Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки аз браузери навшуда истифода баред (ё ҳолати мувофиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Дар ҳамин ҳол, барои таъмини идомаи дастгирӣ, мо сайтро бидуни услуб ва JavaScript намоиш медиҳем.
Морфогенези рӯдаи инсон хусусиятҳои крипт-виллуси микроархитектураи эпителиалии 3D ва ташкили фазоиро муқаррар мекунад. Ин сохтори беназир барои нигоҳ доштани гомеостази рӯда тавассути муҳофизат кардани чароғаки ҳуҷайраҳои бунёдӣ дар крипти базавӣ аз антигенҳои экзогении микробҳо ва метаболитҳои онҳо зарур аст. сатҳи луобпардаи рӯда. Аз ин рӯ, аз нав сохтани сохторҳои эпителиалии 3D барои сохтани моделҳои рӯда дар in vitro муҳим аст. Қобили зикр аст, ки рӯдаи миметикии органикӣ дар чип метавонад морфогенези 3D-и стихиявии эпителийи рӯдаро бо функсияҳои мукаммали физиологӣ ва барқарорсозии биомеханикӣ ба вуҷуд оварад. Морфогенези рӯдаро дар як чипи микрофлюидӣ ва инчунин дар чипи гибридии Transwell дарунсохт. Мо усулҳои муфассалро барои сохтани дастгоҳ, парвариши Caco-2 ё ҳуҷайраҳои эпителиалии органоидҳои рӯда дар танзимоти муқаррарӣ, инчунин дар платформаи микрофлюидӣ, бо истифода аз индуксияи хислати муқарраршудаи эпителиалии 3D тавсиф мекунем. Ин протокол ба барқарорсозии микроархитектураи функсионалии рӯдаи рӯда тавассути назорати ҷараёни моеъи базоlateral барои 5 рӯз ноил мешавад. Усули морфогенези in vitro мо фишори физиологии мувофиқ ва ҳаракати механикиро истифода мебарад ва муҳандисии мураккаби ҳуҷайра ё манипуляцияро талаб намекунад, ки метавонад аз дигар усулҳои мавҷуда бартарӣ дошта бошад. қабатҳои эпителиалии 3D-и рӯдаро in vitro барои барномаҳои биотиббӣ, клиникӣ ва фармасевтӣ хӯрд.
Таҷрибаҳо нишон медиҳанд, ки ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯда Caco-2, ки дар рӯда дар чип 1,2,3,4,5 парвариш карда шудаанд ё дастгоҳҳои микрофлюидикии дуқабата6,7 метавонанд бидуни фаҳмиши дақиқи механизми аслӣ аз морфогенези 3D стихиявӣ гузаранд. морфогенези 3D эпителиалиро in vitro ба вуҷуд меорад, ки онро Caco-2 ва органоидҳои рӯдаҳои аз беморон ҳосилшуда нишон додаанд.Ҳуҷайраҳои эпителиалӣ тасдиқ карда шуданд. Дар ин тадқиқот, мо махсусан ба истеҳсоли ҳуҷайра ва тақсимоти консентратсияи як антагонисти пурқуввати Wnt Диккопф-1 (DKK-1) дар рӯда дар чип ва дастгоҳҳои микрофлюидии тағирёфтаи дорои замимаҳои Transwell бо номи "Чипи гибридӣ" тамаркуз кардем. 1, секретсияи протеини марбут ба frizzled 1, ё Soggy-1) ба рӯдаи рӯи чип морфогенезро бозмедорад ё қабати эпителиалии қаблан сохташудаи 3D-ро вайрон мекунад, ин нишон медиҳад, ки фишори антагонистӣ ҳангоми фарҳанг барои морфогенези рӯда дар vitro масъул аст. Аз ин рӯ, як равиши амалӣ барои ба даст овардани сатҳи робҳои эпителиалии меъда масъул аст. антагонистҳои nt дар қисмати базолаҳолӣ тавассути оббозии фаъол (масалан, дар платформаҳои гибридӣ дар чип ё гибридии дар чип) ё паҳншавии .Васоити базолатералӣ (масалан, аз Transwell ба обанборҳои калони базолатералӣ дар чоҳҳо).
Дар ин протокол, мо як усули муфассалро барои тавлиди микроаппаратҳои рӯда дар як чип ва микросхемаҳои гибридии ба Transwell воридшаванда (қадамҳои 1-5) барои парвариши ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯда дар асоси полидиметилсилоксан (PDMS) дар мембранаҳои рахнашуда (қадамҳои 6A, 7A, 8, B, мембранаҳои полиэстер68) пешниҳод менамоем. , 9) ва морфогенези 3D-ро induced in vitro (қадами 10). Мо инчунин хусусиятҳои ҳуҷайравӣ ва молекулавиро, ки нишондиҳандаи гистогенези хоси бофта ва тафриқаи ҳуҷайраҳои вобаста ба наслро тавассути истифодаи усулҳои тасвирии сершумор муайян кардем (қадамҳои 11-24). форматҳои фарҳангӣ бо тафсилоти техникӣ, аз ҷумла тағирёбии сатҳи мембранаҳои ковокӣ, эҷоди моноқабатҳои 2D ва биохимиявии рӯда ва Таҷдиди микромуҳити биомеханикӣ. in vitro. Барои ба вуҷуд овардани морфогенези 3D аз моноқабатҳои эпителиалии 2D, мо антагонистҳои морфогенро дар ҳарду шаклҳои фарҳангӣ ба воситаи фарҳанг муаррифӣ мекунем. истифодаи як қабати эпителиалии барқароршавандаи 3D, ки метавонад барои моделсозии афзоиши эпителиалии аз морфоген вобаста, ко-культурҳои дарозии мизбон ва микробиома, сирояти патоген, осеби илтиҳобӣ, халалдоршавии монеаи эпителиалӣ ва терапевтҳои ба пробиотик асосёфта истифода шавад Example.influences.
