Nature.com ని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్ పరిమిత CSS మద్దతును కలిగి ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్ను ఉపయోగించాలని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్ప్లోరర్లో అనుకూలత మోడ్ను నిలిపివేయండి). ఈలోగా, నిరంతర మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము సైట్ను శైలులు మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా రెండర్ చేస్తాము.
లిక్విడ్ బయాప్సీ (LB) అనేది బయోమెడికల్ రంగంలో వేగంగా ప్రజాదరణ పొందుతున్న ఒక భావన. ఈ భావన ప్రధానంగా ప్రసరణ ఎక్స్ట్రాసెల్యులర్ DNA (ccfDNA) యొక్క శకలాలను గుర్తించడంపై ఆధారపడి ఉంటుంది, ఇవి ప్రధానంగా వివిధ కణజాలాలలో కణాల మరణం తర్వాత చిన్న శకలాలుగా విడుదలవుతాయి. ఈ శకలాలలో కొంత భాగం విదేశీ (విదేశీ) కణజాలాలు లేదా జీవుల నుండి ఉద్భవించాయి. ప్రస్తుత పనిలో, మేము ఈ భావనను అధిక సముద్రపు నీటి వడపోత సామర్థ్యానికి ప్రసిద్ధి చెందిన సెంటినెల్ జాతి అయిన మస్సెల్స్కు వర్తింపజేసాము. సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థల జీవవైవిధ్యం గురించి సమాచారాన్ని అందించడానికి వివిధ వనరుల నుండి పర్యావరణ DNA శకలాలను సంగ్రహించడానికి సహజ ఫిల్టర్లుగా పనిచేసే మస్సెల్స్ సామర్థ్యాన్ని మేము ఉపయోగిస్తాము. మస్సెల్ హెమోలింప్ 1 నుండి 5 kb వరకు పరిమాణంలో చాలా తేడా ఉన్న DNA శకలాలను కలిగి ఉందని మా ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి. షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ పెద్ద సంఖ్యలో DNA శకలాలు విదేశీ సూక్ష్మజీవుల మూలానికి చెందినవని చూపించింది. వాటిలో, మేము బ్యాక్టీరియా, ఆర్కియా మరియు వైరస్ల నుండి DNA శకలాలను కనుగొన్నాము, వీటిలో తీరప్రాంత సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో సాధారణంగా కనిపించే వివిధ రకాల హోస్ట్లను సోకడానికి తెలిసిన వైరస్లు ఉన్నాయి. ముగింపులో, మా అధ్యయనం మస్సెల్స్కు వర్తించే LB భావన సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో సూక్ష్మజీవుల వైవిధ్యం గురించి గొప్ప కానీ ఇంకా అన్వేషించబడని జ్ఞాన మూలాన్ని సూచిస్తుందని నిరూపిస్తుంది.
సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థల జీవవైవిధ్యంపై వాతావరణ మార్పు (CC) ప్రభావం వేగంగా అభివృద్ధి చెందుతున్న పరిశోధనా రంగం. గ్లోబల్ వార్మింగ్ ముఖ్యమైన శారీరక ఒత్తిళ్లను కలిగించడమే కాకుండా, సముద్ర జీవుల ఉష్ణ స్థిరత్వం యొక్క పరిణామ పరిమితులను కూడా నెట్టివేస్తుంది, అనేక జాతుల ఆవాసాలను ప్రభావితం చేస్తుంది, మరింత అనుకూలమైన పరిస్థితుల కోసం వెతకడానికి వారిని ప్రేరేపిస్తుంది [1, 2]. మెటాజోవాన్ల జీవవైవిధ్యాన్ని ప్రభావితం చేయడంతో పాటు, CC హోస్ట్-సూక్ష్మజీవుల పరస్పర చర్యల యొక్క సున్నితమైన సమతుల్యతను దెబ్బతీస్తుంది. ఈ సూక్ష్మజీవుల డైస్బాక్టీరియోసిస్ సముద్ర జీవావరణ వ్యవస్థలకు తీవ్రమైన ముప్పును కలిగిస్తుంది ఎందుకంటే ఇది సముద్ర జీవులను అంటు వ్యాధికారకాలకు మరింత అనువుగా చేస్తుంది [3, 4]. సామూహిక మరణాలలో SS ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుందని నమ్ముతారు, ఇది ప్రపంచ సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థల నిర్వహణకు తీవ్రమైన సమస్య [5, 6]. అనేక సముద్ర జాతుల ఆర్థిక, పర్యావరణ మరియు పోషక ప్రభావాలను బట్టి ఇది ఒక ముఖ్యమైన సమస్య. CK యొక్క ప్రభావాలు మరింత తక్షణం మరియు తీవ్రంగా ఉండే ధ్రువ ప్రాంతాలలో నివసించే బివాల్వ్లకు ఇది ప్రత్యేకంగా వర్తిస్తుంది [6, 7]. వాస్తవానికి, మైటిలస్ spp వంటి బివాల్వ్లు. సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలపై CC ప్రభావాలను పర్యవేక్షించడానికి విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతున్నాయి. ఆశ్చర్యకరంగా, వాటి ఆరోగ్యాన్ని పర్యవేక్షించడానికి సాపేక్షంగా పెద్ద సంఖ్యలో బయోమార్కర్లు అభివృద్ధి చేయబడ్డాయి, తరచుగా ఎంజైమాటిక్ కార్యకలాపాలు లేదా సెల్ ఎబిలిబిలిటీ మరియు ఫాగోసైటిక్ కార్యకలాపాలు వంటి సెల్యులార్ ఫంక్షన్ల ఆధారంగా ఫంక్షనల్ బయోమార్కర్లను కలిగి ఉన్న రెండు-స్థాయి విధానాన్ని ఉపయోగిస్తాయి [8]. ఈ పద్ధతుల్లో సముద్రపు నీటిని పెద్ద మొత్తంలో గ్రహించిన తర్వాత మృదు కణజాలాలలో పేరుకుపోయే నిర్దిష్ట పీడన సూచికల సాంద్రతను కొలవడం కూడా ఉంటుంది. అయితే, బివాల్వ్ల యొక్క అధిక వడపోత సామర్థ్యం మరియు సెమీ-ఓపెన్ సర్క్యులేటరీ సిస్టమ్ లిక్విడ్ బయాప్సీ (LB) భావనను ఉపయోగించి కొత్త హెమోలింఫ్ బయోమార్కర్లను అభివృద్ధి చేయడానికి అవకాశాన్ని అందిస్తాయి, ఇది రోగి నిర్వహణకు సరళమైన మరియు కనిష్టంగా ఇన్వాసివ్ విధానం. రక్త నమూనాలు [9, 10]. మానవ LBలో అనేక రకాల ప్రసరణ అణువులను కనుగొనగలిగినప్పటికీ, ఈ భావన ప్రధానంగా ప్లాస్మాలో ప్రసరణ చేసే ఎక్స్ట్రాసెల్యులార్ DNA (ccfDNA) శకలాల DNA సీక్వెన్సింగ్ విశ్లేషణపై ఆధారపడి ఉంటుంది. నిజానికి, మానవ ప్లాస్మాలో ప్రసరణ DNA ఉనికి 20వ శతాబ్దం మధ్యకాలం నుండి తెలుసు [11], కానీ ఇటీవలి సంవత్సరాలలో మాత్రమే అధిక-త్రూపుట్ సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతుల ఆగమనం ccfDNA ఆధారంగా క్లినికల్ డయాగ్నసిస్కు దారితీసింది. ఈ ప్రసరణ DNA శకలాలు ఉండటం కణ మరణం తర్వాత జన్యుసంబంధమైన DNA (న్యూక్లియర్ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్) యొక్క నిష్క్రియాత్మక విడుదల కారణంగా ఉంది. ఆరోగ్యవంతమైన వ్యక్తులలో, ccfDNA సాంద్రత సాధారణంగా తక్కువగా ఉంటుంది (<10 ng/mL) కానీ వివిధ పాథాలజీలతో బాధపడుతున్న లేదా ఒత్తిడికి గురైన రోగులలో 5-10 రెట్లు పెరుగుతుంది, ఫలితంగా కణజాలం దెబ్బతింటుంది. ఆరోగ్యవంతమైన వ్యక్తులలో, ccfDNA సాంద్రత సాధారణంగా తక్కువగా ఉంటుంది (<10 ng/mL) కానీ వివిధ పాథాలజీలతో బాధపడుతున్న లేదా ఒత్తిడికి గురైన రోగులలో 5-10 రెట్లు పెరుగుతుంది, ఫలితంగా కణజాలం దెబ్బతింటుంది. У здоровых людей контрация вккДНК в нерме низкая (<10 ng/ml), NO MOJET POVYSHATUS IN 5-10 в 5-10 రాజ్లిచ్నోయ్ పటొలాగీ లేదా పోడ్వెర్గయుషియస్ స్ట్రెస్సూ, ప్రివోడియాషెము క్ పోవ్రేగ్డేనియు త్కనీ. ఆరోగ్యవంతమైన వ్యక్తులలో, cccDNA సాంద్రత సాధారణంగా తక్కువగా ఉంటుంది (<10 ng/mL), కానీ వివిధ పాథాలజీలు ఉన్న రోగులలో లేదా కణజాల నష్టానికి దారితీసే ఒత్తిడిలో ఉన్న రోగులలో ఇది 5-10 రెట్లు పెరుగుతుంది.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）,但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织患在 健康 个体 中, ccfdna中 可 增加 5-10 倍 , 从而 组 织。。损伤కోన్సాంట్రాసియి ccfDNA నిస్కీయే (<10 ng/ml) మీ జ్డోరోవిచ్ లిడియేట్, 5-10వ తేదీలోపు రాజ్లిచ్నిమి పాటోలాజియామి లేదా స్ట్రెసోమ్, హెచ్టో ప్రివోడిట్ క్ పోవ్రెగ్డేనియు త్కనేయ్. ఆరోగ్యకరమైన వ్యక్తులలో ccfDNA సాంద్రతలు సాధారణంగా తక్కువగా ఉంటాయి (<10 ng/ml), కానీ వివిధ పాథాలజీలు లేదా ఒత్తిడి ఉన్న రోగులలో 5-10 రెట్లు పెరగవచ్చు, ఫలితంగా కణజాలం దెబ్బతింటుంది.ccfDNA శకలాల పరిమాణం విస్తృతంగా మారుతుంది, కానీ సాధారణంగా 150 నుండి 200 bp వరకు ఉంటుంది. [12]. స్వీయ-ఉత్పన్నమైన ccfDNA విశ్లేషణ, అంటే, సాధారణ లేదా రూపాంతరం చెందిన హోస్ట్ కణాల నుండి ccfDNA, న్యూక్లియర్ మరియు/లేదా మైటోకాన్డ్రియల్ జన్యువులో ఉన్న జన్యు మరియు బాహ్యజన్యు మార్పులను గుర్తించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది, తద్వారా వైద్యులు నిర్దిష్ట పరమాణు-లక్ష్య చికిత్సలను ఎంచుకోవడానికి సహాయపడుతుంది [13]. అయితే, గర్భధారణ సమయంలో పిండ కణాల నుండి లేదా మార్పిడి చేయబడిన అవయవాల నుండి ccfDNA వంటి విదేశీ వనరుల నుండి ccfDNA పొందవచ్చు [14,15,16,17]. ccfDNA అనేది అంటువ్యాధి ఏజెంట్ (విదేశీ) యొక్క న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల ఉనికిని గుర్తించడానికి కూడా ఒక ముఖ్యమైన సమాచార వనరు, ఇది రక్త సంస్కృతుల ద్వారా గుర్తించబడని విస్తృతమైన ఇన్ఫెక్షన్లను నాన్-ఇన్వాసివ్ గుర్తింపును అనుమతిస్తుంది, సోకిన కణజాలం యొక్క ఇన్వాసివ్ బయాప్సీని నివారిస్తుంది [18]. ఇటీవలి అధ్యయనాలు మానవ రక్తం వైరల్ మరియు బాక్టీరియల్ వ్యాధికారకాలను గుర్తించడానికి ఉపయోగించే గొప్ప సమాచార వనరును కలిగి ఉన్నాయని మరియు మానవ ప్లాస్మాలో కనిపించే ccfDNAలో దాదాపు 1% విదేశీ మూలం అని చూపించాయి [19]. ఈ అధ్యయనాలు ఒక జీవి యొక్క ప్రసరణ సూక్ష్మజీవి యొక్క జీవవైవిధ్యాన్ని ccfDNA విశ్లేషణ ఉపయోగించి అంచనా వేయవచ్చని నిరూపిస్తున్నాయి. అయితే, ఇటీవల వరకు, ఈ భావన మానవులలో మరియు కొంతవరకు ఇతర సకశేరుకాలలో ప్రత్యేకంగా ఉపయోగించబడింది [20, 21].
