Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки аз браузери навшуда истифода баред (ё ҳолати мувофиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Дар ҳамин ҳол, барои таъмини идомаи дастгирӣ, мо сайтро бидуни услуб ва JavaScript намоиш медиҳем.
Зарраҳои кремнийи рахнок бо усули сол-гел бо баъзе тағйиротҳо барои ба даст овардани зарраҳои макропороз омода карда шуданд. Ин зарраҳо бо роҳи полимеризатсияи иловагии интиқоли пораҳои фрагментатсионӣ (RAFT) бо N-фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PMI) ва стирол барои тайёр кардани фазаҳои N-фенилмалеимидҳои полимеридори (Н-фенилмалеймид) ҳосил карда шуданд. сутунҳои пӯлод (100 × 1,8 мм id) бо бастабандии slurry печонида шуданд. Ҷудокунии сутуни PMP-и омехтаи пептид, ки аз панҷ пептид иборат аст (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, en albumes chromatsinuc, digal sinuces entryographic) дар (HAS).Дар шароити оптималии elution, шумораи судї назариявии омехтаи пептид баланд аст, то 280,000 заррин / m².Муқоиса иҷрои ҷудокунии сутуни таҳия бо сутуни тиҷоратӣ Ascentis Express RP-Amide, он мушоҳида шуд, ки иҷрои ҷудокунии сутуни PMP аз сутуни тиҷоратӣ дар робита ба самаранокии resolution ҷудокунӣ бартарӣ буд.
Дар солҳои охир, саноати биофармасевтӣ ба бозори васеъшавандаи ҷаҳонӣ бо афзоиши назарраси ҳиссаи бозор табдил ёфтааст. Бо афзоиши босуръати саноати биофармасевтӣ1,2,3, таҳлили пептидҳо ва сафедаҳо хеле зарур аст. Илова ба пептидҳои мақсаднок, ҳангоми синтези пептидҳо, якчанд ифлосиҳо ба вуҷуд меоянд, бинобар ин, таҳлили хоси пептидҳои пептидӣ ва хосияти хроматификатсияро талаб мекунад. протеинҳо дар моеъҳои бадан, бофтаҳо ва ҳуҷайраҳо аз сабаби шумораи зиёди намудҳои эҳтимолан ошкоршаванда дар як намуна кори ниҳоят душвор аст. Ҳарчанд масс-спектрометрия воситаи муассир барои пайдарпайии пептидҳо ва сафедаҳо аст, агар чунин намунаҳо дар як гузариш ба масс-спектрометр ворид карда шаванд, ҷудокунӣ идеалӣ нахоҳад буд. литҳое, ки дар вақти муайян ба спектрометри масса ворид мешаванд4,5,6. Илова бар ин, ҳангоми ҷудокунии фазаи моеъ, таҳлилҳоро метавон дар минтақаҳои танг тамаркуз кард ва ба ин васила ин таҳлилҳоро тамаркуз карда, ҳассосияти муайянкунии MS-ро беҳтар гардонад. Хроматографияи моеъ (LC) дар даҳсолаи охир хеле пеш рафтааст ва ба як усули маъмул дар таҳлили протеоми табдил ёфтааст.