Протоколи мо метавонад барои доираи васеи олимон дар соҳаи асосӣ (масалан, биологияи луобпардаи рӯда, биологияи ҳуҷайраҳои бунёдӣ ва биологияи рушд) ва тадқиқоти амалӣ (масалан, санҷиши пеш аз клиникӣ, моделсозии бемориҳо, муҳандисии бофтаҳо ва гастроэнтерология) муфид бошад. Аз сабаби такрористеҳсолӣ ва устувории протогенези мо дар протогенези тестӣ vitro, мо дар назар дорем, ки стратегияи техникии мо метавонад ба шунавандагоне паҳн карда шавад, ки динамикаи сигнализатсияи ҳуҷайраҳоро ҳангоми рушди рӯдаҳо, барқароршавӣ ё гомеостаз меомӯзанд. Илова бар ин, протоколи мо барои пурсиши сироят дар зери агентҳои гуногуни сироятӣ, ба монанди Norovirus 8, Синдроми шадиди роҳи нафас муфид аст Coronavirus 2 (SARSella-Cophilicium) Вибрио вабо.Шунавандагони патология ва патогенези бемориҳо низ муфиданд. Истифодаи системаи микрофизиологии рӯда дар чип метавонад ба фарҳанги муштараки тӯлонӣ 10 ва баҳодиҳии минбаъдаи муҳофизати мизбон, аксуламали иммунӣ ва таъмири осеби марбут ба патоген дар рӯдаи меъдаю рӯда (GI) 11 .Дигар ихтилоли GI, бемории синдроилӣ, бемории гепатитӣ, гликемияи гепатитӣ алоқаманд бошад. колит, поучит ё синдроми асаби рӯдаро ҳангоми тайёр кардани қабатҳои эпителиалии 3D рӯда бо истифода аз қабатҳои эпителиалии 3D рӯдаи бемор метавон тақлид кард, ба ин бемориҳо атрофияи виллӣ, кӯтоҳ шудани крипт, осеби луобпардаи луобпарда ё халалдор шудани монеаи эпителиалӣ дохил мешаванд. мураккабии муҳити беморӣ, хонандагон метавонанд ба моделҳои дорои микроархитектураҳои 3D виллуси меъда-крипт илова кардани намудҳои ҳуҷайраҳои марбут ба беморӣ, ба монанди ҳуҷайраҳои мононуклеарии хуни бемор (PBMCs) баррасӣ кунанд.ҳуҷайраҳои иммунии хоси бофта, 5.
Азбаски микроструктураи эпителиалии 3D-ро бидуни раванди ҷудокунӣ собит ва визуалӣ кардан мумкин аст, тамошобиноне, ки дар транскриптомияи фазоӣ ва тасвири баландсифат ё супер-резолютсионӣ кор мекунанд, метавонанд ба харитасозии мо дар бораи динамикаи фазои-вақтии генҳо ва сафедаҳо дар чароғҳои эпителиалӣ таваҷҷӯҳ кунанд.Ба технология шавқманд аст. Ҷавоб ба ангезаҳои микробӣ ё иммунӣ. Ғайр аз ин, байниҳамдигарии тӯлонии мизбон-микробиома 10, 14, ки гомеостази рӯдаро ҳамоҳанг мекунад, дар қабати луобпардаи рӯда 3D тавассути якҷоя парвариш кардани намудҳои гуногуни микробҳо, ҷомеаҳои микробҳо ё микробиоти наҷосат, махсусан дар микробиоти наҷосат муқаррар карда мешавад.Ин равиш махсусан барои шунавандагоне, ки иммунологияи луобпардаҳо, гастроэнтерология, микробиомаи инсон, фарҳангшиносӣ ва микробиологияи клиникиро меомӯзанд, ҷолиб аст, ки мехоҳанд микробиоти қаблан парваришнашудаи рӯдаро дар лаборатория парвариш кунанд. s, ки пайваста қисмҳои базотералиро пур мекунанд, протокол инчунин метавонад ба онҳое паҳн карда шавад, ки платформаҳои фармасевтӣ, биотиббӣ ё скрининг ё тасдиқи баландсуръатро барои саноати хӯрокворӣ таҳия мекунанд. Ҳамчун далели принсип, мо ба наздикӣ имконнопазирии мултиплекси мултиплекси дорои гузариши баландро нишон додем. Аз ин рӯ, тасдиқи усули морфогенези in vitro мо метавонад аз ҷониби бисёре аз лабораторияҳои тадқиқотӣ, саноат ё мақомоти давлатӣ ва танзимкунанда суръат бахшад ва эҳтимолан қабул карда шавад, то дарки барномасозии ҳуҷайравии морфогенези in vitro рӯда дар сатҳи транскриптомӣ барои санҷиши маводи мухаддир ё биотерапевтҳо бо истифода аз маводи мухаддир ва биотерапевтҳо арзёбӣ карда шаванд. моделҳои фармоишӣ ё тиҷории узвҳои чип барои арзёбии такрорпазирии раванди морфогенези рӯда.
Барои омӯхтани протографҳои татбиқшаванда, асосан аз сабаби норасоии морфогенезии 3D, ки онҳо меҳнат мекунанд, метавонанд аз ҷиҳати омори морҳо асосёфта бошанд ва аз ҳама муҳимтар бошанд , муназзам равандҳои рушди инсонро муайян накунед. Вазъиятҳо дар қобилияти сермаҳолати онҳо дар моделҳои сершумори Витро, инчунин дигар моделҳои эпитлейн ба мо хеле маҳдуданд AXIG дар ҷавоб ба устувории mucosal.3D қабатҳои эпителия метавонад дар посух ба омилҳои мизбон фосила ва эвитсияҳои antialial дар посух ба мо имкон диҳад, ки чӣ гуна сохторҳои микробари Ҷамоатҳои он ва синфалисти он метаболитҳои микробҳо истеҳсол мекунанд (масалан, кислотаҳо, кислотаҳои равғании кӯтоҳ), ки ҳангоми 3D сабти эпителия нишон дода шудаанд, нишон дода мешаванд.
Илова ба усули мо барои эҷоди сохторҳои эпителиалии 3D рӯда, якчанд усулҳои in vitro вуҷуд доранд. Фарҳанги органоидҳои рӯда як усули муосири муҳандисии бофтаҳо мебошад, ки ба парвариши ҳуҷайраҳои бунёдии рӯда дар шароити морфогении мушаххас асос ёфтааст23,24,25. Бо вуҷуди ин, истифодаи моделҳои 3D ё ҳостҳои органоид барои таҳлили микробҳо аксар вақт барои таҳлили микроорганоидҳо ба вуҷуд меоянд ал люмен дар дохили органоид иҳота шудааст ва аз ин рӯ, ворид кардани ҷузъҳои люминалӣ ба монанди ҳуҷайраҳои микробҳо ё антигенҳои экзогенӣ маҳдуд аст.Дастрасӣ ба lumens organoid мумкин аст бо истифода аз microinjector,26,27 беҳтар, вале ин усул invaziv ва меҳнат-пуршиддат аст ва талаб дониши махсус барои иҷрои.Ба ғайр аз ин, фарҳангҳои органоид анъанавӣ дар scaffolds hydrogel дар шароити статикӣ нигоҳ дақиқ фаъол дар biomechanics vivo инъикос намекунад.
