Nature.comని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు.మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ సంస్కరణకు పరిమిత CSS మద్దతు ఉంది.ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాల్సిందిగా మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా Internet Explorerలో అనుకూలత మోడ్‌ని నిలిపివేయండి).ఈ సమయంలో, నిరంతర మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము సైట్‌ను స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా రెండర్ చేస్తాము.
లిక్విడ్ బయాప్సీ (LB) అనేది బయోమెడికల్ రంగంలో వేగంగా ప్రజాదరణ పొందుతున్న ఒక భావన.ఈ భావన ప్రధానంగా ప్రసరణ ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ DNA (ccfDNA) యొక్క శకలాలను గుర్తించడంపై ఆధారపడి ఉంటుంది, ఇవి ప్రధానంగా వివిధ కణజాలాలలో కణాల మరణం తర్వాత చిన్న శకలాలుగా విడుదల చేయబడతాయి.ఈ శకలాల యొక్క చిన్న భాగం విదేశీ (విదేశీ) కణజాలాలు లేదా జీవుల నుండి ఉద్భవించింది.ప్రస్తుత పనిలో, మేము ఈ భావనను మస్సెల్స్‌కు వర్తింపజేసాము, ఇది అధిక సముద్రపు నీటి వడపోత సామర్థ్యానికి ప్రసిద్ధి చెందిన సెంటినెల్ జాతి.సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థల జీవవైవిధ్యం గురించి సమాచారాన్ని అందించడానికి వివిధ వనరుల నుండి పర్యావరణ DNA శకలాలను సంగ్రహించడానికి సహజ ఫిల్టర్‌లుగా పనిచేసే మస్సెల్స్ సామర్థ్యాన్ని మేము ఉపయోగిస్తాము.మస్సెల్ హేమోలింఫ్ DNA శకలాలు కలిగి ఉందని మా ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి, ఇవి 1 నుండి 5 kb వరకు పరిమాణంలో చాలా తేడా ఉంటాయి.షాట్‌గన్ సీక్వెన్సింగ్ పెద్ద సంఖ్యలో DNA శకలాలు విదేశీ సూక్ష్మజీవుల మూలం అని చూపించింది.వాటిలో, మేము బ్యాక్టీరియా, ఆర్కియా మరియు వైరస్‌ల నుండి DNA శకలాలను కనుగొన్నాము, వీటిలో సాధారణంగా తీరప్రాంత సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో కనిపించే వివిధ రకాల అతిధేయలకు హాని కలిగించే వైరస్‌లు ఉన్నాయి.ముగింపులో, మా అధ్యయనం మస్సెల్స్‌కు వర్తించే LB భావన సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో సూక్ష్మజీవుల వైవిధ్యం గురించి గొప్ప కానీ ఇంకా అన్వేషించని జ్ఞానాన్ని సూచిస్తుందని నిరూపిస్తుంది.
సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థల జీవవైవిధ్యంపై వాతావరణ మార్పు (CC) ప్రభావం వేగంగా అభివృద్ధి చెందుతున్న పరిశోధన ప్రాంతం.గ్లోబల్ వార్మింగ్ ముఖ్యమైన శారీరక ఒత్తిళ్లను కలిగించడమే కాకుండా, సముద్ర జీవుల యొక్క ఉష్ణ స్థిరత్వం యొక్క పరిణామ పరిమితులను కూడా నెట్టివేస్తుంది, అనేక జాతుల నివాసాలను ప్రభావితం చేస్తుంది, మరింత అనుకూలమైన పరిస్థితుల కోసం వెతకడానికి వారిని ప్రేరేపిస్తుంది [1, 2].మెటాజోవాన్‌ల జీవవైవిధ్యాన్ని ప్రభావితం చేయడంతో పాటు, హోస్ట్-సూక్ష్మజీవుల పరస్పర చర్యల యొక్క సున్నితమైన సమతుల్యతను CC భంగపరుస్తుంది.ఈ సూక్ష్మజీవుల డైస్బాక్టీరియోసిస్ సముద్ర జీవావరణ వ్యవస్థలకు తీవ్రమైన ముప్పును కలిగిస్తుంది, ఎందుకంటే ఇది సముద్ర జీవులను అంటు వ్యాధికారక క్రిములకు [3, 4] ఎక్కువ అవకాశం కలిగిస్తుంది.సామూహిక మరణాలలో SS ఒక ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుందని నమ్ముతారు, ఇది ప్రపంచ సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థల నిర్వహణకు తీవ్రమైన సమస్య [5, 6].అనేక సముద్ర జాతుల ఆర్థిక, పర్యావరణ మరియు పోషక ప్రభావాలను బట్టి ఇది ముఖ్యమైన సమస్య.ధృవ ప్రాంతాలలో నివసించే బివాల్వ్‌లకు ఇది ప్రత్యేకంగా వర్తిస్తుంది, ఇక్కడ CK యొక్క ప్రభావాలు మరింత తక్షణం మరియు తీవ్రంగా ఉంటాయి [6, 7].నిజానికి, మైటిలస్ spp వంటి ద్విపదలు.సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలపై CC ప్రభావాలను పర్యవేక్షించడానికి విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతున్నాయి.వారి ఆరోగ్యాన్ని పర్యవేక్షించడానికి సాపేక్షంగా పెద్ద సంఖ్యలో బయోమార్కర్లు అభివృద్ధి చేయబడటంలో ఆశ్చర్యం లేదు, తరచుగా ఎంజైమాటిక్ యాక్టివిటీ లేదా సెల్ ఎబిబిలిటీ మరియు ఫాగోసైటిక్ యాక్టివిటీ [8] వంటి సెల్యులార్ ఫంక్షన్‌ల ఆధారంగా ఫంక్షనల్ బయోమార్కర్లను కలిగి ఉండే రెండు-స్థాయి విధానాన్ని ఉపయోగిస్తుంది.ఈ పద్ధతులలో సముద్రపు నీటిని పెద్ద మొత్తంలో గ్రహించిన తర్వాత మృదు కణజాలాలలో పేరుకుపోయే నిర్దిష్ట పీడన సూచికల ఏకాగ్రత యొక్క కొలత కూడా ఉంటుంది.అయినప్పటికీ, బివాల్వ్‌ల యొక్క అధిక వడపోత సామర్థ్యం మరియు సెమీ-ఓపెన్ సర్క్యులేటరీ సిస్టమ్, లిక్విడ్ బయాప్సీ (LB) భావనను ఉపయోగించి కొత్త హేమోలింఫ్ బయోమార్కర్‌లను అభివృద్ధి చేయడానికి అవకాశాన్ని అందిస్తాయి, ఇది రోగి నిర్వహణకు సులభమైన మరియు అతితక్కువ హానికర విధానం.రక్త నమూనాలు [9, 10].మానవ LBలో అనేక రకాల సర్క్యులేటింగ్ అణువులను కనుగొనగలిగినప్పటికీ, ఈ భావన ప్రధానంగా ప్లాస్మాలోని ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ DNA (ccfDNA) శకలాలు ప్రసరించే DNA సీక్వెన్సింగ్ విశ్లేషణపై ఆధారపడి ఉంటుంది.వాస్తవానికి, మానవ ప్లాస్మాలో ప్రసరించే DNA ఉనికిని 20వ శతాబ్దం మధ్యకాలం నుండి తెలిసింది [11], అయితే ఇటీవలి సంవత్సరాలలో మాత్రమే అధిక-నిర్గమాంశ సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతుల ఆగమనం ccfDNA ఆధారంగా క్లినికల్ డయాగ్నసిస్‌కు దారితీసింది.ఈ ప్రసరించే DNA శకలాలు ఉనికిలో ఉండటం వలన కణ మరణం తర్వాత జన్యుసంబంధమైన DNA (న్యూక్లియర్ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్) యొక్క నిష్క్రియాత్మక విడుదల కారణంగా ఉంటుంది. ఆరోగ్యవంతమైన వ్యక్తులలో, ccfDNA యొక్క గాఢత సాధారణంగా తక్కువగా ఉంటుంది (<10 ng/mL) కానీ వివిధ పాథాలజీలతో బాధపడుతున్న లేదా ఒత్తిడికి గురైన రోగులలో 5-10 రెట్లు పెరుగుతుంది, ఫలితంగా కణజాలం దెబ్బతింటుంది. ఆరోగ్యవంతమైన వ్యక్తులలో, ccfDNA యొక్క గాఢత సాధారణంగా తక్కువగా ఉంటుంది (<10 ng/mL) కానీ వివిధ పాథాలజీలతో బాధపడుతున్న లేదా ఒత్తిడికి గురైన రోగులలో 5-10 రెట్లు పెరుగుతుంది, ఫలితంగా కణజాలం దెబ్బతింటుంది. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 ng/ml), NO MOJET POVYSHATUS IN 5-10 NOY PATOLOGIEY లేదా PODVERGAUSICY STRESSU, Privodyashemu к POVREGDENISH TKANEY. ఆరోగ్యవంతమైన వ్యక్తులలో, cccDNA యొక్క ఏకాగ్రత సాధారణంగా తక్కువగా ఉంటుంది (<10 ng/mL), అయితే ఇది వివిధ పాథాలజీలు ఉన్న రోగులలో లేదా కణజాల నష్టానికి దారితీసే ఒత్తిడిలో ఉన్న రోగులలో 5-10 రెట్లు పెరుగుతుంది.మీరు -10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个 体 中 , ccfdna增加 5-10 倍 , 从而 组 织。 。కోన్సాంట్రాసియి ccfDNA నిస్కీయే (<10 ng/ml) మీ జ్డోరోవిక్ లిడియేట్, 5-10 గంటలలోపు nыmy patologiyami లేదా stressom, CHTO ప్రివోడిట్ క్ పోవ్రేగ్డేనియు త్కనీ. ఆరోగ్యవంతమైన వ్యక్తులలో ccfDNA సాంద్రతలు సాధారణంగా తక్కువగా ఉంటాయి (<10 ng/ml), కానీ వివిధ పాథాలజీలు లేదా ఒత్తిడి ఉన్న రోగులలో 5-10 రెట్లు పెంచవచ్చు, ఫలితంగా కణజాలం దెబ్బతింటుంది.ccfDNA శకలాల పరిమాణం విస్తృతంగా మారుతూ ఉంటుంది, కానీ సాధారణంగా 150 నుండి 200 bp వరకు ఉంటుంది.[12].స్వీయ-ఉత్పన్నమైన ccfDNA యొక్క విశ్లేషణ, అనగా, సాధారణ లేదా రూపాంతరం చెందిన హోస్ట్ కణాల నుండి ccfDNA, అణు మరియు/లేదా మైటోకాన్డ్రియల్ జన్యువులో ఉన్న జన్యు మరియు బాహ్యజన్యు మార్పులను గుర్తించడానికి ఉపయోగించవచ్చు, తద్వారా నిర్దిష్ట పరమాణు-లక్ష్య చికిత్సలను ఎంచుకోవడానికి వైద్యులకు సహాయం చేస్తుంది [13] .అయినప్పటికీ, గర్భధారణ సమయంలో పిండం కణాల నుండి లేదా మార్పిడి చేయబడిన అవయవాల నుండి ccfDNA వంటి విదేశీ మూలాల నుండి ccfDNA పొందవచ్చు [14,15,16,17].ccfDNA అనేది ఇన్ఫెక్షియస్ ఏజెంట్ (విదేశీ) యొక్క న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల ఉనికిని గుర్తించడానికి కూడా ఒక ముఖ్యమైన సమాచార వనరు, ఇది రక్త సంస్కృతుల ద్వారా గుర్తించబడని విస్తృతమైన ఇన్‌ఫెక్షన్‌లను నాన్-ఇన్వాసివ్ డిటెక్షన్‌ను అనుమతిస్తుంది, సోకిన కణజాలం యొక్క ఇన్వాసివ్ బయాప్సీని నివారించడం [18].ఇటీవలి అధ్యయనాలు నిజానికి మానవ రక్తంలో వైరల్ మరియు బాక్టీరియల్ వ్యాధికారక క్రిములను గుర్తించడానికి ఉపయోగపడే సమాచారం యొక్క గొప్ప మూలం ఉందని మరియు మానవ ప్లాస్మాలో కనిపించే 1% ccfDNA విదేశీ మూలం [19] అని చూపించింది.ఈ అధ్యయనాలు ccfDNA విశ్లేషణను ఉపయోగించి జీవి యొక్క ప్రసరించే సూక్ష్మజీవి యొక్క జీవవైవిధ్యాన్ని అంచనా వేయవచ్చని నిరూపిస్తున్నాయి.అయినప్పటికీ, ఇటీవలి వరకు, ఈ భావన మానవులలో మరియు కొంతవరకు ఇతర సకశేరుకాలలో ప్రత్యేకంగా ఉపయోగించబడింది [20, 21].
