ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดโหมดการทำงานร่วมกันใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่ามีการรองรับอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
การสร้างรูปร่างลำไส้ของมนุษย์สร้างลักษณะเฉพาะของคริปต์-วิลลัสของโครงสร้างจุลภาคของเยื่อบุผิว 3 มิติและการจัดระเบียบเชิงพื้นที่ โครงสร้างเฉพาะนี้จำเป็นต่อการรักษาภาวะธำรงดุลภายในลำไส้โดยปกป้องช่องว่างของเซลล์ต้นกำเนิดในคริปต์ฐานจากแอนติเจนของจุลินทรีย์จากภายนอกและเมแทบอไลต์ของแอนติเจนเหล่านั้น นอกจากนี้ วิลลัสของลำไส้และเมือกที่หลั่งออกมาจะมีเซลล์เยื่อบุผิวที่แยกความแตกต่างทางหน้าที่ได้พร้อมสิ่งกั้นป้องกันบนพื้นผิวของเยื่อเมือกในลำไส้ ดังนั้น การสร้างโครงสร้างเยื่อบุผิว 3 มิติใหม่จึงมีความสำคัญต่อการสร้างแบบจำลองลำไส้ในหลอดทดลอง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ชิปลำไส้จำลองแบบอินทรีย์สามารถกระตุ้นการสร้างรูปร่าง 3 มิติของเยื่อบุผิวลำไส้โดยธรรมชาติด้วยการทำงานทางสรีรวิทยาและชีวกลศาสตร์ที่เพิ่มขึ้น ที่นี่ เราจัดทำโปรโตคอลที่ทำซ้ำได้เพื่อกระตุ้นการสร้างรูปร่างลำไส้ในลำไส้บนชิปไมโครฟลูอิดิกอย่างมั่นคง รวมทั้งในชิปไฮบริดแบบฝัง Transwell เราจะอธิบายวิธีการโดยละเอียดสำหรับอุปกรณ์ การผลิต การเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิว Caco-2 หรือเซลล์ organoid ของลำไส้ในสภาวะปกติ รวมทั้งบนแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิก การเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างรูปร่าง 3 มิติ และการแสดงลักษณะของเยื่อบุผิว 3 มิติที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้รูปแบบการถ่ายภาพหลายวิธี โปรโตคอลนี้ทำให้เกิดการสร้างโครงสร้างไมโครลำไส้ที่ทำงานได้ใหม่โดยควบคุมการไหลของของเหลวบริเวณฐานด้านข้างเป็นเวลา 5 วัน วิธีการสร้างรูปร่างในหลอดทดลองของเรานั้นใช้แรงเฉือนที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยาและการเคลื่อนที่เชิงกล และไม่ต้องใช้การวิศวกรรมเซลล์หรือการจัดการที่ซับซ้อน ซึ่งอาจทำได้ดีกว่าเทคนิคอื่นๆ ที่มีอยู่ เราคาดว่าโปรโตคอลที่เราเสนออาจมีความหมายในวงกว้างสำหรับชุมชนนักวิจัยทางชีวการแพทย์ โดยให้วิธีการในการสร้างชั้นเยื่อบุผิวลำไส้ 3 มิติใหม่ในหลอดทดลองสำหรับการใช้งานทางชีวการแพทย์ คลินิก และเภสัชกรรม
การทดลองแสดงให้เห็นว่าเซลล์ Caco-2 ของเยื่อบุผิวลำไส้ที่เพาะเลี้ยงในชิปลำไส้1,2,3,4,5 หรืออุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกแบบสองชั้น6,7 สามารถเกิดการสร้างรูปร่าง 3 มิติได้เองในหลอดทดลองโดยที่ไม่เข้าใจกลไกพื้นฐานที่ชัดเจน ในการศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้ของเรา เราพบว่าการกำจัดสารต้านการสร้างรูปร่างที่หลั่งออกมาบริเวณฐานด้านข้างออกจากอุปกรณ์เพาะเลี้ยงเป็นสิ่งจำเป็นและเพียงพอที่จะทำให้เกิดการสร้างรูปร่าง 3 มิติของเยื่อบุผิวในหลอดทดลอง ซึ่งได้รับการพิสูจน์แล้วโดย Caco-2 และออร์แกนอยด์ลำไส้ที่ได้จากผู้ป่วย เซลล์เยื่อบุผิวได้รับการตรวจสอบความถูกต้อง ในการศึกษานี้ เราเน้นเฉพาะที่การผลิตเซลล์และการกระจายความเข้มข้นของสารต่อต้าน Wnt ที่มีศักยภาพ Dickkopf-1 (DKK-1) ใน gut-on-a-chip และอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกที่ดัดแปลงที่มีแผ่น Transwell เรียกว่า "Hybrid Chip" เราสาธิตให้เห็นว่าการเพิ่มสารต่อต้าน Wnt จากภายนอก (เช่น DKK-1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1 หรือ Soggy-1) ลงใน gut-on-a-chip จะยับยั้งการสร้างรูปร่างหรือรบกวนชั้นเยื่อบุผิว 3D ที่มีโครงสร้างล่วงหน้า ซึ่งบ่งชี้ว่าความเครียดจากการต่อต้านในระหว่างการเพาะเลี้ยงเป็นสาเหตุของการสร้างรูปร่างลำไส้ในหลอดทดลอง ดังนั้น แนวทางปฏิบัติในการบรรลุการสร้างรูปร่างที่แข็งแกร่งที่ส่วนต่อประสานของเยื่อบุผิวคือ การกำจัดหรือรักษาระดับของสารต่อต้าน Wnt ในช่องข้างฐานให้น้อยที่สุดโดยการชะล้างแบบแอ็คทีฟ (เช่น ในแพลตฟอร์ม gut-on-a-chip หรือ hybrid-on-a-chip) หรือ การแพร่กระจาย สื่อข้างฐาน (เช่น จาก Transwell ที่แทรกเข้าไปในแหล่งกักเก็บข้างฐานขนาดใหญ่ในบ่อน้ำ)
ในโปรโตคอลนี้ เราให้วิธีการโดยละเอียดสำหรับการผลิตไมโครดีไวซ์แบบ gut-on-a-chip และชิปไฮบริดแบบแทรก Transwell (ขั้นตอน 1-5) เพื่อเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้บนเยื่อพรุนที่ใช้โพลีไดเมทิลซิโลเซน (PDMS) (ขั้นตอน 6A, 7A, 8, 9) หรือเยื่อโพลีเอสเตอร์ของแผ่นแทรก Transwell (ขั้นตอน 6B, 7B, 8, 9) และเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างรูปร่าง 3 มิติในหลอดทดลอง (ขั้นตอน 10) นอกจากนี้ เรายังระบุคุณลักษณะของเซลล์และโมเลกุลที่บ่งชี้ถึงการสร้างเนื้อเยื่อเฉพาะและการแยกเซลล์ที่ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์โดยใช้รูปแบบการถ่ายภาพหลายแบบ (ขั้นตอน 11-24) เราเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างรูปร่างโดยใช้เซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ของมนุษย์ เช่น Caco-2 หรือออร์แกนอยด์ลำไส้ ในรูปแบบการเพาะเลี้ยงสองรูปแบบพร้อมรายละเอียดทางเทคนิครวมถึงการดัดแปลงพื้นผิวของเยื่อพรุน การสร้างโมโนเลเยอร์ 2 มิติ และชีวเคมีของลำไส้และการสืบพันธุ์ของ สภาพแวดล้อมทางชีวกลศาสตร์จุลภาคในหลอดทดลอง เพื่อเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างรูปร่างสามมิติจากชั้นเยื่อบุผิวสองชั้นแบบสองมิติ เราได้กำจัดสารต่อต้านมอร์โฟเจนในรูปแบบที่เพาะเลี้ยงทั้งสองแบบโดยการไหลของตัวกลางเข้าไปในช่องฐานด้านข้างของวัฒนธรรม ในที่สุด เราจะแสดงตัวอย่างของการใช้ประโยชน์ของชั้นเยื่อบุผิวสามมิติที่สร้างใหม่ได้ซึ่งสามารถใช้เพื่อสร้างแบบจำลองการเจริญเติบโตของเยื่อบุผิวที่ขึ้นอยู่กับมอร์โฟเจน การเพาะเลี้ยงร่วมกันของโฮสต์-ไมโครไบโอมตามยาว การติดเชื้อจากเชื้อโรค การบาดเจ็บจากการอักเสบ ความผิดปกติของเกราะกั้นเยื่อบุผิว และการบำบัดที่ใช้โปรไบโอติก ตัวอย่างอิทธิพล
โปรโตคอลของเราน่าจะมีประโยชน์ต่อนักวิทยาศาสตร์ในวงกว้างทั้งในด้านพื้นฐาน (เช่น ชีววิทยาของเยื่อบุลำไส้ ชีววิทยาของเซลล์ต้นกำเนิด และชีววิทยาการพัฒนา) และการวิจัยประยุกต์ (เช่น การทดสอบยาก่อนการทดลองทางคลินิก การสร้างแบบจำลองโรค วิศวกรรมเนื้อเยื่อ และระบบทางเดินอาหาร) เนื่องจากโปรโตคอลของเรามีความสามารถในการผลิตซ้ำได้และแข็งแกร่งในการเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างรูปร่างสามมิติของเยื่อบุลำไส้ในหลอดทดลอง เราจึงคาดหวังว่ากลยุทธ์ทางเทคนิคของเราจะสามารถเผยแพร่ให้กับผู้ชมที่ศึกษาพลวัตของการส่งสัญญาณของเซลล์ในระหว่างการพัฒนา การสร้างใหม่ หรือภาวะธำรงดุลของลำไส้ได้ นอกจากนี้ โปรโตคอลของเรายังมีประโยชน์ในการสอบถามการติดเชื้อภายใต้เชื้อก่อโรคต่างๆ เช่น โนโรไวรัส 8, ไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ 2019 ที่ทำให้เกิดโรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง (SARS-CoV-2), เชื้อ Clostridium difficile, เชื้อ Salmonella Typhimurium 9 หรือ Vibrio cholerae กลุ่มเป้าหมายของโรคทางพยาธิวิทยาและพยาธิกำเนิดก็มีประโยชน์เช่นกัน การใช้ระบบไมโครสรีรวิทยาของลำไส้บนชิปอาจช่วยให้สามารถเพาะเลี้ยงร่วมกันในแนวยาว 10 และการประเมินการป้องกันของโฮสต์ การตอบสนองของภูมิคุ้มกัน และการซ่อมแซมการบาดเจ็บที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรคในระบบทางเดินอาหาร (GI) 11 ในเวลาต่อมา ความผิดปกติอื่น ๆ ของระบบทางเดินอาหารที่เกี่ยวข้องกับกลุ่มอาการลำไส้รั่ว โรค celiac โรค Crohn ลำไส้ใหญ่เป็นแผล ถุงอักเสบ หรือกลุ่มอาการลำไส้แปรปรวน สามารถจำลองได้เมื่อเตรียมชั้นเยื่อบุผิวลำไส้ 3 มิติโดยใช้ชั้นเยื่อบุผิวลำไส้ 3 มิติของผู้ป่วย โรคเหล่านี้รวมถึงการฝ่อของวิลลัส การสั้นลงของคริปต์ ความเสียหายของเยื่อเมือก หรือเยื่อบุผิวที่กั้นเสียหาย การตรวจชิ้นเนื้อหรือออร์แกนอยด์ของลำไส้ที่ได้มาจากเซลล์ต้นกำเนิด 12,13 เพื่อสร้างแบบจำลองความซับซ้อนที่สูงขึ้นของสภาพแวดล้อมของโรคได้ดีขึ้น ผู้อ่านอาจพิจารณาเพิ่มประเภทเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับโรค เช่น เซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเลือดส่วนปลายของผู้ป่วย (PBMC) ลงในแบบจำลองที่มี สถาปัตยกรรมไมโครวิลลัส-คริปต์ลำไส้แบบ 3 มิติ เซลล์ภูมิคุ้มกันเฉพาะเนื้อเยื่อ 5.