ప్రస్తుత పత్రంలో, 35 మిలియన్ సంవత్సరాల క్రితం ఏర్పడిన ఒక పెద్ద పీఠభూమి పైన ఉన్న ద్వీపాల సమూహం అయిన సబ్అంటార్కిటిక్ కెర్గులెన్ దీవులలో సాధారణంగా కనిపించే దక్షిణ జాతి అయిన ఔలాకోమియా అట్రా యొక్క ccfDNAను విశ్లేషించడానికి మేము LB సామర్థ్యాన్ని ఉపయోగిస్తాము. అగ్నిపర్వత విస్ఫోటనం. ఇన్ విట్రో ప్రయోగాత్మక వ్యవస్థను ఉపయోగించి, సముద్రపు నీటిలోని DNA శకలాలు మస్సెల్స్ ద్వారా త్వరగా తీసుకోబడి హెమోలింఫ్ కంపార్ట్మెంట్లోకి ప్రవేశిస్తాయని మేము కనుగొన్నాము. షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ మస్సెల్ హెమోలింఫ్ ccfDNA దాని స్వంత మరియు స్వయం మూలం కాని DNA శకలాలను కలిగి ఉందని చూపించింది, వీటిలో సహజీవన బ్యాక్టీరియా మరియు చల్లని అగ్నిపర్వత సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థల యొక్క విలక్షణమైన బయోమ్ల నుండి DNA శకలాలు ఉన్నాయి. హెమోలింఫ్ ccfDNAలో వివిధ హోస్ట్ పరిధులతో వైరస్ల నుండి ఉద్భవించిన వైరల్ సీక్వెన్స్లు కూడా ఉన్నాయి. అస్థి చేపలు, సముద్ర ఎనిమోన్లు, ఆల్గే మరియు కీటకాలు వంటి బహుళ సెల్యులార్ జంతువుల నుండి DNA శకలాలు కూడా మేము కనుగొన్నాము. ముగింపులో, సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో గొప్ప జన్యు సంగ్రహణను ఉత్పత్తి చేయడానికి LB భావనను సముద్ర అకశేరుకాలకు విజయవంతంగా అన్వయించవచ్చని మా అధ్యయనం నిరూపిస్తుంది.
పెద్ద చేపలు (55-70 మి.మీ పొడవు) మైటిలస్ ప్లాటెన్సిస్ (ఎం. ప్లాటెన్సిస్) మరియు ఔలాకోమ్య అట్రా (ఎ. అట్రా) పోర్ట్-ఔ-ఫ్రాన్స్ (049°21.235 దక్షిణ, 070°13.490 తూర్పు) యొక్క అంతర్వేది రాతి తీరాల నుండి సేకరించబడ్డాయి. డిసెంబర్ 2018లో కెర్గులెన్ దీవులు. ఇతర వయోజన నీలి మస్సెల్స్ (మైటిలస్ spp.) వాణిజ్య సరఫరాదారు (PEI ముస్సెల్ కింగ్ ఇంక్., ప్రిన్స్ ఎడ్వర్డ్ ద్వీపం, కెనడా) నుండి పొందబడ్డాయి మరియు 32‰ కృత్రిమ ఉప్పునీరు యొక్క 10–20 L కలిగిన ఉష్ణోగ్రత నియంత్రిత (4°C) ఎరేటెడ్ ట్యాంక్లో ఉంచబడ్డాయి. (కృత్రిమ సముద్ర ఉప్పు రీఫ్ క్రిస్టల్, ఇన్స్టంట్ ఓషన్, వర్జీనియా, USA). ప్రతి ప్రయోగం కోసం, వ్యక్తిగత షెల్ల పొడవు మరియు బరువును కొలుస్తారు.
ఈ ప్రోగ్రామ్ కోసం ఉచిత ఓపెన్ యాక్సెస్ ప్రోటోకాల్ ఆన్లైన్లో అందుబాటులో ఉంది (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). క్లుప్తంగా, LB హెమోలింఫ్ను అబ్డక్టర్ కండరాల నుండి సేకరించారు [22]. హెమోలింఫ్ను 1200×g వద్ద 3 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా స్పష్టం చేశారు, సూపర్నాటెంట్ను ఉపయోగించే వరకు (-20°C) స్తంభింపజేశారు. cfDNA యొక్క ఐసోలేషన్ మరియు శుద్దీకరణ కోసం, తయారీదారు సూచనల ప్రకారం నమూనాలను (1.5-2.0 ml) కరిగించి న్యూక్లియోస్నాప్ cfDNA కిట్ (మాచెరీ-నాగెల్, బెత్లెహెన్, PA) ఉపయోగించి ప్రాసెస్ చేశారు. తదుపరి విశ్లేషణ వరకు ccfDNA -80°C వద్ద నిల్వ చేయబడింది. కొన్ని ప్రయోగాలలో, ccfDNAను QIAamp DNA ఇన్వెస్టిగేటర్ కిట్ (QIAGEN, టొరంటో, ఒంటారియో, కెనడా) ఉపయోగించి వేరుచేసి శుద్ధి చేశారు. ప్రామాణిక పికోగ్రీన్ అస్సే ఉపయోగించి శుద్ధి చేయబడిన DNAను లెక్కించారు. హై సెన్సిటివిటీ DNA కిట్ ఉపయోగించి ఎజిలెంట్ 2100 బయోఅనలైజర్ (ఎజిలెంట్ టెక్నాలజీస్ ఇంక్., శాంటా క్లారా, CA) ఉపయోగించి కేశనాళిక ఎలక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా ఐసోలేటెడ్ ccfDNA యొక్క ఫ్రాగ్మెంట్ డిస్ట్రిబ్యూషన్ విశ్లేషించబడింది. తయారీదారు సూచనల ప్రకారం ccfDNA నమూనాలో 1 µl ఉపయోగించి ఈ పరీక్ష జరిగింది.
హెమోలింఫ్ ccfDNA భాగాల క్రమం కోసం, జెనోమ్ క్యూబెక్ (మాంట్రియల్, క్యూబెక్, కెనడా) ఇల్యూమినా మిసెక్ PE75 కిట్ యొక్క ఇల్యూమినా DNA మిక్స్ కిట్ను ఉపయోగించి షాట్గన్ లైబ్రరీలను సిద్ధం చేసింది. ఒక ప్రామాణిక అడాప్టర్ (బయోఓ) ఉపయోగించబడింది. రా డేటా ఫైల్లు NCBI సీక్వెన్స్ రీడ్ ఆర్కైవ్ (SRR8924808 మరియు SRR8924809) నుండి అందుబాటులో ఉన్నాయి. ఫాస్ట్క్యూసి [23] ఉపయోగించి ప్రాథమిక పఠన నాణ్యతను అంచనా వేశారు. ట్రిమ్మోమాటిక్ [24] క్లిప్పింగ్ అడాప్టర్లు మరియు పేలవమైన నాణ్యత గల రీడ్ల కోసం ఉపయోగించబడింది. జత చేసిన చివరలతో కూడిన షాట్గన్ రీడ్లు ఫ్లాష్ను పొడవైన సింగిల్ రీడ్లలో విలీనం చేయబడ్డాయి, అవి అసమతుల్యతలను నివారించడానికి 20 bp కనిష్ట అతివ్యాప్తితో ఉంటాయి [25]. విలీనం చేయబడిన రీడ్లు బైవాల్వ్ NCBI టాక్సానమీ డేటాబేస్ (e విలువ < 1e−3 మరియు 90% హోమోలజీ) ఉపయోగించి BLASTNతో వ్యాఖ్యానించబడ్డాయి మరియు DUST [26] ఉపయోగించి తక్కువ-సంక్లిష్టత శ్రేణుల మాస్కింగ్ నిర్వహించబడింది. విలీనం చేయబడిన రీడ్లు బైవాల్వ్ NCBI టాక్సానమీ డేటాబేస్ (e విలువ < 1e−3 మరియు 90% హోమోలజీ) ఉపయోగించి BLASTNతో వ్యాఖ్యానించబడ్డాయి మరియు DUST [26] ఉపయోగించి తక్కువ-సంక్లిష్టత శ్రేణుల మాస్కింగ్ నిర్వహించబడింది. ఆబ్జెడినెన్సీ బ్లాస్ట్ఎన్ఎస్ఐఎస్పోల్జోవానియం బాజీ డాన్టివస్ ట్యాక్సోనోమిస్ моллюсков NCBI (జ్ఞాపక ఇ <1e-3 మరియు 90% గోమోలాగి), а маскирование последовательностей низкой сложнобыно ధూళి [26]. పూల్డ్ రీడ్లు NCBI బైవాల్వ్ టాక్సానమీ డేటాబేస్ (e విలువ < 1e-3 మరియు 90% హోమోలజీ) ఉపయోగించి BLASTNతో వ్యాఖ్యానించబడ్డాయి మరియు DUST [26] ఉపయోగించి తక్కువ సంక్లిష్టత శ్రేణి మాస్కింగ్ నిర్వహించబడింది.使用双壳类NCBI进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类进行 复杂度 序列 的。。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽ఆబ్జెడినెన్సీ టెక్నీషియన్ బైలీ ఆన్నోటిరోవానీ స్ పోమోష్యూ BLASTN సిస్పోల్జోవానియమ్ టాక్సోనోమిచెస్కోయ్ బ్యాగ్స్ డేట్ MOLLUSCOV NCBI (ప్రజాస్వామ్య ఇ <1e-3 మరియు 90% గోమోలాగి), మాస్కిరోవానీ పోస్ట్ ధూళి [26]. పూల్డ్ రీడ్లు NCBI బైవాల్వ్ టాక్సానమిక్ డేటాబేస్ (e విలువ <1e-3 మరియు 90% హోమోలజీ) ఉపయోగించి BLASTNతో వ్యాఖ్యానించబడ్డాయి మరియు DUST [26] ఉపయోగించి తక్కువ సంక్లిష్టత శ్రేణి మాస్కింగ్ నిర్వహించబడింది.