Nature.com ని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్ పరిమిత CSS మద్దతును కలిగి ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాలని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో అనుకూలత మోడ్‌ను నిలిపివేయండి). ఈలోగా, నిరంతర మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము సైట్‌ను శైలులు మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా రెండర్ చేస్తాము.
AFEX తో ముందే చికిత్స చేయబడిన మొక్కజొన్న స్టోవర్‌లోని నిరంతర ఒలిగోసాకరైడ్‌ల సంక్లిష్ట విశ్లేషణ కోసం కొత్త ఇమ్యునోలాజికల్ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రిక్ పద్ధతులు. లిగ్నోసెల్యులోసిక్ బయోమాస్ అనేది శిలాజ ఇంధనాలకు స్థిరమైన ప్రత్యామ్నాయం మరియు ఆహారం, ఫీడ్, ఇంధనాలు మరియు రసాయనాలు వంటి ఉత్పత్తుల ఉత్పత్తికి బయోటెక్నాలజీలను అభివృద్ధి చేయడానికి విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతుంది. ఈ సాంకేతికతలకు కీలకం ఏమిటంటే, మొక్క కణ గోడలలో ఉన్న సంక్లిష్ట కార్బోహైడ్రేట్‌లను గ్లూకోజ్, జిలోజ్ మరియు అరబినోస్ వంటి సాధారణ చక్కెరలుగా మార్చడానికి ఖర్చు-పోటీ ప్రక్రియల అభివృద్ధి. లిగ్నోసెల్యులోసిక్ బయోమాస్ చాలా మొండిగా ఉంటుంది కాబట్టి, కావలసిన ఉత్పత్తిని పొందడానికి దీనిని థర్మోకెమికల్ చికిత్సలు (ఉదా., అమ్మోనియా ఫైబర్ ఎక్స్‌ఫోలియేషన్ (AFEX), డైల్యూట్ ఆమ్లాలు (DA), అయానిక్ ద్రవాలు (IL)) మరియు జీవ చికిత్సలు (ఉదా., ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ మరియు సూక్ష్మజీవుల కిణ్వ ప్రక్రియ) కలిపి చేయాలి. అయితే, జలవిశ్లేషణ ప్రక్రియలో వాణిజ్య శిలీంధ్ర ఎంజైమ్‌లను ఉపయోగించినప్పుడు, ఏర్పడిన కరిగే చక్కెరలలో 75-85% మాత్రమే మోనోశాకరైడ్‌లు, మరియు మిగిలిన 15-25% కరిగే, ఇంట్రాక్టబుల్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లు, ఇవి సూక్ష్మజీవులకు ఎల్లప్పుడూ అందుబాటులో ఉండవు. గతంలో, మేము కార్బన్ మరియు డయాటోమాసియస్ ఎర్త్ సెపరేషన్ మరియు సైజు ఎక్స్‌క్లూజన్ క్రోమాటోగ్రఫీ కలయికను ఉపయోగించి కరిగే మొండి పట్టుదలగల ఒలిగోశాకరైడ్‌లను విజయవంతంగా వేరుచేసి శుద్ధి చేసాము మరియు వాటి ఎంజైమ్ నిరోధక లక్షణాలను కూడా పరిశోధించాము. తక్కువ DP మరియు తటస్థ ఒలిగోశాకరైడ్‌ల కంటే అధిక స్థాయి పాలిమరైజేషన్ (DP) మిథైలేటెడ్ యురోనిక్ యాసిడ్ ప్రత్యామ్నాయాలను కలిగి ఉన్న ఒలిగోసాకరైడ్‌లను వాణిజ్య ఎంజైమ్ మిశ్రమాలతో ప్రాసెస్ చేయడం చాలా కష్టమని మేము కనుగొన్నాము. మొక్కల కణ గోడలు మరియు ఎంజైమాటిక్ హైడ్రోలైసేట్‌లలో గ్లైకాన్ బంధాలను వర్గీకరించడానికి మొక్కల బయోమాస్ గ్లైకాన్‌లకు ప్రత్యేకమైన మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్ (mAbs) ఉపయోగించి గ్లైకాన్ ప్రొఫైలింగ్, మ్యాట్రిక్స్-సహాయక లేజర్ డీసార్ప్షన్ అయనీకరణ, టైమ్-ఆఫ్-ఫ్లైట్ మాస్-స్పెక్ట్రోమెట్రీ వంటి అనేక అదనపు పద్ధతుల వాడకాన్ని ఇక్కడ మేము నివేదిస్తాము. MALDI-TOF-MS) ప్రతికూల అయాన్ల ద్వితీయ క్షయం, గ్యాస్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (GC-MS) తర్వాత స్పెక్ట్రోస్కోపీ ద్వారా పొందిన స్ట్రక్చర్-ఇన్ఫర్మేటివ్ డయాగ్నస్టిక్ శిఖరాలను ఉపయోగించి డెరివేటైజేషన్‌తో మరియు లేకుండా ఒలిగోసాకరైడ్ బంధాలను వర్గీకరించడానికి ఉపయోగిస్తుంది. ఒలిగోసాకరైడ్‌ల చిన్న పరిమాణం (DP 4–20) కారణంగా, ఈ అణువులను mAb బైండింగ్ మరియు క్యారెక్టరైజేషన్ కోసం ఉపయోగించడం కష్టం. ఈ సమస్యను అధిగమించడానికి, మేము కొత్త బయోటిన్ సంయోగం-ఆధారిత ఒలిగోసాకరైడ్ స్థిరీకరణ పద్ధతిని వర్తింపజేసాము, ఇది మైక్రోప్లేట్ ఉపరితలంపై తక్కువ DP కరిగే ఒలిగోసాకరైడ్‌లలో ఎక్కువ భాగాన్ని విజయవంతంగా లేబుల్ చేసింది, దీనిని నిర్దిష్ట లిగేషన్ విశ్లేషణ కోసం అధిక త్రూపుట్ mAb వ్యవస్థలో ఉపయోగించారు. ఈ కొత్త పద్ధతి భవిష్యత్తులో మరింత అధునాతన హై త్రూపుట్ గ్లైకోమ్ అస్సేల అభివృద్ధిని సులభతరం చేస్తుంది, వీటిని రోగనిర్ధారణ ప్రయోజనాల కోసం బయోమార్కర్లలో ఉన్న ఒలిగోసాకరైడ్‌లను వేరుచేయడానికి మరియు వర్గీకరించడానికి ఉపయోగించవచ్చు.
వ్యవసాయ, అటవీ, గడ్డి మరియు కలప పదార్థాలతో కూడిన లిగ్నోసెల్యులోసిక్ బయోమాస్, అధిక విలువ కలిగిన ఉత్పత్తులను ఉత్పత్తి చేయడానికి ఆహారం, ఫీడ్, ఇంధనం మరియు రసాయన పూర్వగాములు వంటి బయో-ఆధారిత ఉత్పత్తుల ఉత్పత్తికి సంభావ్య ఫీడ్‌స్టాక్. మొక్క కణ గోడలలో ఉన్న కార్బోహైడ్రేట్‌లు (సెల్యులోజ్ మరియు హెమిసెల్యులోజ్ వంటివి) రసాయన ప్రాసెసింగ్ మరియు బయో ట్రాన్స్ఫర్మేషన్ (ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ మరియు సూక్ష్మజీవుల కిణ్వ ప్రక్రియ వంటివి) ద్వారా మోనోశాకరైడ్‌లుగా డీపాలిమరైజ్ చేయబడతాయి. సాధారణ ముందస్తు చికిత్సలలో అమ్మోనియా ఫైబర్ విస్తరణ (AFEX), డైల్యూట్ యాసిడ్ (DA), అయానిక్ ద్రవం (IL) మరియు ఆవిరి పేలుడు (SE) ఉన్నాయి, ఇవి మొక్కల కణ గోడలను తెరవడం ద్వారా లిగ్నోసెల్యులోజ్ ఉత్పత్తిని తగ్గించడానికి రసాయనాలు మరియు వేడి కలయికను ఉపయోగిస్తాయి3,4. పదార్థం యొక్క మొండితనం, 5. వాణిజ్య క్రియాశీల కార్బోహైడ్రేట్ కలిగిన ఎంజైమ్‌లు (CAZymes) మరియు బయో-ఆధారిత ఇంధనాలు మరియు రసాయనాలను ఉత్పత్తి చేయడానికి ట్రాన్స్‌జెనిక్ ఈస్ట్‌లు లేదా బ్యాక్టీరియాను ఉపయోగించి సూక్ష్మజీవుల కిణ్వ ప్రక్రియను ఉపయోగించి అధిక ఘనపదార్థాల లోడ్ వద్ద ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ జరుగుతుంది 6 .