ప్రస్తుత పేపర్‌లో, 35 మిలియన్ సంవత్సరాల క్రితం ఏర్పడిన పెద్ద పీఠభూమిపై ఉన్న ద్వీపాల సమూహం, సబ్‌టార్కిటిక్ కెర్గులెన్ దీవులలో సాధారణంగా కనిపించే దక్షిణ జాతి అయిన ఔలాకోమ్యా అట్రా యొక్క ccfDNAని విశ్లేషించడానికి మేము LB సంభావ్యతను ఉపయోగిస్తాము.అగ్నిపర్వత విస్ఫోటనం.ఇన్ విట్రో ప్రయోగాత్మక వ్యవస్థను ఉపయోగించి, సముద్రపు నీటిలోని DNA శకలాలు మస్సెల్స్ ద్వారా త్వరగా గ్రహించబడతాయి మరియు హేమోలింఫ్ కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి ప్రవేశిస్తాయి.షాట్‌గన్ సీక్వెన్సింగ్ మస్సెల్ హీమోలింఫ్ ccfDNA దాని స్వంత మరియు నాన్-సెల్ఫ్ మూలం యొక్క DNA శకలాలను కలిగి ఉందని చూపింది, ఇందులో సహజీవన బ్యాక్టీరియా మరియు చల్లని అగ్నిపర్వత సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థల విలక్షణమైన బయోమ్‌ల నుండి DNA శకలాలు ఉన్నాయి.హెమోలింఫ్ ccfDNA వివిధ హోస్ట్ పరిధులతో వైరస్‌ల నుండి వచ్చిన వైరల్ సీక్వెన్స్‌లను కూడా కలిగి ఉంటుంది.అస్థి చేపలు, సముద్రపు ఎనిమోన్లు, ఆల్గే మరియు కీటకాలు వంటి బహుళ సెల్యులార్ జంతువుల నుండి DNA శకలాలు కూడా మేము కనుగొన్నాము.ముగింపులో, సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో గొప్ప జన్యు కచేరీలను రూపొందించడానికి LB భావనను సముద్ర అకశేరుకాలపై విజయవంతంగా అన్వయించవచ్చని మా అధ్యయనం నిరూపిస్తుంది.
పెద్దలు (55-70 మి.మీ పొడవు) మైటిలస్ ప్లాటెన్సిస్ (M. ప్లాటెన్సిస్) మరియు ఔలకోమ్య అట్రా (A. అట్రా) పోర్ట్-ఔ-ఫ్రాన్స్ (049°21.235 S, 070°13.490 E.) యొక్క అంతరకాల రాతి తీరాల నుండి సేకరించబడ్డాయి.డిసెంబర్ 2018లో కెర్గ్యులెన్ దీవులు. ఇతర వయోజన నీలి మస్సెల్స్ (మైటిలస్ spp.) వాణిజ్య సరఫరాదారు (PEI మస్సెల్ కింగ్ ఇంక్., ప్రిన్స్ ఎడ్వర్డ్ ఐలాండ్, కెనడా) నుండి పొందబడ్డాయి మరియు 10-20 L 32‰ కృత్రిమ ఉప్పునీరు కలిగిన ఉష్ణోగ్రత నియంత్రణలో (4°C) ఎరేటెడ్ ట్యాంక్‌లో ఉంచబడ్డాయి.(కృత్రిమ సముద్రపు ఉప్పు రీఫ్ క్రిస్టల్, తక్షణ మహాసముద్రం, వర్జీనియా, USA).ప్రతి ప్రయోగం కోసం, వ్యక్తిగత షెల్ల పొడవు మరియు బరువు కొలుస్తారు.
ఈ ప్రోగ్రామ్ కోసం ఉచిత ఓపెన్ యాక్సెస్ ప్రోటోకాల్ ఆన్‌లైన్‌లో అందుబాటులో ఉంది (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).క్లుప్తంగా, వివరించిన విధంగా LB హేమోలింఫ్ అపహరణ కండరాల నుండి సేకరించబడింది [22].3 నిమిషాల పాటు 1200×g వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా హిమోలింఫ్ స్పష్టం చేయబడింది, సూపర్‌నాటెంట్ ఉపయోగం వరకు స్తంభింపజేయబడింది (-20 ° C).cfDNA యొక్క ఐసోలేషన్ మరియు శుద్దీకరణ కోసం, తయారీదారు సూచనల ప్రకారం నమూనాలను (1.5-2.0 ml) న్యూక్లియోస్నాప్ cfDNA కిట్ (మాచెరీ-నాగెల్, బెత్లెహెన్, PA) ఉపయోగించి కరిగించి ప్రాసెస్ చేశారు.తదుపరి విశ్లేషణ వరకు ccfDNA -80 ° C వద్ద నిల్వ చేయబడింది.కొన్ని ప్రయోగాలలో, QIAamp DNA ఇన్వెస్టిగేటర్ కిట్ (QIAGEN, టొరంటో, అంటారియో, కెనడా) ఉపయోగించి ccfDNA వేరుచేయబడింది మరియు శుద్ధి చేయబడింది.శుద్ధి చేయబడిన DNA ప్రామాణిక PicoGreen పరీక్షను ఉపయోగించి లెక్కించబడింది.హై సెన్సిటివిటీ DNA కిట్‌ని ఉపయోగించి ఎజిలెంట్ 2100 బయోఅనలైజర్ (ఎజిలెంట్ టెక్నాలజీస్ ఇంక్., శాంటా క్లారా, CA)ని ఉపయోగించి కేశనాళిక ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా వివిక్త ccfDNA యొక్క ఫ్రాగ్మెంట్ పంపిణీని విశ్లేషించారు.తయారీదారు సూచనల ప్రకారం ccfDNA నమూనా యొక్క 1 µl ఉపయోగించి పరీక్ష జరిగింది.
హీమోలింఫ్ ccfDNA శకలాల క్రమం కోసం, Génome Québec (మాంట్రియల్, క్యూబెక్, కెనడా) Illumina MiSeq PE75 కిట్ యొక్క Illumina DNA మిక్స్ కిట్‌ని ఉపయోగించి షాట్‌గన్ లైబ్రరీలను సిద్ధం చేసింది.ప్రామాణిక అడాప్టర్ (BioO) ఉపయోగించబడింది.NCBI సీక్వెన్స్ రీడ్ ఆర్కైవ్ (SRR8924808 మరియు SRR8924809) నుండి ముడి డేటా ఫైల్‌లు అందుబాటులో ఉన్నాయి.FastQC [23] ఉపయోగించి ప్రాథమిక పఠన నాణ్యత అంచనా వేయబడింది.ట్రిమ్మోమాటిక్ [24] క్లిప్పింగ్ అడాప్టర్‌లు మరియు నాణ్యత లేని రీడ్‌ల కోసం ఉపయోగించబడింది.జత చేసిన చివరలతో కూడిన షాట్‌గన్ రీడ్‌లు అసమతుల్యతలను నివారించడానికి కనిష్టంగా 20 bp అతివ్యాప్తితో పొడవైన సింగిల్ రీడ్‌లుగా FLASH విలీనం చేయబడ్డాయి [25]. బివాల్వ్ NCBI టాక్సానమీ డేటాబేస్ (e విలువ <1e−3 మరియు 90% హోమోలజీ) ఉపయోగించి BLASTNతో విలీనం చేయబడిన రీడ్‌లు ఉల్లేఖించబడ్డాయి మరియు తక్కువ-సంక్లిష్టత శ్రేణుల మాస్కింగ్ DUST [26]ని ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది. బివాల్వ్ NCBI టాక్సానమీ డేటాబేస్ (e విలువ <1e−3 మరియు 90% హోమోలజీ) ఉపయోగించి BLASTNతో విలీనం చేయబడిన రీడ్‌లు ఉల్లేఖించబడ్డాయి మరియు తక్కువ-సంక్లిష్టత శ్రేణుల మాస్కింగ్ DUST [26]ని ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది. ఆబ్జెడినెన్సీ బ్లాస్ట్‌ఎన్‌ఎస్‌కి స్పోమోషూబ్లాస్ట్‌ఎన్‌ఎస్‌ఎస్‌ఐఎస్‌పోల్‌జోవానియమ్ బాజీ డ్యాన్స్ ట్యాక్సొనమీస్ BI (ప్రసిద్ధి ఇ <1e-3 మరియు 90% గమోలోగియి), మాస్కీరోవానీ పోస్లెడోవాటెల్ నియామకం 26]. NCBI బివాల్వ్ టాక్సానమీ డేటాబేస్ (e విలువ <1e-3 మరియు 90% హోమోలజీ) ఉపయోగించి పూల్ చేసిన రీడ్‌లు BLASTNతో ఉల్లేఖించబడ్డాయి మరియు తక్కువ సంక్లిష్టత సీక్వెన్స్ మాస్కింగ్ DUST [26]ని ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది.使用双壳类NCBI低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类复杂度 序列 的。。。。掩蔽 掩蔽ఆబ్జెడినెన్సీ బ్లాస్ట్‌ఎన్‌కి ఇన్‌పోల్జోవానియం ట్యాక్సోనోమిచెస్కోయ్ అడ్వాన్స్‌డ్ డేట్ COV NCBI (ప్రసిద్ధి ఇ <1e-3 మరియు 90% గోమోలాగి), మాస్కిరోవానీ పోస్లేడోవాటెల్ న్యూస్ దుమ్ము [26]. NCBI బివాల్వ్ టాక్సానమిక్ డేటాబేస్ (e విలువ <1e-3 మరియు 90% హోమోలజీ) ఉపయోగించి పూల్ చేసిన రీడ్‌లు BLASTNతో ఉల్లేఖించబడ్డాయి మరియు తక్కువ సంక్లిష్టత సీక్వెన్స్ మాస్కింగ్ DUST [26]ని ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది.రీడ్‌లు రెండు గ్రూపులుగా విభజించబడ్డాయి: బివాల్వ్ సీక్వెన్స్‌లకు సంబంధించినవి (ఇక్కడ సెల్ఫ్-రీడ్స్ అని పిలుస్తారు) మరియు సంబంధం లేనివి (స్వీయ-పఠనం కానివి).కాంటిగ్‌లను రూపొందించడానికి MEGAHIT ఉపయోగించి రెండు సమూహాలు విడివిడిగా సమావేశమయ్యాయి [27].ఇంతలో, ఏలియన్ మైక్రోబయోమ్ రీడ్‌ల వర్గీకరణ పంపిణీ క్రాకెన్ 2 [28]ని ఉపయోగించి వర్గీకరించబడింది మరియు Galaxy [29, 30]లో క్రోనా పై చార్ట్ ద్వారా గ్రాఫికల్‌గా సూచించబడుతుంది.