Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com.Шумо версияи браузерро бо дастгирии маҳдуди CSS истифода мебаред.Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед).Илова бар ин, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript нишон медиҳем.
Якбора карусели се слайдро намоиш медиҳад.Тугмаҳои Пешина ва Ояндаро истифода баред, то дар як вақт дар се слайд гузаред ё тугмаҳои слайдерро дар охир истифода баред, то дар як вақт аз се слайд гузаред.
Монеаи хун-мағзи сар ва монеаи хун-мағзи сар ба расидани агентҳои биотерапевтӣ ба ҳадафҳои худ дар системаи марказии асаб монеъ мешаванд ва бо ҳамин ба табобати самарабахши бемориҳои асаб халал мерасонанд.Барои кашф кардани интиқолдиҳандагони мағзи сар дар vivo, мо китобхонаи пептидҳои фагҳои T7-ро ҷорӣ кардем ва хун ва моеъи мағзи сар (CSF) -ро бо истифода аз модели ҳавзи калони каламушҳо ҷамъоварӣ кардем.Клонҳои фагҳои мушаххас пас аз чор даври интихоб дар CSF хеле бой шуданд.Санҷиши пептидҳои номзади инфиродӣ дар CSF зиёда аз 1000 маротиба ғанӣ шудани онро нишон дод.Биофаъолияти интиқоли тавассути пептид ба майна тавассути 40% коҳиш додани сатҳи амилоид-β дар моеъи мағзи сар бо истифода аз ингибитори пептиди BACE1, ки ба пептидҳои транзити нави муайяншуда алоқаманд аст, тасдиқ карда шуд.Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки пептидҳое, ки тавассути усулҳои интихоби фаг дар vivo муайян шудаанд, метавонанд воситаҳои муфид барои интиқоли системавии макромолекулаҳо ба майна бо таъсири табобатӣ бошанд.
Тадқиқоти мақсадноки терапияи системаи марказии асаб (CNS) асосан ба муайян кардани доруҳо ва агентҳои оптимизатсияшуда, ки хосиятҳои CNS-ро нишон медиҳанд, бо кӯшиши камтар барои кашф кардани механизмҳое, ки интиқоли фаъоли маводи мухаддирро ба майна бармеангезанд, тамаркуз кардааст.Ин ҳоло тағир меёбад, зеро интиқоли маводи мухаддир, махсусан молекулаҳои калон, як қисми ҷудонашавандаи рушди маводи мухаддири муосири неврология мебошад.Муҳити системаи марказии асаб аз ҷониби системаи монеаи мағзи сар, ки аз монеаи хун-мағзи сар (BBB) ​​ва монеаи хун-мағзи сар (BCBB)1 иборат аст, хуб ҳифз карда мешавад, ки интиқоли доруҳоро ба майна мушкил мекунад1,2.Тахмин меравад, ки қариб ҳама доруҳои молекулавии калон ва зиёда аз 98% доруҳои хурди молекулавӣ аз майна хориҷ карда мешаванд3.Аз ин рӯ, муайян кардани системаҳои нави интиқоли мағзи сар, ки интиқоли самарабахш ва мушаххаси доруҳои терапевтиро ба CNS 4,5 таъмин мекунанд, хеле муҳим аст.Бо вуҷуди ин, BBB ва BCSFB инчунин барои интиқоли маводи мухаддир як имконияти олӣ фароҳам меорад, зеро онҳо ба тамоми сохторҳои майна тавассути рагҳои васеъи он ворид мешаванд.Ҳамин тариқ, кӯшишҳои ҷорӣ барои истифодаи усулҳои ғайриинвазивии интиқол ба майна асосан ба механизми интиқоли ресепторҳо (PMT) бо истифода аз ретсептори эндогении BBB6 асос ёфтаанд.Сарфи назар аз дастовардҳои асосии охирин бо истифода аз роҳи ресепторҳои трансферрин7,8, рушди минбаъдаи системаҳои нави интиқол бо хосиятҳои беҳтар талаб карда мешавад.Бо ин мақсад, ҳадафи мо муайян кардани пептидҳое буд, ки қодиранд дар интиқоли CSF миёнаравӣ кунанд, зеро онҳо метавонистанд барои интиқоли макромолекулаҳо ба CNS ё кушодани роҳҳои нави ретсепторҳо истифода шаванд.Аз ҷумла, ретсепторҳо ва интиқолдиҳандагони мушаххаси системаи мағзи сар (BBB ва BSCFB) метавонанд ҳамчун ҳадафҳои эҳтимолӣ барои интиқоли фаъол ва мушаххаси доруҳои биотерапевтӣ хизмат кунанд.Моеъи ҳароммағз (МС) маҳсули секретории плексуси хороид (КС) буда, тавассути фазои зерибарахноидӣ ва меъдачаҳо бо моеъи байнистисиалии майна мустақиман дар тамос аст4.Дар вактхои охир нишон дода шудааст, ки моеъи субарахноиди маѓзи сар аз њад зиёд ба байни маѓзи майна паҳн мешавад9.Мо умедворем, ки ба фазои паренхималӣ бо истифода аз ин роҳи воридшавии субарахноид ё бевосита тавассути BBB дастрасӣ пайдо кунем.Барои ноил шудан ба ин, мо стратегияи устувори интихоби фагро дар vivo амалӣ кардем, ки пептидҳои тавассути яке аз ин ду роҳи ҷудогона интиқолшавандаро идеалӣ муайян мекунад.
Ҳоло мо як усули пайдарпайии намоиши намоиши фагҳоро дар vivo бо намунаи CSF дар якҷоягӣ бо пайдарпаии гузариши баланд (HTS) барои назорат кардани давраҳои интихоби ибтидоӣ бо гуногунии баландтарини китобхона тавсиф мекунем.Скрининг дар каламушҳои бошуур бо канали систернаи калон (CM) ба таври доимӣ имплантатсия карда шуд, то ифлосшавии хун пешгирӣ карда шавад.Муҳим он аст, ки ин равиш ҳам ҳадафи мағзи сар ва ҳам пептидҳоро бо фаъолияти интиқол тавассути монеаи мағзи сар интихоб мекунад.Мо фагҳои T7-ро аз сабаби андозаи хурдашон (~ 60 нм)10 истифода бурдем ва пешниҳод кардем, ки онҳо барои интиқоли весикулаҳо мувофиқанд, ки убури трансселлюлярии монеаи эндотелиалӣ ва / ё эпителиалӣ-медулларо имкон медиҳанд.Пас аз чор даври паннкунӣ, популятсияҳои фагҳо ҷудо карда шуданд, ки ғанисозии қавии CSF дар vivo ва ассотсиатсияи микрорагҳои мағзи сарро нишон доданд.Муҳим он аст, ки мо тавонистем бозёфтҳои худро тавассути нишон додани он, ки пептидҳои беҳтарини номзади интихобшуда ва аз ҷиҳати химиявӣ синтезшуда қодиранд борҳои сафедаҳоро ба моеъи мағзи сар интиқол диҳанд.Аввалан, таъсири фармакодинамикии CNS тавассути омезиши пептиди пешбари транзитӣ бо ингибитори пептиди BACE1 муқаррар карда шуд.Илова ба нишон додани он, ки стратегияҳои скрининги функсионалии in vivo метавонанд пептидҳои нави интиқоли мағзи сарро ҳамчун интиқолдиҳандагони самараноки протеин муайян кунанд, мо интизорем, ки равишҳои интихоби функсионалии шабеҳ дар муайян кардани роҳҳои нави интиқоли мағзи сар низ муҳим хоҳанд шуд.
Дар асоси воҳидҳои ташаккулдиҳандаи лавҳа (PFU), пас аз қадами бастабандии фаг, китобхонаи пептидҳои фагҳои тасодуфии 12-мери хаттии T7 бо гуногунии тақрибан 109 тарҳрезӣ ва эҷод карда шуданд (ниг. Маводҳо ва усулҳо).Қайд кардан муҳим аст, ки мо ин китобхонаро пеш аз паннкунӣ дар vivo бодиққат таҳлил кардем.Амплификацияи ПТР-и намунаҳои китобхонаи фагҳо бо истифода аз праймерҳои тағирёфта ампликонҳоро тавлид карданд, ки мустақиман ба HTS татбиқ мешуданд (расми 1а).Аз сабаби а) хатогиҳои пайдарпайии HTS11, б) таъсир ба сифати праймерҳо (NNK) 1-12 ва в) мавҷудияти фагҳои навъи ваҳшӣ (wt) (вазкуниҳои скелет) дар китобхонаи интизорӣ, тартиби филтркунии пайдарпай барои истихроҷи танҳо иттилооти пайдарпайии тасдиқшуда амалӣ карда шуд (Расми 1b).Ин қадамҳои филтр ба ҳамаи китобхонаҳои пайдарпайии HTS дахл доранд.Барои китобхонаи стандартӣ, ҳамагӣ 233,868 хониш ба даст оварда шуд, ки 39% аз меъёрҳои филтр гузаштанд ва барои таҳлили китобхона ва интихоби давраҳои минбаъда истифода шуданд (Расми иловагӣ 1c-e).Хонишҳо асосан чанд ҷуфти 3 ҷуфти асосиро дар дарозӣ бо қуллаи 36 нуклеотид ташкил медоданд (Расми 1c), ки тарҳи китобхонаро (NNK) 1-12 тасдиқ мекунад.Қобили зикр аст, ки тақрибан 11% аъзоёни китобхона дорои 12-ченакаи ваҳшӣ (ваз) ваҳшӣ PAGISRELVDKL ва тақрибан нисфи пайдарпайҳо (49%) дорои дохилкунӣ ё ҳазф мебошанд.HTS китобхонаи китобхона гуногунрангии баланди пептидҳоро дар китобхона тасдиқ кард: зиёда аз 81% пайдарпайии пептидҳо танҳо як маротиба пайдо шуданд ва танҳо 1,5% дар ≥4 нусха пайдо шуданд (Расми 2а).Басомадҳои аминокислотаҳо (аа) дар ҳама 12 мавқеъ дар репертуар бо басомадҳое, ки барои шумораи кодонҳое, ки аз репертуари таназзулшудаи NKK тавлид мешаванд, хуб мувофиқат мекарданд (Расми 2б).Басомади мушоҳидашудаи боқимондаҳои aa, ки бо ин воридҳо рамзгузорӣ шудаанд, бо басомади ҳисобшуда (r = 0,893) хуб алоқаманд аст (Расми иловагӣ 2c).Омода кардани китобхонаҳои фагҳо барои тазриқ марҳилаҳои тақвият ва хориҷ кардани эндотоксинро дар бар мегирад.Ин қаблан нишон дода шуда буд, ки гуногунрангии китобхонаҳои фагҳоро коҳиш диҳад12,13.Аз ин рӯ, мо як китобхонаи фагҳои пурқувватро, ки аз эндотоксин хориҷ карда шудааст, тартиб додем ва онро бо китобхонаи аслӣ муқоиса кардем, то басомади АА-ро ҳисоб кунем.Байни ҳавзи аслӣ ва ҳавзи пурқувватшуда ва тозашуда таносуби қавӣ (r = 0,995) мушоҳида карда шуд (Расми иловагӣ 2d), ки ин нишон медиҳад, ки рақобат байни клонҳое, ки дар плитаҳо бо истифода аз фаги T7 пурзӯр карда шудаанд, боиси ғарази ҷиддӣ нагардид.Ин муқоиса ба басомади мотивҳои трипептид дар ҳар як китобхона асос ёфтааст, зеро гуногунии китобхонаҳо (~ 109) ҳатто бо HTS пурра гирифта намешавад.Таҳлили басомади аа дар ҳар як мавқеъ дар се мавқеъи охирини репертуари воридшуда як ғарази хурди вобаста ба мавқеъро ошкор кард (расми 2е).Хулоса, мо ба хулосае омадем, ки сифат ва гуногунии китобхона қобили қабул аст ва танҳо тағйироти ночиз дар гуногунрангӣ аз ҳисоби васеъкунӣ ва омода кардани китобхонаҳои фагҳо дар байни якчанд даври интихоб мушоҳида шудааст.
