ขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comเวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)ในระหว่างนี้ เพื่อให้แน่ใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
วิวัฒนาการของปรสิตจุลินทรีย์เกี่ยวข้องกับการต่อต้านระหว่างการคัดเลือกโดยธรรมชาติ ซึ่งทำให้ปรสิตดีขึ้น และการเบี่ยงเบนทางพันธุกรรม ซึ่งทำให้ปรสิตสูญเสียยีนและสะสมการกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายที่นี่ เพื่อทำความเข้าใจว่าปฏิกิริยานี้เกิดขึ้นได้อย่างไรในระดับโมเลกุลขนาดใหญ่เพียงโมเลกุลเดียว เราจึงอธิบายโครงสร้าง cryo-EM ของไรโบโซมของ Encephalitozoon cuniculi ซึ่งเป็นสิ่งมีชีวิตยูคาริโอตที่มีจีโนมที่เล็กที่สุดชนิดหนึ่งในธรรมชาติการลดลงอย่างมากของ rRNA ในไรโบโซม E. cuniculi มาพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่ไม่เคยมีมาก่อน เช่น วิวัฒนาการของตัวเชื่อม rRNA ที่หลอมรวมและ rRNA ที่ไม่รู้จักก่อนหน้านี้โดยไม่มีส่วนนูนนอกจากนี้ ไรโบโซม E. cuniculi รอดชีวิตจากการสูญเสียชิ้นส่วนและโปรตีนของ rRNA โดยการพัฒนาความสามารถในการใช้โมเลกุลขนาดเล็กเป็นการเลียนแบบโครงสร้างของชิ้นส่วนและโปรตีน rRNA ที่เสื่อมโทรมโดยรวมแล้ว เราแสดงให้เห็นว่าโครงสร้างโมเลกุลที่คิดกันมานานว่าจะลดลง เสื่อมลง และอาจมีการกลายพันธุ์ที่ทำให้ร่างกายทรุดโทรมมีกลไกการชดเชยหลายอย่างที่ทำให้พวกมันยังคงทำงานอยู่แม้จะมีการหดตัวของโมเลกุลมากก็ตาม
เนื่องจากกลุ่มปรสิตจุลินทรีย์ส่วนใหญ่มีเครื่องมือระดับโมเลกุลที่ไม่เหมือนใครเพื่อใช้ประโยชน์จากโฮสต์ของพวกมัน เราจึงต้องพัฒนาวิธีการรักษาที่แตกต่างกันสำหรับปรสิตกลุ่มต่างๆ1,2อย่างไรก็ตาม หลักฐานใหม่บ่งชี้ว่าบางแง่มุมของวิวัฒนาการของปรสิตนั้นมาบรรจบกันและสามารถคาดเดาได้ ซึ่งบ่งชี้ถึงพื้นฐานที่เป็นไปได้สำหรับการแทรกแซงการรักษาในวงกว้างในปรสิตจุลินทรีย์3,4,5,6,7,8,9
งานก่อนหน้านี้ได้ระบุแนวโน้มวิวัฒนาการทั่วไปในปรสิตจุลินทรีย์ที่เรียกว่าการลดจีโนมหรือการสลายตัวของจีโนม10,11,12,13การวิจัยปัจจุบันแสดงให้เห็นว่าเมื่อจุลินทรีย์ละทิ้งวิถีชีวิตอิสระและกลายเป็นปรสิตภายในเซลล์ (หรือเอนโดซิมบิออน) จีโนมของพวกมันจะผ่านการเปลี่ยนแปลงที่ช้าแต่น่าทึ่งเป็นเวลาหลายล้านปี9,11ในกระบวนการที่เรียกว่าการสลายตัวของจีโนม ปรสิตของจุลินทรีย์จะสะสมการกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายซึ่งเปลี่ยนยีนที่สำคัญก่อนหน้านี้หลายตัวให้กลายเป็นยีนปลอม ซึ่งนำไปสู่การสูญเสียยีนอย่างค่อยเป็นค่อยไปและการล่มสลายของการกลายพันธุ์การล่มสลายนี้สามารถทำลายยีนได้ถึง 95% ในสิ่งมีชีวิตภายในเซลล์ที่เก่าแก่ที่สุดเมื่อเทียบกับสิ่งมีชีวิตอิสระที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดดังนั้น วิวัฒนาการของปรสิตภายในเซลล์จึงเป็นการชักเย่อระหว่างสองขั้วตรงข้าม นั่นคือ การคัดเลือกโดยธรรมชาติของดาร์วิน ซึ่งนำไปสู่การพัฒนาปรสิต และการล่มสลายของจีโนม ทำให้ปรสิตถูกลืมเลือนไปวิธีที่ปรสิตสามารถโผล่ออกมาจากสงครามชักเย่อนี้และรักษากิจกรรมของโครงสร้างโมเลกุลไว้ได้ยังไม่ชัดเจน
แม้ว่าจะไม่เข้าใจกลไกการสลายตัวของจีโนมอย่างสมบูรณ์ แต่ดูเหมือนว่าจะเกิดขึ้นส่วนใหญ่เนื่องจากการเบี่ยงเบนทางพันธุกรรมบ่อยครั้งเนื่องจากปรสิตอาศัยอยู่ในประชากรขนาดเล็ก ไม่อาศัยเพศ และมีพันธุกรรมจำกัด พวกมันจึงไม่สามารถกำจัดการกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายซึ่งบางครั้งเกิดขึ้นระหว่างการจำลองแบบของดีเอ็นเอได้อย่างมีประสิทธิภาพสิ่งนี้นำไปสู่การสะสมของการกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายและการลดลงของจีโนมของปรสิตที่ไม่สามารถย้อนกลับได้เป็นผลให้ปรสิตไม่เพียงสูญเสียยีนที่ไม่จำเป็นต่อการอยู่รอดในสภาพแวดล้อมภายในเซลล์เท่านั้นการที่ประชากรปรสิตไม่สามารถกำจัดการกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายเป็นระยะๆ ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ซึ่งทำให้การกลายพันธุ์เหล่านี้สะสมไปทั่วจีโนม รวมถึงยีนที่สำคัญที่สุดของพวกมันด้วย
ความเข้าใจส่วนใหญ่ในปัจจุบันของเราเกี่ยวกับการลดขนาดจีโนมขึ้นอยู่กับการเปรียบเทียบลำดับจีโนมเท่านั้น โดยไม่สนใจการเปลี่ยนแปลงของโมเลกุลจริงที่ทำหน้าที่ดูแลทำความสะอาดและทำหน้าที่เป็นเป้าหมายของยาที่มีศักยภาพการศึกษาเปรียบเทียบแสดงให้เห็นว่าภาระของการกลายพันธุ์ของจุลินทรีย์ภายในเซลล์ที่เป็นอันตรายดูเหมือนจะจูงใจให้โปรตีนและกรดนิวคลีอิกจับตัวกันผิดที่ ทำให้พวกมันต้องพึ่งพาอาศัยกันมากขึ้นและไวต่อความร้อนนอกจากนี้ ปรสิตหลายชนิด—วิวัฒนาการอิสระบางครั้งแยกจากกันมากถึง 2.5 พันล้านปี—ประสบกับการสูญเสียศูนย์ควบคุมคุณภาพที่คล้ายคลึงกันในการสังเคราะห์โปรตีน 5,6 และกลไกการซ่อมแซม DNA24อย่างไรก็ตาม ไม่ค่อยมีใครรู้เกี่ยวกับผลกระทบของวิถีชีวิตภายในเซลล์ต่อคุณสมบัติอื่นๆ ทั้งหมดของโมเลกุลขนาดใหญ่ของเซลล์ รวมถึงการปรับตัวของโมเลกุลต่อภาระที่เพิ่มขึ้นของการกลายพันธุ์ที่เป็นอันตราย