వాణిజ్య ఎంజైమ్‌లలోని CAZymes అనేవి ఎంజైమ్‌ల సంక్లిష్ట మిశ్రమంతో కూడి ఉంటాయి, ఇవి సంక్లిష్ట కార్బోహైడ్రేట్-చక్కెర బంధాలను సినర్జిస్టిక్‌గా విడదీసి మోనోశాకరైడ్‌లను ఏర్పరుస్తాయి2,7. మేము ఇంతకు ముందు నివేదించినట్లుగా, కార్బోహైడ్రేట్‌లతో లిగ్నిన్ యొక్క సుగంధ పాలిమర్‌ల సంక్లిష్ట నెట్‌వర్క్ వాటిని చాలా అతుక్కోలేనిదిగా చేస్తుంది, ఇది అసంపూర్ణ చక్కెర మార్పిడికి దారితీస్తుంది, ప్రీట్రీట్ చేయబడిన బయోమాస్ యొక్క ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ సమయంలో ఉత్పత్తి చేయబడని 15-25% సెక్స్ ఒలిగోసాకరైడ్‌లను కూడబెట్టుకుంటుంది. వివిధ బయోమాస్ ప్రీట్రీట్‌మెంట్ పద్ధతులతో ఇది ఒక సాధారణ సమస్య. ఈ అడ్డంకికి కొన్ని కారణాలు జలవిశ్లేషణ సమయంలో ఎంజైమ్ నిరోధం లేదా మొక్కల బయోమాస్‌లో చక్కెర బంధాలను విచ్ఛిన్నం చేయడానికి అవసరమైన ముఖ్యమైన ఎంజైమ్‌లు లేకపోవడం లేదా తక్కువ స్థాయిలో ఉండటం. ఒలిగోసాకరైడ్‌లలోని చక్కెర బంధాలు వంటి చక్కెరల కూర్పు మరియు నిర్మాణ లక్షణాలను అర్థం చేసుకోవడం, జలవిశ్లేషణ సమయంలో చక్కెర మార్పిడిని మెరుగుపరచడంలో మాకు సహాయపడుతుంది, బయోటెక్నాలజీ ప్రక్రియలను పెట్రోలియం-ఉత్పన్న ఉత్పత్తులతో ఖర్చు-పోటీగా చేస్తుంది.
కార్బోహైడ్రేట్ల నిర్మాణాన్ని నిర్ణయించడం సవాలుతో కూడుకున్నది మరియు లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (LC)11,12, న్యూక్లియర్ మాగ్నెటిక్ రెసొనెన్స్ స్పెక్ట్రోస్కోపీ (NMR)13, క్యాపిల్లరీ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ (CE)14,15,16 మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (MS)17 వంటి పద్ధతుల కలయిక అవసరం. ,పద్దెనిమిది. లేజర్ డీసార్ప్షన్‌తో టైమ్-ఆఫ్-ఫ్లైట్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ మరియు మ్యాట్రిక్స్ (MALDI-TOF-MS) ఉపయోగించి అయనీకరణ వంటి MS పద్ధతులు కార్బోహైడ్రేట్ నిర్మాణాలను గుర్తించడానికి బహుముఖ పద్ధతి. ఇటీవల, సోడియం అయాన్ అడాక్ట్‌ల యొక్క ఘర్షణ-ప్రేరిత డిస్సోసియేషన్ (CID) టెన్డం MS అనేది ఒలిగోసాకరైడ్ అటాచ్‌మెంట్ స్థానాలు, అనోమెరిక్ కాన్ఫిగరేషన్‌లు, సీక్వెన్స్‌లు మరియు బ్రాంచింగ్ స్థానాలకు సంబంధించిన వేలిముద్రలను గుర్తించడానికి విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతోంది 20, 21 .
కార్బోహైడ్రేట్ బంధాలను లోతుగా గుర్తించడానికి గ్లైకాన్ విశ్లేషణ ఒక అద్భుతమైన సాధనం22. ఈ పద్ధతి సంక్లిష్ట కార్బోహైడ్రేట్ లింకేజీలను అర్థం చేసుకోవడానికి ప్రోబ్స్‌గా మొక్క కణ గోడ గ్లైకాన్‌కు దర్శకత్వం వహించిన మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్ (mAbs) ను ఉపయోగిస్తుంది. ప్రపంచవ్యాప్తంగా 250 కంటే ఎక్కువ mAbs అందుబాటులో ఉన్నాయి, వివిధ సాచరైడ్‌లను ఉపయోగించి వివిధ లీనియర్ మరియు బ్రాంచ్డ్ ఒలిగోసాకరైడ్‌లకు వ్యతిరేకంగా రూపొందించబడ్డాయి24. మొక్క కణ రకం, అవయవం, వయస్సు, అభివృద్ధి దశ మరియు పెరుగుదల వాతావరణం25,26 ఆధారంగా గణనీయమైన తేడాలు ఉన్నందున, మొక్క కణ గోడ యొక్క నిర్మాణం, కూర్పు మరియు మార్పులను వర్గీకరించడానికి అనేక mAbs విస్తృతంగా ఉపయోగించబడ్డాయి. ఇటీవల, ఈ పద్ధతిని మొక్క మరియు జంతు వ్యవస్థలలో వెసికిల్ జనాభాను మరియు ఉపకణ గుర్తులు, అభివృద్ధి దశలు లేదా పర్యావరణ ఉద్దీపనల ద్వారా నిర్ణయించబడిన గ్లైకాన్ రవాణాలో వాటి సంబంధిత పాత్రలను అర్థం చేసుకోవడానికి మరియు ఎంజైమాటిక్ కార్యకలాపాలను నిర్ణయించడానికి ఉపయోగించబడింది. గుర్తించబడిన గ్లైకాన్‌లు మరియు జిలాన్‌ల యొక్క కొన్ని విభిన్న నిర్మాణాలలో పెక్టిన్ (P), జిలాన్ (X), మన్నన్ (M), జిలోగ్లుకాన్‌లు (XylG), మిశ్రమ బంధ గ్లూకాన్‌లు (MLG), అరబినోక్సిలాన్ (ArbX), గెలాక్టోమన్నన్ (GalG), గ్లూకురోనిక్ ఆమ్లం-అరబినోక్సిలాన్ (GArbX) మరియు అరబినో-గెలాక్టాన్ (ArbG)29 ఉన్నాయి.
అయితే, ఈ పరిశోధన ప్రయత్నాలన్నీ ఉన్నప్పటికీ, అధిక ఘనపదార్థాల లోడ్ (HSL) జలవిశ్లేషణ సమయంలో ఒలిగోసాకరైడ్ చేరడం యొక్క స్వభావంపై కొన్ని అధ్యయనాలు మాత్రమే దృష్టి సారించాయి, వీటిలో ఒలిగోసాకరైడ్ విడుదల, జలవిశ్లేషణ సమయంలో ఒలిగోమెరిక్ గొలుసు పొడవు మార్పులు, వివిధ తక్కువ DP పాలిమర్లు మరియు వాటి వక్రతలు ఉన్నాయి. పంపిణీలు 30,31,32. ఇంతలో, గ్లైకాన్ విశ్లేషణ గ్లైకాన్ నిర్మాణం యొక్క సమగ్ర విశ్లేషణకు ఉపయోగకరమైన సాధనంగా నిరూపించబడినప్పటికీ, యాంటీబాడీ పద్ధతులను ఉపయోగించి నీటిలో కరిగే తక్కువ DP ఒలిగోసాకరైడ్లను అంచనా వేయడం కష్టం. 5-10 kDa కంటే తక్కువ పరమాణు బరువు కలిగిన చిన్న DP ఒలిగోసాకరైడ్లు ELISA ప్లేట్లు 33, 34 కు బంధించవు మరియు యాంటీబాడీ జోడించే ముందు కొట్టుకుపోతాయి.
ఇక్కడ, మొదటిసారిగా, మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీలను ఉపయోగించి అవిడిన్-కోటెడ్ ప్లేట్లపై ELISA అస్సేను ప్రదర్శిస్తాము, కరిగే వక్రీభవన ఒలిగోసాకరైడ్ల కోసం ఒక-దశ బయోటినిలేషన్ విధానాన్ని గ్లైకోమ్ విశ్లేషణతో కలుపుతాము. గ్లైకోమ్ విశ్లేషణకు మా విధానం MALDI-TOF-MS మరియు GC-MS ఆధారిత హైడ్రోలైజ్డ్ చక్కెర కూర్పుల ఉత్పన్నాన్ని ఉపయోగించి పరిపూరక ఒలిగోసాకరైడ్ లింకేజీల విశ్లేషణ ద్వారా ధృవీకరించబడింది. ఈ వినూత్న విధానాన్ని భవిష్యత్తులో అధిక-త్రూపుట్ పద్ధతిగా అభివృద్ధి చేయవచ్చు మరియు బయోమెడికల్ పరిశోధనలో విస్తృత అనువర్తనాన్ని కనుగొనవచ్చు35.
గ్లైకోసైలేషన్ వంటి ఎంజైమ్‌లు మరియు యాంటీబాడీల యొక్క అనువాదానంతర మార్పులు, 36 వాటి జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను ప్రభావితం చేస్తాయి. ఉదాహరణకు, సీరం ప్రోటీన్ల గ్లైకోసైలేషన్‌లో మార్పులు ఇన్ఫ్లమేటరీ ఆర్థరైటిస్‌లో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తాయి మరియు గ్లైకోసైలేషన్‌లో మార్పులు డయాగ్నస్టిక్ మార్కర్‌లుగా ఉపయోగించబడతాయి37. జీర్ణశయాంతర ప్రేగు మరియు కాలేయం యొక్క దీర్ఘకాలిక ఇన్ఫ్లమేటరీ వ్యాధులు, వైరల్ ఇన్ఫెక్షన్లు, అండాశయం, రొమ్ము మరియు ప్రోస్టేట్ క్యాన్సర్‌లతో సహా వివిధ వ్యాధులలో వివిధ గ్లైకాన్‌లు తక్షణమే కనిపిస్తాయని సాహిత్యంలో నివేదించబడింది38,39,40. యాంటీబాడీ-ఆధారిత గ్లైకాన్ ELISA పద్ధతులను ఉపయోగించి గ్లైకాన్‌ల నిర్మాణాన్ని అర్థం చేసుకోవడం సంక్లిష్టమైన MS పద్ధతులను ఉపయోగించకుండా వ్యాధి నిర్ధారణలో అదనపు విశ్వాసాన్ని అందిస్తుంది.