రీడ్లను రెండు గ్రూపులుగా విభజించారు: బైవాల్వ్ సీక్వెన్స్లకు సంబంధించినవి (ఇక్కడ స్వీయ-రీడ్లు అని పిలుస్తారు) మరియు సంబంధం లేనివి (స్వీయ-రీడ్లు కానివి). కాంటిగ్లను ఉత్పత్తి చేయడానికి MEGAHITని ఉపయోగించి రెండు గ్రూపులను విడిగా సమీకరించారు [27]. ఇంతలో, గ్రహాంతర మైక్రోబయోమ్ రీడ్ల వర్గీకరణ పంపిణీని క్రాకెన్2 [28] ఉపయోగించి వర్గీకరించారు మరియు గెలాక్సీ [29, 30]లోని క్రోనా పై చార్ట్ ద్వారా గ్రాఫికల్గా ప్రాతినిధ్యం వహించారు. మా ప్రాథమిక ప్రయోగాల నుండి సరైన kmers kmers-59గా నిర్ణయించబడింది. తుది ఉల్లేఖనం కోసం BLASTN (బివాల్వ్ NCBI డేటాబేస్, e విలువ < 1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ) తో అమరిక ద్వారా స్వీయ కాంటిగ్లను గుర్తించారు. తుది ఉల్లేఖనం కోసం BLASTN (బివాల్వ్ NCBI డేటాబేస్, e విలువ < 1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ) తో అమరిక ద్వారా స్వీయ కాంటిగ్లను గుర్తించారు. గ్యాటెమ్ సోబ్స్ట్వెన్నియే కాంటిగి బైలీ ఇడెంటిఫిషైరోవానీ పుటేమ్ సోపోస్టావ్లేనియా స్ బ్లాస్ట్న్ (బాజా డానిక్స్ డైవ్స్టవ్ NCBI, ప్రముఖ మరియు <1e-10 మరియు 60%) నుండి ప్రకటనలు తుది ఉల్లేఖనం కోసం BLASTN (NCBI బైవాల్వ్ డేటాబేస్, e విలువ <1e-10 మరియు 60% హోమోలజీ) తో సరిపోల్చడం ద్వారా స్వీయ-కాంటిగ్లను గుర్తించారు.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% గ్యాటెమ్ బైలీ ఐడెంటిఫికేషన్స్ సోబ్స్ట్వెన్నియే కోంటిగి డిలియా ఒకోన్చాటెల్నోయ్ అనోటాషియస్ పుటేమ్ సోపోస్టవ్స్ данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTN (NCBI బైవాల్వ్ డేటాబేస్, e విలువ <1e-10 మరియు 60% హోమోలజీ) తో సరిపోల్చడం ద్వారా తుది ఉల్లేఖనం కోసం స్వీయ-కాంటిగ్లను గుర్తించారు. సమాంతరంగా, నాన్సెల్ఫ్ గ్రూప్ కాంటిగ్లను BLASTN (nt NCBI డేటాబేస్, e విలువ < 1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ)తో వ్యాఖ్యానించారు. సమాంతరంగా, నాన్సెల్ఫ్ గ్రూప్ కాంటిగ్లను BLASTN (nt NCBI డేటాబేస్, e విలువ < 1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ)తో వ్యాఖ్యానించారు. పరాల్లెల్నో చుజెరోడ్ని గ్రుప్పోవై కాంటిగి బైలీ అనోటిరోవానీ స్ పోమోష్యూ BLASTN (బాజా డాన్సీ
PCR కోసం ఉపయోగించే ప్రైమర్లు టేబుల్ S1లో జాబితా చేయబడ్డాయి. ccfDNA లక్ష్య జన్యువులను విస్తరించడానికి Taq DNA పాలిమరేస్ (బయో బేసిక్ కెనడా, మార్ఖం, ON) ఉపయోగించబడింది. కింది ప్రతిచర్య పరిస్థితులు ఉపయోగించబడ్డాయి: 95°C వద్ద 3 నిమిషాలు డీనాటరేషన్, 1 నిమిషానికి 95°C వద్ద డీనాటరేషన్, 1 నిమిషానికి ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను సెట్ చేయడం, 72°C వద్ద 1 నిమిషానికి పొడుగు, 35 చక్రాలు మరియు చివరకు 10 నిమిషాల్లో 72°C. PCR ఉత్పత్తులను 95 V వద్ద SYBRTM సేఫ్ DNA జెల్ స్టెయిన్ (ఇన్విట్రోజెన్, బర్లింగ్టన్, ON, కెనడా) కలిగి ఉన్న అగరోజ్ జెల్స్లో (1.5%) ఎలక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా వేరు చేశారు.
మస్సెల్స్ (మైటిలస్ spp.) 500 ml ఆక్సిజనేటెడ్ సముద్రపు నీటిలో (32 PSU) 24 గంటలు 4°C వద్ద అలవాటు పడ్డాయి. హ్యూమన్ గెలాక్టిన్-7 cDNA సీక్వెన్స్ (NCBI యాక్సెషన్ నంబర్ L07769) ను ఎన్కోడ్ చేసే ఇన్సర్ట్ కలిగిన ప్లాస్మిడ్ DNA ను 190 μg/μl తుది సాంద్రత వద్ద వయల్కు జోడించారు. DNA జోడించకుండా అదే పరిస్థితులలో పొదిగిన మస్సెల్స్ నియంత్రణ. మూడవ కంట్రోల్ ట్యాంక్లో మస్సెల్స్ లేకుండా DNA ఉంది. సముద్రపు నీటిలో DNA నాణ్యతను పర్యవేక్షించడానికి, సూచించిన సమయంలో ప్రతి ట్యాంక్ నుండి సముద్రపు నీటి నమూనాలు (20 μl; మూడు పునరావృత్తులు) తీసుకోబడ్డాయి. ప్లాస్మిడ్ DNA ట్రేసబిలిటీ కోసం, LB మస్సెల్స్ సూచించిన సమయాల్లో పండించబడ్డాయి మరియు qPCR మరియు ddPCR ద్వారా విశ్లేషించబడ్డాయి. సముద్రపు నీటిలో అధిక ఉప్పు శాతం ఉన్నందున, అన్ని PCR పరీక్షలకు ముందు ఆల్కాట్లను PCR నాణ్యత గల నీటిలో (1:10) కరిగించారు.
డిజిటల్ డ్రాప్లెట్ PCR (ddPCR) బయోరాడ్ QX200 ప్రోటోకాల్ (మిస్సిస్సాగా, ఒంటారియో, కెనడా) ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది. వాంఛనీయ ఉష్ణోగ్రతను నిర్ణయించడానికి ఉష్ణోగ్రత ప్రొఫైల్ను ఉపయోగించండి (టేబుల్ S1). QX200 డ్రాప్ జనరేటర్ (బయోరాడ్) ఉపయోగించి డ్రాప్లు ఉత్పత్తి చేయబడ్డాయి. ddPCR ఈ క్రింది విధంగా నిర్వహించబడింది: 5 నిమిషాలకు 95°C, 30 సెకన్లకు 95°C యొక్క 50 చక్రాలు మరియు 1 నిమిషానికి ఇచ్చిన ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత మరియు 30 సెకన్లకు 72°C, 5 నిమిషాలకు 4°C మరియు 5 నిమిషాల్లో 90°C. QX200 డ్రాప్ రీడర్ (బయోరాడ్) ఉపయోగించి డ్రాప్ల సంఖ్య మరియు సానుకూల ప్రతిచర్యలు (కాపీల సంఖ్య/µl) కొలుస్తారు. 10,000 కంటే తక్కువ బిందువులు ఉన్న నమూనాలను తిరస్కరించారు. ddPCR అమలు చేయబడిన ప్రతిసారీ నమూనా నియంత్రణ నిర్వహించబడలేదు.
qPCR ను రోటర్-జీన్® 3000 (కార్బెట్ రీసెర్చ్, సిడ్నీ, ఆస్ట్రేలియా) మరియు LGALS7 నిర్దిష్ట ప్రైమర్లను ఉపయోగించి నిర్వహించారు. క్వాంటిఫాస్ట్ SYBR గ్రీన్ PCR కిట్ (QIAGEN) ఉపయోగించి అన్ని పరిమాణాత్మక PCR లను 20 µl లో నిర్వహించారు. qPCR ను 95°C వద్ద 15 నిమిషాల ఇంక్యుబేషన్తో ప్రారంభించారు, ఆ తర్వాత 95°C వద్ద 10 సెకన్ల పాటు 40 సైకిల్స్ మరియు 60°C వద్ద 60 సెకన్ల పాటు ఒక డేటా సేకరణతో ప్రారంభించారు. 5 సెకన్లకు 95°C, 60 సెకన్లకు 65°C మరియు qPCR చివరిలో 97°C వద్ద వరుస కొలతలను ఉపయోగించి ద్రవీభవన వక్రతలు రూపొందించబడ్డాయి. నియంత్రణ నమూనాలను మినహాయించి, ప్రతి qPCR ను మూడుసార్లు ప్రదర్శించారు.
మస్సెల్స్ అధిక వడపోత రేటుకు ప్రసిద్ధి చెందాయి కాబట్టి, అవి సముద్రపు నీటిలో ఉన్న DNA ముక్కలను ఫిల్టర్ చేసి నిలుపుకోగలవా అని మేము మొదట పరిశోధించాము. ఈ ముక్కలు వాటి సెమీ-ఓపెన్ శోషరస వ్యవస్థలో పేరుకుపోతాయా లేదా అనే దానిపై కూడా మేము ఆసక్తి కలిగి ఉన్నాము. నీలి మస్సెల్ ట్యాంకులకు జోడించిన కరిగే DNA ముక్కల విధిని గుర్తించడం ద్వారా మేము ఈ సమస్యను ప్రయోగాత్మకంగా పరిష్కరించాము. DNA ముక్కలను ట్రాక్ చేయడానికి, మేము మానవ గెలాక్టిన్-7 జన్యువును కలిగి ఉన్న విదేశీ (స్వీయ కాదు) ప్లాస్మిడ్ DNAని ఉపయోగించాము. ddPCR సముద్రపు నీరు మరియు మస్సెల్స్లో ప్లాస్మిడ్ DNA ముక్కలను గుర్తించింది. మస్సెల్స్ లేనప్పుడు సముద్రపు నీటిలో DNA ముక్కల మొత్తం కాలక్రమేణా (7 రోజుల వరకు) సాపేక్షంగా స్థిరంగా ఉంటే, మస్సెల్స్ సమక్షంలో ఈ స్థాయి 8 గంటల్లో దాదాపు పూర్తిగా అదృశ్యమైందని మా ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి (Fig. 1a,b). ఇంట్రావాల్యులర్ ద్రవం మరియు హిమోలింఫ్లో 15 నిమిషాల్లో బాహ్య DNA ముక్కలను సులభంగా గుర్తించవచ్చు (Fig. 1c). బహిర్గతం అయిన 4 గంటల వరకు ఈ ముక్కలను గుర్తించవచ్చు. DNA భాగాలకు సంబంధించి ఈ వడపోత చర్య బ్యాక్టీరియా మరియు ఆల్గేల వడపోత చర్యతో పోల్చదగినది [31]. ఈ ఫలితాలు మస్సెల్స్ వాటి ద్రవ విభాగాలలో విదేశీ DNA ను ఫిల్టర్ చేయగలవని మరియు కూడబెట్టుకోగలవని సూచిస్తున్నాయి.
