Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки аз браузери навшуда истифода баред (ё ҳолати мувофиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Дар ҳамин ҳол, барои таъмини идомаи дастгирӣ, мо сайтро бидуни услуб ва JavaScript намоиш медиҳем.
Морфогенези рӯдаи инсон хусусиятҳои крипт-виллуси микроархитектураи 3D эпителиалӣ ва ташкили фазоиро муқаррар мекунад. Ин сохтори беназир барои нигоҳ доштани гомеостази рӯда тавассути муҳофизат кардани чароғаки ҳуҷайраҳои бунёдӣ дар крипти базавӣ аз антигенҳои микробҳои экзогенӣ ва метаболитҳои онҳо зарур аст. монеа дар сатҳи луобпардаи рӯда. Аз ин рӯ, аз нав сохтани сохторҳои эпителиалии 3D барои сохтани моделҳои рӯда дар in vitro муҳим аст. Қобили зикр аст, ки рӯдаи миметикии органикӣ дар чип метавонад морфогенези 3D-и стихиявии эпителиуми рӯдаро ба вуҷуд оварад, ки мо функсияҳои мукаммали биофизикӣ ва биофизиро таъмин кунем. Протоколи такроршаванда барои ба таври устувор индукси морфогенези рӯда дар чипи микрофлюидӣ ва инчунин дар чипи гибридии Transwell ҷойгиршуда. Мо усулҳои муфассалро барои сохтани дастгоҳ, парвариши Caco-2 ё ҳуҷайраҳои эпителиалии органоидҳои рӯда дар танзимоти анъанавӣ ва инчунин дар платформаи3D тавсиф мекунем. морфогенез ва тавсифи эпителияи муқарраршудаи 3D бо истифода аз якчанд усулҳои тасвирӣ .Ин протокол ба барқарорсозии микроархитектураи функсионалии рӯда тавассути назорати ҷараёни моеъи базотералӣ барои 5 д. Усули морфогенези мо дар in vitro фишори фишурдашавӣ ва ҳаракати физиологии мувофиқро истифода мебарад ва ба мо имкон медиҳад, ки техникаи мураккаби муҳаррики ҳуҷайраҳо вуҷуд дошта бошад. тасаввур кунед, ки протоколи пешниҳодшудаи мо метавонад барои ҷомеаи тадқиқотии биотиббӣ таъсири васеъ дошта бошад ва усули барқарорсозии қабатҳои эпителиалии 3D-и рӯдаро дар in vitro барои барномаҳои биотиббӣ, клиникӣ ва фармасевтӣ таъмин кунад.
Таҷрибаҳо нишон медиҳанд, ки ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯдаҳои Caco-2, ки дар рӯда дар чип 1,2,3,4,5 ё дастгоҳҳои микрофлюидии дуқабат парвариш карда шудаанд6,7 метавонанд бидуни фаҳмиши дақиқи механизми аслӣ аз морфогенези 3D стихиявӣ гузаранд. барои ба вуҷуд овардани морфогенези 3D эпителиалӣ in vitro зарур ва кофӣ аст, ки онро Caco-2 ва органоидҳои рӯдаҳои аз беморон ҳосилшуда нишон додаанд. Ҳуҷайраҳои эпителиалӣ тасдиқ карда шуданд. Дар ин тадқиқот, мо махсусан ба истеҳсоли ҳуҷайра ва тақсимоти консентратсияи як антагонисти тавонои Wnt, Диккопф-1 (DKK-1) дар рӯда-дар-а-чип ва дастгоҳҳои микрофлюидии тағирёфтаи дорои замимаҳои Transwell бо номи "Чип гибридии" тамаркуз кардем. Репрессори Wnt 1, протеини марбут ба қаҳваранг 1, ё Soggy-1) ба рӯдаи рӯи чип морфогенезро бозмедорад ё қабати эпителиалии қаблан сохташудаи 3D-ро вайрон мекунад ва ба он ишора мекунад, ки фишори антагонистӣ ҳангоми парвариш барои морфогенези рӯда дар in vitro масъул аст. хориҷ кардан ё ҳадди ақал нигоҳ доштани сатҳи антагонистҳои Wnt дар қисмати basolateral тавассути оббозии фаъол (масалан, дар платформаҳои гибридии чип ё гибридии чип) ё паҳншавии .Базолатералӣ (масалан, аз Transwell inserts ба обанборҳои калони basolateral дар чоҳҳо).
Дар ин протокол, мо усули муфассалро барои сохтани микроаппаратҳои гибридии ба Трансвелл воридшаванда (қадамҳои 1-5) барои парвариши ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯда дар асоси полидиметилсилоксан (PDMS) дар мембранаҳои рахнашуда (қадамҳои 6A, 7A, 8, 9 дар мембранаҳои полиэстер) пешниҳод менамоем. 7B, 8, 9) ва морфогенези 3D-ро induced in vitro (қадами 10). Мо инчунин хусусиятҳои ҳуҷайравӣ ва молекулавиро муайян кардем, ки аз гистогенези хоси бофта ва тафриқаи ҳуҷайравии вобаста ба насл бо истифода аз усулҳои тасвирии сершумор (қадамҳои 11-24). ё органоидҳои рӯда, дар ду формати фарҳанг бо тафсилоти техникӣ, аз ҷумла тағир додани сатҳи мембранаҳои ковокӣ, эҷоди моноқабатҳои 2D ва биохимиявии рӯда ва Таҷдиди микромуҳити биомеханикӣ. in vitro. қисмати фарҳанг. Ниҳоят, мо муаррифии фоиданокии қабати эпителиалии барқароршавандаи 3D-ро пешниҳод мекунем, ки онро метавон барои моделсозии афзоиши эпителиалии аз морфоген вобаста, фарҳангҳои муштараки мизбон-микробиома, сирояти патоген, осеби илтиҳобӣ, халалдоршавии монеаи эпителиалӣ ва дар асоси пробиотикӣ.
Протоколи мо метавонад барои доираи васеи олимон дар соҳаи асосӣ (масалан, биологияи луобпардаи рӯда, биологияи ҳуҷайраҳои бунёдӣ ва биологияи рушд) ва тадқиқоти амалӣ (масалан, озмоиши маводи мухаддир, моделсозии беморӣ, муҳандисии бофтаҳо ва гастроэнтерология) муфид бошад. epithelium in vitro, мо дар назар дорем, ки стратегияи техникии мо метавонад ба шунавандагоне паҳн карда шавад, ки динамикаи сигнализатсияи ҳуҷайраҳоро ҳангоми рушди рӯдаҳо, барқароршавӣ ё гомеостаз меомӯзанд. Илова бар ин, протоколи мо барои пурсиши сироят дар зери агентҳои гуногуни сироятӣ ба монанди Norovirus 8, Syndrome шадиди роҳи нафас муфид аст CoronavirusSAfflostriicium (CoronavirusSAfflostriicidi2), Salmonella Typhimurium 9 ё Vibrio cholerae. Шунавандагони патология ва патогенези бемориҳо низ муфиданд. Истифодаи системаи микрофизиологии рӯда дар чип метавонад ба фарҳанги муштараки тӯлонӣ 10 ва арзёбии минбаъдаи муҳофизати мизбон, аксуламали иммунӣ ва таъмири осеби вобаста ба патоген дар рӯдаи меъдаю рӯда (GI) 11 .Дигар ихтилоли GI, бемории синдролиак, бемории синдролиак алоқаманд бошад. колитҳои захмӣ, поучит ё синдроми асаби рӯдаро ҳангоми тайёр кардани қабатҳои эпителиалии 3D рӯда бо истифода аз қабатҳои эпителиалии 3D рӯдаи бемор тақлид кардан мумкин аст, ба ин бемориҳо атрофияи виллӣ, кӯтоҳ шудани крипт, осеби луобпардаи луобпарда ё монеаи ҳуҷайраҳои эпителиалии вайроншуда ё тестӣ дохил мешаванд. organoids12,13. Барои беҳтар моделсозии мураккабии баландтари муҳити беморӣ, хонандагон метавонанд ба моделҳои дорои микроархитектураҳои 3D виллуси меъда-крипт илова кардани намудҳои ҳуҷайраҳои марбут ба беморӣ, ба монанди ҳуҷайраҳои мононуклеарии хуни бемор (PBMCs) баррасӣ кунанд. ҳуҷайраҳои иммунии хоси бофта, 5.
