Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com.Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад.Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед).Дар ҳамин ҳол, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript пешкаш хоҳем кард.
Биопсияи моеъ (LB) консепсияест, ки дар соҳаи биотиббӣ зуд маъруфият пайдо мекунад.Консепсия асосан ба ошкор кардани порчаҳои ДНК-и берун аз ҳуҷайра (ccfDNA), ки асосан пас аз марги ҳуҷайраҳо дар бофтаҳои гуногун ҳамчун порчаҳои хурд бароварда мешаванд, асос ёфтааст.Қисми ками ин порчаҳо аз бофтаҳо ё организмҳои хориҷӣ (бегона) сарчашма мегиранд.Дар кори ҷорӣ, мо ин консепсияро ба мидия, як намуди посбон, ки бо қобилияти баланди филтркунии оби баҳр маълум аст, татбиқ кардем.Мо қобилияти мидияҳоро ҳамчун филтрҳои табиӣ истифода мебарем, то пораҳои ДНК-и экологиро аз сарчашмаҳои гуногун ба даст орем, то дар бораи гуногунии биологии экосистемаҳои соҳилии баҳр маълумот пешниҳод кунем.Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки гемолимфи мидия дорои порчаҳои ДНК мебошад, ки андозаашон аз 1 то 5 кб фарқ мекунанд.Пайдарпаии тирандозӣ нишон дод, ки миқдори зиёди пораҳои ДНК аз микробҳои хориҷӣ мебошанд.Дар байни онҳо, мо пораҳои ДНК-ро аз бактерияҳо, археяҳо ва вирусҳо ёфтем, аз ҷумла вирусҳое, ки маълуманд, ки ба ҳостҳои мухталифе, ки одатан дар экосистемаҳои баҳрии соҳилӣ мавҷуданд, сироят мекунанд.Хулоса, тадқиқоти мо нишон медиҳад, ки мафҳуми LB, ки ба мидия истифода мешавад, манбаи бой, вале ҳанӯз омӯхтанашудаи дониш дар бораи гуногунии микробҳо дар экосистемаҳои соҳилии баҳр мебошад.
Таъсири тағирёбии иқлим (CC) ба гуногунии биологии экосистемаҳои баҳрӣ як соҳаи босуръат афзояндаи тадқиқот мебошад.Гармшавии глобалӣ на танҳо фишорҳои муҳими физиологиро ба вуҷуд меорад, балки маҳдудиятҳои эволютсионии устувории гармии организмҳои баҳриро боло бурда, ба муҳити зисти як қатор намудҳо таъсир расонида, онҳоро ба ҷустуҷӯи шароити мусоидтар водор мекунад [1, 2].Илова ба таъсир ба гуногунии биологии метазоанҳо, CC мувозинати нозуки мутақобилаи мизбон ва микробҳоро вайрон мекунад.Ин дисбактериозҳои микробӣ барои экосистемаҳои баҳрӣ хатари ҷиддӣ эҷод мекунад, зеро он организмҳои баҳриро ба микроорганизмҳои сироятӣ бештар ҳассос мекунад [3, 4].Гумон меравад, ки SS дар марги оммавӣ нақши муҳим мебозад, ки мушкилоти ҷиддии идоракунии экосистемаҳои ҷаҳонии баҳр мебошад [5, 6].Ин як масъалаи муҳимест, ки бо назардошти таъсири иқтисодӣ, экологӣ ва ғизоии бисёр намудҳои баҳрӣ.Ин махсусан барои дупаҳлоқҳо, ки дар минтақаҳои қутбӣ зиндагӣ мекунанд, дахл дорад, ки таъсири CK фаврӣ ва шадидтар аст [6, 7].Дар асл, дупаҳлӯҳо ба монанди Mytilus spp.барои мониторинги таъсири CC ба экосистемаҳои баҳрӣ васеъ истифода мешаванд.Тааҷҷубовар нест, ки шумораи нисбатан зиёди биомаркерҳо барои мониторинги саломатии онҳо таҳия карда шудаанд, ки аксар вақт бо истифода аз равиши дуқабата, ки биомаркерҳои функсионалӣ дар асоси фаъолияти ферментативӣ ё функсияҳои ҳуҷайра, ба монанди мавҷудияти ҳуҷайра ва фаъолияти фагоситикӣ мебошанд [8].Ин усулҳо инчунин ченкунии консентратсияи нишондиҳандаҳои фишори мушаххасро дар бар мегиранд, ки пас аз азхудкунии миқдори зиёди оби баҳр дар бофтаҳои нарм ҷамъ мешаванд.Бо вуҷуди ин, қобилияти баланди филтратсия ва системаи гардиши нимкушои дупаҳлҳо имкон медиҳад, ки биомаркерҳои нави гемолимфаро бо истифода аз консепсияи биопсияи моеъ (LB), як равиши оддӣ ва каминвазивӣ барои идоракунии беморон таҳия кунанд.намунаҳои хун [9, 10].Гарчанде ки дар LB-и инсон якчанд намуди молекулаҳои гардишкунанда пайдо мешаванд, ин консепсия пеш аз ҳама ба таҳлили пайдарпайии ДНК пораҳои гардиши ДНК (ccfDNA) дар плазма асос ёфтааст.Дарвоқеъ, мавҷудияти ДНК-и гардишкунанда дар плазмаи инсон аз миёнаҳои асри 20 маълум буд [11], аммо танҳо дар солҳои охир пайдоиши усулҳои секвенсияи баландсуръат боиси ташхиси клиникӣ дар асоси ccfDNA гардид.Мавҷудияти ин порчаҳои ДНК-и гардишкунанда қисман ба озодшавии пассивии ДНК-и геномӣ (ядроӣ ва митохондриалӣ) пас аз марги ҳуҷайра вобаста аст. Дар одамони солим, консентратсияи ccfDNA одатан паст аст (<10 нг/мл), аммо дар беморони гирифтори патологияҳои гуногун ё фишори равонӣ метавонад 5-10 маротиба зиёд карда шавад, ки дар натиҷа бофтаҳо вайрон мешаванд. Дар одамони солим, консентратсияи ccfDNA одатан паст аст (<10 нг/мл), аммо дар беморони гирифтори патологияҳои гуногун ё фишори равонӣ метавонад 5-10 маротиба зиёд карда шавад, ки дар натиҷа бофтаҳо вайрон мешаванд. У здоровых одамон концентрация вккДНК дар норме низкая (<10 нг/мл), аммо метавонад дар 5-10 раз дар патологии гуногун ё зери фишори равонӣ, фишори равонӣ ва повреждению тканей. Дар одамони солим, консентратсияи cccDNA одатан паст аст (<10 нг/мл), аммо он метавонад дар беморони гирифтори патологияҳои гуногун ё дар ҳолати стресс 5-10 маротиба зиёд шавад, ки боиси вайроншавии бофта мегардад.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 нг/мЛ），但在患有各种病理或各中力力加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 нг/мл） 但 在 各 种 病理 戏 戗可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Консентратсияи ccfDNA дар байни одамон (<10 нг/мл) кам аст, аммо метавонад дар 5-10 раз дар беморони гирифтори бемориҳои гуногун ё фишори равонӣ, ки боиси пайдоиши тканей мегардад, афзояд. Консентратсияи ccfDNA одатан дар одамони солим паст (<10 нг/мл) аст, аммо дар беморони гирифтори патологияҳои гуногун ё стресс метавонад 5-10 маротиба зиёд карда шавад, ки боиси вайрон шудани бофта мегардад.Андозаи порчаҳои ccfDNA ба таври васеъ фарқ мекунад, аммо одатан аз 150 то 200 bp аст.[12].Таҳлили ccfDNA-и аз худ гирифташуда, яъне ccfDNA аз ҳуҷайраҳои мизбони муқаррарӣ ё табдилшуда метавонад барои ошкор кардани тағйироти генетикӣ ва эпигенетикӣ дар геноми ядроӣ ва/ё митохондриалӣ истифода шавад ва ба ин васила ба клиникҳо дар интихоби терапевтҳои мушаххаси ҳадафноки молекулавӣ кӯмак расонад [13].Аммо, ccfDNA-ро аз манбаъҳои хориҷӣ ба монанди ccfDNA аз ҳуҷайраҳои ҳомила ҳангоми ҳомиладорӣ ё узвҳои трансплантатсияшуда ба даст овардан мумкин аст [14,15,16,17].ccfDNA инчунин як манбаи муҳими иттилоот барои муайян кардани мавҷудияти кислотаҳои нуклеини агенти сирояткунанда (хориҷӣ) мебошад, ки имкон медиҳад, ки сироятҳои паҳншуда аз ҷониби фарҳангҳои хун муайян карда нашудаанд ва аз биопсияи инвазивии бофтаи сироятшуда пешгирӣ карда шаванд [18].Тадқиқотҳои охирин воқеан нишон доданд, ки хуни инсон дорои манбаи ғании иттилоот аст, ки метавонад барои муайян кардани микроорганизмҳои вирусӣ ва бактериявӣ истифода шавад ва тақрибан 1% ccfDNA, ки дар плазмаи инсон пайдо шудааст, пайдоиши хориҷӣ мебошад [19].Ин тадқиқотҳо нишон медиҳанд, ки гуногунии биологии микробиомаи гардиши организмро метавон бо истифода аз таҳлили ccfDNA арзёбӣ кард.Аммо то вактхои охир ин мафхум танхо дар одамон ва то андозае дар дигар хайвонхои устухон истифода мешуд [20, 21].