మా ప్రాథమిక ప్రయోగాల నుండి సరైన కిమీమర్‌లు kmers-59గా నిర్ణయించబడ్డాయి. చివరి ఉల్లేఖన కోసం BLASTN (బివాల్వ్ NCBI డేటాబేస్, ఇ విలువ <1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ)తో సమలేఖనం చేయడం ద్వారా స్వీయ కాంటిగ్‌లు గుర్తించబడ్డాయి. చివరి ఉల్లేఖన కోసం BLASTN (బివాల్వ్ NCBI డేటాబేస్, ఇ విలువ <1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ)తో సమలేఖనం చేయడం ద్వారా స్వీయ కాంటిగ్‌లు గుర్తించబడ్డాయి. గ్యాటెమ్ సోబ్స్ట్వెన్నియే కాంటిగి బైలీ ఐడెంటిఫిషైరోవానీ పుటేమ్ సోపోస్టావ్లేనియా స్ బ్లాస్ట్న్ (బాజా డాన్, డ్వస్త్వింగ్ ение e <1e-10 и гомология 60%). చివరి ఉల్లేఖన కోసం BLASTN (NCBI బివాల్వ్ డేటాబేస్, ఇ విలువ <1e-10 మరియు 60% హోమోలజీ)తో సరిపోల్చడం ద్వారా స్వీయ-కాంటిగ్‌లు గుర్తించబడ్డాయి.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识廏軏别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% గేటెమ్ బైలీ ఐడెంటిఫికేషన్ సోబ్స్ట్వెన్నియే కోంటిగి డిలియా ఒకకొన్చాటెల్నోయ్ అనోటాషియస్ పుటేమ్ సోపోస్టవ్స్ для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTN (NCBI బివాల్వ్ డేటాబేస్, ఇ విలువ <1e-10 మరియు 60% హోమోలజీ)తో సరిపోలడం ద్వారా చివరి ఉల్లేఖన కోసం స్వీయ-కాంటిగ్‌లు గుర్తించబడ్డాయి. సమాంతరంగా, నాన్‌సెల్ఫ్ గ్రూప్ కాంటిగ్‌లు BLASTN (nt NCBI డేటాబేస్, ఇ విలువ <1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ)తో ఉల్లేఖించబడ్డాయి. సమాంతరంగా, నాన్‌సెల్ఫ్ గ్రూప్ కాంటిగ్‌లు BLASTN (nt NCBI డేటాబేస్, ఇ విలువ <1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ)తో ఉల్లేఖించబడ్డాయి. పరాల్లెల్నో చుజెరోడ్ని గ్రుప్పోవై కాంటిగి బైలీ అనోటిరోవానీ స్ పోమోష్యూ బ్లాస్ట్ఎన్ (బాజా డాన్జీ nt NCBI, 10 60%). సమాంతరంగా, విదేశీ సమూహ కాంటిగ్‌లు BLASTN (NT NCBI డేటాబేస్, ఇ విలువ <1e-10 మరియు 60% హోమోలజీ)తో ఉల్లేఖించబడ్డాయి.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群 పరాల్లెల్నో కాంటిగి, నో సాబ్స్ట్వెన్నోయ్ గ్రూపే, బిలీ అనోటిరోవానీ స్ పోమోషియస్ బ్లాస్ట్న్ (బ్లాస్ట్ ప్రకటన <1e-10 и гомология 60%). సమాంతరంగా, నాన్-సెల్ఫ్ గ్రూప్ కాంటిగ్‌లు BLASTN (nt NCBI డేటాబేస్, ఇ విలువ <1e-10 మరియు 60% హోమోలజీ)తో ఉల్లేఖించబడ్డాయి. Nr మరియు RefSeq ప్రోటీన్ NCBI డేటాబేస్‌లను (e విలువ <1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ) ఉపయోగించి నాన్‌సెల్ఫ్ కాంటిగ్‌లపై కూడా BLASTX నిర్వహించబడింది. Nr మరియు RefSeq ప్రోటీన్ NCBI డేటాబేస్‌లను (e విలువ <1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ) ఉపయోగించి నాన్‌సెల్ఫ్ కాంటిగ్‌లపై కూడా BLASTX నిర్వహించబడింది. BLASTX ట్యాక్జే బైల్ ప్రోవెడన్ ఆన్ నేసమోస్టొయాటేల్‌నిచ్ కాంటిగాస్ సిస్పోల్జోవానియం బేజ్ డాన్‌నిచ్ బెల్కా nr <NR ఒలాజియా 60%). nr మరియు RefSeq NCBI ప్రోటీన్ డేటాబేస్‌లను (e విలువ <1e-10 మరియు 60% హోమోలజీ) ఉపయోగించి నాన్-సెల్ఫ్ కాంటిగ్‌లపై కూడా BLASTX ప్రదర్శించబడింది.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI BLASTX TAKGE NEWS 60%). nr మరియు RefSeq NCBI ప్రోటీన్ డేటాబేస్‌లను (e విలువ <1e-10 మరియు 60% హోమోలజీ) ఉపయోగించి నాన్-సెల్ఫ్ కాంటిగ్‌లపై కూడా BLASTX ప్రదర్శించబడింది.నాన్-సెల్ఫ్-కాంటిగ్‌ల యొక్క BLASTN మరియు BLASTX పూల్స్ చివరి కాంటిగ్‌లను సూచిస్తాయి (అనుబంధ ఫైల్ చూడండి).
PCR కోసం ఉపయోగించే ప్రైమర్‌లు టేబుల్ S1లో ఇవ్వబడ్డాయి.ccfDNA లక్ష్య జన్యువులను విస్తరించడానికి Taq DNA పాలిమరేస్ (బయో బేసిక్ కెనడా, మార్కమ్, ON) ఉపయోగించబడింది.కింది ప్రతిచర్య పరిస్థితులు ఉపయోగించబడ్డాయి: 3 నిమిషాలకు 95 ° C వద్ద డీనాటరేషన్, 1 నిమిషానికి 95 ° C, 1 నిమిషానికి ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను సెట్ చేయండి, 1 నిమిషానికి 72 ° C వద్ద పొడిగింపు, 35 చక్రాలు మరియు చివరకు 10 నిమిషాల్లో 72 ° C..PCR ఉత్పత్తులు 95 V వద్ద SYBRTM సేఫ్ DNA జెల్ స్టెయిన్ (ఇన్విట్రోజెన్, బర్లింగ్టన్, ON, కెనడా) కలిగిన అగరోజ్ జెల్స్‌లో (1.5%) ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా వేరు చేయబడ్డాయి.
మస్సెల్స్ (Mytilus spp.) 500 ml ఆక్సిజనేటేడ్ సముద్రపు నీటిలో (32 PSU) 24 గంటల పాటు 4 ° C వద్ద అలవాటు పడింది.హ్యూమన్ గెలాక్టిన్-7 cDNA సీక్వెన్స్ (NCBI యాక్సెషన్ నంబర్ L07769) ఎన్‌కోడింగ్ ఇన్‌సర్ట్‌ను కలిగి ఉన్న ప్లాస్మిడ్ DNA 190 μg/μl తుది సాంద్రతతో సీసాకు జోడించబడింది.DNA చేరిక లేకుండా అదే పరిస్థితులలో పొదిగిన మస్సెల్స్ నియంత్రణ.మూడవ నియంత్రణ ట్యాంక్‌లో మస్సెల్స్ లేకుండా DNA ఉంది.సముద్రపు నీటిలో DNA నాణ్యతను పర్యవేక్షించడానికి, సూచించిన సమయంలో ప్రతి ట్యాంక్ నుండి సముద్రపు నీటి నమూనాలు (20 μl; మూడు పునరావృత్తులు) తీసుకోబడ్డాయి.ప్లాస్మిడ్ DNA ట్రేస్బిలిటీ కోసం, సూచించిన సమయాల్లో LB మస్సెల్స్ పండించబడ్డాయి మరియు qPCR మరియు ddPCR ద్వారా విశ్లేషించబడ్డాయి.సముద్రపు నీటిలో ఉప్పు ఎక్కువగా ఉన్నందున, అన్ని PCR పరీక్షలకు ముందు ఆల్కాట్‌లు PCR నాణ్యత నీటిలో (1:10) కరిగించబడతాయి.
బయోరాడ్ క్యూఎక్స్ 200 ప్రోటోకాల్ (మిసిసాగా, అంటారియో, కెనడా) ఉపయోగించి డిజిటల్ బిందువు పిసిఆర్ (డిడిపిసిఆర్) ప్రదర్శించబడింది.వాంఛనీయ ఉష్ణోగ్రత (టేబుల్ S1) నిర్ణయించడానికి ఉష్ణోగ్రత ప్రొఫైల్‌ని ఉపయోగించండి.QX200 డ్రాప్ జనరేటర్ (BioRad) ఉపయోగించి డ్రాప్స్ ఉత్పత్తి చేయబడ్డాయి.ddPCR ఈ క్రింది విధంగా నిర్వహించబడింది: 5 నిమిషాలకు 95 ° C, 30 సెకన్లకు 95 ° C యొక్క 50 చక్రాలు మరియు 1 నిమి మరియు 30 సెకన్లకు 72 ° C, 5 నిమిషాలకు 4 ° C మరియు 5 నిమిషాల్లో 90 ° C.QX200 డ్రాప్ రీడర్ (బయోరాడ్) ఉపయోగించి చుక్కల సంఖ్య మరియు సానుకూల ప్రతిచర్యలు (కాపీల సంఖ్య/µl) కొలుస్తారు.10,000 కంటే తక్కువ చుక్కలు ఉన్న నమూనాలు తిరస్కరించబడ్డాయి.ddPCR అమలు చేయబడిన ప్రతిసారీ నమూనా నియంత్రణ నిర్వహించబడదు.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (కార్బెట్ రీసెర్చ్, సిడ్నీ, ఆస్ట్రేలియా) మరియు LGALS7 నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి ప్రదర్శించబడింది.క్వాంటిఫాస్ట్ SYBR గ్రీన్ PCR కిట్ (QIAGEN)ని ఉపయోగించి అన్ని పరిమాణాత్మక PCRలు 20 µlలో ప్రదర్శించబడ్డాయి.qPCR 15 నిమిషాల ఇంక్యుబేషన్‌తో 95 ° C వద్ద ప్రారంభించబడింది, తర్వాత 95 ° C వద్ద 10 సెకన్ల పాటు 40 చక్రాలు మరియు 60 సెకన్లకు 60 ° C వద్ద ఒక డేటా సేకరణతో ప్రారంభించబడింది.5 సెకన్లకు 95 ° C, 60 సెకన్లకు 65 ° C మరియు qPCR చివరిలో 97 ° C వద్ద వరుస కొలతలను ఉపయోగించి ద్రవీభవన వక్రతలు రూపొందించబడ్డాయి.నియంత్రణ నమూనాలు మినహా ప్రతి qPCR మూడుసార్లు ప్రదర్శించబడింది.