เนื่องจากโครงสร้างจุลภาคของเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติสามารถตรึงและมองเห็นได้โดยไม่ต้องมีกระบวนการตัดส่วน ผู้ชมที่ทำงานเกี่ยวกับทรานสคริปโตมิกส์เชิงพื้นที่และการถ่ายภาพความละเอียดสูงหรือความละเอียดสูงพิเศษอาจสนใจในการทำแผนที่พลวัตเชิงพื้นที่และเวลาของยีนและโปรตีนบนช่องว่างของเยื่อบุผิว สนใจในเทคโนโลยี การตอบสนองต่อสิ่งกระตุ้นจากจุลินทรีย์หรือภูมิคุ้มกัน นอกจากนี้ การสนทนาข้ามระหว่างโฮสต์กับไมโครไบโอมตามยาว 10, 14 ที่ประสานสมดุลของลำไส้สามารถสร้างขึ้นในชั้นเยื่อเมือกลำไส้แบบ 3 มิติได้โดยการเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์สายพันธุ์ต่างๆ ชุมชนจุลินทรีย์ หรือจุลินทรีย์ในอุจจาระร่วมกัน โดยเฉพาะในลำไส้เล็ก ในแพลตฟอร์ม แนวทางนี้มีความน่าสนใจเป็นพิเศษสำหรับผู้ชมที่ศึกษาเกี่ยวกับภูมิคุ้มกันของเยื่อเมือก ระบบทางเดินอาหาร ไมโครไบโอมของมนุษย์ คัลทูโรมิกส์ และจุลชีววิทยาคลินิกที่พยายามเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์ในลำไส้ที่ไม่เคยเพาะเลี้ยงมาก่อนในห้องปฏิบัติการ หากสามารถปรับโปรโตคอลการสร้างรูปร่างในหลอดทดลองของเราให้เข้ากับรูปแบบการเพาะเลี้ยงที่ปรับขนาดได้ เช่น แผ่นแทรกหลายหลุมในจานที่มี 24 96 หรือ 384 หลุมที่เติมเต็มช่องข้างฐานอย่างต่อเนื่อง โปรโตคอลก็สามารถเผยแพร่ไปยังผู้พัฒนาแพลตฟอร์มการคัดกรองหรือการตรวจสอบปริมาณงานสูงด้านเภสัชกรรม ชีวการแพทย์ หรือสำหรับอุตสาหกรรมอาหารได้เช่นกัน เพื่อเป็นการพิสูจน์หลักการ เราได้สาธิตให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของระบบการสร้างรูปร่างปริมาณงานสูงแบบมัลติเพล็กซ์ที่ปรับขนาดได้เป็นรูปแบบจานที่มี 24 หลุม นอกจากนี้ ผลิตภัณฑ์หลายอวัยวะบนชิปก็ได้รับการนำออกสู่ตลาดแล้ว16,17,18 ดังนั้น การตรวจสอบความถูกต้องของวิธีการสร้างรูปร่างในหลอดทดลองของเราจึงสามารถเร่งดำเนินการได้ และอาจนำไปใช้ในห้องปฏิบัติการวิจัย อุตสาหกรรม หรือหน่วยงานของรัฐหลายแห่ง และหน่วยงานกำกับดูแลเพื่อทำความเข้าใจการรีโปรแกรมเซลล์ของการสร้างรูปร่างลำไส้ในหลอดทดลองในระดับทรานสคริปโตมิกส์เพื่อทดสอบยาหรือยาชีวภาพ การดูดซึมและการขนส่งของยาตัวเลือกได้รับการประเมินโดยใช้ตัวแทนลำไส้ 3 มิติหรือใช้โมเดลอวัยวะบนชิปที่กำหนดเองหรือเชิงพาณิชย์เพื่อประเมินความสามารถในการทำซ้ำของกระบวนการสร้างรูปร่างลำไส้
มีการใช้แบบจำลองการทดลองที่เกี่ยวข้องกับมนุษย์จำนวนจำกัดเพื่อศึกษาการสร้างรูปร่างของเยื่อบุผิวลำไส้ ซึ่งสาเหตุหลักมาจากการขาดโปรโตคอลที่นำไปปฏิบัติได้เพื่อกระตุ้นการสร้างรูปร่าง 3 มิติในหลอดทดลอง ในความเป็นจริง ความรู้ปัจจุบันส่วนใหญ่เกี่ยวกับการสร้างรูปร่างของลำไส้มีพื้นฐานมาจากการศึกษาในสัตว์ (เช่น ปลาซิบราฟิช20 หนู21 หรือไก่22) อย่างไรก็ตาม แบบจำลองเหล่านี้ต้องใช้แรงงานและต้นทุนสูง อาจมีข้อสงสัยทางจริยธรรม และที่สำคัญที่สุดคือ ไม่สามารถกำหนดกระบวนการพัฒนาของมนุษย์ได้อย่างแม่นยำ แบบจำลองเหล่านี้ยังมีข้อจำกัดมากในความสามารถในการทดสอบในลักษณะที่ปรับขนาดได้หลายทาง ดังนั้น โปรโตคอลของเราสำหรับการสร้างโครงสร้างเนื้อเยื่อ 3 มิติใหม่ในหลอดทดลองจึงมีประสิทธิภาพเหนือกว่าแบบจำลองสัตว์ในร่างกายและแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเซลล์ 2 มิติแบบคงที่ดั้งเดิมอื่นๆ ดังที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ การใช้โครงสร้างเยื่อบุผิว 3 มิติทำให้เราสามารถตรวจสอบตำแหน่งเชิงพื้นที่ของเซลล์ที่แยกความแตกต่างในแกนคริปต์-วิลลัสในการตอบสนองต่อสิ่งกระตุ้นทางเยื่อเมือกหรือภูมิคุ้มกันต่างๆ ชั้นเยื่อบุผิวสามารถให้พื้นที่เพื่อศึกษาว่าเซลล์จุลินทรีย์แข่งขันกันอย่างไรเพื่อสร้างช่องว่างในเชิงพื้นที่และวิวัฒนาการทางระบบนิเวศในการตอบสนองต่อปัจจัยของโฮสต์ (เช่น ชั้นเมือกชั้นในเทียบกับชั้นนอก การหลั่ง IgA และเปปไทด์ต่อต้านจุลินทรีย์) นอกจากนี้ สัณฐานวิทยาของเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติสามารถช่วยให้เราเข้าใจว่าจุลินทรีย์ในลำไส้สร้างโครงสร้างของชุมชนอย่างไร และผลิตเมแทบอไลต์ของจุลินทรีย์ (เช่น กรดไขมันสายสั้น) ร่วมกันอย่างไร ซึ่งกำหนดโครงสร้างของเซลล์และช่องว่างของเซลล์ต้นกำเนิดในช่องฐาน โดยลักษณะเหล่านี้จะแสดงให้เห็นได้ก็ต่อเมื่อสร้างชั้นเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติในหลอดทดลองเท่านั้น
นอกจากวิธีการสร้างโครงสร้างเยื่อบุผิวลำไส้แบบ 3 มิติของเราแล้ว ยังมีวิธีการในหลอดทดลองอีกหลายวิธี การเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ลำไส้เป็นเทคนิคทางวิศวกรรมเนื้อเยื่อที่ทันสมัยที่สุดโดยอาศัยการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดของลำไส้ภายใต้สภาวะมอร์โฟเจนเฉพาะ23,24,25 อย่างไรก็ตาม การใช้แบบจำลองออร์แกนอยด์ 3 มิติสำหรับการวิเคราะห์การขนส่งหรือการเพาะเลี้ยงร่วมกันระหว่างโฮสต์และไมโครไบโอมมักเป็นเรื่องท้าทาย เนื่องจากลูเมนของลำไส้ถูกปิดล้อมไว้ในออร์แกนอยด์ ดังนั้นการนำส่วนประกอบของลูเมน เช่น เซลล์จุลินทรีย์หรือแอนติเจนจากภายนอกเข้าไปจึงจำกัดอยู่ การเข้าถึงลูเมนของออร์แกนอยด์สามารถปรับปรุงได้โดยใช้ไมโครอินเจกเตอร์26,27 แต่เป็นวิธีรุกรานและใช้แรงงานมาก และต้องมีความรู้เฉพาะทางในการดำเนินการ นอกจากนี้ การเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์แบบดั้งเดิมที่เก็บรักษาไว้ในโครงไฮโดรเจลภายใต้สภาวะคงที่นั้นไม่ได้สะท้อนถึงชีวกลศาสตร์ที่ทำงานในร่างกายได้อย่างแม่นยำ