ในงานนี้ เพื่อให้เข้าใจวิวัฒนาการของโปรตีนและกรดนิวคลีอิกของจุลินทรีย์ในเซลล์ได้ดียิ่งขึ้น เราได้พิจารณาโครงสร้างของไรโบโซมของปรสิตในเซลล์ Encephalitozoon cuniculiE. cuniculi เป็นสิ่งมีชีวิตที่มีลักษณะคล้ายเชื้อราซึ่งอยู่ในกลุ่มของปรสิต microsporidia ที่มีจีโนมยูคาริโอตขนาดเล็กผิดปกติ ดังนั้นจึงใช้เป็นสิ่งมีชีวิตจำลองเพื่อศึกษาการสลายตัวของจีโนมเมื่อเร็ว ๆ นี้ โครงสร้างไรโบโซมของ cryo-EM ถูกกำหนดสำหรับจีโนมที่ลดลงในระดับปานกลางของ Microsporidia, Paranosema locustae และ Vairimorpha necatrix31,32 (จีโนมประมาณ 3.2 Mb)โครงสร้างเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการสูญเสียการขยาย rRNA บางส่วนได้รับการชดเชยโดยการพัฒนาของการติดต่อใหม่ระหว่างโปรตีนไรโบโซมที่อยู่ใกล้เคียงหรือการได้รับโปรตีนไรโบโซม msL131,32 ใหม่สปีชีส์ Encephalitozoon (จีโนมประมาณ 2.5 ล้าน bp) พร้อมด้วย Ordospora ญาติที่ใกล้เคียงที่สุด แสดงให้เห็นถึงการลดขนาดจีโนมในยูคารีโอตในระดับสูงสุด - พวกมันมียีนเข้ารหัสโปรตีนน้อยกว่า 2,000 ยีน และคาดว่าไรโบโซมของพวกมันไม่เพียงแต่ปราศจากชิ้นส่วนขยาย rRNA เท่านั้น (ชิ้นส่วน rRNA ที่แยกแยะไรโบโซมยูคาริโอตจากไรโบโซมของแบคทีเรีย) ยังมีโปรตีนไรโบโซมสี่ชนิดเนื่องจากขาดองค์ประกอบที่คล้ายคลึงกัน ในจีโนมของ E. cuniculi26,27,28ดังนั้นเราจึงสรุปได้ว่าไรโบโซมของ E. cuniculi สามารถเปิดเผยกลยุทธ์ที่ไม่รู้จักก่อนหน้านี้สำหรับการปรับตัวระดับโมเลกุลต่อการสลายตัวของจีโนม
โครงสร้าง cryo-EM ของเราแสดงถึงไรโบโซมไซโตพลาสซึมของยูคาริโอตที่เล็กที่สุดที่จะระบุลักษณะเฉพาะและให้ข้อมูลเชิงลึกว่าการลดขนาดจีโนมในระดับสูงสุดส่งผลต่อโครงสร้าง การประกอบ และวิวัฒนาการของเครื่องจักรระดับโมเลกุลที่เป็นส่วนประกอบสำคัญของเซลล์อย่างไรเราพบว่าไรโบโซมของ E. cuniculi ละเมิดหลักการพับอาร์เอ็นเอและการสร้างไรโบโซมที่อนุรักษ์ไว้อย่างแพร่หลาย และค้นพบโปรตีนไรโบโซมชนิดใหม่ที่ไม่รู้จักมาก่อนเราแสดงให้เห็นว่าไรโบโซม microsporidia ได้พัฒนาความสามารถในการจับโมเลกุลขนาดเล็ก และตั้งสมมติฐานว่าการตัดทอนใน rRNA และโปรตีนทำให้เกิดนวัตกรรมทางวิวัฒนาการที่อาจให้คุณสมบัติที่มีประโยชน์แก่ไรโบโซมในท้ายที่สุด
เพื่อปรับปรุงความเข้าใจของเราเกี่ยวกับวิวัฒนาการของโปรตีนและกรดนิวคลีอิกในสิ่งมีชีวิตภายในเซลล์ เราตัดสินใจแยกสปอร์ของ E. cuniculi ออกจากเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่ติดเชื้อเพื่อทำให้ไรโบโซมบริสุทธิ์และกำหนดโครงสร้างของไรโบโซมเหล่านี้เป็นการยากที่จะได้รับ microsporidia ปรสิตจำนวนมากเนื่องจากไม่สามารถเพาะเลี้ยง microsporidia ในอาหารเลี้ยงเชื้อได้แต่จะเติบโตและแพร่พันธุ์ภายในเซลล์เจ้าบ้านเท่านั้นดังนั้น เพื่อให้ได้มวลชีวภาพของ E. cuniculi สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ด้วยไรโบโซม เราจึงติดเชื้อเซลล์ไตของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม RK13 ด้วยสปอร์ของ E. cuniculi และเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ติดเชื้อเหล่านี้เป็นเวลาหลายสัปดาห์เพื่อให้ E. cuniculi เติบโตและเพิ่มจำนวนการใช้ชั้นเซลล์เดียวที่ติดเชื้อขนาดประมาณครึ่งตารางเมตร เราสามารถทำให้สปอร์ของ Microsporidia ประมาณ 300 มก. บริสุทธิ์และใช้มันเพื่อแยกไรโบโซมได้จากนั้นเราทำลายสปอร์ที่บริสุทธิ์ด้วยเม็ดแก้วและแยกไรโบโซมดิบออกโดยใช้การแยกส่วนของโพลีเอทิลีนไกลคอลแบบขั้นตอนของไลเซทสิ่งนี้ทำให้เราได้รับไรโบโซม E. cuniculi ดิบประมาณ 300 µg สำหรับการวิเคราะห์โครงสร้าง
จากนั้นเรารวบรวมภาพ cryo-EM โดยใช้ตัวอย่างไรโบโซมที่ได้ และประมวลผลภาพเหล่านี้โดยใช้มาสก์ที่สอดคล้องกับหน่วยย่อยของไรโบโซมขนาดใหญ่ หัวของหน่วยย่อยขนาดเล็ก และหน่วยย่อยขนาดเล็กในระหว่างขั้นตอนนี้ เรารวบรวมภาพของอนุภาคไรโบโซมประมาณ 108,000 ภาพและคำนวณภาพ cryo-EM ที่มีความละเอียด 2.7 Å (รูปที่ 1-3 เพิ่มเติม)จากนั้นเราใช้ภาพ cryoEM เพื่อสร้างแบบจำลอง rRNA โปรตีนไรโบโซม และปัจจัยการจำศีล Mdf1 ที่เกี่ยวข้องกับไรโบโซม E. cuniculi (รูปที่ 1a, b)
โครงสร้างของไรโบโซม E. cuniculi ในเชิงซ้อนที่มีปัจจัยการจำศีล Mdf1 (pdb id 7QEP)b แผนที่ของปัจจัยการจำศีล Mdf1 ที่เกี่ยวข้องกับไรโบโซม E. cuniculic แผนที่โครงสร้างรองเปรียบเทียบ rRNA ที่กู้คืนในสปีชีส์ Microsporidian กับโครงสร้างไรโบโซมที่รู้จักแผงแสดงตำแหน่งของชิ้นส่วน rRNA ที่ถูกขยาย (ES) และไรโบโซมแอคทีฟไซต์ ซึ่งรวมถึงตำแหน่งการถอดรหัส (DC) ซาร์ซินิซินลูป (SRL) และเปปติดิลทรานสเฟอร์เนสเซ็นเตอร์ (PTC)d ความหนาแน่นของอิเล็กตรอนที่สอดคล้องกับจุดศูนย์กลางเปปติดิลทรานสเฟอร์เรสของไรโบโซม E. cuniculi แสดงว่าตำแหน่งตัวเร่งปฏิกิริยานี้มีโครงสร้างเดียวกันในปรสิต E. cuniculi และโฮสต์ของมัน รวมทั้ง H. sapiense, f ความหนาแน่นของอิเล็กตรอนที่สอดคล้องกันของศูนย์ถอดรหัส (e) และโครงสร้างแผนผังของศูนย์ถอดรหัส (f) บ่งชี้ว่า E. cuniculi มีสารตกค้าง U1491 แทนที่จะเป็น A1491 (การระบุหมายเลข E. coli) ในยูคาริโอตอื่นๆ จำนวนมากการเปลี่ยนแปลงนี้ชี้ให้เห็นว่า E. cuniculi อาจมีความไวต่อยาปฏิชีวนะที่กำหนดเป้าหมายไปยังไซต์ที่ใช้งานอยู่นี้
ตรงกันข้ามกับโครงสร้างของไรโบโซม V. necatrix และ P. locustae ที่สร้างขึ้นก่อนหน้านี้ (โครงสร้างทั้งสองเป็นตัวแทนของ Nosematidae ตระกูล microsporidia เดียวกันและคล้ายกันมาก) ไรโบโซม E. cuniculi 31,32 ตัวผ่านกระบวนการต่างๆ มากมายของ rRNA และการแยกส่วนของโปรตีนการสูญเสียสภาพธรรมชาติเพิ่มเติม (รูปที่ 4-6 เพิ่มเติม)ใน rRNA การเปลี่ยนแปลงที่โดดเด่นที่สุดนั้นรวมถึงการสูญเสียที่สมบูรณ์ของชิ้นส่วน ES12L 25S rRNA ที่ขยายและการเสื่อมสภาพบางส่วนของ h39, h41 และ H18 helices (รูปที่ 1c, รูปที่ 4 เพิ่มเติม)ในบรรดาโปรตีนไรโบโซม การเปลี่ยนแปลงที่โดดเด่นที่สุด ได้แก่ การสูญเสียโปรตีน eS30 และการทำให้โปรตีน eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 และ eS7 สั้นลง (รูปที่ 4, 5)
