కొన్ని LC ట్రబుల్‌షూటింగ్ అంశాలు పాతవి కావు, ఎందుకంటే ఇన్‌స్ట్రుమెంట్ టెక్నాలజీ కాలక్రమేణా మెరుగుపడినప్పటికీ, LC ప్రాక్టీస్‌లో సమస్యలు ఉన్నాయి. LC సిస్టమ్‌లో సమస్యలు తలెత్తడానికి మరియు పేలవమైన పీక్ ఆకారంలో ముగిసేలా అనేక మార్గాలు ఉన్నాయి. పీక్ ఆకృతికి సంబంధించిన సమస్యలు తలెత్తినప్పుడు, ఈ ఫలితాల కోసం సాధ్యమయ్యే కారణాల యొక్క చిన్న జాబితా మా ట్రబుల్షూటింగ్ అనుభవాన్ని సులభతరం చేయడంలో సహాయపడుతుంది.
ఈ “LC ట్రబుల్‌షూటింగ్” కాలమ్‌ని వ్రాయడం మరియు ప్రతి నెలా టాపిక్‌ల గురించి ఆలోచించడం సరదాగా ఉంది, ఎందుకంటే కొన్ని అంశాలు ఎప్పుడూ స్టైల్‌గా మారవు. క్రోమాటోగ్రఫీ రంగంలో పరిశోధన చేస్తున్నప్పుడు కొన్ని విషయాలు లేదా ఆలోచనలు పాతవి అవుతాయి, ఎందుకంటే ట్రబుల్‌షూటింగ్ రంగంలో, కొత్త మరియు మెరుగైన ఆలోచనలతో భర్తీ చేయబడి ఉంటాయి, మొదటి ట్రబుల్షూటింగ్ కథనం నుండి ఈ LC జర్నల్‌లో మొదటి ట్రబుల్షూటింగ్ కథనం 8 లో కనిపించింది. (1).గత కొన్ని సంవత్సరాలుగా, నేను లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (LC)ని ప్రభావితం చేసే సమకాలీన ధోరణులపై అనేక LC ట్రబుల్షూటింగ్ విభాగాలను కేంద్రీకరించాను (ఉదాహరణకు, నిలుపుదలపై ఒత్తిడి ప్రభావం గురించి మన అవగాహన యొక్క సాపేక్ష పోలిక [2] కొత్త అడ్వాన్స్‌లు) LC ఫలితాల యొక్క మా వివరణ మరియు ఆధునిక LC పరికరాలతో ఎలా ట్రబుల్షూట్ చేయాలి, ఈ నెలలో నా LC2 సాధనాలు ప్రారంభమయ్యాయి. LC ట్రబుల్‌షూటింగ్‌లోని కొన్ని “జీవితం మరియు మరణం” అంశాలపై దృష్టి కేంద్రీకరించబడింది — మనం ఉపయోగిస్తున్న సిస్టమ్ వయస్సుతో సంబంధం లేకుండా ఏదైనా ట్రబుల్‌షూటర్‌కు గొప్ప అంశాలు చాలా అవసరం. ఈ సిరీస్‌లోని ప్రధాన అంశం LCGC యొక్క ప్రసిద్ధ “LC ట్రబుల్‌షూటింగ్ గైడ్” వాల్ చార్ట్ (4)కి చాలా సందర్భోచితంగా ఉంటుంది. లై, వాల్ చార్ట్ పేలవమైన పీక్ ఆకారానికి గల 44 విభిన్న సంభావ్య కారణాలను జాబితా చేస్తుంది! మేము ఈ సమస్యలన్నింటినీ ఒక కథనంలో వివరంగా పరిగణించలేము, కాబట్టి ఈ అంశంపై మొదటి విడతలో, నేను తరచుగా చూసే వాటిలో కొన్నింటిపై దృష్టి పెడతాను. యువకులు మరియు పాత LC వినియోగదారులు ఈ ముఖ్యమైన అంశంపై కొన్ని ఉపయోగకరమైన చిట్కాలు మరియు రిమైండర్‌లను కనుగొంటారని నేను ఆశిస్తున్నాను.