Дар мақолаи мазкур, мо потенсиали LB-ро барои таҳлили ccfDNA-и Aulacomya atra, як намуди ҷанубӣ, ки маъмулан дар ҷазираҳои субантарктикии Кергулен, як гурӯҳи ҷазираҳо дар болои платои калон, ки 35 миллион сол пеш ба вуҷуд омадаанд, истифода мебарем.таркиши вулқон.Бо истифода аз системаи таҷрибавии in vitro, мо дарёфтем, ки пораҳои ДНК дар оби баҳр зуд аз ҷониби мидияҳо гирифта мешаванд ва ба қисми гемолимфа дохил мешаванд.Пайдарпайвандии тирпарронӣ нишон дод, ки ccfDNA гемолимфаҳои мидия дорои порчаҳои ДНК-и пайдоиши худ ва ғайрихудӣ, аз ҷумла бактерияҳои симбиотикӣ ва пораҳои ДНК аз биомҳои хоси экосистемаҳои соҳилии вулқонии сард мебошанд.Гемолимф ccfDNA инчунин пайдарпаии вирусиро дар бар мегирад, ки аз вирусҳо бо диапазони гуногуни мизбон гирифта шудаанд.Мо инчунин пораҳои ДНК-ро аз ҳайвоноти бисёрҳуҷайра ба монанди моҳии устухон, анемонҳои баҳрӣ, алгҳо ва ҳашарот ёфтем.Хулоса, тадқиқоти мо нишон медиҳад, ки консепсияи LB метавонад бомуваффақият ба сутунмӯҳраҳои баҳрӣ барои тавлиди репертуари геномии бой дар экосистемаҳои баҳрӣ татбиқ карда шавад.
Калонсолон (дарозии 55-70 мм) Mytilus platensis (M. platensis) ва Aulacomya atra (A. atra) аз сохилхои санглохи байнихамвории Порт-о-Франс (049°21.235 S, 070°13.490 E.) чамъ карда шуданд.Ҷазираҳои Кергулен дар моҳи декабри соли 2018. Дигар мидияҳои кабуди калонсолон (Mytilus spp.) аз як молрасони тиҷоратӣ (PEI Mussel King Inc., Ҷазираи Шоҳзода Эдвард, Канада) гирифта шуда, дар як зарфи газдоре, ки дорои 10-20 л намакоби сунъии 32‰ мавҷуд аст, ҷойгир карда шуданд.(намаки сунъии баҳри Reef Crystal, Instant Ocean, Вирҷиния, ИМА).Барои ҳар як таҷриба, дарозӣ ва вазни снарядҳои алоҳида чен карда шуданд.
Протоколи дастрасии озод барои ин барнома дар интернет дастрас аст (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Ба таври мухтасар, гемолимфи LB аз мушакҳои рабудашуда тавре тавсиф карда шуд [22].Гемолимфа тавассути центрифуга дар 1200 × г барои 3 дақиқа равшан карда шуд, супернатант то истифода шудан ях карда шуд (-20 ° C).Барои ҷудо кардан ва тоза кардани cfDNA, намунаҳо (1,5-2,0 мл) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда бо истифода аз маҷмӯаи NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) об карда шуданд ва коркард карда шуданд.ccfDNA дар -80 ° C то таҳлили минбаъда нигоҳ дошта шуд.Дар баъзе таҷрибаҳо, ccfDNA бо истифода аз маҷмӯаи QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада) ҷудо ва тоза карда шуд.ДНК-и тозашуда бо истифода аз таҳлили стандартии PicoGreen чен карда шуд.Тақсимоти порчаҳои ccfDNA-и ҷудошуда тавассути электрофорези капиллярӣ бо истифода аз биоанализери Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Санта Клара, CA) бо истифода аз маҷмӯаи ДНК ҳассосияти баланд таҳлил карда шуд.Таҳлил бо истифода аз 1 мкл намунаи ccfDNA мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда анҷом дода шуд.
Барои пайдарпайии порчаҳои гемолимфӣ ccfDNA, Génome Québec (Монреал, Квебек, Канада) китобхонаҳои тирандозиро бо истифода аз маҷмӯаи Illumina DNA Mix аз маҷмӯаи Illumina MiSeq PE75 омода кард.Адаптери стандартӣ (BioO) истифода шудааст.Файлҳои маълумоти хом аз бойгонии NCBI Sequence Read (SRR8924808 ва SRR8924809) дастрасанд.Сифати асосии хониш бо истифода аз FastQC арзёбӣ шуд [23].Trimmomatic [24] барои буридани адаптерҳо ва хондани пастсифат истифода шудааст.Хонишҳои тирандозӣ бо нӯгҳои ҷуфтшуда FLASH ба хонданҳои дарозтари ягона бо ҳадди ақали такрори 20 бит барои пешгирӣ кардани номувофиқӣ муттаҳид карда шуданд [25]. Хонишҳои муттаҳидшуда бо BLASTN бо истифода аз пойгоҳи додаи дупаҳлӯи NCBI Taxonomy (қимати e <1e−3 ва 90% гомология) шарҳ дода шуданд ва ниқоб кардани пайдарпайии мураккабии паст бо истифода аз DUST [26] анҷом дода шуд. Хонишҳои муттаҳидшуда бо BLASTN бо истифода аз пойгоҳи додаи дупаҳлӯи NCBI Taxonomy (қимати e <1e−3 ва 90% гомология) шарҳ дода шуданд ва ниқоб кардани пайдарпайии мураккабии паст бо истифода аз DUST [26] анҷом дода шуд. Объединенные чтения бо аннотировани с помощью BLASTN бо истифодабарии базы данных таксономии дуворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 ва 90% гомологии), як маскирование пас аз иҷрои вазифаҳои 2-ро дар бар мегирад. Хонишҳои ҷамъшуда бо BLASTN бо истифода аз базаи таксономияи дупаҳлӯи NCBI (қимати e <1e-3 ва 90% гомология) шарҳ дода шуданд ва бо истифода аз DUST ниқоби пайдарпайии мураккабии паст анҷом дода шуд [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释）用BLASTN 注释（并的读合并的读合并的读合并的读合广的读）读低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 合并 读数 合并 读数 （（（<1e-3 和复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения бо аннотировани с помощью BLASTN бо истифода аз таксономической базы данных дувустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 ва 90% гомологии), як маскирование пас аз анҷоми кори 2-юм. Хонишҳои ҷамъшуда бо BLASTN бо истифода аз базаи таксономии дупаҳлӯи NCBI (қимати e <1e-3 ва 90% гомология) шарҳ дода шуданд ва бо истифода аз DUST ниқоби пайдарпайии мураккабии паст анҷом дода шуд [26].Хонишҳо ба ду гурӯҳ тақсим шуданд: марбут ба пайдарпаии дупаҳлӣ (дар ин ҷо худхондаҳо номида мешаванд) ва алоқаманд (ғайрихудхондаҳо).Ду гурӯҳ бо истифода аз MEGAHIT барои тавлиди контигҳо алоҳида ҷамъ карда шуданд [27].Дар ҳамин ҳол, тақсимоти таксономии хондани микробиомаҳои бегона бо истифода аз Kraken2 тасниф карда шуд [28] ва графикӣ бо диаграммаи пирожни Krona дар Галактика [29, 30] нишон дода шудааст.