ดังนั้นการลดลงอย่างมากของจีโนมของ Encephalotozoon/Ordospora จึงสะท้อนให้เห็นในโครงสร้างไรโบโซมของพวกมัน: ไรโบโซม E. cuniculi ประสบกับการสูญเสียปริมาณโปรตีนอย่างมากที่สุดในไรโบโซมไซโตพลาสซึมของยูคาริโอตซึ่งขึ้นอยู่กับลักษณะโครงสร้าง และไม่มีแม้แต่ rRNA และชิ้นส่วนโปรตีนเหล่านั้นที่อนุรักษ์อย่างกว้างขวางไม่เฉพาะในยูคาริโอตเท่านั้น แต่ยังอยู่ในสามโดเมนของชีวิตด้วยโครงสร้างของไรโบโซม E. cuniculi ให้แบบจำลองโมเลกุลตัวแรกสำหรับการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ และเผยให้เห็นเหตุการณ์วิวัฒนาการที่ถูกมองข้ามโดยทั้งจีโนมเปรียบเทียบและการศึกษาโครงสร้างชีวโมเลกุลภายในเซลล์ (รูปที่ 7 เพิ่มเติม)ด้านล่างนี้ เราจะอธิบายแต่ละเหตุการณ์เหล่านี้พร้อมกับต้นกำเนิดวิวัฒนาการที่เป็นไปได้และผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นต่อการทำงานของไรโบโซม
จากนั้นเราพบว่านอกเหนือจากการตัดปลาย rRNA ขนาดใหญ่แล้ว ไรโบโซมของ E. cuniculi ยังมีการแปรผันของ rRNA ที่ไซต์ที่ใช้งานอยู่แห่งหนึ่งแม้ว่าศูนย์กลางของเปปติดิลทรานสเฟอเรสของไรโบโซม E. cuniculi จะมีโครงสร้างเหมือนกับยูคาริโอตไรโบโซมอื่นๆ (รูปที่ 1d) แต่ศูนย์กลางการถอดรหัสนั้นแตกต่างกันเนื่องจากการแปรผันของลำดับที่นิวคลีโอไทด์ 1491 (การกำหนดหมายเลข E. coli, รูปที่ 1e, f)ข้อสังเกตนี้มีความสำคัญเนื่องจากตำแหน่งการถอดรหัสของยูคาริโอตไรโบโซมโดยทั่วไปประกอบด้วยสารตกค้าง G1408 และ A1491 เมื่อเทียบกับสารตกค้างประเภทแบคทีเรีย A1408 และ G1491การเปลี่ยนแปลงนี้ขึ้นอยู่กับความไวที่แตกต่างกันของไรโบโซมของแบคทีเรียและยูคาริโอตต่อกลุ่มยาปฏิชีวนะไรโบโซมของตระกูลอะมิโนไกลโคไซด์และโมเลกุลขนาดเล็กอื่น ๆ ที่กำหนดเป้าหมายไปยังไซต์ถอดรหัสที่ตำแหน่งการถอดรหัสของไรโบโซม E. cuniculi สารตกค้าง A1491 ถูกแทนที่ด้วย U1491 ซึ่งอาจสร้างส่วนต่อประสานการจับที่ไม่เหมือนใครสำหรับโมเลกุลขนาดเล็กที่กำหนดเป้าหมายไปยังตำแหน่งที่ทำงานอยู่นี้ตัวแปร A14901 เดียวกันนี้ยังมีอยู่ใน microsporidia อื่น ๆ เช่น P. locustae และ V. necatrix ซึ่งบ่งชี้ว่ามันแพร่หลายในหมู่ microsporidia สปีชีส์ (รูปที่ 1f)
เนื่องจากตัวอย่างไรโบโซม E. cuniculi ของเราถูกแยกได้จากสปอร์ที่ไม่ใช้งานทางเมแทบอลิซึม เราจึงทดสอบแผนที่ cryo-EM ของ E. cuniculi สำหรับการจับไรโบโซมที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ภายใต้สภาวะความเครียดหรือความอดอยากปัจจัยการจำศีล 31,32,36,37, 38 เราจับคู่โครงสร้างของไรโบโซมที่จำศีลกับแผนที่ cryo-EM ของไรโบโซม E. cuniculi ที่สร้างไว้ก่อนหน้านี้สำหรับการเชื่อมต่อ ไรโบโซม S. cerevisiae ถูกนำมาใช้ในคอมเพล็กซ์ที่มีปัจจัยจำศีล Stm138, ไรโบโซมตั๊กแตนที่ซับซ้อนด้วยปัจจัย Lso232 และไรโบโซม V. necatrix ในคอมเพล็กซ์ที่มีปัจจัย Mdf1 และ Mdf231ในเวลาเดียวกัน เราพบความหนาแน่นของ cryo-EM ที่สอดคล้องกับปัจจัยส่วนที่เหลือ Mdf1เช่นเดียวกับ Mdf1 ที่จับกับไรโบโซม V. necatrix Mdf1 ยังจับกับไรโบโซม E. cuniculi ซึ่งมันไปบล็อกตำแหน่ง E ของไรโบโซม ซึ่งอาจช่วยทำให้ไรโบโซมพร้อมใช้งานเมื่อสปอร์ของปรสิตกลายเป็นเมแทบอลิซึมเมื่อร่างกายหยุดทำงาน (รูปที่ 2)).
Mdf1 บล็อกตำแหน่ง E ของไรโบโซม ซึ่งดูเหมือนจะช่วยยับยั้งการทำงานของไรโบโซมเมื่อสปอร์ของปรสิตไม่ใช้งานเมแทบอลิซึมในโครงสร้างของไรโบโซม E. cuniculi เราพบว่า Mdf1 ก่อให้เกิดการสัมผัสที่ไม่รู้จักมาก่อนกับลำต้นของไรโบโซม L1 ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของไรโบโซมที่อำนวยความสะดวกในการปลดปล่อย tRNA ที่สลายตัวออกจากไรโบโซมระหว่างการสังเคราะห์โปรตีนการสัมผัสเหล่านี้แนะนำว่า Mdf1 แยกตัวออกจากไรโบโซมโดยใช้กลไกเดียวกับ tRNA ที่ deacetylated ซึ่งให้คำอธิบายที่เป็นไปได้ว่าไรโบโซมกำจัด Mdf1 เพื่อกระตุ้นการสังเคราะห์โปรตีนอีกครั้งได้อย่างไร
อย่างไรก็ตาม โครงสร้างของเราเผยให้เห็นการสัมผัสที่ไม่รู้จักระหว่าง Mdf1 และขาไรโบโซม L1 (ส่วนของไรโบโซมที่ช่วยปลดปล่อย tRNA ที่สลายตัวออกจากไรโบโซมระหว่างการสังเคราะห์โปรตีน)โดยเฉพาะอย่างยิ่ง Mdf1 ใช้หน้าสัมผัสเดียวกันกับส่วนข้อศอกของโมเลกุล tRNA ที่สลายตัว (รูปที่ 2)การสร้างแบบจำลองโมเลกุลที่ไม่รู้จักก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า Mdf1 แยกตัวออกจากไรโบโซมโดยใช้กลไกเดียวกันกับ tRNA ที่ deacetylated ซึ่งจะอธิบายวิธีที่ไรโบโซมกำจัดปัจจัยการจำศีลนี้เพื่อเปิดใช้งานการสังเคราะห์โปรตีนอีกครั้ง
เมื่อสร้างแบบจำลอง rRNA เราพบว่าไรโบโซม E. cuniculi มีชิ้นส่วน rRNA ที่พับอย่างผิดปกติ ซึ่งเราเรียกว่า fused rRNA (รูปที่ 3)ในไรโบโซมที่ครอบคลุมโดเมนทั้งสามของสิ่งมีชีวิต rRNA จะพับเป็นโครงสร้างซึ่ง rRNA ส่วนใหญ่จะจับคู่เบสและพับเข้าหากันหรือมีปฏิสัมพันธ์กับโปรตีนไรโบโซม38,39,40อย่างไรก็ตาม ในไรโบโซมของ E. cuniculi rRNA ดูเหมือนจะละเมิดหลักการพับนี้โดยการแปลงเอนริเก้บางส่วนให้เป็นบริเวณ rRNA ที่กางออก
โครงสร้างของ H18 25S rRNA helix ใน S. cerevisiae, V. necatrix และ E. cuniculiโดยปกติแล้ว ในไรโบโซมซึ่งครอบคลุมโดเมนชีวิตทั้งสาม ลิงเกอร์นี้จะขดเป็นเกลียว RNA ที่ประกอบด้วยสารตกค้าง 24 ถึง 34 ตัวในทางตรงกันข้าม ใน Microsporidia ตัวเชื่อมโยง rRNA นี้จะค่อยๆ ลดขนาดลงเหลือตัวเชื่อมโยงที่มียูริดีนเป็นสายเดี่ยว 2 ตัวที่มีสารตกค้างเพียง 12 ตัวสารตกค้างเหล่านี้ส่วนใหญ่สัมผัสกับตัวทำละลายรูปแสดงให้เห็นว่า microsporidia ปรสิตดูเหมือนจะละเมิดหลักการทั่วไปของการพับ rRNA โดยที่ฐาน rRNA มักจะเชื่อมต่อกับฐานอื่นหรือเกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาระหว่าง rRNA-โปรตีนในไมโครสปอริเดีย ชิ้นส่วน rRNA บางส่วนเกิดการพับที่ไม่เอื้ออำนวย ซึ่ง rRNA helix เดิมกลายเป็นชิ้นส่วนที่มีเกลียวเดี่ยวยาวเกือบเป็นเส้นตรงการมีอยู่ของบริเวณที่ผิดปกติเหล่านี้ช่วยให้ microsporidia rRNA สามารถผูกชิ้นส่วน rRNA ที่อยู่ห่างไกลได้โดยใช้ฐาน RNA จำนวนน้อยที่สุด