Хроматографияи моеъи баръакс (RP-LC) барои тоза кардан ва ҷудо кардани омехтаҳои пептидӣ бо истифода аз кремнийи октадесил (ODS) ҳамчун фазаи статсионарӣ васеъ истифода мешавад11,12,13. Бо вуҷуди ин, фазаҳои статсионарии RP ҷудошавии қаноатбахши пептидҳо ва сафедаҳоро аз сабаби табиати мураккаб ва фазавӣ14 барои сохтори махсуси фазавӣ14 таъмин намекунанд. s барои таҳлили пептидҳо ва сафедаҳо бо қисмҳои қутбӣ ва ғайриқутбӣ барои ҳамкорӣ бо ин таҳлилҳо ва нигоҳ доштани ин таҳлилҳо16.Хроматографияи омехта, ки таъсири мутақобилаи мултиподалӣ таъмин мекунад, метавонад алтернатива ба RP-LC барои ҷудо кардани пептидҳо, сафедаҳо ва дигар омехтаҳои мураккаб бошад. Фазаҳои статсионарии режими омехта (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalation қутбӣ/RPLC) аз сабаби мавҷудияти ҳам гурӯҳҳои қутбӣ ва ҳам ғайриқутбӣ22,23,24,25,26,27,28 гурӯҳҳо бо фазаҳои хуби поларӣ ҷудошаванда барои ҷудокунии пептидҳо ва сафедаҳо мувофиқанд. қувват ва интихоби беназир барои таҳлилҳои қутбӣ ва ғайриқутбӣ, зеро ҷудошавӣ аз таъсири мутақобилаи байни аналитӣ ва фазаи статсионарӣ вобаста аст.Муносибатҳои мултимодалӣ 29, 30, 31, 32. Ба наздикӣ, Чжан ва дигарон.30 як фазаи стационарии полиаминии додецил хотимаёфтаро омода кард ва карбогидридҳо, антидепрессантҳо, флавоноидҳо, нуклеозидҳо, эстрогенҳо ва якчанд дигар таҳлилҳоро бомуваффақият ҷудо кард. Интеркалатори қутбӣ ҳам гурӯҳҳои ғайриқутбӣ ва ҳам гурӯҳҳои ғайриқутбӣ дорад, аз ин рӯ онро метавон барои ҷудо кардани пептидҳо ва сафедаҳое истифода бурд, ки ҳам сутунҳои қутбӣ ва ҳам гидрофобӣ, мобидҳои гидрофобӣ доранд. Сутунҳои C18) зери номи тиҷоратии Ascentis Express RP-Amide сутунҳо дастрасанд, аммо ин сутунҳо танҳо барои таҳлили амин 33 истифода мешаванд.
Дар тадқиқоти ҷорӣ, як марҳилаи статсионарии қутбӣ дарунсохташуда (N-phenylmaleimide-embedded polystyrene) барои ҷудо кардани пептидҳо ва трипсинҳои HSA таҳия ва арзёбӣ карда шуд. Марҳилаи статсионарӣ бо истифода аз стратегияи зерин омода карда шуд. Зарраҳои кремнийи кӯза мувофиқи тартиби дар нашри қаблии мо бо таносуби протеколи PE бо баъзе модификацияҳои полиэтколи Г. ), TMOS, кислотаи сиркои об барои тайёр кардани заррачаҳои кремний бо андозаи калони сӯрохҳо танзим карда шуд. Дуюм, лиганд нав, фенилмалеймид-метил винил изоцианат, синтез карда шуд ва барои ҳосил кардани зарраҳои кремний барои тайёр кардани фазаи статсионарии қутбӣ истифода шуд. ing scheme.The бастабандии сутун аст, ки бо ларзиш механикӣ кӯмак барои таъмини як кати якхела дар дохили сутун ташкил карда мешавад. Баҳогузорӣ ҷудокунии сутуни печонидани омехтаҳои пептидҳои иборат аз панҷ пептид;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ва Trypsin digest аз альбумин хуноба инсон (HAS). Дар омехтаи пептидӣ ва трипсин ҳазм аз HSA мушоҳида карда шуданд, ки бо ҳалли хуб ва самаранокии сутуни дар муқоиса бо иҷрои сутуни Express.The экспресс-A ҷудо карда шуд. Ҳам пептидҳо ва ҳам сафедаҳо дар сутуни PMP, ки аз сутуни Ascentis Express RP-Amide самараноктар буданд, хуб ҳал ва самаранок буданд.
PEG (полиэтиленгликол), мочевина, кислотаи уксусӣ, триметокси ортосиликат (TMOS), триметил хлорсилан (TMCS), трипсин, альбуми хунобаи инсон (HSA), хлориди аммоний, мочевина, гексан метилдисилазан (HMDS), метакрил (HMDS) Benzoyl Peroxide (BPO), HPLC Grade Acetonitrile (ACN), Метанол, 2-Пропанол ва Ацетон аз Sigma-Oldrich (Сент-Луис, МО, ИМА) харида шудаанд.
Омехтаи мочевина (8 г), полиэтиленгликол (8 г) ва 8 мл кислотаи 0,01 Н сирко барои 10 дақиқа омехта карда шуд ва сипас ба он 24 мл TMOS дар шароити яхбаста илова карда шуд. Омехтаи реаксия дар 40 ° C барои 6 соат гарм карда шуд ва сипас дар ҳарорати 128 ° C дар ҳарорати бе об гарм карда шуд. маводи боқимонда дар 70 ° C барои 12 соат хушк карда шуд. Массаи мулоими хушкшуда дар як танӯр хоки ҳамвор ва дар 550 ° C барои 12 соат калсина карда шуд.