Аз тачрибахои пешакии мо кммерхои оптималй кммер-59 муайян карда шуданд. Пас аз он контигҳои худидоракунӣ бо роҳи ҳамоҳангсозӣ бо BLASTN (махзани пойгоҳи дупаҳлӯи NCBI, арзиши e <1e−10 ва 60% гомология) барои шарҳи ниҳоӣ муайян карда шуданд. Пас аз он контигҳои худидоракунӣ бо роҳи ҳамоҳангсозӣ бо BLASTN (махзани пойгоҳи дупаҳлӯи NCBI, арзиши e <1e−10 ва 60% гомология) барои шарҳи ниҳоӣ муайян карда шуданд. Затем собственные контиги бо идентификатсияи путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 ва гомология 60%) барои окончательной аннотации. Пас аз он, худфаъолиятҳо бо роҳи мувофиқат кардан бо BLASTN (махзани NCBI дупаҳлӯ, арзиши e <1e-10 ва 60% гомология) барои шарҳи ниҳоӣ муайян карда шуданд.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识迡别该识别最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем бо идентификатсияи собственные контиги барои окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI барои двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 ва гомология 60%). Пас аз он, худидоракунии контигҳо барои шарҳи ниҳоӣ тавассути мувофиқат бо BLASTN муайян карда шуданд (базанаи NCBI дупаҳлӯ, арзиши e <1e-10 ва 60% гомология). Дар баробари ин, контигҳои гурӯҳи ғайримуқаррарӣ бо BLASTN (nt NCBI базаи маълумотҳо, арзиши e <1e−10 ва 60% гомология) шарҳ дода шуданд. Дар баробари ин, контигҳои гурӯҳи ғайримуқаррарӣ бо BLASTN (nt NCBI базаи маълумотҳо, арзиши e <1e−10 ва 60% гомология) шарҳ дода шуданд. Параллельно чужеродные групповые контиги бо аннотировани с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 ва гомология 60%). Дар баробари ин, контигҳои гурӯҳи хориҷӣ бо BLASTN (базанаи NT NCBI, арзиши e <1e-10 ва 60% гомология) шарҳ дода шуданд.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参参 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотировани с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 ва гомология 60%). Дар баробари ин, контигҳои гурӯҳи ғайридавлатӣ бо BLASTN шарҳ дода шуданд (nt базаи маълумотҳои NCBI, арзиши e <1e-10 ва 60% гомология). BLASTX инчунин дар контигҳои ғайримуқаррарӣ бо истифода аз пойгоҳи додаҳои nr ва RefSeq протеини NCBI (e арзиши <1e−10 ва 60% гомология) гузаронида шуд. BLASTX инчунин дар контигҳои ғайримуқаррарӣ бо истифода аз пойгоҳи додаҳои nr ва RefSeq протеини NCBI (e арзиши <1e−10 ва 60% гомология) гузаронида шуд. BLASTX инчунин бо истифода аз несамостоятельных контигахҳо бо истифода аз баз данных белка nr ва RefSeq NCBI (значение e <1e-10 ва гомология 60%). BLASTX инчунин дар контигҳои ғайридавлатӣ бо истифода аз пойгоҳи додаҳои протеини nr ва RefSeq NCBI анҷом дода шуд (қимати e <1e-10 ва 60% гомология).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧 BLASTX инчунин бо истифода аз несамостоятельных контигахҳо бо истифода аз баз данных белка nr ва RefSeq NCBI (значение e <1e-10 ва гомология 60%). BLASTX инчунин дар контигҳои ғайримуқаррарӣ бо истифода аз пойгоҳи додаҳои сафедаи nr ва RefSeq NCBI (e арзиши <1e-10 ва 60% гомология) анҷом дода шуд.Ҳавзҳои BLASTN ва BLASTX аз контигҳои ғайридавлатӣ контигҳои ниҳоиро намояндагӣ мекунанд (ниг. Ба файли иловагӣ).
Примерҳое, ки барои PCR истифода мешаванд, дар ҷадвали S1 оварда шудаанд.Полимеразаи Taq DNA (Bio Basic Canada, Markham, ON) барои тақвият додани генҳои ҳадафи ccfDNA истифода шудааст.Шароитҳои зерини реаксия истифода шуданд: денатуратсия дар 95 ° C барои 3 дақиқа, 95 ° C барои 1 дақиқа, муқаррар кардани ҳарорати гармкунӣ барои 1 дақиқа, дарозшавӣ дар 72 ° C барои 1 дақиқа, 35 давра ва ниҳоят 72 ° C дар давоми 10 дақиқа..Маҳсулоти ПТР тавассути электрофорез дар гелҳои агарозӣ (1,5%), ки дорои доғи SYBRTM Safe DNA Gel (Invitrogen, Burlington, ON, Канада) дар 95 В ҷудо карда шудаанд.
Мидияҳо (Mytilus spp.) дар оби баҳри 500 мл оксигендор (32 PSU) барои 24 соат дар ҳарорати 4 ° C мутобиқ карда шуданд.ДНК-и плазмиди дорои замима, ки пайдарпаии галектин-7 cDNA-и инсонро рамзгузорӣ мекунад (рақами пайвастшавии NCBI L07769) ба шиша дар консентратсияи ниҳоии 190 мкг/мкл илова карда шуд.Мидияҳое, ки дар як шароит бе иловаи ДНК инкубатор карда шудаанд, назорат буданд.Дар зарфи сеюми назоратӣ ДНК бе мидия мавҷуд буд.Барои назорат кардани сифати ДНК дар оби баҳр, дар вақти муайяншуда аз ҳар як зарф намунаҳои оби баҳр (20 мкл; се такрор) гирифта шуданд.Барои пайгирии плазми ДНК, мидияҳои LB дар вақтҳои зикршуда ҷамъоварӣ карда шуданд ва тавассути qPCR ва ddPCR таҳлил карда шуданд.Аз сабаби миқдори зиёди намаки оби баҳр, аликвотҳо дар оби сифатии ПТР (1:10) пеш аз ҳама санҷишҳои PCR ҳал карда шуданд.
ПТР-и рақамии қатраӣ (ddPCR) бо истифода аз протоколи BioRad QX200 (Миссиссауга, Онтарио, Канада) анҷом дода шуд.Барои муайян кардани ҳарорати оптималӣ профили ҳароратро истифода баред (Ҷадвали S1).Қатраҳо бо истифода аз генератори тарки QX200 (BioRad) тавлид шуданд.ddPCR ба таври зерин анҷом дода шуд: 95 ° C барои 5 дақиқа, 50 давра аз 95 ° C барои 30 сония ва ҳарорати додашудаи гармкунӣ барои 1 дақиқа ва 72 ° C барои 30 сония, 4 ° C барои 5 дақиқа ва 90 ° C дар давоми 5 дақиқа.Миқдори қатраҳо ва аксуламалҳои мусбат (шумораи нусхаҳо/мкл) бо истифода аз хонандаи қатраи QX200 (BioRad) чен карда шуданд.Намунаҳое, ки камтар аз 10 000 қатра доранд, рад карда шуданд.Ҳар дафъае, ки ddPCR иҷро мешуд, назорати намуна иҷро намешуд.
qPCR бо истифода аз Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидней, Австралия) ва примерҳои мушаххаси LGALS7 анҷом дода шуд.Ҳама PCR-ҳои миқдорӣ дар 20 мкл бо истифода аз маҷмӯаи QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN) анҷом дода шуданд.qPCR бо инкубатсияи 15 дақиқа дар 95 ° C ва пас аз 40 давра дар 95 ° C барои 10 сония ва дар 60 ° C барои 60 сония бо як ҷамъоварии маълумот оғоз ёфт.Каҷҳои обшавӣ бо истифода аз ченакҳои пайдарпай дар 95 ° C барои 5 сония, 65 ° C барои 60 сония ва 97 ° C дар охири qPCR тавлид карда шуданд.Ҳар як qPCR дар се нусха анҷом дода шуд, ба истиснои намунаҳои назорат.