แนวทางอื่นๆ ที่ใช้โดยกลุ่มวิจัยหลายกลุ่มใช้โครงไฮโดรเจล 3 มิติที่จัดโครงสร้างไว้ล่วงหน้าเพื่อเลียนแบบโครงสร้างของเยื่อบุผิวลำไส้โดยการเพาะเลี้ยงเซลล์ลำไส้ของมนุษย์ที่แยกออกมาบนพื้นผิวเจล สร้างโครงไฮโดรเจลโดยใช้แม่พิมพ์ที่พิมพ์ 3 มิติ ไมโครมิลล์ หรือสร้างด้วยหิน วิธีนี้แสดงการจัดเรียงเซลล์เยื่อบุผิวที่แยกออกมาแบบจัดระเบียบตัวเองในหลอดทดลองที่มีการไล่ระดับมอร์โฟเจนที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยา โดยสร้างโครงสร้างเยื่อบุผิวที่มีอัตราส่วนภาพสูงและการสื่อสารข้ามระหว่างสโตรมาและเยื่อบุผิวโดยรวมเซลล์สโตรมาไว้ในโครง อย่างไรก็ตาม ลักษณะของโครงที่สร้างโครงสร้างไว้ล่วงหน้าอาจขัดขวางการแสดงกระบวนการสร้างมอร์โฟเจเนติกส์โดยธรรมชาติ โมเดลเหล่านี้ยังไม่ให้การไหลของลูเมนหรือช่องว่างแบบไดนามิก ขาดแรงเฉือนของของไหลที่เซลล์ลำไส้ต้องการเพื่อสร้างมอร์โฟเจเนติกส์และรับหน้าที่ทางสรีรวิทยา การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้อีกกรณีหนึ่งใช้โครงไฮโดรเจลในแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกส์และสร้างรูปแบบ โครงสร้างเยื่อบุลำไส้โดยใช้เทคนิคการแกะสลักด้วยเลเซอร์ ออร์แกนอยด์ลำไส้ของหนูจะทำตามรูปแบบที่แกะสลักเพื่อสร้างโครงสร้างท่อลำไส้ และการไหลของของเหลวภายในช่องว่างลำไส้สามารถสรุปได้โดยใช้โมดูลไมโครฟลูอิดิกส์ อย่างไรก็ตาม แบบจำลองนี้ไม่ได้แสดงกระบวนการสร้างรูปร่างตามธรรมชาติหรือรวมถึงการเคลื่อนไหวทางกลชีวภาพของลำไส้ เทคนิคการพิมพ์ 3 มิติจากกลุ่มเดียวกันสามารถสร้างท่อลำไส้ขนาดเล็กที่มีกระบวนการสร้างรูปร่างตามธรรมชาติได้ แม้ว่าจะต้องสร้างส่วนต่างๆ ของลำไส้ที่ซับซ้อนภายในท่อ แต่แบบจำลองนี้ยังขาดการไหลของของเหลวในช่องว่างลำไส้และการเสียรูปทางกล นอกจากนี้ การทำงานของแบบจำลองอาจมีจำกัด โดยเฉพาะอย่างยิ่งหลังจากกระบวนการพิมพ์ชีวภาพเสร็จสิ้น ซึ่งรบกวนสภาวะการทดลองหรือปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ ในทางกลับกัน โปรโตคอลที่เราเสนอจะให้การสร้างรูปร่างลำไส้ตามธรรมชาติ ความเค้นเฉือนที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยา ไบโอเมคานิกส์ที่เลียนแบบการเคลื่อนไหวของลำไส้ การเข้าถึงช่องด้านข้างด้านบนและด้านล่างที่เป็นอิสระ และการสร้างช่องที่ซับซ้อนขึ้นใหม่ สภาพแวดล้อมทางชีววิทยาของการสร้างโมดูลาร์ ดังนั้น โปรโตคอลการสร้างรูปร่างสามมิติในหลอดทดลองของเราจึงอาจเป็นแนวทางเสริมเพื่อเอาชนะความท้าทายของวิธีการที่มีอยู่
โปรโตคอลของเราเน้นไปที่การสร้างรูปร่างของเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติโดยเฉพาะ โดยมีเซลล์เยื่อบุผิวในวัฒนธรรมเท่านั้น และไม่มีเซลล์โดยรอบประเภทอื่น เช่น เซลล์มีเซนไคมอล เซลล์เยื่อบุผิว และเซลล์ภูมิคุ้มกัน ดังที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ แกนหลักของโปรโตคอลของเราคือการเหนี่ยวนำการสร้างรูปร่างของเยื่อบุผิวโดยการกำจัดสารยับยั้งการสร้างรูปร่างที่หลั่งออกมาจากด้านข้างฐานของตัวกลางที่นำเข้ามา แม้ว่าโครงสร้างแบบโมดูลาร์ที่แข็งแกร่งของ gut-on-a-chip และ hybrid-on-a-chip ของเราช่วยให้เราสร้างชั้นเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติที่เป็นคลื่นได้ใหม่ แต่ความซับซ้อนทางชีวภาพเพิ่มเติม เช่น ปฏิสัมพันธ์ระหว่างเยื่อบุผิวและเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน33,34 การสะสมเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) 35 และในแบบจำลองของเรา คุณสมบัติของ crypt-villus ที่ถ่ายทอดช่องว่างของเซลล์ต้นกำเนิดใน crypt ฐานยังคงต้องพิจารณาเพิ่มเติม เซลล์สโตรมัล (เช่น ไฟโบรบลาสต์) ในเนื้อเยื่อเกี่ยวพันมีบทบาทสำคัญในการผลิตโปรตีน ECM และการควบคุมการทำงานของลำไส้ การสร้างรูปร่างในร่างกาย35,37,38 การเพิ่มเซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพันเข้าไปในแบบจำลองของเราช่วยเพิ่มกระบวนการสร้างรูปร่างและประสิทธิภาพในการเชื่อมต่อเซลล์ ชั้นเยื่อบุผนังหลอดเลือด (เช่น เส้นเลือดฝอยหรือน้ำเหลือง) มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการขนส่งโมเลกุล39 และการคัดเลือกเซลล์ภูมิคุ้มกัน40 ในสภาพแวดล้อมจุลภาคของลำไส้ นอกจากนี้ ส่วนประกอบของหลอดเลือดที่สามารถเชื่อมต่อระหว่างแบบจำลองเนื้อเยื่อเป็นข้อกำหนดเบื้องต้นเมื่อแบบจำลองเนื้อเยื่อได้รับการออกแบบเพื่อแสดงปฏิสัมพันธ์ของหลายอวัยวะ ดังนั้น อาจจำเป็นต้องรวมเซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือดเพื่อสร้างแบบจำลองลักษณะทางสรีรวิทยาที่แม่นยำยิ่งขึ้นด้วยความละเอียดระดับอวัยวะ เซลล์ภูมิคุ้มกันที่ได้รับจากผู้ป่วยยังมีความจำเป็นสำหรับการแสดงการตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด การนำเสนอแอนติเจน การสนทนาข้ามภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดที่ปรับตัวได้ และภูมิคุ้มกันเฉพาะเนื้อเยื่อในบริบทของการเลียนแบบโรคลำไส้
การใช้ชิปไฮบริดนั้นตรงไปตรงมามากกว่าแบบลำไส้บนชิป เนื่องจากการตั้งค่าอุปกรณ์นั้นง่ายกว่า และการใช้แผ่นแทรก Transwell ช่วยให้สามารถเพาะเลี้ยงเยื่อบุลำไส้ได้ในระดับที่ขยายได้ อย่างไรก็ตาม แผ่นแทรก Transwell ที่มีเมมเบรนโพลีเอสเตอร์ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์นั้นไม่มีความยืดหยุ่น และไม่สามารถจำลองการเคลื่อนไหวแบบการบีบตัวของลำไส้ได้ นอกจากนี้ ช่องด้านบนของแผ่นแทรก Transwell ที่วางอยู่ในชิปไฮบริดยังคงอยู่กับที่ โดยไม่มีแรงเฉือนที่ด้านด้านบน เห็นได้ชัดว่าคุณสมบัติคงที่ในช่องด้านบนไม่ค่อยเอื้อต่อการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียร่วมกันในระยะยาวในชิปไฮบริด แม้ว่าเราจะสามารถเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างรูปร่าง 3 มิติได้อย่างมั่นคงในแผ่นแทรก Transwell เมื่อใช้ชิปไฮบริด แต่การขาดไบโอเมคานิกส์ที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยาและการไหลของของเหลวที่ด้านบนอาจจำกัดความเป็นไปได้ของแพลตฟอร์มชิปไฮบริดสำหรับการใช้งานที่มีศักยภาพ
การสร้างใหม่แบบเต็มรูปแบบของแกนคริปต์-วิลลัสในมนุษย์ในวัฒนธรรมลำไส้บนชิปและไฮบริดบนชิปยังไม่ได้รับการพิสูจน์อย่างสมบูรณ์ เนื่องจากการสร้างรูปร่างเริ่มต้นจากชั้นเดียวของเยื่อบุผิว สถาปัตยกรรมไมโคร 3 มิติจึงไม่จำเป็นต้องให้ความคล้ายคลึงทางสัณฐานวิทยากับคริปต์ในร่างกาย แม้ว่าเราจะกำหนดลักษณะของประชากรเซลล์ที่แพร่กระจายใกล้โดเมนคริปต์ฐานในเยื่อบุผิว 3 มิติที่ผ่านการสร้างไมโครแล้ว แต่บริเวณคริปต์และวิลลัสก็ไม่ได้ถูกแบ่งแยกอย่างชัดเจน แม้ว่าช่องด้านบนที่สูงขึ้นบนชิปจะนำไปสู่ความสูงที่เพิ่มขึ้นของเยื่อบุผิวที่ผ่านการสร้างไมโครแล้ว แต่ความสูงสูงสุดยังคงจำกัดอยู่ที่ ~300–400 µm ความลึกที่แท้จริงของคริปต์ในลำไส้เล็กและลำไส้ใหญ่ของมนุษย์คือ ~135 µm และ ~400 µm ตามลำดับ และความสูงของวิลลัสในลำไส้เล็กคือ ~600 µm41