Равишҳои дигаре, ки аз ҷониби якчанд гурӯҳҳои тадқиқотӣ истифода мешаванд, складҳои қаблан сохташудаи 3D гидрогелиро барои тақлид кардани сохтори эпителиалии рӯда тавассути парвариши ҳуҷайраҳои ҷудошудаи рӯдаи инсон дар сатҳи гел истифода мебаранд. Искафолҳои гидрогелро бо истифода аз қолабҳои 3D чопшуда, микрофрезашуда ё литографии сохташуда созед. градиентҳои морфогенӣ, муқаррар кардани таносуби баланди сохтори эпителиалӣ ва строма-эпителиалиро тавассути дохил кардани ҳуҷайраҳои стромалӣ дар scaffold. Бо вуҷуди ин, табиати scaffolds пешакӣ сохташуда метавонад намоиши худи раванди морфогенетикии стихиявиро пешгирӣ кунад. генезис ва ба даст овардани функсияи физиологӣ. Тадқиқоти охирини дигар scaffolds hydrogel дар як платформаи microfluidic истифода бурда мешавад ва сохторҳои эпителиалии рӯда намунавӣ бо истифода аз усулҳои лазерӣ. равандҳои морфогенетикӣ ва ҳаракатҳои механикии рӯдаҳоро дар бар намегиранд. Усулҳои чопи 3D аз як гурӯҳ тавонистанд найҳои хурди рӯдаро бо равандҳои стихиявии морфогенетикӣ эҷод кунанд. Сарфи назар аз сохти мураккаби сегментҳои гуногуни рӯда дар дохили қубур, ин модел инчунин ҷараёни моеъи рӯдаи рӯда ва деформатсияи механикӣ надорад. Илова бар ин, қобилияти коршоямии модел пас аз анҷоми таҷриба барои ҳар як ҳуҷайра метавонад маҳдуд бошад. Ба ҷои ин, протоколи пешниҳодшудаи мо морфогенези стихиявии рӯда, фишори физиологии мувофиқ, биомеханика, ки ҳаракати рӯдаро тақлид мекунад, дастрасии қисмҳои мустақили апикалӣ ва базопалӣ ва аз нав эҷод кардани муҳити мураккаби микробиологии модулиро таъмин мекунад. Аз ин рӯ, муносибати мо дар vitrophotogene мураккабии мураккабро таъмин мекунад. усулхои мавчуда.
Протоколи мо комилан ба морфогенези эпителиалии 3D нигаронида шудааст, ки танҳо ҳуҷайраҳои эпителиалӣ дар фарҳанг ва дигар намудҳои ҳуҷайраҳои атроф ба монанди ҳуҷайраҳои мезенхималӣ, ҳуҷайраҳои эндотелия ва ҳуҷайраҳои иммунӣ нестанд. Тавре ки қаблан тавсиф карда шудааст, асосии протоколи мо индуксияи морфогенези эпителиалӣ мебошад, ки тавассути бартараф кардани миёнаравҳои ингибитории робусҳои ингибитории робусҳо ҷойгиршуда мебошад. Модулияти рӯдаи мо дар чип ва гибриди чип ба мо имкон медиҳад, ки қабати эпителиалии 3D-и печдор, мураккабии иловагии биологӣ ба монанди таъсири мутақобилаи эпителиалӣ-мезенхималӣ33,34, консентратсияи матритсаи берун аз ҳуҷайра (ECM) 35 ва дар модели мо, хусусиятҳои конструктивии бастаҳои криптӣ дар ҳуҷайраҳои криптӣ боқӣ мондаанд. ҳуҷайраҳои тромалӣ (масалан, фибробластҳо) дар мезенхима дар истеҳсоли сафедаҳои ECM ва танзими морфогенези рӯда дар vivo35,37,38 нақши калидӣ мебозанд. Илова кардани ҳуҷайраҳои мезенхимӣ ба модели мо раванди морфогенетикӣ ва самаранокии пайвастшавии ҳуҷайраҳоро такмил дод. Дар қабати эндотелиалӣ (яъне, фибробластҳо) нақши муҳими интиқоли ҳуҷайраҳо ва реагулятсияҳои капиллярҳо 9 мебозанд. recruitment40 дар микромуҳити рӯда. Ғайр аз ин, ҷузъҳои рагҳо, ки метавонанд байни моделҳои бофта пайваст карда шаванд, шарти ҳатмист, вақте ки моделҳои матоъ барои нишон додани таъсири мутақобилаи бисёр узвҳо тарҳрезӣ шудаанд. Бинобар ин, ҳуҷайраҳои эндотелия барои моделсозии хусусиятҳои физиологии дақиқтар бо сатҳи узвҳо метавонанд дохил карда шаванд. муқовимати иммунии модарзодӣ ва иммунитети хоси бофта дар заминаи тақлид кардани бемории рӯда.
Истифодаи микросхемаҳои гибридӣ нисбат ба gut-on-a-chip осонтар аст, зеро насби дастгоҳ соддатар аст ва истифодаи замимаҳои Transwell имкон медиҳад, ки фарҳанги миқёспазири эпителийи рӯдаро фароҳам оранд. Бо вуҷуди ин, замимаҳои дар тиҷоратӣ дастраси Transwell бо мембранаҳои полиэстерӣ чандир нестанд ва наметавонанд ҳаракатҳои ба перисталтика монандро тақлид кунанд. Равшан аст, ки хосиятҳои статикӣ дар қисмати апикалӣ дар микросхемаҳои гибридӣ аҳёнан имкон медиҳанд, ки мофогенези 3D-ро дар замимаҳои Transwell ҳангоми истифодаи микросхемаҳои гибридӣ мустаҳкам кунем, нарасидани микросхемаҳои гибридӣ имкон медиҳад, ки микросхемаҳои потенсиалии биомеханикии моеъро маҳдуд кунанд.
Таҷдиди миқёси пурраи меҳвари крипт-виллуси инсон дар фарҳангҳои гибридии дар чип ва гибридии чип ба таври пурра муқаррар карда нашудааст. Азбаски морфогенез аз як қабати эпителиалӣ оғоз мешавад, микроархитектураҳои 3D ҳатман шабоҳати морфологиро ба домейнҳои криптизатсияи дар наздикии криптизатсияшудаи популятсия дар вижа таъмин намекунанд. эпителийи микромуҳандисии 3D, минтақаҳои крипт ва виллӣ дақиқ ҷудо карда нашудаанд. Ҳарчанд каналҳои болоии чип боиси баланд шудани баландии эпителияи микромуҳандисӣ мешаванд, баландии максималӣ то ҳол бо ~300–400 микрон маҳдуд аст. Амиқии воқеии рӯдаи рӯдаи инсон дар ~30 мкм ва криптҳои хурд дар санҷиш ~ 50 мкм аст. ly ва баландии вилли рӯдаҳои хурд ~ 600 мкм41 аст.
Аз нуқтаи назари визуалӣ, тасвири супер-резолютсионӣ дар микроархитектураҳои 3D метавонад дар рӯда дар чип маҳдуд карда шавад, зеро масофаи кории зарурӣ аз линзаи объективӣ то қабати эпителиалӣ ба миқдори чанд миллиметр аст. Ғайр аз он, азбаски микрофабрикасияи қабат-қабати рӯда дар чип пайвастагии доимии байни ҳар як қабатро дар бар мегирад, кушодан ё хориҷ кардани қабати болоӣ барои тафтиши сохтори сатҳи қабати эпителиалӣ ниҳоят душвор аст. Масалан, бо истифода аз микроскопи электронии сканерӣ (SEM).