Азбаски мидияҳо бо суръати баланди филтратсияашон маълуманд, мо аввал таҳқиқ кардем, ки оё онҳо метавонанд порчаҳои ДНК-ро дар оби баҳр филтр ва нигоҳ доранд.Мо инчунин ба он таваҷҷӯҳ доштем, ки оё ин пораҳо дар системаи лимфаҳои нимкушо ҷамъ мешаванд.Мо ин масъаларо ба таври таҷрибавӣ тавассути пайгирии сарнавишти пораҳои ҳалшавандаи ДНК, ки ба зарфҳои кабуд илова карда шудаанд, ҳал кардем.Барои осон кардани пайгирии пораҳои ДНК, мо ДНК-и хориҷӣ (на худи) плазмиди дорои гени галектин-7-и инсонро истифода бурдем.ddPCR пораҳои ДНК-и плазмидиро дар оби баҳр ва мидия пайгирӣ мекунад.Натиљањои мо нишон медињанд, ки агар миќдори порањои ДНК дар оби бањр бо мурури замон (то 7 рўз) дар њолати набудани мидия нисбатан доимї боќї монда бошад, пас дар мављудияти мидия ин сатњ дар давоми 8 соат ќариб комилан аз байн меравад (расми 1а,б).Порчаҳои ДНК-и экзогенӣ дар давоми 15 дақиқа дар моеъи дохили рагҳо ва гемолимфа ба осонӣ ошкор карда шуданд (расми 1в).Ин порчаҳоро то 4 соат пас аз дучоршавӣ ошкор кардан мумкин аст.Ин фаъолияти филтркунӣ нисбат ба порчаҳои ДНК бо фаъолияти филтркунии бактерияҳо ва алгҳо муқоиса карда мешавад [31].Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки мидияҳо метавонанд ДНК-и хориҷиро дар қисмҳои моеъи худ филтр кунанд ва ҷамъ кунанд.
Консентратсияи нисбии ДНК плазмидӣ дар оби баҳр дар ҳузури (A) ё набудани (B) мидияҳо, ки бо ddPCR чен карда мешаванд.Дар А, натиҷаҳо бо фоизҳо ифода карда мешаванд ва сарҳадҳои қуттиҳо фоизҳои 75 ва 25-ро ифода мекунанд.Каҷи логарифмикии насбшуда бо ранги сурх нишон дода шудааст ва майдони бо хокистарӣ сояафканшуда фосилаи 95% эътимодро ифода мекунад.Дар B, хати сурх маънои миёнаро ифода мекунад ва хати кабуд фосилаи 95% эътимодро барои консентрат нишон медиҳад.C Ҷамъшавии ДНК-и плазмидӣ дар гемолимфа ва моеъи клапанҳои мидия дар вақтҳои гуногун пас аз илова кардани ДНК плазмидӣ.Натиҷаҳо ҳамчун нусхаҳои мутлақи ошкоршуда/мл (±SE) пешниҳод карда мешаванд.
Баъдан, мо пайдоиши ccfDNA-ро дар мидияҳое, ки аз катҳои мидия дар ҷазираҳои Кергулен, як гурӯҳи дурдасти ҷазираҳои дорои таъсири маҳдуди антропогенӣ ҷамъоварӣ шудаанд, таҳқиқ кардем.Бо ин мақсад, cccDNA аз гемолимфҳои мидия ҷудо ва тоза карда шуд, бо усулҳое, ки одатан барои тоза кардани cccDNA-и инсон истифода мешаванд [32, 33].Мо дарёфтем, ки консентратсияи миёнаи гемолимфа ccfDNA дар мидияҳо дар микрограммҳои паст дар як мл диапазони гемолимфа мебошанд (ниг. Ҷадвали S2, Маълумоти иловагӣ).Ин диапазони консентратҳо нисбат ба одамони солим хеле калонтар аст (нанограммаҳои кам дар як миллилитр), аммо дар ҳолатҳои кам, дар беморони саратон, сатҳи ccfDNA метавонад ба якчанд микрограмм дар як миллилитр расад [34, 35].Таҳлили тақсимоти андозаи ccfDNA гемолимфӣ нишон дод, ки ин порчаҳо аз ҷиҳати андоза аз 1000 то 1000 bp фарқ мекунанд.то 5000 зарба (расми 2).Натиҷаҳои шабеҳ бо истифодаи маҷмӯаи кремнийи QIAamp Investigator Kit, ки маъмулан дар илми криминалистӣ барои зуд ҷудо кардан ва тоза кардани ДНК-и геномӣ аз намунаҳои консентратсияи пасти ДНК, аз ҷумла ccfDNA истифода мешавад, ба даст оварда шуданд [36].
Намояндагии ccfDNA электрофореграммаи гемолимфи мидия.Бо NucleoSnap Plasma Kit (боло) ва маҷмӯаи QIAamp DNA Investigator истихроҷ карда шудааст.B Скрипкаи скрипка, ки тақсимоти консентратсияи гемолимфаҳои ccfDNA (±SE) дар мидияҳоро нишон медиҳад.Хатҳои сиёҳ ва сурх мутаносибан медиана ва квартилҳои якум ва сеюмро ифода мекунанд.
Тақрибан 1% ccfDNA дар одамон ва приматҳо манбаи хориҷӣ дорад [21, 37].Бо дарназардошти системаи гардиши нимкушодаи дувафҳо, оби баҳри аз микробҳо бой ва тақсимоти андозаи ccfDNA мидия, мо фарзия кардем, ки ccfDNA гемолимфи мидия метавонад дорои ҳавзи бой ва гуногуни ДНК микроб бошад.Барои санҷидани ин фарзия, мо гемолимфӣ ccfDNA-ро аз намунаҳои Aulacomya atra, ки аз ҷазираҳои Кергулен ҷамъоварӣ шудаанд, тартиб додем, ки беш аз 10 миллион хониш ба даст овард, ки 97,6% онҳо аз назорати сифат гузаштанд.Сипас хонишҳо аз рӯи сарчашмаҳои худ ва ғайримустақим бо истифода аз пойгоҳи додаҳои дупаҳлӯи BLASTN ва NCBI тасниф карда шуданд (расми S1, Маълумоти иловагӣ).
Дар одамон, ҳам ДНК-и ядроӣ ва ҳам митохондриалӣ метавонад ба ҷараёни хун бароварда шавад [38].Аммо дар тадкикоти хозира ДНК-и геномии ядроии мидияро муфассал тавсиф кардан мум-кин набуд, зеро геноми А.Бо вуҷуди ин, мо тавонистем як қатор порчаҳои ccfDNA-и пайдоиши худро бо истифода аз китобхонаи дупаҳлӣ муайян кунем (расми S2, Маълумоти иловагӣ).Мо инчунин мавҷудияти порчаҳои ДНК-и пайдоиши худамонро тавассути амплификацияи мустақими ПТР-и он генҳои A. atra, ки пайдарпай буданд, тасдиқ кардем (расми 3).Ба хамин тарик, бо назардошти он, ки геноми митохондриалии А.атра дар махзани маълумоти омма дастрас аст, далели мавчудияти порчахои митохондриалии ccfDNA дар гемолимфаи А.атра пайдо кардан мумкин аст.Мавҷудияти порчаҳои ДНК-и митохондриалӣ тавассути амплификацияи ПТР тасдиқ карда шуд (расми 3).
Дар гемолимфаи A. atra (нуқтаҳои сурх – рақами саҳҳомӣ: SRX5705969) ва M. platensis (нуқтаҳои кабуд – рақами саҳҳомӣ: SRX5705968) генҳои гуногуни митохондриалӣ мавҷуд буданд, ки тавассути ПЗР тақвият дода шудаанд.Тасвир аз Breton et al., 2011 мутобиқ карда шудааст.Барои илова кардани бевосита ба найчаи ПЗР, ки омехтаи ПТР дорад, шкалаи 3 мм-ро истифода баред.