మా మునుపటి అధ్యయనం ప్రకారం, ముందస్తు చికిత్స మరియు ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ తర్వాత కూడా మొండి ఒలిగోసాకరైడ్‌లు హైడ్రోలైజ్ చేయబడకుండానే ఉన్నాయని తేలింది (మూర్తి 1). గతంలో ప్రచురించబడిన మా పనిలో, AFEX-ప్రీట్రీట్డ్ కార్న్ స్టోవర్ హైడ్రోలైజేట్ (ACSH)8 నుండి ఒలిగోసాకరైడ్‌లను వేరుచేయడానికి మేము యాక్టివేటెడ్ చార్‌కోల్ సాలిడ్-ఫేజ్ ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ పద్ధతిని అభివృద్ధి చేసాము. ప్రారంభ వెలికితీత మరియు విభజన తర్వాత, ఒలిగోసాకరైడ్‌లను సైజు ఎక్స్‌క్లూజన్ క్రోమాటోగ్రఫీ (SEC) ద్వారా మరింత భిన్నం చేసి, పరమాణు బరువు క్రమంలో సేకరించారు. వివిధ ముందస్తు చికిత్సల నుండి విడుదలైన చక్కెర మోనోమర్‌లు మరియు ఒలిగోమర్‌లను చక్కెర కూర్పు విశ్లేషణ ద్వారా విశ్లేషించారు. వివిధ ముందస్తు చికిత్స పద్ధతుల ద్వారా పొందిన చక్కెర ఒలిగోమర్‌ల కంటెంట్‌ను పోల్చినప్పుడు, మొండి ఒలిగోసాకరైడ్‌ల ఉనికి బయోమాస్‌ను మోనోసాకరైడ్‌లుగా మార్చడంలో ఒక సాధారణ సమస్య మరియు కనీసం 10-15% మరియు 18% వరకు చక్కెర దిగుబడి తగ్గడానికి దారితీస్తుంది. US. ఈ పద్ధతి ఒలిగోసాకరైడ్ భిన్నాల యొక్క మరింత పెద్ద-స్థాయి ఉత్పత్తికి ఉపయోగించబడుతుంది. ఫలితంగా వచ్చిన ACH మరియు వివిధ పరమాణు బరువులతో దాని తదుపరి భిన్నాలను ఈ పనిలో ఒలిగోసాకరైడ్‌ల వర్గీకరణ కోసం ప్రయోగాత్మక పదార్థంగా ఉపయోగించారు.
ప్రీ-ట్రీట్మెంట్ మరియు ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ తర్వాత, నిరంతర ఒలిగోసాకరైడ్లు జలవిశ్లేషణ చెందకుండానే మిగిలిపోయాయి. ఇక్కడ (A) అనేది ఒలిగోసాకరైడ్ విభజన పద్ధతి, దీనిలో ఒలిగోసాకరైడ్లు AFEX-ప్రీ-ట్రీట్డ్ కార్న్ స్టోవర్ హైడ్రోలైజేట్ (ACSH) నుండి యాక్టివేటెడ్ కార్బన్ మరియు డయాటోమాసియస్ ఎర్త్ యొక్క ప్యాక్డ్ బెడ్ ఉపయోగించి వేరు చేయబడతాయి; (B) ఒలిగోసాకరైడ్లను వేరు చేసే పద్ధతి. ఒలిగోసాకరైడ్లను సైజు ఎక్స్‌క్లూజన్ క్రోమాటోగ్రఫీ (SEC) ద్వారా మరింత వేరు చేశారు; (C) వివిధ ప్రీ-ట్రీట్మెంట్ల నుండి విడుదల చేయబడిన సాకరైడ్ మోనోమర్లు మరియు ఒలిగోమర్లు (పలుచన ఆమ్లం: DA, అయానిక్ ద్రవం: IL మరియు AFEX). ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ పరిస్థితులు: 25% (w/w) అధిక ఘనపదార్థాల లోడింగ్ (సుమారు 8% గ్లూకాన్ లోడింగ్), 96 గంటల జలవిశ్లేషణ, 20 mg/g వాణిజ్య ఎంజైమ్ లోడింగ్ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 నిష్పత్తి) మరియు (D) AFEX ప్రీ-ట్రీట్డ్ కార్న్ స్టోవర్ (ACS) నుండి విడుదలయ్యే చక్కెర మోనోమర్లు మరియు గ్లూకోజ్, జిలోజ్ మరియు అరబినోస్ యొక్క ఒలిగోమర్లు.
ఘన బయోమాస్ అవశేషాల నుండి వేరుచేయబడిన సారాలలో గ్లైకాన్‌ల సమగ్ర నిర్మాణ విశ్లేషణకు గ్లైకాన్ విశ్లేషణ ఉపయోగకరమైన సాధనంగా నిరూపించబడింది. అయితే, ఈ సాంప్రదాయ పద్ధతిని ఉపయోగించి నీటిలో కరిగే సాచరైడ్‌లు తక్కువగా ప్రాతినిధ్యం వహిస్తాయి41 ఎందుకంటే తక్కువ మాలిక్యులర్ బరువు గల ఒలిగోసాకరైడ్‌లు ELISA ప్లేట్‌లపై స్థిరీకరించడం కష్టం మరియు యాంటీబాడీ జోడించే ముందు కడిగివేయబడతాయి. అందువల్ల, యాంటీబాడీ బైండింగ్ మరియు క్యారెక్టరైజేషన్ కోసం, అవిడిన్-కోటెడ్ ELISA ప్లేట్‌లపై కరిగే, నాన్-కాంప్లైంట్ ఒలిగోసాకరైడ్‌లను పూత పూయడానికి ఒక-దశ బయోటినిలేషన్ పద్ధతిని ఉపయోగించారు. ఈ పద్ధతిని మేము గతంలో ఉత్పత్తి చేసిన ACSH మరియు దాని పరమాణు బరువు (లేదా పాలిమరైజేషన్ డిగ్రీ, DP) ఆధారంగా ఒక భిన్నాన్ని ఉపయోగించి పరీక్షించారు. కార్బోహైడ్రేట్ యొక్క తగ్గించే చివర బయోటిన్-LC-హైడ్రాజైడ్‌ను జోడించడం ద్వారా ఒలిగోసాకరైడ్ బైండింగ్ అనుబంధాన్ని పెంచడానికి ఒక-దశ బయోటినిలేషన్ ఉపయోగించబడింది (Fig. 2). ద్రావణంలో, తగ్గించే చివరన ఉన్న హెమియాసెటల్ సమూహం బయోటిన్-LC-హైడ్రాజైడ్ యొక్క హైడ్రాజైడ్ సమూహంతో చర్య జరిపి హైడ్రాజోన్ బంధాన్ని ఏర్పరుస్తుంది. NaCNBH3 అనే తగ్గింపు ఏజెంట్ సమక్షంలో, హైడ్రాజోన్ బంధం స్థిరమైన బయోటినిలేటెడ్ తుది ఉత్పత్తిగా తగ్గించబడుతుంది. చక్కెర తగ్గింపు ముగింపు మార్పుతో, తక్కువ DP ఒలిగోసాకరైడ్‌లను ELISA ప్లేట్‌లకు బంధించడం సాధ్యమైంది మరియు మా అధ్యయనంలో ఇది గ్లైకాన్-లక్ష్యంగా ఉన్న mAbs ఉపయోగించి అవిడిన్-పూత ప్లేట్‌లపై జరిగింది.
బయోటినిలేటెడ్ ఒలిగోసాకరైడ్ల కోసం ELISA ఆధారంగా మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీల స్క్రీనింగ్. ఇక్కడ (A) న్యూట్రాఅవిడిన్ పూత ప్లేట్లపై గ్లైకాన్-టార్గెటెడ్ mAbsతో ఒలిగోసాకరైడ్ల బయోటినిలేషన్ మరియు తదుపరి ELISA స్క్రీనింగ్ కలిపి మరియు (B) ప్రతిచర్య ఉత్పత్తుల బయోటినిలేషన్ కోసం ఒక-దశ విధానాన్ని చూపిస్తుంది.
ఆ తరువాత ఒలిగోసాకరైడ్-కంజుగేటెడ్ యాంటీబాడీస్‌తో కూడిన అవిడిన్-పూతతో కూడిన ప్లేట్‌లను ప్రాథమిక మరియు ద్వితీయ యాంటీబాడీలకు జోడించి, కాంతి మరియు సమయ-సున్నితమైన మాధ్యమంలో కడుగుతారు. యాంటీబాడీ బైండింగ్ పూర్తయిన తర్వాత, ప్లేట్‌ను పొదిగించడానికి TMB సబ్‌స్ట్రేట్‌ను జోడించండి. చివరకు సల్ఫ్యూరిక్ ఆమ్లంతో ప్రతిచర్య ఆగిపోయింది. యాంటీబాడీ-నిర్దిష్ట క్రాస్-లింకింగ్‌ను గుర్తించడానికి ప్రతి యాంటీబాడీ యొక్క బైండింగ్ బలాన్ని నిర్ణయించడానికి ఇంక్యుబేటెడ్ ప్లేట్‌లను ELISA రీడర్ ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. ప్రయోగం యొక్క వివరాలు మరియు పారామితుల కోసం, సంబంధిత విభాగం “మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్” చూడండి.