ตัวอย่างที่โดดเด่นที่สุดของการเปลี่ยนแปลงทางวิวัฒนาการนี้สามารถสังเกตได้ใน H18 25S rRNA helix (รูปที่ 3)ในสปีชีส์ตั้งแต่ E. coli ไปจนถึงมนุษย์ ฐานของ rRNA helix นี้ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ 24-32 นิวคลีโอไทด์ ก่อตัวเป็นเกลียวที่ไม่สม่ำเสมอเล็กน้อยในโครงสร้างไรโบโซมที่ระบุก่อนหน้านี้จาก V. necatrix และ P. locustae31,32 ฐานของเกลียว H18 นั้นไม่ได้ขดบางส่วน แต่การจับคู่ฐานของนิวคลีโอไทด์นั้นยังคงอยู่อย่างไรก็ตาม ใน E. cuniculi ชิ้นส่วน rRNA นี้กลายเป็นตัวเชื่อมที่สั้นที่สุด 228UUUGU232 และ 301UUUUUUUUUU307ซึ่งแตกต่างจากชิ้นส่วน rRNA ทั่วไป ตัวเชื่อมโยงที่อุดมด้วยยูริดีนเหล่านี้ไม่ขดหรือสัมผัสกับโปรตีนไรโบโซมอย่างกว้างขวางแต่ใช้โครงสร้างที่เปิดด้วยตัวทำละลายและกางออกจนสุด ซึ่งสาย rRNA นั้นยืดออกเกือบเป็นเส้นตรงโครงสร้างที่ยืดออกนี้อธิบายว่า E. cuniculi ใช้ฐาน RNA เพียง 12 ฐานเพื่อเติมช่องว่าง 33 Å ระหว่าง H16 และ H18 rRNA helices ในขณะที่สปีชีส์อื่นต้องการฐาน rRNA อย่างน้อยสองเท่าเพื่อเติมเต็มช่องว่าง
ดังนั้นเราจึงสามารถแสดงให้เห็นว่า ไมโครสปอริเดียปรสิตได้พัฒนากลยุทธ์ในการหดตัวแม้แต่ส่วน rRNA เหล่านั้นที่ยังคงอนุรักษ์ในวงกว้างข้ามสปีชีส์ในสามโดเมนของชีวิตเห็นได้ชัดว่าโดยการสะสมการกลายพันธุ์ที่เปลี่ยน rRNA helices ให้เป็น poly-U linkers สั้น ๆ E. cuniculi สามารถสร้างชิ้นส่วน rRNA ที่ผิดปกติซึ่งมีนิวคลีโอไทด์น้อยที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้สำหรับการ ligation ของชิ้นส่วน rRNA ที่อยู่ไกลออกไปสิ่งนี้ช่วยอธิบายได้ว่า microsporidia ประสบความสำเร็จในการลดโครงสร้างโมเลกุลพื้นฐานลงอย่างมากโดยไม่สูญเสียความสมบูรณ์ของโครงสร้างและหน้าที่ไปได้อย่างไร
คุณสมบัติที่ผิดปกติอีกอย่างของ E. cuniculi rRNA คือลักษณะของ rRNA ที่ไม่มีความหนา (รูปที่ 4)ส่วนนูนเป็นนิวคลีโอไทด์ที่ไม่มีคู่เบสที่บิดออกจากเกลียว RNA แทนที่จะซ่อนอยู่ในนั้นส่วนยื่นออกมาของ rRNA ส่วนใหญ่ทำหน้าที่เป็นกาวโมเลกุล ช่วยยึดเกาะโปรตีนไรโบโซมที่อยู่ติดกันหรือชิ้นส่วน rRNA อื่นๆส่วนนูนบางส่วนทำหน้าที่เป็นบานพับ ทำให้ rRNA helix สามารถงอและพับได้อย่างเหมาะสมที่สุดสำหรับการสังเคราะห์โปรตีนที่มีประสิทธิผล 41
a การยื่นออกมาของ rRNA (การกำหนดหมายเลข S. cerevisiae) ไม่มีอยู่ในโครงสร้างไรโบโซมของ E. cuniculi แต่มีอยู่ในไรโบโซมยูคาริโอตอื่นๆ ส่วนใหญ่ เช่น E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens และไรโบโซมภายในของ E. cuniculiปรสิตขาดส่วนนูน rRNA โบราณจำนวนมากที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างดีความหนาเหล่านี้ทำให้โครงสร้างไรโบโซมคงตัวดังนั้นการไม่มีอยู่ใน microsporidia บ่งชี้ถึงความเสถียรที่ลดลงของการพับ rRNA ในปรสิต microsporidiaการเปรียบเทียบกับลำต้น P (ลำต้น L7/L12 ในแบคทีเรีย) แสดงให้เห็นว่าการสูญเสียการกระแทกของ rRNA บางครั้งเกิดขึ้นพร้อมกับการปรากฏตัวของการกระแทกใหม่ถัดจากการกระแทกที่หายไปH42 helix ใน 23S/28S rRNA มีส่วนนูนแบบโบราณ (U1206 ใน Saccharomyces cerevisiae) ซึ่งคาดว่าจะมีอายุอย่างน้อย 3.5 พันล้านปีเนื่องจากการป้องกันในสามโดเมนของสิ่งมีชีวิตใน microsporidia รอยนูนนี้จะถูกกำจัดออกไปอย่างไรก็ตาม โป่งใหม่ปรากฏขึ้นถัดจากโป่งที่หายไป (A1306 ใน E. cuniculi)
เราพบว่าไรโบโซมของ E. cuniculi ไม่มีส่วนนูนของ rRNA ส่วนใหญ่ที่พบในสปีชีส์อื่น รวมถึงมากกว่า 30 ส่วนนูนที่อนุรักษ์ไว้ในยูคาริโอตอื่นๆ (รูปที่ 4a)การสูญเสียนี้กำจัดการสัมผัสจำนวนมากระหว่างหน่วยย่อยของไรโบโซมและเอนริเก้ rRNA ที่อยู่ติดกัน บางครั้งทำให้เกิดโพรงกลวงขนาดใหญ่ภายในไรโบโซม ทำให้ไรโบโซม E. cuniculi มีรูพรุนมากกว่าเมื่อเทียบกับไรโบโซมแบบดั้งเดิม (รูปที่ 4b)โดยเฉพาะอย่างยิ่งเราพบว่าส่วนนูนเหล่านี้ส่วนใหญ่หายไปในโครงสร้างไรโบโซมของ V. necatrix และ P. locustae ที่ระบุก่อนหน้านี้ ซึ่งถูกมองข้ามโดยการวิเคราะห์โครงสร้างก่อนหน้านี้
บางครั้งการสูญเสีย rRNA นูนจะมาพร้อมกับการพัฒนาของนูนใหม่ถัดจากส่วนนูนที่หายไปตัวอย่างเช่น ไรโบโซม P-stem มีส่วนนูน U1208 (ใน Saccharomyces cerevisiae) ที่รอดชีวิตจากเชื้อ E. coli สู่มนุษย์ จึงคาดว่ามีอายุ 3.5 พันล้านปีในระหว่างการสังเคราะห์โปรตีน ส่วนนูนนี้ช่วยให้ P stem เคลื่อนที่ไปมาระหว่างโครงสร้างแบบเปิดและแบบปิด เพื่อให้ไรโบโซมสามารถรับปัจจัยการแปลและส่งไปยังไซต์ที่ใช้งานอยู่ในไรโบโซมของ E. cuniculi จะไม่มีความหนานี้อย่างไรก็ตามความหนาใหม่ (G883) ที่อยู่ในคู่เบสสามคู่เท่านั้นสามารถนำไปสู่การคืนค่าความยืดหยุ่นที่เหมาะสมที่สุดของ P stem (รูปที่ 4c)
ข้อมูลของเราเกี่ยวกับ rRNA ที่ไม่มีส่วนนูนแนะนำว่าการลดขนาด rRNA นั้นไม่ได้จำกัดเพียงการสูญเสียองค์ประกอบ rRNA บนพื้นผิวของไรโบโซมเท่านั้น แต่อาจเกี่ยวข้องกับนิวเคลียสของไรโบโซม ทำให้เกิดข้อบกพร่องระดับโมเลกุลเฉพาะของปรสิตที่ไม่ได้อธิบายไว้ในเซลล์ที่มีชีวิตอิสระมีการสังเกตสิ่งมีชีวิต
หลังจากสร้างแบบจำลองโปรตีนไรโบโซมตามรูปแบบมาตรฐานและ rRNA เราพบว่าส่วนประกอบของไรโบโซมทั่วไปไม่สามารถอธิบายทั้งสามส่วนของภาพ Cryo-EM ได้ชิ้นส่วนสองชิ้นนี้มีขนาดโมเลกุลเล็ก (รูปที่ 5, รูปที่ 8 เพิ่มเติม)ส่วนแรกประกบระหว่างโปรตีนไรโบโซม uL15 และ eL18 ในตำแหน่งที่มักจะครอบครองโดยปลาย C ของ eL18 ซึ่งย่อมาจาก E. cuniculiแม้ว่าเราจะไม่สามารถระบุตัวตนของโมเลกุลนี้ได้ แต่ขนาดและรูปร่างของเกาะความหนาแน่นนี้ก็อธิบายได้อย่างดีจากการมีอยู่ของโมเลกุลสเปิร์มมิดีนการจับกับไรโบโซมนั้นเสถียรโดยการกลายพันธุ์ที่จำเพาะต่อไมโครสปอริเดียในโปรตีน uL15 (Asp51 และ Arg56) ซึ่งดูเหมือนจะเพิ่มความสัมพันธ์ของไรโบโซมสำหรับโมเลกุลขนาดเล็กนี้ เนื่องจากทำให้ uL15 ห่อหุ้มโมเลกุลขนาดเล็กไว้ในโครงสร้างไรโบโซมรูปที่ 2 เพิ่มเติม)8, ข้อมูลเพิ่มเติม 1, 2).