Бо тағир додани сатҳи зарраҳои кремний бо лигандҳои қаблан синтезшудаи фенилмалеймид-метилвинилизоцианат (PCMP) ва пас аз полимеризатсияи радиалӣ бо стирол, пайвастагии қутбӣ дорои гурӯҳи қутбӣ омода карда шуд.Марҳилаи статсионарӣ барои агрегатҳо ва занҷирҳои полистирол. Раванди омодагӣ дар зер тавсиф карда мешавад.
N-фенилмалеймид (200 мг) ва изоцианати метилвинил (100 мг) дар толуол хушк гудохта шуда, 0,1 мл 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN) ба колба реаксия илова карда шуд, то омехтаи фенилмалеймид-метил винилполианат дар ҳарорати гармии CP30C гарм карда шуд. соат, филтр карда, дар танӯр дар 40°С барои 3 соат хушк карда мешавад.
Зарраҳои кремнийи хушк (2 г) дар толуолҳои хушк (100 мл) пароканда карда шуданд ва дар колбачаи мудаввари поёни 500 мл барои 10 дақиқа садо доданд. PMCP (10 мг) дар толуол гудохта шуд ва қатра ба колбаи реаксия тавассути як воҳиди афтанда илова карда шуд. Омехта дар давоми соат филтр карда шуд ва филтр карда шуд. дар 60°C барои 3 соат. Сипас, зарраҳои кремнийи бо PMCP пайвастшуда (100 г) дар толуол (200 мл) гудохта шуданд ва 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) дар ҳузури 100 мкл дибутилтин дилаурат ҳамчун катализатор илова карда шуд. Омехта дар давоми 5 ° C филтр карда шуд. 3 соат.
Стирол (1 мл), бензоил пероксиди BPO (0,5 мл) ва зарраҳои кремнийи ба TEMPO-PMCP пайвастшуда (1,5 г) дар толуол пароканда карда шуданд ва бо нитроген тоза карда шуданд. Полимеризатсияи стирол дар 100 ° C барои 12 соат гузаронида шуд. Маҳсулоти натиҷа дар тамоми шабонарӯз шуста шуд. ман дар расми 1 нишон дода шудааст.
Намунаҳо дар 393 К барои 1 соат барои ба даст овардани фишори боқимондаи камтар аз 10-3 Torr.The миқдори N2 adsorbed дар фишори нисбии P/P0 = 0,99 барои муайян кардани ҳаҷми умумии pore истифода бурда шуд.The морфологияи луч ва ligand-bonded заррачаҳои кремний истифода бурда шуд, бо microologica Tech Ҷопон тафтиш карда шуд. намунаҳои ried (силикати луч ва зарраҳои кремний-ligand-bonded) дар як сутуни алюминий бо истифода аз навори карбон илтиёмї ҷойгир карда шуданд. Тилло дар бораи намунаҳо бо истифода аз coater sputter Q150T plated шуд, ва қабати 5 nm Au оид ба samples.This супорида шуд. Ин самаранокии равандро бо истифода аз шиддати паст беҳтар мекунад ва таъмин sputteral USA, Flashe grainham. Барои таҳлили элементҳо 1112 анализатори элементалӣ истифода шуд. Барои ба даст овардани тақсимоти андозаи зарраҳо як анализатори андозаи заррачаҳои Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 истифода шуд. Заррачаҳои бараҳна ва зарраҳои кремнийи лигандӣ (ҳар кадоме 5 мг) дар 5 мл изопропанол тақсим карда шуда, барои опропанол миниксикӣ, безараргардонӣ карда шуданд. аз Mastersizer.Таҳлили термогравиметрӣ бо суръати 5 °C дар як дақиқа дар доираи ҳарорати аз 30 то 800 °C анҷом дода шуд.
