి చొప్పింపును జతగా నీడిల్‌మాన్-వున్ష్ సమలేఖనం ద్వారా సమూహానికి జోడించడానికి ప్రయత్నించబడింది.అమరికలో అసమతుల్యత, చొప్పించడం లేదా తొలగింపుల సంఖ్య 2 థ్రెషోల్డ్‌ను మించకపోతే, సమూహానికి చొప్పించడం జోడించబడుతుంది మరియు చొప్పించడం ఎంత తరచుగా జోడించబడిందనే దానితో మొత్తం సమూహ ఫ్రీక్వెన్సీ పెరుగుతుంది.సమూహానికి జోడించబడిన ఇన్‌సర్ట్‌లు ఉపయోగించినట్లుగా గుర్తించబడతాయి మరియు తదుపరి ప్రాసెసింగ్ నుండి మినహాయించబడతాయి.ఇన్సర్ట్ సీక్వెన్స్‌ను ఇప్పటికే ఉన్న సమూహానికి జోడించలేకపోతే, తగిన ఇన్సర్ట్ ఫ్రీక్వెన్సీతో కొత్త సమూహాన్ని సృష్టించడానికి ఇన్సర్ట్ సీక్వెన్స్ ఉపయోగించబడుతుంది మరియు ఉపయోగించినట్లుగా గుర్తు పెట్టబడుతుంది.ప్రతి చొప్పించే క్రమం కొత్త సమూహాన్ని రూపొందించడానికి ఉపయోగించబడినప్పుడు లేదా ఇప్పటికే ఉన్న సమూహంలో చేర్చబడినప్పుడు పునరావృతం ముగుస్తుంది.అన్నింటికంటే, న్యూక్లియోటైడ్‌లతో కూడిన సమూహ ఇన్సర్ట్‌లు చివరికి పెప్టైడ్ సీక్వెన్సులు (పెప్టైడ్ లైబ్రరీలు)లోకి అనువదించబడతాయి.ఈ విశ్లేషణ యొక్క ఫలితం ఇన్సర్షన్‌ల సమితి మరియు వాటి సంబంధిత పౌనఃపున్యాలు వరుస రీడ్‌ల సంఖ్య (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2).
మోటిఫ్ జనరేషన్: ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్‌ల జాబితా ఆధారంగా, దిగువ చూపిన విధంగా సాధ్యమయ్యే అన్ని అమైనో ఆమ్ల నమూనాలను (aa) కలిగి ఉన్న లైబ్రరీ సృష్టించబడింది.పొడవు 3 యొక్క ప్రతి సాధ్యమైన నమూనా పెప్టైడ్ నుండి సంగ్రహించబడింది మరియు దాని విలోమ నమూనా అన్ని నమూనాలను (ట్రిపెప్టైడ్స్) కలిగి ఉన్న సాధారణ మూలాంశ లైబ్రరీతో పాటు జోడించబడింది.చాలా పునరావృతమయ్యే మూలాంశాల లైబ్రరీలు క్రమం చేయబడ్డాయి మరియు రిడెండెన్సీ తొలగించబడ్డాయి.అప్పుడు, మోటిఫ్ లైబ్రరీలోని ప్రతి ట్రైపెప్టైడ్ కోసం, మేము గణన సాధనాలను ఉపయోగించి లైబ్రరీలో దాని ఉనికిని తనిఖీ చేసాము.ఈ సందర్భంలో, కనుగొనబడిన మోటిఫ్ ట్రిపెప్టైడ్‌ను కలిగి ఉన్న పెప్టైడ్ యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీ జోడించబడుతుంది మరియు మోటిఫ్ లైబ్రరీలోని మూలాంశానికి కేటాయించబడుతుంది ("మూలాంశాల సంఖ్య").మోటిఫ్ జనరేషన్ యొక్క ఫలితం ట్రిపెప్టైడ్స్ (మూలాంశాలు) మరియు వాటి సంబంధిత విలువల యొక్క అన్ని సంఘటనలను కలిగి ఉన్న రెండు-డైమెన్షనల్ శ్రేణి, ఇది రీడ్‌లను ఫిల్టర్ చేసినప్పుడు, సమూహంగా మరియు అనువదించబడినప్పుడు సంబంధిత మూలాంశానికి దారితీసే సీక్వెన్సింగ్ రీడ్‌ల సంఖ్య.పైన వివరంగా వివరించిన కొలమానాలు.
