ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS แบบจำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้แน่ใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีรูปแบบและ JavaScript
morphogenesis ลำไส้ของมนุษย์สร้างคุณสมบัติของ crypt-villus ของ microarchitecture 3D epithelial และการจัดระเบียบเชิงพื้นที่ โครงสร้างที่เป็นเอกลักษณ์นี้จำเป็นต่อการรักษาสภาวะสมดุลในลำไส้โดยการปกป้องช่องสเต็มเซลล์ใน basal crypt จากแอนติเจนของจุลินทรีย์จากภายนอกและสารเมแทบอไลต์ของพวกมัน นอกจากนี้ villi ในลำไส้และเมือกที่หลั่งออกมานำเสนอเซลล์เยื่อบุผิวที่มีการทำงานแตกต่างกันโดยมีเกราะป้องกันบนพื้นผิวเยื่อเมือกของลำไส้ ดังนั้น การสร้างโครงสร้างเยื่อบุผิว 3 มิติขึ้นใหม่จึงมีความสำคัญต่อการสร้างแบบจำลองทางเดินอาหาร ในหลอดทดลอง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ไส้ในลำไส้ที่เลียนแบบสารอินทรีย์สามารถกระตุ้นการสร้าง morphogenesis 3 มิติที่เกิดขึ้นเองของเยื่อบุผิวในลำไส้ด้วยการทำงานทางสรีรวิทยาและชีวกลศาสตร์ที่ดีขึ้น ชิปไมโครฟลูอิดิคและในชิปไฮบริดแบบฝังตัวของ Transwell เราอธิบายวิธีการโดยละเอียดสำหรับการผลิตอุปกรณ์ การเพาะเลี้ยง Caco-2 หรือเซลล์เยื่อบุผิวออร์แกนอยด์ในลำไส้ในการตั้งค่าทั่วไป เช่นเดียวกับบนแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิก การเหนี่ยวนำของ morphogenesis 3 มิติ และลักษณะของเยื่อบุผิว 3 มิติที่จัดตั้งขึ้นโดยใช้รูปแบบการสร้างภาพหลายรูปแบบ โปรโตคอลนี้บรรลุการสร้างสถาปัตยกรรมไมโครอาร์คิเทคเจอร์ของลำไส้ที่ทำงานได้ใหม่โดยการควบคุมการไหลของของไหลข้างเคียงเป็นเวลา 5 วัน ใน vi วิธีการ tro morphogenesis ใช้ความเค้นเฉือนที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยาและการเคลื่อนที่เชิงกล และไม่จำเป็นต้องมีวิศวกรรมหรือการควบคุมเซลล์ที่ซับซ้อน ซึ่งอาจมีประสิทธิภาพดีกว่าเทคนิคอื่นๆ ที่มีอยู่ เรามองว่าโปรโตคอลที่เราเสนออาจมีนัยยะกว้างสำหรับชุมชนการวิจัยทางชีวการแพทย์ ซึ่งเป็นวิธีการสร้างชั้นเยื่อบุผิวลำไส้ 3 มิติใหม่ ในหลอดทดลอง สำหรับการใช้งานด้านชีวการแพทย์ คลินิก และเภสัชกรรม
การทดลองแสดงให้เห็นว่าเซลล์ Caco-2 เยื่อบุผิวในลำไส้ที่เลี้ยงใน gut-on-a-chip1,2,3,4,5 หรืออุปกรณ์ microfluidic bilayer6,7 สามารถรับ morphogenesis 3 มิติที่เกิดขึ้นเองในหลอดทดลอง โดยไม่มีความเข้าใจที่ชัดเจนเกี่ยวกับกลไกพื้นฐาน ในการศึกษาล่าสุดของเรา เราพบว่าการกำจัด morphogen antagonists ที่หลั่งจาก basolaterally ออกจากอุปกรณ์เพาะเลี้ยงเป็นสิ่งจำเป็นและเพียงพอที่จะกระตุ้นให้เกิด 3D epithelial morphogenesis ในหลอดทดลอง ซึ่งแสดงให้เห็นโดย Caco-2 และอวัยวะในลำไส้ที่ได้รับจากผู้ป่วยเซลล์เยื่อบุผิวได้รับการตรวจสอบความถูกต้อง ในการศึกษานี้ เรามุ่งเน้นไปที่การผลิตเซลล์และการกระจายความเข้มข้นของ Wnt antagonist ที่มีศักยภาพ Dickkopf-1 (DKK-1) ในไส้บนชิปและอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิคที่ได้รับการดัดแปลงซึ่งมีเม็ดมีด Transwell ซึ่งเรียกว่า ” Hybrid Chip” เราแสดงให้เห็นว่าการเพิ่ม Wnt antagonists จากภายนอก (เช่น DKK-1, Wnt repressor 1, โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ frizzled ที่หลั่งออกมา 1 หรือ Soggy- 1) ไปยังลำไส้บนชิปยับยั้ง morphogenesis หรือขัดขวางชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติที่สร้างไว้ล่วงหน้า ซึ่งบ่งชี้ว่าความเครียดที่เป็นปรปักษ์กันระหว่างการเพาะเลี้ยงมีส่วนรับผิดชอบต่อ morphogenesis ของลำไส้ ในหลอดทดลอง ดังนั้นแนวทางปฏิบัติเพื่อให้บรรลุ morphogenesis ที่แข็งแกร่งที่ส่วนต่อประสานของเยื่อบุผิวคือการกำจัดหรือรักษาระดับของ Wnt antagonists ในช่อง basolateral น้อยที่สุดโดยการล้างแบบแอคทีฟ (เช่นใน gut-on-a-chi p หรือแพลตฟอร์มแบบไฮบริดบนชิป) หรือการแพร่ .Basolateral media (เช่น จาก Transwell แทรกเข้าไปในอ่างเก็บน้ำ Basolateral ขนาดใหญ่ในหลุม)
ในโปรโตคอลนี้ เรามีวิธีการโดยละเอียดสำหรับการประดิษฐ์ไมโครดีไวซ์แบบ Gut-on-a-chip และชิปไฮบริดแบบแทรกด้วย Transwell (ขั้นตอนที่ 1-5) เพื่อเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวในลำไส้บนเยื่อพรุนที่มีรูพรุนเป็นฐานของโพลีไดเมทิลไซลอกเซน (PDMS) (ขั้นตอนที่ 6A, 7A, 8, 9) หรือเยื่อโพลีเอสเตอร์ของเม็ดมีด Transwell (ขั้นตอนที่ 6B, 7B, 8, 9) และมอร์โฟเจน 3 มิติที่เหนี่ยวนำ esis ในหลอดทดลอง (ขั้นตอนที่ 10) นอกจากนี้ เรายังระบุคุณลักษณะของเซลล์และโมเลกุลที่บ่งชี้ถึงฮิสโทเจเนซิสเฉพาะเนื้อเยื่อและการสร้างความแตกต่างของเซลล์ที่ขึ้นกับเชื้อสายโดยการใช้รูปแบบการสร้างภาพหลายรูปแบบ (ขั้นตอนที่ 11-24) เรากระตุ้นการเกิด morphogenesis โดยใช้เซลล์เยื่อบุผิวในลำไส้ของมนุษย์ เช่น Caco-2 หรือออร์แกนอยด์ในลำไส้ ในสองรูปแบบการเพาะเลี้ยงพร้อมรายละเอียดทางเทคนิครวมถึงการดัดแปลงพื้นผิวของเยื่อพรุน การสร้างโมโนเลเยอร์ 2 มิติ และ ชีวเคมีในลำไส้และการสืบพันธุ์ของสภาพแวดล้อมจุลภาคทางชีวกลศาสตร์ ในหลอดทดลอง เพื่อชักนำให้เกิด morphogenesis 3 มิติจาก monolayers เยื่อบุผิว 2 มิติ เรากำจัด morphogen antagonists ในรูปแบบที่เพาะเลี้ยงทั้งสองโดยการไหลอาหารเลี้ยงเชื้อเข้าไปในช่องฐานด้านข้างของวัฒนธรรม ในที่สุด เราให้การแสดงประโยชน์ของชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติที่สร้างใหม่ได้ซึ่งสามารถใช้สร้างแบบจำลองการเจริญเติบโตของเยื่อบุผิวที่ขึ้นกับ morphogen, longit การเพาะเลี้ยงร่วมกันของโฮสต์และไมโครไบโอมที่หูด การติดเชื้อของเชื้อโรค การบาดเจ็บจากการอักเสบ ความผิดปกติของสิ่งกีดขวางเยื่อบุผิว และการบำบัดโดยใช้โปรไบโอติก Example.influences
โปรโตคอลของเราอาจเป็นประโยชน์ต่อนักวิทยาศาสตร์ในวงกว้าง (เช่น ชีววิทยาเยื่อเมือกในลำไส้ ชีววิทยาเซลล์ต้นกำเนิด และชีววิทยาพัฒนาการ) และการวิจัยประยุกต์ (เช่น การทดสอบยาพรีคลินิก การสร้างแบบจำลองโรค วิศวกรรมเนื้อเยื่อ ศึกษาพลวัตของการส่งสัญญาณของเซลล์ในระหว่างการพัฒนาของลำไส้ การสร้างใหม่ หรือสภาวะสมดุล นอกจากนี้ โปรโตคอลของเรายังมีประโยชน์สำหรับการสอบสวนการติดเชื้อภายใต้สารติดเชื้อต่างๆ เช่น Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 หรือ Vibrio choleraeการดูพยาธิสภาพของโรคและการเกิดโรคก็มีประโยชน์เช่นกัน การใช้ระบบไมโครสรีรวิทยาของลำไส้บนชิปอาจช่วยให้เกิดการเพาะเลี้ยงร่วมกันตามยาว 10 และการประเมินการป้องกันโฮสต์ การตอบสนองของภูมิคุ้มกัน และการซ่อมแซมการบาดเจ็บที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรคในระบบทางเดินอาหาร (GI) ตามมาได้ 11 ความผิดปกติทางระบบทางเดินอาหารอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับโรคลำไส้รั่ว โรค celiac โรค Crohn's ลำไส้ใหญ่อักเสบ กระเพาะอักเสบ หรืออาการลำไส้แปรปรวนสามารถจำลองได้เมื่อ 3 มิติใน ชั้นเยื่อบุผิวของลูกอัณฑะถูกเตรียมโดยใช้ชั้นเยื่อบุผิวลำไส้ 3 มิติของผู้ป่วย โรคเหล่านี้ได้แก่ การฝ่อของสัตว์ร้าย โพรงในสมองสั้นลง ความเสียหายของเยื่อเมือก หรือสิ่งกีดขวางเยื่อบุผิวที่บกพร่อง การตรวจชิ้นเนื้อหรือออร์แกนอยด์ในลำไส้ที่ได้จากสเต็มเซลล์12,13 เพื่อสร้างแบบจำลองความซับซ้อนที่สูงขึ้นของสภาพแวดล้อมของโรคได้ดียิ่งขึ้น ผู้อ่านอาจพิจารณาเพิ่มประเภทเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับโรค เช่น เซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเลือดของผู้ป่วย (PBMCs) ) ไปจนถึงโมเดลที่มีสถาปัตยกรรมไมโครอาร์คิเทคเจอร์แบบ 3D intestinal villus-cryptเซลล์ภูมิคุ้มกันเฉพาะเนื้อเยื่อ 5.