จากมุมมองของการถ่ายภาพ การถ่ายภาพความละเอียดสูงแบบในสถานที่ของสถาปัตยกรรมไมโครสามมิติอาจจำกัดอยู่แค่ลำไส้บนชิป เนื่องจากระยะการทำงานที่จำเป็นจากเลนส์วัตถุไปยังชั้นเยื่อบุผิวอยู่ที่ประมาณไม่กี่มิลลิเมตร เพื่อเอาชนะปัญหานี้ อาจต้องใช้เลนส์วัตถุที่อยู่ห่างไกล นอกจากนี้ การทำส่วนบางๆ เพื่อเตรียมตัวอย่างการถ่ายภาพเป็นเรื่องที่ท้าทายเนื่องจาก PDMS มีความยืดหยุ่นสูง นอกจากนี้ เนื่องจากการผลิตไมโครลำไส้บนชิปทีละชั้นเกี่ยวข้องกับการยึดเกาะถาวรระหว่างแต่ละชั้น การเปิดหรือถอดชั้นบนออกเพื่อตรวจสอบโครงสร้างพื้นผิวของชั้นเยื่อบุผิวจึงเป็นเรื่องที่ท้าทายอย่างยิ่ง ตัวอย่างเช่น การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (SEM)
คุณสมบัติไม่ชอบน้ำของ PDMS เป็นปัจจัยจำกัดในงานวิจัยที่ใช้ไมโครฟลูอิดิกส์เกี่ยวกับโมเลกุลขนาดเล็กที่ไม่ชอบน้ำ เนื่องจาก PDMS สามารถดูดซับโมเลกุลที่ไม่ชอบน้ำดังกล่าวแบบไม่จำเพาะได้ ทางเลือกอื่นสำหรับ PDMS อาจพิจารณาใช้สารโพลีเมอร์ชนิดอื่น หรืออีกทางหนึ่ง อาจพิจารณาปรับเปลี่ยนพื้นผิวของ PDMS (เช่น การเคลือบด้วยวัสดุไลโปฟิลิก 42 หรือโพลีเอทิลีนไกลคอล) 43 เพื่อลดการดูดซับของโมเลกุลที่ไม่ชอบน้ำให้น้อยที่สุด
ในที่สุด วิธีการของเรายังไม่ได้รับการระบุลักษณะอย่างชัดเจนในแง่ของการให้การคัดกรองปริมาณงานสูงหรือแพลตฟอร์มการทดลองที่เป็นมิตรกับผู้ใช้แบบ "ขนาดเดียวเหมาะกับทุกคน" โปรโตคอลปัจจุบันต้องใช้ปั๊มฉีดยาต่อไมโครดีไวซ์หนึ่งตัว ซึ่งใช้พื้นที่ในตู้ฟัก CO2 และป้องกันการทดลองขนาดใหญ่ ข้อจำกัดนี้สามารถปรับปรุงได้อย่างมีนัยสำคัญโดยการปรับขนาดของรูปแบบการเพาะเลี้ยงที่สร้างสรรค์ (เช่น แผ่นเพาะเลี้ยงที่มีรูพรุน 24 หลุม 96 หลุม หรือ 384 หลุม ซึ่งช่วยให้สามารถเติมและกำจัดสื่อข้างฐานได้อย่างต่อเนื่อง)
ในการกระตุ้นการสร้างรูปร่างสามมิติของเยื่อบุผิวลำไส้ของมนุษย์ในหลอดทดลอง เราใช้ชิปไมโครฟลูอิดิกสำหรับอุปกรณ์ลำไส้ที่มีไมโครแชนเนลขนานสองอันและเยื่อยืดหยุ่นที่มีรูพรุนอยู่ระหว่างนั้นเพื่อสร้างอินเทอร์เฟซลูเมน-เส้นเลือดฝอย นอกจากนี้ เรายังสาธิตการใช้อุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกช่องทางเดียว (ชิปไฮบริด) ที่ให้การไหลฐานด้านข้างอย่างต่อเนื่องใต้ชั้นเยื่อบุผิวที่มีขั้วที่ปลูกบนแผ่นแทรก Transwell ในทั้งสองแพลตฟอร์ม การสร้างรูปร่างของเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ของมนุษย์ต่างๆ สามารถสาธิตได้โดยการใช้การควบคุมการไหลแบบมีทิศทางเพื่อกำจัดตัวต่อต้านมอร์โฟเจนออกจากช่องฐานด้านข้าง ขั้นตอนการทดลองทั้งหมด (รูปที่ 1) ประกอบด้วยห้าส่วน: (i) การสร้างไมโครชิปลำไส้หรือชิปไฮบริดที่แทรกได้ Transwell (ขั้นตอนที่ 1-5; กล่องที่ 1) (ii) การเตรียมเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ (เซลล์ Caco-2) หรือออร์แกนอยด์ลำไส้ของมนุษย์ กล่อง 2-5) (iii) การเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้บนชิปลำไส้หรือชิปไฮบริด (ขั้นตอนที่ 6-9) (iv) การเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างรูปร่าง 3 มิติในหลอดทดลอง (ขั้นตอนที่ 10) และ (v)) เพื่อกำหนดลักษณะโครงสร้างจุลภาคของเยื่อบุผิว 3 มิติ (ขั้นตอนที่ 11-24) ในที่สุด กลุ่มควบคุมที่เหมาะสม (หารือเพิ่มเติมด้านล่าง) ได้รับการออกแบบเพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพของการสร้างรูปร่างในหลอดทดลองโดยการเปรียบเทียบการสร้างรูปร่างของเยื่อบุผิวกับการควบคุมเชิงพื้นที่ เชิงเวลา เชิงเงื่อนไข หรือเชิงขั้นตอน
เราใช้แพลตฟอร์มวัฒนธรรมสองแบบที่แตกต่างกัน: ชิปแบบ gut-on-a-chip ที่มีช่องตรงหรือช่องม้วนแบบไม่เชิงเส้น หรือชิปไฮบริดที่มีแผ่น Transwell (TW) ในอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกส์ ซึ่งประดิษฐ์ขึ้นตามที่อธิบายไว้ในกล่องที่ 1 และขั้นตอนที่ 1-5 “การผลิตอุปกรณ์” แสดงขั้นตอนหลักในการสร้างชิปตัวเดียวหรือชิปไฮบริด “การเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ของมนุษย์” อธิบายถึงแหล่งเซลล์ (Caco-2 หรือออร์แกนอยด์ลำไส้ของมนุษย์) และขั้นตอนการเพาะเลี้ยงที่ใช้ในโปรโตคอลนี้ “การสร้างรูปร่างในหลอดทดลอง” แสดงขั้นตอนโดยรวมในการเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวที่ได้มาจาก Caco-2 หรือออร์แกนอยด์บนชิปลำไส้หรือบนแผ่น Transwell ของชิปไฮบริด ตามด้วยการเหนี่ยวนำการสร้างรูปร่าง 3 มิติ และการก่อตัวของโครงสร้างเยื่อบุผิวที่มีลักษณะเฉพาะ หมายเลขขั้นตอนโปรแกรมหรือหมายเลขกล่องจะแสดงอยู่ใต้ลูกศรแต่ละอัน แอปพลิเคชันนี้ให้ตัวอย่างวิธีใช้ชั้นเยื่อบุผิวลำไส้ที่สร้างขึ้น เช่น ในลักษณะเฉพาะของการแบ่งตัวของเซลล์ ลำไส้ การศึกษาสรีรวิทยา การสร้างระบบนิเวศของโฮสต์-ไมโครไบโอม และการสร้างแบบจำลองของโรค ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ใน "การแบ่งตัวของเซลล์" แสดงให้เห็นนิวเคลียส เอฟ-แอคติน และ MUC2 ที่แสดงออกในชั้นเยื่อบุผิว Caco-2 3 มิติที่สร้างขึ้นบนชิปลำไส้ การส่งสัญญาณของ MUC2 ปรากฏอยู่ในเซลล์ถ้วยและเมือกที่หลั่งออกมาจากพื้นผิวเมือก ภาพเรืองแสงในสรีรวิทยาของลำไส้แสดงให้เห็นเมือกที่ผลิตขึ้นโดยการย้อมกรดไซอาลิกและสารตกค้าง N-อะซิทิลกลูโคซามีนโดยใช้แอกกลูตินินจมูกข้าวสาลีเรืองแสง ภาพที่ทับซ้อนกันสองภาพใน "การเพาะเลี้ยงร่วมกันของโฮสต์-ไมโครไบโอม" แสดงให้เห็นการเพาะเลี้ยงร่วมกันของโฮสต์-ไมโครไบโอมในลำไส้บนชิป แผงด้านซ้ายแสดงการเพาะเลี้ยงร่วมกันของ E. coli ที่แสดงโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) กับเซลล์เยื่อบุผิว Caco-2 3 มิติที่ดัดแปลงด้วยไมโคร แผงด้านขวาแสดงตำแหน่งของ E. coli GFP ที่เพาะเลี้ยงร่วมกับเยื่อบุผิว Caco-2 3 มิติ เซลล์ตามด้วยการย้อมอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ด้วยเอฟ-แอคติน (สีแดง) และนิวเคลียส (สีน้ำเงิน) การสร้างแบบจำลองโรคแสดงให้เห็นลำไส้ที่แข็งแรงเทียบกับลำไส้รั่วในชิปที่มีการอักเสบของลำไส้ภายใต้ความท้าทายทางสรีรวิทยาด้วยแอนติเจนแบคทีเรีย (เช่น ไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ LPS) และเซลล์ภูมิคุ้มกัน (เช่น PBMC สีเขียว) เซลล์ Caco-2 ได้รับการเพาะเลี้ยงเพื่อสร้างชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติ มาตราส่วน 50 µm รูปภาพในแถวล่าง: “การแยกความแตกต่างของเซลล์” ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจากเอกสารอ้างอิง 2. Oxford University Press; พิมพ์ซ้ำโดยได้รับอนุญาตจากเอกสารอ้างอิง 5. NAS; “การเพาะเลี้ยงร่วมของโฮสต์และจุลินทรีย์” ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจากเอกสารอ้างอิง 3. NAS; “การสร้างแบบจำลองโรค” ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจากเอกสารอ้างอิง 5. NAS