మూలాంశాల సంఖ్య మరియు సంబంధిత స్కాటర్‌ప్లాట్‌ల సాధారణీకరణ: ప్రతి నమూనా కోసం మూలాంశాల సంఖ్య ఉపయోగించి సాధారణీకరించబడింది
ఇక్కడ ni అనేది టాపిక్ iని కలిగి ఉన్న రీడ్‌ల సంఖ్య.అందువలన, vi నమూనాలో మోటిఫ్ iని కలిగి ఉన్న రీడ్‌ల (లేదా పెప్టైడ్‌లు) శాతం ఫ్రీక్వెన్సీని సూచిస్తుంది.ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్షను ఉపయోగించి నాన్-నార్మలైజ్డ్ మోటిఫ్‌ల కోసం P-విలువలు లెక్కించబడ్డాయి.ఉద్దేశ్యాల సంఖ్య యొక్క కోరెలోగ్రామ్‌లకు సంబంధించి, స్పియర్‌మ్యాన్ యొక్క సహసంబంధాలు Rతో సాధారణీకరించబడిన ఉద్దేశ్యాల సంఖ్యను ఉపయోగించి లెక్కించబడ్డాయి.
పెప్టైడ్ లైబ్రరీలోని ప్రతి స్థానం వద్ద అమైనో ఆమ్లాల కంటెంట్‌ను దృశ్యమానం చేయడానికి, వెబ్ లోగోగ్రామ్‌లు 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) సృష్టించబడ్డాయి.మొదట, 12-మెర్ పెప్టైడ్ యొక్క ప్రతి స్థానం వద్ద అమైనో ఆమ్లాల కంటెంట్ 20×12 మాతృకలో నిల్వ చేయబడుతుంది.అప్పుడు, ప్రతి స్థానం వద్ద ఒకే సాపేక్ష అమైనో ఆమ్ల కంటెంట్‌ను కలిగి ఉన్న 1000 పెప్టైడ్‌ల సమితి ఫాస్టా-సీక్వెన్స్ ఫార్మాట్‌లో ఉత్పత్తి చేయబడుతుంది మరియు వెబ్-లోగో 3కి ఇన్‌పుట్‌గా అందించబడుతుంది, ఇది ప్రతి స్థానం వద్ద సంబంధిత అమైనో ఆమ్ల కంటెంట్ యొక్క గ్రాఫికల్ ప్రాతినిధ్యాన్ని ఉత్పత్తి చేస్తుంది.ఇచ్చిన పెప్టైడ్ లైబ్రరీ కోసం.మల్టీడైమెన్షనల్ డేటాసెట్‌లను దృశ్యమానం చేయడానికి, R (biosHeatmap, ఇంకా విడుదల చేయని R ప్యాకేజీ)లో అంతర్గతంగా అభివృద్ధి చేసిన సాధనాన్ని ఉపయోగించి హీట్ మ్యాప్‌లు సృష్టించబడ్డాయి.హీట్ మ్యాప్‌లలో సమర్పించబడిన డెండ్రోగ్రామ్‌లు యూక్లిడియన్ దూర మెట్రిక్‌తో వార్డ్ యొక్క క్రమానుగత క్లస్టరింగ్ పద్ధతిని ఉపయోగించి లెక్కించబడ్డాయి.మోటిఫ్ స్కోరింగ్ డేటా యొక్క గణాంక విశ్లేషణ కోసం, ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్షను ఉపయోగించి అసాధారణ స్కోరింగ్ కోసం P విలువలు లెక్కించబడ్డాయి.ఇతర డేటాసెట్‌ల కోసం P-విలువలు విద్యార్థుల t-పరీక్ష లేదా ANOVAని ఉపయోగించి Rలో లెక్కించబడతాయి.
ఎంచుకున్న ఫేజ్ క్లోన్‌లు మరియు ఇన్‌సర్ట్‌లు లేని ఫేజ్‌లు టెయిల్ వెయిన్ (2×1010 ఫేజెస్/300 μl PBSలో జంతువు) ద్వారా ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి.పెర్ఫ్యూజన్ మరియు తదుపరి స్థిరీకరణకు పది నిమిషాల ముందు, అదే జంతువులు 100 μl DyLight594-లేబుల్ లెక్టిన్ (వెక్టర్ లాబొరేటరీస్ ఇంక్., DL-1177)తో ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి.ఫేజ్ ఇంజెక్షన్ తర్వాత 60 నిమిషాల తర్వాత, ఎలుకలు 50 ml PBSతో గుండె ద్వారా పెర్ఫ్యూజ్ చేయబడ్డాయి, తర్వాత 50 ml 4% PFA/PBS.మెదడు నమూనాలు అదనంగా 4% PFA/PBSలో రాత్రిపూట పరిష్కరించబడ్డాయి మరియు 30% సుక్రోజ్‌లో రాత్రిపూట 4 ° C వద్ద నానబెట్టబడ్డాయి.OCT మిశ్రమంలో నమూనాలు ఫ్లాష్ స్తంభింపజేయబడతాయి.స్తంభింపచేసిన నమూనాల ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ విశ్లేషణ 1% BSAతో నిరోధించబడిన 30 µm క్రయోసెక్షన్‌లపై గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద నిర్వహించబడింది మరియు 4 °C వద్ద T7 ఫేజ్ (నోవస్ NB 600-376A)కి వ్యతిరేకంగా పాలిక్లోనల్ FITC-లేబుల్ చేయబడిన ప్రతిరోధకాలతో పొదిగేది.రాత్రిపూట పొదిగే.చివరగా, విభాగాలు PBSతో 3 సార్లు కడుగుతారు మరియు కన్ఫోకల్ లేజర్ మైక్రోస్కోప్ (లైకా TCS SP5) తో పరిశీలించబడ్డాయి.