ట్రబుల్‌షూటింగ్ ప్రశ్నలకు "ఏదైనా సాధ్యమే" అని నేను ఎక్కువగా సమాధానమిస్తున్నాను. అర్థం చేసుకోవడం కష్టంగా ఉన్న పరిశీలనలను పరిగణనలోకి తీసుకున్నప్పుడు ఈ ప్రతిస్పందన సులభంగా అనిపించవచ్చు, కానీ నేను తరచుగా ఇది సముచితంగా భావిస్తున్నాను. పేలవమైన పీక్ ఆకారానికి గల అనేక కారణాలతో, సమస్య ఏమిటనే విషయాన్ని పరిగణనలోకి తీసుకునేటప్పుడు ఓపెన్ మైండ్‌ని ఉంచడం చాలా ముఖ్యం.
ఏదైనా ట్రబుల్‌షూటింగ్ వ్యాయామంలో కీలకమైన దశ — కానీ నేను తక్కువగా అంచనా వేసినది — పరిష్కరించాల్సిన సమస్య ఉందని గుర్తించడం. తరచుగా సమస్య ఉందని గుర్తించడం అంటే సాధనానికి జరిగేది సిద్ధాంతం, అనుభావిక జ్ఞానం మరియు అనుభవంతో రూపొందించబడిన మన అంచనాలకు భిన్నంగా ఉంటుందని గుర్తించడం (5). మెత్తటి, లీడింగ్ ఎడ్జ్, టైలింగ్ మొదలైనవి), కానీ వెడల్పుకు కూడా ఉంటాయి. అసలు శిఖరం ఆకారం కోసం మా అంచనాలు చాలా సులభం. థియరీ (6) పాఠ్యపుస్తక అంచనాకు బాగా మద్దతు ఇస్తుంది, చాలా సందర్భాలలో, క్రోమాటోగ్రాఫిక్ శిఖరాలు సుష్టంగా ఉండాలి మరియు గాస్సియన్ పంపిణీ ఆకారానికి అనుగుణంగా ఉండాలి. s లో Figure 1 గమనించదగిన కొన్ని ఇతర అవకాశాలను చూపుతుంది-మరో మాటలో చెప్పాలంటే, కొన్ని మార్గాలు తప్పుగా మారవచ్చు. ఈ విడత యొక్క మిగిలిన భాగంలో, ఈ ఆకార రకాలకు దారితీసే పరిస్థితుల యొక్క కొన్ని నిర్దిష్ట ఉదాహరణలను చర్చించడానికి మేము సమయాన్ని వెచ్చిస్తాము.
క్రోమాటోగ్రామ్‌లో కొన్నిసార్లు పీక్‌లు ఎలిట్ చేయబడతాయని అంచనా వేయబడటం లేదు. పై వాల్ చార్ట్, పీక్ లేకపోవడాన్ని సూచిస్తుంది (నాయిస్ పైన కనిపించే విధంగా డిటెక్టర్ ప్రతిస్పందనను సరిపోయేలా చేసేలాగా, నమూనా వాస్తవానికి లక్ష్య విశ్లేషణను కలిగి ఉందని ఊహిస్తే) సాధారణంగా ఏదైనా పరికరం సమస్య లేదా తప్పు మొబైల్ దశ పరిస్థితులకు సంబంధించినది (అన్నింటిలోనూ గమనించినట్లయితే).శిఖరాలు, సాధారణంగా చాలా "బలహీనమైనవి").ఈ వర్గంలోని సంభావ్య సమస్యలు మరియు పరిష్కారాల యొక్క చిన్న జాబితాను టేబుల్ Iలో చూడవచ్చు.
పైన చెప్పినట్లుగా, శ్రద్ధ వహించే ముందు మరియు దాన్ని సరిదిద్దడానికి ప్రయత్నించే ముందు ఎంత పీక్ విస్తరణను సహించాలి అనే ప్రశ్న నేను భవిష్యత్ కథనంలో చర్చించబోయే సంక్లిష్టమైన అంశం. నా అనుభవం ఏమిటంటే, గణనీయ శిఖర విస్తరణ తరచుగా గరిష్ట ఆకృతిలో గణనీయమైన మార్పుతో కూడి ఉంటుంది మరియు పీక్ టైలింగ్ అనేది ప్రీ-పీక్ లేదా స్ప్లిటింగ్ కంటే సర్వసాధారణంగా ఉంటుంది.