เนื่องจากโครงสร้างจุลภาคของเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติสามารถแก้ไขและมองเห็นได้โดยไม่ต้องมีกระบวนการแบ่งส่วน ผู้ชมที่ทำงานเกี่ยวกับการถอดเสียงเชิงพื้นที่และการถ่ายภาพที่มีความละเอียดสูงหรือความละเอียดสูงมากอาจสนใจการทำแผนที่การเปลี่ยนแปลงเชิงพื้นที่ของยีนและโปรตีนบนช่องเยื่อบุผิวของเราสนใจในเทคโนโลยี การตอบสนองต่อสิ่งเร้าของจุลินทรีย์หรือภูมิคุ้มกัน นอกจากนี้ ครอสทอล์คโฮสต์-ไมโครไบโอมตามยาว 10, 14 ที่ประสานสภาวะสมดุลในลำไส้สามารถสร้างขึ้นในชั้นเยื่อบุลำไส้ 3 มิติได้โดยการเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์สายพันธุ์ต่างๆ ชุมชนจุลินทรีย์ หรือจุลินทรีย์ในอุจจาระร่วมกัน โดยเฉพาะอย่างยิ่งในลำไส้บนชิปในแพลตฟอร์ม วิธีการนี้น่าสนใจเป็นพิเศษสำหรับผู้ชมที่กำลังศึกษาวิทยาภูมิคุ้มกันเยื่อเมือก ระบบทางเดินอาหาร ไมโครไบโอมของมนุษย์ วัฒนธรรม และจุลชีววิทยาทางคลินิกที่ต้องการเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์ในลำไส้ที่ไม่ได้เพาะเลี้ยงก่อนหน้านี้ในห้องปฏิบัติการ หากโปรโตคอล morphogenesis ในหลอดทดลองของเราสามารถปรับให้เข้ากับรูปแบบการเพาะเลี้ยงที่ปรับขนาดได้ เช่น การแทรกแบบหลายหลุมในเพลต 24, 96 หรือ 384 หลุมที่เติมช่องฐานด้านข้างอย่างต่อเนื่อง โปรโตคอลยังสามารถเผยแพร่ได้ d แก่ผู้ที่กำลังพัฒนาเภสัชกรรม ชีวการแพทย์ หรือแพลตฟอร์มการคัดกรองหรือการตรวจสอบปริมาณงานสูงสำหรับอุตสาหกรรมอาหาร เพื่อเป็นการพิสูจน์หลักการ เมื่อเร็ว ๆ นี้เราได้แสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของระบบ morphogenesis ปริมาณงานสูงแบบมัลติเพล็กซ์ที่สามารถปรับขนาดเป็นรูปแบบจาน 24 หลุม นอกจากนี้ ผลิตภัณฑ์ออร์แกนบนชิปหลายรายการได้รับการจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ อาจถูกนำมาใช้โดยห้องปฏิบัติการวิจัย อุตสาหกรรม หรือรัฐบาล และหน่วยงานกำกับดูแลหลายแห่ง เพื่อทำความเข้าใจการเขียนโปรแกรมซ้ำของเซลล์ของ in vitro gut morphogenesis ที่ระดับการถอดเสียงเพื่อทดสอบยาหรือชีวบำบัด
มีการใช้แบบจำลองการทดลองที่เกี่ยวข้องกับมนุษย์ในจำนวนจำกัดเพื่อศึกษาการแปรสัณฐานของเยื่อบุผิวในลำไส้ สาเหตุหลักมาจากขาดโปรโตคอลที่นำไปใช้ได้จริงเพื่อชักนำให้เกิด morphogenesis 3 มิติ ในหลอดทดลอง อันที่จริง ความรู้ส่วนใหญ่ในปัจจุบันเกี่ยวกับสัณฐานวิทยาของลำไส้มีพื้นฐานมาจากการศึกษาในสัตว์ (เช่น zebrafish20 หนู21 หรือไก่22) อย่างไรก็ตาม สิ่งเหล่านี้ใช้แรงงานและค่าใช้จ่ายสูง อาจมีข้อสงสัยทางจริยธรรม และที่สำคัญที่สุดคือ ไม่ได้กำหนดกระบวนการพัฒนาของมนุษย์อย่างแม่นยำ แบบจำลองเหล่านี้ยังมีข้อจำกัดอย่างมากในความสามารถในการทดสอบในลักษณะที่ปรับขนาดได้หลายทาง ดังนั้น โปรโตคอลของเราสำหรับการสร้างโครงสร้างเนื้อเยื่อ 3 มิติในหลอดทดลองใหม่จึงมีประสิทธิภาพดีกว่าแบบจำลองสัตว์ในสัตว์ทดลอง เช่นเดียวกับแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบ 2 มิติแบบคงที่แบบดั้งเดิมอื่นๆ ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ การใช้โครงสร้างเยื่อบุผิว 3 มิติช่วยให้เราสามารถตรวจสอบการแปลเชิงพื้นที่ของเซลล์ที่แตกต่างกันในแกน crypt-villus เพื่อตอบสนองต่อรูปแบบต่างๆ สิ่งกระตุ้นเยื่อเมือกหรือภูมิคุ้มกัน ชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติสามารถให้พื้นที่ในการศึกษาว่าเซลล์ของจุลินทรีย์แข่งขันกันอย่างไรเพื่อสร้างช่องว่างเชิงพื้นที่และวิวัฒนาการทางนิเวศวิทยาเพื่อตอบสนองต่อปัจจัยโฮสต์ (เช่น ชั้นเมือกภายในและภายนอก การหลั่งของ IgA และเปปไทด์ต้านจุลชีพ) นอกจากนี้ สัณฐานวิทยาของเยื่อบุผิว 3 มิติยังช่วยให้เราเข้าใจว่าจุลินทรีย์ในลำไส้มีโครงสร้างชุมชนของมันอย่างไร และสร้างเมแทบอไลต์ของจุลินทรีย์ร่วมกัน s (เช่น กรดไขมันสายสั้น) ที่สร้างโครงสร้างเซลล์และช่องสเต็มเซลล์ในฐานใต้ดิน คุณลักษณะเหล่านี้สามารถแสดงให้เห็นได้ก็ต่อเมื่อมีการสร้างชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติในหลอดทดลองเท่านั้น
นอกจากวิธีการของเราในการสร้างโครงสร้างเยื่อบุผิวลำไส้แบบ 3 มิติแล้ว ยังมีวิธีการในหลอดทดลองอีกหลายวิธี การเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ในลำไส้เป็นเทคนิควิศวกรรมเนื้อเยื่อที่ล้ำสมัยโดยอาศัยการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดในลำไส้ภายใต้สภาวะ morphogen ที่เฉพาะเจาะจง23,24,25 อย่างไรก็ตาม การใช้แบบจำลองออร์แกนอยด์ 3 มิติสำหรับการวิเคราะห์การขนส่งหรือการเพาะเลี้ยงร่วมของโฮสต์และไมโครไบโอมมักจะเป็นสิ่งที่ท้าทาย เนื่องจากเซลล์ของลำไส้ถูกปิดอยู่ภายในออร์แกนอยด์ ดังนั้น การแนะนำส่วนประกอบของแสง เช่น เซลล์จุลินทรีย์หรือแอนติเจนจากภายนอกมีจำกัดการเข้าถึงลูเมนออร์กานอยด์สามารถปรับปรุงได้โดยใช้ไมโครอินเจ็กเตอร์26,27 แต่วิธีนี้เป็นการบุกรุกและใช้แรงงานมาก และต้องใช้ความรู้เฉพาะทางในการดำเนินการ นอกจากนี้ การเพาะเลี้ยงออร์กานอยด์แบบดั้งเดิมที่เก็บรักษาไว้ในโครงสร้างไฮโดรเจลภายใต้สภาวะคงที่ไม่ได้สะท้อนถึงชีวกลศาสตร์ที่ใช้งานอยู่ในร่างกายอย่างแม่นยำ