మస్సెల్స్ అధిక వడపోత రేటుకు ప్రసిద్ధి చెందినందున, సముద్రపు నీటిలో ఉన్న DNA శకలాలు ఫిల్టర్ చేసి ఉంచగలవా అని మేము మొదట పరిశోధించాము.ఈ శకలాలు వాటి సెమీ-ఓపెన్ శోషరస వ్యవస్థలో పేరుకుపోతాయా అనే దానిపై కూడా మాకు ఆసక్తి ఉంది.బ్లూ మస్సెల్ ట్యాంకులకు జోడించిన కరిగే DNA శకలాలు యొక్క విధిని గుర్తించడం ద్వారా మేము ఈ సమస్యను ప్రయోగాత్మకంగా పరిష్కరించాము.DNA శకలాలు ట్రాకింగ్‌ను సులభతరం చేయడానికి, మేము మానవ గెలాక్టిన్-7 జన్యువును కలిగి ఉన్న విదేశీ (స్వయం కాదు) ప్లాస్మిడ్ DNAని ఉపయోగించాము.ddPCR సముద్రపు నీరు మరియు మస్సెల్స్‌లోని ప్లాస్మిడ్ DNA శకలాలను గుర్తించింది.మస్సెల్స్ లేనప్పుడు సముద్రపు నీటిలో DNA శకలాలు కాలక్రమేణా (7 రోజుల వరకు) సాపేక్షంగా స్థిరంగా ఉంటే, మస్సెల్స్ సమక్షంలో ఈ స్థాయి దాదాపు 8 గంటల్లో పూర్తిగా అదృశ్యమైందని మా ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి (Fig. 1a,b).ఎక్సోజనస్ DNA యొక్క శకలాలు 15 నిమిషాలలో ఇంట్రావాల్వులర్ ద్రవం మరియు హేమోలింఫ్‌లో సులభంగా కనుగొనబడ్డాయి (Fig. 1c).బహిర్గతం అయిన 4 గంటల తర్వాత కూడా ఈ శకలాలు గుర్తించబడతాయి.DNA శకలాలు సంబంధించి ఈ వడపోత చర్య బ్యాక్టీరియా మరియు ఆల్గే [31] యొక్క వడపోత చర్యతో పోల్చవచ్చు.ఈ ఫలితాలు మస్సెల్స్ తమ ద్రవ విభాగాలలో విదేశీ DNAని ఫిల్టర్ చేయగలవని మరియు పేరుకుపోతాయని సూచిస్తున్నాయి.
సముద్రపు నీటిలో ప్లాస్మిడ్ DNA యొక్క సాపేక్ష సాంద్రతలు (A) లేదా మస్సెల్స్ లేకపోవడం (B)లో, ddPCR ద్వారా కొలుస్తారు.Aలో, 75వ మరియు 25వ శాతాలను సూచించే పెట్టెల సరిహద్దులతో ఫలితాలు శాతాలుగా వ్యక్తీకరించబడతాయి.అమర్చిన లాగరిథమిక్ వక్రత ఎరుపు రంగులో చూపబడింది మరియు బూడిద రంగులో ఉన్న ప్రాంతం 95% విశ్వాస విరామాన్ని సూచిస్తుంది.Bలో, ఎరుపు గీత సగటును సూచిస్తుంది మరియు నీలి రేఖ ఏకాగ్రత కోసం 95% విశ్వాస విరామాన్ని సూచిస్తుంది.C ప్లాస్మిడ్ DNA చేరిక తర్వాత వివిధ సమయాల్లో మస్సెల్స్ యొక్క హిమోలింఫ్ మరియు వాల్యులర్ ద్రవంలో ప్లాస్మిడ్ DNA చేరడం.ఫలితాలు గుర్తించబడిన సంపూర్ణ కాపీలుగా ప్రదర్శించబడతాయి/mL (±SE).
తరువాత, పరిమిత మానవజన్య ప్రభావంతో కూడిన రిమోట్ ద్వీపాల సమూహం అయిన కెర్గులెన్ దీవులలోని మస్సెల్ పడకల నుండి సేకరించిన మస్సెల్స్‌లో ccfDNA యొక్క మూలాన్ని మేము పరిశోధించాము.ఈ ప్రయోజనం కోసం, మానవ cccDNA [32, 33]ను శుద్ధి చేయడానికి సాధారణంగా ఉపయోగించే పద్ధతుల ద్వారా మస్సెల్ హేమోలింఫ్‌ల నుండి cccDNA వేరుచేయబడింది మరియు శుద్ధి చేయబడింది.మస్సెల్స్‌లో సగటు హిమోలింఫ్ ccfDNA సాంద్రతలు ప్రతి ml హిమోలింఫ్ పరిధికి తక్కువ మైక్రోగ్రాములలో ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము (టేబుల్ S2, అనుబంధ సమాచారం చూడండి).ఈ సాంద్రతల శ్రేణి ఆరోగ్యకరమైన వ్యక్తుల కంటే చాలా పెద్దది (మిల్లీలీటర్‌కు తక్కువ నానోగ్రామ్‌లు), కానీ అరుదైన సందర్భాల్లో, క్యాన్సర్ రోగులలో, ccfDNA స్థాయి ప్రతి మిల్లీలీటర్‌కు అనేక మైక్రోగ్రాములకు చేరుకుంటుంది [34, 35].హేమోలింఫ్ ccfDNA యొక్క పరిమాణ పంపిణీ యొక్క విశ్లేషణ ఈ శకలాలు 1000 bp నుండి 1000 bp వరకు పరిమాణంలో చాలా తేడా ఉన్నట్లు చూపించింది.5000 bp వరకు (Fig. 2).సిలికా-ఆధారిత QIAamp ఇన్వెస్టిగేటర్ కిట్‌ను ఉపయోగించి ఇలాంటి ఫలితాలు పొందబడ్డాయి, ccfDNA [36]తో సహా తక్కువ సాంద్రత కలిగిన DNA నమూనాల నుండి జన్యుసంబంధమైన DNAని వేగంగా వేరుచేయడానికి మరియు శుద్ధి చేయడానికి ఫోరెన్సిక్ సైన్స్‌లో సాధారణంగా ఉపయోగించే ఒక పద్ధతి.
మస్సెల్ హేమోలింఫ్ యొక్క ప్రతినిధి ccfDNA ఎలెక్ట్రోఫోరేగ్రామ్.NucleoSnap ప్లాస్మా కిట్ (టాప్) మరియు QIAamp DNA ఇన్వెస్టిగేటర్ కిట్‌తో సంగ్రహించబడింది.B మస్సెల్స్‌లో హిమోలింఫ్ ccfDNA సాంద్రతలు (± SE) పంపిణీని చూపే వయోలిన్ ప్లాట్.నలుపు మరియు ఎరుపు గీతలు వరుసగా మధ్యస్థ మరియు మొదటి మరియు మూడవ త్రైమాసికాలను సూచిస్తాయి.
మానవులు మరియు ప్రైమేట్స్‌లో సుమారు 1% ccfDNA విదేశీ మూలాన్ని కలిగి ఉంది [21, 37].బివాల్వ్స్ యొక్క సెమీ-ఓపెన్ సర్క్యులేటరీ సిస్టమ్, మైక్రోబియల్-రిచ్ సముద్రపు నీరు మరియు మస్సెల్ ccfDNA యొక్క పరిమాణ పంపిణీని బట్టి, మస్సెల్ హేమోలింఫ్ ccfDNA సూక్ష్మజీవుల DNA యొక్క గొప్ప మరియు వైవిధ్యమైన పూల్ కలిగి ఉండవచ్చని మేము ఊహించాము.ఈ పరికల్పనను పరీక్షించడానికి, మేము కెర్గులెన్ దీవుల నుండి సేకరించిన ఔలాకోమ్యా అట్రా నమూనాల నుండి హీమోలింఫ్ ccfDNAని క్రమం చేసాము, 10 మిలియన్లకు పైగా రీడ్‌లను అందించాము, వీటిలో 97.6% నాణ్యత నియంత్రణను ఆమోదించాయి.BLASTN మరియు NCBI బివాల్వ్ డేటాబేస్‌లను (Fig. S1, సప్లిమెంటరీ ఇన్ఫర్మేషన్) ఉపయోగించి రీడింగులు స్వీయ మరియు నాన్-సెల్ఫ్ సోర్స్‌ల ప్రకారం వర్గీకరించబడ్డాయి.
మానవులలో, న్యూక్లియర్ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ DNA రెండింటినీ రక్తప్రవాహంలోకి విడుదల చేయవచ్చు [38].ఏదేమైనప్పటికీ, ప్రస్తుత అధ్యయనంలో, A. అట్రా జన్యువు క్రమం లేదా వివరించబడనందున, మస్సెల్స్ యొక్క న్యూక్లియర్ జెనోమిక్ DNA గురించి వివరంగా వివరించడం సాధ్యం కాలేదు.అయినప్పటికీ, మేము బైవాల్వ్ లైబ్రరీని (Fig. S2, అనుబంధ సమాచారం) ఉపయోగించి మా స్వంత మూలానికి చెందిన అనేక ccfDNA శకలాలను గుర్తించగలిగాము.సీక్వెన్స్ చేయబడిన ఆ A. అట్రా జన్యువుల యొక్క దర్శకత్వం వహించిన PCR యాంప్లిఫికేషన్ ద్వారా మా స్వంత మూలం యొక్క DNA శకలాలు ఉన్నట్లు కూడా మేము నిర్ధారించాము (Fig. 3).అదేవిధంగా, A. అట్రా యొక్క మైటోకాన్డ్రియల్ జన్యువు పబ్లిక్ డేటాబేస్‌లలో అందుబాటులో ఉన్నందున, A. అట్రా యొక్క హేమోలింఫ్‌లో మైటోకాన్డ్రియల్ ccfDNA శకలాలు ఉన్నట్లు ఆధారాలు కనుగొనవచ్చు.మైటోకాన్డ్రియాల్ DNA శకలాలు ఉనికిని PCR యాంప్లిఫికేషన్ (Fig. 3) ద్వారా నిర్ధారించబడింది.
PCR ద్వారా విస్తరించబడిన A. అట్రా (ఎరుపు చుక్కలు - స్టాక్ నంబర్: SRX5705969) మరియు M. ప్లాటెన్సిస్ (బ్లూ డాట్స్ - స్టాక్ నంబర్: SRX5705968) యొక్క హేమోలింఫ్‌లో వివిధ మైటోకాన్డ్రియల్ జన్యువులు ఉన్నాయి.ఫిగర్ బ్రెటన్ మరియు ఇతరుల నుండి స్వీకరించబడింది., 2011 B A. అట్రా నుండి హీమోలింఫ్ సూపర్‌నాటెంట్ యొక్క విస్తరణ FTA కాగితంపై నిల్వ చేయబడింది.PCR మిశ్రమాన్ని కలిగి ఉన్న PCR ట్యూబ్‌కు నేరుగా జోడించడానికి 3 mm పంచ్‌ను ఉపయోగించండి.