Сутунҳои танги аз пӯлоди зангногир бо шишагини андозааш (100 × 1,8 мм id) бо усули бастабандии slurry бо истифода аз ҳамон тартиби дар Ref.31.Сутуни аз пӯлоди зангногир (шишаканӣ, 100 × 1,8 мм id) бо васлаки дорои фрити 1 мкм ба пакери slurry (Alltech Deerfield, IL, ИМА) пайваст карда шуд. Бо таваққуфи 150 мг сутуни нигоҳдории статсионарӣ, ки дар он мефиристед. ҳамчун ҳалкунандаи slurry ва инчунин ҳалкунанда propelling. Сутунро пайдарпай бо фишори 100 МП дар давоми 10 дақиқа, 80 МП барои 15 дақиқа ва 60 МП барои 30 дақиқа пур кунед. Ҳангоми бастабандӣ, ларзиши механикӣ бо ду ларзиши сутуни GC (Alltech, Deerfield, USA) барои озод кардани сутуни якхела ва бастабандии сутунҳо истифода шуд. фишорро оҳиста оҳиста пахш кунед, то ҳар гуна осеби дохили сутунро пешгирӣ кунад. Сутунро аз агрегати бастабандии slurry ҷудо кунед ва арматураи дигарро ба даромадгоҳ ва системаи LC пайваст кунед, то кори онро тафтиш кунед.
Насоси LC (10AD Shimadzu, Ҷопон), инжектор (Valco (ИМА) C14 W.05) бо ҳалқаи сӯзандоруи 50nL, дегазатори мембрана (Shimadzu DGU-14A), равзанаи капиллярии UV-VIS детектори махсуси дастгоҳи μLC (UV-2075) сохта шудааст ва таъсири микроэлементҳои шишагини изофиро кам мекунад. Пас аз бастабандӣ капиллярҳо (50 μm id 365 ва капиллярҳои камшавии иттифоқӣ (50 мкм) дар баромади 1/16" иттиҳодияи коҳишдиҳанда насб карда шуданд. Ҷамъоварии маълумот ва коркарди хроматографӣ бо истифода аз нармафзори Multichro 2000 анҷом дода шуд. Мониторинг дар 254 μм id 365 маълумотҳои азхудкунии Chromatographic таҳлил карда шуд. (Нортгемптон, MA).
Альбумин аз хунобаи инсон, хокаи лиофилизатсияшуда, ≥ 96% (электрофорези агароз гели) 3 мг омехта бо трипсин (1,5 мг), 4,0 М мочевина (1 мл) ва 0,2 М аммоний бикарбонати (1 мл). Маҳлул барои 10 дақиқа омехта карда шуд ва баъд дар ваннаи кв36 м об нигоҳ дошта шуд. 0,1% TFA. Маҳлулро филтр кунед ва дар ҳарорати зери 4 °C нигоҳ доред.
Ҷудокунии омехтаҳои пептидӣ ва ҳазми трипсинҳои HSA дар сутунҳои PMP алоҳида арзёбӣ карда шуданд. Ҷудокунии омехтаи пептидҳо ва дайджести трипсинҳои HSA-ро аз ҷониби сутуни PMP тафтиш кунед ва натиҷаҳоро бо сутуни Ascentis Express RP-Amide муқоиса кунед. Рақами таблиғи назариявӣ ба таври зерин ҳисоб карда мешавад:
Тасвирҳои SEM аз зарраҳои кремнийи бараҳна ва зарраҳои кремнийи бо лиганд пайвастшуда дар расми нишон дода шудаанд.2 .Тасвирҳои SEM заррачаҳои кремнийи бараҳна (A, B) нишон медиҳанд, ки дар муқоиса бо таҳқиқоти қаблии мо, ин зарраҳо курашакл мебошанд, ки дар онҳо зарраҳо дароз карда шудаанд ё симметрияи номунтазам доранд. Сатҳи зарраҳои кремнийи бо лиганд пайвастшуда (C, D) ҳамвортар аст. зарраҳои ca.
Тасвирҳои сканкунии микроскопи электронии зарраҳои кремнийи бараҳна (A, B) ва зарраҳои кремнийи бо лиганд пайвастшуда (C, D).