วิธีการอื่นๆ ที่ใช้โดยกลุ่มวิจัยหลายกลุ่มใช้นั่งร้านไฮโดรเจล 3 มิติที่สร้างไว้ล่วงหน้าเพื่อเลียนแบบโครงสร้างเยื่อบุผิวของลำไส้โดยการเพาะเลี้ยงเซลล์ลำไส้ของมนุษย์ที่แยกได้บนพื้นผิวเจล สร้างโครงไฮโดรเจลโดยใช้พิมพ์ 3 มิติ กัดสีขนาดจิ๋ว หรือพิมพ์แบบพิมพ์หิน วิธีนี้แสดงการจัดเรียงเซลล์เยื่อบุผิวที่แยกได้เองในหลอดทดลองด้วยการไล่ระดับสี morphogen ที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยา ทำให้มีอัตราส่วนกว้างยาวสูง โครงสร้างเยื่อบุผิวและ stroma-epithelial crosstalk โดยรวมเซลล์ stromal ไว้ในนั่งร้าน อย่างไรก็ตาม ลักษณะของโครงร่างที่มีโครงสร้างล่วงหน้าอาจป้องกันการแสดงกระบวนการ morphogenetic ที่เกิดขึ้นเอง แบบจำลองเหล่านี้ไม่ได้ให้การไหลแบบไดนามิก luminal หรือสิ่งของคั่นระหว่างหน้า ขาดความเค้นเฉือนของเหลวที่เซลล์ในลำไส้จำเป็นต้องผ่าน morphogenesis และได้รับการทำงานทางสรีรวิทยา การศึกษาล่าสุดอีกชิ้นหนึ่งใช้โครงร่างไฮโดรเจลในไมโครฟลู แพลตฟอร์ม idic และโครงสร้างเยื่อบุผิวลำไส้ที่มีลวดลายโดยใช้เทคนิคการแกะสลักด้วยเลเซอร์ ออร์แกนอยด์ในลำไส้ของหนูทำตามรูปแบบที่แกะสลักเพื่อสร้างโครงสร้างท่อลำไส้ และสรุปการไหลของของไหลภายในลำไส้ได้โดยใช้โมดูลไมโครฟลูอิดิกส์ อย่างไรก็ตาม แบบจำลองนี้ไม่ได้แสดงกระบวนการทางสัณฐานวิทยาที่เกิดขึ้นเองหรือรวมถึงการเคลื่อนไหวทางกลศาสตร์ของลำไส้ เทคนิคการพิมพ์ 3 มิติจากกลุ่มเดียวกันสามารถสร้างท่อทางเดินอาหารขนาดเล็กด้วยสปอน กระบวนการทางสัณฐานวิทยาแบบ taneous แม้จะมีการประดิษฐ์ที่ซับซ้อนของส่วนต่างๆ ของลำไส้ภายในท่อ แบบจำลองนี้ยังขาดการไหลของของไหลแบบลูมินัสและการเสียรูปเชิงกล นอกจากนี้ ความสามารถในการทำงานของแบบจำลองอาจถูกจำกัด โดยเฉพาะอย่างยิ่งหลังจากกระบวนการพิมพ์ทางชีวภาพเสร็จสมบูรณ์ ซึ่งรบกวนเงื่อนไขการทดลองหรือปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์กับเซลล์ โปรโตคอลที่เราเสนอนำเสนอรูปแบบสัณฐานวิทยาของลำไส้ที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ ความเครียดเฉือนที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยา ชีวกลศาสตร์ที่เลียนแบบการเคลื่อนไหวของลำไส้ การเข้าถึงช่องปลายยอดและฐานด้านข้างอิสระ และการสร้างสภาพแวดล้อมจุลภาคทางชีวภาพที่ซับซ้อนของโมดูลาร์ขึ้นใหม่ ดังนั้น โปรโตคอล morphogenesis 3 มิติ ในหลอดทดลอง ของเราอาจให้แนวทางเสริมเพื่อเอาชนะความท้าทายของวิธีการที่มีอยู่
โปรโตคอลของเรามุ่งเน้นไปที่ morphogenesis ของเยื่อบุผิว 3 มิติ โดยมีเพียงเซลล์เยื่อบุผิวในการเพาะเลี้ยง และไม่มีเซลล์ประเภทอื่นที่อยู่รอบข้าง เช่น เซลล์ mesenchymal เซลล์บุผนังหลอดเลือด และเซลล์ภูมิคุ้มกัน ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ แกนหลักของโปรโตคอลของเราคือการเหนี่ยวนำให้เกิด morphogenesis ของเยื่อบุผิวโดยการกำจัดสารยับยั้ง morphogen ที่หลั่งออกมาที่ด้านฐานของสื่อที่แนะนำ ในขณะที่โมดูลาร์ที่แข็งแกร่งของ gut-on-a-chip และ hybrid-on- a-chip ช่วยให้เราสามารถสร้างชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติที่เป็นลูกคลื่นขึ้นใหม่ ความซับซ้อนทางชีววิทยาเพิ่มเติม เช่น ปฏิกิริยาระหว่างเยื่อบุผิวกับมีเซนไคม์ 33,34 การสะสมของเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) 35 และในแบบจำลองของเรา คุณสมบัติของ crypt-villus ที่ถ่ายทอดเซลล์ต้นกำเนิดเฉพาะใน basal crypts ยังคงได้รับการพิจารณาต่อไป เซลล์ Stromal (เช่น ไฟโบรบลาสต์) ใน mesenchyme มีบทบาทสำคัญในการผลิตโปรตีน ECM และการควบคุมของ morphogenesis ในลำไส้ ในร่างกาย การเพิ่มเซลล์ mesenchymal ในแบบจำลองของเราช่วยปรับปรุงกระบวนการ morphogenesis และประสิทธิภาพการยึดเกาะของเซลล์ ชั้นบุผนังหลอดเลือด (เช่นเส้นเลือดฝอยหรือน้ำเหลือง) มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการขนส่งระดับโมเลกุล และการสรรหาเซลล์ภูมิคุ้มกัน40 ในสภาพแวดล้อมจุลภาคของลำไส้ นอกจากนี้ส่วนประกอบของหลอดเลือดที่สามารถเชื่อมต่อระหว่างแบบจำลองเนื้อเยื่อเป็นข้อกำหนดเบื้องต้นเมื่อมีแบบจำลองเนื้อเยื่อ ออกแบบมาเพื่อแสดงให้เห็นถึงการทำงานร่วมกันของอวัยวะหลายส่วน ดังนั้นอาจต้องรวมเซลล์บุผนังหลอดเลือดเพื่อสร้างแบบจำลองลักษณะทางสรีรวิทยาที่แม่นยำยิ่งขึ้นด้วยความละเอียดระดับอวัยวะ เซลล์ภูมิคุ้มกันที่ได้รับจากผู้ป่วยยังจำเป็นสำหรับการแสดงการตอบสนองของภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ การนำเสนอแอนติเจน
การใช้ชิปไฮบริดนั้นตรงไปตรงมากว่าการใช้ไส้บนชิป เนื่องจากการตั้งค่าอุปกรณ์นั้นง่ายกว่า และการใช้เม็ดมีด Transwell ทำให้สามารถเพาะเลี้ยงเยื่อบุผิวในลำไส้ที่ปรับขนาดได้ อย่างไรก็ตาม เม็ดมีด Transwell ที่มีเยื่อโพลีเอสเตอร์ที่มีจำหน่ายในท้องตลาดนั้นไม่ยืดหยุ่นและไม่สามารถจำลองการเคลื่อนไหวคล้ายการบีบตัวได้ นอกจากนี้ ช่องปลายของเม็ดมีด Transwell ที่วางอยู่ในชิปไฮบริดยังคงอยู่นิ่งโดยไม่มีความเค้นเฉือนที่ด้านปลาย เห็นได้ชัดว่าคุณสมบัติคงที่ใน a ช่อง pical แทบไม่ช่วยให้เกิดการเพาะเลี้ยงร่วมกันของแบคทีเรียในระยะยาวในชิปไฮบริด แม้ว่าเราจะสามารถกระตุ้นการเกิด morphogenesis แบบ 3 มิติได้อย่างแข็งแกร่งในเม็ดมีด Transwell เมื่อใช้ชิปไฮบริด การขาดแคลนชีวกลศาสตร์ที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยาและการไหลของของไหลที่ปลายอาจจำกัดความเป็นไปได้ของแพลตฟอร์มชิปไฮบริดสำหรับการใช้งานที่เป็นไปได้
