ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com คุณกำลังใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันที่รองรับ CSS ได้จำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) นอกจากนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าจะได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจึงแสดงเว็บไซต์โดยไม่ใช้รูปแบบและ JavaScript
แสดงสไลด์ 3 สไลด์พร้อมกัน ใช้ปุ่ม Previous และ Next เพื่อเลื่อนดูสไลด์ 3 สไลด์พร้อมกัน หรือใช้ปุ่ม Slider ที่ท้ายสไลด์เพื่อเลื่อนดูสไลด์ 3 สไลด์พร้อมกัน
อุปสรรคเลือด-สมองและอุปสรรคเลือด-สมองป้องกันไม่ให้สารชีวบำบัดเข้าถึงเป้าหมายในระบบประสาทส่วนกลาง จึงขัดขวางการรักษาโรคทางระบบประสาทที่มีประสิทธิภาพ เพื่อค้นพบตัวส่งผ่านสมองใหม่ๆ ในร่างกาย เราได้แนะนำคลังข้อมูลเปปไทด์ฟาจ T7 และเก็บเลือดและน้ำไขสันหลัง (CSF) ตามลำดับโดยใช้แบบจำลองหนูที่มีสติสัมปชัญญะจำนวนมากที่ใส่ท่อ โคลนฟาจเฉพาะเจาะจงได้รับการเสริมความเข้มข้นใน CSF อย่างมากหลังจากการคัดเลือก 4 รอบ การทดสอบเปปไทด์ผู้สมัครแต่ละตัวเผยให้เห็นการเสริมความเข้มข้นใน CSF มากกว่า 1,000 เท่า ฤทธิ์ทางชีวภาพของการส่งผ่านเปปไทด์ไปยังสมองได้รับการยืนยันโดยการลดลงของระดับอะไมลอยด์-β ในน้ำไขสันหลัง 40% โดยใช้สารยับยั้งเปปไทด์ BACE1 ที่เชื่อมโยงกับเปปไทด์ขนส่งใหม่ที่ระบุ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าเปปไทด์ที่ระบุโดยวิธีการคัดเลือกฟาจในร่างกายอาจเป็นตัวพาที่มีประโยชน์สำหรับการส่งโมเลกุลขนาดใหญ่ไปยังสมองอย่างเป็นระบบซึ่งมีผลในการบำบัด
งานวิจัยการบำบัดแบบกำหนดเป้าหมายระบบประสาทส่วนกลาง (CNS) ส่วนใหญ่มุ่งเน้นไปที่การระบุยาและตัวแทนที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมซึ่งแสดงคุณสมบัติในการกำหนดเป้าหมาย CNS โดยมีความพยายามน้อยลงในการค้นหากลไกที่ขับเคลื่อนการส่งยาไปยังสมอง สิ่งนี้เริ่มเปลี่ยนแปลงไปในขณะนี้ เนื่องจากการส่งยา โดยเฉพาะโมเลกุลขนาดใหญ่ เป็นส่วนสำคัญของการพัฒนายาทางประสาทวิทยาสมัยใหม่ สภาพแวดล้อมของระบบประสาทส่วนกลางได้รับการปกป้องอย่างดีโดยระบบกั้นหลอดเลือดสมอง ซึ่งประกอบด้วยกั้นเลือดสมอง (BBB) ​​และกั้นเลือดสมอง (BCBB)1 ทำให้การส่งยาไปยังสมองเป็นเรื่องท้าทาย1,2 คาดว่ายาโมเลกุลขนาดใหญ่เกือบทั้งหมดและยาโมเลกุลขนาดเล็กมากกว่า 