మస్సెల్స్ సమక్షంలో (A) లేదా లేకపోవడం (B) సమయంలో సముద్రపు నీటిలో ప్లాస్మిడ్ DNA యొక్క సాపేక్ష సాంద్రతలు, ddPCR ద్వారా కొలుస్తారు. A లో, ఫలితాలు శాతాలుగా వ్యక్తీకరించబడతాయి, పెట్టెల సరిహద్దులు 75వ మరియు 25వ శాతాలను సూచిస్తాయి. అమర్చిన లాగరిథమిక్ వక్రరేఖ ఎరుపు రంగులో చూపబడింది మరియు బూడిద రంగులో షేడ్ చేయబడిన ప్రాంతం 95% విశ్వాస విరామాన్ని సూచిస్తుంది. B లో, ఎరుపు రేఖ సగటును సూచిస్తుంది మరియు నీలి రేఖ ఏకాగ్రత కోసం 95% విశ్వాస విరామాన్ని సూచిస్తుంది. C ప్లాస్మిడ్ DNA జోడించిన తర్వాత వేర్వేరు సమయాల్లో మస్సెల్స్ యొక్క హెమోలింఫ్ మరియు వాల్యులర్ ద్రవంలో ప్లాస్మిడ్ DNA చేరడం. ఫలితాలు గుర్తించబడిన సంపూర్ణ కాపీలు/mL (±SE) గా ప్రదర్శించబడతాయి.
తరువాత, పరిమిత మానవజన్య ప్రభావం కలిగిన దీవుల సమూహం అయిన కెర్గులెన్ దీవులలోని మస్సెల్ బెడ్ల నుండి సేకరించిన మస్సెల్స్లో ccfDNA యొక్క మూలాన్ని మేము పరిశోధించాము. ఈ ప్రయోజనం కోసం, మస్సెల్ హెమోలింఫ్ల నుండి cccDNAను మానవ cccDNAను శుద్ధి చేయడానికి సాధారణంగా ఉపయోగించే పద్ధతుల ద్వారా వేరుచేసి శుద్ధి చేశారు [32, 33]. మస్సెల్స్లో సగటు హెమోలింఫ్ ccfDNA సాంద్రతలు ml హెమోలింఫ్ పరిధిలో తక్కువ మైక్రోగ్రాములు ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము (టేబుల్ S2, అనుబంధ సమాచారం చూడండి). ఈ సాంద్రతల శ్రేణి ఆరోగ్యకరమైన వ్యక్తుల కంటే చాలా పెద్దది (మిల్లీలీటర్కు తక్కువ నానోగ్రాములు), కానీ అరుదైన సందర్భాల్లో, క్యాన్సర్ రోగులలో, ccfDNA స్థాయి మిల్లీలీటర్కు అనేక మైక్రోగ్రాములకు చేరుకుంటుంది [34, 35]. హెమోలింఫ్ ccfDNA యొక్క పరిమాణ పంపిణీ యొక్క విశ్లేషణ ఈ శకలాలు 1000 bp నుండి 1000 bp వరకు 5000 bp వరకు పరిమాణంలో చాలా తేడా ఉంటుందని చూపించింది (చిత్రం 2). సిలికా-ఆధారిత QIAamp ఇన్వెస్టిగేటర్ కిట్ను ఉపయోగించి ఇలాంటి ఫలితాలు పొందబడ్డాయి, ఇది ccfDNA [36]తో సహా తక్కువ సాంద్రత కలిగిన DNA నమూనాల నుండి జన్యుసంబంధమైన DNAను వేగంగా వేరుచేసి శుద్ధి చేయడానికి ఫోరెన్సిక్ సైన్స్లో సాధారణంగా ఉపయోగించే పద్ధతి.
మస్సెల్ హెమోలింఫ్ యొక్క ప్రతినిధి ccfDNA ఎలక్ట్రోఫోరేగ్రామ్. న్యూక్లియోస్నాప్ ప్లాస్మా కిట్ (పైభాగం) మరియు QIAamp DNA ఇన్వెస్టిగేటర్ కిట్తో సంగ్రహించబడింది. B మస్సెల్స్లో హెమోలింఫ్ ccfDNA సాంద్రతలు (±SE) పంపిణీని చూపించే వయోలిన్ ప్లాట్. నలుపు మరియు ఎరుపు రేఖలు వరుసగా మధ్యస్థం మరియు మొదటి మరియు మూడవ క్వార్టైల్లను సూచిస్తాయి.
మానవులు మరియు ప్రైమేట్లలో దాదాపు 1% ccfDNA విదేశీ మూలాన్ని కలిగి ఉంది [21, 37]. బైవాల్వ్ల సెమీ-ఓపెన్ సర్క్యులేటరీ సిస్టమ్, సూక్ష్మజీవులు అధికంగా ఉండే సముద్రపు నీరు మరియు మస్సెల్ ccfDNA యొక్క పరిమాణ పంపిణీని బట్టి, మస్సెల్ హెమోలింప్ ccfDNAలో సూక్ష్మజీవుల DNA యొక్క గొప్ప మరియు వైవిధ్యమైన సమూహం ఉండవచ్చని మేము ఊహించాము. ఈ పరికల్పనను పరీక్షించడానికి, మేము కెర్గులెన్ దీవుల నుండి సేకరించిన ఔలాకోమియా అట్రా నమూనాల నుండి హెమోలింప్ ccfDNAను క్రమం చేసాము, ఇది 10 మిలియన్లకు పైగా రీడ్లను ఇచ్చింది, వీటిలో 97.6% నాణ్యత నియంత్రణలో ఉత్తీర్ణత సాధించింది. అప్పుడు రీడింగ్లను BLASTN మరియు NCBI బైవాల్వ్ డేటాబేస్లను ఉపయోగించి స్వీయ మరియు స్వీయేతర మూలాల ప్రకారం వర్గీకరించారు (Fig. S1, అనుబంధ సమాచారం).
మానవులలో, న్యూక్లియర్ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ DNA రెండింటినీ రక్తప్రవాహంలోకి విడుదల చేయవచ్చు [38]. అయితే, ప్రస్తుత అధ్యయనంలో, A. atra జన్యువు క్రమం చేయబడలేదు లేదా వివరించబడలేదు కాబట్టి, మస్సెల్స్ యొక్క న్యూక్లియర్ జెనోమిక్ DNA గురించి వివరంగా వివరించడం సాధ్యం కాలేదు. అయితే, బైవాల్వ్ లైబ్రరీని ఉపయోగించి మన స్వంత మూలానికి చెందిన అనేక ccfDNA భాగాలను మేము గుర్తించగలిగాము (Fig. S2, అనుబంధ సమాచారం). సీక్వెన్స్ చేయబడిన ఆ A. atra జన్యువుల డైరెక్ట్ PCR యాంప్లిఫికేషన్ ద్వారా మన స్వంత మూలానికి చెందిన DNA భాగాల ఉనికిని కూడా మేము నిర్ధారించాము (Fig. 3). అదేవిధంగా, A. atra యొక్క మైటోకాన్డ్రియల్ జన్యువు పబ్లిక్ డేటాబేస్లలో అందుబాటులో ఉన్నందున, A. atra యొక్క హెమోలింఫ్లో మైటోకాన్డ్రియల్ ccfDNA భాగాల ఉనికికి ఆధారాలను కనుగొనవచ్చు. మైటోకాన్డ్రియల్ DNA భాగాల ఉనికిని PCR యాంప్లిఫికేషన్ ద్వారా నిర్ధారించారు (Fig. 3).
PCR ద్వారా విస్తరించబడిన A. atra (ఎరుపు చుక్కలు - స్టాక్ నంబర్: SRX5705969) మరియు M. ప్లాటెన్సిస్ (నీలం చుక్కలు - స్టాక్ నంబర్: SRX5705968) యొక్క హెమోలింఫ్లో వివిధ మైటోకాన్డ్రియల్ జన్యువులు ఉన్నాయి. బ్రెటన్ మరియు ఇతరుల నుండి స్వీకరించబడిన చిత్రం, 2011 B A. atra నుండి హెమోలింఫ్ సూపర్నాటెంట్ యొక్క విస్తరణ FTA కాగితంపై నిల్వ చేయబడింది. PCR మిశ్రమాన్ని కలిగి ఉన్న PCR ట్యూబ్కు నేరుగా జోడించడానికి 3 mm పంచ్ను ఉపయోగించండి.
సముద్రపు నీటిలో సమృద్ధిగా ఉండే సూక్ష్మజీవుల కంటెంట్ను దృష్టిలో ఉంచుకుని, మేము మొదట్లో హెమోలింఫ్లోని సూక్ష్మజీవుల DNA శ్రేణుల వర్గీకరణపై దృష్టి పెట్టాము. దీన్ని చేయడానికి, మేము రెండు వేర్వేరు వ్యూహాలను ఉపయోగిస్తాము. మొదటి వ్యూహం క్రాకెన్2ను ఉపయోగించింది, ఇది అల్గోరిథం-ఆధారిత శ్రేణి వర్గీకరణ కార్యక్రమం, ఇది BLAST మరియు ఇతర సాధనాలతో పోల్చదగిన ఖచ్చితత్వంతో సూక్ష్మజీవుల శ్రేణులను గుర్తించగలదు [28]. 6719 కంటే ఎక్కువ రీడ్లు బ్యాక్టీరియా మూలానికి చెందినవిగా నిర్ధారించబడ్డాయి, అయితే 124 మరియు 64 వరుసగా ఆర్కియా మరియు వైరస్ల నుండి వచ్చాయి (Fig. 4). అత్యంత సమృద్ధిగా ఉన్న బ్యాక్టీరియా DNA శకలాలు ఫర్మిక్యూట్స్ (46%), ప్రోటీబాక్టీరియా (27%) మరియు బాక్టీరాయిడెట్స్ (17%) (Fig. 4a). ఈ పంపిణీ మెరైన్ బ్లూ మస్సెల్ మైక్రోబయోమ్ [39, 40] యొక్క మునుపటి అధ్యయనాలకు అనుగుణంగా ఉంది. గామాప్రోటీబాక్టీరియా ప్రోటీబాక్టీరియా (44%) యొక్క ప్రధాన తరగతి, ఇందులో అనేక వైబ్రియోనేల్స్ (Fig. 4b) ఉన్నాయి. ddPCR పద్ధతి A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41] యొక్క ccfDNAలో విబ్రియో DNA శకలాలు ఉన్నట్లు నిర్ధారించింది. ccfDNA యొక్క బాక్టీరియల్ మూలం గురించి మరింత సమాచారం పొందడానికి, అదనపు విధానాన్ని తీసుకున్నారు (Fig. S2, అనుబంధ సమాచారం). ఈ సందర్భంలో, అతివ్యాప్తి చెందిన రీడ్లు జత-ముగింపు రీడ్లుగా అసెంబుల్ చేయబడ్డాయి మరియు BLASTN మరియు 1e−3 యొక్క e విలువ మరియు >90% హోమోలజీతో కటాఫ్ ఉపయోగించి స్వీయ (బివాల్వ్లు) లేదా నాన్-సెల్ఫ్ మూలం అని వర్గీకరించబడ్డాయి. ఈ సందర్భంలో, అతివ్యాప్తి చెందిన రీడ్లు జత-ముగింపు రీడ్లుగా అసెంబుల్ చేయబడ్డాయి మరియు BLASTN మరియు 1e−3 యొక్క e విలువ మరియు >90% హోమోలజీతో కటాఫ్ ఉపయోగించి స్వీయ (బివాల్వ్లు) లేదా నాన్-సెల్ఫ్ మూలం అని వర్గీకరించబడ్డాయి. నేను ఏటమ్ స్లుచై పెరెక్రివ్యూషియస్ బైలీ సోబ్రాని కాక్ ఛేనియ స్ పార్నిమి కోన్సామి మరియు బైలీ క్లాస్సి సోబ్స్ట్వెన్నియే (దృవీకరణ మొలిస్కి) లేదా చుజీ పో ప్రోయిస్హోడ్నియు యొక్క ఇస్పోల్జోవానియమ్ బ్లాస్ట్న్ మరియు స్నోచన్-3 с గోమోలాగ్ 90%. ఈ సందర్భంలో, అతివ్యాప్తి చెందుతున్న రీడ్లు జత-ముగింపు రీడ్లుగా సేకరించబడ్డాయి మరియు BLASTN మరియు e విలువ 1e-3 మరియు >90% హోమోలజీతో కటాఫ్ ఉపయోగించి స్థానిక (బివాల్వ్) లేదా అసలైనవి కానివిగా వర్గీకరించబడ్డాయి.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e> 90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。మీరు和> 90% 同源性 的 分类 自身 В В В В В том случае перекрывующеся чтения були собраны как чтения с parnыmy konshami and класифицы సోబ్స్ట్వెన్నియే (ప్రత్యేకమైన మార్పు) порога гомологии> 90%. ఈ సందర్భంలో, అతివ్యాప్తి చెందుతున్న రీడ్లు జత-ముగింపు రీడ్లుగా సేకరించబడ్డాయి మరియు e BLASTN మరియు 1e-3 విలువలు మరియు హోమోలజీ థ్రెషోల్డ్ >90% ఉపయోగించి స్వంత (బివాల్వ్లు) లేదా అసలైనవి కానివిగా వర్గీకరించబడ్డాయి.A. atra జన్యువు ఇంకా క్రమం చేయబడనందున, మేము MEGAHIT నెక్స్ట్ జనరేషన్ సీక్వెన్సింగ్ (NGS) అసెంబ్లర్ యొక్క డి నోవో అసెంబ్లీ వ్యూహాన్ని ఉపయోగించాము. మొత్తం 147,188 కాంటిగ్లు మూలం యొక్క ఆధారిత (బివాల్వ్లు)గా గుర్తించబడ్డాయి. ఈ కాంటిగ్లను BLASTN మరియు BLASTX ఉపయోగించి 1e-10 యొక్క e-విలువలతో పేల్చారు. ఈ వ్యూహం A. atra ccfDNAలో ఉన్న 482 నాన్-బివాల్వ్ శకలాలను గుర్తించడానికి మాకు వీలు కల్పించింది. ఈ DNA శకలాల్లో సగానికి పైగా (57%) బ్యాక్టీరియా నుండి పొందబడ్డాయి, ప్రధానంగా సల్ఫోట్రోఫిక్ సింబియంట్లతో సహా గిల్ సింబియంట్ల నుండి మరియు గిల్ సింబియంట్ల నుండి సోలెమ్యా వెలమ్ (Fig. 5).