ఈ సమస్యల్లో ప్రతి ఒక్కటి ట్రబుల్‌షూటింగ్ LC యొక్క మునుపటి సంచికలలో వివరంగా చర్చించబడింది మరియు ఈ అంశాలపై ఆసక్తి ఉన్న పాఠకులు ఈ సమస్యలకు మూల కారణాలు మరియు సంభావ్య పరిష్కారాలపై సమాచారం కోసం ఈ మునుపటి కథనాలను చూడవచ్చు.మరిన్ని వివరాలు.
పీక్ టైలింగ్, పీక్ ఫ్రంటింగ్ మరియు స్ప్లిటింగ్ అన్నీ రసాయన లేదా భౌతిక దృగ్విషయాల వల్ల సంభవించవచ్చు మరియు ఈ సమస్యలకు సంభావ్య పరిష్కారాల జాబితా విస్తృతంగా మారుతుంది, మనం రసాయన లేదా భౌతిక సమస్యతో వ్యవహరిస్తున్నామా అనే దానిపై ఆధారపడి ఉంటుంది. తరచుగా, క్రోమాటోగ్రామ్‌లోని వివిధ శిఖరాలను పోల్చడం ద్వారా, మీరు వాటి గురించి ముఖ్యమైన ఆధారాలను కనుగొనవచ్చు. కొన్ని శిఖరాలు ప్రభావితమవుతాయి, కానీ మిగిలినవి బాగా కనిపిస్తాయి, కారణం చాలావరకు రసాయనం.
పీక్ టైలింగ్ యొక్క రసాయన కారణాలు ఇక్కడ క్లుప్తంగా చర్చించడానికి చాలా క్లిష్టంగా ఉన్నాయి. ఆసక్తిగల పాఠకులు "LC ట్రబుల్షూటింగ్" యొక్క ఇటీవలి సంచికను మరింత లోతైన చర్చ (10) కోసం సూచిస్తారు. అయితే, ఇంజెక్ట్ చేయబడిన విశ్లేషణ యొక్క ద్రవ్యరాశిని తగ్గించడం మరియు పీక్ ఆకారం మెరుగుపడుతుందా అని చూడటం ఒక సులభమైన విషయం. అయితే, ఈ సమస్య తప్పక "పరిమిత పద్ధతిలో ఉండాలి". ing చిన్న విశ్లేషణ ద్రవ్యరాశి, లేదా క్రోమాటోగ్రాఫిక్ పరిస్థితులు తప్పనిసరిగా మార్చబడాలి, తద్వారా ఇంజెక్ట్ చేసిన పెద్ద ద్రవ్యరాశితో కూడా మంచి పీక్ ఆకారాలను పొందవచ్చు.
పీక్ టైలింగ్‌కు అనేక సంభావ్య భౌతిక కారణాలు కూడా ఉన్నాయి. సాధ్యాసాధ్యాల గురించిన వివరణాత్మక చర్చకు ఆసక్తి ఉన్న పాఠకులు "LC ట్రబుల్‌షూటింగ్" (11) యొక్క మరొక ఇటీవలి సంచికను సూచిస్తారు. పీక్ టైలింగ్‌కు అత్యంత సాధారణ భౌతిక కారణాలలో ఒకటి ఇంజెక్టర్ మరియు డిటెక్టర్ మధ్య ఒక బిందువు వద్ద పేలవమైన కనెక్షన్ (12) ఒక విపరీతమైన ఉదాహరణ కొన్ని వారాల క్రితం రూపొందించబడింది. మేము ఇంతకు ముందు ఉపయోగించని ఇంజెక్షన్ వాల్వ్, మరియు స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ కేశనాళికపై అచ్చు వేయబడిన ఫెర్రూల్‌తో చిన్న వాల్యూమ్ ఇంజెక్షన్ లూప్‌ను ఇన్‌స్టాల్ చేసాము. కొన్ని ప్రారంభ ట్రబుల్షూటింగ్ ప్రయోగాల తర్వాత, ఇంజెక్షన్ వాల్వ్ స్టేటర్‌లోని పోర్ట్ డెప్త్ మనం ఉపయోగించిన దానికంటే చాలా లోతుగా ఉందని మేము గ్రహించాము, దీని ఫలితంగా పోర్ట్ ట్యూబ్‌లో పెద్ద ట్యూబ్‌లో సమస్య సులభంగా పరిష్కరించబడుతుంది. పోర్ట్ దిగువన ఉన్న డెడ్ వాల్యూమ్‌ను తొలగించడానికి ఫెర్రుల్‌ను సరైన స్థానానికి సర్దుబాటు చేయవచ్చు.