Намунаи пайдарпайи моеъи мағзи сар мумкин аст бо роҳи ҷарроҳӣ имплантатсия кардани канула ба CM-и каламушҳои бошуур барои осон кардани муайянкунии фаги T7, ки ба дохили варид ворид карда мешавад (iv) тавассути BBB ва/ё BCSFB (расми 1а-б).Мо дар се даври аввали интихоби in vivo (расми 1c) ду силоҳи мустақили интихобро истифода бурдем (дастаҳои A ва B).Мо бо кам кардани микдори умумии фаг, ки дар се даври аввали интихоб чорй карда шуда буд, тадричан чиддии интихобро зиёд кардем.Барои даври чоруми паннкунӣ, мо намунаҳоро аз шохаҳои А ва В муттаҳид кардем ва се интихоби мустақили иловагиро анҷом додем.Барои омӯзиши хосиятҳои in vivo зарраҳои фагҳои T7 дар ин модел, фагҳои навъи ваҳшӣ (PAGISELVDKL Master insert) тавассути рагҳои дум ба каламушҳо ворид карда шуданд.Барқароркунии фагҳо аз моеъи мағзи сар ва хун дар нуқтаҳои гуногуни вақт нишон дод, ки фагҳои нисбатан хурди T7 икосаэдралӣ марҳилаи тозакунии ибтидоӣ аз қисмати хун доранд (расми 3).Дар асоси титрҳои додашуда ва ҳаҷми хуни каламушҳо, мо ҳисоб кардем, ки танҳо тақрибан 1% вазни.фаг аз вояи воридшуда дар хун 10 дақиқа пас аз сӯзандору ба дохили вена муайян карда шуд.Пас аз ин пастшавии босуръати аввалия, клиренси ибтидоии сусттар бо ними умри 27,7 дақиқа чен карда шуд.Муҳим он аст, ки аз қисмати CSF танҳо хеле кам фагҳо гирифта шуданд, ки заминаи пасти муҳоҷирати фагҳои навъи ваҳшӣ ба қисмати CSFро нишон медиҳад (расми 3).Ба ҳисоби миёна дар моеъи мағзи сар дар тӯли тамоми давраи интихоб (0-250 дақиқа) танҳо тақрибан 1 x 10-3% титрҳои фагҳои T7 дар хун ва 4 x 10-8% фагҳои аввала воридшуда ошкор карда шуданд.Қобили зикр аст, ки давраи нимпардохти фагҳои навъи ваҳшӣ (25,7 дақиқа) дар моеъи ҳароммағз ба ҳамон даврае буд, ки дар хун мушоҳида мешавад.Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки монеа, ки шӯъбаи CSF-ро аз хун ҷудо мекунад, дар каламушҳои бо CM-канулшуда солим аст ва имкон медиҳад, ки дар vivo интихоби китобхонаҳои фагҳо барои муайян кардани клонҳое, ки аз хун ба шӯъбаи CSF ба осонӣ интиқол дода мешаванд.
(а) Ташкили усули аз нав гирифтани моеъи мағзи сар (CSF) аз ҳавзи калон.(б) Диаграммае, ки ҷойгиршавии ҳуҷайраи монеаи системаи марказии асаб (CNS) ва стратегияи интихобро нишон медиҳад, ки барои муайян кардани пептидҳое, ки аз монеаи хун-мағзи сар (BBB) ​​ва монеаи хун-мағзи сар истифода мешаванд.(в) Схемаи скрининги намоиши фаг дар vivo.Дар ҳар як даври интихоб, фагҳо (идентификаторҳои ҳайвонот дар дохили тирҳо) ба дохили вена ворид карда шуданд.Ду шохаи алтернативии мустақил (A, B) то даври 4-уми интихоб алоҳида нигоҳ дошта мешаванд.Барои даври интихобии 3 ва 4, ҳар як клони фаги аз CSF истихроҷшуда дастӣ пайдарпай карда шуд.(г) Кинетикаи фаг, ки аз хун (халқаҳои сурх) ва моеъи мағзи сар (секунҷаҳои сабз) дар давраи аввали интихоб дар ду каламушҳои канулшуда пас аз воридкунии дохиливаридии китобхонаи пептидҳои T7 (2 x 1012 фаг/ҳайвон) ҷудо карда шудааст.Майдончаҳои кабуд консентратсияи миёнаи ибтидоии фагро дар хун нишон медиҳанд, ки аз рӯи миқдори фаги воридшуда бо назардошти ҳаҷми умумии хун ҳисоб карда мешавад.Майдончаҳои сиёҳ нуқтаи буриши хатти y-ро, ки аз консентратсияи фагҳои хун экстраполяция карда шудаанд, нишон медиҳанд.(д, е) Басомади нисбӣ ва тақсимоти ҳама мотивҳои эҳтимолии такроршавандаи трипептид, ки дар пептид мавҷуданд, пешниҳод кунед.Шумораи нақшҳое, ки дар 1000 хониш пайдо шудаанд, нишон дода шудаанд.Ба таври назаррас (р <0,001) накшу нигори бойшуда бо нуктахои сурх ишора карда шудаанд.(д) Нақшаи парокандаи коррелятсия, ки басомади нисбии мотиви трипептидҳои китобхонаи тазриқӣ бо фагҳои аз хун гирифташуда аз ҳайвонот №1.1 ва №1.2 муқоиса мекунад.(е) Графикаи парокандаи коррелятсия бо муқоисаи басомадҳои нисбии мотивҳои трипептидҳои фагҳои ҳайвонот №1.1 ва №1.2, ки дар хун ва моеъи мағзи сар ҷудо карда шудаанд.(g, h) Намоиши ID пайдарпаии фаги дар хун ғанишуда (г) дар муқоиса бо китобхонаҳои тазриқшуда ва фаг, ки дар CSF (h) бо хун ғанӣ шудааст, пас аз даври интихоби in vivo дар ҳарду ҳайвон.Андозаи рамзи як ҳарф нишон медиҳад, ки то чӣ андоза он аминокислотаҳо дар ин мавқеъ пайдо мешаванд.Сабз = қутбӣ, бунафш = нейтрал, кабуд = асосӣ, сурх = кислота ва сиёҳ = аминокислотаҳои гидрофобӣ.Тасвири 1а, б аз ҷониби Эдуард Урич тарҳрезӣ ва истеҳсол шудааст.