ชิปแบบ gut-on-a-chip และแบบไฮบริดนั้นผลิตขึ้นโดยใช้แบบจำลอง PDMS ที่ถอดออกจากแม่พิมพ์ซิลิกอนด้วยเทคนิคลิโธกราฟีแบบอ่อน1,44 และสร้างลวดลายด้วย SU-8 การออกแบบไมโครแชนเนลในแต่ละชิปนั้นกำหนดโดยพิจารณาจากหลักอุทกพลศาสตร์ เช่น ความเค้นเฉือนและแรงดันของอุทกพลศาสตร์1,4,12 การออกแบบแบบ gut-on-a-chip ดั้งเดิม (รูปภาพที่ขยาย 1a) ซึ่งประกอบด้วยไมโครแชนเนลตรงคู่ขนานที่วางเคียงกัน ได้พัฒนาไปเป็นแบบ gut-on-a-chip ที่ซับซ้อน (รูปภาพที่ขยาย 1b) ซึ่งประกอบด้วยไมโครแชนเนลโค้งคู่หนึ่งเพื่อกระตุ้นให้ของเหลวคงตัวนานขึ้น รูปแบบการไหลแบบไม่เป็นเชิงเส้น และการเปลี่ยนรูปหลายแกนของเซลล์ที่เพาะเลี้ยง (รูปภาพที่ 2a–f) 12 เมื่อจำเป็นต้องสร้างไบโอเมคานิกส์ของลำไส้ที่ซับซ้อนกว่านี้ ก็สามารถเลือกแบบ gut-on-a-chip ที่ซับซ้อนได้ เราได้สาธิตให้เห็นว่า Gut-Chip แบบคดเคี้ยวยังกระตุ้นการสร้างรูปร่าง 3 มิติได้อย่างมากในเวลาที่ใกล้เคียงกัน กรอบที่มีระดับการเจริญเติบโตของเยื่อบุผิวที่คล้ายคลึงกันเมื่อเทียบกับ Gut-Chip ดั้งเดิม โดยไม่คำนึงถึงประเภทของเซลล์ที่เพาะเลี้ยง ดังนั้น เพื่อเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างรูปร่าง 3 มิติ การออกแบบลำไส้แบบเชิงเส้นและซับซ้อนบนชิปจึงสามารถใช้แทนกันได้ แบบจำลอง PDMS ที่บ่มบนแม่พิมพ์ซิลิโคนที่มีรูปแบบ SU-8 ให้คุณสมบัติเชิงลบหลังจากการถอดแม่พิมพ์ (รูปที่ 2a) เพื่อสร้างลำไส้บนชิป ชั้น PDMS ด้านบนที่เตรียมไว้จะถูกเชื่อมกับฟิล์ม PDMS ที่มีรูพรุนตามลำดับ จากนั้นจึงจัดตำแหน่งกับชั้น PDMS ด้านล่างโดยการเชื่อมแบบถาวรโดยใช้เครื่องบำบัดโคโรนา (รูปที่ 2b–f) เพื่อสร้างชิปไฮบริด แบบจำลอง PDMS ที่บ่มแล้วจะถูกเชื่อมกับสไลด์แก้วเพื่อสร้างอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกช่องเดียวที่สามารถรองรับอินเสิร์ต Transwell ได้ (รูปที่ 2h และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 2) กระบวนการเชื่อมจะดำเนินการโดยการบำบัดพื้นผิวของแบบจำลอง PDMS และแก้วด้วยพลาสมาออกซิเจนหรือการบำบัดโคโรนา หลังจากการฆ่าเชื้ออุปกรณ์ที่ผลิตด้วยไมโครที่ติดอยู่กับซิลิโคน ท่อ การตั้งค่าอุปกรณ์ก็พร้อมที่จะทำการสร้างรูปร่างสามมิติของเยื่อบุลำไส้แล้ว (รูปที่ 2g)
ก. ภาพประกอบแผนผังของการเตรียมชิ้นส่วน PDMS จากแม่พิมพ์ซิลิโคนลาย SU-8 เทสารละลาย PDMS ที่ยังไม่ผ่านการบ่มลงบนแม่พิมพ์ซิลิโคน (ซ้าย) บ่มที่อุณหภูมิ 60 °C (กลาง) และถอดออกจากแม่พิมพ์ (ขวา) PDMS ที่ถอดออกจากแม่พิมพ์แล้วถูกตัดเป็นชิ้นๆ และทำความสะอาดเพื่อใช้งานต่อไป ข. รูปถ่ายของแม่พิมพ์ซิลิโคนที่ใช้ในการเตรียมชั้นบนของ PDMS ค. รูปถ่ายของแม่พิมพ์ซิลิโคนที่ใช้ในการผลิตเมมเบรนพรุนของ PDMS ง. ภาพถ่ายชุดส่วนประกอบ PDMS ด้านบนและด้านล่าง และอุปกรณ์ลำไส้บนชิปที่ประกอบแล้ว จ. แผนผังการจัดตำแหน่งของส่วนประกอบ PDMS ด้านบน เมมเบรน และด้านล่าง แต่ละชั้นจะยึดติดกันอย่างถาวรด้วยการบำบัดด้วยพลาสมาหรือโคโรนา ฉ. แผนผังของอุปกรณ์กัทบนชิปที่ประดิษฐ์ขึ้นโดยมีไมโครแชนเนลที่ซับซ้อนซ้อนทับกันและห้องสูญญากาศ ฉ. การติดตั้งกัทบนชิปสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบไมโครฟลูอิดิก กัทบนชิปที่ประดิษฐ์ขึ้นประกอบด้วย วางท่อซิลิโคนและกระบอกฉีดยาไว้บนแผ่นปิด อุปกรณ์ชิปถูกวางไว้บนฝาของจานเพาะเชื้อขนาด 150 มม. เพื่อการประมวลผล ใช้สารยึดเกาะเพื่อปิดท่อซิลิโคน ภาพสแน็ปช็อตของการผลิตชิปไฮบริดและการสร้างรูปร่าง 3 มิติโดยใช้ชิปไฮบริด แผ่นแทรก Transwell ที่เตรียมไว้โดยอิสระเพื่อเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุลำไส้ชั้นเดียว 2 มิติถูกใส่เข้าไปในชิปไฮบริดเพื่อเหนี่ยวนำการสร้างรูปร่าง 3 มิติของลำไส้ สื่อถูกซึมผ่านไมโครแชนเนลใต้ชั้นเซลล์ที่สร้างขึ้นบนแผ่นแทรก Transwell แถบมาตราส่วน 1 ซม. พิมพ์ซ้ำโดยได้รับอนุญาตจากแหล่งอ้างอิง 4. Elsevier
ในโปรโตคอลนี้ เซลล์สายพันธุ์ Caco-2 และออร์แกนอยด์ของลำไส้ถูกใช้เป็นแหล่งของเยื่อบุผิว (รูปที่ 3a) เซลล์ทั้งสองประเภทได้รับการเพาะเลี้ยงแยกกัน (กล่อง 2 และกล่อง 5) และใช้ในการเพาะไมโครแชนเนลเคลือบ ECM ของลำไส้ที่อยู่บนชิปหรือแผ่นแทรก Transwell เมื่อเซลล์บรรจบกัน (>95% ครอบคลุมในขวด) เซลล์ Caco-2 ที่เพาะเลี้ยงตามปกติ (ระหว่างช่องที่ 10 และ 50) ในขวด T จะถูกเก็บเกี่ยวเพื่อเตรียมสารแขวนลอยเซลล์ที่แยกตัวออกโดยของเหลวทริปซิไนเซชัน (กล่อง 2) ออร์แกนอยด์ของลำไส้ของมนุษย์จากการตัดชิ้นเนื้อลำไส้หรือการตัดออกทางศัลยกรรมได้รับการเพาะเลี้ยงในโดมนั่งร้าน Matrigel ในจาน 24 หลุมเพื่อรองรับไมโครเอนไวรอนเมนต์โครงสร้าง อาหารเลี้ยงเชื้อที่มีมอร์โฟเจนที่จำเป็น (เช่น Wnt, R-spondin และ Noggin) และปัจจัยการเจริญเติบโตที่เตรียมตามที่อธิบายไว้ในกล่อง 3 ได้รับการเสริมทุก ๆ วันเว้นวันจนกว่าออร์แกนอยด์จะเติบโตถึง เส้นผ่านศูนย์กลาง ~500 µm ออร์แกนอยด์ที่โตเต็มที่แล้วจะถูกเก็บเกี่ยวและแยกออกเป็นเซลล์เดี่ยวเพื่อเพาะลงบนลำไส้หรือแผ่น Transwell บนชิป (กล่อง 5) ดังที่เราได้รายงานไว้ก่อนหน้านี้ สามารถแยกความแตกต่างได้ตามประเภทของโรค12,13 (เช่น ลำไส้ใหญ่เป็นแผล โรคโครห์น มะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก หรือผู้บริจาคปกติ) บริเวณที่เกิดรอยโรค (เช่น บริเวณที่เกิดรอยโรคเทียบกับบริเวณที่ไม่มีรอยโรค) และตำแหน่งในระบบทางเดินอาหาร (เช่น ลำไส้เล็กส่วนต้น ลำไส้เล็กส่วนกลาง ลำไส้เล็กส่วนปลาย ลำไส้ใหญ่ส่วนซีคัม ลำไส้ใหญ่ หรือทวารหนัก) เราจัดเตรียมโปรโตคอลที่เหมาะสมที่สุดในกล่อง 5 สำหรับการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ในลำไส้ใหญ่ (โคลอยด์) ซึ่งโดยทั่วไปต้องใช้มอร์โฟเจนในความเข้มข้นที่สูงกว่าออร์แกนอยด์ในลำไส้เล็ก