రకం స్థాయిలో సాపేక్ష సమృద్ధి. B రెండు ప్రధాన ఫైలా (ఫర్మిక్యూట్స్ మరియు ప్రోటీబాక్టీరియా) యొక్క సూక్ష్మజీవుల వైవిధ్యం. ddPCR యొక్క ప్రతినిధి విస్తరణ C విబ్రియో spp. A. మూడు అట్రా హెమోలింఫ్లలో 16S rRNA జన్యువు (నీలం) యొక్క శకలాలు.
మొత్తం 482 సేకరించిన కాంటిగ్లను విశ్లేషించారు. మెటాజెనోమిక్ కాంటిగ్ ఉల్లేఖనాల (ప్రోకార్యోట్లు మరియు యూకారియోట్లు) వర్గీకరణ పంపిణీ యొక్క సాధారణ ప్రొఫైల్. BLASTN మరియు BLASTX ద్వారా గుర్తించబడిన బ్యాక్టీరియా DNA భాగాల వివరణాత్మక పంపిణీ.
క్రాకెన్2 విశ్లేషణలో ముస్సెల్ ccfDNAలో యూరియార్కియోటా (65%), క్రెనార్కియోటా (24%) మరియు థౌర్మార్కియోటా (11%) (Fig. 6a) యొక్క DNA శకలాలు సహా ఆర్కియల్ DNA శకలాలు ఉన్నాయని కూడా చూపించింది. కాలిఫోర్నియా మస్సెల్స్ యొక్క సూక్ష్మజీవుల సమాజంలో గతంలో కనుగొనబడిన యూరియార్కియోటా మరియు క్రెనార్కియోటా నుండి తీసుకోబడిన DNA శకలాలు ఉండటం ఆశ్చర్యం కలిగించకూడదు [42]. యూరియార్కియోటా తరచుగా తీవ్రమైన పరిస్థితులతో సంబంధం కలిగి ఉన్నప్పటికీ, సముద్ర క్రయోజెనిక్ వాతావరణంలో యూరియార్కియోటా మరియు క్రెనార్కియోటా రెండూ అత్యంత సాధారణ ప్రోకార్యోట్లలో ఉన్నాయని ఇప్పుడు గుర్తించబడింది [43, 44]. కెర్గులెన్ పీఠభూమి [45] పై దిగువ లీక్ల నుండి విస్తృతమైన మీథేన్ లీక్లు మరియు కెర్గులెన్ దీవుల తీరంలో గమనించిన సూక్ష్మజీవుల మీథేన్ ఉత్పత్తి గురించి ఇటీవలి నివేదికల ప్రకారం, మస్సెల్స్లో మెథనోజెనిక్ సూక్ష్మజీవుల ఉనికి ఆశ్చర్యం కలిగించదు [46].
తర్వాత మా దృష్టి DNA వైరస్ల నుండి రీడింగ్లపై మళ్లింది. మాకు తెలిసినంతవరకు, ఇది మస్సెల్స్ యొక్క వైరస్ కంటెంట్ యొక్క మొదటి ఆఫ్-టార్గెట్ అధ్యయనం. ఊహించినట్లుగా, మేము బాక్టీరియోఫేజ్ల DNA శకలాలు (కాడోవైరల్స్) (Fig. 6b) కనుగొన్నాము. అయితే, అత్యంత సాధారణ వైరల్ DNA న్యూక్లియోసైటోవైరస్ల ఫైలం నుండి వస్తుంది, దీనిని న్యూక్లియర్ సైటోప్లాస్మిక్ లార్జ్ DNA వైరస్ (NCLDV) అని కూడా పిలుస్తారు, ఇది ఏ వైరస్లోనైనా అతిపెద్ద జన్యువును కలిగి ఉంటుంది. ఈ ఫైలమ్లో, చాలా DNA సీక్వెన్స్లు మిమిమిడోవిరిడే (58%) మరియు పోక్స్విరిడే (21%) కుటుంబాలకు చెందినవి, వీటి సహజ హోస్ట్లలో సకశేరుకాలు మరియు ఆర్థ్రోపోడ్లు ఉన్నాయి, అయితే ఈ DNA సీక్వెన్స్లలో కొద్ది భాగం తెలిసిన వైరోలాజికల్ ఆల్గేకు చెందినవి. సముద్ర యూకారియోటిక్ ఆల్గేను సోకుతుంది. ఈ సీక్వెన్స్లను పండోర వైరస్ నుండి కూడా పొందారు, ఇది తెలిసిన ఏదైనా వైరల్ జాతిలో అతిపెద్ద జన్యు పరిమాణం కలిగిన జెయింట్ వైరస్. ఆసక్తికరంగా, హెమోలింప్ ccfDNA సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా నిర్ణయించబడిన వైరస్ సోకినట్లు తెలిసిన హోస్ట్ల పరిధి సాపేక్షంగా పెద్దది (Figure S3, అనుబంధ సమాచారం). ఇందులో బాకులోవిరిడే మరియు ఇరిడోవిరిడే వంటి కీటకాలను ప్రభావితం చేసే వైరస్లు, అలాగే అమీబా, ఆల్గే మరియు సకశేరుకాలను ప్రభావితం చేసే వైరస్లు ఉన్నాయి. పిథోవైరస్ సైబెరికమ్ జన్యువుకు సరిపోయే సీక్వెన్స్లను కూడా మేము కనుగొన్నాము. పిటోవైరస్లను ("జోంబీ వైరస్లు" అని కూడా పిలుస్తారు) మొదట సైబీరియాలోని 30,000 సంవత్సరాల పురాతన శాశ్వత మంచు నుండి వేరుచేయబడ్డాయి [47]. అందువల్ల, ఈ వైరస్ల యొక్క అన్ని ఆధునిక జాతులు అంతరించిపోలేదని [48] మరియు ఈ వైరస్లు రిమోట్ సబార్కిటిక్ సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో ఉండవచ్చని చూపించే మునుపటి నివేదికలతో మా ఫలితాలు స్థిరంగా ఉన్నాయి.
చివరగా, ఇతర బహుళ సెల్యులార్ జంతువుల నుండి DNA శకలాలు కనుగొనగలమా అని మేము పరీక్షించాము. nt, nr మరియు RefSeq లైబ్రరీలతో (జన్యు మరియు ప్రోటీన్) BLASTN మరియు BLASTX ద్వారా మొత్తం 482 విదేశీ కాంటిగ్లు గుర్తించబడ్డాయి. బహుళ సెల్యులార్ జంతువుల ccfDNA యొక్క విదేశీ శకలాలలో అస్థి ఎముకల DNA ప్రధానంగా ఉంటుందని మా ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి (చిత్రం 5). కీటకాలు మరియు ఇతర జాతుల నుండి DNA శకలాలు కూడా కనుగొనబడ్డాయి. DNA శకలాలలో చాలా పెద్ద భాగాన్ని గుర్తించలేదు, బహుశా భూసంబంధమైన జాతులతో పోలిస్తే జన్యుసంబంధమైన డేటాబేస్లలో పెద్ద సంఖ్యలో సముద్ర జాతుల ప్రాతినిధ్యం తక్కువగా ఉండటం వల్ల కావచ్చు [49].
ప్రస్తుత పత్రంలో, మేము LB భావనను మస్సెల్స్కు వర్తింపజేస్తాము, హెమోలింఫ్ ccfDNA షాట్ సీక్వెన్సింగ్ సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థల కూర్పుపై అంతర్దృష్టిని అందించగలదని వాదిస్తున్నాము. ముఖ్యంగా, 1) మస్సెల్ హెమోలింఫ్ సాపేక్షంగా పెద్ద (~1-5 kb) ప్రసరణ DNA భాగాల సాపేక్షంగా అధిక సాంద్రతలు (మైక్రోగ్రామ్ స్థాయిలు) కలిగి ఉందని మేము కనుగొన్నాము; 2) ఈ DNA భాగాలు స్వతంత్రమైనవి మరియు స్వతంత్రం కానివి 3) ఈ DNA భాగాల విదేశీ వనరులలో, మేము బ్యాక్టీరియా, ఆర్కియల్ మరియు వైరల్ DNA, అలాగే ఇతర బహుళ సెల్యులార్ జంతువుల DNA లను కనుగొన్నాము; 4) హెమోలింఫ్లో ఈ విదేశీ ccfDNA భాగాల చేరడం వేగంగా జరుగుతుంది మరియు మస్సెల్స్ యొక్క అంతర్గత వడపోత కార్యకలాపాలకు దోహదం చేస్తుంది. ముగింపులో, ఇప్పటివరకు ప్రధానంగా బయోమెడిసిన్ రంగంలో వర్తింపజేయబడిన LB భావన, సెంటినెల్ జాతులు మరియు వాటి పర్యావరణం మధ్య పరస్పర చర్యను బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి ఉపయోగించగల గొప్ప కానీ అన్వేషించబడని జ్ఞాన మూలాన్ని ఎన్కోడ్ చేస్తుందని మా అధ్యయనం నిరూపిస్తుంది.