การถ่ายภาพ Cryo-EM แสดงการมีอยู่ของนิวคลีโอไทด์นอกไรโบสที่จับกับไรโบโซม E. cuniculiในไรโบโซม E. cuniculi นิวคลีโอไทด์นี้อยู่ในตำแหน่งเดียวกับนิวคลีโอไทด์ 25S rRNA A3186 (Saccharomyces cerevisiae numbering) ในไรโบโซมยูคาริโอตอื่นๆ ส่วนใหญ่b ในโครงสร้างไรโบโซมของ E. cuniculi นิวคลีโอไทด์นี้ตั้งอยู่ระหว่างไรโบโซมโปรตีน uL9 และ eL20 ซึ่งจะทำให้การสัมผัสระหว่างโปรตีนทั้งสองมีความเสถียรการวิเคราะห์การอนุรักษ์ลำดับ cd eL20 ในบรรดาสปีชีส์ microsporidiaต้นไม้สายวิวัฒนาการของสปีชีส์ Microsporidia (c) และการจัดเรียงหลายลำดับของโปรตีน eL20 (d) แสดงให้เห็นว่าสารตกค้างที่จับกับนิวคลีโอไทด์ F170 และ K172 ได้รับการอนุรักษ์ใน Microsporidia ทั่วไปส่วนใหญ่ ยกเว้น S. lophii ยกเว้น Microsporidia ที่แตกกิ่งก้านสาขาในช่วงต้น ซึ่งยังคงไว้ซึ่งส่วนขยาย ES39L rRNAe รูปนี้แสดงให้เห็นว่าสารตกค้างที่จับกับนิวคลีโอไทด์ F170 และ K172 มีอยู่ใน eL20 ของจีโนม microsporidia ที่ลดลงอย่างมากเท่านั้น แต่ไม่มีในยูคาริโอตอื่นๆโดยรวมแล้ว ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าไมโครสปอริเดียนไรโบโซมได้พัฒนาตำแหน่งจับนิวคลีโอไทด์ที่ดูเหมือนจะจับโมเลกุลของ AMP และใช้พวกมันเพื่อทำให้ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีนเสถียรในโครงสร้างไรโบโซมการอนุรักษ์ไซต์ที่มีผลผูกพันนี้ใน Microsporidia สูงและไม่มีอยู่ในยูคาริโอตอื่น ๆ แสดงให้เห็นว่าไซต์นี้อาจให้ข้อได้เปรียบในการอยู่รอดแบบคัดเลือกสำหรับ Microsporidiaดังนั้น กระเป๋าที่จับกับนิวคลีโอไทด์ในไมโครสปอริเดียไรโบโซมดูเหมือนจะไม่ใช่คุณลักษณะที่เสื่อมลงหรือรูปแบบสุดท้ายของการสลายตัวของ rRNA ดังที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ แต่เป็นนวัตกรรมเชิงวิวัฒนาการที่เป็นประโยชน์ที่ช่วยให้ไมโครสปอริเดียไรโบโซมสามารถจับโมเลกุลขนาดเล็กได้โดยตรง โดยใช้พวกมันเป็นหน่วยการสร้างโมเลกุลหน่วยการสร้างสำหรับไรโบโซมการค้นพบนี้ทำให้ไมโครสปอริเดียไรโบโซมเป็นไรโบโซมชนิดเดียวที่ทราบว่าใช้นิวคลีโอไทด์เดี่ยวเป็นโครงสร้างหลักf เส้นทางวิวัฒนาการสมมุติฐานที่ได้มาจากการจับนิวคลีโอไทด์
ความหนาแน่นของน้ำหนักโมเลกุลต่ำที่สองอยู่ที่ส่วนต่อประสานระหว่างโปรตีนไรโบโซม uL9 และ eL30 (รูปที่ 5a)อินเทอร์เฟซนี้เคยอธิบายไว้ในโครงสร้างของไรโบโซม Saccharomyces cerevisiae ซึ่งเป็นตำแหน่งที่จับสำหรับนิวคลีโอไทด์ 25S ของ rRNA A3186 (ส่วนหนึ่งของส่วนขยาย ES39L rRNA)38แสดงให้เห็นว่าในไรโบโซมของ P. locustae ES39L ที่เสื่อมลง ส่วนต่อประสานนี้จับกับนิวคลีโอไทด์เดี่ยว 31 ที่ไม่รู้จัก และสันนิษฐานว่านิวคลีโอไทด์นี้เป็นรูปแบบสุดท้ายที่ลดลงของ rRNA ซึ่งความยาวของ rRNA คือ ~130-230 เบสES39L ลดลงเป็นนิวคลีโอไทด์เดี่ยว 32.43ภาพ Cryo-EM ของเราสนับสนุนแนวคิดที่ว่านิวคลีโอไทด์สามารถอธิบายความหนาแน่นได้อย่างไรก็ตาม ความละเอียดที่สูงขึ้นของโครงสร้างของเราแสดงให้เห็นว่านิวคลีโอไทด์นี้เป็นโมเลกุลนอกระบบโบโซม ซึ่งอาจจะเป็น AMP (รูปที่ 5a, b)
จากนั้นเราถามว่าตำแหน่งการจับนิวคลีโอไทด์ปรากฏในไรโบโซม E. cuniculi หรือไม่หรือว่ามีมาก่อนหรือไม่เนื่องจากการจับนิวคลีโอไทด์ส่วนใหญ่ถูกสื่อกลางโดยสารตกค้าง Phe170 และ Lys172 ในโปรตีนไรโบโซม eL30 เราจึงประเมินการอนุรักษ์สารตกค้างเหล่านี้ในยูคาริโอตตัวแทน 4396 ตัวดังเช่นในกรณีของ uL15 ข้างต้น เราพบว่าสารตกค้าง Phe170 และ Lys172 ได้รับการอนุรักษ์อย่างสูงใน Microsporidia ทั่วไปเท่านั้น แต่ไม่มีอยู่ในยูคาริโอตอื่น ๆ รวมถึง Microsporidia Mitosporidium และ Amphiamblys ที่ผิดปกติ ซึ่งชิ้นส่วน ES39L rRNA ไม่ลดลง 44, 45, 46 (รูปที่ 5c)-e).
เมื่อนำมารวมกัน ข้อมูลเหล่านี้สนับสนุนแนวคิดที่ว่า E. cuniculi และอาจเป็นไปได้ว่า microsporidia อื่น ๆ ที่เป็นที่ยอมรับได้พัฒนาความสามารถในการจับสารเมตาโบไลต์ขนาดเล็กจำนวนมากในโครงสร้างไรโบโซมอย่างมีประสิทธิภาพเพื่อชดเชยการลดลงของระดับ rRNA และโปรตีนในการทำเช่นนั้น พวกเขาได้พัฒนาความสามารถพิเศษในการจับนิวคลีโอไทด์นอกไรโบโซม ซึ่งแสดงให้เห็นว่าโครงสร้างโมเลกุลของปรสิตชดเชยด้วยการจับสารเมแทบอไลต์ขนาดเล็กจำนวนมาก และใช้พวกมันเป็นโครงสร้างเลียนแบบของ RNA และชิ้นส่วนโปรตีนที่เสื่อมโทรม.