ก. เวิร์กโฟลว์สำหรับการเหนี่ยวนำการสร้างรูปร่างลำไส้ในชิปลำไส้ เยื่อบุผิวลำไส้ของมนุษย์ Caco-2 และออร์แกนอยด์ลำไส้ใช้ในโปรโตคอลนี้เพื่อสาธิตการสร้างรูปร่าง 3 มิติ เซลล์เยื่อบุผิวที่แยกออกมาถูกเพาะในอุปกรณ์ลำไส้บนชิปที่เตรียมไว้ (การเตรียมชิป) เมื่อเพาะเซลล์แล้ว (เพาะเมล็ด) และติด (ติด) กับเยื่อพรุน PDMS ในวันที่ 0 (D0) การไหลของด้านยอด (AP) จะเริ่มต้นและคงไว้เป็นเวลา 2 วันแรก (การไหล, AP, D0-D2) การไหลของด้านฐานข้าง (BL) จะเริ่มต้นพร้อมกับการเคลื่อนไหวการยืดแบบเป็นวงจร (การยืด การไหล AP และ BL) เมื่อมีการสร้างโมโนเลเยอร์ 2 มิติที่สมบูรณ์ การสร้างรูปร่าง 3 มิติของลำไส้เกิดขึ้นโดยธรรมชาติหลังจาก 5 วันของการเพาะเลี้ยงไมโครฟลูอิดิก (การสร้างรูปร่าง, D5) ภาพคอนทราสต์เฟสแสดงสัณฐานวิทยาที่เป็นตัวแทนของเซลล์ Caco-2 ในแต่ละขั้นตอนการทดลองหรือจุดเวลา (บาร์ กราฟ 100 µm) แผนภาพสี่ภาพที่แสดงให้เห็นลำดับการเกิดรูปร่างลำไส้ที่สอดคล้องกัน (ด้านบนขวา) ลูกศรประประในแผนภาพแสดงทิศทางการไหลของของเหลว b ภาพ SEM แสดงโครงสร้างพื้นผิวของเยื่อบุผิว Caco-2 3 มิติที่จัดทำขึ้น (ซ้าย) ภาพขยายที่เน้นบริเวณที่ขยาย (กล่องประประสีขาว) แสดงไมโครวิลลีที่สร้างใหม่บนชั้น Caco-2 3 มิติ (ขวา) c มุมมองด้านหน้าแนวนอนของเยื่อบุผิว Caco-2 3 มิติ คลาวดิน (ZO-1 สีแดง) และขอบแปรงต่อเนื่องที่มีป้ายกำกับว่า F-actin (สีเขียว) และนิวเคลียส (สีน้ำเงิน) การมองเห็นแบบคอนโฟคอลอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของเซลล์เยื่อบุผิวบนชิปลำไส้ ลูกศรที่ชี้ไปที่แผนภาพกลางระบุตำแหน่งของระนาบโฟกัสสำหรับมุมมองคอนโฟคอลแต่ละมุม d ช่วงเวลาของการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาในออร์แกนอยด์ที่เพาะเลี้ยงบนชิปที่ได้จากกล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟสในวันที่ 3 7, 9, 11 และ 13 ภาพขยาย (ด้านบนขวา) แสดงการขยายสูงของภาพที่ให้ไว้e, ภาพถ่ายจุลภาค DIC ของเนื้อเยื่อบุผิว organoid 3D ที่สร้างขึ้นในลำไส้บนชิ้นที่ถ่ายในวันที่ 7f, ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ซ้อนทับที่แสดงเครื่องหมายของเซลล์ต้นกำเนิด (LGR5; สีแดงอมม่วง), เซลล์ถ้วย (MUC2; สีเขียว), เอฟ-แอกติน (สีเทา) และนิวเคลียส (สีฟ้าอมเขียว) ที่เติบโตบนชิ้นเนื้อในลำไส้เป็นเวลา 3 วัน ตามลำดับ (ซ้าย) และ organoids 13 วัน (กลาง) บนชั้นเนื้อเยื่อบุผิว ดูข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 3 ซึ่งเน้นที่การส่งสัญญาณ LGR5 โดยไม่มีการส่งสัญญาณ MUC2 ภาพฟลูออเรสเซนซ์ที่แสดงโครงสร้างจุลภาคของเนื้อเยื่อบุผิว (ขวา) ของเนื้อเยื่อบุผิว organoid 3D ที่สร้างขึ้นในลำไส้บนชิ้นเนื้อโดยการย้อมเยื่อหุ้มพลาสมาด้วยสีย้อม CellMask (ขวา) ในวันที่ 13 ของการเพาะเลี้ยงแถบมาตราส่วนคือ 50 μm เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่นb พิมพ์ซ้ำโดยได้รับอนุญาตจาก อ้างอิง 2. สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยออกซ์ฟอร์ด; c ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจาก Reference 2. สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยออกซ์ฟอร์ด; e และ f ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตโดยอ้างอิง 12 ภายใต้ใบอนุญาตครีเอทีฟคอมมอนส์ CC BY 4.0
ในลำไส้บนชิป จำเป็นต้องปรับเปลี่ยนพื้นผิวไม่ชอบน้ำของเยื่อพรุน PDMS เพื่อให้เคลือบ ECM ได้สำเร็จ ในโปรโตคอลนี้ เราใช้สองวิธีที่แตกต่างกันเพื่อปรับเปลี่ยนความไม่ชอบน้ำของเยื่อ PDMS สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ Caco-2 การกระตุ้นพื้นผิวด้วยการบำบัดด้วย UV/โอโซนเพียงอย่างเดียวก็เพียงพอที่จะลดความไม่ชอบน้ำของพื้นผิว PDMS เคลือบ ECM และยึดเซลล์ Caco-2 เข้ากับเยื่อ PDMS อย่างไรก็ตาม การเพาะเลี้ยงไมโครฟลูอิดิกของเยื่อบุผิวออร์แกนอยด์ต้องใช้การทำปฏิกิริยากับพื้นผิวโดยใช้สารเคมีเพื่อให้เกิดการสะสมโปรตีน ECM อย่างมีประสิทธิภาพโดยการใช้โพลีเอทิลีนไอมีน (PEI) และกลูตารัลดีไฮด์กับไมโครแชนเนลของ PDMS ตามลำดับ หลังจากการปรับเปลี่ยนพื้นผิว โปรตีน ECM จะถูกสะสมเพื่อปกคลุมพื้นผิว PDMS ที่ทำปฏิกิริยาแล้ว จากนั้นจึงใส่เข้าไปในเยื่อบุผิวออร์แกนอยด์ที่แยกออกมา หลังจากที่ยึดเซลล์แล้ว การเพาะเลี้ยงเซลล์ไมโครฟลูอิดิกจะเริ่มต้นโดยการแพร่กระจายเฉพาะตัวกลางเข้าไปในไมโครแชนเนลด้านบนจนกว่าเซลล์จะสร้างโมโนเลเยอร์ที่สมบูรณ์ ในขณะที่ไมโครแชนเนลด้านล่าง รักษาสภาวะคงที่ วิธีการที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการกระตุ้นพื้นผิวและการเคลือบ ECM นี้ทำให้สามารถยึดเกาะของเยื่อบุผิวออร์แกนอยด์เพื่อเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างรูปร่าง 3 มิติบนพื้นผิว PDMS ได้
นอกจากนี้ วัฒนธรรม Transwell ยังต้องเคลือบ ECM ก่อนการเพาะเลี้ยงเซลล์ อย่างไรก็ตาม วัฒนธรรม Transwell ไม่จำเป็นต้องมีขั้นตอนการเตรียมการล่วงหน้าที่ซับซ้อนเพื่อกระตุ้นพื้นผิวของแผ่นแทรกที่มีรูพรุน สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ Caco-2 บนแผ่นแทรก Transwell การเคลือบ ECM บนแผ่นแทรกที่มีรูพรุนจะเร่งการยึดเกาะของเซลล์ Caco-2 ที่แยกตัวออกจากกัน (น้อยกว่า 1 ชั่วโมง) และการสร้างเกราะป้องกันบริเวณรอยต่อที่แน่นหนา (น้อยกว่า 1-2 วัน) ในการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์บนแผ่นแทรก Transwell ออร์แกนอยด์ที่แยกออกมาจะถูกเพาะเลี้ยงบนแผ่นแทรกเคลือบ ECM ติดไว้บนพื้นผิวเยื่อหุ้มเซลล์ (น้อยกว่า 3 ชั่วโมง) และคงไว้จนกว่าออร์แกนอยด์จะสร้างโมโนเลเยอร์ที่สมบูรณ์พร้อมความสมบูรณ์ของการกั้น การเพาะเลี้ยง Transwell จะดำเนินการในเพลต 24 หลุมโดยไม่ใช้ชิปไฮบริด