సముద్రపు నీటిలో సమృద్ధిగా ఉన్న సూక్ష్మజీవుల కంటెంట్ కారణంగా, మేము మొదట్లో హేమోలింఫ్‌లోని సూక్ష్మజీవుల DNA సన్నివేశాల వర్గీకరణపై దృష్టి సారించాము.దీన్ని చేయడానికి, మేము రెండు వేర్వేరు వ్యూహాలను ఉపయోగిస్తాము.BLAST మరియు ఇతర సాధనాలతో పోల్చదగిన ఖచ్చితత్వంతో సూక్ష్మజీవుల శ్రేణులను గుర్తించగల అల్గోరిథం-ఆధారిత సీక్వెన్స్ వర్గీకరణ ప్రోగ్రామ్ క్రాకెన్2ను మొదటి వ్యూహం ఉపయోగించింది [28].6719 కంటే ఎక్కువ రీడ్‌లు బ్యాక్టీరియా మూలానికి చెందినవిగా నిర్ధారించబడ్డాయి, అయితే 124 మరియు 64 వరుసగా ఆర్కియా మరియు వైరస్‌ల నుండి వచ్చినవి (Fig. 4).అత్యంత సమృద్ధిగా ఉన్న బ్యాక్టీరియా DNA శకలాలు ఫర్మిక్యూట్స్ (46%), ప్రోటీబాక్టీరియా (27%), మరియు బాక్టీరాయిడెట్స్ (17%) (Fig. 4a).ఈ పంపిణీ మెరైన్ బ్లూ మస్సెల్ మైక్రోబయోమ్ [39, 40] యొక్క మునుపటి అధ్యయనాలకు అనుగుణంగా ఉంటుంది.గామాప్రొటీబాక్టీరియా అనేది ప్రోటీబాక్టీరియా యొక్క ప్రధాన తరగతి (44%), ఇందులో అనేక వైబ్రియోనెల్స్ (Fig. 4b) ఉన్నాయి.ddPCR పద్ధతి A. అట్రా హెమోలింఫ్ (Fig. 4c) [41] యొక్క ccfDNAలో విబ్రియో DNA శకలాలు ఉన్నట్లు నిర్ధారించింది.ccfDNA యొక్క బ్యాక్టీరియా మూలం గురించి మరింత సమాచారం పొందడానికి, ఒక అదనపు విధానం తీసుకోబడింది (Fig. S2, అనుబంధ సమాచారం). ఈ సందర్భంలో, అతివ్యాప్తి చెందిన రీడ్‌లు జత-ముగింపు రీడ్‌లుగా సమీకరించబడ్డాయి మరియు BLASTN మరియు 1e−3 యొక్క e విలువను ఉపయోగించి స్వీయ (బివాల్వ్‌లు) లేదా నాన్‌సెల్ఫ్ ఆరిజన్‌గా వర్గీకరించబడ్డాయి మరియు >90% హోమోలజీతో కటాఫ్. ఈ సందర్భంలో, అతివ్యాప్తి చెందిన రీడ్‌లు జత-ముగింపు రీడ్‌లుగా సమీకరించబడ్డాయి మరియు BLASTN మరియు 1e−3 యొక్క e విలువను ఉపయోగించి స్వీయ (బివాల్వ్‌లు) లేదా నాన్‌సెల్ఫ్ ఆరిజన్‌గా వర్గీకరించబడ్డాయి మరియు >90% హోమోలజీతో కటాఫ్. В В В В В В В Пом случае перекрывающеся чтения були собраны как чтения с parnыmy konssami and били классии మీరు (ప్రత్యేకమైన మాలిస్కి) లేదా చుజీ పో ప్రోయిస్హోగ్డేనియమ్ బ్లాస్ట్న్ మరియు సార్వత్రిక పాటలు 1e>3 0%. ఈ సందర్భంలో, అతివ్యాప్తి చెందుతున్న రీడ్‌లు జత-ముగింపు రీడ్‌లుగా సేకరించబడ్డాయి మరియు BLASTN మరియు 1e-3 యొక్క e విలువను ఉపయోగించి స్థానిక (బివాల్వ్) లేదా నాన్-ఒరిజినల్‌గా వర్గీకరించబడ్డాయి మరియు >90% హోమోలజీతో కటాఫ్ చేయబడ్డాయి.మీరు分类为自身（双壳类）或非自身来源。మీరు 0% 同源性 的 分类 自身 ఈ విషయం ఉత్కంఠభరితమైన మాలిస్కి) లేదా ప్రోద్బలమైన %ఇస్పోల్జోవానియమ్ జానచెనియ్ మరియు బ్లాస్ట్న్ గేమ్ మరియు 1e-3 ఈ సందర్భంలో, అతివ్యాప్తి చెందుతున్న రీడ్‌లు జత-ముగింపు రీడ్‌లుగా సేకరించబడ్డాయి మరియు e BLASTN మరియు 1e-3 విలువలు మరియు హోమోలజీ థ్రెషోల్డ్>90% ఉపయోగించి స్వంత (బివాల్వ్‌లు) లేదా అసలైనవిగా వర్గీకరించబడ్డాయి.A. అట్రా జీనోమ్ ఇంకా క్రమం చేయబడనందున, మేము MEGAHIT నెక్స్ట్ జనరేషన్ సీక్వెన్సింగ్ (NGS) అసెంబ్లర్ యొక్క డి నోవో అసెంబ్లీ వ్యూహాన్ని ఉపయోగించాము.మొత్తం 147,188 కాంటిగ్‌లు మూలం యొక్క డిపెండెంట్ (బివాల్వ్స్)గా గుర్తించబడ్డాయి.ఈ కాంటిగ్‌లు BLASTN మరియు BLASTXలను ఉపయోగించి 1e-10 యొక్క ఇ-విలువలతో పేలాయి.ఈ వ్యూహం A. atra ccfDNAలో ఉన్న 482 నాన్-బివాల్వ్ శకలాలను గుర్తించడానికి మాకు అనుమతినిచ్చింది.ఈ DNA శకలాలు సగానికి పైగా (57%) బ్యాక్టీరియా నుండి పొందబడ్డాయి, ప్రధానంగా సల్ఫోట్రోఫిక్ సింబియాంట్స్‌తో సహా గిల్ సింబియాంట్స్ మరియు గిల్ సింబియాంట్స్ సోలెమ్యా వెలమ్ (Fig. 5).
రకం స్థాయిలో సాపేక్ష సమృద్ధి.B రెండు ప్రధాన ఫైలా యొక్క సూక్ష్మజీవుల వైవిధ్యం (ఫర్మిక్యూట్స్ మరియు ప్రోటీబాక్టీరియా).ddPCR C Vibrio spp యొక్క ప్రతినిధి విస్తరణ.A. మూడు అట్రా హీమోలింఫ్‌లలో 16S rRNA జన్యువు (నీలం) శకలాలు.
సేకరించిన మొత్తం 482 కాంటిగ్‌లు విశ్లేషించబడ్డాయి.మెటాజెనోమిక్ కాంటిగ్ ఉల్లేఖనాల వర్గీకరణ పంపిణీ యొక్క సాధారణ ప్రొఫైల్ (ప్రోకార్యోట్‌లు మరియు యూకారియోట్లు).B BLASTN మరియు BLASTX ద్వారా గుర్తించబడిన బ్యాక్టీరియా DNA శకలాలు యొక్క వివరణాత్మక పంపిణీ.
క్రాకెన్ 2 విశ్లేషణ కూడా మస్సెల్ ccfDNA ఆర్కియల్ DNA శకలాలు కలిగి ఉందని చూపించింది, ఇందులో యూరియార్‌కియోటా (65%), క్రెనార్‌చెయోటా (24%), మరియు థౌర్‌మార్చెయోటా (11%) (Fig. 6a) యొక్క DNA శకలాలు ఉన్నాయి.కాలిఫోర్నియా మస్సెల్స్‌లోని సూక్ష్మజీవుల సంఘంలో గతంలో కనుగొనబడిన యూరియార్‌కియోటా మరియు క్రెనార్‌చెయోటా నుండి తీసుకోబడిన DNA శకలాలు ఉండటం ఆశ్చర్యం కలిగించదు [42].Euryarchaeota తరచుగా తీవ్రమైన పరిస్థితులతో సంబంధం కలిగి ఉన్నప్పటికీ, ఇప్పుడు Euryarchaeota మరియు Crenarcheota రెండూ సముద్ర క్రయోజెనిక్ వాతావరణంలో అత్యంత సాధారణ ప్రొకార్యోట్‌లలో ఉన్నాయని గుర్తించబడింది [43, 44].మస్సెల్స్‌లో మెథనోజెనిక్ సూక్ష్మజీవుల ఉనికి ఆశ్చర్యం కలిగించదు, కెర్గులెన్ పీఠభూమి [45] దిగువన లీక్‌ల నుండి విస్తృతమైన మీథేన్ లీక్‌ల గురించి ఇటీవలి నివేదికలు మరియు కెర్గులెన్ దీవుల తీరంలో గమనించిన సూక్ష్మజీవుల మీథేన్ ఉత్పత్తి [46].
మా దృష్టి DNA వైరస్‌ల రీడింగ్‌లపైకి మళ్లింది.మనకు తెలిసినంత వరకు, ఇది మస్సెల్స్ వైరస్ కంటెంట్‌కు సంబంధించిన మొదటి ఆఫ్-టార్గెట్ అధ్యయనం.ఊహించినట్లుగా, మేము బాక్టీరియోఫేజెస్ (కాడోవైరల్స్) (Fig. 6b) యొక్క DNA శకలాలు కనుగొన్నాము.అయినప్పటికీ, అత్యంత సాధారణ వైరల్ DNA న్యూక్లియోసైటోవైరస్ల ఫైలమ్ నుండి వస్తుంది, దీనిని న్యూక్లియర్ సైటోప్లాస్మిక్ లార్జ్ DNA వైరస్ (NCLDV) అని కూడా పిలుస్తారు, ఇది ఏదైనా వైరస్ కంటే అతిపెద్ద జన్యువును కలిగి ఉంటుంది.ఈ ఫైలమ్‌లో, చాలా DNA శ్రేణులు మిమిమిడోవిరిడే (58%) మరియు పోక్స్‌విరిడే (21%) కుటుంబాలకు చెందినవి, వీటి సహజ అతిధేయలలో సకశేరుకాలు మరియు ఆర్థ్రోపోడ్‌లు ఉన్నాయి, అయితే ఈ DNA శ్రేణులలో కొద్ది భాగం తెలిసిన వైరోలాజికల్ ఆల్గేకి చెందినవి.సముద్రపు యూకారియోటిక్ ఆల్గేను సోకుతుంది.తెలిసిన వైరల్ జాతుల కంటే అతిపెద్ద జన్యు పరిమాణం కలిగిన పెద్ద వైరస్ పండోర వైరస్ నుండి కూడా సీక్వెన్సులు పొందబడ్డాయి.ఆసక్తికరంగా, హెమోలింఫ్ సిసిఎఫ్‌డిఎన్‌ఎ సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా నిర్ణయించబడిన వైరస్ సోకిన హోస్ట్‌ల పరిధి సాపేక్షంగా పెద్దది (మూర్తి ఎస్ 3, సప్లిమెంటరీ ఇన్ఫర్మేషన్).ఇందులో బాకులోవిరిడే మరియు ఇరిడోవిరిడే వంటి కీటకాలను సంక్రమించే వైరస్‌లు, అలాగే అమీబా, ఆల్గే మరియు సకశేరుకాలు సోకే వైరస్‌లు ఉన్నాయి.మేము Pithovirus sibericum జన్యువుతో సరిపోలే సన్నివేశాలను కూడా కనుగొన్నాము.పిటోవైరస్‌లు ("జోంబీ వైరస్‌లు" అని కూడా పిలుస్తారు) సైబీరియాలోని 30,000 సంవత్సరాల నాటి శాశ్వత మంచు నుండి మొదట వేరుచేయబడ్డాయి [47].అందువల్ల, మా ఫలితాలు ఈ వైరస్‌లలోని అన్ని ఆధునిక జాతులు అంతరించిపోలేదని చూపించే మునుపటి నివేదికలకు అనుగుణంగా ఉన్నాయి [48] మరియు ఈ వైరస్‌లు రిమోట్ సబార్కిటిక్ సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో ఉండవచ్చు.
చివరగా, మేము ఇతర బహుళ సెల్యులార్ జంతువుల నుండి DNA శకలాలు కనుగొనగలమా అని పరీక్షించాము.nt, nr మరియు RefSeq లైబ్రరీలతో (జెనోమిక్ మరియు ప్రోటీన్) మొత్తం 482 విదేశీ కాంటిగ్‌లను BLASTN మరియు BLASTX గుర్తించాయి.బహుళ సెల్యులార్ జంతువుల ccfDNA యొక్క విదేశీ శకలాలు అస్థి ఎముకల DNA ప్రధానంగా ఉన్నాయని మా ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి (Fig. 5).కీటకాలు మరియు ఇతర జాతుల నుండి DNA శకలాలు కూడా కనుగొనబడ్డాయి.DNA శకలాలు సాపేక్షంగా పెద్ద భాగం గుర్తించబడలేదు, బహుశా భూసంబంధమైన జాతులతో పోలిస్తే జన్యు డేటాబేస్‌లలో పెద్ద సంఖ్యలో సముద్ర జాతులు తక్కువగా ప్రాతినిధ్యం వహించడం వల్ల కావచ్చు [49].