ส่วนที่สามที่ไม่ได้จำลองของแผนที่ cryo-EM ของเรา ซึ่งพบในหน่วยย่อยของไรโบโซมขนาดใหญ่ความละเอียดที่ค่อนข้างสูง (2.6 Å) ของแผนที่ของเราแสดงให้เห็นว่าความหนาแน่นนี้เป็นของโปรตีนที่มีการรวมกันที่ไม่เหมือนใครของสิ่งตกค้างในห่วงโซ่ด้านข้างขนาดใหญ่ ซึ่งทำให้เราสามารถระบุความหนาแน่นนี้เป็นโปรตีนไรโบโซมที่ไม่รู้จักก่อนหน้านี้ ซึ่งเราระบุว่ามันมีชื่อว่า msL2 (Microsporidia- โปรตีนเฉพาะ L2) (วิธีการ รูปที่ 6)การค้นหาที่คล้ายคลึงกันของเราแสดงให้เห็นว่า msL2 ได้รับการอนุรักษ์ใน Microsporidia clade ของสกุล Encephaliter และ Orosporidium แต่ไม่มีอยู่ในสปีชีส์อื่น รวมทั้ง Microsporidia อื่นๆในโครงสร้างไรโบโซม msL2 ใช้ช่องว่างที่เกิดจากการสูญเสีย ES31L rRNA ที่ขยายออกไปในความว่างเปล่านี้ msL2 ช่วยให้การพับ rRNA เสถียรและสามารถชดเชยการสูญเสีย ES31L ได้ (รูปที่ 6)
ความหนาแน่นของอิเล็กตรอนและแบบจำลองของไรโบโซมโปรตีนเฉพาะของ Microsporidia ที่พบในไรโบโซม E. cuniculib ไรโบโซมยูคาริโอตส่วนใหญ่ รวมทั้งไรโบโซม 80S ของ Saccharomyces cerevisiae มีการขยาย ES19L rRNA ที่หายไปในสปีชีส์ Microsporidian ส่วนใหญ่โครงสร้างที่สร้างขึ้นก่อนหน้านี้ของไรโบโซม V. necatrix microsporidia แสดงให้เห็นว่าการสูญเสีย ES19L ในปรสิตเหล่านี้ได้รับการชดเชยด้วยวิวัฒนาการของโปรตีนไรโบโซม msL1 ใหม่ในการศึกษานี้ เราพบว่าไรโบโซม E. cuniculi ยังพัฒนาโปรตีนเลียนแบบ RNA ของไรโบโซมเพิ่มเติมเพื่อเป็นการชดเชยการสูญเสีย ES19Lอย่างไรก็ตาม msL2 (ปัจจุบันทำหมายเหตุประกอบเป็นโปรตีน ECU06_1135 สมมุติฐาน) และ msL1 มีต้นกำเนิดทางโครงสร้างและวิวัฒนาการที่แตกต่างกันc การค้นพบการสร้างโปรตีนไรโบโซม msL1 และ msL2 ที่ไม่เกี่ยวข้องทางวิวัฒนาการนี้แสดงให้เห็นว่าหากไรโบโซมสะสมการกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายใน rRNA ของพวกมัน พวกมันสามารถบรรลุความหลากหลายเชิงองค์ประกอบในระดับที่ไม่เคยมีมาก่อนแม้ในสปีชีส์ย่อยเล็กน้อยที่เกี่ยวข้องกันการค้นพบนี้สามารถช่วยชี้แจงที่มาและวิวัฒนาการของไมโทคอนเดรียลไรโบโซม ซึ่งเป็นที่ทราบกันดีว่ามี rRNA ที่ลดลงอย่างมากและความแปรปรวนที่ผิดปกติขององค์ประกอบโปรตีนในสายพันธุ์ต่างๆ
จากนั้นเราเปรียบเทียบโปรตีน msL2 กับโปรตีน msL1 ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ซึ่งเป็นโปรตีนไรโบโซมที่จำเพาะต่อไมโครสปอริเดียเพียงชนิดเดียวที่พบในไรโบโซม V. necatrixเราต้องการทดสอบว่า msL1 และ msL2 เกี่ยวข้องกับวิวัฒนาการหรือไม่การวิเคราะห์ของเราแสดงให้เห็นว่า msL1 และ msL2 ครอบครองช่องเดียวกันในโครงสร้างไรโบโซม แต่มีโครงสร้างหลักและโครงสร้างตติยภูมิที่แตกต่างกัน ซึ่งบ่งชี้ถึงต้นกำเนิดวิวัฒนาการที่เป็นอิสระจากกัน (รูปที่ 6)ดังนั้น การค้นพบ msL2 ของเราจึงแสดงหลักฐานว่ากลุ่มของสปีชีส์ยูคาริโอตที่มีขนาดกะทัดรัดสามารถพัฒนาโปรตีนไรโบโซมที่มีโครงสร้างแตกต่างกันได้อย่างอิสระเพื่อชดเชยการสูญเสียชิ้นส่วน rRNAการค้นพบนี้เป็นที่น่าสังเกตว่าไรโบโซมยูคาริโอตในไซโตพลาสซึมส่วนใหญ่มีโปรตีนที่ไม่แปรผัน รวมถึงโปรตีนในตระกูลเดียวกันของไรโบโซม 81 ตัวการปรากฏตัวของ msL1 และ msL2 ใน microsporidia clades ต่างๆ เพื่อตอบสนองต่อการสูญเสียส่วน rRNA ที่ขยายออกไปแสดงให้เห็นว่าการย่อยสลายของสถาปัตยกรรมโมเลกุลของปรสิตทำให้ปรสิตแสวงหาการกลายพันธุ์เพื่อชดเชย ซึ่งอาจนำไปสู่การได้มาในประชากรปรสิตที่แตกต่างกันในที่สุดโครงสร้าง
ในที่สุด เมื่อแบบจำลองของเราเสร็จสมบูรณ์ เราเปรียบเทียบองค์ประกอบของไรโบโซม E. cuniculi กับที่คาดการณ์จากลำดับจีโนมก่อนหน้านี้เคยคิดว่าโปรตีนไรโบโซมหลายชนิด รวมทั้ง eL14, eL38, eL41 และ eS30 หายไปจากจีโนมของ E. cuniculi เนื่องจากไม่มีโฮโมโลเกของพวกมันอย่างชัดเจนจากจีโนมของ E. cuniculiการสูญเสียโปรตีนไรโบโซมจำนวนมากยังคาดการณ์ได้ในปรสิตภายในเซลล์และเอนโดซิมบิออนที่ลดลงอย่างมากตัวอย่างเช่น แม้ว่าแบคทีเรียที่มีชีวิตอิสระส่วนใหญ่จะมีตระกูลโปรตีนไรโบโซม 54 ตระกูลเดียวกัน แต่มีเพียง 11 ตระกูลของโปรตีนเหล่านี้เท่านั้นที่มีโฮโมโลกที่ตรวจพบได้ในแต่ละจีโนมที่วิเคราะห์ของแบคทีเรียที่ถูกจำกัดโฮสต์ในการสนับสนุนแนวคิดนี้ การทดลองพบการสูญเสียโปรตีนไรโบโซมใน V. necatrix และ P. locustae microsporidia ซึ่งขาดโปรตีน eL38 และ eL4131,32
อย่างไรก็ตาม โครงสร้างของเราแสดงให้เห็นว่ามีเพียง eL38, eL41 และ eS30 เท่านั้นที่หายไปในไรโบโซมของ E. cuniculiโปรตีน eL14 ได้รับการอนุรักษ์และโครงสร้างของเราแสดงให้เห็นว่าเหตุใดจึงไม่พบโปรตีนนี้ในการค้นหาที่คล้ายคลึงกัน (รูปที่ 7)ในไรโบโซมของ E. cuniculi ตำแหน่งการจับ eL14 ส่วนใหญ่จะหายไปเนื่องจากการสลายตัวของ ES39L ที่ขยายด้วย rRNAในกรณีที่ไม่มี ES39L, eL14 สูญเสียโครงสร้างทุติยภูมิส่วนใหญ่ และมีเพียง 18% ของลำดับ eL14 เท่านั้นที่เหมือนกันใน E. cuniculi และ S. cerevisiaeการรักษาลำดับที่ไม่ดีนี้เป็นสิ่งที่น่าทึ่ง เพราะแม้แต่ Saccharomyces cerevisiae และ Homo sapiens ซึ่งเป็นสิ่งมีชีวิตที่วิวัฒนาการห่างกัน 1.5 พันล้านปี ก็ยังมีสิ่งตกค้างเดียวกันใน eL14 มากกว่า 51%การสูญเสียการอนุรักษ์ที่ผิดปกตินี้อธิบายได้ว่าทำไมในปัจจุบัน E. cuniculi eL14 จึงได้รับคำอธิบายประกอบว่าเป็นโปรตีน M970_061160 สมมุติฐาน และไม่ใช่โปรตีนไรโบโซม eL1427