การสร้างรูปร่างสามมิติในหลอดทดลองสามารถเริ่มต้นได้โดยการนำการไหลของของเหลวไปทางด้านฐานด้านข้างของชั้นเยื่อบุผิวที่สร้างขึ้น ในลำไส้บนชิป การสร้างรูปร่างของเยื่อบุผิวเริ่มต้นขึ้นเมื่อตัวกลางถูกกระจายเข้าไปในไมโครแชนเนลด้านบนและด้านล่าง (รูปที่ 3a) ดังที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ เป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องนำการไหลของของเหลวเข้าไปในช่องด้านล่าง (ฐานด้านข้าง) เพื่อกำจัดสารยับยั้งการสร้างรูปร่างที่หลั่งออกมาในทิศทางต่างๆ อย่างต่อเนื่อง เพื่อให้มีสารอาหารและซีรั่มเพียงพอสำหรับเซลล์ที่ถูกจับกับเยื่อพรุนและสร้างแรงเฉือนในลูเมน เรามักจะใช้การไหลแบบคู่ในลำไส้บนชิป ในชิปไฮบริด จะแทรกแผ่น Transwell ที่มีโมโนเลเยอร์ของเยื่อบุผิวเข้าไปในชิปไฮบริด จากนั้นจึงนำตัวกลางไปวางไว้ใต้ด้านฐานด้านข้างของแผ่น Transwell ที่มีรูพรุนผ่านไมโครแชนเนล การสร้างรูปร่างของลำไส้เกิดขึ้น 3-5 วันหลังจากการเริ่มต้นการไหลด้านฐานด้านข้างในแพลตฟอร์มการเพาะเลี้ยงทั้งสองแบบ
ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติที่ผ่านการออกแบบด้วยไมโครวิศวกรรมสามารถวิเคราะห์ได้โดยการใช้รูปแบบการถ่ายภาพต่างๆ รวมถึงกล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟส กล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์การรบกวนแบบดิฟเฟอเรนเชียลอินเตอร์เฟอเรนซ์ (DIC) SEM หรือกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ (รูปที่ 3 และ 4) การถ่ายภาพแบบคอนทราสต์เฟสหรือ DIC สามารถทำได้ง่ายตลอดเวลาในระหว่างการเพาะเลี้ยงเพื่อตรวจสอบรูปร่างและการยื่นออกมาของชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติ เนื่องจากความโปร่งใสทางแสงของ PDMS และฟิล์มโพลีเอสเตอร์ ทั้งแพลตฟอร์มแบบกัท-ออน-อะ-ชิปและแบบไฮบริดจึงสามารถให้การถ่ายภาพในสถานที่แบบเรียลไทม์โดยไม่จำเป็นต้องตัดส่วนหรือถอดประกอบอุปกรณ์ เมื่อทำการถ่ายภาพด้วยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ (รูปที่ 1, 3c, f และ 4b, c) โดยทั่วไปเซลล์จะถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มาลดีไฮด์ (PFA) 4% (น้ำหนักต่อปริมาตร) ตามด้วย Triton X-100 และอัลบูมินในซีรั่มวัว (BSA) 2% (น้ำหนักต่อปริมาตร) ตามลำดับ ขึ้นอยู่กับ สามารถใช้เซลล์ชนิดต่างๆ สารตรึงเซลล์ สารทำให้ซึมผ่านได้ และสารบล็อกเซลล์ได้ แอนติบอดีปฐมภูมิที่กำหนดเป้าหมายที่เครื่องหมายเซลล์หรือภูมิภาคที่ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์นั้นใช้เพื่อเน้นเซลล์ที่เคลื่อนที่ไม่ได้ในตำแหน่งบนชิป ตามด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิพร้อมกับสีย้อมที่กำหนดเป้าหมายที่นิวเคลียส (เช่น อินโดล 4',6-ไดอะมิดิโน-2-ฟีนิลีน) DAPI) หรือเอฟ-แอกติน (เช่น ฟัลโลอิดินที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสง) การถ่ายภาพสดตามการเรืองแสงยังสามารถดำเนินการได้ในตำแหน่งเพื่อตรวจจับการผลิตเมือก (รูปที่ 1 "การแบ่งตัวของเซลล์" และ "สรีรวิทยาของลำไส้") การสุ่มตั้งรกรากของเซลล์จุลินทรีย์ (รูปที่ 1 "การเพาะเลี้ยงร่วมกันระหว่างโฮสต์และจุลินทรีย์") การคัดเลือกเซลล์ภูมิคุ้มกัน (รูปที่ 1 "การสร้างแบบจำลองโรค") หรือโครงร่างของสัณฐานวิทยาของเยื่อบุผิว 3 มิติ (รูปที่ 3c, f และ 4b, c) เมื่อปรับเปลี่ยนลำไส้บนชิปเพื่อแยก ชั้นบนจากชั้นไมโครแชนเนลด้านล่าง ตามที่อธิบายไว้ในเอกสารอ้างอิง ตามที่แสดงในรูปที่ 2 สามารถมองเห็นสัณฐานวิทยาของเยื่อบุผิว 3 มิติ เช่นเดียวกับไมโครวิลลีบนขอบแปรงด้านยอดได้ด้วย SEM (รูปที่ 3b) การแสดงออกของเครื่องหมายการแยกความแตกต่างสามารถประเมินได้โดยการทำ PCR5 เชิงปริมาณหรือการจัดลำดับ RNA ของเซลล์เดี่ยว ในกรณีนี้ ชั้น 3 มิติของเซลล์เยื่อบุผิวที่ปลูกในชิปลำไส้หรือชิปไฮบริดจะถูกเก็บเกี่ยวโดยการทริปซิไนเซชัน จากนั้นจึงนำไปใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางโมเลกุลหรือทางพันธุกรรม
ก. เวิร์กโฟลว์สำหรับการเหนี่ยวนำการสร้างรูปร่างลำไส้ในชิปไฮบริด โพรโทคอลนี้ใช้ Caco-2 และออร์แกนอยด์ลำไส้เพื่อสาธิตการสร้างรูปร่าง 3 มิติในแพลตฟอร์มชิปไฮบริด เซลล์เยื่อบุผิวที่แยกตัวออกจากกันจะถูกเพาะในแผ่น Transwell ที่เตรียมไว้ (การเตรียม TW ดูรูปด้านล่าง) เมื่อเพาะเซลล์แล้ว (เพาะเมล็ด) และแนบกับเมมเบรนโพลีเอสเตอร์ในแผ่น Transwell เซลล์ทั้งหมดจะถูกเพาะเลี้ยงในสภาวะคงที่ (การเพาะเลี้ยง TW) หลังจากผ่านไป 7 วัน แผ่น Transwell แผ่นเดียวที่มีโมโนเลเยอร์ 2 มิติของเซลล์เยื่อบุผิวจะถูกผสมเข้ากับชิปไฮบริดเพื่อแนะนำการไหลเวียนข้างฐาน (Flow, BL) ซึ่งในที่สุดนำไปสู่การสร้างชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติ (การสร้างรูปร่าง) ไมโครกราฟคอนทราสต์เฟสที่แสดงลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลล์เยื่อบุผิวอวัยวะมนุษย์ที่ได้รับจากผู้บริจาคปกติ (สาย C103) ที่ขึ้นลำไส้ใหญ่ในแต่ละขั้นตอนหรือจุดเวลาของการทดลอง แผนผังในชั้นบนแสดงการกำหนดค่าการทดลองสำหรับแต่ละขั้นตอน ชิปไฮบริด (แผนผังด้านซ้าย) สามารถนำไปสู่การสร้างรูปร่างสามมิติของเซลล์เยื่อบุผิว organoid ด้วยมุมมองกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลจากบนลงล่างที่ตำแหน่ง Z ต่างๆ (บน กลาง และล่าง ดูแผนผังด้านขวาและเส้นประที่สอดคล้องกัน) แสดงลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่ชัดเจน เอฟ-แอกติน (สีฟ้าอมเขียว) นิวเคลียส (สีเทา) c ภาพไมโครกราฟคอนโฟคอลเรืองแสง (มุมมอง 3 มิติแบบเอียง) ของเซลล์เยื่อบุผิวที่ได้จาก organoid ที่เพาะเลี้ยงใน Transwell แบบคงที่ (TW; ภาพแทรกภายในกรอบเส้นประสีขาว) เทียบกับชิปไฮบริด (ภาพเต็มขนาดใหญ่ที่สุด) เปรียบเทียบสัณฐานวิทยา 2 มิติกับ 3 มิติตามลำดับ มุมมองตัดขวางแนวตั้ง 2 มิติคู่หนึ่ง (ภาพแทรกที่มุมขวาบน "XZ") แสดงคุณลักษณะ 2 มิติและ 3 มิติด้วย แถบมาตราส่วน 100 µmc พิมพ์ซ้ำโดยได้รับอนุญาตจากแหล่งอ้างอิง 4. Elsevier
สามารถเตรียมการควบคุมได้โดยการเพาะเลี้ยงเซลล์เดียวกัน (Caco-2 หรือเซลล์เยื่อบุผิว organoid ของลำไส้) ในโมโนเลเยอร์สองมิติภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงแบบคงที่แบบธรรมดา ที่น่าสังเกตคือ การสูญเสียสารอาหารอาจเกิดขึ้นเนื่องจากความจุปริมาตรของไมโครแชนเนลที่จำกัด (เช่น ประมาณ 4 µL ในช่องบนสุดของการออกแบบลำไส้เล็กแบบเดิม) ดังนั้น จึงสามารถเปรียบเทียบสัณฐานวิทยาของเยื่อบุผิวก่อนและหลังการใช้การไหลข้างฐานได้เช่นกัน