Гидрофобияи PDMS омили маҳдудкунанда дар таҳқиқоти микрофлюидӣ, ки бо молекулаҳои хурди гидрофобӣ сарукор доранд, буд, зеро PDMS метавонад ба таври ғайримуқаррарӣ чунин молекулаҳои гидрофобиро адсорб кунад. Алтернативаҳои PDMS метавонанд бо дигар маводҳои полимерӣ баррасӣ карда шаванд. Интихобан, тағирёбии сатҳи PDMS бо маводи полиэтилолӣ (масалан, g243) ) барои кам кардани адсорбсияи молекулаҳои гидрофобӣ баррасӣ кардан мумкин аст.
Ниҳоят, усули мо аз нуқтаи назари таъмини скрининги баландсуръат ё платформаи таҷрибавии барои корбар-дӯсти “як андоза” хуб тавсиф карда нашудааст. Протоколи ҷорӣ як насоси сӯзандоруро барои як дастгоҳи хурд талаб мекунад, ки дар инкубатори CO2 ҷойро ишғол мекунад ва аз таҷрибаҳои миқёси калон пешгирӣ мекунад. 384-чоҳҳои ковокӣ, ки имкон медиҳанд, ки пайваста пурра ва хориҷ кардани васоити базолатералӣ).
Барои ба вуҷуд овардани морфогенези 3D-и эпителияи рӯдаи инсон дар vitro, мо як дастгоҳи микрофлюидии рӯдаро истифода кардем, ки дорои ду микроканали мувозӣ ва мембранаи ковокии чандирӣ дар байни онҳо барои эҷод кардани интерфейси люмен-капиллярӣ мавҷуд аст. Дар ҳарду платформа, морфогенези ҳуҷайраҳои эпителиалии гуногуни рӯдаи одамро тавассути истифодаи манипуляцияи самти ҷараёни ҷараён барои хориҷ кардани антагонистҳои морфоген аз қисмати базолаҳолӣ нишон додан мумкин аст. Тамоми раванди таҷрибавӣ (Расми 1) аз панҷ қисм иборат аст: (i) микрофабрикатсияи микрофабрика дар қуттии микросхемаҳои гузаранда (- чипси 1) ) тайёр кардани ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯда (ҳуҷайраҳои Caco-2) ё органоидҳои рӯдаи одам;қуттиҳои 2-5), (iii) фарҳанги ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯда дар микросхемаҳои меъда ё микросхемаҳои гибридӣ (қадамҳои 6-9), (iv) индуксияи морфогенези 3D in vitro (қадами 10) ва (v) ) барои тавсифи микроструктураи эпителиалии 3D (қадамҳои мувофиқ ба гурӯҳи 41) тарҳрезӣ шудаанд. самаранокии морфогенези in vitro тавассути муқоисаи морфогенези эпителиалӣ бо назорати фазоӣ, вақтӣ, шартӣ ё мурофиавӣ хӯрд.
Мо ду платформаи фарҳангии гуногунро истифода бурдем: чип-дар-а-чип бо каналҳои рост ё каналҳои печидаи ғайрихаттӣ ё микросхемаҳои гибридии дорои Трансвелл (TW) дар дастгоҳи микрофлюидӣ, ки тавре дар қуттии 1 тавсиф шудаанд ва қадами 1-5 сохта шудаанд. манбаи ҳуҷайра (Caco-2 ё органоидҳои рӯдаи инсон) ва тартиби парвариши дар ин протокол истифодашуда. "Морфогенези in vitro" марҳилаҳои умумиро нишон медиҳад, ки дар он ҳуҷайраҳои эпителиалии аз органоид гирифташуда дар чипи рӯда ё дар замимаҳои Transwell аз чипи гибридӣ парвариш карда мешаванд, пас аз индуксияи қуттии ташаккули рақами эпиморфозҳои 3D ва шумораи сохтори эпиморогении 3D. Дар зер ҳар як тирча нишон дода мешавад. Дар барнома мисолҳое оварда шудааст, ки чӣ тавр қабатҳои эпителиалии муқарраршудаи рӯдаро метавон истифода бурд, масалан, дар тавсифи дифференсиатсияи ҳуҷайраҳо, омӯзиши физиологияи рӯда, таъсиси экосистемаҳои мизбон-микробиома ва моделсозии бемориҳо. Дар чипи рӯда. Сигнализатсияи MUC2 дар ҳуҷайраҳои пиёла ва луобе, ки аз сатҳи луобпарда ҷудо мешавад, мавҷуд аст. Тасвирҳои флуоресцентӣ дар Физиологияи рӯда луоберо нишон медиҳанд, ки дар натиҷаи ранг кардани кислотаи сиалӣ ва боқимондаҳои N-ацетилглюкозаминӣ бо истифода аз агглютинини гандум флуоресцентӣ ҳосил шудааст. с дар рӯда дар як chip.The панели чап нишон медиҳад, ки фарҳанги муштараки E. coli ифодаи сафедаи флуоресценти сабз (GFP) бо ҳуҷайраҳои эпителиалии микромуҳандисии 3D Caco-2. Панели рост нишон медиҳад, ки маҳаллисозии GFP E. coli якҷоя бо ҳуҷайраҳои эпителиалии 3D Caco-2 ва баъд аз он бо ҳуҷайраҳои эпителиалии 3D Caco-2 ва аз паи бо nucluiencluiiininges (Fe- luorescent nude) (Fluorescent nudeliase red). Дар микросхемаҳои илтиҳоби рӯда дар зери мушкилоти физиологӣ бо антигенҳои бактериявӣ (масалан, липополисахарид, LPS) ва ҳуҷайраҳои иммунӣ (масалан, PBMC);сабз). Ҳуҷайраҳои Caco-2 барои сохтани қабати эпителиалии 3D парвариш карда шуданд. Сатри миқёс, 50 ​​микрон. Тасвирҳо дар сатри поён: "Фарқияти ҳуҷайраҳо" бо иҷозати истинод мутобиқ карда шудаанд.2.Матбуоти Донишгоҳи Оксфорд;Бо иҷозати Ref.5 нусхабардорӣ шудааст.NAS;"Корманд-Фарҳанги микробҳо" бо иҷозати ref.3 мутобиқ карда шудааст.NAS;"Моделсозии бемориҳо" бо иҷозати истинод мутобиқ карда шудааст.5.NAS.