Мо як китобхонаи пептидҳои фагро ба ду каламушҳои асбоби CM (қалаҳои А ва В) ва фаги ҷудошуда аз моеъи мағзи сар ва хун ворид кардем (Расми 1d).Тозакунии босуръати ибтидоии китобхона нисбат ба фагҳои навъи ваҳшӣ камтар буд.Давраи миёнаи нисфирӯзии китобхонаи сӯзандору дар ҳарду ҳайвон 24,8 дақиқа дар хун, монанд ба фагҳои ваҳшӣ ва 38,5 дақиқа дар CSF буд.Намунаҳои фагҳои хун ва моеъи мағзи сар аз ҳар як ҳайвон ба HTS гузаронида шуданд ва ҳамаи пептидҳои муайяншуда барои мавҷудияти мотиви кӯтоҳи трипептид таҳлил карда шуданд.Мотивҳои трипептидҳо интихоб карда шуданд, зеро онҳо барои ташаккули сохтор ва таъсири мутақобилаи пептид-протеинҳо заминаи ҳадди аққал фароҳам меоранд14,15.Мо дар тақсимоти мотивҳо байни китобхонаи фагҳои сӯзандору ва клонҳои аз хуни ҳарду ҳайвон истихроҷшуда таносуби хуб пайдо кардем (расми 1е).Маълумотҳо нишон медиҳанд, ки таркиби китобхона танҳо дар қисми хун ғанӣ шудааст.Басомадҳои аминокислотаҳо ва пайдарпаии консенсус минбаъд дар ҳар як мавқеъ бо истифода аз мутобиқсозии нармафзори Weblogo16 таҳлил карда шуданд.Ҷолиб он аст, ки мо ғанисозии қавӣ дар пасмондаҳои glycine хун ёфт (расми 1g).Вақте ки хун бо клонҳои аз CSF интихобшуда муқоиса карда шуд, интихоби қавӣ ва баъзе ҷудошавии мотивҳо мушоҳида карда шуд (расми 1f) ва аминокислотаҳои аминокислотаҳо дар мавқеъҳои пешакӣ муайяншуда дар 12 узв афзалият доштанд (расми 1h).Қобили зикр аст, ки ҳайвоноти алоҳида дар моеъи мағзи сар ба таври назаррас фарқ мекарданд, дар ҳоле ки ғанисозии глицини хун дар ҳарду ҳайвон мушоҳида шудааст (Расми иловагӣ 4a–j).Пас аз филтркунии қатъии маълумоти пайдарпай дар моеъи мағзи сар №1.1 ва №1.2, ҳамагӣ 964 ва 420 пептидҳои беназири 12-мер ба даст оварда шуданд (Расми 1d-e).Клонҳои фагҳои ҷудошуда тақвият дода шуданд ва ба даври дуюми интихоби in vivo гузаронида шуданд.Фагҳои аз даври дуюми интихоб истихроҷшуда дар ҳар як ҳайвон ба HTS гузаронида шуданд ва ҳамаи пептидҳои муайяншуда ҳамчун вуруд ба барномаи шинохти мотивҳо барои таҳлили пайдоиши мотивҳои трипептид истифода шуданд (расми 2a, b, ef).Дар муқоиса бо давраи аввали фаг, ки аз CSF барқарор карда шудааст, мо интихоби минбаъда ва ҷудошавии бисёр нақшҳоро дар CSF дар шохаҳои А ва В мушоҳида кардем (расми 2).Барои муайян кардани он, ки оё онҳо намунаҳои гуногуни пайдарпайии пайдарпайро ифода мекунанд, як алгоритми мушаххаскунии шабака татбиқ карда шуд.Байни пайдарпаии 12-ченакае, ки аз ҷониби CSF дар clade алтернативии A (расми 2c, d) ва clade B (расми 2g, h) барқарор карда шудааст, шабоҳати равшан мушоҳида карда шуд.Таҳлили якҷояшуда дар ҳар як шоха профилҳои гуногуни интихобро барои пептидҳои 12-мер (Расми иловагӣ 5c,d) ва афзоиши таносуби титри CSF / хун бо мурури замон барои клонҳои ҷамъшуда пас аз даври дуюми интихоб нисбат ба даври якуми интихобро ошкор кард (Расми 5e).).
Ғанӣ кардани мотивҳо ва пептидҳо дар моеъи мағзи сар тавассути ду даври пайдарпайи интихоби намоиши фагҳои функсионалии in vivo.
Ҳама фагҳои моеъи мағзи сар аз даври аввали ҳар як ҳайвон (ҳайвонҳои № 1.1 ва № 1.2) ҷамъ карда шуданд, тақвият дода шуданд, HT-пайдабандӣ ва дубора ворид карда шуданд (2 x 1010 фаг / ҳайвон) 2 каламушҳои канулшудаи SM (# 1.1 → #).2.1 ва 2.2, 1.2 → 2.3 ва 2.4).(a,b,e,f) Диаграммаҳои парокандаи коррелятсия бо муқоисаи басомади нисбии мотивҳои трипептидҳои ҳамаи фагҳои аз CSF гирифташуда дар даври якум ва дуюми интихоб.Басомади нисбӣ ва тақсимоти мотивҳо, ки ҳама трипептидҳои эҳтимолии такроршавандаро дар пептидҳо дар ҳарду самт пайдо мекунанд.Шумораи нақшҳое, ки дар 1000 хониш пайдо шудаанд, нишон дода шудаанд.Мотивҳое, ки дар яке аз китобхонаҳои муқоисашаванда ба таври назаррас интихоб шудаанд ё хориҷ карда шудаанд (p <0,001) бо нуқтаҳои сурх таъкид карда мешаванд.(c, d, g, h) Намоиши логотипи пайдарпайии ҳама пайдарпаии дарози 12 аминокислотаи CSF дар асоси даври 2 ва 1 интихоби in vivo.Андозаи рамзи як ҳарф нишон медиҳад, ки то чӣ андоза он аминокислотаҳо дар ин мавқеъ пайдо мешаванд.Барои муаррифии логотип, басомади пайдарпаии CSF аз ҳайвонҳои алоҳида гирифташуда байни ду даври интихоб муқоиса карда мешавад ва пайдарпаии ғанишуда дар даври дуюм нишон дода мешавад: (в) #1.1–#2.1 (г) #1.1–#2.2 (г) #1.2–#2.3 ва (з) #1.2–#2.4.Кислотаҳои аминокислотаҳои бойтарин дар мавқеи додашуда дар (c, d) ҳайвонот №.2.1 ва №.2.2 ё (г, h) дар ҳайвонот №.2.3 ва №.2.4 бо ранг нишон дода шудаанд.Сабз = қутбӣ, бунафш = нейтрал, кабуд = асосӣ, сурх = кислота ва сиёҳ = аминокислотаҳои гидрофобӣ.
Пас аз даври сеюми интихоб, мо 124 пайдарпаии беназири пептидҳоро (№ 3.1 ва № 3.2) аз 332 клонҳои фагҳои барқароршудаи CSF муайян кардем, ки аз ду ҳайвон ҷудо карда шудаанд (расми 6а).Дар пайдарпаии LGSVS (18,7%) таносуби нисбӣ баландтарин дошт, пас аз он ваҳшӣ навъи ваҳшӣ PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) ва SARGSWREIVSLS (2,2%).Дар даври охирини чорум, мо ду шохаи мустақилона интихобшударо аз се ҳайвони алоҳида ҷамъ кардем (расми 1c).Аз 925 клонҳои фагҳои пайдарпай, ки аз CSF барқарор карда шудаанд, дар даври чорум мо 64 пайдарпаии беҳамтои пептидҳоро пайдо кардем (Расми 6б), ки дар байни онҳо таносуби нисбии фагҳои навъи ваҳшӣ то 0,8% коҳиш ёфт.Клонҳои маъмултарини CSF дар даври чорум LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) ва RLSSVD2, GRPQKINGARVC (3,6%) буданд.%)).Диапазони дарозии пептидҳои интихобшуда аз сабаби ворид кардани нуклеотидҳо/ҳазф ё кодонҳои бармаҳал қатъ дар праймерҳои китобхона ҳангоми истифодаи кодонҳои вайроншуда барои тарҳрезии китобхонаи NNK вобаста аст.Кодонҳои бармаҳал пептидҳои кӯтоҳтар тавлид мекунанд ва интихоб карда мешаванд, зеро онҳо мотиви мусоидро дар бар мегиранд.Пептидҳои дарозтар метавонанд дар натиҷаи воридкунӣ/нест кардан дар праймерҳои китобхонаҳои синтетикӣ ба амал оянд.Ин кодони таваққуфгоҳи тарҳрезишударо берун аз чаҳорчӯба ҷойгир мекунад ва онро то он даме, ки кодони таваққуф дар поён пайдо шавад, мехонад.Умуман, мо омилҳои ғанисозии ҳамаи чор даври интихобро тавассути муқоисаи маълумоти воридотӣ бо маълумоти баромади намунавӣ ҳисоб кардем.Дар даври аввали скрининг, мо титрҳои фагҳои ваҳшӣ ҳамчун истинод ба замина ғайри мушаххас истифода бурдем.Ҷолиб он аст, ки интихоби фагҳои манфӣ дар давраи аввали CSF хеле қавӣ буд, аммо на дар хун (расми 3а), ки ин метавонад аз эҳтимолияти ками паҳншавии ғайрифаъоли аксари аъзои китобхонаи пептидҳо ба қисмати CSF бошад ё фагҳои нисбӣ нисбат ба бактериопҳо самараноктар нигоҳ дошта шаванд ё аз гардиши хун хориҷ карда шаванд.Бо вуҷуди ин, дар даври дуюми паннкунӣ, интихоби қавии фагҳо дар CSF дар ҳарду клад мушоҳида карда шуд, ки ин аз он шаҳодат медиҳад, ки даври қаблӣ бо фагҳо, ки пептидҳоро нишон медиҳанд, ки ба гирифтани CSF мусоидат мекунанд, бой шудааст (расми 3а).Боз, бе ғанисозии назарраси хун.Инчунин дар даврахои сеюм ва чорум клонхои фагхо дар CSF хеле бой гардиданд.Муқоисаи басомади нисбии ҳар як пайдарпаии пептидҳои беназир дар байни ду даври охирини интихоб, мо дарёфтем, ки пайдарпайҳо дар даври чоруми интихоб боз ҳам бештар бой шудаанд (расми 3б).Аз ҳама 64 пайдарпаии беназири пептидҳо бо истифода аз ҳарду самти пептидҳо 931 трипептидҳо гирифта шуданд.Мотивҳои аз ҳама ғанишуда дар даври чорум барои профилҳои ғанисозии онҳо дар ҳама давраҳо нисбат ба китобхонаи воридшуда (бурида: ғанисозии 10%) (Расми иловагӣ 6c) бодиққат тафтиш карда шуданд.Намунаҳои умумии интихоб нишон доданд, ки аксари мотивҳои омӯхташуда дар ҳама давраҳои қаблии ҳарду шохаи интихобӣ ғанӣ шудаанд.Бо вуҷуди ин, баъзе нақшҳо (масалан, SGL, VSG, LGS GSV) асосан аз синфи алтернативии А буданд, дар ҳоле ки дигарон (масалан, FGW, RTN, WGF, NTR) дар табақаи алтернативии В бой шудаанд.
Тасдиқи интиқоли CSF аз пептидҳои бо фаг нишондодашудаи CSF ғанӣ ва пептидҳои пешвои биотинилшуда, ки ба бори стрептавидин пайваст карда шудаанд.