ఫిగర్ 1eలో చూపినటువంటి పీక్ ఫ్రంట్‌లు భౌతిక లేదా రసాయన సమస్యల వల్ల కూడా సంభవించవచ్చు. లీడింగ్ ఎడ్జ్‌కి ఒక సాధారణ భౌతిక కారణం కాలమ్‌లోని పార్టికల్ బెడ్ బాగా ప్యాక్ చేయబడకపోవడం లేదా కాలక్రమేణా కణాలు పునర్వ్యవస్థీకరించబడటం. ఆదర్శ (లీనియర్) పరిస్థితులలో, నిశ్చల దశ (అందుకే, నిలుపుదల కారకం) ద్వారా నిలుపబడిన విశ్లేషణ మొత్తం కాలమ్‌లోని విశ్లేషణ యొక్క ఏకాగ్రతకు రేఖీయంగా సంబంధం కలిగి ఉంటుంది. క్రోమాటోగ్రాఫికల్‌గా, దీనర్థం, కాలమ్‌లోకి ఇంజెక్ట్ చేయబడిన విశ్లేషణ ద్రవ్యరాశి పెరిగేకొద్దీ, శిఖరం కూడా పొడవుగా మారుతుంది, కానీ ఈ రేఖ విస్తారంగా మారినప్పుడు మాత్రమే కాకుండా, ఈ బంధం విస్తారంగా ఉండదు. ఎక్కువ ద్రవ్యరాశి ఇంజెక్ట్ చేయబడినంత వెడల్పుగా ఉంటుంది.అంతేకాకుండా, నాన్ లీనియర్ ఆకారాలు క్రోమాటోగ్రాఫిక్ శిఖరాల ఆకారాన్ని నిర్ణయిస్తాయి, దీని ఫలితంగా లీడింగ్ లేదా వెనుక అంచులు ఏర్పడతాయి. మాస్ ఓవర్‌లోడ్‌తో పీక్ టైలింగ్ (10)కి కారణమయ్యే విధంగా, నాన్ లీనియర్ రిటెన్షన్ వల్ల కలిగే పీక్ లీడింగ్‌ను కూడా ఇంజెక్ట్ చేసిన విశ్లేషణ ద్రవ్యరాశిని తగ్గించడం ద్వారా నిర్ధారించవచ్చు. ఈ ప్రవర్తనను తగ్గించడానికి మాటోగ్రాఫిక్ పరిస్థితులు తప్పనిసరిగా మార్చబడాలి.
కొన్నిసార్లు మనం మూర్తి 1fలో చూపిన విధంగా “స్ప్లిట్” పీక్‌గా కనిపించడాన్ని గమనిస్తాము. ఈ సమస్యను పరిష్కరించడంలో మొదటి దశ ఏమిటంటే, శిఖరం ఆకారం పాక్షిక సహ-ఎలుషన్ (అంటే, రెండు విభిన్నమైన కానీ దగ్గరగా ఎల్యూట్ చేసే సమ్మేళనాల ఉనికి) కారణంగా ఉందో లేదో నిర్ణయించడం. వాస్తవానికి రెండు వేర్వేరు విశ్లేషణలు ఉంటే, వాటి ఉదాహరణను పెంచడం లేదా వాటి పరిష్కారాన్ని ఎంచుకోవడం ద్వారా, వాటి పరిష్కారాన్ని ఎంచుకోండి. మరియు స్పష్టమైన "స్ప్లిట్" శిఖరాలు భౌతిక పనితీరుకు సంబంధించినవి కాలమ్‌తో ఏమీ చేయవు. తరచుగా, ఈ నిర్ణయానికి అత్యంత ముఖ్యమైన ఆధారం ఏమిటంటే, క్రోమాటోగ్రామ్‌లోని అన్ని శిఖరాలు స్ప్లిట్ ఆకారాలను ప్రదర్శిస్తాయా లేదా ఒకటి లేదా రెండు మాత్రమే. ఇది ఒకటి లేదా రెండు అయితే, ఇది బహుశా సహ-ఎల్యూషన్ సమస్య కావచ్చు;అన్ని శిఖరాలు విభజించబడితే, అది బహుశా భౌతిక సమస్య, చాలావరకు కాలమ్‌కు సంబంధించినది.