Бо назардошти миқдори зиёди микробҳо дар оби баҳр, мо дар аввал ба тавсифи пайдарпаии ДНК-и микробҳо дар гемолимф тамаркуз кардем.Барои ин, мо ду стратегияи гуногунро истифода мебарем.Стратегияи аввал Kraken2, барномаи таснифоти пайдарпайии алгоритмиро истифода бурд, ки метавонад пайдарпайии микробҳоро бо дақиқии муқоисашаванда бо BLAST ва дигар асбобҳо муайян кунад [28].Зиёда аз 6719 хониш пайдоиши бактериявӣ муайян карда шуд, дар ҳоле ки 124 ва 64 мутаносибан аз архей ва вирусҳо буданд (расми 4).Пораҳои аз ҳама фаровони ДНК-и бактериявӣ Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) ва Bacterioides (17%) буданд (расми 4а).Ин тақсимот бо таҳқиқоти қаблии микробиомаи мидияи кабуди баҳрӣ мувофиқ аст [39, 40].Гаммапротеобактерияҳо синфи асосии Протеобактерияҳо буданд (44%), аз ҷумла бисёр Вибрионалҳо (расми 4б).Усули ddPCR мавҷудияти порчаҳои ДНК Vibrio дар ccfDNA-и A. atra hemolymph (расми 4c) [41].Барои гирифтани маълумоти бештар дар бораи пайдоиши бактериявии ccfDNA, равиши иловагӣ андешида шуд (расми S2, Маълумоти иловагӣ). Дар ин ҳолат, мутолиаҳое, ки ба ҳам мепайвандад, ҳамчун хондани ҷуфтшуда ҷамъ карда шуданд ва бо истифода аз BLASTN ва арзиши e 1e−3 ва буриш бо >90% гомология ҳамчун пайдоиши худ (дучандон) ё пайдоиши ғайримустақим тасниф карда шуданд. Дар ин ҳолат, мутолиаҳое, ки ба ҳам мепайвандад, ҳамчун хондани ҷуфтшуда ҷамъ карда шуданд ва бо истифода аз BLASTN ва арзиши e 1e−3 ва буриш бо >90% гомология ҳамчун пайдоиши худ (дучандон) ё пайдоиши ғайримустақим тасниф карда шуданд. В этом случае перекрывающиеся чтения бо собраны как чтения с парными концами ва бл классифицировани как собственные (двустворчатые моллюски) ё чужие по происхождению бо истифода аз BLASTN ва значения аз 190%. Дар ин ҳолат, хонишҳои такроршаванда ҳамчун хонишҳои ҷуфтшуда ҷамъоварӣ карда шуданд ва бо истифода аз BLASTN ва арзиши e аз 1e-3 ва буриш бо >90% гомология ҳамчун модарӣ (дуқаба) ё ғайриаслӣ тасниф карда шуданд.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 檀 匀 匀% 值店值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 嚄用和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения бо собрани как чтения с парными концами ва классифицировани как собственные (двустворчатые моллюски) ё несобственные по происхождению бо истифодабарии значений e BLASTN логи и по-19e. Дар ин ҳолат, хонишҳои такрорӣ ҳамчун хонишҳои ҷуфтшуда ҷамъоварӣ карда шуданд ва бо истифода аз арзишҳои e BLASTN ва 1e-3 ва ҳадди гомологӣ>90% ҳамчун худӣ (дучандон) ё ғайриаслӣ тасниф карда шуданд.Азбаски геноми A. atra то ҳол пайдарпаӣ карда нашудааст, мо стратегияи де-новои монтажи монтажчии MEGAHIT Next Generation Generation (NGS) -ро истифода бурдем.Ҳамагӣ 147,188 контиг ҳамчун вобастагӣ (дувафҳо) аз пайдоиш муайян карда шудаанд.Сипас ин контигҳо бо арзишҳои электронии 1e-10 бо истифода аз BLASTN ва BLASTX тарконда шуданд.Ин стратегия ба мо имкон дод, ки 482 порчаҳои ғайридавлатӣ дар A. atra ccfDNA мавҷудбударо муайян кунем.Зиёда аз нисфи (57%) ин порчаҳои ДНК аз бактерияҳо, асосан аз симбионтҳои гил, аз ҷумла симбионтҳои сулфотрофӣ ва аз симбионтҳои солемя велум (расми 5) гирифта шудаанд.
Фаровонии нисбӣ дар сатҳи намуд.B Гуногунии микробҳои ду фила асосӣ (Firmicutes ва Proteobacteria).Амплификацияи намояндагии ddPCR C Vibrio spp.A. Порчаҳои гени 16S rRNA (кабуд) дар се атра гемолимфаҳо.
Ҳамагӣ 482 контигҳои ҷамъшуда таҳлил карда шуданд.Профили умумии тақсимоти таксономикии контигҳои метагеномӣ (прокариотҳо ва эукариотҳо).B Тақсимоти муфассали пораҳои ДНК бактериявӣ, ки аз ҷониби BLASTN ва BLASTX муайян карда шудаанд.
Таҳлили Kraken2 инчунин нишон дод, ки ccfDNA мидия порчаҳои ДНК-и археалиро дар бар мегирад, аз ҷумла порчаҳои ДНК-и Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) ва Thaurmarcheota (11%) (расми 6а).Мавҷудияти пораҳои ДНК аз Euryarchaeota ва Crenarchaeota, ки қаблан дар ҷомеаи микробҳои мидияҳои Калифорния пайдо шуда буданд, набояд тааҷҷубовар бошад [42].Гарчанде ки Euryarchaeota аксар вақт бо шароити шадид алоқаманд аст, ҳоло эътироф шудааст, ки ҳам Euryarchaeota ва ҳам Crenarcheota аз прокариотҳои маъмултарин дар муҳити криогении баҳрӣ мебошанд [43, 44].Мавҷудияти микроорганизмҳои метаногенӣ дар мидия тааҷҷубовар нест, бо дарназардошти гузоришҳои ахир дар бораи ихроҷи васеъи метан аз ихроҷи поён дар платои Кергулен [45] ва тавлиди эҳтимолии метани микробӣ дар соҳили ҷазираҳои Кергулен [46].
Сипас таваҷҷӯҳи мо ба хондани вирусҳои ДНК равона шуд.Ба маълумоти беҳтарини мо, ин аввалин омӯзиши ғайриҳадаф оид ба мундариҷаи вируси мидия мебошад.Тавре ки интизор мерафт, мо пораҳои ДНК-и бактериофагҳоро (Caudovirales) ёфтем (расми 6б).Бо вуҷуди ин, ДНК-и маъмултарини вирусӣ аз филуми нуклеоцитовирусҳо, инчунин бо номи вируси цитоплазми калони ДНК-и ядроӣ (NCLDV) маълум аст, ки бузургтарин геноми ҳама гуна вирусро дорад.Дар дохили ин филум, аксари пайдарпаии ДНК ба оилаҳои Mimimidoviridae (58%) ва Poxviridae (21%) тааллуқ доранд, ки мизбони табиии онҳо сутунмӯҳраҳо ва буғумподагонро дар бар мегиранд, дар ҳоле ки як қисми ками ин пайдарпаии ДНК ба алгҳои маълуми вирусологӣ тааллуқ доранд.Алгҳои эукариотии баҳриро сироят мекунад.Пайдарпайҳо инчунин аз вируси Pandora, вируси азим бо андозаи калонтарини геномҳои ҳама гуна насли вирусии маълум ба даст оварда шудаанд.Ҷолиб он аст, ки доираи мизбонҳое, ки ба вирус мубтало шудаанд, тавре ки бо пайдарпайии гемолимфӣ ccfDNA муайян карда шудаанд, нисбатан калон буд (Расми S3, Маълумоти иловагӣ).Ба он вирусхое дохил мешаванд, ки хашарот ба монанди Baculoviridae ва Iridoviridae, инчунин вирусхое, ки амеба, алгхо ва хайвоноти устухонро сироят мекунанд.Мо инчунин пайдарпаии мувофиқи геномҳои Pithovirus sibericum пайдо кардем.Питовирусҳо (инчунин бо номи "вирусҳои зомби" маъруфанд) бори аввал аз яхбандии абадии 30 000-сола дар Сибир ҷудо карда шуданд [47].Ҳамин тариқ, натиҷаҳои мо бо гузоришҳои қаблӣ мувофиқат мекунанд, ки нишон медиҳанд, ки на ҳама намудҳои муосири ин вирусҳо нест шудаанд [48] ва ин вирусҳо метавонанд дар экосистемаҳои дурдасти баҳрии субарктикӣ мавҷуд бошанд.