(а) Коэффитсиентҳои ғанисозӣ дар ҳамаи чор давр (R1-R4) дар асоси титрҳои сӯзандору (ворид = I) фаг (PFU) ва титрҳои фагҳои CSF муайяншуда (баромад = O) ҳисоб карда мешаванд.Омилҳои ғанисозӣ дар се даври охир (R2-R4) бо муқоиса бо даври қаблӣ ва даври аввал (R1) бо маълумоти вазн ҳисоб карда шуданд.Барҳои кушода моеъи мағзи сар, барҳои сояафкан плазма мебошанд.(***p<0,001, дар асоси t-testи Студент).(б) Рӯйхати пептидҳои фагҳои фаровон, ки аз рӯи таносуби нисбии онҳо ба ҳамаи фагҳои дар CSF пас аз даври 4-уми интихоб ҷамъовардашуда гурӯҳбандӣ карда шудаанд.Шаш клонҳои фагҳои маъмултарин бо ранг, рақамгузорӣ ва омилҳои ғанигардонии онҳо дар байни давраҳои 3 ва 4-и интихоб (инсетҳо) таъкид карда мешаванд.(c,d) Шаш клонҳои фагҳои аз ҳама ғанишуда, китобхонаҳои пептидҳои фагҳои холӣ ва волидайн аз даври 4 дар модели намунагирии CSF ба таври инфиродӣ таҳлил карда шуданд.Намунаҳои CSF ва хун дар нуқтаҳои вақти зикршуда ҷамъоварӣ карда шуданд.(в) Миқдори баробари 6 клонҳои фагҳои номзад (2 x 1010 фаг/ҳайвон), фагҳои холӣ (№ 1779) (2 x 1010 фаг/ҳайвонот) ва китобхонаҳои пептидҳои фагҳои фондӣ (2 x 1012 фаг/ҳайвонот) Ҳадди аққал тавассути CM мини думдор ба ҳайвон ба 3 дум ҷудо карда мешаванд.Фармакокинетикаи CSF-и ҳар як клони фагҳои воридшуда ва китобхонаи пептидҳои фаг бо мурури замон нишон дода шудааст.(г) таносуби миёнаи CSF / хунро барои ҳамаи фагҳои барқароршуда / мл дар тӯли вақти интихоб нишон медиҳад.(д) Чор пептидҳои пешвои синтетикӣ ва як назорати шифршуда бо биотин ба стрептавидин тавассути N-терминуси худ (дисплейи тетрамер) ва пас аз сӯзандору (раги дум iv, 10 мг стрептавидин/кг) пайваст карда шуданд.Ҳадди ақал се каламушҳои intubated (N = 3).).Намунаҳои CSF дар нуқтаҳои вақти зикршуда ҷамъоварӣ карда шуданд ва консентратсияи стрептавидин тавассути CSF зидди стрептавидини ELISA чен карда шуданд (nd = ошкор нашудааст).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, дар асоси санҷиши ANOVA).(е) Муқоисаи пайдарпаии кислотаи аминокислотаҳои клони пептиди фагҳои ғанишуда №2002 (арғувон) бо дигар клонҳои пептидҳои фагҳои интихобшуда аз даври 4-уми интихоб.Қисмҳои аминокислотаҳои якхела ва шабеҳ бо ранг рамзгузорӣ карда мешаванд.
Аз тамоми фагҳои ғанишуда дар даври чорум (Расми 3b), шаш клонҳои номзад барои таҳлили минбаъдаи инфиродӣ дар модели интихоби CSF интихоб карда шуданд.Миқдори баробари шаш фаги номзад, фаги холӣ (бе воридкунӣ) ва китобхонаҳои пептидҳои профаг ба се ҳайвони канулшудаи CM ворид карда шуданд ва фармакокинетика дар таҳлилҳои CSF (расми 3c) ва хун (расми 7) муайян карда шуданд.Ҳама клонҳои фагҳои санҷидашуда ба қисми CSF дар сатҳи 10-1000 маротиба зиёдтар аз фаги назорати холӣ (#1779) нигаронида шудаанд.Масалан, клонҳои №2020 ва №2077 нисбат ба фагҳои назоратӣ тақрибан 1000 маротиба зиёдтар титрҳои CSF доштанд.Профили фармакокинетикии ҳар як пептиди интихобшуда гуногун аст, аммо ҳамаи онҳо қобилияти баланди CSF доранд.Мо бо мурури замон коҳиши доимии клонҳои #1903 ва #2011 мушоҳида кардем, дар ҳоле ки барои клонҳои #2077, #2002 ва #2009 афзоиш дар давоми 10 дақиқаи аввал метавонад интиқоли фаъолро нишон диҳад, аммо бояд тафтиш карда шавад.Клонҳои №2020, #2002 ва #2077 дар сатҳи баланд мӯътадил шуданд, дар ҳоле ки консентратсияи CSF-и клони #2009 пас аз афзоиши аввал оҳиста коҳиш ёфт.Сипас мо басомади нисбии ҳар як номзади CSF-ро бо консентратсияи хуни он муқоиса кардем (расми 3d).Таносуби титри миёнаи ҳар як номзади CSF бо титри хуни он дар ҳама вақтҳои интихоб нишон дод, ки се нафар аз шаш номзад дар CSF хун ба таври назаррас бой шудаанд.Ҷолиб он аст, ки клони № 2077 устувории баландтари хунро нишон дод (Расми иловагӣ 7).Барои тасдиқ кардани он, ки худи пептидҳо қодиранд, ки бори дигарро ба ҷузъҳои фагҳо ба қисмати CSF интиқол диҳанд, мо чор пептидҳои пешбарро, ки бо биотин ҳосил шудаанд, дар N-терминус, ки пептидҳо ба заррачаи фаг мепайванданд, синтез кардем.Пептидҳои биотинӣ (рақамҳои 2002, 2009, 2020 ва 2077) бо стрептавидин (SA) пайваст карда шуданд, то шаклҳои мултимерикиро то андозае тақлидкунандаи геометрияи фагҳо ба даст оранд.Ин формат инчунин ба мо имкон дод, ки таъсири SA-ро дар хун ва моеъи мағзи сар ҳамчун пептидҳои протеини боркаш чен кунем.Муҳим он аст, ки маълумоти фагро аксар вақт метавон дубора тавлид кард, вақте ки пептидҳои синтетикӣ дар ин формати конъюгатшудаи SA идора карда шуданд (расми 3e).Пептидҳои шифршуда таъсири камтари ибтидоӣ ва тозакунии тезтар CSF бо сатҳи номуайян дар давоми 48 соат доштанд.Барои дарёфти фаҳмиш дар бораи роҳҳои интиқоли ин клонҳои фагҳои пептидӣ ба фазои CSF, мо локализатсияи зарбаҳои пептидҳои инфиродии фагро бо истифода аз иммуногистохимия (IHC) таҳлил кардем, то зарраҳои фагро 1 соат пас аз сӯзандоруи дохиливаридӣ дар vivo мустақиман ошкор кунем.Қобили зикр аст, ки клонҳои № 2002, № 2077 ва № 2009-ро бо доғи сахт дар капиллярҳои майна муайян кардан мумкин аст, дар ҳоле ки фаги назоратӣ (№ 1779) ва клони № 2020 ошкор карда нашуданд (Расми иловагӣ 8).Ин аз он шаҳодат медиҳад, ки ин пептидҳо маҳз тавассути убури BBB ба таъсир ба майна мусоидат мекунанд.Барои санҷидани ин гипотеза таҳлили муфассали бештар лозим аст, зеро масири BSCFB низ метавонад ҷалб карда шавад.Ҳангоми муқоисаи пайдарпаии кислотаи аминокислотаҳои клони аз ҳама ғанишуда (#2002) бо дигар пептидҳои интихобшуда, қайд карда шуд, ки баъзеи онҳо васеъшавии аминокислотаҳои аминокислотаҳо доранд, ки метавонанд механизми интиқоли шабеҳро нишон диҳанд (расми 3f).
Аз сабаби профили беназири плазма ва афзоиши назарраси CSF бо мурури замон, клони дисплейи фаг # 2077 дар тӯли 48 соат дарозтар омӯхта шуд ва тавонист афзоиши босуръати CSF-ро дар робита бо сатҳи устувори SA такрор кунад (расми 4а).Нисбати дигар клонҳои фагҳои муайяншуда, №2077 барои капиллярҳои мағзи сар сахт ранг карда шудааст ва ҳангоми дидан бо қарори баландтар ва эҳтимолан каме ранг кардан дар фазои паренхималӣ колокализатсияи назаррасро бо лектини маркери капиллярӣ нишон дод (Расми 4b).Барои тафтиш кардани он, ки оё таъсири фармакологии тавассути пептид ба миён омада метавонад дар CNS ба даст оварда шавад, мо таҷрибае анҷом додем, ки дар он версияҳои биотинии i) пептид транзити #2077 ва ii) пептид ингибитори BACE1 бо SA дар ду таносуби гуногун омехта карда шуданд.Барои як комбинатсия мо танҳо ингибитори пептиди BACE1-ро истифода бурдем ва барои дигараш таносуби 1:3 ингибитори пептидҳои BACE1 ба пептиди #2077-ро истифода бурдем.Ҳарду намуна ба дохили вена ворид карда шуданд ва сатҳи хун ва моеъи мағзи сар бо мурури замон чен карда шуданд пептидҳои бета-амилоид 40 (Abeta40).Abeta40 дар CSF чен карда шуд, зеро он ҷилавгирӣ аз BACE1-ро дар паренхимаи мағзи сар инъикос мекунад.Тавре ки интизор мерафт, ҳарду комплексҳо сатҳи хуни Abeta40-ро ба таври назаррас коҳиш доданд (расми 4c, d).Аммо, танҳо намунаҳое, ки омехтаи пептидҳои №.2077 ва ингибитори пептиди BACE1, ки ба SA пайваст карда шудааст, боиси коҳиши назарраси Abeta40 дар моеъи мағзи сар (расми 4c).Маълумот нишон медиҳад, ки пептид №.2077 қодир аст, ки протеини 60 кДа-и SA-ро ба CNS интиқол диҳад ва инчунин бо ингибиторҳои SA-конъюгатшудаи пептиди BACE1 таъсири фармакологиро ба вуҷуд меорад.