ప్రైమేట్లతో పాటు, ఎలుకలు, కుక్కలు, పిల్లులు మరియు గుర్రాలు [50, 51, 52] వంటి క్షీరదాలలో ccfDNA ఐసోలేషన్ నివేదించబడింది. అయితే, మాకు తెలిసినంతవరకు, ఓపెన్ సర్క్యులేషన్ సిస్టమ్ ఉన్న సముద్ర జాతులలో ccfDNA యొక్క గుర్తింపు మరియు క్రమం గురించి నివేదించిన మొదటి అధ్యయనం మాది. మస్సెల్స్ యొక్క ఈ శరీర నిర్మాణ లక్షణం మరియు వడపోత సామర్థ్యం, కనీసం పాక్షికంగా, ఇతర జాతులతో పోలిస్తే ప్రసరణ DNA శకలాలు యొక్క విభిన్న పరిమాణ లక్షణాలను వివరించవచ్చు. మానవులలో, రక్తంలో ప్రసరించే చాలా DNA శకలాలు 150 నుండి 200 bp వరకు పరిమాణంలో ఉన్న చిన్న శకలాలు. గరిష్టంగా 167 bp [34, 53] గరిష్టంగా ఉంటాయి. DNA శకలాలలో ఒక చిన్న కానీ ముఖ్యమైన భాగం 300 మరియు 500 bp మధ్య పరిమాణంలో ఉంటుంది మరియు దాదాపు 5% 900 bp కంటే పొడవుగా ఉంటాయి. [54]. ఈ పరిమాణ పంపిణీకి కారణం ప్లాస్మాలో ccfDNA యొక్క ప్రధాన మూలం కణాల మరణం ఫలితంగా సంభవిస్తుంది, ఇది కణాల మరణం కారణంగా లేదా ఆరోగ్యకరమైన వ్యక్తులలో ప్రసరణ హెమటోపోయిటిక్ కణాల నెక్రోసిస్ కారణంగా లేదా క్యాన్సర్ రోగులలో కణితి కణాల అపోప్టోసిస్ కారణంగా (సర్క్యులేటింగ్ ట్యూమర్ DNA అని పిలుస్తారు). , ctDNA). మస్సెల్స్లో మేము కనుగొన్న హెమోలింఫ్ ccfDNA యొక్క పరిమాణ పంపిణీ 1000 నుండి 5000 bp వరకు ఉంది, ఇది మస్సెల్ ccfDNA కి వేరే మూలం ఉందని సూచిస్తుంది. ఇది ఒక తార్కిక పరికల్పన, ఎందుకంటే మస్సెల్స్ సెమీ-ఓపెన్ వాస్కులర్ వ్యవస్థను కలిగి ఉంటాయి మరియు అధిక సాంద్రత కలిగిన సూక్ష్మజీవుల జన్యు DNA కలిగిన సముద్ర జల వాతావరణంలో నివసిస్తాయి. వాస్తవానికి, బాహ్య DNAని ఉపయోగించి మా ప్రయోగశాల ప్రయోగాలు మస్సెల్స్ సముద్రపు నీటిలో DNA శకలాలు పేరుకుపోతాయని చూపించాయి, కనీసం కొన్ని గంటల తర్వాత అవి సెల్యులార్ తీసుకోవడం మరియు/లేదా విడుదల చేయబడిన మరియు/లేదా వివిధ సంస్థలలో నిల్వ చేసిన తర్వాత అవి క్షీణించబడతాయి. కణాల అరుదైన (ప్రోకార్యోటిక్ మరియు యూకారియోటిక్ రెండూ) దృష్ట్యా, ఇంట్రావాల్యులర్ కంపార్ట్మెంట్ల వాడకం స్వీయ-మూలాల నుండి మరియు విదేశీ వనరుల నుండి ccfDNA మొత్తాన్ని తగ్గిస్తుంది. బివాల్వ్ ఇన్నేటివ్ రోగనిరోధక శక్తి యొక్క ప్రాముఖ్యత మరియు పెద్ద సంఖ్యలో ప్రసరణ ఫాగోసైట్లు పరిగణనలోకి తీసుకుంటే, సూక్ష్మజీవులు మరియు/లేదా సెల్యులార్ శిధిలాలను తీసుకోవడం ద్వారా విదేశీ DNA పేరుకుపోయే ప్రసరణ ఫాగోసైట్లలో విదేశీ ccfDNA కూడా సమృద్ధిగా ఉంటుందని మేము మరింత పరికల్పన చేసాము. కలిసి చూస్తే, బివాల్వ్ హెమోలింఫ్ ccfDNA అనేది పరమాణు సమాచారం యొక్క ప్రత్యేకమైన రిపోజిటరీ అని మరియు సెంటినెల్ జాతిగా వాటి స్థితిని బలోపేతం చేస్తుందని మా ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి.
మా డేటా ప్రకారం, బ్యాక్టీరియా నుండి ఉత్పన్నమైన హెమోలింఫ్ ccfDNA శకలాల క్రమం మరియు విశ్లేషణ హోస్ట్ బాక్టీరియల్ వృక్షజాలం మరియు చుట్టుపక్కల సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలో ఉన్న బ్యాక్టీరియా గురించి కీలక సమాచారాన్ని అందించగలవు. షాట్ సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతులు సాంప్రదాయ 16S rRNA గుర్తింపు పద్ధతులను ఉపయోగించినట్లయితే తప్పిపోయే ప్రారంభ బ్యాక్టీరియా A. అట్రా గిల్ యొక్క క్రమాలను వెల్లడించాయి, దీనికి కారణం రిఫరెన్స్ లైబ్రరీ బయాస్. వాస్తవానికి, కెర్గులెన్ వద్ద అదే మస్సెల్ పొరలో M. ప్లాటెన్సిస్ నుండి సేకరించిన LB డేటాను మేము ఉపయోగించడం వలన గిల్-అనుబంధ బాక్టీరియల్ సింబియంట్ల కూర్పు రెండు మస్సెల్ జాతులకు ఒకేలా ఉందని తేలింది (Fig. S4, అనుబంధ సమాచారం). రెండు జన్యుపరంగా భిన్నమైన మస్సెల్ల యొక్క ఈ సారూప్యత కెర్గులెన్ యొక్క చల్లని, సల్ఫరస్ మరియు అగ్నిపర్వత నిక్షేపాలలో బ్యాక్టీరియా సంఘాల కూర్పును ప్రతిబింబిస్తుంది [55, 56, 57, 58]. పోర్ట్-ఆ-ఫ్రాన్స్ తీరం వంటి బయోటర్బేటెడ్ తీర ప్రాంతాల నుండి మస్సెల్స్ను పండించేటప్పుడు సల్ఫర్-తగ్గించే సూక్ష్మజీవుల స్థాయిలు బాగా వివరించబడ్డాయి [59]. మరొక అవకాశం ఏమిటంటే, ప్రారంభ ముస్సెల్ వృక్షజాలం క్షితిజ సమాంతర ప్రసారం ద్వారా ప్రభావితమవుతుంది [60, 61]. సముద్ర పర్యావరణం, సముద్రపు అడుగుభాగం మరియు ముస్సెల్స్లో సహజీవన బ్యాక్టీరియా కూర్పు మధ్య సహసంబంధాన్ని నిర్ణయించడానికి మరిన్ని పరిశోధనలు అవసరం. ఈ అధ్యయనాలు ప్రస్తుతం కొనసాగుతున్నాయి.
హెమోలింఫ్ ccfDNA యొక్క పొడవు మరియు సాంద్రత, దాని శుద్దీకరణ సౌలభ్యం మరియు వేగవంతమైన షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ను అనుమతించే అధిక నాణ్యత సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో జీవవైవిధ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి మస్సెల్ ccfDNAని ఉపయోగించడం వల్ల కలిగే అనేక ప్రయోజనాల్లో కొన్ని. ఇచ్చిన పర్యావరణ వ్యవస్థలో వైరల్ కమ్యూనిటీలను (వైరోమ్లు) వర్గీకరించడానికి ఈ విధానం ప్రత్యేకంగా ప్రభావవంతంగా ఉంటుంది [62, 63]. బ్యాక్టీరియా, ఆర్కియా మరియు యూకారియోట్ల మాదిరిగా కాకుండా, వైరల్ జన్యువులు 16S సీక్వెన్స్ల వంటి ఫైలోజెనెటిక్గా సంరక్షించబడిన జన్యువులను కలిగి ఉండవు. మస్సెల్స్ వంటి సూచిక జాతుల నుండి ద్రవ బయాప్సీలను సాధారణంగా తీరప్రాంత సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో నివసించే హోస్ట్లను సోకడానికి తెలిసిన సాపేక్షంగా పెద్ద సంఖ్యలో ccfDNA వైరస్ శకలాలను గుర్తించడానికి ఉపయోగించవచ్చని మా ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి. ఇందులో ప్రోటోజోవా, ఆర్థ్రోపోడ్లు, కీటకాలు, మొక్కలు మరియు బాక్టీరియల్ వైరస్లను (ఉదా., బాక్టీరియోఫేజ్లు) సోకడానికి తెలిసిన వైరస్లు ఉన్నాయి. కెర్గులెన్ వద్ద అదే మస్సెల్ పొరలో సేకరించిన బ్లూ మస్సెల్స్ (M. ప్లాటెన్సిస్) యొక్క హెమోలింఫ్ ccfDNA వైరోమ్ను మేము పరిశీలించినప్పుడు ఇలాంటి పంపిణీ కనుగొనబడింది (టేబుల్ S2, అనుబంధ సమాచారం). ccfDNA యొక్క షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ అనేది మానవులు లేదా ఇతర జాతుల వైరోమ్ అధ్యయనంలో ఊపందుకుంటున్న కొత్త విధానం [21, 37, 64]. ఈ విధానం డబుల్-స్ట్రాండ్డ్ DNA వైరస్లను అధ్యయనం చేయడానికి ప్రత్యేకంగా ఉపయోగపడుతుంది, ఎందుకంటే బాల్టిమోర్లోని అత్యంత వైవిధ్యమైన మరియు విస్తృత తరగతి వైరస్లను సూచించే అన్ని డబుల్-స్ట్రాండ్డ్ DNA వైరస్లలో ఏ ఒక్క జన్యువు కూడా సంరక్షించబడదు [65]. ఈ వైరస్లలో ఎక్కువ భాగం వర్గీకరించబడలేదు మరియు వైరల్ ప్రపంచంలోని పూర్తిగా తెలియని భాగం నుండి వైరస్లను కలిగి ఉండవచ్చు [66], మస్సెల్స్ A. atra మరియు M. ప్లాటెన్సిస్ యొక్క వైరోమ్లు మరియు హోస్ట్ పరిధులు రెండు జాతుల మధ్య వస్తాయని మేము కనుగొన్నాము. అదేవిధంగా (ఫిగర్ S3, అదనపు సమాచారం చూడండి). ఈ సారూప్యత ఆశ్చర్యం కలిగించదు, ఎందుకంటే ఇది వాతావరణంలో ఉన్న DNA తీసుకోవడంలో ఎంపిక లేకపోవడాన్ని ప్రతిబింబిస్తుంది. RNA వైరోమ్ను వర్గీకరించడానికి శుద్ధి చేయబడిన RNAను ఉపయోగించి భవిష్యత్ అధ్యయనాలు ప్రస్తుతం అవసరం.