Дар тақсимоти андозаи зарраҳои заррачаҳои кремний луч ва заррачаҳои кремний-ligand-bonded дар расми 3 (A) нишон дода шудааст. Каҷҳои тақсимоти андозаи зарраҳо дар асоси ҳаҷми зарраҳо нишон дод, ки андозаи зарраҳои кремний пас аз тағйири кимиёвӣ зиёд (расми. 3A). Маълумоти тақсимоти андозаи зарраҳои зарраҳои кремний аз омӯзиши ҷорӣ ва ҳаҷми пештара дар муқоиса бо андозаи заррачаҳои силикӣ дар муқоиса (1) мебошанд. PMP 3,36 мкм аст, дар муқоиса бо таҳқиқоти қаблии мо бо арзиши ad(0,5) 3,05 мкм (заррачаҳои кремнийи бо полистирол басташуда)34. Ин партия дар муқоиса бо таҳқиқоти қаблии мо аз сабаби таносуби мухталифи PEG, мочевина, TMOS ва кислотаи сиркоӣ тақсимоти андозаи зарраҳои тангтар дошт. марҳилаи заррачаҳои кремний, ки мо қаблан омӯхта будем.Ин маънои онро дорад, ки функсионализатсияи сатҳи зарраҳои кремний бо стирол танҳо як қабати полистиролро (0,97 микрон) дар сатҳи кремний ҷойгир кардааст, дар ҳоле ки дар марҳилаи PMP ғафсии қабат 1,38 микрон буд.
Тақсимоти андозаи зарраҳо (A) ва тақсимоти андозаи сӯрохҳо (B) зарраҳои кремнийи бараҳна ва зарраҳои кремнийи бо лиганд алоқаманд.
Андозаи сӯрохҳо, ҳаҷми сӯрохҳо ва майдони сатҳи зарраҳои кремнийи таҳқиқоти ҷорӣ дар ҷадвали 1(B) оварда шудаанд. Профилҳои PSD заррачаҳои кремнийи бараҳна ва зарраҳои кремнийи лигандӣ дар расми 3(B) нишон дода шудаанд. Натиҷаҳо бо таҳқиқоти қаблии мо муқоиса карда мешаванд. андозаи сӯрохҳо пас аз тағир додани кимиёвӣ, тавре ки дар ҷадвали 1(B) нишон дода шудааст, 69 кам мешавад ва тағирёбии хат дар расми 3(B) нишон дода шудааст. Ба ҳамин монанд, ҳаҷми сӯрохи зарраҳои кремний пас аз тағирёбии кимиёвӣ аз 0,67 то 0,58 см3/г кам шуд. (124 м2/г). Тавре ки дар ҷадвали 1(Б) нишон дода шудааст, пас аз тағир додани кимиёвӣ масоҳати сатҳи (м2/г) заррачаҳои кремний низ аз 116 м2/г то 105 м2/г кам шуд.
Натиљаи тањлили элементарии фазаи статсионарї дар љадвали 2 нишон дода шудааст. Сарбории карбон дар фазаи стационарии љорї 6,35% -ро ташкил медињад, ки нисбат ба боркунии карбонии тањќиќоти пештараи мо камтар аст (заррањои силикати полистирол, мутаносибан 7,93%35 ва 10,21%) стирол, баъзе лигандҳои қутбӣ, аз қабили фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PCMP) ва 4-гидрокси-ТЕМПО истифода шуданд. Вазни нитроген дар марҳилаи ҳозираи статсионарӣ 2,21% аст, дар муқоиса бо 0,1735 ва 0,85% вазни нитроген дар таҳқиқоти қаблӣ, нисбат ба статсионарии он нисбат ба фаза нисбат ба фаза баландтар аст. phenylmaleimide.Ба ҳамин монанд, боркунии карбон аз маҳсулоти (4) ва (5) мутаносибан 2,7% ва 2,9% буд, дар ҳоле ки боркунии карбон аз маҳсулоти ниҳоӣ (6) 6,35% буд, тавре ки дар ҷадвали 2. талафоти вазн бо марҳилаи статсионарии PMP санҷида шуд, ва каҷи TGA дар мувофиқати TGA мувофиқи вазни TGA хуб аст, ки дар расми 6 нишон дода шудааст. боркунии карбон (6,35%), зеро лигандҳо на танҳо C, балки N, O ва H низ доранд.