Азбаски микроструктураи эпителиалии 3D-ро бидуни раванди ҷудокунӣ собит ва визуалӣ кардан мумкин аст, тамошобиноне, ки дар транскриптомияи фазоӣ ва тасвири баландсифат ё супер-резолютсионӣ кор мекунанд, метавонанд ба харитасозии мо дар бораи динамикаи фазои-вақтии генҳо ва сафедаҳо дар чароғҳои эпителиалӣ таваҷҷӯҳ кунанд. Ба технология шавқманд аст. Ҷавоб ба ангезаҳои микробӣ ё иммунӣ. Ғайр аз ин, байниҳамдигарии тӯлонии мизбон-микробиома 10, 14, ки гомеостази рӯдаро ҳамоҳанг мекунад, дар қабати луобпардаи рӯда 3D тавассути якҷоя парвариш кардани намудҳои гуногуни микробҳо, ҷамоаҳои микробҳо ё микробиоти наҷосат, махсусан дар микробиоти наҷосат муқаррар карда мешавад. Ин равиш махсусан барои шунавандагоне, ки иммунологияи луобпардаҳо, гастроэнтерология, микробиомаи инсон, фарҳангшиносӣ ва микробиологияи клиникиро меомӯзанд, ҷолиб аст, ки мехоҳанд дар лаборатория микробиотаи қаблан коркарднашудаи рӯдаҳоро парвариш кунанд. 384 лавҳаҳои чоҳ, ки пайваста қисмҳои базолаҷро пур мекунанд, протокол инчунин метавонад ба онҳое паҳн карда шавад, ки платформаҳои фармасевтӣ, биотиббӣ ё скрининг ё тасдиқи баландсуръатро барои саноати хӯрокворӣ таҳия мекунанд. Ҳамчун далели принсип, мо ба наздикӣ имконнопазирии мултиплекси мултиплекси пластинҳои баландсуръатро ба формати мултиплекси пластинҳои баландсифатро нишон додем24. Маҳсулоти сершумори орган-дар-а-чип тиҷоратӣ шудаанд16,17,18. Аз ин рӯ, тасдиқи усули морфогенези in vitro мо метавонад суръат бахшад ва эҳтимолан аз ҷониби бисёре аз лабораторияҳои тадқиқотӣ, саноат ё мақомоти давлатӣ ва танзимкунанда барои фаҳмидани дубора барномарезии ҳуҷайравии морфогенези рӯдаи рӯда дар сатҳи транскриптатсия ва биотропии доруворӣ қабул карда шавад. номзадҳо бо истифода аз суррогатҳои рӯдаи 3D ё бо истифода аз моделҳои фармоишӣ ё тиҷории узвҳои чип барои арзёбии такрорпазирии раванди морфогенези рӯда арзёбӣ карда шуданд.
Шумораи маҳдуди моделҳои таҷрибавии марбут ба инсон барои омӯзиши морфогенези эпителиалии рӯда истифода шудаанд, ки асосан аз сабаби набудани протоколҳои амалӣ барои ба вуҷуд овардани морфогенези 3D дар vitro. Дарвоқеъ, бисёре аз донишҳои кунунӣ дар бораи морфогенези рӯда ба омӯзиши ҳайвонот асос ёфтааст (масалан, моҳии зебравӣ ё моҳии 22, 22, 22, 20, 20, 20, 20, 20, 20, 20). хароҷоти пуршиддат, метавонад аз ҷиҳати ахлоқӣ шубҳанок бошад, ва муҳимтар аз ҳама, ба таври дақиқ муайян кардани равандҳои рушди инсон нест. Ин моделҳо низ дар қобилияти худ дар як бисёрҷонибаи миқёспазир санҷида мешаванд. Аз ин рӯ, протоколи мо барои барқарорсозии сохторҳои бофтаи 3D дар vitro бартарӣ дар моделҳои ҳайвоноти vivo, инчунин дигар моделҳои анъанавии uD A тасвир шудааст. Сохторҳои эпителиалии 3D ба мо имкон доданд, ки ҷойгиршавии фазоии ҳуҷайраҳои дифференсиалӣ дар меҳвари крипт-виллус дар посух ба ангезаҳои гуногуни луобпарда ё иммунӣ тафтиш кунем. Қабатҳои эпителиалии 3D метавонанд фазоеро фароҳам оранд, ки чӣ гуна ҳуҷайраҳои микробҳо барои ташаккул додани чароғҳои фазоӣ ва эволютсияи экологӣ дар посух ба омилҳои мизбон рақобат мекунанд (масалан, қабати зидди луобпардаи 1 ва ифлосӣ, пептидҳо).Ғайр аз ин, морфологияи эпителиалии 3D ба мо имкон медиҳад, ки бифаҳмем, ки чӣ тавр микробиотаи рӯда ҷамоаҳои худро сохтор мекунад ва ба таври синергетикӣ метаболитҳои микробҳоро (масалан, кислотаҳои равғании кӯтоҳ) ба вуҷуд меорад, ки созмони ҳуҷайра ва чароғҳои ҳуҷайраҳои бунёдиро дар криптҳои базавӣ ташаккул медиҳанд.
Илова ба усули мо барои эҷоди сохторҳои эпителиалии 3D рӯда, якчанд усулҳои in vitro вуҷуд доранд. Фарҳанги органоидҳои рӯда як техникаи муосири муҳандисии бофта мебошад, ки ба парвариши ҳуҷайраҳои бунёдии меъда дар шароити мушаххаси морфоген асос ёфтааст23,24,25. Аммо, истифодаи моделҳои 3D ё моделҳои ҳостӣ-органоидҳои 3D барои таҳлили микробҳои микробҳо истифода мешавад. зеро люмени рӯда дар дохили органоид ҷойгир аст ва аз ин рӯ, ворид кардани ҷузъҳои люминалӣ ба монанди ҳуҷайраҳои микробҳо ё антигенҳои экзогенӣ маҳдуд аст. Дастрасӣ ба lumens organoid мумкин аст бо истифода аз microinjector,26,27 беҳтар, вале ин усул invaziv ва меҳнат-пуршиддат аст ва талаб дониши махсус барои иҷрои.Ба ғайр аз ин, фарҳангҳои органоид анъанавӣ дар scaffolds hydrogel дар шароити статикӣ нигоҳ дақиқ фаъол дар biomechanics vivo инъикос намекунад.