(a) Тазриқи клоналӣ (2 × 10 фаг/ҳайвон) фаги T7, ки профилҳои дарозмуддати фармакокинетикии пептиди CSF № 2077 (RLSSVDSDLSGC) ва фаги назоратии сӯзишворӣ (# 1779) дар ҳадди аққал се каламушҳои CM-интубатсияшуда нишон медиҳанд.(б) Тасвири микроскопии конфокалии микрорагҳои кортикалии намояндагӣ дар каламушҳои бо фаг воридшуда (2 × 10 10 фаг/ҳайвон), ки муқобили пептиди № 2077 ва зарфҳоро (лектин) нишон медиҳад.Ин клонҳои фагҳо ба 3 каламушҳо дода шуданд ва барои гардиши 1 соат пеш аз перфузия иҷозат доданд.Майнаҳо ба қисмҳо ҷудо карда шуда, бо антителоҳои поликлоналии FITC нишон додашуда бар зидди капсиди фаги T7 ранг карда шуданд.Даҳ дақиқа пеш аз перфузия ва фиксатсияи минбаъда, лектин бо тамғаи DyLight594 ба дохили варид ворид карда шуд.Тасвирҳои флуоресцентӣ, ки ранг кардани лектин (сурх)-и паҳлӯи рӯшноии микроравҳо ва фагҳо (сабз) дар люмени капиллярҳо ва бофтаи периваскулярии майнаро нишон медиҳанд.Сатри миқёс ба 10 микрон мувофиқат мекунад.(c, d) Пептиди ингибитори биотинишудаи BACE1 танҳо ё дар якҷоягӣ бо пептиди транзити биотинишудаи №2077 ба стрептавидин пайваст карда шуд ва пас аз сӯзандоруи ҳадди аққал се каламушҳои канулшудаи CM (10 мг стрептавидин/кг) ворид карда шуд.Пастшавии ингибитори пептидҳои BACE1 дар Aβ40 тавассути Aβ1-40 ELISA дар хун (сурх) ва моеъи мағзи сар (норанҷӣ) дар нуқтаҳои вақти зикршуда чен карда шуд.Барои беҳтар возеҳтар хати нуқта дар график бо миқёси 100% кашида мешавад.(в) Камшавии фоиз дар Aβ40 дар хун (секунҷаҳои сурх) ва моеъи мағзи сар (секунҷаҳои норанҷӣ) дар каламушҳо, ки бо стрептавидин бо пептидҳои транзитӣ №2077 ва пептиди ингибитори BACE1 дар таносуби 3:1 коркард шудаанд.(г) Коҳиши фоиз дар хуни Aβ40 (донаҳои сурх) ва моеъи мағзи сар (долаҳои норанҷӣ) аз каламушҳо, ки бо стрептавидин табобат карда шудаанд, дар якҷоягӣ бо пептидҳои ингибитори BACE1.Консентратсияи Aβ дар назорат 420 pg/ml (инҳирофи стандартӣ = 101 pg/ml) буд.
Намоиши фагҳо дар якчанд самтҳои тадқиқоти биотиббӣ бомуваффақият татбиқ карда шудааст17.Ин усул барои омӯзиши гуногунии рагҳои рагҳои in vivo18,19 ва инчунин таҳқиқоте, ки ба рагҳои мағзи сар 20,21,22,23,24,25,26 нигаронида шудааст, истифода шудааст.Дар ин таҳқиқот, мо татбиқи ин усули интихобро на танҳо барои муайян кардани бевоситаи пептидҳое, ки ба рагҳои мағзи сар равона шудаанд, балки инчунин ба кашфи номзадҳо бо хосиятҳои интиқоли фаъол барои убури монеаи хун-мағзи сар васеъ кардем.Мо ҳоло таҳияи тартиби интихоби in vivo дар каламушҳои интубатсияшудаи CM тавсиф мекунем ва потенсиали онро барои муайян кардани пептидҳо бо хосиятҳои хонагии CSF нишон медиҳем.Бо истифода аз фаги T7, ки китобхонаи пептидҳои тасодуфии 12-мерро нишон медиҳад, мо тавонистем нишон диҳем, ки фаги T7 ба қадри кофӣ хурд аст (диаметри тақрибан 60 нм)10, ки ба монеаи хун-мағзи сар мутобиқ карда шавад ва ба ин васила мустақиман аз монеаи хун-мағзи сар ё плексуси хороид убур кунад.Мо мушоҳида кардем, ки ҷамъоварии CSF аз каламушҳои канулшудаи CM усули хуб назоратшавандаи скрининги функсионалии in vivo буд ва фаги истихроҷшуда на танҳо ба рагҳо пайваст, балки ҳамчун интиқолдиҳанда дар монеаи хун-мағзи сар низ фаъолият мекард.Ғайр аз он, тавассути ҷамъоварии хун дар як вақт ва татбиқ кардани HTS ба CSF ва фагҳои аз хун гирифташуда, мо тасдиқ кардем, ки интихоби мо аз CSF аз ғанисозии хун ё мувофиқат барои тавсеа дар байни давраҳои интихоб таъсир нарасондааст.Бо вуҷуди ин, қисми хун як қисми тартиби интихоб аст, зеро фагҳое, ки метавонанд ба қисмати CSF бирасанд, бояд зинда монад ва дар гардиши хун ба қадри кофӣ гардиш кунанд, то дар майна бой шаванд.Бо мақсади ба даст овардани маълумоти боэътимоди пайдарпай аз маълумоти хоми HTS, мо филтрҳоро татбиқ кардем, ки ба хатогиҳои пайдарпайии платформаи мушаххас дар ҷараёни таҳлил мутобиқ карда шудаанд.Бо ворид кардани параметрҳои кинетикӣ ба усули скрининг, мо фармакокинетикаи босуръати фагҳои навъи ваҳшӣ T7 (t½ ~ 28 дақиқа) дар хун24, 27, 28 тасдиқ кардем ва инчунин нисфи ҳаёти онҳоро дар моеъи мағзи сар (t½ ~ 26 дақиқа) дар як дақиқа муайян кардем).Сарфи назар аз профилҳои фармакокинетикии шабеҳ дар хун ва CSF, танҳо 0,001% консентратсияи фаг дар хун дар CSF муайян карда шуд, ки ин нишон медиҳад, ки ҳаракати пасти фагҳои навъи ваҳшӣ T7 дар монеаи хун-мағзи сар.Ин кор аҳамияти даври аввали интихобро ҳангоми истифодаи стратегияҳои panning in vivo, махсусан барои системаҳои фагҳо, ки аз гардиш зуд тоза карда мешаванд, таъкид мекунад, зеро шумораи ками клонҳо қодиранд ба қисмати CNS бирасанд.Ҳамин тариқ, дар даври аввал, коҳиши гуногунии китобхонаҳо хеле калон буд, зеро дар ин модели хеле қатъии CSF дар ниҳоят танҳо шумораи маҳдуди клонҳо ҷамъоварӣ карда шуданд.Ин стратегияи паноҳбарӣ дар vivo якчанд марҳилаҳои интихобро дар бар мегирад, ба монанди ҷамъшавии фаъол дар қисмати CSF, зинда мондани клонҳо дар шӯъбаи хун ва зуд хориҷ кардани клонҳои фагҳои T7 аз хун дар давоми 10 дақиқаи аввал (расми 1d ва расми иловагӣ 4M).).Ҳамин тариқ, пас аз даври аввал дар CSF клонҳои фагҳои гуногун муайян карда шуданд, гарчанде ки ҳамон як ҳавзи ибтидоӣ барои ҳайвоноти алоҳида истифода мешуд.Ин аз он шаҳодат медиҳад, ки як қатор қадамҳои қатъии интихоби китобхонаҳои сарчашма бо шумораи зиёди аъзоёни китобхона боиси коҳиши назарраси гуногунрангӣ мегардад.Аз ин рӯ, рӯйдодҳои тасодуфӣ қисми ҷудонашавандаи раванди интихоби ибтидоӣ мешаванд ва ба натиҷа таъсири калон мерасонанд.Эҳтимол меравад, ки бисёре аз клонҳо дар китобхонаи аслӣ майли ғанисозии CSF хеле монанд доштанд.Аммо, ҳатто дар як шароити таҷрибавӣ, натиҷаҳои интихоб метавонанд аз сабаби шумораи ками ҳар як клони мушаххас дар ҳавзи ибтидоӣ фарқ кунанд.
Мотивхое, ки дар CSF бой шудаанд, аз накшахои хун фарк мекунанд.Ҷолиб он аст, ки мо гузаришро ба сӯи пептидҳои аз глицин бой дар хуни ҳайвоноти алоҳида қайд кардем.(Расми 1g, Расми иловагӣ 4e, 4f).Фагҳое, ки пептидҳои глицин доранд, метавонанд устувортар бошанд ва эҳтимоли камтар аз гардиш хориҷ карда шаванд.Бо вуҷуди ин, ин пептидҳои аз глицин бой дар намунаҳои моеъи мағзи сар ошкор карда нашуданд, ки ин нишон медиҳад, ки китобхонаҳои мураттабшуда аз ду марҳилаи гуногуни интихоб гузаштаанд: яке дар хун ва дигаре имкон дод, ки дар моеъи мағзи сар ҷамъ шаванд.Клонҳои бо CSF ғанишуда, ки дар натиҷаи даври чоруми интихоб ба даст омадаанд, ба таври васеъ санҷида шудаанд.Тақрибан ҳамаи клонҳои инфиродӣ санҷидашуда тасдиқ карда шуданд, ки дар CSF дар муқоиса бо фаги холии назоратӣ бой шудаанд.Як зарбаи пептид (# 2077) муфассалтар баррасӣ карда шуд.Он дар муқоиса бо дигар хитҳо (Расми 3d ва Расми 7) ними плазма дарозтар нишон дод ва ҷолиб он аст, ки ин пептид боқимондаи систеинро дар терминали C дошт.Ба наздикӣ нишон дода шудааст, ки илова кардани систеин ба пептидҳо метавонад хусусиятҳои фармакокинетикии онҳоро тавассути пайвастшавӣ ба альбумин 29 беҳтар кунад.Ин дар айни замон барои пептиди #2077 номаълум аст ва омӯзиши минбаъдаро талаб мекунад.Баъзе пептидҳо вобастагии валентӣ дар ғанисозии CSF нишон доданд (маълумот нишон дода нашудааст), ки метавонад бо геометрияи сатҳи намоишшудаи капсиди T7 алоқаманд бошад.Системаи T7, ки мо истифода бурдем, 5-15 нусхаи ҳар як пептидро дар як заррачаи фаг нишон дод.IHC дар клонҳои фагҳои сурб ба дохили варид воридшуда ба кортекси мағзи каламушҳо гузаронида шуд (расми иловагӣ 8).Маълумот нишон дод, ки ҳадди аққал се клон (№ 2002, № 2009 ва № 2077) бо BBB ҳамкорӣ мекунанд.Муайян кардан лозим аст, ки оё ин мутақобилаи BBB ба ҷамъшавии CSF ё ҳаракати ин клонҳо мустақиман ба BCSFB оварда мерасонад.Муҳим он аст, ки мо нишон медиҳем, ки пептидҳои интихобшуда қобилияти интиқоли CSF-и худро ҳангоми синтез ва пайвастан ба бори сафеда нигоҳ медоранд.Пайвастагии пептидҳои биотинии N-терминалӣ ба SA аслан натиҷаҳоеро такрор мекунад, ки бо клонҳои фагҳои мувофиқи онҳо дар хун ва моеъи мағзи сар (расми 3e).Ниҳоят, мо нишон медиҳем, ки пептиди сурб #2077 қодир аст, ки амали мағзи сари як ингибитори пептиди биотинишудаи BACE1-ро, ки ба SA пайваст карда шудааст, мусоидат кунад ва боиси ба таври назаррас фармакодинамикӣ дар CNS бо роҳи коҳиш додани сатҳи Abeta40 дар CSF (расми 4).Мо натавонистем ягон гомологҳоро дар пойгоҳи додаҳо тавассути анҷом додани ҷустуҷӯи гомологии пайдарпайии пептидӣ аз ҳама хитҳо муайян кунем.Бояд қайд кард, ки андозаи китобхонаи T7 тақрибан 109 аст, дар ҳоле ки андозаи китобхонаи назариявӣ барои 12-mers 4 x 1015 аст. Аз ин рӯ, мо танҳо як қисми хурди фазои гуногунии китобхонаи пептидҳои 12-мерро интихоб кардем, ки ин маънои онро дорад, ки пептидҳои оптимизатсияи бештарро тавассути арзёбии ин пай дар пайи ҳамшафат муайян кардан мумкин аст.Гипотетикӣ, яке аз сабабҳое, ки мо ягон гомологҳои табиии ин пептидҳоро наёфтем, метавонад дар ҷараёни эволютсия интихоб нашуда бошад, то воридшавии беназорати баъзе мотивҳои пептидҳоро ба майна пешгирӣ кунад.