ขั้นตอนการพิมพ์หินแบบอ่อนควรดำเนินการในห้องปลอดเชื้อ สำหรับแต่ละชั้นบนชิป (ชั้นบนและล่างและเมมเบรน) และชิปไฮบริด จะใช้โฟโตมาสก์ที่แตกต่างกันและผลิตขึ้นบนเวเฟอร์ซิลิกอนแยกกัน เนื่องจากความสูงของไมโครแชนเนลต่างกัน ความสูงเป้าหมายของไมโครแชนเนลด้านบนและด้านล่างของลำไส้บนชิปคือ 500 µm และ 200 µm ตามลำดับ ความสูงเป้าหมายของช่องของชิปไฮบริดคือ 200 µm
วางเวเฟอร์ซิลิโคนขนาด 3 นิ้วลงในจานที่มีอะซิโตน หมุนแผ่นเบาๆ เป็นเวลา 30 วินาที จากนั้นปล่อยให้เวเฟอร์แห้งในอากาศ ย้ายเวเฟอร์ไปที่จานที่มี IPA จากนั้นหมุนแผ่นเป็นเวลา 30 วินาทีเพื่อทำความสะอาด
สามารถใช้สารละลายปิรันย่า (ส่วนผสมของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์และกรดซัลฟิวริกเข้มข้น 1:3 (ปริมาตรต่อปริมาตร)) เพื่อเพิ่มการกำจัดสารตกค้างอินทรีย์ออกจากพื้นผิวเวเฟอร์ซิลิคอนให้ได้มากที่สุด
สารละลายปิรันย่ามีฤทธิ์กัดกร่อนสูงมากและก่อให้เกิดความร้อน จำเป็นต้องมีมาตรการด้านความปลอดภัยเพิ่มเติม สำหรับการกำจัดขยะ ให้ปล่อยให้สารละลายเย็นลงก่อน จากนั้นจึงย้ายไปทิ้งในถังขยะที่สะอาดและแห้ง ใช้ภาชนะรองและติดฉลากถังขยะอย่างถูกต้อง โปรดปฏิบัติตามแนวทางด้านความปลอดภัยของโรงงานสำหรับขั้นตอนโดยละเอียดเพิ่มเติม
ทำให้เวเฟอร์แห้งโดยวางไว้บนแผ่นความร้อน 200 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที หลังจากทำให้แห้งแล้ว ให้เขย่าเวเฟอร์ในอากาศ 5 ครั้งเพื่อให้เย็นลง
เทโฟโตเรซิสต์ SU-8 2100 ประมาณ 10 กรัมลงบนบริเวณตรงกลางของเวเฟอร์ซิลิกอนที่ทำความสะอาดแล้ว ใช้แหนบเกลี่ยโฟโตเรซิสต์ให้ทั่วเวเฟอร์ วางเวเฟอร์บนแผ่นทำความร้อนที่อุณหภูมิ 65°C เป็นครั้งคราวเพื่อให้โฟโตเรซิสต์เหนียวน้อยลงและเกลี่ยได้ง่ายขึ้น อย่าวางเวเฟอร์บนแผ่นทำความร้อนโดยตรง
SU-8 ถูกกระจายอย่างสม่ำเสมอบนเวเฟอร์โดยการเคลือบแบบหมุน โปรแกรมการหมุนเข้าของ SU-8 เป็นเวลา 5–10 วินาที เพื่อแพร่กระจายที่ 500 รอบต่อนาที ด้วยอัตราเร่ง 100 รอบต่อนาที/วินาที ตั้งค่าการหมุนหลักให้มีรูปแบบความหนา 200 µm ที่ 1,500 รอบต่อนาที หรือทำให้ได้ความหนา 250 µm (โดยให้ชั้นบนสุดของลำไส้บนชิปมีความสูง 500 µm โปรดดู "ขั้นตอนสำคัญ" ด้านล่าง) ด้วยอัตราเร่ง 300 รอบต่อนาที/วินาที 30 วินาที ที่ 1,200 รอบต่อนาที
ความเร็วในการหมุนหลักสามารถปรับได้ตามความหนาเป้าหมายของรูปแบบ SU-8 บนเวเฟอร์ซิลิกอน
ในการสร้างรูปแบบ SU-8 ที่มีความสูง 500 µm สำหรับชั้นบนของลำไส้บนชิป ขั้นตอนการปั่นเคลือบและการอบแบบอ่อนของกล่องนี้ (ขั้นตอนที่ 7 และ 8) จะถูกทำซ้ำตามลำดับ (ดูขั้นตอนที่ 9) เพื่อผลิตชั้น SU-8 ที่มีความหนา 250 µm จำนวน 2 ชั้น ซึ่งสามารถทาเป็นชั้นและเชื่อมเข้าด้วยกันโดยการฉายแสง UV ในขั้นตอนที่ 12 ของกล่องนี้ ทำให้ได้ชั้นที่มีความสูง 500 µm
อบเวเฟอร์เคลือบ SU-8 ให้นิ่มโดยวางเวเฟอร์อย่างระมัดระวังบนแผ่นร้อนที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที จากนั้นเปลี่ยนการตั้งค่าเป็น 95 องศาเซลเซียส และฟักต่ออีก 40 นาที
ในการสร้างความสูง 500 μm ของรูปแบบ SU-8 ในไมโครแชนเนลด้านบน ให้ทำซ้ำขั้นตอนที่ 7 และ 8 เพื่อสร้างชั้น SU-8 ที่มีความหนา 250 μm จำนวน 2 ชั้น
ใช้ UV Mask Aligner เพื่อทดสอบหลอดไฟตามคำแนะนำของผู้ผลิตเพื่อคำนวณเวลาการเปิดรับแสงของเวเฟอร์ (เวลาการเปิดรับแสง, มิลลิวินาที) = (ปริมาณการเปิดรับแสง, mJ/cm2)/(กำลังไฟของหลอดไฟ, mW/cm2)
หลังจากกำหนดเวลาการเปิดรับแสงแล้ว ให้วางโฟโตมาส์กไว้บนที่ยึดมาส์กของอุปกรณ์จัดตำแหน่งมาส์ก UV และวางโฟโตมาส์กไว้บนเวเฟอร์เคลือบ SU-8
วางพื้นผิวที่พิมพ์ของโฟโตมาส์กโดยตรงบนด้านเคลือบ SU-8 ของเวเฟอร์ซิลิกอนเพื่อลดการกระจายของรังสี UV ให้เหลือน้อยที่สุด
เปิดรับแสง UV 260 mJ/cm2 บนเวเฟอร์เคลือบ SU-8 และโฟโตมาสก์ในแนวตั้งเป็นเวลาการเปิดรับแสงที่กำหนดไว้ล่วงหน้า (ดูขั้นตอนที่ 10 ของกล่องนี้)
หลังจากได้รับแสง UV แล้ว เวเฟอร์ซิลิกอนเคลือบ SU-8 จะถูกอบที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 5 นาที และ 95°C เป็นเวลา 15 นาทีบนแผ่นร้อนแต่ละแผ่น เพื่อสร้างลวดลายที่มีความสูง 200 µm ขยายเวลาหลังการอบที่อุณหภูมิ 95°C เป็น 30 นาที เพื่อสร้างลวดลายที่มีความสูง 500 µm
เทน้ำยาพัฒนาลงในจานแก้ว จากนั้นจึงนำเวเฟอร์ที่อบแล้ววางลงในจาน ปริมาตรของน้ำยาพัฒนา SU-8 อาจแตกต่างกันไป ขึ้นอยู่กับขนาดของแผ่นแก้ว ตรวจสอบให้แน่ใจว่าคุณใช้น้ำยาพัฒนา SU-8 เพียงพอที่จะขจัด SU-8 ที่ไม่ได้รับแสงออกจนหมด ตัวอย่างเช่น เมื่อใช้จานแก้วขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 150 มม. ที่มีความจุ 1 ลิตร ให้ใช้น้ำยาพัฒนา SU-8 ประมาณ 300 มล. ฉีดน้ำยาพัฒนาแม่พิมพ์เป็นเวลา 25 นาที โดยหมุนเบาๆ เป็นครั้งคราว
ล้างแม่พิมพ์ที่พัฒนาแล้วด้วยน้ำยาพัฒนาใหม่ประมาณ 10 มิลลิลิตร ตามด้วย IPA โดยการฉีดสารละลายโดยใช้ปิเปต
วางเวเฟอร์ลงในเครื่องทำความสะอาดพลาสม่า และสัมผัสกับพลาสม่าออกซิเจน (ก๊าซในบรรยากาศ ความดันเป้าหมาย 1 × 10−5 ทอร์ กำลังไฟ 125 วัตต์) เป็นเวลา 1.5 นาที
วางเวเฟอร์ลงในเครื่องดูดความชื้นแบบสูญญากาศโดยมีแผ่นแก้วอยู่ข้างใน สามารถวางเวเฟอร์และสไลด์เคียงข้างกัน หากเครื่องดูดความชื้นแบบสูญญากาศถูกแบ่งออกเป็นหลายชั้นด้วยแผ่น ให้วางสไลด์ในห้องด้านล่าง และวางเวเฟอร์ในห้องด้านบน หยดสารละลายไตรคลอโร(1H, 1H, 2H, 2H-เพอร์ฟลูออโรอ็อกทิล)ไซเลน ปริมาณ 100 µL ลงบนสไลด์แก้ว แล้วใช้สุญญากาศเพื่อไซลาไนเซชัน
ละลายเซลล์ Caco-2 ที่แช่แข็งในอ่างน้ำ 37°C จากนั้นย้ายเซลล์ที่ละลายแล้วไปยังขวด T75 ที่บรรจุเซลล์ Caco-2 ที่อุ่นไว้แล้ว 37°C จำนวน 15 มล.
เพื่อให้เซลล์ Caco-2 ผ่านได้โดยความเข้มข้นประมาณ 90% ขั้นแรกให้ทำการอุ่นอาหารเลี้ยงเชื้อ Caco-2, PBS และทริปซิน 0.25%/EDTA 1 มิลลิโมลาร์ ในอ่างน้ำอุณหภูมิ 37°C
ดูดตัวกลางโดยใช้การดูดสูญญากาศ ล้างเซลล์สองครั้งด้วย PBS อุ่น 5 มล. โดยการดูดสูญญากาศซ้ำและเติม PBS ใหม่