Ниҳоят, мо озмоиш кардем, то бубинем, ки оё мо метавонем пораҳои ДНК-ро аз дигар ҳайвоноти бисёрҳуҷайра пайдо кунем.Ҳамагӣ 482 контигҳои хориҷӣ аз ҷониби BLASTN ва BLASTX бо китобхонаҳои nt, nr ва RefSeq (геномӣ ва сафеда) муайян карда шуданд.Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки дар байни порчаҳои бегонаи ccfDNA-и ҳайвоноти бисёрҳуҷайра ДНК-и устухонҳои устухон бартарӣ доранд (расми 5).Порчаҳои ДНК аз ҳашарот ва дигар намудҳо низ пайдо шудаанд.Қисми нисбатан зиёди пораҳои ДНК муайян карда нашудааст, ки эҳтимолан аз сабаби кам муаррифии шумораи зиёди намудҳои баҳрӣ дар пойгоҳи додаҳои геномӣ дар муқоиса бо намудҳои заминӣ [49].
Дар мақолаи мазкур мо консепсияи LB-ро ба мидияҳо татбиқ мекунем ва далел меорем, ки пайдарпаии тирҳои гемолимфӣ ccfDNA метавонад дар бораи таркиби экосистемаҳои соҳилии баҳр фаҳмиш диҳад.Аз ҷумла, мо дарёфтем, ки 1) гемолимфи мидия дорои консентратсияи нисбатан баланд (сатҳи микрограммӣ) пораҳои нисбатан калон (~1-5 кб) пораҳои ДНК-и гардишкунанда дорад;2) ин пораҳои ДНК ҳам мустақил ва ҳам ғайримустақил мебошанд 3) Дар байни манбаъҳои хориҷии ин пораҳои ДНК ДНК-и бактериявӣ, археалӣ ва вирусӣ, инчунин ДНК-и дигар ҳайвоноти бисёрҳуҷайраро ёфтем;4) Ҷамъшавии ин порчаҳои ccfDNA-и хориҷӣ дар гемолимфа зуд ба амал омада, ба фаъолияти филтркунии дохилии мидия мусоидат мекунад.Хулоса, тадқиқоти мо нишон медиҳад, ки мафҳуми LB, ки то ҳол асосан дар соҳаи биотиббӣ татбиқ шудааст, як манбаи бой, вале омӯхтанашудаи донишро рамзгузорӣ мекунад, ки метавонад барои беҳтар фаҳмидани ҳамкории байни намудҳои посбон ва муҳити онҳо истифода шавад.
Илова ба приматҳо, изолятсияи ccfDNA дар ширхӯрон, аз ҷумла мушҳо, сагҳо, гурбаҳо ва аспҳо гузориш дода шудааст [50, 51, 52].Аммо, ба маълумоти мо, тадқиқоти мо аввалин бор дар бораи ошкор ва пайдарпайии ccfDNA дар намудҳои баҳр бо системаи гардиши кушод гузориш медиҳад.Ин хусусияти анатомӣ ва қобилияти филтркунии мидия метавонад ҳадди аққал қисман хусусиятҳои гуногуни андозаи пораҳои гардиши ДНК-ро дар муқоиса бо дигар намудҳо шарҳ диҳад.Дар одамон, аксари пораҳои ДНК, ки дар хун гардиш мекунанд, пораҳои хурд мебошанд, ки андозаашон аз 150 то 200 bp мебошад.бо қуллаи максималии 167 bp [34, 53].Қисми хурд, вале муҳими порчаҳои ДНК аз 300 то 500 bp ва тақрибан 5% аз 900 bp дарозтаранд.[54].Сабаби ин тақсимоти андоза дар он аст, ки манбаи асосии ccfDNA дар плазма дар натиҷаи марги ҳуҷайраҳо ё аз сабаби марги ҳуҷайра ё аз сабаби некрозии ҳуҷайраҳои гемопоэтикии гардиш дар одамони солим ё аз сабаби апоптози ҳуҷайраҳои варам дар беморони саратон (бо номи ДНК-и гардиши варам маълум аст)., ctDNA).Тақсимоти андозаи ccfDNA-и гемолимфӣ, ки мо дар мидия ёфтем, аз 1000 то 5000 bp буд ва аз он шаҳодат медиҳад, ки ccfDNA-и мидия пайдоиши дигар дорад.Ин як фарзияи мантиқӣ аст, зеро мидияҳо системаи рагҳои нимкушо доранд ва дар муҳити обии баҳрӣ, ки дорои консентратсияи баланди ДНК-и микробҳои геномӣ мебошанд, зиндагӣ мекунанд.Дарвоқеъ, таҷрибаҳои лаборатории мо бо истифода аз ДНК-и экзогенӣ нишон доданд, ки мидияҳо пораҳои ДНК-ро дар оби баҳр ҷамъ мекунанд, ҳадди аққал пас аз чанд соат пас аз гирифтани ҳуҷайраҳо вайрон мешаванд ва/ё озод мешаванд ва/ё дар созмонҳои гуногун нигоҳ дошта мешаванд.Бо дарназардошти камёфт будани ҳуҷайраҳо (ҳам прокариотҳо ва ҳам эукариотҳо), истифодаи қисмҳои дохили рагҳо миқдори ccfDNA-ро аз манбаъҳои худ ва инчунин аз манбаъҳои хориҷӣ кам мекунад.Бо дарназардошти аҳамияти иммунитети модарзодии дупаҳлӯ ва шумораи зиёди фагоситҳои гардишкунанда, мо минбаъд фарзия кардем, ки ҳатто ccfDNA-и хориҷӣ дар фагоситҳои гардишгар бой шудааст, ки ДНК-и хориҷиро ҳангоми ворид шудани микроорганизмҳо ва/ё партовҳои ҳуҷайра ҷамъ мекунанд.Якҷоя гирифта, натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки ccfDNA гемолимфаҳои дупаҳлӣ як анбори ягонаи иттилооти молекулавӣ буда, мақоми онҳоро ҳамчун намуди посбонӣ мустаҳкам мекунад.
Маълумоти мо нишон медиҳад, ки пайдарпайӣ ва таҳлили порчаҳои гемолимфаҳои ccfDNA-и бактериявӣ гирифташуда метавонанд маълумоти калидиро дар бораи флораи бактериявии мизбон ва бактерияҳое, ки дар экосистемаи баҳрии атроф мавҷуданд, таъмин кунанд.Усулҳои пайдарпайии тир пайдарпайии бактерияҳои комменсалии A. atra gill-ро ошкор карданд, ки агар усулҳои муқаррарии мушаххаскунии 16S rRNA истифода мешуданд, аз сабаби ғарази китобхонаи истинод.Дарвоқеъ, истифодаи мо аз маълумоти LB, ки аз M. platensis дар ҳамон қабати мушакҳо дар Кергулен ҷамъоварӣ шудааст, нишон дод, ки таркиби симбионтҳои бактериявии бо гилл алоқаманд барои ҳарду намуди мидия якхела буд (расми S4, Маълумоти иловагӣ).Ин шабоҳати ду мидия аз ҷиҳати генетикӣ фарқкунанда метавонад таркиби ҷамоаҳои бактериявиро дар конҳои сард, сулфур ва вулқонии Кергулен инъикос кунад [55, 56, 57, 58].Сатҳи баланди микроорганизмҳои коҳишдиҳандаи сулфур ҳангоми ҷамъоварии мидия аз минтақаҳои соҳилии биотурбатшуда [59], ба монанди соҳили Порт-о-Франс, хуб тавсиф шудааст.Имконияти дигар ин аст, ки ба флораи мушакҳо метавонад тавассути интиқоли уфуқӣ таъсир расонад [60, 61].Барои муайян кардани таносуби байни мухити бахр, сатхи таги бахр ва таркиби бактерияхои симбиотики дар мидия тадкикоти бештар лозим аст.Айни замон ин тадқиқотҳо идома доранд.