การสร้างใหม่อย่างเต็มรูปแบบของแกน crypt-villus ของมนุษย์ในวัฒนธรรม gut-on-a-chip และลูกผสมบนชิปยังไม่ได้รับการจัดตั้งขึ้นอย่างสมบูรณ์ เนื่องจาก morphogenesis เริ่มต้นจาก monolayer ของเยื่อบุผิว สถาปัตยกรรมไมโครสามมิติ 3D จึงไม่จำเป็นต้องให้ความคล้ายคลึงกันทางสัณฐานวิทยากับ crypts ในร่างกาย แม้ว่าเราจะจำแนกประชากรเซลล์ที่เพิ่มขึ้นใกล้กับโดเมน crypt ฐานในเยื่อบุผิว 3 มิติไมโครวิศวกรรม โพรงใต้ดินและวิลลัสไม่ได้แบ่งเขตอย่างชัดเจน แม้ว่าช่องด้านบนที่สูงขึ้นบนชิปจะทำให้ความสูงของเยื่อบุผิวที่ปรับจุลภาคสูงขึ้น แต่ความสูงสูงสุดยังคงจำกัดไว้ที่ ~300–400 µm ความลึกที่แท้จริงของโพรงใต้ดินในลำไส้ของมนุษย์ในลำไส้เล็กและลำไส้ใหญ่คือ ~135 µm และ ~400 µm ตามลำดับ และความสูงของ villi ในลำไส้เล็กคือ ~600 µm41
จากมุมมองด้านการถ่ายภาพ การถ่ายภาพความละเอียดสูงพิเศษในแหล่งกำเนิดของสถาปัตยกรรมไมโคร 3 มิติอาจถูกจำกัดอยู่ที่ส่วนในของชิป เนื่องจากระยะการทำงานที่ต้องการจากเลนส์ใกล้วัตถุถึงชั้นเยื่อบุผิวนั้นอยู่ที่ไม่กี่มิลลิเมตร เพื่อแก้ปัญหานี้ อาจต้องใช้วัตถุระยะไกล นอกจากนี้ การสร้างชิ้นส่วนบางๆ สำหรับการเตรียมชิ้นงานสร้างภาพเป็นสิ่งที่ท้าทายเนื่องจากความยืดหยุ่นสูงของ PDMS นอกจากนี้ เนื่องจากการสร้างไมโครแฟบริเคชันแบบทีละชั้นของ ไส้ในชิปเกี่ยวข้องกับการยึดติดอย่างถาวรระหว่างแต่ละชั้น การเปิดหรือเอาชั้นบนออกจึงเป็นเรื่องยากอย่างยิ่งที่จะตรวจสอบโครงสร้างพื้นผิวของชั้นเยื่อบุผิว ตัวอย่างเช่น การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (SEM)
ความสามารถในการไม่ชอบน้ำของ PDMS เป็นปัจจัยจำกัดในการศึกษาเกี่ยวกับไมโครฟลูอิดิกที่เกี่ยวข้องกับโมเลกุลขนาดเล็กที่ไม่ชอบน้ำ เนื่องจาก PDMS สามารถดูดซับโมเลกุลที่ไม่ชอบน้ำดังกล่าวได้โดยไม่เจาะจง ทางเลือกอื่นสำหรับ PDMS อาจพิจารณาร่วมกับวัสดุโพลีเมอร์อื่นๆ อีกทางหนึ่ง การปรับเปลี่ยนพื้นผิวของ PDMS (เช่น การเคลือบด้วยวัสดุ lipophilic 42 หรือโพลี (เอทิลีนไกลคอล) 43 ) สามารถพิจารณาเพื่อลดการดูดซับของโมเลกุลที่ไม่ชอบน้ำ
ประการสุดท้าย วิธีการของเรายังไม่โดดเด่นในแง่ของการคัดกรองปริมาณงานสูงหรือแพลตฟอร์มการทดลองที่เป็นมิตรกับผู้ใช้ "ขนาดเดียวเหมาะกับทุกคน" โปรโตคอลปัจจุบันต้องใช้ปั๊มหลอดฉีดยาต่ออุปกรณ์ขนาดเล็ก ซึ่งใช้พื้นที่ในตู้อบ CO2 และป้องกันการทดลองขนาดใหญ่ ข้อจำกัดนี้สามารถปรับปรุงได้อย่างมากโดยความสามารถในการปรับขยายของรูปแบบการเพาะเลี้ยงที่เป็นนวัตกรรมใหม่ (เช่น เม็ดมีดที่มีรูพรุน 24 หลุม 96 หลุม หรือ 384 หลุมที่เติมซ้ำได้อย่างต่อเนื่อง ishment และการกำจัดสื่อ basolateral)
เพื่อกระตุ้นการเกิดสัณฐานวิทยาแบบ 3 มิติของเยื่อบุผิวในลำไส้ของมนุษย์ ในหลอดทดลอง เราใช้อุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกชิปในลำไส้ที่มีไมโครแชนแนลคู่ขนาน 2 ช่องและเมมเบรนที่มีรูพรุนยืดหยุ่นระหว่างนั้น เพื่อสร้างอินเทอร์เฟซลูเมน-คาพิลลารี นอกจากนี้ เรายังสาธิตการใช้อุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิคช่องเดียว (ชิปไฮบริด) ที่ให้การไหลของเบสโซด้านข้างอย่างต่อเนื่องใต้ชั้นเยื่อบุผิวโพลาไรซ์ที่ปลูกบนเม็ดมีดทรานส์เวลล์ ในทั้งสองแพลตฟอร์ม สามารถแสดงให้เห็นเซลล์บุผิวของ testinal ได้โดยใช้การจัดการทิศทางของการไหลเพื่อกำจัด morphogen antagonists ออกจากช่อง basolateral ขั้นตอนการทดลองทั้งหมด (รูปที่ 1) ประกอบด้วยห้าส่วน: (i) การสร้างจุลภาคของชิปในลำไส้หรือชิปลูกผสมแบบแทรกได้ของ Transwell (ขั้นตอนที่ 1-5; กล่องที่ 1), (ii) การเตรียมเซลล์เยื่อบุผิวในลำไส้ (เซลล์ Caco-2) หรืออวัยวะในลำไส้ของมนุษย์;กล่อง 2-5), (iii) การเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวในลำไส้บนชิปในลำไส้หรือชิปไฮบริด (ขั้นตอนที่ 6-9), (iv) การเหนี่ยวนำของ morphogenesis 3 มิติ ในหลอดทดลอง (ขั้นตอนที่ 10) และ (v) ) เพื่อกำหนดลักษณะของโครงสร้างจุลภาคของเยื่อบุผิว 3 มิติ (ขั้นตอนที่ 11-24) ในที่สุด กลุ่มควบคุมที่เหมาะสม (จะกล่าวถึงด้านล่าง) ได้รับการออกแบบเพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพของ morphogenes ในหลอดทดลอง คือการเปรียบเทียบ morphogenesis ของเยื่อบุผิวกับการควบคุมเชิงพื้นที่ เวลา เงื่อนไข หรือขั้นตอน
เราใช้แพลตฟอร์มการเพาะเลี้ยงที่แตกต่างกัน 2 แพลตฟอร์ม ได้แก่ ไส้บนชิปที่มีช่องตรงหรือช่องที่ไม่เชิงเส้น หรือชิปไฮบริดที่มีเม็ดมีด Transwell (TW) ในอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิค ประดิษฐ์ตามที่อธิบายไว้ในกล่องที่ 1 และขั้นตอนที่ 1 -5 "การผลิตอุปกรณ์" แสดงขั้นตอนหลักในการสร้างชิปตัวเดียวหรือชิปไฮบริด "การเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวในลำไส้ของมนุษย์" อธิบายแหล่งที่มาของเซลล์ (Caco-2 หรืออวัยวะในลำไส้ของมนุษย์) และ ขั้นตอนการเพาะเลี้ยงที่ใช้ในโปรโตคอลนี้ "การเพาะเลี้ยงสัณฐานในหลอดทดลอง" แสดงขั้นตอนโดยรวมซึ่งเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวที่ได้จาก Caco-2 หรือออร์แกนอยด์บนชิปในลำไส้หรือบนชิปลูกผสม Transwell ตามด้วยการเหนี่ยวนำ morphogenesis 3 มิติและการก่อตัวของโครงสร้างเยื่อบุผิวที่มีลักษณะเฉพาะ หมายเลขขั้นตอนของโปรแกรมหรือหมายเลขกล่องแสดงอยู่ใต้ลูกศรแต่ละอัน แอปพลิเคชันแสดงตัวอย่างวิธีการสร้างชั้นเยื่อบุผิวในลำไส้ที่สามารถนำมาใช้ได้ เช่น ในเซลล์ต่างๆ การศึกษาลักษณะเฉพาะของไอออน การศึกษาสรีรวิทยาของลำไส้ การจัดตั้งระบบนิเวศโฮสต์-ไมโครไบโอม และการสร้างแบบจำลองโรค ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ใน “การสร้างความแตกต่างของเซลล์” แสดงนิวเคลียส F-actin และ MUC2 ที่แสดงในชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติ Caco-2 ที่สร้างขึ้นบนชิปลำไส้ การส่งสัญญาณ MUC2 มีอยู่ในเซลล์กุณโฑและเมือกที่หลั่งออกมาจากพื้นผิวเยื่อเมือก ภาพเรืองแสงในสรีรวิทยาของลำไส้แสดงเมือกที่เกิดจากการย้อมสีสำหรับ กรดเซียลิกและสารตกค้าง N-acetylglucosamine โดยใช้ agglutinin ของจมูกข้าวสาลีเรืองแสง ภาพสองภาพที่ทับซ้อนกันใน "Host-Microbe Co-Cultures" แสดงการเพาะเลี้ยงร่วมของโฮสต์และไมโครไบโอมในลำไส้บนชิป แผงด้านซ้ายแสดงการเพาะเลี้ยงร่วมกันของ E. coli ซึ่งแสดงโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) ด้วยเซลล์เยื่อบุผิว 3D Caco-2 ที่ทำวิศวกรรมไมโคร แผงด้านขวาแสดงการแปล GFP E. coli co -เพาะเลี้ยงด้วยเซลล์เยื่อบุผิว 3 มิติ Caco-2 ตามด้วยการย้อมอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ด้วย F-actin (สีแดง) และนิวเคลียส (สีน้ำเงิน) การสร้างแบบจำลองโรคแสดงให้เห็นลำไส้ที่มีสุขภาพดีเทียบกับลำไส้ที่รั่วในชิปการอักเสบของลำไส้ภายใต้ความท้าทายทางสรีรวิทยาด้วยแอนติเจนของแบคทีเรีย (เช่น lipopolysaccharide, LPS) และเซลล์ภูมิคุ้มกัน (เช่น PBMC;สีเขียว).เพาะเลี้ยงเซลล์ Caco-2 เพื่อสร้างชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติ สเกลบาร์ 50 µm รูปภาพในแถวล่าง: “ความแตกต่างของเซลล์” ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจากเอกสารอ้างอิง2สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยอ็อกซ์ฟอร์ด;ทำซ้ำโดยได้รับอนุญาตจาก Ref.5นาส;“Host-Microbe Co-Culture” ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจาก ref.3นาส;“การสร้างแบบจำลองของโรค” ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจากเอกสารอ้างอิง5.แนส
ทั้งชิปแบบไส้บนชิปและชิปแบบไฮบริดถูกสร้างขึ้นโดยใช้แบบจำลอง PDMS ที่ถอดแบบจากแม่พิมพ์ซิลิกอนด้วยการพิมพ์หินแบบอ่อน1,44 และทำลวดลายด้วย SU-8 การออกแบบช่องไมโครในชิปแต่ละตัวถูกกำหนดโดยการพิจารณาอุทกพลศาสตร์ เช่น ความเค้นเฉือนและแรงดันอุทกพลศาสตร์ (ข้อมูลขยายรูปที่ 1b) ซึ่งรวมถึงไมโครแชนเนลแบบโค้งคู่หนึ่งเพื่อกระตุ้นเวลาที่อยู่อาศัยของของเหลวที่เพิ่มขึ้น รูปแบบการไหลแบบไม่เชิงเส้น และการเสียรูปแบบหลายแกนของเซลล์เพาะเลี้ยง (รูปที่ 2a–f) 12. เมื่อจำเป็นต้องสร้างชีวกลศาสตร์ของลำไส้ที่ซับซ้อนมากขึ้น ก็สามารถเลือกไส้ในบนชิปที่ซับซ้อนได้ เราได้แสดงให้เห็นว่า Gut-Chip ที่ซับซ้อนนั้นยัง ทำให้เกิด morphogenesis 3 มิติอย่างมากในกรอบเวลาที่ใกล้เคียงกันโดยมีระดับการเจริญเติบโตของเยื่อบุผิวใกล้เคียงกันเมื่อเทียบกับ Gut-Chip ดั้งเดิม โดยไม่คำนึงถึงชนิดของเซลล์เพาะเลี้ยง ดังนั้นเพื่อกระตุ้น morphogenesis 3 มิติ การออกแบบไส้ในบนชิปเชิงเส้นและซับซ้อนจึงใช้แทนกันได้ แบบจำลอง PDMS ที่บ่มบนแม่พิมพ์ซิลิกอนด้วยรูปแบบ SU-8 ให้คุณสมบัติเชิงลบหลังจากการถอดแบบ (รูปที่2a) ในการสร้างไส้บนชิป ชั้น PDMS ด้านบนที่เตรียมไว้จะถูกผูกมัดตามลำดับกับฟิล์ม PDMS ที่มีรูพรุน จากนั้นจึงจัดแนวกับชั้น PDMS ด้านล่างด้วยการยึดเกาะแบบเปลี่ยนกลับไม่ได้โดยใช้เครื่องบำบัดโคโรนา (รูปที่ 2b–f) ในการสร้างชิปไฮบริด แบบจำลอง PDMS ที่หายแล้วถูกเชื่อมเข้ากับสไลด์แก้วเพื่อสร้างอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิคช่องเดียวที่สามารถรองรับการแทรกของ Transwell (รูปที่ 2h และรูปที่ขยายข้อมูล 2) กระบวนการติดยึดนั้นดำเนินการโดยการรักษาพื้นผิวของแบบจำลอง PDMS และแก้วด้วยพลาสมาออกซิเจนหรือการบำบัดด้วยโคโรนา หลังจากการฆ่าเชื้ออุปกรณ์ไมโครแฟบริคที่ติดกับท่อซิลิโคน การตั้งค่าอุปกรณ์ก็พร้อมที่จะทำ morphogenesis 3 มิติของเยื่อบุผิวในลำไส้ (รูปที่ 2g)
a, ภาพประกอบแผนผังของการเตรียมชิ้นส่วน PDMS จากแม่พิมพ์ซิลิกอนที่มีลวดลาย SU-8 สารละลาย PDMS ที่ไม่ผ่านการบ่มถูกเทลงบนแม่พิมพ์ซิลิกอน (ซ้าย) บ่มที่อุณหภูมิ 60 °C (ตรงกลาง) และถอดแบบ (ขวา) PDMS ที่ถอดแบบแล้วถูกตัดออกเป็นชิ้น ๆ และทำความสะอาดเพื่อใช้งานต่อไป b ภาพถ่ายของแม่พิมพ์ซิลิกอนที่ใช้ในการเตรียมชั้นบนของ PDMS c ภาพถ่ายของแม่พิมพ์ซิลิกอนที่ใช้สร้างเยื่อพรุน PDMS ง ชุดภาพถ่าย s ของส่วนประกอบ PDMS บนและล่างและอุปกรณ์ลำไส้บนชิปที่ประกอบเข้าด้วยกัน e แผนผังการจัดตำแหน่งของส่วนประกอบ PDMS บนและล่าง แต่ละชั้นถูกเชื่อมเข้าด้วยกันอย่างถาวรโดยการรักษาพลาสมาหรือโคโรนา f แผนผังของอุปกรณ์ gut-on-a-chip ที่ประดิษฐ์ขึ้นพร้อมช่องไมโครและห้องสุญญากาศซ้อนทับซ้อนกัน g การตั้งค่า gut-on-a-chip สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ไมโครฟลูอิดิก ไส้ประดิษฐ์บนชิปที่ประกอบเข้ากับหลอดซิลิโคนและหลอดฉีดยาวางอยู่บนสลิปปิดอุปกรณ์ชิปถูกวางไว้บนฝาของจานเพาะเชื้อขนาด 150 มม. สำหรับการประมวลผล สารยึดเกาะใช้เพื่อปิดท่อซิลิโคน h ภาพสแนปชอตของการผลิตชิปไฮบริดและ morphogenesis 3 มิติโดยใช้ชิปไฮบริด เม็ดมีด Transwell ที่เตรียมอย่างอิสระเพื่อเพาะเลี้ยง monolayers 2 มิติของเซลล์เยื่อบุผิวในลำไส้ถูกใส่เข้าไปในชิปไฮบริดเพื่อกระตุ้น 3 มิติในลำไส้ morphogenesis ตัวกลางกระจายตัวผ่านไมโครแชนเนลใต้ชั้นเซลล์ที่สร้างขึ้นบนส่วนแทรกของ Transwell แถบมาตราส่วน 1 ซม. ชม. พิมพ์ซ้ำโดยได้รับอนุญาตจากแหล่งอ้างอิง4เอลส์เวียร์.