Лиганди фенилмалеймид-метилвинилизоцианат барои тағир додани сатҳи зарраҳои кремний интихоб карда шуд, зеро он дорои гурӯҳҳои қутбӣ фенилмалеймид ва гурӯҳҳои винилизоцианат мебошад. Гурӯҳҳои изоцианати винил минбаъд бо стирол тавассути полимеризатсияи радикалии зинда реаксия карда метавонанд. фаза, азбаски қисми фенилмалеймид дар рН муқаррарӣ заряди виртуалӣ надорад. Қутбияти фазаи стационариро метавон бо миқдори оптималии стирол ва вақти реаксияи полимеризатсияи радикалҳои озод назорат кард. Қадами охирини реаксия (полимеризатсияи радикалии озод) муҳим аст ва метавонад қутбияти марҳилаи статсионериро тағир диҳад. вақти реаксия боркунии карбонро ба фазаи статсионарӣ зиёд кард ва баръакс. SP-ҳои бо консентратсияи гуногуни стирол омодашуда борҳои гуногуни карбон доранд. Боз, ин фазаҳои статсионариро ба сутунҳои аз пӯлоди зангногир бор кунед ва иҷрои хроматографии онҳоро тафтиш кунед (интихобӣ, ҳалкунанда, арзиши N ва ғ.). Дар асоси ин таҷрибаҳо, як формулаи статсионарӣ барои омода кардани фазаи хуби назоратӣ ба таври оптимизатсияшуда барои таъмин намудани формулаи статсионарӣ ба таври оптимизатсияшуда интихоб карда шуд.
Панҷ омехтаи пептидӣ (Гли-Тир, Гли-Лю-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, лейцин энкефалин) инчунин бо истифода аз сутуни PMP бо истифода аз марҳилаи мобилӣ арзёбӣ карда шуданд;60/40 (v/v) ацетонитрил/об (0,1% TFA) бо суръати ҷараёни 80 мкЛ/дақ. Дар шароити оптималии элюсия рақами таблиғи назариявӣ (N) дар як сутун (100 × 1,8 мм id) 20,000 ± 100 (200,000 ± 100) аст (200,000 ± 1,8 мм) арзиши се сутуни P/m²T-ро медиҳад. роматограммаҳо дар расми 5А нишон дода шудаанд. Таҳлили зуд дар сутуни PMP бо суръати баланд (700 мкЛ/дақ), панҷ пептидҳо дар давоми як дақиқа элюта карда шуданд, N арзишҳои хеле хуб буданд, 13,500 ± 330 дар як сутун (100 × 1,8 мм id), ба 135,000 мм сутун мувофиқат мекунанд. 00 × 1,8 мм id) бо се лотҳои гуногуни марҳилаи статсионарии PMP барои санҷиши такрорӣ пур карда шуданд. Консентратсияи таҳлилшаванда барои ҳар як сутун бо истифода аз шароити оптималии элюсия ва шумораи плитаҳои назариявӣ N ва вақти нигоҳдорӣ барои ҷудо кардани ҳамон омехтаи санҷишӣ дар ҳар як сутун сабт карда шуд. Маълумоти такрорӣ барои сутунҳои PMP дар ҷадвал нишон дода шудааст, ки корпоратсияҳои PMP дар ҷадвали 4 нишон дода шудаанд. Ҷадвали 3.
Ҷудокунии омехтаи пептидӣ дар сутуни PMP (B) ва сутуни Ascentis Express RP-Amide (A);марҳилаи мобилӣ 60/40 ACN / H2O (TFA 0,1%), андозаҳои сутуни PMP (100 × 1,8 мм id);Таҳлилӣ Тартиби элюсияи пайвастагиҳо: 1 (Гли-Тир), 2 (Гли-Лю-Тир), 3 (Гли-Гли-Тир-Арг), 4 (Тир-Иле-Гли-Сер-Арг) ва 5 (лейцин) кислотаи энкефалин)).
Сутуни PMP (100 × 1,8 мм id) барои ҷудо кардани ҳазмҳои триптии альбумини хунобаи инсон дар хроматографияи моеъи баланд арзёбӣ шуд. Хроматограмма дар расми 6 нишон медиҳад, ки намуна хуб ҷудо карда шудааст ва ҳалли хеле хуб аст. Диҷестҳои HSA бо истифода аз суръати ҷараёни 100 μL/FAA30/дақ, фазаи мобилӣ таҳлил карда шуданд. .Чунон ки дар хроматограмма нишон дода шудааст (Расми 6), ҳозимаи HSA ба 17 қуллаи мувофиқ ба 17 пептидҳо тақсим шудааст. Самаранокии ҷудошавии ҳар як қулла дар дайджести HSA ҳисоб карда шуд ва арзишҳо дар ҷадвали 5 оварда шудаанд.