ACSH లో ఉన్న కరిగే ఒలిగోసాకరైడ్‌లను అలాగే లిగ్నోసెల్యులోసిక్ హైడ్రోలైసేట్‌ల నుండి వేరుచేయబడిన ముడి మరియు శుద్ధి చేయబడిన ఒలిగోసాకరైడ్ భిన్నాలలో వర్గీకరించడం ద్వారా నిర్దిష్ట అనువర్తనాల కోసం ఈ కొత్తగా అభివృద్ధి చేయబడిన పద్ధతి యొక్క ప్రయోజనాన్ని మేము ప్రదర్శిస్తాము. చిత్రం 3లో చూపినట్లుగా, బయోఅసిలేటెడ్ గ్లైకోమ్ అస్సే పద్ధతులను ఉపయోగించి ACSH లో గుర్తించబడిన అత్యంత సాధారణ ఎపిటోప్-ప్రత్యామ్నాయ జిలాన్‌లు సాధారణంగా యూరోనిక్ (U) లేదా మిథైలురోనిక్ (MeU) మరియు పెక్టిక్ అరబినోగలాక్టాన్‌లు. వాటిలో ఎక్కువ భాగం నాన్-హైడ్రోలైజ్డ్ ఘనపదార్థాల (UHS) గ్లైకాన్‌ల విశ్లేషణపై మా మునుపటి అధ్యయనంలో కూడా కనుగొనబడ్డాయి43.
సెల్ వాల్ గ్లైకాన్‌కు దర్శకత్వం వహించిన మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీని ఉపయోగించి రీకాల్సిట్రాంట్ ఒలిగోసాకరైడ్ ఎపిటోప్‌లను గుర్తించడం. "తటస్థ" భిన్నం ACN భిన్నం మరియు "ఆమ్ల" భిన్నం FA భిన్నం. హీట్‌మ్యాప్‌లోని ప్రకాశవంతమైన ఎరుపు రంగులు అధిక ఎపిటోప్ కంటెంట్‌ను సూచిస్తాయి మరియు ప్రకాశవంతమైన నీలం రంగులు ఖాళీ నేపథ్యాన్ని సూచిస్తాయి. స్కేల్‌లోని రంగు విలువలు N=2 సూత్రీకరణల కోసం ముడి OD విలువలపై ఆధారపడి ఉంటాయి. ప్రతిరోధకాల ద్వారా గుర్తించబడిన ప్రధాన ఎపిటోప్‌లు కుడి వైపున చూపబడ్డాయి.
పరీక్షించబడిన వాణిజ్య ఎంజైమ్ మిశ్రమంలో అత్యంత సాధారణ సెల్యులేజ్‌లు మరియు హెమిసెల్యులేజ్‌ల ద్వారా ఈ నాన్-సెల్యులోజ్ నిర్మాణాలను విడదీయలేము, ఇందులో సాధారణంగా ఉపయోగించే వాణిజ్య ఎంజైమ్‌లు ఉంటాయి. అందువల్ల, వాటి జలవిశ్లేషణకు కొత్త సహాయక ఎంజైమ్‌లు అవసరం. అవసరమైన నాన్-సెల్యులోజ్ అనుబంధ ఎంజైమ్‌లు లేకుండా, ఈ నాన్-సెల్యులోజ్ బంధాలు మోనోశాకరైడ్‌లుగా పూర్తిగా మారకుండా నిరోధిస్తాయి, వాటి మాతృ చక్కెర పాలిమర్‌లను విస్తృతంగా చిన్న ముక్కలుగా హైడ్రోలైజ్ చేసి వాణిజ్య ఎంజైమ్ మిశ్రమాలను ఉపయోగించి కరిగించినప్పటికీ.
సిగ్నల్ పంపిణీ మరియు దాని బైండింగ్ బలం యొక్క మరింత అధ్యయనం ప్రకారం, డైమర్‌లలో తక్కువ DP భిన్నాల (D, E, F, DP) కంటే అధిక DP చక్కెర భిన్నాలలో (A, B, C, DP 20+ వరకు) బైండింగ్ ఎపిటోప్‌లు తక్కువగా ఉన్నాయని తేలింది (చిత్రం 1). తటస్థ భాగాల కంటే సెల్యులోజ్ కాని ఎపిటోప్‌లలో ఆమ్ల శకలాలు ఎక్కువగా కనిపిస్తాయి. ఈ దృగ్విషయాలు మా మునుపటి అధ్యయనంలో గమనించిన నమూనాకు అనుగుణంగా ఉంటాయి, ఇక్కడ అధిక DP మరియు ఆమ్ల భాగాలు ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణకు ఎక్కువ నిరోధకతను కలిగి ఉన్నాయి. అందువల్ల, సెల్యులోజ్ కాని గ్లైకాన్ ఎపిటోప్‌లు మరియు U మరియు MeU ప్రత్యామ్నాయాల ఉనికి ఒలిగోసాకరైడ్‌ల స్థిరత్వానికి బాగా దోహదపడుతుంది. తక్కువ DP ఒలిగోసాకరైడ్‌లకు బైండింగ్ మరియు గుర్తింపు సామర్థ్యం సమస్యాత్మకంగా ఉంటుందని గమనించాలి, ప్రత్యేకించి ఎపిటోప్ డైమెరిక్ లేదా ట్రైమెరిక్ ఒలిగోసాకరైడ్ అయితే. వేర్వేరు పొడవుల వాణిజ్య ఒలిగోసాకరైడ్‌లను ఉపయోగించి దీనిని పరీక్షించవచ్చు, ప్రతి ఒక్కటి నిర్దిష్ట mAbకి బంధించే ఒక ఎపిటోప్‌ను మాత్రమే కలిగి ఉంటుంది.
అందువల్ల, నిర్మాణ-నిర్దిష్ట ప్రతిరోధకాల వాడకం కొన్ని రకాల రీకాల్సిట్రాంట్ బంధాలను వెల్లడించింది. ఉపయోగించిన యాంటీబాడీ రకం, తగిన లిగేషన్ నమూనా మరియు అది ఉత్పత్తి చేసే సిగ్నల్ బలం (చాలా మరియు తక్కువ సమృద్ధిగా) ఆధారంగా, కొత్త ఎంజైమ్‌లను గుర్తించవచ్చు మరియు మరింత పూర్తి గ్లైకోకన్వర్షన్ కోసం ఎంజైమ్ మిశ్రమానికి సెమీ-క్వాంటిటేటివ్‌గా జోడించవచ్చు. ACSH ఒలిగోసాకరైడ్‌ల విశ్లేషణను ఉదాహరణగా తీసుకుంటే, ప్రతి బయోమాస్ పదార్థానికి గ్లైకాన్ బంధాల డేటాబేస్‌ను మనం సృష్టించవచ్చు. ప్రతిరోధకాల యొక్క విభిన్న అనుబంధాన్ని పరిగణనలోకి తీసుకోవాలి మరియు వాటి అనుబంధం తెలియకపోతే, ఇది వివిధ ప్రతిరోధకాల సంకేతాలను పోల్చినప్పుడు కొన్ని ఇబ్బందులను సృష్టిస్తుందని ఇక్కడ గమనించాలి. అదనంగా, గ్లైకాన్ బంధాల పోలిక ఒకే యాంటీబాడీ కోసం నమూనాల మధ్య ఉత్తమంగా పని చేస్తుంది. ఈ మొండి బంధాలను CAZyme డేటాబేస్‌కు అనుసంధానించవచ్చు, దాని నుండి మనం ఎంజైమ్‌లను గుర్తించవచ్చు, అభ్యర్థి ఎంజైమ్‌లను ఎంచుకోవచ్చు మరియు బంధాన్ని విచ్ఛిన్నం చేసే ఎంజైమ్‌ల కోసం పరీక్షించవచ్చు లేదా బయోఫైనరీలలో ఉపయోగించడానికి ఈ ఎంజైమ్‌లను వ్యక్తీకరించడానికి సూక్ష్మజీవుల వ్యవస్థలను అభివృద్ధి చేయవచ్చు44.