ในโปรโตคอลนี้ เซลล์ Caco-2 และออร์แกนอยด์ในลำไส้ถูกใช้เป็นแหล่งเยื่อบุผิว (รูปที่ 3a) เซลล์ทั้งสองประเภทได้รับการเพาะเลี้ยงอย่างอิสระ (กล่องที่ 2 และกล่องที่ 5) และใช้เพื่อเพาะไมโครแชนแนลที่เคลือบด้วย ECM ของไส้บนชิปหรือเม็ดมีด Transwell เมื่อเซลล์ไหลมารวมกัน (ครอบคลุมมากกว่า 95% ในขวด) เซลล์ Caco-2 ที่เพาะเลี้ยงเป็นประจำ (ระหว่างข้อ 10 และ 50) ใน T-f มีการเก็บเกี่ยวลาสค์เพื่อเตรียมสารแขวนลอยของเซลล์ที่แยกออกจากกันโดยของเหลวทริปซิไนเซชัน (กล่องที่ 2) ออร์แกนอยด์ในลำไส้ของมนุษย์จากการตัดชิ้นเนื้อในลำไส้หรือการผ่าตัดถูกเพาะเลี้ยงในโดมนั่งร้าน Matrigel ในเพลต 24 หลุมเพื่อรองรับสภาพแวดล้อมจุลภาคของโครงสร้าง สื่อที่มีมอร์โฟเจนที่จำเป็น (เช่น Wnt, R-spondin และ Noggin) และปัจจัยการเจริญเติบโตที่เตรียมตามที่อธิบายไว้ในกล่องที่ 3 ถูกเสริมทุกวัน ๆ จนกว่าจะออร์แกนอยด์ มีขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 500 µm ออร์แกนอยด์ที่โตเต็มที่จะถูกเก็บเกี่ยวและแยกออกจากกันเป็นเซลล์เดียวสำหรับการเพาะในลำไส้หรือแทรก Transwell บนชิป (กล่องที่ 5) ดังที่เราได้รายงานไปก่อนหน้านี้ มันสามารถแยกความแตกต่างได้ตามประเภทโรค 12,13 (เช่น ลำไส้ใหญ่อักเสบ, โรคโครห์น, มะเร็งลำไส้ใหญ่หรือผู้บริจาคปกติ), บริเวณที่มีรอยโรค (เช่น รอยโรคกับบริเวณที่ไม่มีรอยโรค) และตำแหน่งทางเดินอาหารในระบบทางเดินอาหาร (เช่น ลำไส้เล็กส่วนต้น ลำไส้เล็กส่วนต้น ลำไส้เล็กส่วนต้น ลำไส้ใหญ่ หรือไส้ตรง) เรามีโปรโตคอลที่ปรับให้เหมาะสมในกล่องที่ 5 สำหรับการเพาะเลี้ยงโคโลนิกออร์แกนอยด์ (คอลลอยด์) ที่โดยทั่วไปต้องการความเข้มข้นของมอร์โฟเจนที่สูงกว่าออร์แกนอยด์ในลำไส้เล็ก
a, เวิร์กโฟลว์สำหรับการเหนี่ยวนำของ morphogenesis ในลำไส้ในชิปลำไส้ Caco-2 เยื่อบุผิวในลำไส้ของมนุษย์และออร์แกนอยด์ในลำไส้ถูกใช้ในโปรโตคอลนี้เพื่อแสดงให้เห็นถึง morphogenesis 3 มิติ เซลล์เยื่อบุผิวที่แยกได้นั้นถูกเพาะในอุปกรณ์ gut-on-a-chip ที่เตรียมไว้ (การเตรียมชิป) เมื่อเซลล์ถูกเพาะ (seed) และติด (แนบ) กับเมมเบรนที่มีรูพรุนของ PDMS ในวันที่ 0 (D0) ปลายยอด การไหล (AP) เริ่มต้นและคงไว้เป็นเวลา 2 วันแรก (การไหล, AP, D0-D2) การไหลเบโซด้านข้าง (BL) ยังเริ่มต้นขึ้นพร้อมกับการเคลื่อนไหวยืดเป็นวงกลม (การยืด การไหล การไหล AP และ BL) เมื่อมีการสร้างโมโนเลเยอร์ 2 มิติที่สมบูรณ์ขึ้น มอร์โฟเจเนซิส 3 มิติในลำไส้เกิดขึ้นเองหลังจาก 5 วันของการเพาะไมโครฟลูอิดิค (morphogenesis, D5) รูปภาพคอนทราสต์ของเฟสแสดงสัณฐานวิทยาที่เป็นตัวแทนของเซลล์ Caco-2 ที่ แต่ละขั้นตอนการทดลองหรือจุดเวลา (กราฟแท่ง 100 µm) แผนภาพสี่ภาพแสดงการเรียงตัวที่สอดคล้องกันของการเกิดสัณฐานของลำไส้ (ขวาบน) ลูกศรเส้นประในแผนผังแสดงทิศทางการไหลของของไหล ข ภาพ SEM แสดงโทโพโลยีพื้นผิวของเยื่อบุผิว Caco-2 แบบ 3 มิติ (ซ้าย) สิ่งที่ใส่เข้าไปซึ่งเน้นพื้นที่ขยาย (กล่องประสีขาว) แสดงไมโครวิลไลที่สร้างใหม่บนภาพ 3 มิติ ชั้น Caco-2 (ขวา) c, มุมมองด้านหน้าแนวนอนของ Caco-2 3D ที่สร้างขึ้น, claudin (ZO-1, สีแดง) และเยื่อหุ้มขอบแปรงต่อเนื่องที่ติดฉลาก F-actin (สีเขียว) และนิวเคลียส (สีน้ำเงิน) การสร้างภาพด้วยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ confocal ของเซลล์เยื่อบุผิวบนชิปในลำไส้ ลูกศรชี้ไปที่แผนผังตรงกลางระบุตำแหน่งของระนาบโฟกัสสำหรับแต่ละมุมมอง confocal d บนชิปที่ได้จากกล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟสในวันที่ 3, 7, 9, 11 และ 13 สิ่งที่ใส่เข้าไป (ขวาบน) แสดงการขยายสูงของภาพที่ให้มาe, โฟโตไมโครกราฟ DIC ของเยื่อบุผิวออร์แกนอยด์ 3 มิติที่สร้างขึ้นในลำไส้บนชิ้นที่ถ่ายในวันที่ 7.f, ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ซ้อนทับแสดงเครื่องหมายสำหรับเซลล์ต้นกำเนิด (LGR5;สีม่วงแดง), เซลล์กุณโฑ (MUC2; สีเขียว), F-actin (สีเทา) และนิวเคลียส (สีฟ้า) ที่ปลูกบนชิปของลำไส้เป็นเวลา 3 วันตามลำดับ (ซ้าย) และออร์แกนอยด์อายุ 13 วัน (กลาง) บนชั้นเยื่อบุผิวดูข้อมูลเพิ่มเติมที่ Extended Data รูปที่ 3 ซึ่งเน้นการส่งสัญญาณ LGR5 โดยไม่มีสัญญาณ MUC2 ภาพเรืองแสงแสดงโครงสร้างจุลภาคของเยื่อบุผิว (ขวา) ของเยื่อบุผิวออร์แกนอยด์ 3 มิติที่สร้างขึ้นในลำไส้ บนชิปโดยการย้อมพลาสมาเมมเบรนด้วยสีย้อม CellMask (ขวา) ในวันที่ 13 ของการเพาะเชื้อ แถบมาตราส่วนคือ 50 μm เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่นb พิมพ์ซ้ำโดยได้รับอนุญาตจากเอกสารอ้างอิง2.สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยอ็อกซ์ฟอร์ด;c ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจาก Reference.2สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยอ็อกซ์ฟอร์ด;e และ f ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจากการอ้างอิง 12 ภายใต้สัญญาอนุญาตครีเอทีฟคอมมอนส์ CC BY 4.0
ในลำไส้บนชิป จำเป็นต้องปรับเปลี่ยนพื้นผิวที่ไม่ชอบน้ำของเมมเบรนที่มีรูพรุนของ PDMS เพื่อการเคลือบ ECM ที่ประสบความสำเร็จ ในโปรโตคอลนี้ เราใช้วิธีการที่แตกต่างกันสองวิธีเพื่อปรับเปลี่ยนการไม่ชอบน้ำของเมมเบรน PDMS สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ Caco-2 การเปิดใช้งานพื้นผิวโดยการบำบัดด้วยรังสียูวี/โอโซนเพียงอย่างเดียวก็เพียงพอที่จะลดความไม่ชอบน้ำของพื้นผิว PDMS เคลือบ ECM และติดเซลล์ Caco-2 เข้ากับเมมเบรน PDMS อย่างไรก็ตาม การเพาะเลี้ยงไมโครฟลูอิดิกของออร์กานอยด์ epi ธีเลียมต้องการการทำให้พื้นผิวทำงานตามสารเคมีเพื่อให้เกิดการสะสมของโปรตีน ECM อย่างมีประสิทธิภาพโดยการใช้โพลีเอทิลีนมีน (PEI) และกลูตาราลดีไฮด์ตามลำดับกับไมโครแชนเนล PDMS หลังจากการปรับเปลี่ยนพื้นผิว โปรตีน ECM จะถูกสะสมไว้เพื่อปกปิดพื้นผิว PDMS ที่ทำหน้าที่แล้ว จากนั้นจึงนำเข้าสู่เยื่อบุผิวออร์แกนอยด์ที่แยกได้ หลังจากติดเซลล์แล้ว การเพาะเลี้ยงเซลล์ไมโครฟลูอิดิกจะเริ่มต้นด้วยการผสมเฉพาะสื่อเข้าไปในไมโครแชนแนลด้านบนจนกระทั่งเซลล์ก่อตัวเป็นโมโนเลเยอร์ที่สมบูรณ์ ในขณะที่ ไมโครแชนเนลที่ต่ำกว่าจะรักษาสภาวะคงที่ วิธีการที่ปรับให้เหมาะสมนี้สำหรับการเปิดใช้งานพื้นผิวและการเคลือบ ECM ช่วยให้การยึดเกาะของเยื่อบุผิวออร์กาโนดเพื่อกระตุ้นการสร้าง morphogenesis 3 มิติบนพื้นผิว PDMS