และไรโบโซม Microsporidia สูญเสียส่วนขยาย ES39L rRNA ซึ่งกำจัดตำแหน่งที่จับกับโปรตีนไรโบโซม eL14 บางส่วนในกรณีที่ไม่มี ES39L โปรตีน eL14 microspore จะผ่านการสูญเสียโครงสร้างทุติยภูมิ ซึ่ง α-helix ที่จับกับ rRNA เดิมจะเสื่อมสภาพเป็นลูปความยาวน้อยที่สุดb การจัดเรียงหลายลำดับแสดงให้เห็นว่าโปรตีน eL14 ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงในสปีชีส์ยูคารีโอต (ความเหมือนกันของลำดับ 57% ระหว่างยีสต์และโฮโมโลกิกของมนุษย์) แต่อนุรักษ์ได้ไม่ดีและแตกต่างกันในไมโครสปอริเดีย (ซึ่งไม่เกิน 24% ของสิ่งตกค้างที่เหมือนกันกับโฮโมโลล็อก eL14)จาก S. cerevisiae หรือ H. sapiens)การอนุรักษ์ลำดับที่ไม่ดีและความแปรปรวนของโครงสร้างทุติยภูมินี้อธิบายว่าทำไม eL14 homologue จึงไม่เคยพบใน E. cuniculi และเหตุใดจึงคิดว่าโปรตีนนี้หายไปใน E. cuniculiในทางตรงกันข้าม E. cuniculi eL14 ก่อนหน้านี้ถูกเพิ่มความคิดเห็นเป็นโปรตีน M970_061160 สมมุติฐานข้อสังเกตนี้ชี้ให้เห็นว่าความหลากหลายของจีโนมของ microsporidia นั้นถูกประเมินค่าสูงเกินไปในปัจจุบัน: ยีนบางตัวที่คิดว่าหายไปใน microsporidia นั้นถูกรักษาไว้จริง ๆ แม้ว่าจะอยู่ในรูปแบบที่มีความแตกต่างสูงก็ตามบางคนคิดว่ารหัสสำหรับยีน microsporidia สำหรับโปรตีนเฉพาะหนอน (เช่น โปรตีนสมมุติฐาน M970_061160) จริง ๆ แล้วรหัสสำหรับโปรตีนที่หลากหลายมากที่พบในยูคาริโอตอื่น ๆ
การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าการเสียสภาพของ rRNA สามารถนำไปสู่การสูญเสียการอนุรักษ์ลำดับในโปรตีนไรโบโซมที่อยู่ติดกันอย่างมาก ทำให้ไม่สามารถตรวจพบโปรตีนเหล่านี้สำหรับการค้นหาที่คล้ายคลึงกันดังนั้น เราอาจประเมินค่าระดับที่แท้จริงของการย่อยสลายของโมเลกุลในสิ่งมีชีวิตขนาดเล็กในจีโนมสูงเกินไป เนื่องจากโปรตีนบางชนิดที่คิดว่าจะสูญเสียไปยังคงอยู่จริง ๆ แม้ว่าจะอยู่ในรูปแบบที่เปลี่ยนแปลงอย่างมากก็ตาม
ปรสิตสามารถรักษาการทำงานของเครื่องจักรระดับโมเลกุลได้อย่างไรภายใต้เงื่อนไขการลดจีโนมที่รุนแรง?การศึกษาของเราตอบคำถามนี้โดยอธิบายโครงสร้างโมเลกุลที่ซับซ้อน (ไรโบโซม) ของ E. cuniculi ซึ่งเป็นสิ่งมีชีวิตที่มีจีโนมยูคาริโอตที่เล็กที่สุดชนิดหนึ่ง
เป็นที่ทราบกันดีมาเกือบสองทศวรรษแล้วว่าโมเลกุลโปรตีนและอาร์เอ็นเอในจุลินทรีย์ปรสิตมักจะแตกต่างจากโมเลกุลที่คล้ายคลึงกันในสิ่งมีชีวิตอิสระเพราะขาดศูนย์ควบคุมคุณภาพ มีขนาดเล็กลงเหลือ 50% ของขนาดในจุลินทรีย์ที่มีชีวิตอิสระ เป็นต้นการกลายพันธุ์ที่ทำให้ร่างกายอ่อนแอจำนวนมากซึ่งทำให้การพับและการทำงานบกพร่องตัวอย่างเช่น ไรโบโซมของสิ่งมีชีวิตในจีโนมขนาดเล็ก รวมทั้งปรสิตภายในเซลล์และเอนโดซิมไบโอตจำนวนมาก คาดว่าจะขาดโปรตีนไรโบโซมหลายตัวและนิวคลีโอไทด์ rRNA มากถึงหนึ่งในสามเมื่อเทียบกับสิ่งมีชีวิตอิสระสายพันธุ์ 27, 29, 30, 49 อย่างไรก็ตาม วิธีที่โมเลกุลเหล่านี้ทำงานของปรสิตยังคงเป็นเรื่องลึกลับ ส่วนใหญ่ศึกษาผ่านจีโนมเปรียบเทียบ
การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าโครงสร้างของโมเลกุลขนาดใหญ่สามารถเปิดเผยแง่มุมต่างๆ ของวิวัฒนาการที่ยากต่อการสกัดจากการศึกษาจีโนมเชิงเปรียบเทียบแบบดั้งเดิมของปรสิตในเซลล์และสิ่งมีชีวิตอื่นๆ ที่จำกัดโฮสต์ (รูปที่ 7 เพิ่มเติม)ตัวอย่างเช่น ตัวอย่างของโปรตีน eL14 แสดงให้เห็นว่าเราสามารถประเมินค่าสูงเกินจริงของระดับการย่อยสลายที่แท้จริงของเครื่องมือระดับโมเลกุลในสปีชีส์ของปรสิตปัจจุบันเชื่อว่าปรสิตสมองมียีนเฉพาะ microsporidia หลายร้อยยีนอย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่ายีนที่มีลักษณะเฉพาะเหล่านี้บางส่วนเป็นเพียงยีนที่แตกต่างกันมากซึ่งพบได้ทั่วไปในเซลล์ยูคาริโอตอื่นๆยิ่งไปกว่านั้น ตัวอย่างของโปรตีน msL2 แสดงให้เห็นว่าเรามองข้ามโปรตีนไรโบโซมชนิดใหม่และประเมินเนื้อหาของเครื่องสร้างโมเลกุลปรสิตต่ำไปอย่างไรตัวอย่างของโมเลกุลขนาดเล็กแสดงให้เห็นว่าเราสามารถมองข้ามนวัตกรรมที่แยบยลที่สุดในโครงสร้างโมเลกุลของปรสิตที่สามารถให้ฤทธิ์ทางชีววิทยาใหม่แก่พวกมันได้อย่างไร
เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้ช่วยปรับปรุงความเข้าใจของเราเกี่ยวกับความแตกต่างระหว่างโครงสร้างโมเลกุลของสิ่งมีชีวิตที่ถูกจำกัดโฮสต์และคู่ของพวกมันในสิ่งมีชีวิตอิสระเราแสดงให้เห็นว่าเครื่องจักรระดับโมเลกุล ซึ่งคิดกันมานานแล้วว่าจะลดลง เสื่อมลง และอาจมีการกลายพันธุ์ที่ทำให้ร่างกายทรุดโทรมต่างๆ นานา แทนที่จะมีชุดของลักษณะโครงสร้างที่ผิดปกติซึ่งถูกมองข้ามอย่างเป็นระบบ
ในทางกลับกัน ชิ้นส่วน rRNA ที่ไม่เทอะทะและชิ้นส่วนหลอมรวมที่เราพบในไรโบโซมของ E. cuniculi แนะนำว่าการลดขนาดจีโนมสามารถเปลี่ยนแปลงได้แม้กระทั่งชิ้นส่วนของเครื่องจักรระดับโมเลกุลพื้นฐานที่เก็บรักษาไว้ในสามโดเมนของชีวิต – หลังจากผ่านไปเกือบ 3.5 พันล้านปีวิวัฒนาการของสายพันธุ์ที่เป็นอิสระ
ชิ้นส่วน rRNA ที่ปราศจากกระพุ้งและหลอมรวมในไรโบโซม E. cuniculi มีความสนใจเป็นพิเศษในแง่ของการศึกษาก่อนหน้านี้เกี่ยวกับโมเลกุล RNA ในแบคทีเรียเอนโดซิมไบโอติกตัวอย่างเช่น ในเพลี้ย endosymbiont Buchnera aphidicola โมเลกุล rRNA และ tRNA แสดงให้เห็นว่ามีโครงสร้างที่ไวต่ออุณหภูมิเนื่องจากความเอนเอียงขององค์ประกอบ A+T และสัดส่วนที่สูงของคู่เบสที่ไม่เป็นที่ยอมรับการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ใน RNA เช่นเดียวกับการเปลี่ยนแปลงในโมเลกุลของโปรตีน เป็นที่เชื่อกันว่ามีส่วนรับผิดชอบต่อการพึ่งพาอาศัยกันมากเกินไปของ endosymbiont ในคู่นอน และการที่ endosymbiont ไม่สามารถถ่ายเทความร้อนได้ 21, 23แม้ว่า microsporidia rRNA ของปรสิตจะมีการเปลี่ยนแปลงทางโครงสร้างที่แตกต่างกัน แต่ธรรมชาติของการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าเสถียรภาพทางความร้อนที่ลดลงและการพึ่งพาโปรตีน chaperone ที่สูงขึ้นอาจเป็นลักษณะทั่วไปของโมเลกุล RNA ในสิ่งมีชีวิตที่มีจีโนมลดลง