Дигар равишҳое, ки аз ҷониби якчанд гурӯҳҳои тадқиқотӣ истифода мешаванд, складҳои қаблан сохташудаи 3D гидрогелиро барои тақлид кардани сохтори эпителиалии рӯда тавассути парвариши ҳуҷайраҳои ҷудошудаи рӯдаи инсон дар сатҳи гел истифода мебаранд. Искафолҳои гидрогелро бо истифода аз қолабҳои 3D чопшуда, микрофрезашуда ё литографии сохташуда месозанд. градиентҳои морфогении аз ҷиҳати физиологӣ мувофиқ, муқаррар кардани таносуби баланди сохтори эпителиалӣ ва строма-эпителиалӣ тавассути дохил кардани ҳуҷайраҳои стромалӣ дар scaffold. Бо вуҷуди ин, табиати scaffolds пешакӣ сохташуда метавонад намоиши худи раванди морфогенетикии стихиявиро пешгирӣ кунад. Ҳуҷайраҳои рӯда бояд аз морфогенез гузаранд ва функсияи физиологиро ба даст оранд. Тадқиқоти дигари ба наздикӣ скафольдҳои гидрогелиро дар платформаи микрофлюидӣ ва сохторҳои эпителиалии рӯда бо истифода аз усулҳои лазерӣ истифода бурданд. Органоидҳои рӯдаҳои муш ба намунаҳои кандашуда пайравӣ мекунанд, то сохторҳои қубурҳои рӯдаро ба вуҷуд оранд ва бо истифода аз реаксияи моеъи дохилии моеъ. module.Бо вуҷуди ин, ин модел на равандҳои стихиявии морфогенетикиро намоиш медиҳад ва на ҳаракатҳои механикиологии рӯдаро дар бар мегирад. Усулҳои чопи 3D аз ҳамон гурӯҳ тавонистанд найҳои хурди рӯдаро бо равандҳои морфогенетикии стихиявӣ созанд. Сарфи назар аз сохти мураккаби сегментҳои гуногуни рӯда дар дохили найча, ин модел инчунин қобилияти ҷараёни механикӣ ва шакли моеъи механикиро надорад. маҳдуд аст, махсусан пас аз ба итмом расидани раванди биопринтинг, шароити таҷрибавӣ ё мутақобилаи ҳуҷайраҳо ба ҳуҷайраҳо. протоколи морфогенези 3D in vitro мо метавонад як равиши иловагиро барои бартараф кардани мушкилоти усулҳои мавҷуда таъмин кунад.
Протоколи мо комилан ба морфогенези эпителиалии 3D нигаронида шудааст, ки танҳо ҳуҷайраҳои эпителиалӣ дар фарҳанг ва дигар намудҳои ҳуҷайраҳои атроф ба монанди ҳуҷайраҳои мезенхимӣ, ҳуҷайраҳои эндотелиалӣ ва ҳуҷайраҳои иммунӣ вуҷуд надоранд. Тавре ки қаблан тавсиф карда шудааст, асосии протоколи мо индуксияи морфогенези эпителиалӣ бо роҳи бартараф кардани ингибиторҳои ҷарроҳии паҳлӯии семорфогени воридшуда мебошад. Дар ҳоле ки модулияти устувори рӯдаи дар чип ва гибридии чипи мо ба мо имкон медиҳад, ки қабати эпителиалии 3D-ро аз нав эҳё кунем, мураккабии иловагии биологӣ ба монанди таъсири мутақобилаи эпителиалӣ-мезенхимӣ33,34, матритсаи берун аз ҳуҷайра (ECM) таҳшин 35, моделҳои конвейерӣ ва,- дар криптҳои базавӣ бояд минбаъд баррасӣ карда шаванд.Ҳуҷайраҳои стромалӣ (масалан, фибробластҳо) дар мезенхима дар истеҳсоли сафедаҳои ECM ва танзими морфогенези рӯда дар vivo35,37,38.Илова кардани ҳуҷайраҳои мезенхимӣ ба модели мо раванди морфогенетикӣ ва самаранокии қабати пайвастшавии ҳуҷайраҳои endothelila (The endothelillas) ва маҳсулнокии бозикунии ҳуҷайраҳо нақши калидӣ мебозанд. нақши муҳим дар танзими интиқоли молекулавӣ39 ва ҷалби ҳуҷайраҳои иммунӣ40 дар микромуҳити рӯда. Ғайр аз ин, ҷузъҳои рагҳо, ки метавонанд байни моделҳои бофта пайваст шаванд, шарти ҳатмист, вақте ки моделҳои бофта барои нишон додани таъсири мутақобилаи бисёр узвҳо тарҳрезӣ шудаанд. Аз ин рӯ, ҳуҷайраҳои эндотелиалӣ бояд ба модели хусусиятҳои узвҳои физиологии дақиқтар дохил карда шаванд. Ҳуҷайраҳои иммунии аз беморон гирифташуда инчунин барои нишон додани аксуламалҳои иммунии модарзодӣ, муаррифии антиген, муқовимати иммунии модарзодии мутобиқшавӣ ва иммунитети хоси бофта дар заминаи тақлид кардани бемории рӯда муҳиманд.
Истифодаи микросхемаҳои гибридӣ нисбат ба gut-on-a-chip осонтар аст, зеро насби дастгоҳ соддатар аст ва истифодаи замимаҳои Transwell имкон медиҳад, ки фарҳанги миқёспазири эпителийи рӯдаро фароҳам оранд. Бо вуҷуди ин, замимаҳои дар тиҷоратӣ дастраси Transwell бо мембранаҳои полиэстерӣ чандир нестанд ва наметавонанд ҳаракатҳои ба перисталтикӣ монандро тақлид кунанд. бе фишори кӯчиш дар паҳлӯи апикалӣ устувор монд. Равшан аст, ки хосиятҳои статикӣ дар қисмати апикалӣ хеле кам имкон медиҳанд, ки дар микросхемаҳои гибридӣ ко-культурии бактериявии дарозмуддатро таъмин кунанд. Дар ҳоле ки мо метавонем ҳангоми истифодаи микросхемаҳои гибридӣ ба таври мӯътадил морфогенези 3D-ро ба вуҷуд орем. платформаҳои чипи гибридӣ барои барномаҳои эҳтимолӣ.
Таҷдиди миқёси пурраи меҳвари крипт-виллуси инсон дар фарҳангҳои гибриди дар чип ва гибридии микросхемаҳои одам пурра муқаррар карда нашудааст. Азбаски морфогенез аз як қабати эпителиалӣ оғоз мешавад, микроархитектураҳои 3D ҳатман шабоҳати морфологиро ба хислати протсессории ҳуҷайраҳои дар наздикии криптатсияшуда таъмин намекунанд. домени крипти базавӣ дар эпителиуми микромуҳандисии 3D, минтақаҳои крипт ва виллӣ ба таври возеҳ ҷудо карда нашудаанд. Ҳарчанд каналҳои болоии чип боиси баланд шудани баландии эпителияи микромуҳандисӣ мешаванд, баландии максималӣ то ҳол бо ~300-400 мкм маҳдуд аст. Амиқии воқеии крипти меъдаҳои рӯдаи рӯдаи инсон ~ 3 мкм хурд аст ва ~400 мкм, мутаносибан ва баландии вилли рӯдаҳои хурд ~ 600 микрон аст41.