Чипҳои гибридӣ ва гибридӣ бо истифода аз репликаҳои PDMS сохта шудаанд, ки аз қолабҳои кремний бо литографияи нарм канда шуда буданд1,44 ва бо SU-8 тарҳрезӣ шудаанд. Тарҳрезии микроканалҳо дар ҳар як чип бо назардошти гидродинамика ба монанди фишори кӯч ва фишори гидродинамикӣ муайян карда мешавад1,4,12. Тарҳрезии аслӣ аз дуччат иборат аст. микроканалҳои рости мувозиро ба вуҷуд оварда, ба як чипи мураккаби рӯда табдил ёфт (Маълумоти васеъшуда Расми 1б), ки як ҷуфт микроканалҳои каҷро дар бар мегирад, то вақти зиёдшавии моеъ, шаклҳои ҷараёни ғайрихаттӣ ва деформатсияи бисёрсоҳаи ҳуҷайраҳои парваришшуда (расми 2a-f) барои бозсозии мураккаби биоканикаҳо лозим аст. метавон интихоб кард. Мо нишон додем, ки Gut-Chip-и печида низ дар як чаҳорчӯбаи вақт ба таври шабеҳ морфогенези 3D-ро бо дараҷаи шабеҳи афзоиши эпителиалӣ дар муқоиса бо Gut-Chip-и аслӣ, новобаста аз навъи ҳуҷайраи парваришшуда, ба таври шадид индуксия мекунад. Аз ин рӯ, барои ба вуҷуд овардани морфогенези 3D, хаттӣ ва мураккабҳои силули MSP-ро ба вуҷуд меоранд. ds бо намунаҳои SU-8 пас аз рехтан хусусиятҳои манфиро таъмин карданд (расми 2).2a). Барои сохтани рӯда дар як чип, қабати болоии PDMS-и омодашуда пайдарпай ба як филми ковокии PDMS пайваст карда шуд ва сипас бо қабати поёнии PDMS тавассути пайванди бебозгашт бо истифода аз табобати корона мувофиқ карда шуд (расми 2b-f). хуб дохил (расми. 2h ва Маълумоти васеъ. Расми 2). Раванди bonding аст, ки бо коркарди рӯи репликаи PDMS ва шиша бо плазмаи оксиген ё табобати corona анҷом дода мешавад.Баъд аз стерилизатсияи дастгоҳи microfabricated ба найчаи силикон замима, насби дастгоҳ омода барои иҷрои 3D morphogenesis morphogenesis аз epithelium.
а, Тасвири схемавии тайёр кардани қисмҳои PDMS аз қолибҳои кремнийи намунавии SU-8. Маҳлули PDMS шифонаёфта ба қолаби кремний (аз чап) рехта шуд, дар 60 °C (миёна) табобат карда шуд (аз рост). истифода бурда мешавад, ки барои сохтани мембранаи PDMS porous.d, Як қатор аксҳои ҷузъҳои болоӣ ва поёнии PDMS ва дастгоҳи рӯда дар чип васлшуда.e, Схемати ҳамоҳангсозии ҷузъҳои болоӣ, мембрана ва поёнии PDMS. Ҳар як қабат ба таври бебозгашт бо плазма ё корона пайваст карда мешавад. s ва vacuum chambers.g, Setup of gut-on-a-chip for microfluidic cell microfluidic gutun сохта дар як чипи ҷамъ бо найчаи силикон ва сӯзандору дар як coverslip ҷойгир карда шуд. Дастгоҳи чип оид ба зарфи як табақ Петри 150 мм барои коркарди ҷойгир карда шуд.The binder барои пӯшидани найчаҳои визуалӣ аз матоъ истифода бурда мешавад. морфогенез бо истифода аз микросхемаҳои гибридии. Трансвелл ба таври мустақилона ба фарҳанг омода карда шудааст 2D monolayers ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯда ба чипи гибридӣ ворид карда шуданд, то morphogenesis 3D меъдаро ба вуҷуд оранд. Миёна тавассути микроканалҳо дар зери қабати ҳуҷайраи муқарраршуда дар Transwell, barprinth perfused, perfused.Elsevier.
Дар ин протокол, хатти ҳуҷайраҳои Caco-2 ва органоидҳои рӯда ҳамчун манбаи эпителиалӣ истифода мешуданд (расми 3a). Ҳарду намуди ҳуҷайраҳо мустақилона парвариш карда шуданд (Қуттии 2 ва Қуттии 5) ва барои тухми микроканалҳои бо ECM-пӯшонидашудаи рӯдаи чип ё Transwell inserts истифода мешуданд. Вақте ки ҳуҷайраҳо ба ҳам мепайванданд (% 95 ҳуҷайраҳо), Дар порчаҳои 10 ва 50) дар колбаҳои T барои тайёр кардани суспензияҳои ҳуҷайраҳои ҷудошуда тавассути моеъи трипсинизатсия ҷамъ карда мешаванд (қуттии 2). Органоидҳои рӯдаи инсон аз биопсияҳои рӯда ё резекцияҳои ҷарроҳӣ дар гунбазҳои скафанди Матригел дар лавҳаҳои 24-чоҳ барои дастгирӣ кардани микроорганизмҳои сохтории R, ҳамчун микроорганизмҳои муҳими R. spondin, and Noggin) ва омилҳои афзоиш, ки дар қуттии 3 тавсиф шудаанд, ҳар рӯзи дигар илова карда мешуданд, то он даме ки органоидҳо ба диаметри ~ 500 мкм зиёд шаванд. бемории n's, саратони рӯдаи рӯда ё донори муқаррарӣ), макони осеб (масалан, осеб дар муқоиса бо минтақаи осебнадошта) ва ҷойгиршавии меъдаю рӯда дар рӯда (масалан, рӯдаи дувоздаҳ, ҷигар, рӯдаи рӯдаи рӯдаи рӯда, рӯдаи рӯда ё рост). с.