Дарозӣ ва консентратсияи гемолимфӣ ccfDNA, осонии тозакунии он ва сифати баланд барои имкон додани пайдарпайии босуръати тирандозӣ баъзе аз бартариҳои зиёди истифодаи ccfDNA mussel барои арзёбии гуногунии биологӣ дар экосистемаҳои соҳилии баҳр мебошанд.Ин равиш махсусан барои тавсифи ҷамоаҳои вирусӣ (виромҳо) дар экосистемаи додашуда самаранок аст [62, 63].Баръакси бактерияҳо, археяҳо ва эукариотҳо, геномҳои вирусӣ генҳои аз ҷиҳати филогенетикӣ ҳифзшуда, ба монанди пайдарпаии 16S надоранд.Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки биопсияҳои моеъ аз намудҳои индикатор ба монанди мидия метавонанд барои муайян кардани миқдори нисбатан зиёди порчаҳои вируси ccfDNA истифода шаванд, ки ба ҳостҳое, ки одатан дар экосистемаҳои баҳрии соҳилӣ зиндагӣ мекунанд, маълуманд.Ба ин вирусҳое дохил мешаванд, ки ба протозоаҳо, буғумҳо, ҳашаротҳо, растаниҳо ва вирусҳои бактериявӣ (масалан, бактериофагҳо) сироят мекунанд.Вақте ки мо вируси гемолимфии ccfDNA-и мидияҳои кабуд (M. platensis) дар ҳамон қабати мидия дар Кергулен ҷамъ овардашударо тафтиш кардем, тақсимоти шабеҳ пайдо шуд (Ҷадвали S2, Маълумоти иловагӣ).Пайдарпаии тирандозии ccfDNA дар ҳақиқат як равиши навест, ки дар омӯзиши вируси одамон ё дигар намудҳо суръат мегирад [21, 37, 64].Ин равиш махсусан барои омӯзиши вирусҳои ДНК-и дуқабата муфид аст, зеро дар байни ҳама вирусҳои ДНК-и дуқатор ягон гени ягона нигоҳ дошта намешавад, ки синфи гуногунтарин ва васеътарини вирусҳоро дар Балтимор намояндагӣ мекунад [65].Гарчанде ки аксари ин вирусҳо таснифнашуда боқӣ мемонанд ва метавонанд вирусҳои як қисми комилан номаълуми олами вирусиро дар бар гиранд [66], мо дарёфтем, ки вирусҳо ва қаторҳои мизбони мидияҳои A. atra ва M. platensis дар байни ин ду намуд ҷойгиранд.ҳамин тавр (ниг. расми S3, маълумоти иловагӣ).Ин монандӣ тааҷҷубовар нест, зеро он метавонад набудани интихобӣ дар қабули ДНК-и дар муҳити атроф мавҷудбударо инъикос кунад.Тадқиқотҳои оянда бо истифода аз РНК-и тозашуда дар айни замон барои тавсифи вируси РНК лозиманд.
Дар омӯзиши мо, мо як лӯлаи хеле сахтгиреро истифода бурдем, ки аз кори Коварски ва ҳамкасбон мутобиқ карда шудааст [37], ки онҳо ду марҳилаи ҳазфи хонишҳои ҷамъшуда ва контигҳоро пеш аз ва баъд аз монтажи ccfDNA-и модарӣ истифода бурданд, ки дар натиҷа таносуби баланди хондани хаританашуда ба вуҷуд омад.Аз ин рӯ, мо наметавонем истисно кунем, ки баъзе аз ин хондани хаританашуда то ҳол пайдоиши худро доранд, пеш аз ҳама, зеро мо геноми истинод барои ин навъи мидия надорем.Мо инчунин ин лӯларо истифода бурдем, зеро мо дар бораи химераҳо байни хондани худ ва ғайримустақим ва дарозии хониши аз ҷониби Illumina MiSeq PE75 тавлидшуда нигарон будем.Сабаби дигари аксари хонишҳои ношинос дар он аст, ки аксари микробҳои баҳрӣ, махсусан дар минтақаҳои дурдаст, ба монанди Кергулен, шарҳ дода нашудаанд.Мо Illumina MiSeq PE75-ро истифода бурдем, бо назардошти дарозии порчаи ccfDNA ба ccfDNA-и инсон монанд.Барои таҳқиқоти оянда, бо назардошти натиҷаҳои мо, ки нишон медиҳанд, ки гемолимфӣ ccfDNA нисбат ба одамон ва/ё ширхӯрон хондани дарозтар дорад, мо тавсия медиҳем, ки платформаи пайдарпай барои порчаҳои дарозтари ccfDNA мувофиқтар истифода барем.Ин амалия муайян кардани нишондодҳои бештарро барои таҳлили амиқтар осонтар мекунад.Гирифтани пайдарпаии пурраи геномҳои ҳастаии A. atra, ки ҳоло дастрас нест, инчунин ба табъизи ccfDNA аз манбаъҳои худ ва ғайрихудӣ мусоидат мекунад.Бо назардошти он, ки тадкикоти мо ба имкони-яти татбик намудани концепцияи биопсияи моеъ ба мидия нигаронида шудааст, мо умедворем, ки азбаски ин концепция дар тадкикоти оянда истифода мешавад, барои зиёд кардани иктидори ин усул барои омухтани гуногунии микробхои мидия асбобхо ва трубопроводхои нав кор карда мешаванд.экосистемаи баҳрӣ.
Ҳамчун биомаркери клиникии ғайриинвазивӣ, сатҳи баланди плазмаи ccfDNA инсон бо бемориҳои гуногун, осеби бофтаҳо ва шароити стресс алоқаманд аст [67,68,69].Ин афзоиш бо баровардани пораҳои ДНК-и пайдоиши худ пас аз осеби бофта алоқаманд аст.Мо ин масъаларо бо истифода аз фишори шадиди гармӣ ҳал кардем, ки дар он мидияҳо ба ҳарорати 30 °C кӯтоҳ дучор шуданд.Мо ин таҳлилро дар се намуди гуногуни мидия дар се таҷрибаи мустақил анҷом додем.Бо вуҷуди ин, мо пас аз фишори гармии шадид дар сатҳи ccfDNA ягон тағирот пайдо накардем (ниг. Расми S5, маълумоти иловагӣ).Ин кашфиёт метавонад ҳадди ақалл қисман далели онро фаҳмонад, ки мидияҳо системаи гардиши нимкушода доранд ва аз ҳисоби фаъолияти баланди филтркунии худ миқдори зиёди ДНК-и хориҷиро ҷамъ мекунанд.Аз тарафи дигар, мидияҳо, ба монанди бисёре аз ҳайвоноти сутунмӯҳрана, метавонанд ба осеби бофтаи аз стресс тобовартар бошанд ва ба ин васила озодшавии ccfDNA-ро дар гемолимфаҳои худ маҳдуд кунанд [70, 71].