లిగ్నోసెల్యులోసిక్ హైడ్రోలైసేట్‌లలో ఉన్న తక్కువ మాలిక్యులర్ బరువు గల ఒలిగోసాకరైడ్‌లను వర్గీకరించడానికి రోగనిరోధక పద్ధతులు ప్రత్యామ్నాయ పద్ధతులను ఎలా పూర్తి చేస్తాయో అంచనా వేయడానికి, మేము అదే ప్యానెల్ (Fig. 5) ఒలిగోసాకరైడ్ భాగంలో MALDI (Fig. 4, S1-S8) మరియు GC-MS ఆధారంగా TMS-ఉత్పన్నమైన సాచరైడ్‌ల విశ్లేషణను నిర్వహించాము. ఒలిగోసాకరైడ్ అణువుల ద్రవ్యరాశి పంపిణీ ఉద్దేశించిన నిర్మాణంతో సరిపోతుందో లేదో పోల్చడానికి MALDI ఉపయోగించబడుతుంది. చిత్రం 4 తటస్థ భాగాలు ACN-A మరియు ACN-B యొక్క MSని చూపిస్తుంది. ACN-A విశ్లేషణ DP 4–8 (Fig. 4) నుండి DP 22 (Fig. S1) వరకు పెంటోస్ చక్కెరల శ్రేణిని నిర్ధారించింది, దీని బరువులు MeU-xylan ఒలిగోసాకరైడ్‌లకు అనుగుణంగా ఉంటాయి. ACN-B విశ్లేషణ DP 8-15తో పెంటోస్ మరియు గ్లూకోక్సిలాన్ సిరీస్‌ను నిర్ధారించింది. Figure S3 వంటి అనుబంధ పదార్థంలో, FA-C ఆమ్ల భాగం ద్రవ్యరాశి పంపిణీ పటాలు 8-15 DP కలిగిన (Me)U ప్రత్యామ్నాయ పెంటోస్ చక్కెరల శ్రేణిని చూపుతాయి, ఇవి ELISA-ఆధారిత mAb స్క్రీనింగ్‌లో కనిపించే ప్రత్యామ్నాయ జిలాన్‌లకు అనుగుణంగా ఉంటాయి. ఎపిటోప్‌లు స్థిరంగా ఉంటాయి.
ACS లో కరిగే నాన్-కంప్లైంట్ ఒలిగోసాకరైడ్ల MALDI-MS స్పెక్ట్రం ఉంది. ఇక్కడ, (A) మిథైలేటెడ్ యురోనిక్ ఆమ్లం (DP 4-8) కలిగిన ACN-A తక్కువ బరువు శ్రేణి భిన్నాలు గ్లూకురోక్సిలాన్ ఒలిగోసాకరైడ్లను ప్రత్యామ్నాయం చేశాయి మరియు (B) గ్లూకురోక్సిలాన్ (DP 8-15) తో ప్రత్యామ్నాయం చేయబడిన ACN-B జిలాన్ మరియు మిథైలేటెడ్ యురోనిక్ ఆమ్లం ఒలిగోసాకరైడ్లు.
వక్రీభవన ఒలిగోసాకరైడ్ల గ్లైకాన్ అవశేషాల కూర్పు విశ్లేషణ. ఇక్కడ (A) GC-MS విశ్లేషణను ఉపయోగించి పొందిన వివిధ ఒలిగోసాకరైడ్ భిన్నాల TMS శాకరైడ్ కూర్పు. (B) ఒలిగోసాకరైడ్లలో ఉన్న వివిధ TMS-ఉత్పన్న చక్కెరల నిర్మాణాలు. ACN - తటస్థ ఒలిగోసాకరైడ్లను కలిగి ఉన్న అసిటోనిట్రైల్ భిన్నం మరియు FA - ఆమ్ల ఒలిగోసాకరైడ్లను కలిగి ఉన్న ఫెరులిక్ ఆమ్ల భిన్నం.
Figure S9 లో చూపిన విధంగా ఒలిగోసాకరైడ్ భిన్నం యొక్క LC-MS విశ్లేషణ నుండి మరొక ఆసక్తికరమైన ముగింపు తీసుకోబడింది (పద్ధతులను ఎలక్ట్రానిక్ సప్లిమెంటరీ మెటీరియల్‌లో చూడవచ్చు). ACN-B భిన్నం యొక్క లిగేషన్ సమయంలో హెక్సోస్ మరియు -OAc సమూహాల శకలాలు పదేపదే గమనించబడ్డాయి. ఈ అన్వేషణ గ్లైకోమ్ మరియు MALDI-TOF విశ్లేషణలో గమనించిన ఫ్రాగ్మెంటేషన్‌ను నిర్ధారించడమే కాకుండా, ప్రీ-ట్రీట్ చేయబడిన లిగ్నోసెల్యులోసిక్ బయోమాస్‌లో సంభావ్య కార్బోహైడ్రేట్ ఉత్పన్నాల గురించి కొత్త సమాచారాన్ని కూడా అందిస్తుంది.
మేము TMS గ్లైకాన్ ఉత్పన్నం ఉపయోగించి ఒలిగోసాకరైడ్ భిన్నాల గ్లైకాన్ కూర్పు విశ్లేషణను కూడా నిర్వహించాము. GC-MS ఉపయోగించి, ఒలిగోసాకరైడ్ భిన్నంలో నాడీ (ఉత్పన్నం కాని) మరియు ఆమ్ల చక్కెరల (GluA మరియు GalA) కూర్పును మేము నిర్ణయించాము (Fig. 5). గ్లూకురోనిక్ ఆమ్లం ఆమ్ల భాగాలు C మరియు D లలో కనిపిస్తుంది, అయితే గెలాక్టురోనిక్ ఆమ్లం ఆమ్ల భాగాలు A మరియు B లలో కనిపిస్తుంది, ఈ రెండూ ఆమ్ల చక్కెరల యొక్క అధిక DP భాగాలు. ఈ ఫలితాలు మా ELISA మరియు MALDI డేటాను నిర్ధారించడమే కాకుండా, ఒలిగోసాకరైడ్ చేరడంపై మా మునుపటి అధ్యయనాలకు కూడా అనుగుణంగా ఉంటాయి. అందువల్ల, ఒలిగోసాకరైడ్ల బయోటినిలేషన్ మరియు తదుపరి ELISA స్క్రీనింగ్ ఉపయోగించి ఆధునిక రోగనిరోధక పద్ధతులు వివిధ జీవ నమూనాలలో కరిగే రీకాల్సిట్రాంట్ ఒలిగోసాకరైడ్లను గుర్తించడానికి సరిపోతాయని మేము నమ్ముతున్నాము.
ELISA-ఆధారిత mAb స్క్రీనింగ్ పద్ధతులు అనేక విభిన్న పద్ధతుల ద్వారా ధృవీకరించబడినందున, ఈ కొత్త పరిమాణాత్మక పద్ధతి యొక్క సామర్థ్యాన్ని మేము మరింత అన్వేషించాలనుకుంటున్నాము. రెండు వాణిజ్య ఒలిగోసాకరైడ్లు, xylohexaccharide oligosaccharide (XHE) మరియు 23-α-L-arabinosyl-xylotriose (A2XX), సెల్ వాల్ గ్లైకాన్‌ను లక్ష్యంగా చేసుకుని కొత్త mAb విధానాన్ని ఉపయోగించి కొనుగోలు చేయబడ్డాయి మరియు పరీక్షించబడ్డాయి. బయోటినిలేటెడ్ బైండింగ్ సిగ్నల్ మరియు ఒలిగోసాకరైడ్ గాఢత యొక్క లాగ్ గాఢత మధ్య సరళ సహసంబంధాన్ని చిత్రం 6 చూపిస్తుంది, ఇది లాంగ్‌ముయిర్ అధిశోషణ నమూనాను సూచిస్తుంది. mAbsలో, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, మరియు CCRC-M151 XHEతో సహసంబంధం కలిగి ఉన్నాయి మరియు CCRC-M108, CCRC-M109, మరియు LM11 1 nm నుండి 100 నానో పరిధిలో A2XXతో సహసంబంధం కలిగి ఉన్నాయి. ప్రయోగం సమయంలో యాంటీబాడీల పరిమిత లభ్యత కారణంగా, ప్రతి ఒలిగోసాకరైడ్ గాఢతతో పరిమిత ప్రయోగాలు జరిగాయి. కొన్ని యాంటీబాడీలు సబ్‌స్ట్రేట్ వలె అదే ఒలిగోసాకరైడ్‌కు చాలా భిన్నంగా స్పందిస్తాయని ఇక్కడ గమనించాలి, బహుశా అవి కొద్దిగా భిన్నమైన ఎపిటోప్‌లకు బంధిస్తాయి మరియు చాలా భిన్నమైన బైండింగ్ అనుబంధాలను కలిగి ఉండవచ్చు. కొత్త mAb విధానాన్ని నిజమైన నమూనాలకు వర్తింపజేసినప్పుడు ఖచ్చితమైన ఎపిటోప్ గుర్తింపు యొక్క విధానాలు మరియు చిక్కులు చాలా క్లిష్టంగా ఉంటాయి.
వివిధ గ్లైకాన్-టార్గెటింగ్ mAbs యొక్క గుర్తింపు పరిధిని నిర్ణయించడానికి రెండు వాణిజ్య ఒలిగోసాకరైడ్‌లను ఉపయోగించారు. ఇక్కడ, ఒలిగోసాకరైడ్ గాఢత యొక్క లాగ్ గాఢతతో సరళ సహసంబంధాలు mAbతో (A) XHE మరియు mAbతో (B) A2XX కోసం లాంగ్‌ముయిర్ అధిశోషణ నమూనాలను సూచిస్తాయి. సంబంధిత ఎపిటోప్‌లు పరీక్షలో సబ్‌స్ట్రేట్‌లుగా ఉపయోగించే వాణిజ్య ఒలిగోసాకరైడ్‌ల నిర్మాణాలను సూచిస్తాయి.