а, Ҷараёни кор барои индуксияи морфогенези рӯда дар чипи рӯда. Дар ин протокол барои намоиш додани морфогенези 3D ҳуҷайраҳои эпителиалии ҷудошудаи Caco-2 ва ҳуҷайраҳои рӯдаи рӯда истифода мешаванд. Мембранаи рахнашудаи MS дар рӯзи 0 (D0), ҷараёни апикалӣ (AP) оғоз мешавад ва дар давоми 2 рӯзи аввал нигоҳ дошта мешавад (ҷараён, AP, D0-D2). Ҷараёни basolateral (BL) низ дар якҷоягӣ бо ҳаракатҳои дарозкунии даврӣ (дароз, ҷараён, AP ва BL) ҳангоми ба вуҷуд омадани як қабати пурраи 2D monolayer 2D пас аз рӯзҳо дар як қабати 2D-и микротестогении 3D-и spphred ба таври назаррас ба вуҷуд меояд. фарҳанги идик (морфогенез, D5).Тасвирҳои контрасти марҳилавӣ морфологияи намояндагии ҳуҷайраҳои Caco-2-ро дар ҳар як қадами таҷрибавӣ ё нуқтаи вақт нишон медиҳанд (графи бар, 100 микрон).Чор диаграммаи схематикӣ, ки каскадҳои мувофиқи морфогенези рӯдаро (аз рости боло) тасвир мекунанд. Тирҳои рахнашуда дар самти ҷараёни моеъи боло S, тасвири болоии EM-ро нишон медиҳанд. -2 эпителий (аз чап). Маҷмӯае, ки майдони калонкардашударо нишон медиҳад (қуттии рахи сафед) микровиллии барқароршударо дар қабати 3D Caco-2 нишон медиҳад (аз рост). дар микроскопияи рӯда. Тирчаҳое, ки ба схемаи мобайн ишора мекунанд, ҷойгиршавии ҳамвории фокусиро барои ҳар як намуди конфокалӣ нишон медиҳанд.d, Ҷараёни вақти тағирёбии морфологии органоидҳо, ки дар микроскопияи контрасти фазавӣ дар рӯзҳои 3, 7, 9, 11 ва 13 ба даст оварда шудаанд. рӯда дар буридаи дар рӯзи 7.f гирифташуда, Тасвирҳои болоии иммунофлуоресцентӣ, ки маркерҳоро барои ҳуҷайраҳои бунёдӣ нишон медиҳанд (LGR5;magenta), ҳуҷайраҳои пиёла (MUC2; сабз), F-актин (хокистарӣ) ва ядрои (кабуд) дар микросхемаҳои рӯда дар тӯли 3 рӯз мутаносибан (Чап) ва органоидҳои 13-рӯза (миёна) дар қабати эпителиалӣ. Эпителияи органоидии 3D дар рӯда дар чип тавассути ранг кардани мембранаи плазма бо рангҳои CellMask (аз рост) дар рӯзи 13-и фарҳанг муқаррар шудааст. Бари миқёс 50 мкм аст, агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад.b Бо иҷозати истинод дубора чоп карда мешавад.2.Матбуоти Донишгоҳи Оксфорд;в Бо иҷозати Reference.2 мутобиқ карда шудааст.Матбуоти Донишгоҳи Оксфорд;e ва f бо иҷозат бо истинод мутобиқ карда шудааст.12 Дар доираи Литсензияи Creative Commons CC BY 4.0.
Дар рӯда дар як чип, барои бомуваффақият пӯшонидани ECM сатҳи гидрофобии мембранаи ковокии PDMS тағир додан лозим аст. Дар ин протокол, мо ду усули гуногунро барои тағир додани гидрофоб будани мембранаҳои PDMS истифода мебарем. Барои парвариши ҳуҷайраҳои Caco-2, фаъолсозии сатҳи танҳо тавассути табобати ултрабунафш / озон барои кам кардани сатҳи гидрофобикии ҳуҷайраҳои PCMD2 ва мембранаи PCMD2 кифоя буд. .Бо вуҷуди ин, фарҳанги микрофлюидикии эпителияи organoid талаб мекунад, ки функсионализатсияи сатҳи кимиёвӣ дар асоси кимиёвӣ барои ноил шудан ба таҳшини самараноки сафедаҳои ECM тавассути татбиқи пайдарпайи полиэтиленеимин (PEI) ва глутаральдегид ба микроканалҳои PDMS.Баъд аз тағир додани сатҳ, сафедаҳои ECM барои пӯшонидани ҳуҷайраҳои функсионалии PDMS ҷойгир карда шуданд ва пас аз он ба ҳуҷайраҳои функсионалии ҳуҷайраҳои эпителӣ пайваст карда мешаванд. фарҳанги ҳуҷайраи моеъ тавассути perfusing танҳо миёна ба microchannel боло оғоз то он даме, ки ҳуҷайраҳо як қабати пурра ташкил, дар ҳоле ки микроканал поёнӣ шароити статикӣ нигоҳ медорад. Ин усули оптимизатсияшуда барои фаъолгардонии рӯи ва молидани ECM имкон замимаи epithelium organoid ба ангеза morphogenesis 3D дар сатҳи PDMS.
Фарҳангҳои трансвелл инчунин пеш аз кишти ҳуҷайра қабати ECM-ро талаб мекунанд;Аммо, фарҳангҳои Трансвелл барои фаъол кардани сатҳи дохилҳои ковок қадамҳои мураккаби коркарди пешакиро талаб намекунанд. Барои парвариши ҳуҷайраҳои Caco-2 дар замимаҳои Transwell, пӯшиши ECM дар замимаҳои ковокӣ пайвастшавии ҳуҷайраҳои ҷудошудаи Caco-2 (<1 соат) ва ташаккули монеаи қатъии пайвастагиро (<1-2 рӯз) суръат мебахшад. ба сатҳи мембрана (<3 соат) меафтад ва то он даме, ки органоидҳо як қабати пурра бо тамомияти монеаро ташкил медиҳанд нигоҳ дошта мешаванд. Фарҳангҳои трансвелл дар плитаҳои 24-чоҳ бе истифодаи микросхемаҳои гибридӣ анҷом дода мешаванд.
Морфогенези in vitro 3D метавонад бо истифода аз ҷараёни моеъ ба ҷанбаи базотералии қабати муқарраршудаи эпителиалӣ оғоз шавад. Дар рӯда дар чип, морфогенези эпителиалӣ вақте оғоз шуд, ки миёна ба микроканалҳои болоӣ ва поёнӣ ворид карда шуд (Расми 3а). Тавре ки қаблан тавсиф шудааст, дар ҷорӣ кардани ҷараёни моеъи пайвастаи моеъ дар самти мукаммали моеъи моеъ муҳим аст (расми 3а). ингибиторҳои морфоген. Барои таъмини маводи ғизоии кофӣ ва хуноба ба ҳуҷайраҳои дар мембранаҳои ковок пайвастшуда ва тавлиди фишори люминалӣ, мо маъмулан ҷараёни дугонаро дар рӯда дар чип истифода мебарем. Дар микросхемаҳои гибридӣ, замимаҳои Трансвелл, ки дорои моноқабатҳои эпителиалӣ ба микросхемаҳои гибридӣ ворид карда шуданд. Сипас, миёнаравӣ дар зери порчаҳои басезинии порфаналӣ дар зери порчаҳои басезинӣ истифода бурда мешавад. пас аз 3-5 рӯз пас аз оғози ҷараёни базоlateral дар ҳарду платформаи фарҳангӣ ба амал омад.