Ҳаҷми триптии HSA (100 × 1,8 мм id) дар сутуни PMP ҷудо карда шуд;суръати ҷараён (100 мкЛ/дақ), марҳилаи мобилӣ 60/40 ацетонитрил/об бо 0,1% TFA.
ки дар он L дарозии сутун аст, η часпакии марҳилаи мобилӣ, ΔP фишори бозгашти сутун ва u суръати хаттии марҳилаи мобилӣ мебошад. Гузаришпазирии сутуни PMP 2,5 × 10-14 м2, суръати ҷараён 25 мкЛ/дақ ва 60/40 в/в/қобилияти об барои ҳар як сутуни P18 мм истифода шудааст. id) ба тадқиқоти қаблии мо монанд буд Ref.34. Гузариши сутуне, ки бо зарраҳои сатҳи рӯякӣ печонида шудааст, ин аст: 1,7 × 10-15 барои зарраҳои 1,3 мкм, 3,1 × 10-15 барои зарраҳои 1,7 мкм, 5,2 × 10-1512 с барои заррачаҳо. Заррачаҳои 5 мкм 43. Аз ин рӯ, гузариши марҳилаи PMP ба заррачаҳои ядроии 5 мкм монанд аст.
ки дар он Wx вазни сутуни пурборшуда бо хлороформ, Wy вазни сутуни пурборшуда бо метанол ва ρ зичии ҳалкунанда мебошад. Зичии метанол (ρ = 0,7866) ва хлороформ (ρ = 1,484). Порозияи умумии сутунҳои SILICA-13018 mm. Сутунҳои 4 ва C18-Мочевина 31, ки мо қаблан омӯхта будем, мутаносибан 0,63 ва 0,55 буданд. Ин маънои онро дорад, ки мавҷудияти лигандҳои мочевина гузариши марҳилаи статсионариро коҳиш медиҳад. Аз тарафи дигар, порозиягии умумии сутуни PMP (100 × 1,8 мм) нисбат ба сутуни C6 0 мм камтар аст. -заррачаҳои кремнийи пайвастшуда, зеро дар фазаҳои стационарии навъи C18 лигандҳои C18 ба заррачаҳои кремний ҳамчун занҷирҳои хаттӣ пайваст мешаванд, дар ҳоле ки дар фазаҳои стационарии типи полистирол дар атрофи он қабати нисбатан ғафси полимерӣ ба вуҷуд меояд. Дар як таҷрибаи маъмулӣ қаъри сутун чунин ҳисоб карда мешавад:
Дар расми 7А, В сутуни PMP (100 × 1,8 мм id) ва сутуни Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм id) бо истифода аз шароити якхела (яъне, 60/40 ACN/H2O ва 0,1% TFA) нишон дода шудаанд.) участкаи Ван Димтер.Омехтаҳои пептидии интихобшуда (Гли-Тир, Гли-Лю-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, Лейцин Энкефалин) дар 20 мкл омода карда шуданд/ Меъёри ҳадди ақали ҷараёни ҳарду сутун 800 мкЛ/дақ аст. аст, ки сутуни Express RP-Amide мутаносибан 2,6 мкм ва 3,9 мкм буд. Қиматҳои HETP нишон медиҳанд, ки самаранокии ҷудокунии сутуни PMP (100 × 1,8 мм id) нисбат ба сутуни дар тиҷоратӣ дастрас Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм id) хеле беҳтар аст (100 × 1,8 мм идентификатсия, ки қимати van DeemA бо афзоиши N.7 нишон медиҳад). дар муқоиса бо таҳқиқоти қаблии мо назаррас нест. Самаранокии баландтари ҷудокунии сутуни PMP (100 × 1,8 мм id) дар муқоиса бо сутуни Ascentis Express RP-Amide ба такмил додани шакли заррачаҳо, андоза ва расмиёти мураккаби бастабандии сутунҳо, ки дар кори ҷорӣ истифода мешаванд34 асос ёфтааст.
(A) нақшаи ван Димтер (HETP ба муқобили суръати хатии марҳилаи мобилӣ) бо истифода аз сутуни PMP (100 × 1,8 мм id) дар 60/40 ACN/H2O бо 0,1% TFA.(B) ван Димтер (HETP дар муқоиса бо суръати хатти фазаи мобилӣ) бо истифода аз сутуни RP-1018 дар мм-018 ба даст оварда шудааст. 0/40 ACN / H2O бо 0,1% TFA.