ప్రస్తుత పేపర్‌లో, మేము LB భావనను మస్సెల్స్‌కు వర్తింపజేస్తాము, హేమోలింఫ్ ccfDNA షాట్ సీక్వెన్సింగ్ సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థల కూర్పుపై అంతర్దృష్టిని అందించగలదని వాదించారు.ప్రత్యేకించి, 1) మస్సెల్ హేమోలింఫ్ సాపేక్షంగా పెద్ద (~1-5 kb) DNA శకలాలు ప్రసరించే సాపేక్షంగా అధిక సాంద్రతలను (మైక్రోగ్రామ్ స్థాయిలు) కలిగి ఉందని మేము కనుగొన్నాము;2) ఈ DNA శకలాలు స్వతంత్రమైనవి మరియు స్వతంత్రం కానివి 3) ఈ DNA శకలాలు యొక్క విదేశీ వనరులలో, మేము బ్యాక్టీరియా, ఆర్కియల్ మరియు వైరల్ DNA, అలాగే ఇతర బహుళ సెల్యులార్ జంతువుల DNAలను కనుగొన్నాము;4) హిమోలింఫ్‌లో ఈ విదేశీ ccfDNA శకలాలు చేరడం వేగంగా జరుగుతుంది మరియు మస్సెల్స్ యొక్క అంతర్గత వడపోత చర్యకు దోహదం చేస్తుంది.ముగింపులో, ఇప్పటివరకు ప్రధానంగా బయోమెడిసిన్ రంగంలో అన్వయించబడిన LB భావన, సెంటినెల్ జాతులు మరియు వాటి పర్యావరణం మధ్య పరస్పర చర్యను బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి ఉపయోగపడే గొప్ప కానీ అన్వేషించబడని విజ్ఞాన మూలాన్ని ఎన్‌కోడ్ చేస్తుందని మా అధ్యయనం నిరూపిస్తుంది.
ప్రైమేట్‌లతో పాటు, ఎలుకలు, కుక్కలు, పిల్లులు మరియు గుర్రాలు [50, 51, 52] సహా క్షీరదాలలో ccfDNA ఐసోలేషన్ నివేదించబడింది.అయినప్పటికీ, మా జ్ఞానం ప్రకారం, ఓపెన్ సర్క్యులేషన్ సిస్టమ్‌తో సముద్ర జాతులలో సిసిఎఫ్‌డిఎన్‌ఎను గుర్తించడం మరియు క్రమం చేయడం మా అధ్యయనం మొదటిది.ఈ శరీర నిర్మాణ సంబంధమైన లక్షణం మరియు మస్సెల్స్ యొక్క వడపోత సామర్థ్యం, ​​ఇతర జాతులతో పోలిస్తే DNA శకలాలు ప్రసరించే విభిన్న పరిమాణ లక్షణాలను కనీసం కొంత భాగాన్ని వివరించవచ్చు.మానవులలో, రక్తంలో ప్రసరించే చాలా DNA శకలాలు 150 నుండి 200 bp వరకు ఉండే చిన్న శకలాలు.గరిష్టంగా 167 bp [34, 53].DNA శకలాలు యొక్క చిన్న కానీ ముఖ్యమైన భాగం 300 మరియు 500 bp పరిమాణంలో ఉంటుంది మరియు 5% 900 bp కంటే ఎక్కువ.[54].ఈ పరిమాణ పంపిణీకి కారణం ఏమిటంటే, ప్లాస్మాలో ccfDNA యొక్క ప్రధాన మూలం సెల్ డెత్ కారణంగా లేదా ఆరోగ్యకరమైన వ్యక్తులలో రక్తప్రసరణ కణాల నెక్రోసిస్ కారణంగా లేదా క్యాన్సర్ రోగులలో కణితి కణాల అపోప్టోసిస్ (ప్రసరణ కణితి DNA అని పిలుస్తారు) కారణంగా కణాల మరణం ఫలితంగా సంభవిస్తుంది., ctDNA).మేము మస్సెల్స్‌లో కనుగొన్న హిమోలింఫ్ ccfDNA పరిమాణం పంపిణీ 1000 నుండి 5000 bp వరకు ఉంటుంది, ఇది మస్సెల్ ccfDNA వేరే మూలాన్ని కలిగి ఉందని సూచిస్తుంది.ఇది తార్కిక పరికల్పన, ఎందుకంటే మస్సెల్స్ సెమీ-ఓపెన్ వాస్కులర్ సిస్టమ్‌ను కలిగి ఉంటాయి మరియు సూక్ష్మజీవుల జన్యుసంబంధమైన DNA యొక్క అధిక సాంద్రతలను కలిగి ఉన్న సముద్ర జల వాతావరణంలో నివసిస్తాయి.వాస్తవానికి, ఎక్సోజనస్ DNA ఉపయోగించి మా ప్రయోగశాల ప్రయోగాలు సముద్రపు నీటిలో DNA శకలాలు పేరుకుపోతాయని చూపించాయి, కనీసం కొన్ని గంటల తర్వాత సెల్యులార్ తీసుకోవడం మరియు/లేదా విడుదల చేసిన తర్వాత మరియు/లేదా వివిధ సంస్థలలో నిల్వ చేయబడిన తర్వాత అవి క్షీణించబడతాయి.కణాల అరుదైన (ప్రొకార్యోటిక్ మరియు యూకారియోటిక్ రెండూ) దృష్ట్యా, ఇంట్రావాల్వులర్ కంపార్ట్‌మెంట్ల వాడకం స్వీయ-మూలాల నుండి అలాగే విదేశీ మూలాల నుండి ccfDNA మొత్తాన్ని తగ్గిస్తుంది.బివాల్వ్ ఇన్నేట్ ఇమ్యూనిటీ యొక్క ప్రాముఖ్యతను మరియు పెద్ద సంఖ్యలో ప్రసరించే ఫాగోసైట్‌లను పరిగణనలోకి తీసుకుంటే, సూక్ష్మజీవులు మరియు/లేదా సెల్యులార్ శిధిలాలను తీసుకోవడం ద్వారా విదేశీ DNA పేరుకుపోయే ఫాగోసైట్‌లను ప్రసరించే ఫాగోసైట్‌లలో విదేశీ ccfDNA కూడా సమృద్ధిగా ఉంటుందని మేము మరింత ఊహిస్తున్నాము.కలిసి చూస్తే, బివాల్వ్ హేమోలింఫ్ సిసిఎఫ్‌డిఎన్‌ఎ పరమాణు సమాచారం యొక్క ప్రత్యేకమైన రిపోజిటరీ అని మరియు సెంటినల్ జాతిగా వారి స్థితిని బలోపేతం చేస్తుందని మా ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి.
బ్యాక్టీరియా-ఉత్పన్నమైన హిమోలింఫ్ ccfDNA శకలాల క్రమం మరియు విశ్లేషణ హోస్ట్ బ్యాక్టీరియా వృక్షజాలం మరియు చుట్టుపక్కల సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలో ఉన్న బ్యాక్టీరియా గురించి కీలక సమాచారాన్ని అందించగలదని మా డేటా సూచిస్తుంది.షాట్ సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతులు ప్రారంభ బ్యాక్టీరియా A. అట్రా గిల్ యొక్క సీక్వెన్స్‌లను బహిర్గతం చేశాయి, ఇది సంప్రదాయ 16S rRNA ఐడెంటిఫికేషన్ పద్ధతులను ఉపయోగించినట్లయితే, పాక్షికంగా రిఫరెన్స్ లైబ్రరీ బయాస్ కారణంగా తప్పిపోయేది.వాస్తవానికి, Kerguelen వద్ద అదే మస్సెల్ పొరలో M. ప్లాటెన్సిస్ నుండి సేకరించిన LB డేటా యొక్క మా ఉపయోగం రెండు మస్సెల్ జాతులకు (Fig. S4, సప్లిమెంటరీ ఇన్ఫర్మేషన్) గిల్-అనుబంధ బాక్టీరియా చిహ్నాల కూర్పు ఒకేలా ఉందని చూపించింది.రెండు జన్యుపరంగా భిన్నమైన మస్సెల్స్ యొక్క ఈ సారూప్యత కెర్గులెన్ [55, 56, 57, 58] యొక్క చల్లని, సల్ఫరస్ మరియు అగ్నిపర్వత నిక్షేపాలలో బ్యాక్టీరియా సంఘాల కూర్పును ప్రతిబింబిస్తుంది.పోర్ట్-ఔ-ఫ్రాన్స్ తీరం వంటి బయోటర్బేటెడ్ తీర ప్రాంతాల [59] నుండి మస్సెల్స్‌ను పండించేటప్పుడు సల్ఫర్-తగ్గించే సూక్ష్మజీవుల యొక్క అధిక స్థాయిలు బాగా వివరించబడ్డాయి.మరొక అవకాశం ఏమిటంటే, క్షితిజ సమాంతర ప్రసారం [60, 61] ద్వారా ప్రారంభ మస్సెల్ వృక్షజాలం ప్రభావితం కావచ్చు.సముద్ర పర్యావరణం, సముద్రపు అడుగు ఉపరితలం మరియు మస్సెల్స్‌లోని సహజీవన బ్యాక్టీరియా కూర్పు మధ్య పరస్పర సంబంధాన్ని గుర్తించడానికి మరింత పరిశోధన అవసరం.ఈ అధ్యయనాలు ప్రస్తుతం కొనసాగుతున్నాయి.
హీమోలింఫ్ ccfDNA యొక్క పొడవు మరియు గాఢత, దాని శుద్దీకరణ సౌలభ్యం మరియు వేగవంతమైన షాట్‌గన్ సీక్వెన్సింగ్‌ను అనుమతించడానికి అధిక నాణ్యత సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో జీవవైవిధ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి మస్సెల్ ccfDNAని ఉపయోగించడం వల్ల కలిగే అనేక ప్రయోజనాల్లో కొన్ని.ఇచ్చిన పర్యావరణ వ్యవస్థలో వైరల్ కమ్యూనిటీలను (వైరోమ్‌లు) వర్గీకరించడానికి ఈ విధానం ప్రత్యేకంగా ప్రభావవంతంగా ఉంటుంది [62, 63].బ్యాక్టీరియా, ఆర్కియా మరియు యూకారియోట్‌ల వలె కాకుండా, వైరల్ జన్యువులు 16S సీక్వెన్స్‌ల వంటి ఫైలోజెనెటిక్‌గా సంరక్షించబడిన జన్యువులను కలిగి ఉండవు.మస్సెల్స్ వంటి సూచిక జాతుల నుండి ద్రవ జీవాణుపరీక్షలు సాధారణంగా తీర ప్రాంత సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో నివసించే అతిధేయలకు హాని కలిగించే సాపేక్షంగా పెద్ద సంఖ్యలో ccfDNA వైరస్ శకలాలు గుర్తించడానికి ఉపయోగించవచ్చని మా ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.ఇందులో ప్రోటోజోవా, ఆర్థ్రోపోడ్స్, కీటకాలు, మొక్కలు మరియు బాక్టీరియా వైరస్‌లు (ఉదా, బాక్టీరియోఫేజెస్) సోకగల వైరస్‌లు ఉన్నాయి.Kerguelen (టేబుల్ S2, సప్లిమెంటరీ ఇన్ఫర్మేషన్) వద్ద అదే మస్సెల్ పొరలో సేకరించిన బ్లూ మస్సెల్స్ (M. ప్లాటెన్సిస్) యొక్క హేమోలింఫ్ ccfDNA వైరోమ్‌ను మేము పరిశీలించినప్పుడు ఇదే విధమైన పంపిణీ కనుగొనబడింది.ccfDNA యొక్క షాట్‌గన్ సీక్వెన్సింగ్ అనేది మానవులు లేదా ఇతర జాతుల [21, 37, 64] యొక్క వైరోమ్ అధ్యయనంలో ఊపందుకుంటున్న కొత్త విధానం.డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA వైరస్‌లను అధ్యయనం చేయడానికి ఈ విధానం ప్రత్యేకంగా ఉపయోగపడుతుంది, ఎందుకంటే అన్ని డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA వైరస్‌లలో ఏ ఒక్క జన్యువు భద్రపరచబడలేదు, బాల్టిమోర్‌లోని అత్యంత వైవిధ్యమైన మరియు విస్తృత తరగతి వైరస్‌లను సూచిస్తుంది [65].ఈ వైరస్‌లు చాలా వరకు వర్గీకరించబడనప్పటికీ మరియు వైరల్ ప్రపంచంలోని పూర్తిగా తెలియని భాగం నుండి వైరస్‌లను కలిగి ఉండవచ్చు [66], మస్సెల్స్ A. అట్రా మరియు M. ప్లాటెన్‌సిస్ యొక్క వైరోమ్‌లు మరియు హోస్ట్ పరిధులు రెండు జాతుల మధ్య వస్తాయి.అదేవిధంగా (ఫిగర్ S3, అదనపు సమాచారం చూడండి).ఈ సారూప్యత ఆశ్చర్యకరం కాదు, ఎందుకంటే ఇది పర్యావరణంలో ఉన్న DNA తీసుకోవడంలో ఎంపిక లోపాన్ని ప్రతిబింబిస్తుంది.RNA వైరోమ్‌ని వర్గీకరించడానికి ప్రస్తుతం శుద్ధి చేయబడిన RNAని ఉపయోగించి భవిష్యత్తు అధ్యయనాలు అవసరం.
మా అధ్యయనంలో, మేము స్థానిక ccfDNA యొక్క అసెంబ్లీకి ముందు మరియు తర్వాత పూల్ చేసిన రీడ్‌లు మరియు కాంటిగ్‌ల యొక్క రెండు-దశల తొలగింపును ఉపయోగించిన కోవర్స్కీ మరియు సహచరుల [37] పని నుండి స్వీకరించబడిన చాలా కఠినమైన పైప్‌లైన్‌ను ఉపయోగించాము, ఫలితంగా మ్యాప్ చేయని రీడ్‌లు అధిక నిష్పత్తిలో ఉన్నాయి.అందువల్ల, మ్యాప్ చేయని ఈ రీడ్‌లలో కొన్ని ఇప్పటికీ వాటి స్వంత మూలాన్ని కలిగి ఉండవచ్చని మేము తోసిపుచ్చలేము, ప్రధానంగా ఈ మస్సెల్ జాతికి సంబంధించిన రిఫరెన్స్ జీనోమ్ మా వద్ద లేదు.మేము స్వీయ మరియు నాన్-సెల్ఫ్ రీడ్‌ల మధ్య చిమెరాస్ మరియు Illumina MiSeq PE75 ద్వారా రూపొందించబడిన రీడ్ లెంగ్త్‌ల గురించి ఆందోళన చెందుతున్నందున మేము ఈ పైప్‌లైన్‌ని కూడా ఉపయోగించాము.చాలా వరకు నిర్దేశించని రీడింగ్‌లకు మరొక కారణం ఏమిటంటే, చాలా సముద్ర సూక్ష్మజీవులు, ముఖ్యంగా కెర్గులెన్ వంటి మారుమూల ప్రాంతాలలో, ఉల్లేఖించబడలేదు.మేము Illumina MiSeq PE75ని ఉపయోగించాము, మానవ ccfDNA లాగా ccfDNA ఫ్రాగ్మెంట్ పొడవులను ఊహించి.భవిష్యత్ అధ్యయనాల కోసం, మానవులు మరియు/లేదా క్షీరదాల కంటే హీమోలింఫ్ ccfDNA ఎక్కువ రీడ్‌లను కలిగి ఉందని చూపుతున్న మా ఫలితాలను బట్టి, పొడవైన ccfDNA శకలాలు కోసం మరింత అనువైన సీక్వెన్సింగ్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌ను ఉపయోగించమని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము.ఈ అభ్యాసం లోతైన విశ్లేషణ కోసం మరిన్ని సూచనలను గుర్తించడం చాలా సులభం చేస్తుంది.ప్రస్తుతం అందుబాటులో లేని పూర్తి A. అట్రా న్యూక్లియర్ జీనోమ్ సీక్వెన్స్‌ను పొందడం వలన స్వీయ మరియు నాన్-సెల్ఫ్ మూలాల నుండి ccfDNA యొక్క వివక్షను కూడా చాలా సులభతరం చేస్తుంది.మా పరిశోధన మస్సెల్స్‌కు లిక్విడ్ బయాప్సీ భావనను వర్తింపజేసే అవకాశంపై దృష్టి సారించినందున, భవిష్యత్ పరిశోధనలో ఈ భావన ఉపయోగించబడుతున్నందున, మస్సెల్స్ యొక్క సూక్ష్మజీవుల వైవిధ్యాన్ని అధ్యయనం చేయడానికి ఈ పద్ధతి యొక్క సామర్థ్యాన్ని పెంచడానికి కొత్త సాధనాలు మరియు పైప్‌లైన్‌లు అభివృద్ధి చేయబడతాయని మేము ఆశిస్తున్నాము.సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థ.
నాన్-ఇన్వాసివ్ క్లినికల్ బయోమార్కర్‌గా, ccfDNA యొక్క ఎలివేటెడ్ హ్యూమన్ ప్లాస్మా స్థాయిలు వివిధ వ్యాధులు, కణజాల నష్టం మరియు ఒత్తిడి పరిస్థితులతో సంబంధం కలిగి ఉంటాయి [67,68,69].ఈ పెరుగుదల కణజాల నష్టం తర్వాత దాని స్వంత మూలం యొక్క DNA శకలాలు విడుదలతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది.మేము ఈ సమస్యను తీవ్రమైన వేడి ఒత్తిడిని ఉపయోగించి పరిష్కరించాము, దీనిలో మస్సెల్స్ క్లుప్తంగా 30 °C ఉష్ణోగ్రతకు బహిర్గతమవుతాయి.మేము మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో మూడు వేర్వేరు రకాల మస్సెల్స్‌పై ఈ విశ్లేషణ చేసాము.అయినప్పటికీ, తీవ్రమైన వేడి ఒత్తిడి తర్వాత మేము ccfDNA స్థాయిలలో ఎటువంటి మార్పును కనుగొనలేదు (మూర్తి S5, అదనపు సమాచారం చూడండి).మస్సెల్స్ సెమీ-ఓపెన్ సర్క్యులేటరీ సిస్టమ్‌ను కలిగి ఉంటాయి మరియు వాటి అధిక వడపోత చర్య కారణంగా పెద్ద మొత్తంలో విదేశీ DNA పేరుకుపోతాయనే వాస్తవాన్ని ఈ ఆవిష్కరణ కనీసం కొంతవరకు వివరించవచ్చు.మరోవైపు, మస్సెల్స్, అనేక అకశేరుకాల వలె, ఒత్తిడి-ప్రేరిత కణజాల నష్టానికి మరింత నిరోధకతను కలిగి ఉండవచ్చు, తద్వారా వారి హేమోలింఫ్ [70, 71]లో ccfDNA విడుదలను పరిమితం చేస్తుంది.
ఈ రోజు వరకు, జల పర్యావరణ వ్యవస్థలలోని జీవవైవిధ్యం యొక్క DNA విశ్లేషణ ప్రధానంగా పర్యావరణ DNA (eDNA) మెటాబార్‌కోడింగ్‌పై దృష్టి సారించింది.అయినప్పటికీ, ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించినప్పుడు ఈ పద్ధతి సాధారణంగా జీవవైవిధ్య విశ్లేషణలో పరిమితం చేయబడింది.షాట్‌గన్ సీక్వెన్సింగ్ వాడకం PCR యొక్క పరిమితులను మరియు ప్రైమర్ సెట్‌ల పక్షపాత ఎంపికను తప్పించుకుంటుంది.అందువల్ల, ఒక కోణంలో, మా పద్ధతి ఇటీవల ఉపయోగించిన అధిక-నిర్గమాంశ eDNA షాట్‌గన్ సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతికి దగ్గరగా ఉంటుంది, ఇది విచ్ఛిన్నమైన DNAని నేరుగా క్రమం చేయగలదు మరియు దాదాపు అన్ని జీవులను విశ్లేషించగలదు [72, 73].అయినప్పటికీ, ప్రామాణిక eDNA పద్ధతుల నుండి LBని వేరుచేసే అనేక ప్రాథమిక సమస్యలు ఉన్నాయి.వాస్తవానికి, eDNA మరియు LB మధ్య ప్రధాన వ్యత్యాసం సహజ వడపోత హోస్ట్‌ల ఉపయోగం.eDNAని అధ్యయనం చేయడానికి సహజ వడపోతగా స్పాంజ్‌లు మరియు బివాల్వ్‌లు (డ్రెస్సీనా spp.) వంటి సముద్ర జాతుల ఉపయోగం నివేదించబడింది [74, 75].అయినప్పటికీ, డ్రీస్సేనా యొక్క అధ్యయనం కణజాల బయాప్సీలను ఉపయోగించింది, దాని నుండి DNA సంగ్రహించబడింది.LB నుండి ccfDNA యొక్క విశ్లేషణకు టిష్యూ బయాప్సీ, ప్రత్యేకమైన మరియు కొన్నిసార్లు ఖరీదైన పరికరాలు మరియు eDNA లేదా టిష్యూ బయాప్సీకి సంబంధించిన లాజిస్టిక్స్ అవసరం లేదు.వాస్తవానికి, LB నుండి ccfDNAని కోల్డ్ చైన్‌ను నిర్వహించకుండా FTA మద్దతుతో నిల్వ చేయవచ్చు మరియు విశ్లేషించవచ్చని మేము ఇటీవల నివేదించాము, ఇది మారుమూల ప్రాంతాలలో పరిశోధనలకు పెద్ద సవాలుగా ఉంది [76].లిక్విడ్ బయాప్సీల నుండి ccfDNA యొక్క సంగ్రహణ కూడా చాలా సులభం మరియు షాట్‌గన్ సీక్వెన్సింగ్ మరియు PCR విశ్లేషణ కోసం అధిక నాణ్యత DNAని అందిస్తుంది.eDNA విశ్లేషణ [77]తో అనుబంధించబడిన కొన్ని సాంకేతిక పరిమితులను బట్టి ఇది గొప్ప ప్రయోజనం.నమూనా పద్ధతి యొక్క సరళత మరియు తక్కువ ధర దీర్ఘకాలిక పర్యవేక్షణ కార్యక్రమాలకు కూడా ప్రత్యేకంగా అనుకూలంగా ఉంటుంది.వారి అధిక వడపోత సామర్థ్యంతో పాటు, బివాల్వ్‌ల యొక్క మరొక ప్రసిద్ధ లక్షణం వాటి శ్లేష్మం యొక్క రసాయన మ్యూకోపాలిసాకరైడ్ కూర్పు, ఇది వైరస్‌ల శోషణను ప్రోత్సహిస్తుంది [78, 79].ఇది జీవవైవిధ్యం మరియు ఇచ్చిన జల జీవావరణ వ్యవస్థలో వాతావరణ మార్పుల ప్రభావాన్ని వర్ణించేందుకు ద్విపదలను ఆదర్శవంతమైన సహజ వడపోతగా చేస్తుంది.eDNAతో పోల్చితే హోస్ట్-ఉత్పన్న DNA శకలాల ఉనికిని పద్ధతి యొక్క పరిమితిగా చూడగలిగినప్పటికీ, eDNAతో పోల్చితే అటువంటి స్థానిక ccfDNAని కలిగి ఉండటానికి సంబంధించిన ఖర్చు ఆరోగ్య అధ్యయనాల కోసం అందుబాటులో ఉన్న విస్తారమైన సమాచారం కోసం ఏకకాలంలో అర్థమవుతుంది.ఆఫ్‌సెట్ హోస్ట్.హోస్ట్ హోస్ట్ యొక్క జన్యువులో విలీనం చేయబడిన వైరల్ సీక్వెన్స్‌ల ఉనికిని ఇది కలిగి ఉంటుంది.బివాల్వ్స్ [80, 81]లో క్షితిజ సమాంతరంగా ప్రసారం చేయబడిన ల్యుకేమిక్ రెట్రోవైరస్ల ఉనికిని బట్టి ఇది మస్సెల్స్‌కు చాలా ముఖ్యమైనది.eDNA కంటే LB యొక్క మరొక ప్రయోజనం ఏమిటంటే, ఇది హేమోలింఫ్‌లో రక్త కణాలను ప్రసరించే ఫాగోసైటిక్ చర్యను దోపిడీ చేస్తుంది, ఇది సూక్ష్మజీవులను (మరియు వాటి జన్యువులను) చుట్టుముడుతుంది.