ในทางกลับกัน โครงสร้างของเราแสดงให้เห็นว่า microsporidia ของปรสิตได้พัฒนาความสามารถพิเศษในการต่อต้าน rRNA และชิ้นส่วนโปรตีนที่อนุรักษ์ไว้ในวงกว้าง การพัฒนาความสามารถในการใช้สารเมตาโบไลต์ขนาดเล็กที่มีอยู่มากมายและพร้อมใช้งานเป็นการเลียนแบบโครงสร้างของ rRNA ที่เสื่อมสภาพและชิ้นส่วนโปรตีนการสลายตัวของโครงสร้างโมเลกุล.ความคิดเห็นนี้ได้รับการสนับสนุนโดยข้อเท็จจริงที่ว่าโมเลกุลขนาดเล็กที่ชดเชยการสูญเสียชิ้นส่วนโปรตีนใน rRNA และไรโบโซมของ E. cuniculi จับกับสิ่งตกค้างเฉพาะ microsporidia ในโปรตีน uL15 และ eL30สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าการจับกันของโมเลกุลขนาดเล็กกับไรโบโซมอาจเป็นผลจากการคัดเลือกในเชิงบวก ซึ่งการกลายพันธุ์ที่จำเพาะต่อไมโครสปอริเดียในโปรตีนไรโบโซมได้รับการคัดเลือกสำหรับความสามารถในการเพิ่มความสัมพันธ์ของไรโบโซมสำหรับโมเลกุลขนาดเล็ก ซึ่งอาจนำไปสู่สิ่งมีชีวิตไรโบโซมที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นการค้นพบนี้เผยให้เห็นถึงนวัตกรรมอันชาญฉลาดในโครงสร้างโมเลกุลของปรสิตจุลินทรีย์ และทำให้เราเข้าใจได้ดีขึ้นว่าโครงสร้างโมเลกุลของปรสิตยังคงทำหน้าที่ของมันอย่างไรแม้จะมีวิวัฒนาการลดลง
ในปัจจุบัน การจำแนกโมเลกุลขนาดเล็กเหล่านี้ยังไม่ชัดเจนยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัดว่าเหตุใดการปรากฏตัวของโมเลกุลขนาดเล็กเหล่านี้ในโครงสร้างไรโบโซมจึงแตกต่างกันระหว่างสายพันธุ์ไมโครสปอริเดียโดยเฉพาะอย่างยิ่ง ยังไม่ชัดเจนว่าทำไมการจับกันของนิวคลีโอไทด์จึงสังเกตได้ในไรโบโซมของ E. cuniculi และ P. locustae และไม่พบในไรโบโซมของ V. necatrix แม้ว่าจะมี F170 ตกค้างอยู่ในโปรตีน eL20 และ K172 ของ V. necatrixการลบออกนี้อาจเกิดจากเรซิดิว 43 uL6 (ที่อยู่ติดกับช่องจับนิวคลีโอไทด์) ซึ่งเป็นไทโรซีนใน V. necatrix และไม่ใช่ทรีโอนีนใน E. cuniculi และ P. locustaeห่วงโซ่ด้านข้างอะโรมาติกขนาดใหญ่ของ Tyr43 สามารถรบกวนการจับนิวคลีโอไทด์เนื่องจากการทับซ้อนกันของสเตอริกอีกทางหนึ่ง การลบนิวคลีโอไทด์ที่เห็นได้ชัดอาจเกิดจากการถ่ายภาพด้วยความเย็นด้วยความเย็นต่ำ ซึ่งขัดขวางการสร้างแบบจำลองของชิ้นส่วนไรโบโซมของ V. necatrix
ในทางกลับกัน งานของเราเสนอว่ากระบวนการสลายตัวของจีโนมอาจเป็นแรงสร้างสรรค์โดยเฉพาะอย่างยิ่ง โครงสร้างของไรโบโซม E. cuniculi แสดงให้เห็นว่าการสูญเสีย rRNA และชิ้นส่วนโปรตีนในไรโบโซม microsporidia จะสร้างแรงกดดันทางวิวัฒนาการที่ส่งเสริมการเปลี่ยนแปลงในโครงสร้างไรโบโซมตัวแปรเหล่านี้เกิดขึ้นไกลจากตำแหน่งที่ทำงานอยู่ของไรโบโซม และดูเหมือนว่าจะช่วยรักษา (หรือฟื้นฟู) ส่วนประกอบของไรโบโซมที่เหมาะสม ซึ่งมิฉะนั้นอาจถูกขัดขวางโดย rRNA ที่ลดลงสิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่านวัตกรรมที่สำคัญของไรโบโซม microsporidia ดูเหมือนว่าจะพัฒนาไปสู่ความต้องการในการบัฟเฟอร์การเลื่อนของยีน
บางทีนี่อาจแสดงให้เห็นได้ดีที่สุดจากการจับกับนิวคลีโอไทด์ ซึ่งไม่เคยพบในสิ่งมีชีวิตอื่นมาก่อนข้อเท็จจริงที่ว่าสารตกค้างที่จับกับนิวคลีโอไทด์มีอยู่ใน microsporidia ทั่วไป แต่ไม่มีในยูคารีโอตอื่นๆ แสดงให้เห็นว่าตำแหน่งที่จับกับนิวคลีโอไทด์ไม่ได้เป็นเพียงวัตถุโบราณที่รอการหายไป หรือตำแหน่งสุดท้ายสำหรับ rRNA ที่จะกลับคืนสู่รูปของนิวคลีโอไทด์แต่ละตัวไซต์นี้ดูเหมือนจะเป็นฟีเจอร์ที่มีประโยชน์ที่สามารถพัฒนาผ่านการเลือกเชิงบวกหลายๆ รอบตำแหน่งที่จับกับนิวคลีโอไทด์อาจเป็นผลพลอยได้จากการคัดเลือกโดยธรรมชาติ: เมื่อ ES39L ถูกย่อยสลาย microsporidia จะถูกบังคับให้หาค่าชดเชยเพื่อฟื้นฟูการกำเนิดทางชีวภาพของไรโบโซมที่เหมาะสมในกรณีที่ไม่มี ES39Lเนื่องจากนิวคลีโอไทด์นี้สามารถเลียนแบบการสัมผัสกันของโมเลกุลของนิวคลีโอไทด์ A3186 ใน ES39L ได้ โมเลกุลของนิวคลีโอไทด์จึงกลายเป็นส่วนประกอบสำคัญของไรโบโซม ซึ่งการจับกันของนิวคลีโอไทด์จะดีขึ้นอีกโดยการกลายพันธุ์ของลำดับ eL30
เกี่ยวกับวิวัฒนาการระดับโมเลกุลของปรสิตภายในเซลล์ การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าพลังของการคัดเลือกโดยธรรมชาติของดาร์วินและการเบี่ยงเบนทางพันธุกรรมของการสลายตัวของจีโนมไม่ได้ทำงานแบบขนาน แต่เป็นการแกว่งประการแรก การเบี่ยงเบนทางพันธุกรรมจะกำจัดคุณลักษณะที่สำคัญของสารชีวโมเลกุล ทำให้การชดเชยมีความจำเป็นอย่างมากเฉพาะเมื่อปรสิตตอบสนองความต้องการนี้ผ่านการคัดเลือกโดยธรรมชาติของดาร์วินเท่านั้นที่โมเลกุลขนาดใหญ่ของพวกมันจะมีโอกาสพัฒนาลักษณะที่น่าประทับใจและสร้างสรรค์ที่สุดที่สำคัญ วิวัฒนาการของตำแหน่งที่จับกับนิวคลีโอไทด์ในไรโบโซม E. cuniculi แสดงให้เห็นว่ารูปแบบวิวัฒนาการของโมเลกุลแบบสูญเสียเพื่อให้ได้มานี้ไม่เพียงแต่ตัดทอนการกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายเท่านั้น แต่บางครั้งก็มอบหน้าที่ใหม่ทั้งหมดให้กับโมเลกุลขนาดใหญ่ของปรสิต
แนวคิดนี้สอดคล้องกับทฤษฎีสมดุลการเคลื่อนที่ของซีเวลล์ ไรท์ ซึ่งระบุว่าระบบการคัดเลือกโดยธรรมชาติที่เข้มงวดจะจำกัดความสามารถของสิ่งมีชีวิตในการสร้างนวัตกรรม51,52,53อย่างไรก็ตาม หากการเลื่อนระดับทางพันธุกรรมขัดขวางการคัดเลือกโดยธรรมชาติ การเลื่อนลอยเหล่านี้สามารถสร้างการเปลี่ยนแปลงที่ไม่ได้อยู่ในตัวมันเอง (หรือถึงขั้นเสียหาย) แต่นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงเพิ่มเติมที่ให้สมรรถภาพที่สูงขึ้นหรือกิจกรรมทางชีวภาพใหม่กรอบการทำงานของเราสนับสนุนแนวคิดนี้โดยแสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ประเภทเดียวกันที่ลดการพับและการทำงานของชีวโมเลกุลดูเหมือนจะเป็นตัวกระตุ้นหลักสำหรับการปรับปรุงสอดคล้องกับรูปแบบวิวัฒนาการแบบ win-win การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าการสลายตัวของจีโนม ซึ่งแต่เดิมมองว่าเป็นกระบวนการเสื่อมถอย เป็นตัวขับเคลื่อนหลักของนวัตกรรม บางครั้งและบางทีอาจทำให้โมเลกุลขนาดใหญ่ได้รับกิจกรรมของปรสิตใหม่ๆสามารถใช้งานได้