วัฒนธรรมทรานเวลล์ยังต้องการการเคลือบ ECM ก่อนการเพาะเซลล์อย่างไรก็ตาม การเพาะเลี้ยง Transwell ไม่จำเป็นต้องมีขั้นตอนการปรับสภาพที่ซับซ้อนเพื่อกระตุ้นพื้นผิวของเม็ดมีดที่มีรูพรุน สำหรับการเติบโตของเซลล์ Caco-2 บนเม็ดมีด Transwell การเคลือบ ECM บนเม็ดมีดที่มีรูพรุนจะช่วยเร่งการยึดเกาะของเซลล์ Caco-2 ที่แยกออกจากกัน (<1 ชั่วโมง) และการก่อตัวของสิ่งกีดขวางทางแยกที่แน่นหนา (<1-2 วัน) ในการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์บนเม็ดมีด Transwell ออร์แกนอยด์ที่แยกได้จะถูกเพาะบนเม็ดมีดที่เคลือบ ECM โดยยึดติดกับพื้นผิวเมมเบรน (<3 ชั่วโมง) และรักษาไว้จนกว่าออร์แกนอยด์ สร้าง monolayer ที่สมบูรณ์แบบด้วยความสมบูรณ์ของสิ่งกีดขวาง การเพาะเลี้ยง Transwell ดำเนินการในเพลต 24 หลุมโดยไม่ต้องใช้ชิปไฮบริด
ในหลอดทดลอง 3D morphogenesis สามารถเริ่มต้นได้โดยใช้การไหลของของไหลไปยังลักษณะ basolateral ของชั้นเยื่อบุผิวที่จัดตั้งขึ้น ในลำไส้บนชิป morphogenesis ของเยื่อบุผิวเริ่มขึ้นเมื่อตัวกลางถูกกระจายเข้าสู่ไมโครแชนแนลด้านบนและด้านล่าง (รูปที่ 3a) ดังที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ การแนะนำการไหลของของไหลในช่องด้านล่าง (basolateral) เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการกำจัดสารยับยั้ง morphogen ที่หลั่งในทิศทางอย่างต่อเนื่อง และสร้างความเครียดเฉือนแบบลูมินัล โดยทั่วไปเราใช้การไหลแบบคู่ในลำไส้บนชิป ในชิปไฮบริด เม็ดมีด Transwell ที่มีเยื่อบุผิว monolayers ถูกแทรกเข้าไปในชิปไฮบริด จากนั้น สื่อจะถูกนำไปใช้ใต้ด้านฐานของเม็ดมีด Transwell ที่มีรูพรุนผ่านไมโครแชนแนล morphogenesis ในลำไส้เกิดขึ้น 3-5 วันหลังจากการเริ่มต้นของการไหลพื้นฐานในแพลตฟอร์มเพาะเลี้ยงทั้งสอง
คุณสมบัติทางสัณฐานวิทยาของชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติแบบไมโครวิศวกรรมสามารถวิเคราะห์ได้โดยใช้รูปแบบการถ่ายภาพต่างๆ รวมถึงกล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟส กล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์การรบกวนที่แตกต่างกัน (DIC) SEM หรือกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ (รูปที่ 3 และ 4) การถ่ายภาพเฟสคอนทราสต์หรือ DIC สามารถทำได้ง่ายทุกเวลาระหว่างการเพาะเลี้ยงเพื่อตรวจสอบรูปร่างและการยื่นออกมาของชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติ เนื่องจากความโปร่งใสทางแสงของ PDMS และ ฟิล์มโพลีเอสเตอร์ ทั้งแบบไส้ในชิปและแบบชิปแบบไฮบริดสามารถให้การถ่ายภาพแบบเรียลไทม์ในแหล่งกำเนิดโดยไม่จำเป็นต้องแบ่งส่วนหรือถอดชิ้นส่วนอุปกรณ์ เมื่อทำการถ่ายภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ (รูปที่ 1, 3c, f และ 4b, c) โดยทั่วไปเซลล์จะได้รับการแก้ไขด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ (PFA) 4% (wt/vol) ตามด้วย Triton X-100 และ 2% (wt/vol) ) อัลบั้มซีรั่มวัว ขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์ สามารถใช้สารตรึง สารเพิ่มการซึมผ่าน และสารปิดกั้นต่างๆ ได้ แอนติบอดีปฐมภูมิที่กำหนดเป้าหมายเซลล์ที่ขึ้นกับเชื้อสายหรือเครื่องหมายภูมิภาคใช้เพื่อเน้นเซลล์ที่ตรึงอยู่ในแหล่งกำเนิดบนชิป ตามด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิพร้อมกับสีย้อมตอบโต้ที่กำหนดเป้าหมายนิวเคลียสอย่างใดอย่างหนึ่ง (เช่น 4 ′, 6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) หรือ F-actin (เช่น fluor ฟาลลอยดินที่ติดป้าย escently) นอกจากนี้ยังสามารถถ่ายภาพสดที่ใช้ฟลูออเรสเซนซ์ในแหล่งกำเนิดเพื่อตรวจจับการผลิตเมือก (รูปที่1, “ความแตกต่างของเซลล์” และ “สรีรวิทยาของลำไส้”), การเพิ่มจำนวนเซลล์ของจุลินทรีย์แบบสุ่ม (รูปที่ 1, “โฮสต์-การเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์ร่วมกัน”) การสรรหาเซลล์ภูมิคุ้มกัน (รูปที่ 1, 'การสร้างแบบจำลองโรค') หรือรูปร่างของสัณฐานวิทยาของเยื่อบุผิว 3 มิติ (รูปที่ 3c,f และ 4b,c) เมื่อแก้ไขไส้ในชิปเพื่อแยกชั้นบนออกจากชั้นไมโครแชนแนลด้านล่างตามที่อธิบายไว้ใน อ้างอิง ดังที่แสดงในรูปที่ 2 สัณฐานวิทยาของเยื่อบุผิว 3 มิติ รวมทั้ง microvilli บนขอบแปรงปลายสามารถมองเห็นได้ด้วย SEM (รูปที่ 3b) การแสดงออกของตัวบ่งชี้ความแตกต่างสามารถประเมินได้โดยการทำ PCR5 เชิงปริมาณหรือการจัดลำดับ RNA เซลล์เดียว ในกรณีนี้ ชั้น 3 มิติของเซลล์เยื่อบุผิวที่ปลูกในชิปลำไส้หรือชิปลูกผสมจะถูกเก็บเกี่ยวโดยทริปซินไนเซชัน แล้วนำไปใช้สำหรับการวิเคราะห์ระดับโมเลกุลหรือพันธุกรรม .
a, เวิร์กโฟลว์สำหรับการเหนี่ยวนำของ morphogenesis ในลำไส้ในชิปไฮบริด Caco-2 และออร์แกนอยด์ในลำไส้ถูกใช้ในโปรโตคอลนี้เพื่อสาธิต morphogenesis 3 มิติในแพลตฟอร์มชิปแบบไฮบริด เซลล์เยื่อบุผิวที่แยกออกจากกันถูกเพาะในเม็ดมีด Transwell ที่เตรียมไว้ (การเตรียม TW; ดูรูปภาพด้านล่าง) เมื่อเซลล์ถูกเพาะ (seed) และติดเข้ากับเยื่อโพลีเอสเตอร์ในเม็ดมีด Transwell เซลล์ทั้งหมดจะถูกเพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะคงที่ (การเพาะเลี้ยง TW)หลังจากนั้น 7 วัน การแทรก Transwell หนึ่งอันที่มีเซลล์เยื่อบุผิวชั้นเดียว 2 มิติถูกรวมเข้ากับชิปไฮบริดเพื่อแนะนำการไหลแบบเบสโซแลทเทอรัล (Flow, BL) ซึ่งท้ายที่สุดนำไปสู่การสร้างชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติ (morphogenesis) ไมโครกราฟคอนทราสต์ของเฟสแสดงลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลล์เยื่อบุผิวของอวัยวะมนุษย์ที่ได้มาจากผู้บริจาคปกติ (เส้น C103) ขึ้นโคลอนที่แต่ละขั้นตอนการทดลองหรือจุดเวลา แผนผังในชั้นบนแสดงการกำหนดค่าการทดลอง สำหรับแต่ละ step.b ชิปไฮบริด (แผนผังด้านซ้าย) สามารถนำไปสู่ ​​morphogenesis 3 มิติของเซลล์เยื่อบุผิวออร์แกนอยด์ด้วยมุมมองกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลจากบนลงล่างที่ตำแหน่ง Z ที่แตกต่างกัน (บน กลาง และล่าง;ดูแผนผังด้านขวาและเส้นประที่สอดคล้องกัน)แสดงลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่ชัดเจน F-actin (สีฟ้า), นิวเคลียส (สีเทา) c, กราฟไมโครกราฟเรืองแสงแบบคอนโฟคอล (มุมมอง 3 มิติ) ของเซลล์เยื่อบุผิวที่ได้มาจากออร์แกนอยด์ที่เพาะเลี้ยงใน Static Transwell (TW; สิ่งที่ใส่เข้าไปภายในกล่องประสีขาว) เทียบกับชิปไฮบริด (ภาพเต็มที่ใหญ่ที่สุด) เปรียบเทียบสัณฐานวิทยา 2 มิติกับ 3 มิติ ตามลำดับ คู่ของมุมมองตัดขวางแนวตั้ง 2 มิติ (แทรกที่มุมขวาบน; “XZ” ) ยังแสดงคุณสมบัติ 2D และ 3D สเกลบาร์ 100 µm.c พิมพ์ซ้ำโดยได้รับอนุญาตจากแหล่งอ้างอิง4.เอลส์เวียร์.