98% కనీస స్వచ్ఛత కలిగిన అన్ని పెప్టైడ్‌లు జెన్‌స్క్రిప్ట్ USA ద్వారా సంశ్లేషణ చేయబడ్డాయి, బయోటైనిలేటెడ్ మరియు లైయోఫైలైజ్ చేయబడ్డాయి.ఎన్-టెర్మినస్ వద్ద అదనపు ట్రిపుల్ గ్లైసిన్ స్పేసర్ ద్వారా బయోటిన్ కట్టుబడి ఉంటుంది.మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీని ఉపయోగించి అన్ని పెప్టైడ్‌లను తనిఖీ చేయండి.
స్ట్రెప్టావిడిన్ (సిగ్మా S0677) బయోటైనిలేటెడ్ పెప్టైడ్, బయోటైనిలేటెడ్ BACE1 ఇన్హిబిటరీ పెప్టైడ్ లేదా బయోటైనిలేటెడ్ BACE1 ఇన్హిబిటరీ పెప్టైడ్ మరియు BACE1 ఇన్హిబిటరీ పెప్టైడ్ మరియు BACE1 ఇన్హిబిటరీ DMBS.ఇంజెక్షన్ ముందు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట.స్ట్రెప్టావిడిన్-కంజుగేటెడ్ పెప్టైడ్‌లు మస్తిష్క కుహరం ఉన్న ఎలుకల తోక సిరల్లోకి 10 mg/kg మోతాదులో ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి.
స్ట్రెప్టావిడిన్-పెప్టైడ్ కాంప్లెక్స్‌ల ఏకాగ్రతను ELISA అంచనా వేసింది.Nunc Maxisorp మైక్రోటైటర్ ప్లేట్లు (సిగ్మా) 1.5 μg/ml మౌస్ యాంటీ స్ట్రెప్టావిడిన్ యాంటీబాడీ (థర్మో, MA1-20011)తో రాత్రిపూట 4 ° C వద్ద పూత పూయబడ్డాయి.గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2 గంటల పాటు బ్లాక్ చేసిన తర్వాత (బ్లాకింగ్ బఫర్: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% జెలటిన్, 1% BSA) ప్లేట్‌ను 0.05% ట్వీన్-20/PBS (వాష్ బఫర్)తో కడగాలి (వాష్ బఫర్) 3 ప్లాస్‌లకు బాగా జోడించబడ్డాయి. ma 1:10,000, CSF 1:115).డిటెక్షన్ యాంటీబాడీ (1 μg/ml, యాంటీ స్ట్రెప్టావిడిన్-HRP, నోవస్ NB120-7239)తో ప్లేట్ రాత్రిపూట 4 ° C వద్ద పొదిగేది.మూడు వాషింగ్ దశల తర్వాత, 20 నిమిషాల వరకు TMB సబ్‌స్ట్రేట్ సొల్యూషన్ (రోచె)లో పొదిగే ద్వారా స్ట్రెప్టావిడిన్ కనుగొనబడింది.1M H2SO4తో రంగు అభివృద్ధిని ఆపిన తర్వాత, శోషణను 450 nm వద్ద కొలవండి.