Якҷоя гирифта, натиҷаҳои мо барои кори оянда барои муайян кардан ва тавсиф кардани системаҳои нақлиётии монеаи мағзи сар дар vivo муфассалтар замина фароҳам меоранд.Танзими асосии ин усул ба стратегияи функсионалии интихоб асос ёфтааст, ки на танҳо клонҳоро бо хосиятҳои пайванди рагҳои мағзи сар муайян мекунад, балки инчунин як қадами муҳимеро дар бар мегирад, ки дар он клонҳои муваффақ барои убур кардани монеаҳои биологӣ дар vivo ба қисми CNS фаъолияти дохилӣ доранд.фаҳмонидани механизми интиқоли ин пептидҳо ва афзалияти онҳо барои пайвастшавӣ ба микроваскулятсияи хоси минтақаи майна мебошад.Ин метавонад ба кашфи роҳҳои нави интиқоли BBB ва ретсепторҳо оварда расонад.Мо интизорем, ки пептидҳои муайяншуда метавонанд мустақиман ба ретсепторҳои мағзи сар ё ба лигандҳои гардиши тавассути BBB ё BCSFB интиқолшаванда пайваст шаванд.Векторҳои пептидӣ бо фаъолияти интиқоли CSF, ки дар ин кор кашф шудаанд, минбаъд таҳқиқ карда мешаванд.Мо айни замон хусусияти мағзи сари ин пептидҳоро барои қобилияти убур кардани BBB ва/ё BCSFB тафтиш карда истодаем.Ин пептидҳои нав барои кашфи эҳтимолии ретсепторҳо ё роҳҳои нав ва таҳияи платформаҳои нави хеле муассир барои интиқоли макромолекулаҳо, ба монанди биологӣ, ба майна асбобҳои бениҳоят арзишманд хоҳанд буд.
Канул кардани систернаи калон (CM) бо истифода аз тағир додани усули қаблан тавсифшуда.Каламушҳои анестетикии Wistar (200-350 г) ба дастгоҳи стереотаксикӣ насб карда шуданд ва дар болои пӯсти сартарошшуда ва ба таври асептикӣ омодашуда барои фош кардани косахонаи сар буриданд.Дар майдони болишти боло ду сӯрохиро парма кунед ва винтҳои мустаҳкамро дар сӯрохҳо маҳкам кунед.Барои роҳнамоии стереотатикии канулаи аз пӯлоди зангногир ба CM сӯрохи иловагӣ дар қафаси паҳлуии оксипитал парма карда шуд.Дар атрофи канула сементи дандонпизишкро молед ва бо винтҳо маҳкам кунед.Пас аз фототабобат ва сахтшавии цемент захми пуст бо 4/0 супрамид баста шуд.Ҷойгиркунии дурусти каннула бо ихроҷи стихиявии моеъи мағзи сар (CSF) тасдиқ карда мешавад.Каламушро аз дастгоҳи стереотаксикӣ хориҷ кунед, нигоҳубини мувофиқи пас аз ҷарроҳӣ ва табобати дардро гиред ва ба он иҷозат диҳед, ки ҳадди аққал як ҳафта то пайдо шудани нишонаҳои хун дар моеъи мағзи сар.Каламушҳои Wistar (Crl:WI/Han) аз Чарлз Ривер (Фаронса) гирифта шудаанд.Ҳама каламушҳо дар шароити махсуси аз патогенҳо озод нигоҳ дошта мешуданд.Ҳама озмоишҳои ҳайвонот аз ҷониби Идораи байтории шаҳри Базели Швейтсария тасдиқ карда шуданд ва мувофиқи Литсензияи ҳайвоноти № 2474 (Арзёбии интиқоли фаъоли мағзи сар тавассути андозагирии сатҳҳои номзадҳои терапевтӣ дар моеъи мағзи сар ва мағзи каламуш) анҷом дода шуданд.
Бо хушхӯю хушхӯю каламушро бо cannula CM дар даст нигоҳ доред.Датураро аз канюла хориҷ кунед ва 10 мкл моеъи стихиявии мағзи сарро ҷамъ кунед.Азбаски гузариши каннула дар ниҳоят осеб дидааст, ба ин тадқиқот танҳо намунаҳои моеъи рӯдаи мағзи сар бо ягон далели ифлосшавии хун ё рангоранг дохил карда шуданд.Дар баробари ин, тақрибан 10-20 мкл хун аз буридани хурд дар нӯги дум ба қубурҳои гепарин (Сигма-Олдрих) гирифта шуд.CSF ва хун дар нуқтаҳои гуногуни вақт пас аз сӯзандоруи фаги T7 ҷамъ карда шуданд.Пеш аз ҷамъоварии ҳар як намунаи CSF тақрибан 5-10 мкл моеъ партофта шуд, ки ба ҳаҷми мурдаи катетер мувофиқат мекунад.
Китобхонаҳо бо истифода аз вектори T7Select 10-3b, ки дар дастури системавии T7Select тавсиф шудаанд (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Ба таври мухтасар, як замимаи тасодуфии 12-мер ДНК дар формати зерин синтез карда шуд:
Кодони NNK барои пешгирӣ кардани кодонҳои дукаратаи таваққуф ва аз ҳад зиёди аминокислотаҳо дар замима истифода мешуд.N таносуби эквимолярии ба таври дастӣ омехташудаи ҳар як нуклеотид ва К таносуби эквимолярии дастӣ омехтаи нуклеотидҳои аденин ва ситозин мебошад.Минтақаҳои якқатор бо роҳи инкубатсияи минбаъда бо dNTP (Novagen) ва Klenow enzyme (New England Biolabs) дар буфери Klenow (New England Biolabs) барои 3 соат дар ҳарорати 37°С ба ДНК-и дуқабата табдил дода шуданд.Пас аз реаксия, ДНК-и дуқабата бо боришоти EtOH барқарор карда шуд.ДНК-и натиҷавӣ бо ферментҳои маҳдудкунандаи EcoRI ва HindIII (ҳарду аз Roche) ҳазм карда шуд.Варақаи ҷудошуда ва тозашуда (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) пас аз он дар чаҳорчӯба ба вектори қаблан ҷудошудаи T7 пас аз аминокислотаи 348 аз гени капсиди 10В пайваст карда шуд.Реаксияҳои пайвастшавӣ дар 16 ° C барои 18 соат пеш аз бастабандии in vitro инкубатсия карда шуданд.Бастабандии фагҳо дар vitro мувофиқи дастурҳое, ки бо маҷмӯаи клонкунии T7Select 10-3b (Novagen) дода шудаанд, анҷом дода шуд ва маҳлули бастабандӣ як маротиба барои лизис бо истифода аз Escherichia coli (BLT5615, Novagen) тақвият дода шуд.Лизатҳоро центрифуга карданд, титр карданд ва дар -80 ° C ҳамчун маҳлули захираи глицерин ях карданд.
Амплификацияи мустақими ПТР-и минтақаҳои тағйирёбандаи фагҳо дар шўрбо ё табақ бо истифода аз праймерҳои хусусии синтези 454/Roche-amplicon тақвият дода мешаванд.Примери муттаҳидсозии пешқадам дорои пайдарпайии минтақаи тағирёбанда (NNK) 12 (шаблон мушаххас), GS FLX Titanium Adapter A ва пайдарпаии калидҳои китобхонаи чаҳор асосӣ (TCAG) мебошад (Расми иловагии 1a):
Праймери баръакси синтез инчунин биотинеро дар бар мегирад, ки барои гирифтани маҳтобҳо ва GS FLX Titanium Adapter B барои амплификацияи клоналӣ ҳангоми эмульсия ПЗР лозим аст:
Пас аз он ампликонҳо мувофиқи протоколи 454 GS-FLX Titanium ба 454/Roche pyrosequencing гузаронида шуданд.Барои пайдарпайии дастӣ Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ДНК фаги T7 тавассути ПТР тақвият дода шуд ва бо ҷуфтҳои зерини примерҳо секвенсия карда шуд:
Васлкунакҳо аз лавҳаҳои инфиродӣ бо истифода аз маҷмӯаи Roche Fast Start DNA Polymerase (мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда) ба амплификацияи ПТР гузаронида шуданд.Оғози гарм (10 дақиқа дар 95 °C) ва 35 давраи пурзӯр (50 сония дар 95 °C, 1 дақиқа дар 50 °C ва 1 дақиқа дар 72 °C) иҷро кунед.