Аз нуқтаи назари визуалӣ, тасвири баландсифати микроархитектураҳои 3D метавонад бо рӯда дар чип маҳдуд карда шавад, зеро масофаи зарурии корӣ аз линзаи объективӣ то қабати эпителиалӣ ба миқдори чанд миллиметр аст. Барои бартараф кардани ин мушкилот, ҳадафи дурдаст лозим аст. PDMS.Ғайр аз ин, азбаски микрофабрикаи қабати-қабати рӯда дар як чип пайвастагии доимии байни ҳар як қабатро дар бар мегирад, кушодан ё хориҷ кардани қабати болоӣ барои тафтиши сохтори сатҳи қабати эпителиалӣ хеле душвор аст. Масалан, бо истифода аз микроскопи электронии сканерӣ (SEM).
Гидрофобии PDMS омили маҳдудкунанда дар таҳқиқоти микрофлюидӣ дар асоси молекулаҳои хурди гидрофобӣ буд, зеро PDMS метавонад чунин молекулаҳои гидрофобиро ғайримуқаррарӣ адсорб кунад. Алтернативаҳои PDMS метавонанд бо дигар маводи полимерӣ баррасӣ карда шаванд. гликол) 43) барои кам кардани адсорбсияи молекулаҳои гидрофобӣ ҳисоб кардан мумкин аст.
Ниҳоят, усули мо аз нуқтаи назари таъмини скрининги баландсуръат ё платформаи таҷрибавии барои корбар-дӯсти “як андоза” хуб тавсиф карда нашудааст. Протоколи ҷорӣ як насоси сӯзандоруро барои як дастгоҳи хурд талаб мекунад, ки дар инкубатори CO2 ҷой ишғол мекунад ва аз таҷрибаҳои миқёси калон пешгирӣ мекунад. 96-чоҳ, ё 384-чоҳҳои ковокӣ, ки имкон медиҳанд, ки пайваста пурра ва хориҷ кардани ВАО-и базоlateral).
Барои ба вуҷуд овардани морфогенези 3D-и эпителияи рӯдаи инсон дар vitro, мо як дастгоҳи микрофлюидии рӯдаро истифода кардем, ки дорои ду микроканалҳои мувозӣ ва мембранаи поруси чандирӣ дар байни онҳо барои эҷод кардани интерфейси люмен-капиллярӣ мебошад. қабатҳои эпителиалӣ, ки дар inserts Transwell парвариш карда мешаванд. Дар ҳарду платформа, морфогенези ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯдаҳои гуногуни инсон тавассути истифодаи манипуляцияи самти ҷараёни ҷараён барои хориҷ кардани антагонистҳои морфоген аз қисмати базотерналӣ нишон дода мешавад. Тамоми тартиби таҷрибавӣ (Расми 1) аз панҷ қисм иборат аст: (i) чипси микрофобрид дар Transwell. (қадамҳои 1-5; Чорчӯби 1), (ii) тайёр кардани ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯда (ҳуҷайраҳои Caco-2) ё органоидҳои рӯдаи инсон; қуттиҳои 2-5), (iii) фарҳанги ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯда дар микросхемаҳои рӯда ё микросхемаҳои гибридӣ (қадамҳои 6-9), (iv) индуксияи морфогенези 3D in vitro (қадами 10) ва (v) ) барои тавсифи микроструктураи эпителиалии 3D (қадамҳои мувофиқи гурӯҳи 2-F, дар гурӯҳи 41). дар зер) барои тасдиқи самаранокии морфогенези in vitro бо роҳи муқоисаи морфогенези эпителиалӣ бо назорати фазоӣ, вақтӣ, шартӣ ё мурофиавӣ тарҳрезӣ шудааст.
Мо ду платформаи фарҳангии гуногунро истифода бурдем: чип-дар-а-чип бо каналҳои рост ё каналҳои печонидашудаи ғайрихаттӣ ё микросхемаҳои гибридии дорои васлкунакҳои Transwell (TW) дар дастгоҳи микрофлюидӣ, ки тавре дар қуттии 1 тавсиф шудаанд ва қадами 1-5. “Таҷҳизоти дастгоҳ” қадамҳои асосии сохтани чипи ягона ё гибтестии инсониро нишон медиҳад. Ҳуҷайраҳо" манбаи ҳуҷайра (Caco-2 ё органоидҳои рӯдаи инсон) ва тартиби парвариши дар ин протокол истифодашударо шарҳ медиҳад. "Морфогенези in vitro" марҳилаҳои умумиро нишон медиҳад, ки дар он ҳуҷайраҳои эпителиалии аз органоид гирифташуда дар чипи рӯда ё дар замимаҳои Transwell аз микросхемаҳои гибридизатсия ва чипфогени гибридизатсияшуда парвариш карда мешаванд. сохтори эпителиалӣ. Рақами қадами барнома ё рақами қуттӣ дар зери ҳар як тир нишон дода мешавад. Дар барнома мисолҳое оварда шудааст, ки чӣ тавр қабатҳои эпителиалии муқарраршудаи рӯдаро метавон истифода бурд, масалан, дар тавсифи фарқияти ҳуҷайра, омӯзиши физиологияи рӯда, таъсиси экосистемаҳои микробиомаи мизбон ва моделсозии беморӣ. Дар қабати эпителиалии 3D Caco-2, ки дар чипи рӯда тавлид шудааст, ифода ёфтааст. Сигналгузории MUC2 дар ҳуҷайраҳои пиёла ва луобе, ки аз сатҳи луобпарда ҷудо мешавад. "Хаст-Микробҳои муштарак" фарҳангҳои муштараки мизбон-микробиомаро дар рӯда дар чип нишон медиҳанд. Дар панели чап фарҳанги coli-и E. coli, ки сафедаи флуоресценти сабзро (GFP) бо ҳуҷайраҳои эпителиалии микромуҳандисии 3D Caco-2 ифода мекунад, нишон медиҳад. Дар панели рост маҳалли ҷойгиршавии ҳуҷайраҳои эпителиалии GFP-D Caco-2, coli-и GFP E. пас аз он рангкунии иммунофлуоресцентӣ бо F-актин (сурх) ва ядроҳо (кабуд). Моделсозии бемориҳо солим ва рӯдаи leaky дар микросхемаҳои илтиҳоби рӯда дар зери мушкилоти физиологӣ бо антигенҳои бактериявӣ (масалан, липополисахарид, LPS) ва ҳуҷайраҳои иммунӣ (масалан, ба ҳуҷайраҳои PBMC-и сабз таъсис дода шудаанд) нишон медиҳад. қабат. Сатри миқёс, 50 ​​мкм. Тасвирҳо дар сатри поён: "Фарқияти ҳуҷайраҳо" бо иҷозати истинод мутобиқ карда шудаанд.2. Матбуоти Донишгоҳи Оксфорд; Бо иҷозати Ref.5 нусхабардорӣ шудааст. NAS; "Корманд-Фарҳанги микробҳо" бо иҷозати ref.3 мутобиқ карда шудааст. NAS; "Моделсозии бемориҳо" бо иҷозати истинод мутобиқ карда шудааст.5. NAS.