Фазаи статсионарии полистироли қутбӣ барои ҷудо кардани омехтаҳои пептидҳои синтетикӣ ва ҳазми трипсинҳои альбумин хунобаи инсон (HAS) дар хроматографияи моеъи баланд омода ва арзёбӣ карда шуд. Иҷрои хроматографии сутунҳои PMP барои омехтаҳои пептидӣ дар самаранокии ҷудокунӣ ва ҳалли аъло аст. зарраҳои ca, синтези назоратшавандаи марҳилаи статсионарӣ ва бастабандии мураккаби сутун. Илова ба самаранокии баланди ҷудокунӣ, фишори пасти бозгашти сутун бо суръати баланд бартарии дигари ин марҳилаи статсионарӣ мебошад. Сутунҳои PMP такроршавандагии хуб нишон медиҳанд ва метавонанд барои таҳлили омехтаҳои пептидҳо ва ҳазми трипсинҳои сафедаҳои гуногун истифода шаванд. Дар оянда сутунҳои PMP инчунин барои ҷудо кардани сафедаҳо ва антителоҳои моноклоналӣ арзёбӣ карда мешаванд.
Филд, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Тадқиқот оид ба системаҳои ҷудокунии пептидҳо тавассути хроматографияи баръакси марҳилаи I Қисми I: Таҳияи Протоколи тавсифи сутунҳо.Хроматография.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б.
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Пептидҳои терапевтии синтетикӣ: илм ва бозор. кашфи маводи мухаддир.15 (1-2) имрӯз, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.200.
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Хроматография.A 1261, 78–90 (2012).
Лю, В. ва дигарон. Хроматография-масс-спектрометрияи моеъи пешрафта имкон медиҳад, ки метаболомика ва протеомикаҳои ба таври васеъ мақсаднок ворид карда шаванд.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Нақши UHPLC дар рушди маводи мухаддир.J.Сентябри Sci.30 (8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Ҷанбаҳои бунёдӣ ва амалии хроматографияи моеъи фишори ултрабаланд барои separations.J.Сентябри Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelicheff, P. Татбиқи хроматографияи моеъи ултра-баланд дар рушди маводи мухаддир.J.Хроматография.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hydrogels macroporous monolithic омода аз нафт-дар-об эмульсияҳои марҳилаи дохилӣ баланд барои тоза самаранок enteroviruses.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Нақши хроматографияи моеъ дар proteomics.J.Хроматография.A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Тамоюлҳои пайдошуда дар ҷудошавии хроматографияи моеъи баръакси пептидҳо ва сафедаҳои терапевтӣ: назария ва татбиқ.J.Фарматсия.Биомедикӣ.анус.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дейли, АЕ & Геблер, ҶК Ҷудокунии дученакаи пептидҳо бо истифода аз системаи RP-RP-HPLC бо истифода аз арзишҳои гуногуни рН дар андозаҳои ҷудокунии якум ва дуюм.Сентябри Sci.28 (14), 1694-1703 (2005).
Фелетти, С. ва дигарон. Хусусиятҳои интиқоли масса ва иҷрои кинетикии сутунҳои хроматографии пуриқтидор, ки бо зарраҳои C18 зери 2 мкм пурра ва сатҳи рӯякӣ баста шудаанд, таҳқиқ карда шуданд.Сентябри Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Тамоюлҳои охирин ва мушкилоти таҳлилӣ дар ҷудокунӣ, муайянкунӣ ва тасдиқи пептидҳои биоактивии растанӣ.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s002168-02 (s002168-02).
Мюллер, ҶБ ва дигарон. Манзараи протеомикии салтанати ҳаёт. Табиат 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Коркарди поёнии пептидҳои терапевтӣ тавассути хроматографияи моеъи тайёрӣ. Молекула (Базел, Швейтсария) 26(15), 4688(2021).
Янг, Ю. & Генг, X. Хроматографияи омехта ва татбиқи он ба биополимерҳо.Ҷ.Хроматография.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Чжао, Г., Донг, X.-Y. & Sun, Y. Лигандҳо барои хроматографияи омехтаи сафеда: принсип, тавсиф ва тарҳрезӣ.Биотехнология.144(1), 3-11 (2009).