Фаг аз китобхонаҳо, фагҳои навъи ваҳшӣ, фагҳои аз CSF ва хун наҷотёфта ё клонҳои инфиродӣ дар Escherichia coli BL5615 дар шўрбои бемории сил (Sigma Aldrich) ё дар зарфҳои 500 см2 (Thermo Scientific) барои 4 соат дар ҳарорати 37°C тақвият дода шуданд.Фаг аз плитаҳо бо роҳи шустани плитаҳо бо буфери Tris-EDTA (Fluka Analytical) ё бо ҷамъ кардани лавҳаҳо бо нӯгҳои пипеткаи стерилӣ гирифта шуд.Фаг аз супернатанти фарҳанг ё буфери экстраксионӣ бо як даври боришоти полиэтиленгликоли (PEG 8000) (Промега) ҷудо карда шуд ва дар буфери Трис-EDTA дубора боздошта шуд.
Фаги пурқувватшуда бо истифода аз маҳтобҳои хориҷкунандаи эндотоксин (Miltenyi Biotec) пеш аз сӯзандоруи (IV) (500 мкл/ҳайвон) 2-3 даври хориҷкунии эндотоксин гузаронида шуд.Дар даври аввал фагҳои 2 × 1012 ҷорӣ карда шуданд;дар дуюм, фагҳои 2 × 1010;дар даврахои сейум ва чоруми интихобй ба хар чорво 2×109 фаг.Мазмуни фагҳо дар CSF ва намунаҳои хун, ки дар нуқтаҳои вақти зикршуда ҷамъоварӣ шудаанд, тавассути ҳисобкунии лавҳа мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда (дастури системаи T7Select) муайян карда шуд.Интихоби фагҳо тавассути сӯзандоруи дохиливаридии китобхонаҳои тозашуда ба рагҳои дум ё бо роҳи дубора ворид кардани фаги аз CSF аз даври интихоби қаблӣ гирифташуда анҷом дода шуд ва ҳосили минбаъда мутаносибан дар 10 дақиқа, 30 дақиқа, 60 дақиқа, 90 дақиқа, 120 дақиқа, 180 дақиқа ва намунаи хун анҷом дода шуд.Дар маҷмӯъ чор даври паннкунӣ дар vivo гузаронида шуд, ки дар он ду шохаи интихобшуда дар се даври аввали интихоб алоҳида нигоҳ дошта шуда, таҳлил карда шуданд.Ҳама замимаҳои фагҳои аз CSF аз ду даври аввали интихоб истихроҷшуда ба 454/Roche пиросеквенсия дучор шуданд, дар ҳоле ки ҳамаи клонҳои аз CSF аз ду даври охирини интихоб истихроҷшуда дастӣ пайдарпай шуданд.Ҳама фагҳои хун аз даври аввали интихоб инчунин ба пиросеквенсияи 454/Roche дучор шуданд.Барои тазриқи клонҳои фагҳо, фагҳои интихобшуда дар E. coli (BL5615) дар лавҳаҳои 500 см2 дар ҳарорати 37°C барои 4 соат тақвият дода шуданд.Клонҳои ба таври инфиродӣ интихобшуда ва дастӣ пайдарпай дар муҳити сил паҳн карда шуданд.Пас аз истихроҷи фаг, тозакунӣ ва хориҷ кардани эндотоксин (тавре ки дар боло тавсиф шудааст), 2 × 1010 фаг/ҳайвон дар 300 мкл ба як раги дум ба дохили вена ворид карда шуд.
Коркарди пешакӣ ва филтркунии сифатии маълумоти пайдарпай.Маълумоти Raw 454/Roche бо истифода аз нармафзори фурӯшанда аз формати харитаи ҷараёнҳои дуӣ (sff) ба формати хондашавандаи Pearson (fasta) табдил дода шуд.Коркарди минбаъдаи пайдарпаии нуклеотидҳо бо истифода аз барномаҳои хусусии C ва скриптҳо (бастаи нармафзори нашрнашуда), тавре ки дар зер тавсиф шудааст, анҷом дода шуд.Таҳлили маълумоти ибтидоӣ тартиби қатъии филтркунии бисёрмарҳиларо дар бар мегирад.Барои филтр кардани хонданҳое, ки пайдарпаии дурусти воридкунии ДНК-и 12мерро дар бар намегиранд, хонданҳо ба таври пайдарпай ба нишони оғоз (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), тамғаи қатъ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ва замимаи замина (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGW) бо истифода аз санҷиши глобалӣ мутобиқ карда шуданд.Ҳамоҳангсозӣ, ки имкон медиҳад то 2 номувофиқатӣ дар як ҳамворкунӣ31.Аз ин рӯ, хондани бе тегҳои оғоз ва қатъ ва хондани дорои замимаҳои заминавӣ, яъне ҳамвораҳое, ки аз шумораи иҷозатдодашудаи номувофиқӣ зиёданд, аз китобхона хориҷ карда шуданд.Дар мавриди хондани боқимонда, пайдарпаии N-mer ДНК, ки аз аломати ибтидоӣ тӯл мекашад ва то аломати қатъ тамом мешавад, аз пайдарпаии хондани аслӣ хориҷ карда шуд ва минбаъд коркард карда шуд (минбаъд «ворид» номида мешавад).Пас аз тарҷумаи замима, қисми пас аз кодони аввал дар охири 5′-и праймер аз замима хориҷ карда мешавад.Илова бар ин, нуклеотидҳое, ки ба кодонҳои нопурра дар охири 3′-и праймер оварда мерасонанд, низ хориҷ карда шуданд.Барои истисно кардани замимаҳое, ки танҳо пайдарпаии заминавӣ доранд, замимаҳое, ки бо намунаи аминокислотаи "PAG" оғоз мешаванд, низ хориҷ карда шуданд.Пептидҳое, ки дарозии пас аз тарҷума камтар аз 3 аминокислотаҳо буданд, аз китобхона хориҷ карда шуданд.Ниҳоят, зиёдатӣ дар ҳавзи дохилкуниро хориҷ кунед ва басомади ҳар як замимаи беназирро муайян кунед.Натоиҷи ин таҳлил рӯйхати пайдарпаии нуклеотидҳо (варақҳо) ва басомадҳои (хондан) онҳоро дар бар мегирад (Расмҳои иловагӣ 1c ва 2).
Гурӯҳи N-mer ДНК аз рӯи шабоҳати пайдарпай: Барои бартараф кардани хатогиҳои пайдарпайии мушаххаси 454/Рош (масалан, мушкилот бо секвенсияи васеъшавии гомополимерҳо) ва бартараф кардани изофаҳои камтар муҳим, замимаҳои пайдарпаии N-mer ДНК-и қаблан филтршуда (васлкунӣ) аз рӯи шабоҳат мураттаб карда мешаванд.воридкунӣ (то 2 асоси номувофиқ иҷозат дода мешавад) бо истифода аз алгоритми итеративӣ, ки ба таври зерин муайян карда мешавад: воридкунӣ аввал аз рӯи басомади худ (аз баландтарин ба пасттарин) ва агар онҳо якхела бошанд, аз рӯи дарозӣ (аз ҳама ба кӯтоҳтарин) мураттаб карда мешаванд.Ҳамин тариқ, аз ҳама бештар ва дарозтарин воридкунӣ "гурӯҳи" аввалро муайян мекунад.Басомади гурӯҳӣ ба басомади калидӣ муқаррар карда мешавад.Сипас, ҳар як воридкунии дар рӯйхати мураттабшуда боқимонда кӯшиш карда шуд, ки ба гурӯҳ тавассути ҳамоҳангсозии ҷуфтии Needleman-Wunsch илова карда шавад.Агар шумораи номувофиқӣ, дохилкунӣ ё ҳазфкунӣ дар як ҳамворкунӣ аз ҳадди 2 зиёд набошад, воридкунӣ ба гурӯҳ илова карда мешавад ва басомади умумии гурӯҳ ба андозаи зуд-зуд илова шудани воридкунӣ зиёд мешавад.Варақаҳои ба гурӯҳ иловашуда ҳамчун истифодашуда қайд карда мешаванд ва аз коркарди минбаъда хориҷ карда мешаванд.Агар пайдарпаии воридкуниро ба гурӯҳи аллакай мавҷуда илова кардан ғайриимкон бошад, пайдарпаии дохилкунӣ барои сохтани гурӯҳи нав бо басомади воридкунии мувофиқ истифода мешавад ва ҳамчун истифодашуда қайд карда мешавад.Итерация вақте ба итмом мерасад, ки ҳар як пайдарпаии воридкунӣ ё барои ташкили гурӯҳи нав истифода шудааст ё метавонад ба гурӯҳи аллакай мавҷуда дохил карда шавад.Дар ниҳоят, иловаҳои гурӯҳбандишуда, ки аз нуклеотидҳо иборатанд, дар ниҳоят ба пайдарпайии пептидҳо (китобхонаҳои пептидӣ) табдил меёбанд.Натиҷаи ин таҳлил маҷмӯи воридкунӣ ва басомадҳои мувофиқи онҳо мебошад, ки шумораи хондани пайдарпайро ташкил медиҳанд (расми 2).
Насли Motif: Дар асоси рӯйхати пептидҳои беназир, китобхонае сохта шудааст, ки дорои ҳама шаклҳои имконпазири аминокислотаҳо (aa), тавре ки дар зер нишон дода шудааст.Ҳар як намунаи имконпазири дарозии 3 аз пептид истихроҷ карда шуд ва намунаи баръакси он дар якҷоягӣ бо китобхонаи умумии мотивҳо, ки дорои ҳама намунаҳо (трипептидҳо) мебошад, илова карда шуд.Китобхонаҳои нақшҳои хеле такроршаванда пайдарпай ҷойгир карда шуданд ва зиёдатӣ бартараф карда шуданд.Сипас, барои ҳар як трипептид дар китобхонаи мотивҳо, мо мавҷудияти онро дар китобхона бо истифода аз асбобҳои ҳисоббарор тафтиш кардем.Дар ин ҳолат, басомади пептиди дорои трипептид мотиви ёфтшуда илова карда мешавад ва ба мотив дар китобхонаи мотивҳо таъин карда мешавад ("шумораи нақшҳо").Натиҷаи тавлиди мотивҳо массиви дученакаест, ки дорои ҳама рӯйдодҳои трипептидҳо (мотивҳо) ва арзишҳои мувофиқи онҳост, ки шумораи хонданҳои пайдарпайӣ мебошанд, ки ҳангоми филтр, гурӯҳбандӣ ва тарҷумаи хондан мотиви мувофиқ ба вуҷуд меоянд.Метрикҳо, ки дар боло муфассал тавсиф шудаанд.