Хусусиятҳои морфологии қабатҳои эпителиалии 3D-и микромуҳандисиро тавассути истифодаи усулҳои гуногуни тасвирӣ, аз ҷумла микроскопияи контрасти фазавӣ, микроскопияи дифференсиалии контраст (DIC), SEM ё микроскопияи конфокалии иммунофлуоресцентӣ (Расмҳои 3 ва 4) таҳлил кардан мумкин аст. қабатҳои телиалӣ. Аз сабаби шаффофияти оптикии PDMS ва филмҳои полиэстерӣ, ҳам платформаҳои чипи гибридӣ ва ҳам чипҳои гибридӣ метавонанд дар вақти воқеӣ бе зарурати ҷудокунӣ ё ҷудо кардани дастгоҳ тасвири воқеӣ таъмин кунанд. Ҳангоми иҷро кардани тасвири иммунофлуоресцентӣ (Расмҳои 1, 3cb) бо ҳуҷайраҳои маъмулӣ, fwt, бо банди 1, 4b, cwt ислоҳ карда мешаванд), алдегид (PFA), пас аз он Triton X-100 ва 2% (ваз/ҳаҷм)) альбумини хунобаи гов (BSA) ба тартиб оварда мешаванд. Вобаста аз намуди ҳуҷайра, фиксаторҳо, гузарандаҳо ва агентҳои блокаторро метавон истифода бурд. Рангҳои доғро, ки ба ядро ​​(масалан, 4′,6-диамидино-2-фенилен) индол, DAPI) ё F-актин (масалан, флуоресценти фаллоидин нишон дода шудаанд) нишон медиҳанд. Тасвирҳои зинда дар асоси флуоресцент низ метавонанд дар ин ҷо барои ошкор кардани истеҳсоли луоб анҷом дода шаванд (расми 1).1, "Тафовути ҳуҷайраҳо" ва "Физиологияи рӯда"), колонизатсияи тасодуфии ҳуҷайраҳои микробҳо (Расми 1, "Маданияти муштараки микробҳо"), ҷалби ҳуҷайраҳои иммунӣ (расми 1, "Моделсозии бемориҳо") ё контурҳои морфологияи эпителиалии 3D (Тағйир додани микробҳо). барои ҷудо кардани қабати болоӣ аз қабати microchannel поёнии, тавре ки дар ref.As дар расми 2 нишон дода шудааст, морфологияи эпителии 3D ва инчунин microvilli дар сарҳади хасу apical мумкин аст аз ҷониби SEM визуалӣ (расми. 3b) .Ифодаи нишонгузорҳои тафриқавӣ мумкин аст аз ҷониби иҷрои PCR5 миқдорӣ ё як ҳуҷайраи эпителиалии RNA дар ин ҳуҷайраҳои афзояндаи epitheli g дар ин ҳолат арзёбӣ карда мешавад. s ё микросхемаҳои гибридӣ тавассути трипсинизатсия ҷамъоварӣ карда мешаванд ва сипас барои таҳлили молекулавӣ ё генетикӣ истифода мешаванд.
а, Ҷараёни кор барои индуксияи морфогенези рӯда дар чипи гибридӣ. Caco-2 ва органоидҳои рӯда дар ин протокол барои намоиш додани морфогенези 3D дар платформаи чипи гибридӣ истифода мешаванд. Ҳуҷайраҳои эпителиалии ҷудошуда дар замимаҳои омодашудаи Transwell тухмипошакҳо карда шуданд (Ҳуҷайраҳои полиэстерӣ дар зер оварда шудаанд) (ниг. дохилкунии чоҳ, ҳамаи ҳуҷайраҳо дар шароити статикӣ парвариш карда шуданд (культураи TW). Пас аз 7 рӯз, як варақаи ягонаи Transwell дорои як қабати 2D ҳуҷайраҳои эпителиалӣ ба як чипи гибридӣ ворид карда шуд, то ҷараёни базолатералиро ҷорӣ кунад (Ҷараён, BL), ки дар ниҳоят ба тавлиди қабати эпителиалии 3D-и ҳуҷайраҳои эпителиалии консентратсияи микрофографии инсон оварда расонд. ҳуҷайраҳои lial, ки аз донори муқаррарӣ (хати C103) болоравии колон дар ҳар як қадами таҷрибавӣ ё нуқтаи вақт гирифта шудаанд. Схемаҳои қабатҳои болоӣ конфигуратсияи таҷрибавӣ барои ҳар як қадамро нишон медиҳанд.диаграммаи рост ва хатҳои нуқтадори мувофиқро бубинед).хусусиятҳои равшани морфологиро нишон доданд. F-актин (кабуд), ядро ​​(хокистарӣ).c, микрографҳои конфокалии флуоресцентӣ (намоиши кунҷи 3D) ҳуҷайраҳои эпителиалии аз органоид гирифташуда, ки дар Transwell статикӣ парвариш карда шудаанд (TW; дар дохили қуттии рахи сафед) бо чипи гибридӣ (калонтарин кадри пурра) нисбат ба 2D нисбат ба 2D. Намоишҳои амудии буриши амудӣ (дар кунҷи рости болоии ҷойгиршуда; “XZ”) инчунин хусусиятҳои 2D ва 3D-ро нишон медиҳанд. Сатри миқёс, 100 мкм.c Бо иҷозати истинод дубора чоп карда мешавад.4.Elsevier.
Назоратҳоро тавассути парвариши ҳамон ҳуҷайраҳо (Како-2 ё ҳуҷайраҳои эпителиалии органоидҳои рӯда) ба як қабатҳои дученака дар шароити фарҳанги анъанавии статикӣ омода кардан мумкин аст. Қобили зикр аст, ки камшавии маводи ғизоӣ метавонад аз сабаби маҳдуд будани ҳаҷми ҳаҷми микроканалҳо (яъне ~4 мкЛ дар канали болоӣ дар ҷараёни аслии рӯда-чип, тарҳрезии эпителиалии паҳлӯӣ ва пас аз татбиқи эпителологияи паҳлӯӣ) коҳиш ёбад. муқоиса.
Раванди литографияи нарм бояд дар як ҳуҷраи тоза анҷом дода шавад. Барои ҳар як қабати чип (қабатҳои болоӣ ва поёнӣ ва мембранаҳо) ва микросхемаҳои гибридӣ, фотомаскаҳои гуногун истифода мешуданд ва дар вафли алоҳидаи кремний сохта шудаанд, зеро баландии микроканалҳо гуногун буданд. Баландии ҳадафи микроканалҳои болоӣ ва поёнии рӯда дар чип 500 µm ва баландии ҳадафи каналро ташкил медиҳад. чип 200 микрон аст.
Вафли кремнийии 3-дюймаи 3-дюймаи онро дар табақе бо ацетон ҷойгир кунед. Табақро барои 30 сония бодиққат гардиш кунед, сипас вафлиро дар ҳаво хушк кунед. Вафлиро ба табақе бо IPA интиқол диҳед, сипас табақчаро барои тоза кардани 30 сония чарх занед.
Маҳлули пиранҳа (омехтаи пероксиди гидроген ва кислотаи консентратсионии сулфат, 1:3 (ҳаҷм/ҳаҷм)) метавонад ба таври ихтиёрӣ барои ба ҳадди аксар тоза кардани пасмондаҳои органикӣ аз сатҳи вафли кремний истифода шавад.