మా అధ్యయనంలో, కోవర్స్కీ మరియు సహచరులు [37] చేసిన పని నుండి స్వీకరించబడిన చాలా కఠినమైన పైప్లైన్ను మేము ఉపయోగించాము, వారు స్థానిక ccfDNA అసెంబ్లీకి ముందు మరియు తరువాత పూల్డ్ రీడ్లు మరియు కాంటిగ్లను రెండు-దశల తొలగింపును ఉపయోగించారు, దీని ఫలితంగా మ్యాప్ చేయని రీడ్లు అధిక నిష్పత్తిలో ఉన్నాయి. అందువల్ల, ఈ మ్యాప్ చేయని రీడ్లలో కొన్ని ఇప్పటికీ వాటి స్వంత మూలాన్ని కలిగి ఉండవచ్చని మేము తోసిపుచ్చలేము, ప్రధానంగా ఈ మస్సెల్ జాతికి మా వద్ద రిఫరెన్స్ జీనోమ్ లేదు. స్వీయ మరియు నాన్-సెల్ఫ్ రీడ్ల మధ్య చిమెరాస్ మరియు ఇల్యూమినా మిసెక్ PE75 ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన రీడ్ లెంగ్త్ల గురించి మేము ఆందోళన చెందాము కాబట్టి మేము ఈ పైప్లైన్ను కూడా ఉపయోగించాము. నిర్దేశించని రీడింగ్లలో ఎక్కువ భాగం సముద్ర సూక్ష్మజీవులు, ముఖ్యంగా కెర్గులెన్ వంటి మారుమూల ప్రాంతాలలో, వ్యాఖ్యానించబడలేదు. ccfDNA ఫ్రాగ్మెంట్ పొడవులు మానవ ccfDNA మాదిరిగానే ఉంటాయని భావించి, మేము ఇల్యూమినా మిసెక్ PE75ని ఉపయోగించాము. భవిష్యత్ అధ్యయనాల కోసం, హెమోలింప్ ccfDNA మానవులు మరియు/లేదా క్షీరదాల కంటే ఎక్కువ రీడ్లను కలిగి ఉందని మా ఫలితాలు చూపిస్తున్నందున, పొడవైన ccfDNA ఫ్రాగ్లకు మరింత అనుకూలమైన సీక్వెన్సింగ్ ప్లాట్ఫారమ్ను ఉపయోగించమని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈ అభ్యాసం లోతైన విశ్లేషణ కోసం మరిన్ని సూచనలను గుర్తించడం చాలా సులభతరం చేస్తుంది. ప్రస్తుతం అందుబాటులో లేని పూర్తి A. అట్రా న్యూక్లియర్ జీనోమ్ సీక్వెన్స్ను పొందడం వల్ల స్వీయ మరియు స్వీయేతర వనరుల నుండి ccfDNA యొక్క వివక్షతను కూడా బాగా సులభతరం చేస్తుంది. మా పరిశోధన మస్సెల్స్పై ద్రవ బయాప్సీ భావనను వర్తించే అవకాశంపై దృష్టి సారించినందున, ఈ భావనను భవిష్యత్ పరిశోధనలో ఉపయోగిస్తున్నందున, మస్సెల్స్ యొక్క సూక్ష్మజీవుల వైవిధ్యాన్ని అధ్యయనం చేయడానికి ఈ పద్ధతి యొక్క సామర్థ్యాన్ని పెంచడానికి కొత్త సాధనాలు మరియు పైప్లైన్లు అభివృద్ధి చేయబడతాయని మేము ఆశిస్తున్నాము. సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థ.
నాన్-ఇన్వాసివ్ క్లినికల్ బయోమార్కర్గా, ccfDNA యొక్క పెరిగిన మానవ ప్లాస్మా స్థాయిలు వివిధ వ్యాధులు, కణజాల నష్టం మరియు ఒత్తిడి పరిస్థితులతో సంబంధం కలిగి ఉంటాయి [67,68,69]. ఈ పెరుగుదల కణజాల నష్టం తర్వాత దాని స్వంత మూలం యొక్క DNA శకలాలు విడుదలతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది. తీవ్రమైన ఉష్ణ ఒత్తిడిని ఉపయోగించి మేము ఈ సమస్యను పరిష్కరించాము, దీనిలో మస్సెల్స్ 30 °C ఉష్ణోగ్రతకు క్లుప్తంగా బహిర్గతమయ్యాయి. మేము మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో మూడు వేర్వేరు రకాల మస్సెల్స్పై ఈ విశ్లేషణను చేసాము. అయితే, తీవ్రమైన ఉష్ణ ఒత్తిడి తర్వాత ccfDNA స్థాయిలలో ఎటువంటి మార్పును మేము కనుగొనలేదు (చిత్రం S5, అదనపు సమాచారం చూడండి). ఈ ఆవిష్కరణ కనీసం పాక్షికంగా, మస్సెల్స్ సెమీ-ఓపెన్ సర్క్యులేటరీ వ్యవస్థను కలిగి ఉన్నాయని మరియు వాటి అధిక వడపోత చర్య కారణంగా పెద్ద మొత్తంలో విదేశీ DNAని కూడబెట్టుకుంటాయని వివరించవచ్చు. మరోవైపు, అనేక అకశేరుకాల మాదిరిగానే మస్సెల్స్ కూడా ఒత్తిడి-ప్రేరిత కణజాల నష్టానికి మరింత నిరోధకతను కలిగి ఉండవచ్చు, తద్వారా వాటి హెమోలింఫ్లో ccfDNA విడుదలను పరిమితం చేస్తుంది [70, 71].
ఈ రోజు వరకు, జల పర్యావరణ వ్యవస్థలలో జీవవైవిధ్యం యొక్క DNA విశ్లేషణ ప్రధానంగా పర్యావరణ DNA (eDNA) మెటాబార్కోడింగ్పై దృష్టి పెట్టింది. అయితే, ప్రైమర్లను ఉపయోగించినప్పుడు జీవవైవిధ్య విశ్లేషణలో ఈ పద్ధతి సాధారణంగా పరిమితం. షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ వాడకం PCR యొక్క పరిమితులను మరియు ప్రైమర్ సెట్ల పక్షపాత ఎంపికను అధిగమిస్తుంది. అందువల్ల, ఒక కోణంలో, మా పద్ధతి ఇటీవల ఉపయోగించిన హై-త్రూపుట్ eDNA షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతికి దగ్గరగా ఉంటుంది, ఇది విచ్ఛిన్నమైన DNAని నేరుగా క్రమం చేయగలదు మరియు దాదాపు అన్ని జీవులను విశ్లేషించగలదు [72, 73]. అయితే, LBని ప్రామాణిక eDNA పద్ధతుల నుండి వేరు చేసే అనేక ప్రాథమిక సమస్యలు ఉన్నాయి. వాస్తవానికి, eDNA మరియు LB మధ్య ప్రధాన వ్యత్యాసం సహజ ఫిల్టర్ హోస్ట్ల ఉపయోగం. eDNA అధ్యయనం కోసం సహజ ఫిల్టర్గా స్పాంజ్లు మరియు బివాల్వ్లు (డ్రెస్సీనా spp.) వంటి సముద్ర జాతుల ఉపయోగం నివేదించబడింది [74, 75]. అయితే, డ్రీస్సేనా అధ్యయనం DNA సంగ్రహించిన కణజాల బయాప్సీలను ఉపయోగించింది. LB నుండి ccfDNA విశ్లేషణకు కణజాల బయాప్సీ, ప్రత్యేకమైన మరియు కొన్నిసార్లు ఖరీదైన పరికరాలు మరియు eDNA లేదా కణజాల బయాప్సీతో సంబంధం ఉన్న లాజిస్టిక్స్ అవసరం లేదు. వాస్తవానికి, LB నుండి ccfDNA ను కోల్డ్ చైన్ నిర్వహించకుండా FTA మద్దతుతో నిల్వ చేయవచ్చు మరియు విశ్లేషించవచ్చు అని మేము ఇటీవల నివేదించాము, ఇది మారుమూల ప్రాంతాలలో పరిశోధనకు ప్రధాన సవాలు [76]. ద్రవ బయాప్సీల నుండి ccfDNA ను సంగ్రహించడం కూడా సులభం మరియు షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ మరియు PCR విశ్లేషణ కోసం అధిక నాణ్యత గల DNA ను అందిస్తుంది. eDNA విశ్లేషణతో అనుబంధించబడిన కొన్ని సాంకేతిక పరిమితులను బట్టి ఇది గొప్ప ప్రయోజనం [77]. నమూనా పద్ధతి యొక్క సరళత మరియు తక్కువ ఖర్చు దీర్ఘకాలిక పర్యవేక్షణ కార్యక్రమాలకు కూడా ప్రత్యేకంగా అనుకూలంగా ఉంటుంది. వాటి అధిక వడపోత సామర్థ్యంతో పాటు, బివాల్వ్ల యొక్క మరొక ప్రసిద్ధ లక్షణం వాటి శ్లేష్మం యొక్క రసాయన మ్యూకోపాలిసాకరైడ్ కూర్పు, ఇది వైరస్ల శోషణను ప్రోత్సహిస్తుంది [78, 79]. ఇది ఇచ్చిన జల పర్యావరణ వ్యవస్థలో జీవవైవిధ్యం మరియు వాతావరణ మార్పుల ప్రభావాన్ని వర్గీకరించడానికి బివాల్వ్లను ఆదర్శవంతమైన సహజ వడపోతగా చేస్తుంది. eDNA తో పోలిస్తే హోస్ట్-ఉత్పన్న DNA శకలాలు ఉండటం ఈ పద్ధతి యొక్క పరిమితిగా పరిగణించబడుతున్నప్పటికీ, eDNA తో పోలిస్తే అటువంటి స్థానిక ccfDNA కలిగి ఉండటంతో సంబంధం ఉన్న ఖర్చు ఆరోగ్య అధ్యయనాలకు అందుబాటులో ఉన్న విస్తారమైన సమాచారం కోసం ఏకకాలంలో అర్థమవుతుంది. ఆఫ్సెట్ హోస్ట్. హోస్ట్ హోస్ట్ యొక్క జన్యువులో విలీనం చేయబడిన వైరల్ సీక్వెన్స్ల ఉనికి ఇందులో ఉంది. బివాల్వ్లలో [80, 81] క్షితిజ సమాంతరంగా ప్రసారం చేయబడిన లుకేమిక్ రెట్రోవైరస్ల ఉనికిని బట్టి ఇది మస్సెల్స్కు చాలా ముఖ్యమైనది. eDNA కంటే LB యొక్క మరొక ప్రయోజనం ఏమిటంటే ఇది హెమోలింఫ్లో రక్త కణాల ప్రసరణ యొక్క ఫాగోసైటిక్ కార్యకలాపాలను దోపిడీ చేస్తుంది, ఇది సూక్ష్మజీవులను (మరియు వాటి జన్యువులను) మింగేస్తుంది. ఫాగోసైటోసిస్ అనేది బివాల్వ్లలో రక్త కణాల ప్రధాన విధి [82]. చివరగా, ఈ పద్ధతి మస్సెల్స్ యొక్క అధిక వడపోత సామర్థ్యాన్ని (సగటున 1.5 l/h సముద్రపు నీరు) మరియు రెండు రోజుల ప్రసరణను సద్వినియోగం చేసుకుంటుంది, ఇవి సముద్రపు నీటి యొక్క వివిధ పొరల మిశ్రమాన్ని పెంచుతాయి, ఇది హెటెరోలాగస్ eDNA సంగ్రహాన్ని అనుమతిస్తుంది. [83, 84]. అందువల్ల, మస్సెల్స్ యొక్క పోషక, ఆర్థిక మరియు పర్యావరణ ప్రభావాలను బట్టి మస్సెల్ ccfDNA విశ్లేషణ ఒక ఆసక్తికరమైన మార్గం. మానవుల నుండి సేకరించిన LB విశ్లేషణ మాదిరిగానే, ఈ పద్ధతి బాహ్య పదార్థాలకు ప్రతిస్పందనగా హోస్ట్ DNAలో జన్యు మరియు బాహ్యజన్యు మార్పులను కొలిచే అవకాశాన్ని కూడా తెరుస్తుంది. ఉదాహరణకు, నానోపోర్ సీక్వెన్సింగ్ ఉపయోగించి స్థానిక ccfDNAలో జీనోమ్-వైడ్ మిథైలేషన్ విశ్లేషణను నిర్వహించడానికి మూడవ తరం సీక్వెన్సింగ్ టెక్నాలజీలను ఊహించవచ్చు. మస్సెల్ ccfDNA శకలాల పొడవు రసాయన పరివర్తనల అవసరం లేకుండా ఒకే సీక్వెన్సింగ్ నుండి జీనోమ్-వైడ్ DNA మిథైలేషన్ విశ్లేషణను అనుమతించే దీర్ఘ-చదివిన సీక్వెన్సింగ్ ప్లాట్ఫారమ్లతో ఆదర్శంగా అనుకూలంగా ఉండటం ద్వారా ఈ ప్రక్రియను సులభతరం చేయాలి. 85,86] ఇది ఒక ఆసక్తికరమైన అవకాశం, ఎందుకంటే DNA మిథైలేషన్ నమూనాలు పర్యావరణ ఒత్తిడికి ప్రతిస్పందనను ప్రతిబింబిస్తాయని మరియు అనేక తరాల పాటు కొనసాగుతాయని చూపబడింది. అందువల్ల, వాతావరణ మార్పు లేదా కాలుష్య కారకాలకు గురైన తర్వాత ప్రతిస్పందనను నియంత్రించే అంతర్లీన విధానాలపై ఇది విలువైన అంతర్దృష్టిని అందిస్తుంది [87]. అయితే, LB వాడకం పరిమితులు లేకుండా లేదు. పర్యావరణ వ్యవస్థలో సూచిక జాతుల ఉనికి దీనికి అవసరమని చెప్పనవసరం లేదు. పైన చెప్పినట్లుగా, ఇచ్చిన పర్యావరణ వ్యవస్థ యొక్క జీవవైవిధ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి LBని ఉపయోగించడానికి మూలం నుండి DNA శకలాల ఉనికిని పరిగణనలోకి తీసుకునే కఠినమైన బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ పైప్లైన్ కూడా అవసరం. సముద్ర జాతులకు రిఫరెన్స్ జన్యువుల లభ్యత మరొక ప్రధాన సమస్య. మెరైన్ క్షీరద జీనోమ్స్ ప్రాజెక్ట్ మరియు ఇటీవల స్థాపించబడిన ఫిష్10కె ప్రాజెక్ట్ [88] వంటి చొరవలు భవిష్యత్తులో ఇటువంటి విశ్లేషణను సులభతరం చేస్తాయని ఆశిస్తున్నారు. సముద్ర ఫిల్టర్-ఫీడింగ్ జీవులకు LB భావన యొక్క అనువర్తనం సీక్వెన్సింగ్ టెక్నాలజీలో తాజా పురోగతికి కూడా అనుకూలంగా ఉంటుంది, పర్యావరణ ఒత్తిడికి ప్రతిస్పందనగా సముద్ర ఆవాసాల ఆరోగ్యం గురించి ముఖ్యమైన సమాచారాన్ని అందించడానికి మల్టీ-ఓమ్ బయోమార్కర్ల అభివృద్ధికి ఇది బాగా సరిపోతుంది.
జీనోమ్ సీక్వెన్సింగ్ డేటా బయోప్రాజెక్ట్స్ SRR8924808 కింద NCBI సీక్వెన్స్ రీడ్ ఆర్కైవ్ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 లో నిక్షిప్తం చేయబడింది.
బ్రియర్లీ AS, కింగ్స్ఫోర్డ్ MJ సముద్ర జీవులు మరియు పర్యావరణ వ్యవస్థలపై వాతావరణ మార్పు ప్రభావం. కోల్ బయాలజీ. 2009; 19: P602–P614.
గిస్సీ E, మానియా E, మజారిస్ AD, ఫ్రాషెట్టి S, అల్మ్పానిడౌ V, బెవిలాక్వా S, మరియు ఇతరులు. వాతావరణ మార్పు మరియు ఇతర స్థానిక ఒత్తిళ్ల మిశ్రమ ప్రభావాలను సముద్ర పర్యావరణంపై పరిగణించండి. సాధారణ శాస్త్రీయ వాతావరణం. 2021;755:142564.
కారెల్లా F, Antuofermo E, ఫరీనా S, సలాతి F, మందాస్ D, ప్రాడో P, మరియు ఇతరులు. ) మార్చి మొదటి సైన్స్. 2020;7:48.
సెరోంట్ ఎల్, నికాస్ట్రో సిఆర్, జర్డి జిఐ, గోబర్విల్లే ఇ. పునరావృతమయ్యే వేడి ఒత్తిడి పరిస్థితులలో తగ్గిన వేడి సహనం బ్లూ మస్సెల్స్ యొక్క అధిక వేసవి మరణాలను వివరిస్తుంది. శాస్త్రీయ నివేదిక 2019; 9:17498.
ఫే SB, సీపీల్స్కి AM, నస్సెల్ S, సెర్వంటెస్-యోషిడా K, హ్వాన్ JL, హుబెర్ ER, మరియు ఇతరులు. జంతువుల మరణాల ఫ్రీక్వెన్సీ, కారణాలు మరియు పరిధిలో ఇటీవలి మార్పులు. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
స్కార్పా ఎఫ్, సన్నా డి, అజ్జేనా ఐ, ముగెట్టి డి, సెరుటి ఎఫ్, హోస్సేని ఎస్, మరియు ఇతరులు. బహుళ జాతులేతర-నిర్దిష్ట వ్యాధికారకాలు పిన్నా నోబిలిస్ యొక్క సామూహిక మరణాలకు కారణం కావచ్చు. జీవితం. 2020;10:238.
బ్రాడ్లీ M, కౌట్స్ SJ, జెంకిన్స్ E, ఓ'హారా TM. ఆర్కిటిక్ జూనోటిక్ వ్యాధులపై వాతావరణ మార్పు యొక్క సంభావ్య ప్రభావం. Int J సర్కంపోలార్ హెల్త్. 2005; 64:468–77.
బేయర్ జె., గ్రీన్ NW, బ్రూక్స్ ఎస్., అలన్ ఐజె, రూస్ ఎ., గోమెజ్ టి. మరియు ఇతరులు. తీరప్రాంత కాలుష్య పర్యవేక్షణలో సిగ్నల్ జీవులుగా బ్లూ మస్సెల్స్ (మైటిలస్ ఎడులిస్ spp.): ఒక సమీక్ష. మార్చి ఎన్విరాన్ రెస్ 2017; 130:338-65.
సిరవెగ్నా జి, మార్సోని ఎస్, సియెనా ఎస్, బార్డెల్లి ఎ. క్యాన్సర్ చికిత్సలో ద్రవ బయాప్సీ ఇంటిగ్రేషన్. నాట్ రెవ్ క్లీన్ ఓంకోల్. 2017; 14:531–48.
వాన్ జెసిఎం, మాస్సీ సి, గార్సియా-కోర్బాచో జె, మౌలియర్ ఎఫ్, బ్రెంటన్ జెడి, కాల్డాస్ సి, మరియు ఇతరులు. ద్రవ బయాప్సీ పరిపక్వత: కణితి DNA ప్రసరణకు అనుమతిస్తుంది. నాట్ రెవ్ క్యాన్సర్. 2017;17:223–38.
మాండెల్ పి., మెటైస్ పి. మానవ ప్లాస్మాలో న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలు. సోక్ బయోల్ అనుబంధ సంస్థల సమావేశ నిమిషాలు. 1948; 142:241-3.
బ్రోంకోర్స్ట్ AJ, ఉంగెరర్ W, హోల్డెన్రైడర్ S. క్యాన్సర్ చికిత్సకు పరమాణు మార్కర్గా కణ రహిత DNA కోసం కొత్త పాత్ర. బయోమోలార్ విశ్లేషణ యొక్క పరిమాణీకరణ. 2019;17:100087.
ఇగ్నాటియాడిస్ ఎం., స్లెడ్జ్ జిడబ్ల్యు, జెఫ్రీ ఎస్ఎస్ లిక్విడ్ బయాప్సీ క్లినిక్లోకి ప్రవేశిస్తుంది - అమలు సమస్యలు మరియు భవిష్యత్తు సవాళ్లు. నాట్ రెవరెండ్ క్లిన్ ఓంకోల్. 2021; 18:297–312.
లో వైఎం, కార్బెట్టా ఎన్., చాంబర్లైన్ పిఎఫ్, రాయ్ డబ్ల్యూ., సార్జెంట్ ఐఎల్, రెడ్మాన్ సిడబ్ల్యు మరియు ఇతరులు. పిండ DNA తల్లి ప్లాస్మా మరియు సీరంలో ఉంటుంది. లాన్సెట్. 1997; 350:485-7.
ముఫారే MN, వాంగ్ RJ, షా GM, స్టీవెన్సన్ DK, క్వాక్ SR గర్భధారణ సమయంలో మహిళల రక్తంలో ప్రసరణ చేయబడిన ఎక్స్ట్రాసెల్యులార్ RNA ఉపయోగించి గర్భధారణ కోర్సు మరియు దాని సమస్యల అధ్యయనం. డోపీడియాట్రిక్స్. 2020;8:605219.
ఒల్లెరిచ్ ఎం, షేర్వుడ్ కె, కియోన్ పి, షుట్జ్ ఇ, బెక్ జె, స్టెగ్బౌర్ జె, మరియు ఇతరులు. లిక్విడ్ బయాప్సీ: కిడ్నీ గ్రాఫ్ట్లో అలోజెనిక్ గాయాలను గుర్తించడానికి దాత కణ రహిత DNA ఉపయోగించబడుతుంది. నాట్ రెవ్ నెఫ్రోల్. 2021; 17:591–603.
జువాన్ FC, Lo YM ప్రినేటల్ డయాగ్నస్టిక్స్లో ఆవిష్కరణలు: ప్రసూతి ప్లాస్మా జీనోమ్ సీక్వెన్సింగ్. అన్నా MD. 2016;67:419-32.
గు డబ్ల్యూ, డెంగ్ ఎక్స్, లీ ఎం, సుకు వైడి, అరెవాలో ఎస్, స్ట్రైక్ డి, మరియు ఇతరులు. సోకిన శరీర ద్రవాల తదుపరి తరం మెటాజెనోమిక్ సీక్వెన్సింగ్తో వేగవంతమైన వ్యాధికారక గుర్తింపు. నాట్ మెడిసిన్. 2021;27:115-24.
పోస్ట్ సమయం: ఆగస్టు-14-2022