Нормализатсияи шумораи нақшҳо ва парокандаи мувофиқ: Шумораи мотивҳо барои ҳар як намуна бо истифода аз
ки дар он ni шумораи мутолиахое, ки мавзуи i доранд.Ҳамин тариқ, vi басомади фоизи хондан (ё пептидҳо)-ро, ки мотиви i дар намуна доранд, ифода мекунад.Арзишҳои P барои шумораи ғайримуқаррарии мотивҳо бо истифода аз санҷиши дақиқи Фишер ҳисоб карда шуданд.Оид ба коррелограммҳои шумораи ангезаҳо, таносуби Спирман бо истифода аз шумораи нормалшудаи мотивҳо бо Р.
Барои тасаввур кардани мундариҷаи кислотаҳои аминокислотаҳо дар ҳар як мавқеъ дар китобхонаи пептидҳо веб логограммаҳои 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) сохта шудаанд.Аввалан, мундариҷаи аминокислотаҳо дар ҳар як мавқеи пептиди 12-мер дар матритсаи 20 × 12 нигоҳ дошта мешавад.Сипас, маҷмӯи 1000 пептидҳо, ки дорои ҳамон мазмуни нисбии аминокислотаҳо дар ҳар як мавқеъ мебошанд, дар формати пайдарпайӣ тавлид мешаванд ва ҳамчун вуруд ба веб-логотипи 3 таъмин карда мешаванд, ки тасвири графикии таркиби аминокислотаҳои аминокислотаи нисбӣ дар ҳар як мавқеъро тавлид мекунад.барои китобхонаи пептидии додашуда.Барои визуализатсияи маҷмӯи додаҳои бисёрченака, харитаҳои гармӣ бо истифода аз абзори дохилии таҳияшуда дар R (biosHeatmap, бастаи R, ки ҳанӯз нашр нашудааст) сохта шудаанд.Дендрограммаҳое, ки дар харитаҳои гармӣ пешниҳод шудаанд, бо истифода аз усули кластерҳои иерархикии Уорд бо метрикаи масофаи Евклидӣ ҳисоб карда шуданд.Барои таҳлили омории маълумоти баҳодиҳии мотивҳо, арзишҳои P барои баҳои ғайримуқаррарӣ бо истифода аз санҷиши дақиқи Фишер ҳисоб карда шуданд.Арзишҳои P барои дигар маҷмӯаҳои додаҳо дар R бо истифода аз t-test ё ANOVA донишҷӯён ҳисоб карда шуданд.
Клонҳои фагҳои интихобшуда ва фагҳо бидуни воридкунӣ тавассути рагҳои дум ба дохили вена ворид карда шуданд (2 × 1010 фаг / ҳайвон дар 300 мкл PBS).Даҳ дақиқа пеш аз перфузия ва фиксатсияи минбаъда, ба ҳамон ҳайвонҳо 100 мкл лектини тамғаи DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177) ворид карда шуданд.60 дақиқа пас аз тазриқи фаг, каламушҳо тавассути дил бо 50 мл PBS ва пас аз 50 мл 4% PFA/PBS перфузия карда шуданд.Намунаҳои майна ба таври илова дар як шабонарӯз дар 4% PFA/PBS ҷойгир карда шуданд ва дар 30% сахароза дар як шабонарӯз дар 4 ° C тар карда шуданд.Намунаҳо дар омехтаи OCT ях карда мешаванд.Таҳлили иммуногистохимикии намунаҳои яхкардашуда дар ҳарорати хонагӣ дар криосекцияҳои 30 мкм, ки бо 1% BSA баста шудаанд ва бо антителоҳои поликлоналии FITC ишорашуда бар зидди фаги T7 (Novus NB 600-376A) дар 4 °C инкубатор карда шуданд.Якшаба инкубатсия кунед.Ниҳоят, қисмҳо 3 маротиба бо PBS шуста шуданд ва бо микроскопи лазерии конфокалӣ (Leica TCS SP5) тафтиш карда шуданд.
Ҳама пептидҳо бо ҳадди ақали тозагии 98% аз ҷониби GenScript USA синтез карда шуда, биотинизатсия ва лиофилизатсия шудаанд.Биотин тавассути фосилаи иловагии сегонаи глицин дар N-терминус пайваст карда мешавад.Ҳама пептидҳоро бо истифода аз масс-спектрометрия тафтиш кунед.
Стрептавидин (Sigma S0677) бо зиёдатии эквимолярии 5-каратаи пептиди биотинилшуда, пептиди ингибитори биотинишудаи BACE1 ё маҷмӯи (таносуби 3:1) пептиди ингибитори биотинии BACE1 ва пептиди ингибитори BACE1 дар 5-10% дар DMSO/in DMSO-и ингибиторӣ омехта карда шуд.1 соат дар ҳарорати хонагӣ пеш аз тазриқ.Пептидҳои ба стрептавидин пайвастшуда ба дохили вена бо миқдори 10 мг/кг ба яке аз рагҳои думи каламушҳои дорои холигии мағзи сар ворид карда шуданд.
Консентратсияи комплексҳои стрептавидин-пептидӣ тавассути ELISA арзёбӣ карда шуд.Пластинҳои микротитрҳои Nunc Maxisorp (Sigma) дар як шабонарӯз дар 4 ° C бо 1,5 мкг / мл антиденои зидди стрептавидини муш (Thermo, MA1-20011) пӯшонида шуданд.Пас аз басташавӣ (буфери басташавӣ: 140 нМ NaCL, 5 мм EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатин, 1% BSA) дар ҳарорати хонагӣ барои 2 соат, табақро бо 0,05% Tween-20/PBS (буфери шустан) барои 3 сония шуста, ба плазмаҳои плазма илова карда шуданд. 1:10,000, CSF 1:115).Пас аз он, табақ дар як шабонарӯз дар 4°C бо антитело муайянкунанда (1 мкг/мл, антистрептавидин-HRP, Novus NB120-7239) инкубатсия карда шуд.Пас аз се марҳилаи шустан, стрептавидин тавассути инкубатсия дар маҳлули субстрати TMB (Roche) то 20 дақиқа муайян карда шуд.Пас аз қатъ кардани рушди ранг бо 1M H2SO4, абсорбенсро дар 450 нм чен кунед.
Функсияи маҷмӯи ингибиторҳои стрептавидин-пептид-BACE1 аз ҷониби Aβ (1-40) ELISA мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда (Wako, 294-64701) арзёбӣ карда шуд.Ба таври мухтасар, намунаҳои CSF дар ҳалкунандаи стандартӣ (1:23) ҳал карда шуданд ва дар як шабонарӯз дар 4°C дар пластинаҳои 96-чоҳи бо антитело забти BNT77 фаро гирифташуда инкубатсия карда шуданд.Пас аз панҷ қадами шустан, антитело бо HRP пайвастшудаи BA27 илова карда шуд ва барои 2 соат дар 4 ° C инкубатсия карда шуд ва пас аз панҷ қадами шустан.Aβ (1-40) тавассути инкубатсия дар маҳлули TMB барои 30 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ муайян карда шуд.Пас аз он ки рушди ранг бо маҳлули қатъшуда қатъ карда шуд, абсорбенсро дар 450 нм чен кунед.Намунаҳои плазма ба истихроҷи фазаи сахт пеш аз Aβ (1-40) ELISA дучор шуданд.Плазма ба 0,2% DEA (Sigma) дар плитаҳои 96-чоҳ илова карда шуд ва дар ҳарорати хонагӣ барои 30 дақиқа инкубатсия карда шуд.Пас аз шустани пайдарпай плитаҳои SPE (Oasis, 186000679) бо об ва 100% метанол, намунаҳои плазма ба плитаҳои SPE илова карда шуданд ва ҳама моеъ хориҷ карда шуданд.Намунаҳо шуста шуданд (аввал бо 5% метанол баъд 30% метанол) ва бо 2% NH4OH/90% метанол элюта карда шуданд.Пас аз хушк кардани элюат дар 55 ° C дар тӯли 99 дақиқа дар ҷараёни доимии N2, намунаҳо дар ҳалкунандаҳои стандартӣ кам карда шуданд ва Aβ (1-40) тавре ки дар боло тавсиф шудааст, чен карда шуданд.
Чӣ тавр ин мақоларо овардан мумкин аст: Urich, E. et al.Интиқоли бор ба майна бо истифода аз пептидҳои транзитӣ дар vivo муайян карда мешавад.илм.5, 14104;дои: 10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ва Moos T. Таҳвили доруҳои макромолекулярӣ ба майна бо истифода аз терапияи мақсаднок.Маҷаллаи Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., ва Мартинес-Мартинес, P. Интиқоли пептидҳо ва маводи мухаддир сафеда дар саросари монеаи хун-мағзи сар.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, WM Монеаи хун-мағзи сар: монеа дар рушди маводи мухаддири мағзи сар.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, KE, Дункан, JA, Stopa, EG, ва Byrd, A. Дурнамои беҳтар кардани интиқоли маводи мухаддир ва ҳадаф ба майна тавассути роҳи choroid plexus-CSF.Тадқиқоти фармасевтӣ 22, 1011-1037, 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Модернизатсияи биофармацевтика бо аспҳои троянии молекулавӣ барои интиқоли мағзи сар.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардридж, интиқоли пептидҳои ретсептори WM тавассути монеаи хун-мағзи сар.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. ва дигарон.Воридшавии мағзи сар ва самаранокии антителоҳои терапевтиро бо истифода аз молекулҳои моновалентӣ афзоиш диҳед.Neuron 81, 49-60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Биен-Ли, Н.Интиқоли ресепторҳои трансферрин (TfR) азхудкунии майнаи вариантҳои наздикии антителоҳои TfR-ро муайян мекунад.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084 / jem.20131660 (2014).