గ్లైకాన్-టార్గెటెడ్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్ (గ్లైకోకోమిక్ విశ్లేషణ లేదా ELISA-ఆధారిత mAb స్క్రీనింగ్) వాడకం అనేది మొక్కల బయోమాస్‌ను తయారు చేసే ప్రధాన సెల్ వాల్ గ్లైకాన్‌ల యొక్క లోతైన వర్గీకరణకు ఒక శక్తివంతమైన సాధనం. అయితే, క్లాసికల్ గ్లైకాన్ విశ్లేషణ పెద్ద సెల్ వాల్ గ్లైకాన్‌లను మాత్రమే వర్గీకరిస్తుంది, ఎందుకంటే చాలా ఒలిగోసాకరైడ్‌లు ELISA ప్లేట్‌లపై సమర్థవంతంగా స్థిరీకరించబడవు. ఈ అధ్యయనంలో, AFEX-ప్రీట్రీట్డ్ కార్న్ స్టవర్‌ను అధిక ఘనపదార్థాల కంటెంట్ వద్ద ఎంజైమాటిక్‌గా హైడ్రోలైజ్ చేశారు. హైడ్రోలైజేట్‌లోని రీకాల్సిట్రాంట్ సెల్ వాల్ కార్బోహైడ్రేట్‌ల కూర్పును నిర్ణయించడానికి చక్కెర విశ్లేషణ ఉపయోగించబడింది. అయితే, హైడ్రోలైజేట్‌లలోని చిన్న ఒలిగోసాకరైడ్‌ల యొక్క mAb విశ్లేషణ తక్కువగా అంచనా వేయబడింది మరియు ELISA ప్లేట్‌లపై ఒలిగోసాకరైడ్‌లను సమర్థవంతంగా స్థిరీకరించడానికి అదనపు సాధనాలు అవసరం.
న్యూట్రాఅవిడిన్™ పూత ప్లేట్‌లపై ఒలిగోసాకరైడ్ బయోటినిలేషన్ మరియు ELISA స్క్రీనింగ్‌లను కలపడం ద్వారా mAb స్క్రీనింగ్ కోసం ఒక కొత్త మరియు సమర్థవంతమైన ఒలిగోసాకరైడ్ స్థిరీకరణ పద్ధతిని మేము ఇక్కడ నివేదిస్తాము. స్థిరీకరించబడిన బయోటినిలేటెడ్ ఒలిగోసాకరైడ్‌లు యాంటీబాడీకి తగినంత అనుబంధాన్ని చూపించాయి, తద్వారా రీకాల్సిట్రాంట్ ఒలిగోసాకరైడ్‌లను వేగంగా మరియు సమర్థవంతంగా గుర్తించగలుగుతాయి. మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ ఆధారంగా ఈ మొండి పట్టుదలగల ఒలిగోసాకరైడ్‌ల కూర్పు యొక్క విశ్లేషణ ఇమ్యునోస్క్రీనింగ్‌కు ఈ కొత్త విధానం యొక్క ఫలితాలను నిర్ధారించింది. అందువల్ల, ఈ అధ్యయనాలు ఒలిగోసాకరైడ్‌లలో క్రాస్‌లింక్‌లను గుర్తించడానికి ఒలిగోసాకరైడ్ బయోటినిలేషన్ మరియు ELISA స్క్రీనింగ్‌ను ఉపయోగించవచ్చని మరియు ఒలిగోసాకరైడ్‌ల నిర్మాణాన్ని వర్ణించే ఇతర జీవరసాయన అధ్యయనాలలో విస్తృతంగా అన్వయించవచ్చని చూపిస్తున్నాయి.
ఈ బయోటిన్-ఆధారిత గ్లైకాన్ ప్రొఫైలింగ్ పద్ధతి మొక్కల బయోమాస్‌లో కరిగే ఒలిగోసాకరైడ్‌ల యొక్క రీకాల్సిట్రాంట్ కార్బోహైడ్రేట్ బంధాలను పరిశోధించగల మొదటి నివేదిక. బయో ఇంధన ఉత్పత్తి విషయానికి వస్తే బయోమాస్‌లోని కొన్ని భాగాలు ఎందుకు మొండిగా ఉన్నాయో అర్థం చేసుకోవడానికి ఇది సహాయపడుతుంది. ఈ పద్ధతి గ్లైకోమ్ విశ్లేషణ పద్ధతుల్లో ఒక ముఖ్యమైన అంతరాన్ని పూరిస్తుంది మరియు మొక్కల ఒలిగోసాకరైడ్‌లకు మించి విస్తృత శ్రేణి ఉపరితలాలకు దాని అనువర్తనాన్ని విస్తరిస్తుంది. భవిష్యత్తులో, బయోటైనిలేషన్ కోసం మనం రోబోటిక్‌లను ఉపయోగించవచ్చు మరియు ELISAని ఉపయోగించి నమూనాల అధిక-నిర్గమాంశ విశ్లేషణ కోసం మనం అభివృద్ధి చేసిన పద్ధతిని ఉపయోగించవచ్చు.
పయనీర్ 33A14 హైబ్రిడ్ విత్తనాల నుండి పండించిన మొక్కజొన్న గడ్డి (CS) 2010లో కొలరాడోలోని రేలోని క్రామర్ ఫామ్స్ నుండి పండించబడింది. భూ యజమాని అనుమతితో, ఈ బయోమాస్‌ను పరిశోధన కోసం ఉపయోగించవచ్చు. నమూనాలను గది ఉష్ణోగ్రతలో జిప్-లాక్ సంచులలో 6% తేమ కంటే తక్కువ పొడిగా నిల్వ చేశారు. నమూనాలను గది ఉష్ణోగ్రతలో జిప్-లాక్ సంచులలో 6% తేమ కంటే తక్కువ పొడిగా నిల్వ చేశారు. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной темпер. నమూనాలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద జిప్పర్డ్ సంచులలో <6% తేమతో పొడిగా నిల్వ చేశారు.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% ఒబ్రేసియస్ ట్రాన్సక్ టు పాకెట్స్ స్సస్టేజ్కోయ్-మోల్నియయ్ ప్రై కోమ్నట్నోయ్ టెంపరటురే స్ వ్లాగ్నోస్ట్యుర్ <6%. నమూనాలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద తేమ < 6% వద్ద జిప్పర్ సంచులలో నిల్వ చేస్తారు.ఈ అధ్యయనం స్థానిక మరియు జాతీయ మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా ఉంది. NREL ప్రోటోకాల్ ఉపయోగించి కూర్పు విశ్లేషణ జరిగింది. కూర్పులో 31.4% గ్లూకాన్, 18.7% జిలాన్, 3.3% అరాబినాన్, 1.2% గెలాక్టాన్, 2.2% ఎసిటైల్, 14.3% లిగ్నిన్, 1.7% ప్రోటీన్ మరియు 13. 4% బూడిద ఉన్నట్లు కనుగొనబడింది.
సెలిక్® CTec2 (138 mg ప్రోటీన్/ml, లాట్ VCNI 0001) అనేది నోవోజైమ్స్ (ఫ్రాంక్లింటన్, NC, USA) నుండి సెల్యులేస్, β-గ్లూకోసిడేస్ మరియు సెలిక్® HTec2 (157 mg ప్రోటీన్/ml, లాట్ VHN00001) ల సంక్లిష్ట మిశ్రమం. పెక్టిన్‌ను తగ్గించే ఎంజైమ్‌ల సంక్లిష్ట మిశ్రమం అయిన మల్టీఫెక్ట్ పెక్టినేస్® (72 mg ప్రోటీన్/mL) ను డ్యూపాంట్ ఇండస్ట్రియల్ బయోసైన్సెస్ (పాలో ఆల్టో, CA, USA) విరాళంగా ఇచ్చింది. కెజెల్డాల్ నైట్రోజన్ విశ్లేషణ (AOAC పద్ధతి 2001.11, డైరీ వన్ కోఆపరేటివ్ ఇంక్., ఇథాకా, NY, USA) ఉపయోగించి ప్రోటీన్ కంటెంట్‌ను అంచనా వేయడం ద్వారా (మరియు ప్రోటీన్ కాని నైట్రోజన్ సహకారాన్ని తీసివేయడం ద్వారా) ఎంజైమ్ ప్రోటీన్ సాంద్రతలను నిర్ణయించారు. డయాటోమాసియస్ ఎర్త్ 545 ను EMD మిల్లిపోర్ (బిల్లెరికా, MA) నుండి కొనుగోలు చేశారు. యాక్టివేటెడ్ కార్బన్ (డార్కో, 100 మెష్ గ్రాన్యూల్స్), అవిసెల్ (PH-101), బీచ్ జిలాన్ మరియు అన్ని ఇతర రసాయనాలను సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ (సెయింట్ లూయిస్, MO) నుండి కొనుగోలు చేశారు.