Маҳлули Пиранҳа бениҳоят зангзананда аст ва гармиро тавлид мекунад. Тадбирҳои иловагии бехатарӣ заруранд. Барои партофтани партовҳо, иҷозат диҳед, ки маҳлул хунук шавад ва ба як контейнери партовҳои тоза ва хушк интиқол дода шавад. Зарфҳои дуюмдараҷаро истифода баред ва контейнерҳои партовро дуруст нишон диҳед. Барои расмиёти муфассалтар дастурҳои бехатарии иншоотро риоя кунед.
Вафлиҳоро бо гузоштани онҳо дар табақи гармии 200 °C барои 10 дақиқа хушк кунед. Пас аз хушкшавӣ, вафлиро панҷ маротиба дар ҳаво ларзонд, то хунук шавад.
~10 г фоторезист SU-8 2100-ро ба маркази вафли кремнийи тозашуда резед. Барои баробар паҳн кардани фоторезист дар вафли аз пинцет истифода баред. Баъзан вафлиро дар табақчаи гарми 65°C ҷойгир кунед, то фоторезистент камтар часпанда ва паҳн кардани он осонтар бошад. Вафлиро мустақиман ба табақчаи гарм ҷойгир накунед.
SU-8 тавассути иҷро кардани қабати чарх ба вафли баробар тақсим карда шуд. Гарди воридотии SU-8-ро барои 5-10 сония барномарезӣ кунед, то дар 500 чархзанӣ бо шитоби 100 rpm/с паҳн шавад. Спини асосиро барои ғафсии 200 мкм дар шакли ғафсӣ дар 1,500 мкм (ғафсӣ ба 500 мкм50м) таъин кунед. баландии м барои қабати болоии рӯда дар чип; нигаред ба "Қадамҳои муҳим" дар зер) бо суръатбахшии 300 rpm/s 30 сония дар 1,200 чархзанӣ муқаррар карда мешавад.
Суръати асосии чархзаниро мувофиқи ғафсии ҳадафи намунаи SU-8 дар вафли кремний танзим кардан мумкин аст.
Барои сохтани намунаҳои SU-8 бо баландии 500 мкм барои қабати болоии рӯда дар чип, қабати чархзанӣ ва қадамҳои нонпазии нарми ин қуттӣ (қадамҳои 7 ва 8) пай дар пай такрор карда шуданд (ниг. қадами 9) то ду қабати 250 мкм. Як қабати ғафси SU-8, ки онро метавон қабати қабати қабати 250 мкм ба ин қуттии қабати 2 мк5 пайваст кард. .
Вафлиҳои СУ-8-ро бодиққат дар табақи гарм дар 65 °C барои 5 дақиқа ҷойгир кунед, сипас танзимро ба 95 °C гузаред ва барои 40 дақиқаи иловагӣ инкубатсия кунед.
Барои ноил шудан ба баландии 500 мкм намунаи SU-8 дар микроканали боло, қадамҳои 7 ва 8-ро такрор кунед, то ду қабати ғафсии SU-8 250 мкм тавлид кунед.
Бо истифода аз Aligner Mask UV, мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда озмоиши лампаро анҷом диҳед, то вақти таъсири вафлиро ҳисоб кунед.(вақти экспозиция, мс) = (вояи экспозиция, мҶ/см2)/(иқтидори чароғ, мВ/см2).
Пас аз муайян кардани вақти экспозиция, фотомаскаро ба дорандаи ниқоби алигнери ниқоби ултрабунафш ҷойгир кунед ва фотомаскаро ба вафли бо СУ-8 пӯшидашуда ҷойгир кунед.
Сатҳи чопшудаи фотониқобро мустақиман дар паҳлӯи СУ-8 бо қабати кремний ҷойгир кунед, то паҳншавии ултрабунафшро кам кунед.
Вафли SU-8 ва фотониқоби пӯшонидашуда амудӣ ба 260 мҶ/см2 нури ултрабунафшро барои вақти пешакии экспозитсия фош кунед (ниг. қадами 10-и ин қуттӣ).
Пас аз таъсири ултрабунафш, вафли кремнийи бо SU-8 печонидашуда дар 65 ° C барои 5 дақиқа ва 95 ° C барои 15 дақиқа дар ҳар як табақи гарм барои сохтани намунаҳо бо баландии 200 μm пухта шуданд. Вақти пас аз пухтан дар 95 °C то 30 дақиқа барои сохтани намунаҳои баландии 50 мкм.
Таҳиягар ба табақ шиша рехта мешавад ва вафли пухта дар табақ ҷойгир карда мешавад. Ҳаҷми таҳиягари SU-8 вобаста ба андозаи табақи шиша метавонад фарқ кунад. Боварӣ ҳосил кунед, ки таҳиягари SU-8-ро кофӣ истифода баред, то SU-8-ро пурра тоза кунед. Масалан, ҳангоми истифодаи табақчаи шишагии диаметри 150 мм бо зарфияти 1 L-80M 200% коркард кунед. бо гардиши нарм баъзан.
Қолаби таҳияшударо бо ~ 10 мл таҳиягари тару тоза ва пас аз IPA тавассути пошидани маҳлул бо пипетка бишӯед.
Вафлиро дар тозакунандаи плазма ҷойгир кунед ва ба плазмаи оксиген (гази атмосфера, фишори ҳадаф 1 × 10−5 Тор, қувваи 125 Вт) барои 1,5 дақиқа гузоред.
Вафлиро дар эксикатори вакуумӣ бо слайди шишагии дарун ҷойгир кунед. Вафлиҳо ва слайдҳоро паҳлӯ ба паҳлӯ ҷойгир кардан мумкин аст. Агар эксикатори вакуумӣ бо як табақ ба якчанд қабатҳо тақсим карда шавад, слайдҳоро дар камераи поёнӣ ва вафлиро дар камераи боло ҷойгир кунед. 100 мкЛ trichlorooc, H1H2,H2, мањлули д дар слайд шиша ва истифода вакуум барои силанизатсия.
Як шиша ҳуҷайраҳои яхкардаи Caco-2-ро дар ваннаи обии 37°C об кунед, сипас ҳуҷайраҳои обшударо ба колбачаи T75 интиқол диҳед, ки дорои 15 мл мухити қаблан гармшудаи Како-2 37°С мебошад.
Барои гузаштан аз ҳуҷайраҳои Caco-2 дар ~ 90% конфлюзия, аввал муҳити гарми Caco-2, PBS ва 0,25% трипсин / 1 мм EDTA дар ваннаи обии 37 ° C.
Аспиратсия миёна тавассути vacuum aspiration.Wash ҳуҷайраҳои ду маротиба бо 5 мл PBS гарм тавассути такрор саъю вакуум ва илова PBS тару тоза.