కాలమ్ యొక్క భౌతిక లక్షణాలకు సంబంధించిన స్ప్లిట్ పీక్‌లు సాధారణంగా పాక్షికంగా నిరోధించబడిన ఇన్‌లెట్ లేదా అవుట్‌లెట్ ఫ్రిట్స్ లేదా కాలమ్‌లోని కణాల పునర్వ్యవస్థీకరణ కారణంగా ఉంటాయి, ఇది కాలమ్ ఛానల్ ఏర్పడే కొన్ని ప్రాంతాల్లో మొబైల్ దశ కంటే వేగంగా ప్రవహించేలా మొబైల్ దశను అనుమతిస్తుంది.అయినప్పటికీ, నా అనుభవంలో, ఇది సాధారణంగా దీర్ఘకాలిక పరిష్కారం కంటే స్వల్పకాలికంగా ఉంటుంది. ఇది తరచుగా కాలమ్‌లో కణాలు మళ్లీ కలిసిపోతే ఆధునిక నిలువు వరుసలతో ప్రాణాంతకం అవుతుంది. ఈ సమయంలో, నిలువు వరుసను భర్తీ చేయడం మరియు కొనసాగించడం ఉత్తమం.
నా స్వంత ల్యాబ్‌లో ఇటీవలి ఉదాహరణ నుండి కూడా Figure 1gలో గరిష్ట స్థాయి, సిగ్నల్ చాలా ఎక్కువగా ఉందని సూచిస్తుంది, అది ప్రతిస్పందన శ్రేణి యొక్క ఉన్నత స్థాయికి చేరుకుంది. ఆప్టికల్ శోషణ డిటెక్టర్‌ల కోసం (UV-vis), విశ్లేషణ సాంద్రత చాలా ఎక్కువగా ఉన్నప్పుడు, విశ్లేషణ చాలా తక్కువ కాంతిని గ్రహిస్తుంది. విచ్చలవిడి కాంతి మరియు "డార్క్ కరెంట్" వంటి శబ్దం యొక్క వివిధ మూలాలచే ప్రభావితమవుతుంది, ఇది సిగ్నల్ రూపాన్ని చాలా "మసకగా" చేస్తుంది మరియు విశ్లేషణ ఏకాగ్రతతో సంబంధం లేకుండా చేస్తుంది.ఇది జరిగినప్పుడు, సమస్య తరచుగా విశ్లేషణ యొక్క ఇంజెక్షన్ వాల్యూమ్‌ను తగ్గించడం ద్వారా సులభంగా పరిష్కరించబడుతుంది-ఇంజెక్షన్ వాల్యూమ్‌ను తగ్గించడం, నమూనాను పలుచన చేయడం లేదా రెండూ.
క్రోమాటోగ్రఫీ పాఠశాలలో, మేము నమూనాలో విశ్లేషణ ఏకాగ్రత యొక్క సూచికగా డిటెక్టర్ సిగ్నల్ (అనగా, క్రోమాటోగ్రామ్‌లోని y- అక్షం) ను ఉపయోగిస్తాము. కాబట్టి సున్నా క్రింద సిగ్నల్‌తో క్రోమాటోగ్రామ్‌ను చూడటం విచిత్రంగా అనిపిస్తుంది, సాధారణ వ్యాఖ్యానం ఏమిటంటే, ఇది ప్రతికూల విశ్లేషణ ఏకాగ్రతను సూచిస్తుంది.