То имрӯз, таҳлили ДНК-и гуногунии биологӣ дар экосистемаҳои обӣ асосан ба метабаркодкунии ДНК-и экологӣ (eDNA) тамаркуз кардааст.Аммо, ин усул одатан ҳангоми таҳлили гуногунии биологӣ ҳангоми истифодаи праймерҳо маҳдуд аст.Истифодаи пайдарпаии таппонча маҳдудиятҳои PCR ва интихоби ғаразноки маҷмӯаҳои праймерро рад мекунад.Ҳамин тариқ, ба маънои муайян, усули мо ба усули пайдарпайии сердаромади eDNA Shotgun, ки ба наздикӣ истифода шудааст, наздиктар аст, ки қодир аст мустақиман ДНК-и пора-пораҳоро пайдарпай кунад ва тақрибан ҳамаи организмҳоро таҳлил кунад [72, 73].Бо вуҷуди ин, як қатор масъалаҳои бунёдӣ мавҷуданд, ки LB-ро аз усулҳои стандартии eDNA фарқ мекунанд.Албатта, фарқи асосии байни eDNA ва LB истифодаи мизбони филтри табиӣ мебошад.Истифодаи навъҳои баҳрӣ ба монанди исфанҷҳо ва дупаҳлӯҳо (Dresseina spp.) ҳамчун филтри табиӣ барои омӯзиши eDNA гузориш дода шудааст [74, 75].Бо вуҷуди ин, тадқиқоти Драйсена биопсияҳои бофтаро истифода бурд, ки аз он ДНК гирифта шудааст.Таҳлили ccfDNA аз LB биопсияи матоъ, таҷҳизоти махсус ва баъзан гаронбаҳо ва логистикаи марбут ба eDNA ё биопсияи матоъро талаб намекунад.Дарвоқеъ, мо ба наздикӣ гузориш дода будем, ки ccfDNA аз LB метавонад бо дастгирии FTA бидуни нигоҳ доштани занҷири сард нигоҳ дошта шавад ва таҳлил карда шавад, ки ин як мушкилоти асосӣ барои тадқиқот дар минтақаҳои дурдаст аст [76].Истихроҷи ccfDNA аз биопсияҳои моеъ низ оддӣ аст ва ДНК-и баландсифатро барои пайдарпайии таппонча ва таҳлили PCR таъмин мекунад.Ин як бартарии бузург бо назардошти баъзе маҳдудиятҳои техникии марбут ба таҳлили eDNA аст [77].Содда ва арзиши пасти усули интихоб низ махсусан барои барномаҳои мониторинги дарозмуддат мувофиқ аст.Ба ѓайр аз ќобилияти баланди филтркунии онњо, боз як хусусияти маъруфи дупахлї таркиби кимиёвии мукополисахариди луоби онњо мебошад, ки ба азхудкунии вирусњо мусоидат мекунад [78, 79].Ин дупахҳоро як филтри табиии беҳтарин барои тавсифи гуногунии биологӣ ва таъсири тағирёбии иқлим дар экосистемаи обӣ месозад.Гарчанде ки мавҷудияти пораҳои ДНК-и аз ҷониби мизбон гирифташуда ҳамчун маҳдудияти усул дар муқоиса бо eDNA баррасӣ карда мешавад, хароҷоти марбут ба доштани чунин ccfDNA-и ватанӣ дар муқоиса бо eDNA ҳамзамон барои миқдори зиёди иттилооте, ки барои омӯзиши саломатӣ дастрас аст, фаҳмо аст.мизбони офсет.Ин мавҷудияти пайдарпаии вирусиро дар бар мегирад, ки ба геноми мизбон дохил карда шудаанд.Ин махсусан барои мидияҳо муҳим аст, бо назардошти мавҷудияти ретровирусҳои лейкемии ба таври уфуқӣ гузаранда дар дупаҳлӯҳо [80, 81].Бартарии дигари LB нисбат ба eDNA дар он аст, ки он аз фаъолияти фагоситикии ҳуҷайраҳои гардиши хун дар гемолимфа истифода мебарад, ки микроорганизмҳоро (ва геномҳои онҳоро) фаро мегирад.Фагоцитоз вазифаи асосии ҳуҷайраҳои хун дар дупаҳлҳо мебошад [82].Ниҳоят, усул аз қобилияти баланди филтркунии мидия (ба ҳисоби миёна 1,5 л/соат оби баҳр) ва гардиши дурӯза истифода мебарад, ки омехташавии қабатҳои гуногуни оби баҳрро зиёд мекунанд ва имкон медиҳанд, ки eDNA-и гетерологӣ гирифта шаванд.[83, 84].Ҳамин тариқ, таҳлили ccfDNA мидия як роҳи ҷолибест, ки бо назардошти таъсири ғизоӣ, иқтисодӣ ва экологии мидияҳо.Монанди таҳлили LB аз одамон ҷамъоварӣшуда, ин усул инчунин имкони чен кардани тағироти генетикӣ ва эпигенетикиро дар ДНК-и мизбон дар посух ба моддаҳои экзогенӣ мекушояд.Масалан, технологияҳои пайдарпайии насли сеюмро метавон пешбинӣ кард, ки таҳлили метилизатсияи умуми геномро дар ccfDNA-и ватанӣ бо истифода аз пайдарпайии нанопораҳо анҷом диҳад.Ин раванд бояд аз он сабаб мусоидат кунад, ки дарозии порчаҳои ccfDNA мидия бо платформаҳои секвенцияи тӯлонӣ мутолиа карда мешавад, ки имкон медиҳад таҳлили метилизатсияи ДНК-и умуми геномро аз як секвенсияи ягона бидуни ниёз ба тағироти кимиёвӣ иҷозат диҳад.85,86] Ин як имкони ҷолиб аст, зеро нишон дода шудааст, ки аксуламали зиёди ДНК ба вокунишҳои муҳити зист ва вокунишҳои зиёди DNA-ро инъикос мекунанд.Аз ин рӯ, он метавонад дар бораи механизмҳои асосии танзимкунандаи вокуниш пас аз дучоршавӣ ба тағирёбии иқлим ё ифлоскунандаҳо фаҳмиши арзишманд диҳад [87].Бо вуҷуди ин, истифодаи LB бидуни маҳдудият нест.Бояд гуфт, ки ин мавҷудияти намудҳои индикаторро дар экосистема талаб мекунад.Тавре ки дар боло зикр гардид, истифодаи LB барои арзёбии гуногунии биологии экосистемаи додашуда инчунин лӯлаи дақиқи биоинформатикаро талаб мекунад, ки мавҷудияти пораҳои ДНК-ро аз манбаъ ба назар мегирад.Мушкилоти дигари муҳим мавҷудияти геномҳои истинод барои намудҳои баҳрӣ мебошад.Умед аст, ки ташаббусҳо ба монанди Лоиҳаи геномҳои ширхӯрони баҳрӣ ва лоиҳаи ба наздикӣ таъсисёфтаи Fish10k [88] ба чунин таҳлил дар оянда мусоидат хоҳанд кард.Татбиқи консепсияи LB ба организмҳои филтри ғизодиҳии баҳрӣ инчунин бо дастовардҳои навтарин дар технологияи пайдарпайӣ мувофиқ аст ва онро барои таҳияи биомаркерҳои бисёр-ом барои пешниҳоди маълумоти муҳим дар бораи саломатии маконҳои баҳрӣ дар посух ба фишори муҳити зист мувофиқ месозад.
Маълумот дар бораи пайдарпайии геном дар бойгонии хониши NCBI Sequence https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 зери Bioprojects SRR8924808 нигоҳ дошта шудааст.
Brierley AS, Kingsford MJ Таъсири тағирёбии иқлим ба ҳаёти баҳрӣ ва экосистема.Коул биология.2009;19: P602-P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Таъсири якҷояи тағирёбии иқлим ва дигар стрессҳои маҳаллӣ ба муҳити баҳрро баррасӣ кунед.мухити умумии илмй.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Илми якуми март.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Паст шудани таҳаммулпазирии гармӣ дар шароити фишори гармии такрорӣ марги баланди тобистонаи мидияҳои кабудро шарҳ медиҳад.Ҳисоботи илмӣ 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Тағйироти охирин дар басомад, сабабҳо ва дараҷаи марги ҳайвонот.Proc Natl Acad Sci ИМА.2015; 112: 1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Якчанд микроорганизмҳои патогенӣ, ки ба намудҳо хос нестанд, метавонанд боиси марги оммавии Pinna nobilis шаванд.Ҳаёт.2020;10:238.
Брэдли M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Таъсири эҳтимолии тағирёбии иқлим ба бемориҳои зоонотикии Арктика.Int J Саломатии Circumpolar.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Мидияҳои кабуд (Mytilus edulis spp.) ҳамчун организмҳои сигналӣ дар мониторинги ифлосшавии соҳил: барраси.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Интегратсияи биопсияи моеъ дар табобати саратон.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Камолоти биопсияи моеъ: Имкон медиҳад, ки ДНК-и варам гардиш кунад.Саратон Nat Rev.2017; 17: 223–38.
Mandel P., Metais P. Кислотаҳои нуклеинӣ дар плазмаи инсон.Протоколи вохӯрии ширкатҳои фаръии Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Нақши нав барои ДНК-и бе ҳуҷайра ҳамчун аломати молекулавӣ барои табобати саратон.Миқдори таҳлили биомолярӣ.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Биопсияи моеъ ба клиника ворид мешавад - масъалаҳои татбиқ ва мушкилоти оянда.Нат Рев Клин Онкол.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ва дигарон.ДНК-и ҳомила дар плазма ва хунобаи модар мавҷуд аст.Лансет.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Омӯзиши ҷараёни ҳомиладорӣ ва мушкилоти он бо истифода аз RNA-и берун аз ҳуҷайравии гардиши хун дар хуни занон ҳангоми ҳомиладорӣ.допедиатрия.2020;8:605219.
Оллерих М, Шервуд К, Кеовн П, Шутц Е, Бек Ҷ, Стегбауэр Ҷ, ва дигарон.Биопсияи моеъ: ДНК-и аз ҳуҷайраҳои донорӣ барои ошкор кардани осебҳои аллогенӣ дар пайванди гурда истифода мешавад.Нат Рев Нефрол.2021;17:591–603.
Хуан ФК, Ло YM Навовариҳо дар ташхиси пеш аз таваллуд: пайдарпаии геноми плазмаи модарон.Анна MD.2016;67:419-32.
Гу В, Денг X, Ли М, Суку ЙД, Аревало С, Стрейк Д, ва дигарон.Муайянкунии босуръати патоген бо пайдарпаии насли ояндаи моеъҳои сироятшудаи бадан.Тибби Нат.2021;27:115-24.