Ҳарду чипҳои гибридӣ бо истифода аз репликаҳои PDMS сохта шудаанд, ки аз қолабҳои кремний бо литографияи нарм канда шуда буданд1,44 ва бо SU-8 тарҳрезӣ шудаанд. Тарҳрезии микроканалҳо дар ҳар як чип бо назардошти гидродинамика ба монанди фишори кӯч ва фишори гидродинамикӣ муайян карда мешавад1,4,12. Тарҳрезии аслӣ, аз ду микроканалҳои рости параллелӣ дар ҳамҷояшуда иборат буда, ба як чипи мураккаб табдил ёфт (Маълумоти васеъшуда Расми 1b), ки як ҷуфт микроканалҳои каҷро дар бар мегирад, то вақти зиёдшавии моеъ, шаклҳои ҷараёни ғайрихаттӣ ва деформатсияи бисёрсоҳаи ҳуҷайраҳои парваришшавандаро дар бар мегирад (расми 2aW барои биоканикаи мураккаб бештар лозим аст). recreated, gut-on-a-chips мураккаб метавонад интихоб карда шавад. Мо нишон додем, ки Gut-Chip печида низ сахт induces morphogenesis 3D дар чаҳорчӯбаи вақт шабеҳ бо дараҷаи шабеҳи афзоиши эпителиалӣ дар муқоиса бо Gut-Chip аслӣ, новобаста аз навъи ҳуҷайраи фарҳангӣ. Аз ин рӯ, ба inducearogenesis дар linemorphogenesis ва тарҳрезии gmorphogenesis, replices.PDMS табобатшаванда дар қолибҳои кремний бо намунаҳои SU-8 пас аз demolding хусусиятҳои манфии таъмин (расми 2a) .Барои истеҳсоли рӯда дар як чип, қабати болоии PDMS тайёр пай дар пай ба як филми PDMS ковок пайваст карда шуд ва сипас бо қабати PDMS поёнии мувофиқ бо истифода аз матоъ бебозгашт бо истифода аз corg2b). микросхемаҳои гибридӣ, репликаҳои PDMS-и шифоёфта ба слайдҳои шишагӣ пайваст карда шуданд, то дастгоҳҳои микрофлюидикии як каналро эҷод кунанд, ки метавонанд воридҳои Transwell -ро ҷойгир кунанд (Расми 2h ва Маълумоти васеъшуда расми 2). Раванди пайвастшавӣ тавассути коркарди сатҳи репликаи PDMS ва шиша бо коркарди оксигени плазмаи microonab пайваст карда мешавад. найчаи силикон, насби дастгоҳ барои иҷрои 3D морфогенези эпителийи рӯда омода буд (Расми 2g).
а, Тасвири схемавии омодасозии қисмҳои PDMS аз қолибҳои кремнийи намунавии SU-8. Маҳлули PDMS шифонаёфта ба қолаби кремний (аз чап) рехта шуд, дар 60 °C (миёна) табобат карда шуд (аз рост). қолаби кремний истифода бурда мешавад барои истеҳсоли membrane PDMS porous.d, Як қатор аксҳои ҷузъҳои болоӣ ва поёнии PDMS ва дастгоҳи рӯда дар чип ҷамъ. convoluted microchannels convoluted ва камераҳои вакуум.g, Setup of gut-on-a-chip for microfluidic cell culture.The рӯдаи бофта дар як чипи ҷамъ бо найчаи силикон ва сӯзандору дар як coverslip ҷойгир карда шуд. Дастгоҳи чип дар сарпӯши як 150 мм ҷойгир карда шуд, ки ба найчаи визуалӣ найчаи Petri барои коркарди пӯшидани найчаи Petri истифода бурда мешавад. Лавҳаҳои сохтани чипи гибридӣ ва морфогенези 3D бо истифода аз микросхемаҳои гибридӣ. Замимаҳои Трансвелл мустақилона барои фарҳанг омода карда шуданд. Моноқабатҳои 2D ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯда ба чипи гибридӣ ворид карда шуданд, то морфогенези 3D-и меъдаро ба вуҷуд оранд. Дар миёнаравӣ тавассути қабати microchannelS дар қабати microchannel S perfused карда мешавад. бар, 1 см.ч Бо ичозати справка.4. Elsevier.
Дар ин протокол, хати ҳуҷайраҳои Caco-2 ва органоидҳои рӯда ҳамчун манбаи эпителиалӣ истифода мешуданд (расми 3a). Ҳарду намуди ҳуҷайраҳо мустақилона парвариш карда шуданд (Қуттии 2 ва Қуттии 5) ва барои тухми микроканалҳои бо ECM пӯшонидашудаи рӯдаи чип ё замимаҳои Трансвелл истифода мешуданд. Вақте ки ҳуҷайраҳо ба ҳам мепайванданд (95% пӯшонида мешаванд), Ҳуҷайраҳои Caco-2 (байни гузаргоҳҳои 10 ва 50) дар колбаҳо барои тайёр кардани суспензияҳои ҳуҷайраҳои ҷудошуда тавассути моеъи трипсинатсия (қуттии 2) ҷамъоварӣ карда мешаванд. Органоидҳои рӯдаи инсон аз биопсияҳои рӯда ё резекцияҳои ҷарроҳӣ дар гунбазҳои скафанди Матригел парвариш карда шуданд, ки дар онҳо микросхемаҳои муҳими 24-чоҳро дастгирӣ мекунанд. морфогенҳо (ба монанди Wnt, R-spondin ва Noggin) ва омилҳои афзоиш, ки дар қуттии 3 тавсиф шудаанд, ҳар рӯзи дигар илова карда мешуданд, то он даме ки органоидҳо дар диаметри ~ 500 мкм калон шаванд. навъи беморӣ 12,13 (масалан, колитҳои захми, бемории Крон, саратони рӯдаи рӯда ё донори муқаррарӣ), макони осеб (масалан, осеб дар муқоиса бо минтақаи осебнадошта) ва ҷойгиршавии меъдаю рӯда дар рӯда (масалан, рӯдаи duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, or rectum). (колоидҳо), ки одатан консентратсияи баланди морфогенҳоро нисбат ба органоидҳои рӯдаҳои хурд талаб мекунанд.