98% จะถูกกำจัดออกจากสมอง3 นั่นคือเหตุผลที่การระบุระบบขนส่งสมองใหม่ที่ให้การส่งยารักษาไปยัง CNS ที่มีประสิทธิภาพและเฉพาะเจาะจงจึงมีความสำคัญมาก 4,5 อย่างไรก็ตาม BBB และ BCSFB ยังเป็นโอกาสที่ดีเยี่ยมสำหรับการส่งยา เนื่องจากระบบเหล่านี้แทรกซึมและเข้าสู่โครงสร้างทั้งหมดของสมองผ่านหลอดเลือดขนาดใหญ่ ดังนั้น ความพยายามในปัจจุบันในการใช้วิธีการที่ไม่รุกรานในการส่งมอบไปยังสมองนั้นส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับกลไกของการขนส่งผ่านตัวรับ (PMT) โดยใช้ตัวรับ BBB6 ในร่างกาย แม้จะมีความก้าวหน้าที่สำคัญล่าสุดในการใช้เส้นทางตัวรับทรานสเฟอร์ริน7,8 แต่จำเป็นต้องมีการพัฒนาระบบการส่งมอบใหม่ที่มีคุณสมบัติที่ดีขึ้นต่อไป เพื่อจุดประสงค์นี้ เป้าหมายของเราคือการระบุเปปไทด์ที่สามารถทำหน้าที่เป็นตัวกลางในการขนส่งน้ำไขสันหลังได้ เนื่องจากโดยหลักการแล้ว เปปไทด์เหล่านี้สามารถใช้เพื่อส่งมอบโมเลกุลขนาดใหญ่ไปยังระบบประสาทส่วนกลางหรือเพื่อเปิดเส้นทางตัวรับใหม่ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ตัวรับและตัวขนส่งเฉพาะของระบบหลอดเลือดสมอง (BBB และ BSCFB) สามารถทำหน้าที่เป็นเป้าหมายที่มีศักยภาพสำหรับการส่งมอบยาชีวบำบัดที่ออกฤทธิ์และเฉพาะเจาะจง น้ำไขสันหลัง (CSF) เป็นผลิตภัณฑ์ที่หลั่งออกมาจากกลุ่มเส้นประสาทคอรอยด์ (CS) และสัมผัสโดยตรงกับของเหลวในเนื้อเยื่อระหว่างช่องสมองผ่านช่องว่างใต้เยื่อหุ้มสมองและช่องว่างของโพรงหัวใจ4 เมื่อไม่นานมานี้ มีการแสดงให้เห็นว่าน้ำหล่อสมองและไขสันหลังใต้เยื่อหุ้มสมองแพร่กระจายมากเกินไปในเนื้อเยื่อระหว่างช่องสมอง9 เราหวังว่าจะเข้าถึงช่องว่างของเนื้อเยื่อได้โดยใช้ช่องทางไหลเข้าใต้เยื่อหุ้มสมองนี้หรือผ่าน BBB โดยตรง เพื่อให้บรรลุเป้าหมายนี้ เราได้นำกลยุทธ์การคัดเลือกฟาจในร่างกายที่มีประสิทธิภาพมาใช้ ซึ่งในอุดมคติแล้วสามารถระบุเปปไทด์ที่ขนส่งโดยเส้นทางที่แตกต่างกันสองเส้นทางนี้
ขณะนี้ เราอธิบายวิธีการคัดกรองการแสดงฟาจแบบต่อเนื่องในร่างกายโดยใช้การสุ่มตัวอย่าง CSF ร่วมกับการจัดลำดับปริมาณงานสูง (HTS) เพื่อติดตามรอบการคัดเลือกเริ่มต้นที่มีความหลากหลายในห้องสมุดสูงสุด การคัดกรองดำเนินการกับหนูที่ยังมีสติโดยใช้เข็มซิสเตอร์นาขนาดใหญ่ (CM) ที่ฝังไว้ถาวรเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของเลือด สิ่งสำคัญคือ วิธีการนี้จะคัดเลือกทั้งเป้าหมายที่สมองและเปปไทด์ที่มีกิจกรรมการขนส่งข้ามอุปสรรคหลอดเลือดสมอง เราใช้ฟาจ T7 เนื่องจากมีขนาดเล็ก (~60 นาโนเมตร)10 และแนะนำว่าฟาจเหล่านี้เหมาะสำหรับการขนส่งเวสิเคิลที่ช่วยให้ข้ามผ่านอุปสรรคของเอ็นโดทีเลียมและ/หรือเยื่อบุผิว-เมดัลลาได้ หลังจากทำการคัดกรองสี่รอบ ประชากรฟาจถูกแยกออกโดยแสดงให้เห็นการเสริมความเข้มข้นของ CSF ในร่างกายอย่างแข็งแกร่งและการเชื่อมโยงของไมโครเวสเซลในสมอง ที่สำคัญ เราสามารถยืนยันผลการค้นพบของเราได้โดยการแสดงให้เห็นว่าเปปไทด์ที่เป็นตัวเลือกที่ดีที่สุดที่สังเคราะห์ขึ้นทางเคมีนั้นสามารถขนส่งโปรตีนเข้าไปในน้ำไขสันหลังได้ ขั้นแรก ผลทางเภสัชพลศาสตร์ของระบบประสาทส่วนกลางได้รับการพิสูจน์โดยการผสมผสานเปปไทด์ขนส่งชั้นนำกับสารยับยั้งเปปไทด์ BACE1 นอกเหนือจากการแสดงให้เห็นว่ากลยุทธ์การคัดกรองการทำงานในร่างกายสามารถระบุเปปไทด์ขนส่งสมองใหม่ๆ เป็นตัวพาโปรตีนที่มีประสิทธิภาพได้แล้ว เรายังคาดว่าแนวทางการคัดเลือกการทำงานที่คล้ายคลึงกันจะกลายมาเป็นสิ่งสำคัญในการระบุเส้นทางการขนส่งสมองใหม่ๆ อีกด้วย
จากหน่วยสร้างคราบจุลินทรีย์ (PFU) หลังจากขั้นตอนการบรรจุฟาจ ห้องสมุดของเปปไทด์ฟาจ T7 เชิงเส้นแบบสุ่ม 12 เมอร์ที่มีความหลากหลายประมาณ 109 ได้ถูกออกแบบและสร้างขึ้น (ดูวัสดุและวิธีการ) สิ่งสำคัญที่ต้องทราบคือ เราได้วิเคราะห์ห้องสมุดนี้อย่างรอบคอบก่อนการแพนนิ่งแบบ in vivo การขยาย PCR ของตัวอย่างห้องสมุดฟาจโดยใช้ไพรเมอร์ที่ดัดแปลงจะสร้างแอมพลิคอนที่สามารถนำไปใช้กับ HTS ได้โดยตรง (รูปเสริม 1a) เนื่องจาก a) ข้อผิดพลาดในการเรียงลำดับ HTS11, b) ผลกระทบต่อคุณภาพของไพรเมอร์ (NNK)1-12 และ c) การมีฟาจชนิดป่า (wt) (ส่วนแทรกโครงกระดูก) ในห้องสมุดสแตนด์บาย จึงได้นำขั้นตอนการกรองลำดับมาใช้เพื่อแยกเฉพาะข้อมูลลำดับที่ตรวจยืนยันแล้วเท่านั้น (รูปเสริม 1b) ขั้นตอนการกรองเหล่านี้ใช้ได้กับห้องสมุดการเรียงลำดับ HTS ทั้งหมด สำหรับไลบรารีมาตรฐานนั้น ได้ข้อมูลการอ่านทั้งหมด 233,868 รายการ ซึ่ง 39% ผ่านเกณฑ์การกรองและใช้สำหรับการวิเคราะห์ไลบรารีและการคัดเลือกสำหรับรอบถัดไป (ภาพเสริม 1c–e) ข้อมูลการอ่านส่วนใหญ่มีความยาว 3 คู่เบสเป็นทวีคูณ โดยมีจุดสูงสุดที่ 36 นิวคลีโอไทด์ (ภาพเสริม 