ఫాగోసైటోసిస్ బైవాల్వ్స్‌లోని రక్త కణాల ప్రధాన విధి [82].చివరగా, ఈ పద్ధతి మస్సెల్స్ యొక్క అధిక వడపోత సామర్థ్యం (సగటున 1.5 l/h సముద్రపు నీరు) మరియు రెండు-రోజుల ప్రసరణ ప్రయోజనాన్ని పొందుతుంది, ఇది సముద్రపు నీటి యొక్క వివిధ పొరల మిశ్రమాన్ని పెంచుతుంది, ఇది భిన్నమైన eDNA సంగ్రహాన్ని అనుమతిస్తుంది.[83, 84].అందువల్ల, మస్సెల్ ccfDNA విశ్లేషణ అనేది మస్సెల్స్ యొక్క పోషక, ఆర్థిక మరియు పర్యావరణ ప్రభావాలను బట్టి ఒక ఆసక్తికరమైన మార్గం.మానవుల నుండి సేకరించిన LB యొక్క విశ్లేషణ మాదిరిగానే, ఈ పద్ధతి బాహ్య పదార్థాలకు ప్రతిస్పందనగా హోస్ట్ DNAలో జన్యు మరియు బాహ్యజన్యు మార్పులను కొలిచే అవకాశాన్ని కూడా తెరుస్తుంది.ఉదాహరణకు, నానోపోర్ సీక్వెన్సింగ్‌ని ఉపయోగించి స్థానిక ccfDNAలో జన్యు-వ్యాప్త మిథైలేషన్ విశ్లేషణను నిర్వహించడానికి మూడవ తరం సీక్వెన్సింగ్ సాంకేతికతలను ఊహించవచ్చు.మస్సెల్ ccfDNA శకలాల పొడవు దీర్ఘ-రీడ్ సీక్వెన్సింగ్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లకు అనువైనదిగా ఉండటం ద్వారా ఈ ప్రక్రియను సులభతరం చేయాలి, ఇది రసాయన పరివర్తనలు అవసరం లేకుండా ఒకే సీక్వెన్సింగ్ నుండి జన్యు-వ్యాప్త DNA మిథైలేషన్ విశ్లేషణను అనుమతిస్తుంది.85,86] ఇది ఒక ఆసక్తికరమైన అవకాశం.అందువల్ల, వాతావరణ మార్పు లేదా కాలుష్య కారకాలకు గురైన తర్వాత ప్రతిస్పందనను నియంత్రించే అంతర్లీన విధానాలపై ఇది విలువైన అంతర్దృష్టిని అందిస్తుంది [87].అయితే, LB యొక్క ఉపయోగం పరిమితులు లేకుండా లేదు.దీనికి పర్యావరణ వ్యవస్థలో సూచిక జాతుల ఉనికి అవసరం అని ప్రత్యేకంగా చెప్పనవసరం లేదు.పైన పేర్కొన్నట్లుగా, ఇచ్చిన పర్యావరణ వ్యవస్థ యొక్క జీవవైవిధ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి LBని ఉపయోగించడం కూడా మూలం నుండి DNA శకలాల ఉనికిని పరిగణనలోకి తీసుకునే కఠినమైన బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ పైప్‌లైన్ అవసరం.మరో ప్రధాన సమస్య సముద్ర జాతుల కోసం రిఫరెన్స్ జన్యువుల లభ్యత.మెరైన్ మామల్ జీనోమ్స్ ప్రాజెక్ట్ మరియు ఇటీవల స్థాపించబడిన ఫిష్10కె ప్రాజెక్ట్ [88] వంటి కార్యక్రమాలు భవిష్యత్తులో ఇటువంటి విశ్లేషణను సులభతరం చేస్తాయని భావిస్తున్నారు.సముద్రపు ఫిల్టర్-ఫీడింగ్ జీవులకు LB కాన్సెప్ట్ యొక్క అప్లికేషన్ సీక్వెన్సింగ్ టెక్నాలజీలో తాజా పురోగతికి కూడా అనుకూలంగా ఉంటుంది, పర్యావరణ ఒత్తిడికి ప్రతిస్పందనగా సముద్ర ఆవాసాల ఆరోగ్యం గురించి ముఖ్యమైన సమాచారాన్ని అందించడానికి మల్టీ-ఓమ్ బయోమార్కర్ల అభివృద్ధికి ఇది బాగా సరిపోతుంది.
జీనోమ్ సీక్వెన్సింగ్ డేటా బయోప్రాజెక్ట్స్ SRR8924808 కింద NCBI సీక్వెన్స్ రీడ్ ఆర్కైవ్ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808లో జమ చేయబడింది.
బ్రియర్లీ AS, కింగ్స్‌ఫోర్డ్ MJ సముద్ర జీవులు మరియు పర్యావరణ వ్యవస్థలపై వాతావరణ మార్పు ప్రభావం.కోల్ బయాలజీ.2009;19: P602–P614.
గిస్సీ E, మానియా E, మజారిస్ AD, ఫ్రాస్చెట్టి S, Almpanidou V, బెవిలాక్వా S, మరియు ఇతరులు.సముద్ర పర్యావరణంపై వాతావరణ మార్పు మరియు ఇతర స్థానిక ఒత్తిళ్ల మిశ్రమ ప్రభావాలను పరిగణించండి.సాధారణ శాస్త్రీయ వాతావరణం.2021;755:142564.
కారెల్లా F, Antuofermo E, ఫరీనా S, సలాతి F, మందాస్ D, ప్రాడో P, మరియు ఇతరులు.)మార్చి మొదటి సైన్స్.2020;7:48.
సెరోంట్ ఎల్, నికాస్ట్రో CR, జార్డి GI, గోబెర్‌విల్లే E. పునరావృత వేడి ఒత్తిడి పరిస్థితులలో తగ్గించబడిన వేడిని తట్టుకోవడం వల్ల నీలి మస్సెల్స్ యొక్క వేసవి మరణాలు ఎక్కువగా ఉంటాయి.శాస్త్రీయ నివేదిక 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, నస్స్లే S, సెర్వంటెస్-యోషిడా K, హ్వాన్ JL, హుబెర్ ER, మరియు ఇతరులు.జంతువుల మరణాల ఫ్రీక్వెన్సీ, కారణాలు మరియు విస్తీర్ణంలో ఇటీవలి మార్పులు.ప్రోక్ నాట్ల్ అకాడ్ సైన్స్ USA.2015;112:1083-8.
స్కార్పా ఎఫ్, సన్నా డి, అజ్జేనా ఐ, ముగెట్టి డి, సెరుటి ఎఫ్, హోస్సేని ఎస్, మరియు ఇతరులు.బహుళ జాతులేతర-నిర్దిష్ట వ్యాధికారకాలు పిన్నా నోబిలిస్ యొక్క సామూహిక మరణాలకు కారణం కావచ్చు.జీవితం.2020;10:238.
బ్రాడ్లీ M, కౌట్స్ SJ, జెంకిన్స్ E, ఓ'హారా TM.ఆర్కిటిక్ జూనోటిక్ వ్యాధులపై వాతావరణ మార్పు యొక్క సంభావ్య ప్రభావం.Int J సర్కమ్పోలార్ ఆరోగ్యం.2005;64:468–77.
బేయర్ J., గ్రీన్ NW, బ్రూక్స్ S., అలన్ IJ, రూస్ A., గోమెజ్ T. మరియు ఇతరులు.నీలి మస్సెల్స్ (మైటిలస్ ఎడులిస్ spp.) కోస్టల్ పొల్యూషన్ మానిటరింగ్‌లో సిగ్నల్ ఆర్గానిజమ్స్: ఎ రివ్యూ.మార్ ఎన్విరాన్ రెస్ 2017;130:338-65.
సిరవేగ్నా జి, మార్సోని ఎస్, సియెనా ఎస్, బార్డెల్లి ఎ. క్యాన్సర్ చికిత్సలో ద్రవ జీవాణుపరీక్ష యొక్క ఇంటిగ్రేషన్.నాట్ రెవ్ క్లీన్ ఓంకోల్.2017;14:531–48.
వాన్ JCM, మాస్సీ C, గార్సియా-కోర్బాచో J, మౌలియర్ F, బ్రెంటన్ JD, కాల్డాస్ C, మరియు ఇతరులు.లిక్విడ్ బయాప్సీ పరిపక్వత: కణితి DNA ప్రసరించడానికి అనుమతిస్తుంది.నాట్ రెవ్ క్యాన్సర్.2017;17:223–38.
మాండెల్ పి., మెటైస్ పి. మానవ ప్లాస్మాలోని న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలు.Soc Biol అనుబంధ సంస్థల సమావేశ నిమిషాలు.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. క్యాన్సర్ చికిత్స కోసం మాలిక్యులర్ మార్కర్‌గా సెల్-ఫ్రీ DNA కోసం కొత్త పాత్ర.బయోమోలార్ విశ్లేషణ యొక్క పరిమాణీకరణ.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS లిక్విడ్ బయాప్సీ క్లినిక్‌లోకి ప్రవేశిస్తుంది - అమలు సమస్యలు మరియు భవిష్యత్తు సవాళ్లు.నాట్ రెవ్ క్లిన్ ఓంకోల్.2021;18:297–312.
లో YM, కార్బెట్టా N., ఛాంబర్‌లైన్ PF, రాయ్ W., సార్జెంట్ IL, రెడ్‌మాన్ CW మరియు ఇతరులు.పిండం DNA ప్రసూతి ప్లాస్మా మరియు సీరంలో ఉంటుంది.లాన్సెట్.1997;350:485-7.
Mufarray MN, వాంగ్ RJ, షా GM, స్టీవెన్సన్ DK, క్వాక్ SR గర్భధారణ సమయంలో స్త్రీల రక్తంలో ప్రసరణ ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ ఆర్‌ఎన్‌ఏను ఉపయోగించి గర్భం యొక్క కోర్సు మరియు దాని సంక్లిష్టతలను అధ్యయనం చేస్తుంది.డోపీడియాట్రిక్స్.2020;8:605219.
ఒల్లెరిచ్ M, షేర్వుడ్ K, కియోన్ P, షుట్జ్ E, బెక్ J, స్టెగ్‌బౌర్ J, మరియు ఇతరులు.లిక్విడ్ బయాప్సీ: కిడ్నీ గ్రాఫ్ట్‌లో అలోజెనిక్ గాయాలను గుర్తించడానికి దాత కణ రహిత DNA ఉపయోగించబడుతుంది.నాట్ రెవ్ నెఫ్రోల్.2021;17:591–603.
జువాన్ FC, Lo YM ఇన్నోవేషన్స్ ఇన్ ప్రినేటల్ డయాగ్నోస్టిక్స్: మెటర్నల్ ప్లాస్మా జీనోమ్ సీక్వెన్సింగ్.అన్నా MD.2016;67:419-32.
Gu W, డెంగ్ X, లీ M, Sucu YD, అరెవాలో S, స్ట్రైక్ D, మరియు ఇతరులు.సోకిన శరీర ద్రవాల తదుపరి తరం మెటాజెనోమిక్ సీక్వెన్సింగ్‌తో వేగవంతమైన వ్యాధికారక గుర్తింపు.నాట్ మెడిసిన్.2021;27:115-24.