а, Ҷараёни кор барои индуксияи морфогенези рӯда дар чипи рӯда. Caco-2 эпителияи рӯдаҳои инсон ва organoids рӯдаҳо дар ин протокол барои намоиш додани морфогенези 3D истифода мешаванд. Ҳуҷайраҳои эпителиалии ҷудошуда дар дастгоҳи омодашудаи рӯда-оид-а-чипнс тухмипошакҳо карда шуданд (ҳуҷайраҳои чипӣ гузошта шудаанд) (замима карда мешавад) ба мембранаи porous PDMS дар рӯзи 0 (D0), апикалӣ (AP) ҷараёни оғоз ва нигоҳ дошта мешавад, дар давоми 2 рӯзи аввал (ҷараён, AP, D0-D2). Ҷараёни basolateral (BL) низ дар якҷоягӣ бо ҳаракатҳои дарозии давравӣ (дароз, ҷараён, AP ва BL) оғоз мешавад, вақте ки як шакли пурраи 2D layerer monophogens. Пас аз 5 рӯзи фарҳанги микрофлюидӣ (морфогенез, D5) ба таври стихиявӣ ба вуқӯъ пайваст. Тасвирҳои контрасти марҳилавӣ морфологияи намояндагии ҳуҷайраҳои Caco-2-ро дар ҳар як қадами таҷрибавӣ ё нуқтаи вақт нишон медиҳанд (графи бар, 100 микрон). Чор диаграммаи схематикӣ, ки каскадҳои мувофиқи моеъро дар самти рост нишон медиҳанд. flow.b, тасвири SEM, ки топологияи сатҳи эпителияи муқарраршудаи 3D Caco-2 (аз чап) нишон медиҳад. Дар маҷмӯа, ки майдони калонкардашударо нишон медиҳад (қуттии рахи сафед) микровилли барқароршударо дар қабати 3D Caco-2 нишон медиҳад (аз рост).c, Намоиши уфуқии фронталии муқарраршудаи Caco-2 3D, claudin (ZO) мембранаҳои пайвастаи F (cloudin (ZO) labeln brushed). ва ядроҳо (кабуд) визуализатсияи конфокалии ҳуҷайраҳои эпителиалӣ дар микросхемаҳои рӯда. Тирҳое, ки ба схемаи мобайнӣ ишора мекунанд, ҷойгиршавии ҳавопаймои фокусиро барои ҳар як намуди конфокалӣ нишон медиҳанд.d, Вақти тағироти морфологӣ дар organoids, ки дар чипи тавассути микроскопияи контрасти фазавӣ ба даст оварда шудааст, дар рӯзҳои 3, 7, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1). калоншавии баланди тасвири пешниҳодшударо нишон медиҳад.e, фотомикрографи DIC эпителияи органоидҳои 3D дар рӯда дар буридаи дар рӯзи 7.f гирифташуда муқаррар карда шудааст, Тасвирҳои болоии иммунофлуоресцентӣ, ки маркерҳоро барои ҳуҷайраҳои бунёдӣ (LGR5; магента), ҳуҷайраҳои гоблетӣ (MUC2; сабз), F-актин (сабз), чиптаҳои F-актин (сабз) ва дар рӯзҳо афзоиш меёбанд. (Чап) ва органоидҳои 13-рӯза (миёна) дар қабати эпителиалӣ. Ҳамчунин нигаред ба Маълумоти васеъшуда ба расми 3, ки сигнализатсияи LGR5-ро бидуни сигнализатсияи MUC2 таъкид мекунад. Тасвирҳои флуоресцентӣ, ки микроструктураи эпителиалии (аз рост) эпителиуми органоидҳои 3D дар рӯда таъсис дода шудаанд (аз тарафи рост) бо ранг кардани мембранаи C13 бо микросхемаҳои фарҳанг. Сатри миқёс 50 мкм аст, агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад.b Бо иҷозати истинод дубора чоп карда мешавад.2. Матбуоти Донишгоҳи Оксфорд; в Бо иҷозати Reference.2 мутобиқ карда шудааст. Матбуоти Донишгоҳи Оксфорд; e ва f бо иҷозат бо истинод мутобиқ карда шудааст.12 Дар доираи Литсензияи Creative Commons CC BY 4.0.
Дар рӯда дар як чип, барои бомуваффақият пӯшонидани ECM сатҳи гидрофобии мембранаи ковокии PDMS тағир додан лозим аст. Дар ин протокол, мо ду усули гуногунро барои тағир додани гидрофоб будани мембранаҳои PDMS истифода мебарем. Барои парвариши ҳуҷайраҳои Caco-2, фаъолсозии сатҳ тавассути коркарди ултрабунафш / озон танҳо барои кам кардани сатҳи гидрофобикии ҳуҷайраҳои Ca-DCM2 кифоя буд. PDMS membrane.Бо вуҷуди ин, фарҳанги микрофлюидикии эпителияи органоид талаб мекунад, ки функсионалӣ дар асоси кимиёвии рӯизаминӣ барои ноил шудан ба таҳшини самараноки сафедаҳои ECM тавассути татбиқи пайдарпайи полиэтиленеимин (PEI) ва глутаральдегид ба микроканалҳои PDMS. Пас аз тағир додани сатҳи, сафедаҳои ECMMS пасандоз карда шуданд, то ба рӯйпӯш кардани сатҳи органоид ҷойгир карда шаванд. epithelium.After ҳуҷайраҳои замима шудаанд, фарҳанги ҳуҷайраи microfluidic оғоз бо perfusing танҳо миёна ба microchannel болоӣ то ҳуҷайраҳои ташкил monolayer пурра, дар ҳоле ки microchannel поёнии нигоҳ шароити статикӣ.Ин усули оптимизатсияшуда барои фаъолгардонии рӯи ва молидани ECM имкон замимаи epithelium organoid ба ангеза 3D рӯи PMSphogenesis.
Фарҳангҳои трансвелл инчунин пеш аз кишти ҳуҷайра қабати ECM-ро талаб мекунанд; Аммо, фарҳангҳои Трансвелл барои фаъол кардани сатҳи порус қадамҳои мураккаби коркарди пешакиро талаб намекунанд. Барои парвариши ҳуҷайраҳои Caco-2 дар замимаҳои Трансвелл, пӯшиши ECM дар замимаҳои ковок пайвастшавии ҳуҷайраҳои парокандаи Caco-2 (<1 соат) ва ташаккули монеаи қатъии пайвастшавиро (<1-2 рӯз) суръат мебахшад. замимаҳое, ки ба сатҳи мембрана (<3 соат) замима карда мешаванд ва то он даме, ки органоидҳо як қабати пурра бо тамомияти монеаро ташкил медиҳанд нигоҳ дошта мешаванд. Фарҳангҳои трансвеллӣ дар плитаҳои 24-чоҳ бе истифодаи микросхемаҳои гибридӣ анҷом дода мешаванд.
Морфогенези 3D дар vitro метавонад бо истифода аз ҷараёни моеъ ба ҷанбаи базотералии қабати муқарраршудаи эпителиалӣ оғоз шавад. Дар рӯда дар чип, морфогенези эпителиалӣ вақте оғоз шуд, ки миёна ба микроканалҳои болоӣ ва поёнӣ ворид карда шуд (расми 3a). Тавре ки қаблан тавсиф карда шудааст, дар ҷорӣ кардани ҷараёни пайвастаи моеъ дар артиши пайвастаи моеъ (комплантиалӣ) муҳим аст. Ингибиторҳои секретсияи морфогени самтбахш. Барои таъмин намудани маводи ғизоӣ ва хунобаи кофӣ ба ҳуҷайраҳои дар мембранаҳои ковок пайвастшуда ва тавлиди фишори ҷудошавии люминалӣ, мо маъмулан ҷараёни дугонаро дар рӯда дар чип татбиқ мекунем. microchannel.morphogenesis меъда 3-5 рӯз пас аз оғози ҷараёни basolateral дар ҳар ду платформаи фарҳанг рух дод.