การควบคุมสามารถเตรียมได้โดยการเพาะเลี้ยงเซลล์เดียวกัน (Caco-2 หรือเซลล์เยื่อบุผิวออร์แกนอยด์ในลำไส้) ให้เป็นโมโนเลเยอร์สองมิติภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงแบบคงที่ทั่วไป โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การสูญเสียสารอาหารอาจเป็นผลมาจากความจุปริมาตรที่จำกัดของช่องไมโคร (เช่น ~4 µL ในช่องด้านบนสุดของการออกแบบชิปไส้ในดั้งเดิม) ดังนั้น สัณฐานวิทยาของเยื่อบุผิวก่อนและหลังการใช้การไหลแบบเบสโซไซด์ยังสามารถเปรียบเทียบได้
กระบวนการพิมพ์หินแบบอ่อนควรดำเนินการในห้องปลอดเชื้อ สำหรับแต่ละเลเยอร์บนชิป (ชั้นบนและล่างและเมมเบรน) และชิปไฮบริด มีการใช้โฟโต้มาสก์ที่แตกต่างกันและประดิษฐ์ขึ้นบนเวเฟอร์ซิลิคอนแยกกัน เนื่องจากความสูงของช่องไมโครนั้นแตกต่างกัน ความสูงเป้าหมายของช่องไมโครบนและล่างของไส้บนชิปคือ 500 µm และ 200 µm ตามลำดับ ความสูงเป้าหมายของช่องสัญญาณของชิปไฮบริดคือ 200 µm
วางแผ่นเวเฟอร์ซิลิคอนขนาด 3 นิ้วลงในจานที่มีอะซิโตน ค่อยๆ หมุนแผ่นเป็นเวลา 30 วินาที จากนั้นผึ่งลมให้แผ่นเวเฟอร์แห้ง ย้ายแผ่นเวเฟอร์ไปยังจานที่มี IPA จากนั้นหมุนแผ่นเป็นเวลา 30 วินาทีเพื่อทำความสะอาด
สารละลายปิรันยา (ส่วนผสมของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์และกรดซัลฟิวริกเข้มข้น 1:3 (ปริมาตร/ปริมาตร)) สามารถเลือกใช้เพื่อกำจัดสารอินทรีย์ที่ตกค้างออกจากผิวเวเฟอร์ซิลิคอนได้สูงสุด
สารละลายปลาปิรันย่ามีฤทธิ์กัดกร่อนสูงและสร้างความร้อน จำเป็นต้องมีมาตรการป้องกันด้านความปลอดภัยเพิ่มเติม สำหรับการกำจัดของเสีย ให้ปล่อยให้สารละลายเย็นลงและถ่ายโอนไปยังภาชนะบรรจุของเสียที่แห้งและสะอาด ใช้ภาชนะรองและติดฉลากของภาชนะบรรจุของเสียอย่างถูกต้อง โปรดปฏิบัติตามคำแนะนำด้านความปลอดภัยของโรงงานสำหรับขั้นตอนโดยละเอียดเพิ่มเติม
คายน้ำเวเฟอร์โดยวางไว้บนจานร้อน 200 °C เป็นเวลา 10 นาที หลังจากคายน้ำแล้ว เวเฟอร์จะถูกเขย่า 5 ครั้งในอากาศเพื่อทำให้เย็นลง
เท photoresist SU-8 2100 ประมาณ 10 กรัมลงบนกึ่งกลางของเวเฟอร์ซิลิคอนที่ทำความสะอาดแล้ว ใช้แหนบเพื่อเกลี่ย photoresist ให้ทั่วบนเวเฟอร์ บางครั้งวางเวเฟอร์บนแผ่นร้อน 65°C เพื่อให้ photoresist เหนียวน้อยลงและกระจายง่ายขึ้น อย่าวางเวเฟอร์โดยตรงบนแผ่นร้อน
SU-8 กระจายอย่างสม่ำเสมอบนเวเฟอร์โดยการเคลือบสปิน ตั้งโปรแกรมการหมุนที่เข้ามาของ SU-8 เป็นเวลา 5–10 วินาทีเพื่อเผยแพร่ที่ 500 รอบต่อนาทีที่อัตราเร่ง 100 รอบต่อนาที/วินาที ตั้งค่าสปินหลักสำหรับการสร้างลวดลายความหนา 200 µm ที่ 1,500 รอบต่อนาที หรือให้ได้ความหนา 250 µm (ทำให้ชั้นบนของไส้ในชิปสูงขึ้น 500 µm ดูที่ “ขั้นตอนวิกฤต” ด้านล่าง) ตั้งไว้ที่อัตราเร่ง 300 รอบต่อนาที/วินาที 30 วินาทีที่ 1,200 รอบต่อนาที
ความเร็วในการปั่นหลักสามารถปรับได้ตามความหนาของชิ้นงานของรูปแบบ SU-8 บนซิลิคอนเวเฟอร์
ในการประดิษฐ์รูปแบบ SU-8 ที่ความสูง 500 µm สำหรับชั้นบนของไส้ในบนชิป การเคลือบแบบหมุนและขั้นตอนการอบแบบอ่อนของกล่องนี้ (ขั้นตอนที่ 7 และ 8) ถูกทำซ้ำตามลำดับ (ดูขั้นตอนที่ 9) เพื่อสร้างชั้นหนา 250 µm ของ SU-8 สองชั้น ซึ่งสามารถซ้อนทับกันเป็นชั้นและรวมเข้ากับแสง UV ในขั้นตอนที่ 12 ของกล่องนี้ ทำให้ได้ชั้นที่สูง 500 µm
อบเวเฟอร์เคลือบ SU-8 อย่างนุ่มนวลโดยวางเวเฟอร์อย่างระมัดระวังบนแผ่นร้อนที่อุณหภูมิ 65 °C เป็นเวลา 5 นาที จากนั้นเปลี่ยนการตั้งค่าเป็น 95 °C และบ่มต่ออีก 40 นาที
เพื่อให้รูปแบบ SU-8 มีความสูง 500 μm ในช่องไมโครด้านบน ให้ทำซ้ำขั้นตอนที่ 7 และ 8 เพื่อสร้างชั้น SU-8 ที่มีความหนา 250 μm สองชั้น
ใช้ UV Mask Aligner ทำการทดสอบหลอดไฟตามคำแนะนำของผู้ผลิตเพื่อคำนวณเวลาเปิดรับแสงของแผ่นเวเฟอร์ (เวลาเปิดรับแสง ms) = (ปริมาณรังสี mJ/cm2)/(กำลังไฟ mW/cm2)
หลังจากกำหนดเวลาเปิดรับแสงแล้ว ให้วางโฟโต้มาสก์บนที่วางมาสก์ของ UV Mask Aligner และวางโฟโตมาสก์บนแผ่นเวเฟอร์เคลือบ SU-8
วางพื้นผิวที่พิมพ์ของโฟโต้มาสก์ลงบนด้านที่เคลือบด้วย SU-8 ของซิลิคอนเวเฟอร์โดยตรงเพื่อลดการกระจายตัวของรังสียูวี
ให้เวเฟอร์เคลือบ SU-8 และโฟโต้มาสก์ในแนวตั้งถึงแสง UV 260 mJ/cm2 ตามเวลาที่กำหนดไว้ล่วงหน้า (ดูขั้นตอนที่ 10 ของกล่องนี้)
หลังจากได้รับรังสี UV เวเฟอร์ซิลิคอนเคลือบ SU-8 จะถูกอบที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 5 นาที และ 95°C เป็นเวลา 15 นาทีบนแผ่นความร้อนแต่ละแผ่นเพื่อสร้างลวดลายที่มีความสูง 200 μm ขยายเวลาหลังการอบที่ 95°C เป็น 30 นาทีเพื่อสร้างลวดลายที่มีความสูง 500 µm
เทผู้พัฒนาลงในจานแก้วและวางแผ่นเวเฟอร์อบไว้ในจาน ปริมาตรของผู้พัฒนา SU-8 อาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับขนาดของแผ่นกระจก ตรวจสอบให้แน่ใจว่าใช้ผู้พัฒนา SU-8 เพียงพอเพื่อกำจัด SU-8 ที่ยังไม่สัมผัสออกอย่างสมบูรณ์ ตัวอย่างเช่น เมื่อใช้จานแก้วขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 150 มม. ที่มีความจุ 1 ลิตร ให้ใช้ผู้พัฒนา SU-8 ประมาณ 300 มล. พัฒนาแม่พิมพ์เป็นเวลา 25 นาทีโดยหมุนเบา ๆ เป็นครั้งคราว
ล้างแม่พิมพ์ที่พัฒนาแล้วด้วยนักพัฒนาใหม่ประมาณ 10 มล. ตามด้วย IPA โดยฉีดพ่นสารละลายโดยใช้ปิเปต
วางเวเฟอร์ในเครื่องล้างพลาสมาและให้ออกซิเจนพลาสมา (ก๊าซในบรรยากาศ ความดันเป้าหมาย 1 × 10−5 ทอร์ กำลังไฟ 125 วัตต์) เป็นเวลา 1.5 นาที
วางแผ่นเวเฟอร์ในเครื่องดูดความชื้นแบบสุญญากาศที่มีแผ่นกระจกด้านใน สามารถวางแผ่นเวเฟอร์และแผ่นสไลด์เคียงข้างกันได้หากแผ่นดูดความชื้นแบ่งออกเป็นหลายชั้น ให้วางแผ่นสไลด์ไว้ในห้องล่างและเวเฟอร์ไว้ห้องบน หยดสารละลายไซเลน 100 ไมโครลิตร (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) ลงบนแผ่นกระจกแล้วใช้สุญญากาศเพื่อฆ่าเชื้อ
ละลายเซลล์ Caco-2 ที่แช่แข็งในขวดแก้วในอ่างน้ำที่มีอุณหภูมิ 37°C จากนั้นย้ายเซลล์ที่ละลายแล้วไปยังขวด T75 ที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อ Caco-2 ที่อุ่นล่วงหน้า 37°C 15 มล.
ในการผ่านเซลล์ Caco-2 ที่การไหลรวมกันประมาณ 90% ให้อุ่นอาหารเลี้ยงเชื้อ Caco-2, PBS และทริปซิน 0.25%/EDTA 1 mM ก่อนในอ่างน้ำที่มีอุณหภูมิ 37°C
ดูดตัวกลางโดยการดูดสุญญากาศ ล้างเซลล์สองครั้งด้วย PBS อุ่น 5 มล. โดยการดูดสุญญากาศซ้ำแล้วเติม PBS ใหม่