ఈ సందర్భంలో, ప్రతికూల శిఖరం అంటే నిలువు వరుస నుండి బయటకు వచ్చే అణువులు పీక్‌కు ముందు మరియు తర్వాత వెంటనే మొబైల్ దశ కంటే తక్కువ కాంతిని గ్రహిస్తాయి. ఉదాహరణకు, సాపేక్షంగా తక్కువ గుర్తింపు తరంగదైర్ఘ్యాలు (<230 nm) మరియు మొబైల్ ఫేజ్ సంకలితాలను ఉపయోగించినప్పుడు ఈ తరంగదైర్ఘ్యాల వద్ద ఎక్కువ కాంతిని గ్రహించే మొబైల్ దశ సంకలనాలు సంభవించవచ్చు. క్రమాంకనం వక్రరేఖను సిద్ధం చేయడానికి మరియు ఖచ్చితమైన పరిమాణాత్మక సమాచారాన్ని పొందేందుకు మీరు వాస్తవానికి ప్రతికూల శిఖరాలను ఉపయోగించవచ్చు, కాబట్టి వాటిని స్వతహాగా నివారించేందుకు ఎటువంటి ప్రాథమిక కారణం లేదు (ఈ పద్ధతిని కొన్నిసార్లు "పరోక్ష UV గుర్తింపు" అని సూచిస్తారు) (13).అయితే, మనం నిజంగా ప్రతికూల శిఖరాలను పూర్తిగా నివారించాలనుకుంటే, శోషణను గుర్తించడం కంటే మొబైల్ దశను మార్చడం ఉత్తమం. మొబైల్ దశ యొక్క కూర్పు, తద్వారా అవి విశ్లేషణల కంటే తక్కువ కాంతిని గ్రహిస్తాయి.
సాల్వెంట్ మ్యాట్రిక్స్ వంటి నమూనాలోని విశ్లేషణ కాకుండా ఇతర భాగాల వక్రీభవన సూచిక మొబైల్ దశ యొక్క వక్రీభవన సూచికకు భిన్నంగా ఉన్నప్పుడు వక్రీభవన సూచిక (RI) గుర్తింపును ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు ప్రతికూల శిఖరాలు కూడా కనిపిస్తాయి. ఇది UV-vis డిటెక్షన్‌తో కూడా జరుగుతుంది, కానీ ఈ ప్రభావం చాలా తక్కువగా ఉంటుంది. మొబైల్ దశకు మాతృక.
LC ట్రబుల్షూటింగ్ యొక్క ప్రాథమిక అంశంపై మూడవ భాగంలో, గమనించిన శిఖరం ఆకారం ఊహించిన లేదా సాధారణ శిఖర ఆకృతికి భిన్నంగా ఉండే పరిస్థితులను చర్చించాను. అటువంటి సమస్యల యొక్క ప్రభావవంతమైన ట్రబుల్షూటింగ్ ఊహించిన శిఖర ఆకృతుల జ్ఞానంతో ప్రారంభమవుతుంది (సిద్ధాంతం లేదా ఇప్పటికే ఉన్న పద్ధతులతో ముందస్తు అనుభవం ఆధారంగా), కాబట్టి ఈ అంచనాల నుండి వ్యత్యాసాలు స్పష్టంగా ఉన్నాయి. నేను చాలా తరచుగా చూసే కారణాలు.ఈ వివరాలను తెలుసుకోవడం అనేది ట్రబుల్షూటింగ్ ప్రారంభించడానికి మంచి స్థలాన్ని అందిస్తుంది, కానీ అన్ని అవకాశాలను సంగ్రహించదు. కారణాలు మరియు పరిష్కారాల యొక్క మరింత లోతైన జాబితాపై ఆసక్తి ఉన్న పాఠకులు LCGC “LC ట్రబుల్షూటింగ్ గైడ్” వాల్ చార్ట్‌ని చూడవచ్చు.
(4) LCGC “LC ట్రబుల్షూటింగ్ గైడ్” వాల్ చార్ట్.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. ఫెలింగర్, క్రోమాటోగ్రఫీలో డేటా విశ్లేషణ మరియు సిగ్నల్ ప్రాసెసింగ్ (ఎల్సేవియర్, న్యూయార్క్, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) వహాబ్ MF, దాస్‌గుప్తా PK, కడ్జో AF మరియు ఆర్మ్‌స్ట్రాంగ్ DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.