Хусусиятҳои морфологии қабатҳои эпителиалии 3D-и микромуҳандисиро тавассути истифодаи усулҳои гуногуни тасвирӣ, аз ҷумла микроскопияи контрасти фазавӣ, микроскопияи дифференсиалии контраст (DIC), SEM ё микроскопияи иммунофлуоресцентӣ (Расмҳои 3 ва 4) таҳлил кардан мумкин аст. қабатҳои эпителиалии 3D. Аз сабаби шаффофияти оптикии PDMS ва филмҳои полиэстерӣ, ҳам платформаҳои чипи гибридӣ ва ҳам чипҳои гибридӣ метавонанд дар вақти воқеӣ бе зарурати ҷудокунӣ ё демонтажи дастгоҳ тасвирро таъмин кунанд. Ҳангоми иҷрои тасвири иммунофлуоресцентӣ (расмҳои 3, f4 ва бо ҳуҷайраҳои маъмулӣ), 4% (вазна/ҳаҷм) параформальдегид (PFA), пас аз он Triton X-100 ва 2% (ваз/ҳаҷм)) альбумини хунобаи гов (BSA) бо тартиб. Вобаста аз намуди ҳуҷайра, фиксаторҳои гуногун, пермеабилиизаторҳо ва агентҳои блокаторро метавон истифода бурд. чип, ки пас аз он антителоҳои дуюмдараҷа дар якҷоягӣ бо рангҳои муқобил, ки ба ядро ​​(масалан, 4′,6-диамидино-2-фенилен) индол, DAPI) ё F-актин (масалан, флуоресценти флуоресцентӣ нишон дода шудаанд) нишон медиҳанд. Тасвирҳои зинда дар асоси флуорессенс низ метавонанд дар situ, истеҳсоли "муг1"-и гуногун анҷом дода шаванд (Fi ба истеҳсоли "G1". физиология»), мустамликадории тасодуфии ҳуҷайраҳои микробҳо (расми 1, «Хаст-микробҳои муштарак»), ҷалби ҳуҷайраҳои иммунӣ (расми 1, «Моделсозии бемориҳо») ё контурҳои морфологияи эпителиалии 3D (расми 3c,f ва 4b,c барои ҷудо кардани қабати поёнии чиппер аз ҷудо кардани қабати W). қабати microchannel, тавре ки дар ref.As тасвир дар расми 2 нишон дода шудааст, морфологияи эпителиалии 3D ва инчунин microvilli дар сарҳади хасу apical мумкин аст аз ҷониби SEM (расми 3b) визуалӣ. Ифодаи маркерҳои тафриқавӣ метавонад тавассути иҷрои PCR5 миқдорӣ ё пайдарпай RNA якҳуҷайраҳо арзёбӣ карда шаванд. микросхемаҳои гибридӣ бо роҳи трипсинизатсия ҷамъоварӣ карда мешаванд ва сипас барои таҳлили молекулавӣ ё генетикӣ истифода мешаванд.
a, Ҷараёни кор барои индуксияи морфогенези рӯда дар чипи гибридӣ. Caco-2 ва органоидҳои рӯда дар ин протокол барои намоиш додани морфогенези 3D дар платформаи чипи гибридӣ истифода мешаванд. Ҳуҷайраҳои эпителиалии ҷудошуда дар замимаҳои омодашудаи Transwell тухмипошакҳо карда шуданд (Ҳуҷайраҳои пешакии TW дар зер оварда шудаанд) ва дар зер оварда шудаанд. мембранаҳои полиэстерӣ дар замимаҳои Transwell, ҳама ҳуҷайраҳо дар шароити статикӣ парвариш карда шуданд (маданияти TW). Пас аз 7 рӯз, як замимаи ягонаи Transwell дорои як қабати 2D ҳуҷайраҳои эпителиалӣ ба як чипи гибридӣ ворид карда шуд, то ҷараёни базотералиро ҷорӣ кунад (Ҷараён, BL), ки дар ниҳоят ба тавлиди қабати 3D микрографи эпителиалии консентралӣ оварда расонд. нишон медиҳад, ки хусусиятҳои морфологии ҳуҷайраҳои эпителиалии узвҳои инсон, ки аз донори муқаррарӣ (хати C103) ба болоравии колония дар ҳар як қадами таҷрибавӣ ё нуқтаи вақт гирифта шудаанд. Схематикӣ дар қабатҳои болоӣ конфигуратсияи таҷрибавиро барои ҳар як қадам нишон медиҳад. мавқеъҳо (болоӣ, миёна ва поёнӣ; ба схематикии рост ва хатҳои нуқтадори мувофиқ нигаред). хусусиятҳои равшани морфологиро нишон дод. F-актин (кабуд), ядро ​​(хокистарӣ).c, Микрографҳои конфокалии флуоресцентӣ (намоиши кунҷи 3D) ҳуҷайраҳои эпителиалии аз органоид ҳосилшуда, ки дар Transwell статикӣ парвариш карда шудаанд (TW; воридшуда дар дохили қуттии рахи сафед) бо чипи гибридӣ (калонтарин кадри пурра) нисбат ба паҳлӯ3D. Намоишҳои буриши амудии 2D (дар кунҷи рости боло ҷойгир карда шудааст; "XZ") инчунин хусусиятҳои 2D ва 3D-ро нишон медиҳанд. Сатри миқёс, 100 мкм.c Бо иҷозати истинод дубора чоп карда мешавад.4. Elsevier.
Назоратро тавассути парвариши ҳамон ҳуҷайраҳо (Како-2 ё ҳуҷайраҳои эпителиалии органоидҳои рӯда) ба як қабатҳои дученака дар шароити фарҳанги анъанавии статикӣ омода кардан мумкин аст. Қобили зикр аст, ки камшавии маводи ғизоӣ метавонад аз сабаби маҳдуд будани ҳаҷми ҳаҷми микроканалҳо (яъне ~4 мкЛ дар канали болоӣ оид ба тарҳи аслии рӯда-чип, тарҳрезии эпителологияи паҳлӯӣ ва пас аз татбиқи эпителология) кам шудани маводи ғизоӣ ба вуҷуд ояд. ҷараёнро низ муқоиса кардан мумкин аст.
Раванди литографияи нарм бояд дар як ҳуҷраи тоза анҷом дода шавад. Барои ҳар як қабати чип (қабатҳои болоӣ ва поёнӣ ва мембранаҳо) ва микросхемаҳои гибридӣ фотомаскаҳои гуногун истифода мешуданд ва дар вафлиҳои алоҳидаи кремний сохта шудаанд, зеро баландии микроканалҳо гуногун буданд. Баландии ҳадафи микроканалҳои болоӣ ва поёнии рӯда дар чип 500 µm, баландии ҳадафи каналҳо мебошад. чипи гибридӣ 200 микрон аст.
Вафли кремнийии 3-дюймаи 3-дюймаи онро дар табақе бо ацетон ҷойгир кунед. Табақро барои 30 сония бодиққат гардиш кунед, сипас вафлиро дар ҳаво хушк кунед. Вафлиро ба табақе бо IPA интиқол диҳед, сипас табақчаро барои тоза кардани 30 сония чарх занед.