AFEX ప్రీ-ట్రీట్‌మెంట్‌ను GLBRC (బయోమాస్ కన్వర్షన్ రీసెర్చ్ లాబొరేటరీ, MSU, లాన్సింగ్, MI, USA)లో నిర్వహించారు. ప్రీ-ట్రీట్‌మెంట్‌ను 140°C వద్ద 15 నిమిషాల పాటు నిర్వహించారు. స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ బెంచ్‌టాప్ బ్యాచ్ రియాక్టర్ (పార్ ఇన్‌స్ట్రుమెంట్స్ కంపెనీ)లో 60% (w/w) లోడింగ్ వద్ద అన్‌హైడ్రస్ అమ్మోనియా మరియు బయోమాస్ 1:1 నిష్పత్తిలో 46 నివాస సమయం. దీనికి 30 నిమిషాలు పట్టింది. రియాక్టర్‌ను 140°Cకి తీసుకువచ్చారు మరియు అమ్మోనియా వేగంగా విడుదల చేయబడింది, దీని వలన బయోమాస్ త్వరగా గది ఉష్ణోగ్రతకు తిరిగి వస్తుంది. AFEX ప్రీ-ట్రీట్ చేసిన కార్న్ స్టవర్ (ACS) కూర్పు ట్రీట్‌మెంట్ చేయని కార్న్ స్టవర్ (UT-CS) మాదిరిగానే ఉంటుంది.
అధిక ఘనపదార్థాలు ACSH 25% (w/w) (సుమారు 8% డెక్స్ట్రాన్ లోడింగ్) పెద్ద ఎత్తున ఒలిగోసాకరైడ్ల ఉత్పత్తికి ప్రారంభ పదార్థంగా తయారు చేయబడింది. ACS యొక్క ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణను Cellic® Ctec2 10 mg ప్రోటీన్/g గ్లూకాన్ (ప్రీట్రీట్డ్ బయోమాస్‌లో), Htec2 (నోవోజైమ్స్, ఫ్రాంక్లిన్టన్, NC), 5 mg ప్రోటీన్/g గ్లూకాన్ మరియు మల్టీఫెక్ట్ పెక్టినేస్ (జెనెన్‌కోర్ ఇంక్, USA) వంటి వాణిజ్య ఎంజైమ్ మిశ్రమాన్ని ఉపయోగించి నిర్వహించారు. ), 5 mg ప్రోటీన్/g డెక్స్ట్రాన్. 3 లీటర్లు, pH 4.8, 50°C మరియు 250 rpm పని వాల్యూమ్‌తో 5-లీటర్ బయోరియాక్టర్‌లో ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ జరిగింది. 96 గంటల పాటు జలవిశ్లేషణ తర్వాత, హైడ్రోలైజేట్‌ను సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా 6000 rpm వద్ద 30 నిమిషాలు మరియు తరువాత 14000 rpm వద్ద 30 నిమిషాలు సేకరించి హైడ్రోలైజ్ చేయని ఘనపదార్థాలను తొలగించారు. తరువాత హైడ్రోలైజేట్‌ను 0.22 మి.మీ ఫిల్టర్ బీకర్ ద్వారా స్టెరైల్ ఫిల్టర్‌కు గురి చేశారు. ఫిల్టర్ చేసిన హైడ్రోలైజేట్‌ను 4°C వద్ద స్టెరైల్ బాటిళ్లలో నిల్వ చేసి, ఆపై కార్బన్‌పై భిన్నం చేశారు.
NREL ప్రయోగశాల విశ్లేషణ విధానాల ప్రకారం సారం ఆధారిత బయోమాస్ నమూనాల కూర్పు విశ్లేషణ: కూర్పు విశ్లేషణ కోసం నమూనాల తయారీ (NREL/TP-510-42620) మరియు బయోమాస్‌లో నిర్మాణాత్మక కార్బోహైడ్రేట్‌లు మరియు లిగ్నిన్ నిర్ధారణ (NREL/TP-510 – 42618)47.
ఆటోక్లేవ్-ఆధారిత యాసిడ్ జలవిశ్లేషణ పద్ధతిని ఉపయోగించి 2 ml స్కేల్‌పై హైడ్రోలైజేట్ ప్రవాహం యొక్క ఒలిగోసాకరైడ్ విశ్లేషణను నిర్వహించారు. 10 ml స్క్రూ క్యాప్ కల్చర్ ట్యూబ్‌లో హైడ్రోలైజేట్ నమూనాను 69.7 µl 72% సల్ఫ్యూరిక్ ఆమ్లంతో కలిపి 121 °C వద్ద బెంచ్‌టాప్‌పై 1 గంట పాటు పొదిగించి, మంచు మీద చల్లబరిచి, అధిక పనితీరు గల లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (HPLC) వయల్‌లోకి ఫిల్టర్ చేయండి. ఆమ్ల-హైడ్రోలైజ్ చేయబడిన నమూనాలోని మొత్తం చక్కెర సాంద్రత నుండి హైడ్రోలైజ్ చేయని నమూనాలోని మోనోసాకరైడ్‌ల సాంద్రతను తీసివేయడం ద్వారా ఒలిగోసాకరైడ్‌ల సాంద్రతను నిర్ణయించారు.
బయో-రాడ్ అమినెక్స్ HPX-87H కాలమ్‌పై ఆటోసాంప్లర్, కాలమ్ హీటర్, ఐసోక్రటిక్ పంప్ మరియు రిఫ్రాక్టివ్ ఇండెక్స్ డిటెక్టర్‌తో కూడిన షిమాడ్జు HPLC వ్యవస్థను ఉపయోగించి యాసిడ్ హైడ్రోలైజ్డ్ బయోమాస్‌లో గ్లూకోజ్, జిలోజ్ మరియు అరబినోస్ సాంద్రతలను విశ్లేషించారు. కాలమ్‌ను 50°C వద్ద నిర్వహించి, 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 నీటి ప్రవాహంతో తొలగించారు.
హైడ్రోలైజేట్ సూపర్‌నాటెంట్‌ను కరిగించి, మోనోమర్ మరియు ఒలిగోసాకరైడ్ కంటెంట్ కోసం విశ్లేషించారు. ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ తర్వాత పొందిన మోనోమెరిక్ చక్కెరలను బయో-రాడ్ (హెర్క్యులస్, CA) అమినెక్స్ HPX-87P కాలమ్ మరియు యాష్ గార్డ్ కాలమ్‌తో కూడిన HPLC విశ్లేషించింది. కాలమ్ ఉష్ణోగ్రత 80°C వద్ద నిర్వహించబడింది, నీటిని 0.6 ml/min ప్రవాహం రేటుతో మొబైల్ దశగా ఉపయోగించారు. రిఫరెన్స్ 41, 48, 49లో వివరించిన పద్ధతుల ప్రకారం 121°C వద్ద డైల్యూట్ ఆమ్లంలో జలవిశ్లేషణ ద్వారా ఒలిగోసాకరైడ్‌లను నిర్ణయించారు.
గతంలో వివరించిన విధానాలు 27, 43, 50, 51 ఉపయోగించి ముడి, AFEX ముందస్తు చికిత్స మరియు అన్ని నాన్-హైడ్రోలైజ్డ్ బయోమాస్ అవశేషాలపై (సీరియల్ సెల్ వాల్ ఎక్స్‌ట్రాక్ట్‌ల ఉత్పత్తి మరియు వాటి mAb స్క్రీనింగ్‌తో సహా) సాకరైడ్ విశ్లేషణ జరిగింది. గ్లైకోమ్ విశ్లేషణ కోసం, మొక్కల కణ గోడ పదార్థం యొక్క ఆల్కహాల్-కరగని అవశేషాలను బయోమాస్ అవశేషాల నుండి తయారు చేస్తారు మరియు అమ్మోనియం ఆక్సలేట్ (50 mM), సోడియం కార్బోనేట్ (50 mM మరియు 0.5% w/v), CON. (1M మరియు 4M, రెండూ 1% w/v సోడియం బోరోహైడ్రైడ్‌తో) మరియు గతంలో వివరించిన విధంగా యాసిడ్ క్లోరైట్ వంటి పెరుగుతున్న దూకుడు కారకాలతో సీరియల్ వెలికితీతకు లోబడి ఉంటాయి. అప్పుడు సారం సెల్ వాల్ గ్లైకాన్‌కు దర్శకత్వం వహించిన mAb50ల సంక్లిష్ట ప్యానెల్‌కు వ్యతిరేకంగా ELISAకి గురిచేయబడింది మరియు mAb బైండింగ్ ప్రతిచర్యలను హీట్ మ్యాప్‌గా ప్రదర్శించారు. మొక్కల కణ గోడ గ్లైకాన్‌ను లక్ష్యంగా చేసుకునే mAbs ప్రయోగశాల స్టాక్‌ల నుండి (CCRC, JIM మరియు MAC సిరీస్) కొనుగోలు చేయబడ్డాయి.
ఒలిగోశాకరైడ్ల యొక్క ఒక-దశ బయోటినిలేషన్. బయోటిన్-LC-హైడ్రాజైడ్‌తో కార్బోహైడ్రేట్‌ల సంయోగం ఈ క్రింది విధానాన్ని ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది. బయోటిన్-LC-హైడ్రాజైడ్ (4.6 mg/12 μmol) ను డైమిథైల్ సల్ఫాక్సైడ్ (DMSO, 70 μl) లో 65° C వద్ద 1 నిమిషం పాటు తీవ్రంగా కదిలించి వేడి చేయడం ద్వారా కరిగించారు. హిమనదీయ ఎసిటిక్ ఆమ్లం (30 µl) జోడించబడింది మరియు మిశ్రమాన్ని సోడియం సైనోబోరోహైడ్రైడ్ (6.4 mg/100 µmol) పై పోసి, 65° C వద్ద 1 నిమిషం పాటు వేడి చేసిన తర్వాత పూర్తిగా కరిగించబడింది. తరువాత, ఎండిన ఒలిగోసాకరైడ్ (1-100 nmol) కు 5 నుండి 8 μl వరకు ప్రతిచర్య మిశ్రమాన్ని జోడించి, తగ్గించే చివరలో 10 రెట్లు లేదా అంతకంటే ఎక్కువ మోలార్ అదనపు లేబుల్‌ను పొందారు. ప్రతిచర్య 65°C వద్ద 2 గంటలు నిర్వహించబడింది, ఆ తర్వాత నమూనాలను వెంటనే శుద్ధి చేశారు. లేబులింగ్ ప్రయోగాలలో తగ్గింపు లేకుండా సోడియం సైనోబోరోహైడ్రైడ్ ఉపయోగించబడలేదు మరియు నమూనాలను 65°C వద్ద 2.5 గంటలు చర్య జరిపారు.