స్ట్రెప్టావిడిన్-పెప్టైడ్-BACE1 ఇన్హిబిటర్ కాంప్లెక్స్ యొక్క పనితీరును తయారీదారు ప్రోటోకాల్ (వాకో, 294-64701) ప్రకారం Aβ(1-40) ELISA అంచనా వేసింది.క్లుప్తంగా, CSF నమూనాలు ప్రామాణిక పలచన (1:23)లో కరిగించబడ్డాయి మరియు BNT77 క్యాప్చర్ యాంటీబాడీతో పూసిన 96-బావి ప్లేట్లలో రాత్రిపూట 4 ° C వద్ద పొదిగేవి.ఐదు వాషింగ్ దశల తర్వాత, HRP- కంజుగేటెడ్ BA27 యాంటీబాడీ జోడించబడింది మరియు 4 ° C వద్ద 2 గంటల పాటు పొదిగేది, తర్వాత ఐదు వాషింగ్ దశలు.Aβ(1–40) గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాలు TMB ద్రావణంలో పొదిగే ద్వారా కనుగొనబడింది.స్టాప్ సొల్యూషన్‌తో రంగు అభివృద్ధిని ఆపివేసిన తర్వాత, 450 nm వద్ద శోషణను కొలవండి.Aβ(1–40) ELISAకి ముందు ప్లాస్మా నమూనాలు ఘన దశ వెలికితీతకు లోబడి ఉన్నాయి.ప్లాస్మా 96-బావి పలకలలో 0.2% DEA (సిగ్మా)కి జోడించబడింది మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాలు పొదిగేది.SPE ప్లేట్‌లను (ఒయాసిస్, 186000679) నీరు మరియు 100% మిథనాల్‌తో వరుసగా కడిగిన తర్వాత, ప్లాస్మా నమూనాలు SPE ప్లేట్‌లకు జోడించబడ్డాయి మరియు మొత్తం ద్రవాన్ని తొలగించారు.నమూనాలు కడుగుతారు (మొదట 5% మిథనాల్‌తో తరువాత 30% మిథనాల్) మరియు 2% NH4OH/90% మిథనాల్‌తో తొలగించబడ్డాయి.స్థిరమైన N2 కరెంట్‌లో 99 నిమిషాలకు 55°C వద్ద ఎలుయేట్‌ను ఎండబెట్టిన తర్వాత, నమూనాలను ప్రామాణిక పలచగాలలో తగ్గించారు మరియు పైన వివరించిన విధంగా Aβ(1–40)ని కొలుస్తారు.
ఈ కథనాన్ని ఎలా ఉదహరించాలి: ఉరిచ్, ఇ. మరియు ఇతరులు.వివోలో గుర్తించబడిన ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్‌లను ఉపయోగించి మెదడుకు కార్గో డెలివరీ.శాస్త్రం.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB మరియు Moos T. లక్ష్య చికిత్సను ఉపయోగించి మెదడుకు స్థూల కణ ఔషధాల పంపిణీ.న్యూరోకెమిస్ట్రీ జర్నల్ 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., మరియు మార్టినెజ్-మార్టినెజ్, P. రక్త-మెదడు అవరోధం అంతటా పెప్టైడ్ మరియు ప్రోటీన్ ఔషధాల డెలివరీ.ప్రోగ్ న్యూరోబయోల్ 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
పార్డ్రిడ్జ్, WM రక్త-మెదడు అవరోధం: మెదడు ఔషధ అభివృద్ధిలో అడ్డంకి.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
జోహన్సన్, KE, డంకన్, JA, స్టోపా, EG, మరియు బైర్డ్, A. మెరుగైన డ్రగ్ డెలివరీ మరియు కొరోయిడ్ ప్లెక్సస్-CSF పాత్‌వే ద్వారా మెదడును లక్ష్యంగా చేసుకోవడం కోసం అవకాశాలు.ఫార్మాస్యూటికల్ రీసెర్చ్ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
పార్డ్రిడ్జ్, WM మెదడు డెలివరీ కోసం మాలిక్యులర్ ట్రోజన్ హార్స్‌తో బయోఫార్మాస్యూటికల్స్ యొక్క ఆధునికీకరణ.బయోకాన్జగ్ కెమ్ 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
పార్డ్రిడ్జ్, రక్త-మెదడు అవరోధం అంతటా WM గ్రాహక-మధ్యవర్తిత్వ పెప్టైడ్ రవాణా.ఎండోక్ర్ రెవ్. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.మోనోవాలెంట్ మాలిక్యులర్ షటిల్‌లను ఉపయోగించి చికిత్సా ప్రతిరోధకాల మెదడు వ్యాప్తి మరియు సామర్థ్యాన్ని పెంచండి.న్యూరాన్ 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
బీన్-లీ, N. మరియు ఇతరులు.ట్రాన్స్‌ఫెర్రిన్ రిసెప్టర్ (TfR) రవాణా TfR యాంటీబాడీస్ యొక్క అఫినిటీ వేరియంట్‌ల మెదడు తీసుకోవడం నిర్ణయిస్తుంది.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).