Маҳлули пиранҳа (омехтаи пероксиди гидроген ва кислотаи консентратсионии сулфат, 1:3 (ҳаҷм/ҳаҷм)) метавонад ба таври ихтиёрӣ барои ба ҳадди аксар тоза кардани пасмондаҳои органикӣ аз сатҳи вафли кремний истифода шавад.
Маҳлули Пиранҳа бениҳоят зангзананда аст ва гармиро тавлид мекунад. Тадбирҳои иловагии бехатарӣ заруранд. Барои партофтани партовҳо, иҷозат диҳед, ки маҳлул хунук шавад ва ба як контейнери партовҳои тоза ва хушк интиқол дода шавад. Зарфҳои дуюмдараҷаро истифода баред ва контейнерҳои партовро дуруст нишон диҳед. Барои расмиёти муфассалтар дастурҳои бехатарии иншоотро риоя кунед.
Вафлиҳоро бо гузоштани онҳо дар табақи гармии 200 °C барои 10 дақиқа хушк кунед. Пас аз хушкшавӣ, вафлиро панҷ маротиба дар ҳаво ларзонд, то хунук шавад.
~10 г фоторезист SU-8 2100-ро ба маркази вафли кремнийи тозашуда резед. Барои баробар паҳн кардани фоторезист дар вафли аз пинцет истифода баред. Баъзан вафлиро дар табақчаи гарми 65°C ҷойгир кунед, то фоторезистент камтар часпанда ва паҳн кардани он осонтар бошад. Вафлиро мустақиман ба табақчаи гарм ҷойгир накунед.
SU-8 тавассути иҷро кардани қабати чарх ба вафли баробар тақсим карда шуд. Гардиши воридотии SU-8-ро барои 5-10 сония барномарезӣ кунед, то дар 500 чархзанӣ бо шитоби 100 rpm/с паҳн шавад. Спини асосиро барои ғафсии 200 мкм дар шакли ғафсӣ дар 1,500 мкм (қафсӣ ба 500 мкм) таъин кунед. Баландии 500 мкм барои қабати болоии рӯда дар чип; нигаред ба "Қадамҳои муҳим" дар поён) бо суръатбахшии 300 rpm/s 30 сония дар 1200 чархзанӣ.
Суръати асосии чархзаниро мувофиқи ғафсии ҳадафи намунаи SU-8 дар вафли кремний танзим кардан мумкин аст.
Барои сохтани намунаҳои SU-8 бо баландии 500 мкм барои қабати болоии рӯда дар чип, қабати чархзанӣ ва қадамҳои нонпазии мулоими ин Қуттӣ (қадамҳои 7 ва 8) пай дар пай такрор карда шуданд (ниг. қадами 9) то ду қабати 250 мкм. Як қабати ғафси SU-8, ки онро метавон бо қабати қабати 250 мкм ба қуттии UV пайваст кард. 500 микрон баланд.
Вафлиҳои СУ-8-ро бодиққат дар табақи гарм дар 65 °C барои 5 дақиқа ҷойгир кунед, сипас танзимро ба 95 °C гузаред ва барои 40 дақиқаи иловагӣ инкубатсия кунед.
Барои ноил шудан ба баландии 500 мкм намунаи SU-8 дар микроканали боло, қадамҳои 7 ва 8-ро такрор кунед, то ду қабати ғафсии SU-8 250 мкм тавлид кунед.
Бо истифода аз Aligner Mask UV, мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда озмоиши лампаро анҷом диҳед, то вақти таъсири вафлиро ҳисоб кунед.(вақти экспозиция, мс) = (вояи экспозиция, мҶ/см2)/(иқтидори чароғ, мВ/см2).
Пас аз муайян кардани вақти экспозиция, фотомаскаро ба дорандаи ниқоби алигнери ниқоби ултрабунафш ҷойгир кунед ва фотомаскаро ба вафли бо СУ-8 пӯшидашуда ҷойгир кунед.
Сатҳи чопшудаи фотониқобро мустақиман дар паҳлӯи СУ-8 бо қабати кремний ҷойгир кунед, то паҳншавии ултрабунафшро кам кунед.
Вафли SU-8 ва фотониқоби пӯшонидашуда амудӣ ба 260 мҶ/см2 нури ултрабунафшро барои вақти пешакии экспозитсия фош кунед (ниг. қадами 10-и ин қуттӣ).
Пас аз таъсири ултрабунафш, вафли кремнийи бо SU-8 печонидашуда дар 65 ° C барои 5 дақиқа ва 95 ° C барои 15 дақиқа дар ҳар як табақи гарм барои сохтани намунаҳо бо баландии 200 μm пухта шуданд. Вақти пас аз пухтан дар 95 °C то 30 дақиқа барои сохтани намунаҳои баландии 50 мкм.
Таҳиягар ба табақ шиша рехта мешавад ва вафли пухта дар табақ ҷойгир карда мешавад. Ҳаҷми таҳиягари SU-8 вобаста ба андозаи табақи шишагӣ метавонад фарқ кунад. Боварӣ ҳосил кунед, ки таҳиягари SU-8-ро кофӣ истифода баред, то SU-8-ро комилан хориҷ кунед. Масалан, ҳангоми истифодаи табақчаи шишагии диаметри 150 мм бо иқтидори 1 L-00De, коркардкунанда ~ 800D-ро истифода баред. барои 25 дақиқа бо гардиши мулоим баъзан.
Қолаби таҳияшударо бо ~ 10 мл таҳиягари тару тоза ва пас аз IPA тавассути пошидани маҳлул бо пипетка бишӯед.
Вафлиро дар тозакунандаи плазма ҷойгир кунед ва ба плазмаи оксиген (гази атмосфера, фишори ҳадаф 1 × 10−5 Тор, қувваи 125 Вт) барои 1,5 дақиқа гузоред.
Вафлиро дар эксикатори вакуумӣ бо слайди шишагӣ дар дохили он ҷойгир кунед. Вафлиҳо ва слайдҳоро паҳлӯ ба паҳлӯ ҷойгир кардан мумкин аст. Агар эксикатори вакуумӣ бо табақ ба якчанд қабатҳо тақсим карда шавад, слайдҳоро дар камераи поёнӣ ва вафлиҳоро дар камераи боло ҷойгир кунед. 100 мкЛ trichloro (H1,H1,H2,) партоед. Маҳлули 2Н-перфтороктил)силанро дар слайди шишагин ва барои силанизатсия вакуум истифода баред.
Як шиша ҳуҷайраҳои яхкардаи Caco-2-ро дар ваннаи обии 37°C об кунед, сипас ҳуҷайраҳои обшударо ба колбачаи T75 интиқол диҳед, ки дорои 15 мл мухити қаблан гармшудаи Како-2 37°С мебошад.
Барои гузаштан аз ҳуҷайраҳои Caco-2 дар ~ 90% конфлюзия, аввал муҳити гарми Caco-2, PBS ва 0,25% трипсин / 1 мм EDTA дар ваннаи обии 37 ° C.
Аспиратсия миёна тавассути vacuum aspiration.Wash ҳуҷайраҳои ду маротиба бо 5 мл PBS гарм тавассути такрор саъю вакуум ва илова PBS тару тоза.