బయోటినిలేటెడ్ ఒలిగోసాకరైడ్ల నమూనాలను ELISA పూత మరియు కడగడం. అవిడిన్-కోటెడ్ ప్లేట్ యొక్క ప్రతి బావికి 25 μl బయోటినిలేటెడ్ నమూనాలు (5 ml 0.1 M Tris బఫర్ సొల్యూషన్ (TBS) లో కరిగించిన ప్రతి సాంద్రీకృత నమూనాలో 100 μl) జోడించబడ్డాయి. 0.1 M TBS లో 10 μg/ml గాఢతతో నియంత్రణ బావులను 50 μl బయోటిన్‌తో పూత పూశారు. ఖాళీ కొలతల కోసం డీయోనైజ్డ్ నీటిని పూతగా ఉపయోగించారు. టాబ్లెట్‌ను చీకటిలో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2 గంటలు పొదిగించారు. గ్రెనియర్ ఫ్లాట్ 3A కోసం ప్రోగ్రామ్ నంబర్ 11ని ఉపయోగించి 0.1 M TBSలో 0.1% స్కిమ్డ్ మిల్క్‌తో ప్లేట్‌ను 3 సార్లు కడగాలి.
ప్రాథమిక ప్రతిరోధకాలను జోడించడం మరియు కడగడం. ప్రతి బావికి 40 µl ప్రాథమిక ప్రతిరోధకాన్ని జోడించండి. చీకటిలో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట పాటు మైక్రోప్లేట్‌ను పొదిగించండి. ఆ తర్వాత గ్రెనియర్ ఫ్లాట్ 3A కోసం వాష్ ప్రోగ్రామ్ #11ని ఉపయోగించి ప్లేట్‌లను 0.1M TBSలో 0.1% పాలతో 3 సార్లు కడగాలి.
సెకండరీ యాంటీబాడీని వేసి కడగాలి. ప్రతి బావికి 50 µl ఎలుక/ఎలుక సెకండరీ యాంటీబాడీని (0.1 M TBSలో 0.1% పాలలో 1:5000 కరిగించబడింది) జోడించండి. చీకటిలో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద మైక్రోప్లేట్‌ను 1 గంట పాటు పొదిగించండి. ఆ తర్వాత గ్రెనియర్ ఫ్లాట్ 5A ప్లేట్ వాష్ ప్రోగ్రామ్ #12 ఉపయోగించి మైక్రోప్లేట్‌లను 0.1 M TBSలో 0.1% పాలతో 5 సార్లు కడగాలి.
ఒక సబ్‌స్ట్రేట్‌ను జోడించడం. బేస్ సబ్‌స్ట్రేట్‌కు 50 µl 3,3′,5,5′-టెట్రామెథైల్బెంజిడిన్ (TMB) జోడించండి (15 ml డీయోనైజ్డ్ నీటిలో 2 చుక్కల బఫర్, 3 చుక్కల TMB, 2 చుక్కల హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ జోడించడం ద్వారా). TMB సబ్‌స్ట్రేట్‌ను సిద్ధం చేయండి. మరియు ఉపయోగించే ముందు వోర్టెక్స్ చేయండి). మైక్రోప్లేట్‌ను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాలు పొదిగించండి. చీకటిలో.
దశను పూర్తి చేసి టాబ్లెట్‌ను చదవండి. ప్రతి బావికి 50 µl 1 N సల్ఫ్యూరిక్ ఆమ్లాన్ని వేసి, ELISA రీడర్‌ని ఉపయోగించి 450 నుండి 655 nm వరకు శోషణను నమోదు చేయండి.
ఈ విశ్లేషణ పదార్థాల యొక్క 1 mg/ml ద్రావణాలను డీయోనైజ్డ్ నీటిలో తయారు చేయండి: అరబినోస్, రామ్నోస్, ఫ్యూకోస్, జిలోజ్, గెలాక్టురోనిక్ ఆమ్లం (GalA), గ్లూకురోనిక్ ఆమ్లం (GlcA), మన్నోస్, గ్లూకోజ్, గెలాక్టోస్, లాక్టోస్, N-అసిటైల్మన్నోసమైన్ (manNAc), N-అసిటైల్గ్లూకోసమైన్. (glcNAc), N-అసిటైల్గలాక్టోసమైన్ (galNAc), ఇనోసిటాల్ (అంతర్గత ప్రమాణం). పట్టిక 1లో చూపిన 1 mg/mL చక్కెర ద్రావణాలను జోడించడం ద్వారా రెండు ప్రమాణాలను తయారు చేశారు. నమూనాలను -80° C వద్ద స్తంభింపజేసి లైయోఫైలైజ్ చేస్తారు. మొత్తం నీరు తొలగించబడే వరకు (సాధారణంగా సుమారు 12-18 గంటలు).
విశ్లేషణాత్మక సమతుల్యతపై స్క్రూ క్యాప్ ట్యూబ్‌లకు 100–500 µg నమూనాను జోడించండి. జోడించిన మొత్తాన్ని రికార్డ్ చేయండి. నమూనాను నిర్దిష్ట సాంద్రత కలిగిన ద్రావకంలో కరిగించి, దానిని ట్యూబ్‌కు ద్రవ రూపంలో జోడించడం ఉత్తమం. ప్రతి నమూనా ట్యూబ్‌కు అంతర్గత ప్రమాణంగా 20 µl 1 mg/ml ఇనోసిటాల్‌ను ఉపయోగించండి. నమూనాకు జోడించిన అంతర్గత ప్రమాణం మొత్తం ప్రామాణిక ట్యూబ్‌కు జోడించిన అంతర్గత ప్రమాణం మొత్తానికి సమానంగా ఉండాలి.
స్క్రూ క్యాప్ సీసాకు 8 మి.లీ. అన్‌హైడ్రస్ మిథనాల్‌ను జోడించండి. తరువాత 4 మి.లీ. 3 N. మిథనాలిక్ HCl ద్రావణాన్ని మూతపెట్టి కదిలించండి. ఈ ప్రక్రియలో నీరు ఉపయోగించబడదు.
ఒలిగోసాకరైడ్ నమూనాలు మరియు ప్రామాణిక TMS గొట్టాలకు 500 µl 1 M HCl మిథనాల్ ద్రావణాన్ని జోడించండి. నమూనాలను రాత్రిపూట (168 గంటలు) 80° C వద్ద థర్మల్ బ్లాక్‌లో పొదిగించారు. మెథనోలిసిస్ ఉత్పత్తిని గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద డ్రైయింగ్ మానిఫోల్డ్ ఉపయోగించి ఆరబెట్టండి. 200 µl MeOH వేసి మళ్ళీ ఆరబెట్టండి. ఈ ప్రక్రియ రెండుసార్లు పునరావృతమవుతుంది. నమూనాకు 200 µl మిథనాల్, 100 µl పిరిడిన్ మరియు 100 µl ఎసిటిక్ అన్హైడ్రైడ్ వేసి బాగా కలపండి. నమూనాలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాలు పొదిగించి ఎండబెట్టండి. 200 µl మిథనాల్ వేసి మళ్ళీ ఆరబెట్టండి.
200 µl ట్రై-సిల్ వేసి, మూతపెట్టిన ట్యూబ్‌ను 20 నిమిషాలు వేడి చేయండి. 80°C, తర్వాత గది ఉష్ణోగ్రతకు చల్లబరచండి. నమూనాను సుమారు 50 µl వాల్యూమ్‌కు మరింత ఆరబెట్టడానికి డ్రైయింగ్ మానిఫోల్డ్‌ను ఉపయోగించండి. నమూనాలను పూర్తిగా ఆరనివ్వలేదని గమనించడం ముఖ్యం.
2 మి.లీ. హెక్సేన్ వేసి వోర్టెక్సింగ్ ద్వారా బాగా కలపండి. పాశ్చర్ పైపెట్‌ల చివరలను (5-8 మి.మీ.) గాజు ఉన్ని ముక్కతో నింపి, 5-3/4 అంగుళాల వ్యాసం కలిగిన పైపెట్ పైన గాజు ఉన్నిని చొప్పించండి. నమూనాలను 3000 గ్రాముల వద్ద 2 నిమిషాలు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. ఏవైనా కరగని అవశేషాలు అవక్షేపించబడతాయి. నమూనాను 100-150 µl కు ఆరబెట్టండి. 80 °C ప్రారంభ ఉష్ణోగ్రత మరియు 2.0 నిమిషాల ప్రారంభ సమయంలో (టేబుల్ 2) GC-MS లోకి సుమారు 1 μl వాల్యూమ్ ఇంజెక్ట్ చేయబడింది.