1c) ซึ่งยืนยันการออกแบบไลบรารี (NNK) 1–12 ที่น่าสังเกตคือ ประมาณ 11% ของสมาชิกในไลบรารีมีแกนหลักแบบ 12 มิติแบบไวด์ไทป์ (wt) PAGISRELVDKL และเกือบครึ่งหนึ่งของลำดับ (49%) มีการแทรกหรือการลบ HTS ของไลบรารีไลบรารียืนยันความหลากหลายสูงของเปปไทด์ในไลบรารี: พบลำดับเปปไทด์มากกว่า 81% เพียงครั้งเดียว และมีเพียง 1.5% ที่เกิดขึ้นใน ≥4 สำเนา (ภาพเสริม 2a) ความถี่ของกรดอะมิโน (aa) ที่ตำแหน่งทั้ง 12 ตำแหน่งในคลังข้อมูลมีความสัมพันธ์ที่ดีกับความถี่ที่คาดหวังสำหรับจำนวนโคดอนที่สร้างโดยคลังข้อมูล NKK ที่เสื่อม (รูปเสริม 2b) ความถี่ที่สังเกตได้ของกรดอะมิโน aa ที่เข้ารหัสโดยส่วนแทรกเหล่านี้มีความสัมพันธ์ที่ดีกับความถี่ที่คำนวณได้ (r = 0.893) (รูปเสริม 2c) การเตรียมคลังข้อมูลฟาจสำหรับการฉีดประกอบด้วยขั้นตอนการขยายและการกำจัดเอนโดทอกซิน ซึ่งก่อนหน้านี้ได้มีการแสดงให้เห็นแล้วว่าอาจลดความหลากหลายของคลังข้อมูลฟาจได้12,13 ดังนั้น เราจึงจัดลำดับคลังข้อมูลฟาจที่ขยายด้วยแผ่นเพลทที่ได้รับการกำจัดเอนโดทอกซิน และเปรียบเทียบกับคลังข้อมูลดั้งเดิมเพื่อประมาณความถี่ของ AA พบว่ามีความสัมพันธ์กันอย่างแข็งแกร่ง (r = 0.995) ระหว่างกลุ่มตัวอย่างดั้งเดิมและกลุ่มตัวอย่างที่ขยายและบริสุทธิ์ (รูปเสริม 2d) ซึ่งบ่งชี้ว่าการแข่งขันระหว่างโคลนที่ขยายบนเพลตโดยใช้ฟาจ T7 ไม่ก่อให้เกิดอคติที่สำคัญ การเปรียบเทียบนี้ขึ้นอยู่กับความถี่ของโมทีฟไตรเปปไทด์ในแต่ละไลบรารี เนื่องจากไม่สามารถจับความหลากหลายของไลบรารี (~109) ได้อย่างสมบูรณ์แม้กับ HTS การวิเคราะห์ความถี่ของ aa ในแต่ละตำแหน่งเผยให้เห็นอคติเล็กน้อยที่ขึ้นอยู่กับตำแหน่งในสามตำแหน่งสุดท้ายของคลังข้อมูลที่ป้อน (รูปเสริม 2e) สรุปได้ว่า เราสรุปได้ว่าคุณภาพและความหลากหลายของไลบรารีเป็นที่ยอมรับได้ และสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในความหลากหลายเท่านั้นเนื่องจากการขยายและการเตรียมไลบรารีฟาจระหว่างรอบการคัดเลือกหลายรอบ
การสุ่มตัวอย่างน้ำไขสันหลังแบบต่อเนื่องสามารถทำได้โดยการผ่าตัดฝังเข็มเข้าไปใน CM ของหนูที่ยังมีสติ เพื่ออำนวยความสะดวกในการระบุฟาจ T7 ที่ฉีดเข้าเส้นเลือดดำ (iv) ผ่าน BBB และ/หรือ BCSFB (รูปที่ 1a-b) เราใช้แขนการคัดเลือกอิสระสองแขน (แขน A และ B) ในสามรอบแรกของการคัดเลือกในร่างกาย (รูปที่ 1c) เราค่อยๆ เพิ่มความเข้มงวดในการคัดเลือกโดยลดปริมาณฟาจทั้งหมดที่ใส่เข้าไปในสามรอบแรกของการคัดเลือก สำหรับการคัดกรองรอบที่สี่ เราได้รวมตัวอย่างจากสาขา A และ B และทำการคัดเลือกอิสระเพิ่มเติมอีกสามแบบ เพื่อศึกษาคุณสมบัติในร่างกายของอนุภาคฟาจ T7 ในแบบจำลองนี้ ฟาจชนิดป่า (แผ่นแทรกหลัก PAGISRELVDKL) ถูกฉีดเข้าไปในหนูผ่านเส้นเลือดที่หาง การกู้คืนฟาจจากน้ำหล่อสมองและไขสันหลังและเลือดในช่วงเวลาต่างๆ แสดงให้เห็นว่าฟาจ T7 icosahedral ที่มีขนาดค่อนข้างเล็กมีช่วงการกวาดล้างเริ่มต้นอย่างรวดเร็วจากช่องเลือด (รูปเสริม 3) จากค่าไทเตอร์ที่ให้และปริมาณเลือดของหนู เราคำนวณได้ว่าตรวจพบฟาจเพียงประมาณ 1% โดยน้ำหนักจากยาที่ให้ในเลือด 10 นาทีหลังจากฉีดเข้าเส้นเลือดดำ หลังจากการลดลงอย่างรวดเร็วในช่วงแรกนี้ จะวัดการกวาดล้างขั้นต้นที่ช้าลง โดยมีครึ่งชีวิต 27.7 นาที ที่สำคัญ มีการนำฟาจออกจากช่อง CSF เพียงไม่กี่ตัวเท่านั้น ซึ่งบ่งชี้ถึงพื้นหลังต่ำสำหรับการอพยพของฟาจประเภทป่าเข้าไปในช่อง CSF (รูปเสริม 3) โดยเฉลี่ยแล้ว ตรวจพบฟาจ T7 ไทเตอร์เพียงประมาณ 1 x 10-3% ในเลือด และฟาจที่แช่ไว้ในช่วงแรก 4 x 10-8% ในน้ำหล่อสมองและไขสันหลังตลอดระยะเวลาการสุ่มตัวอย่างทั้งหมด (0-250 นาที) ที่น่าสังเกตคือ ครึ่งชีวิต (25.7 นาที) ของฟาจชนิดป่าในน้ำไขสันหลังนั้นใกล้เคียงกับที่สังเกตได้ในเลือด ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าสิ่งกั้นที่แยกช่อง CSF ออกจากเลือดนั้นยังคงสภาพเดิมในหนูที่ใส่ท่อ CM ทำให้สามารถเลือกคลังฟาจในร่างกายเพื่อระบุโคลนที่เคลื่อนย้ายจากเลือดไปยังช่อง CSF ได้อย่างง่ายดาย
(ก) การกำหนดวิธีการสุ่มตัวอย่างน้ำไขสันหลัง (CSF) ใหม่จากแหล่งรวมขนาดใหญ่ (ข) แผนผังแสดงตำแหน่งเซลล์ของอุปสรรคระบบประสาทส่วนกลาง (CNS) และกลยุทธ์การคัดเลือกที่ใช้ในการระบุเปปไทด์ที่ผ่านอุปสรรคเลือดสมอง (BBB) ​​และอุปสรรคเลือดสมอง (ค) ผังงานการคัดกรองการแสดงผลฟาจในร่างกาย ในแต่ละรอบของการคัดเลือก ฟาจ (ตัวระบุสัตว์ภายในลูกศร) จะถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำ แยกแขนงทางเลือกอิสระสองแขนง (A, B) ไว้แยกกันจนถึงรอบที่ 4 ของการคัดเลือก สำหรับรอบการคัดเลือกที่ 3 และ 4 โคลนฟาจแต่ละโคลนที่สกัดจาก CSF จะถูกจัดลำดับด้วยมือ (d) จลนพลศาสตร์ของฟาจที่แยกได้จากเลือด (วงกลมสีแดง) และน้ำไขสันหลัง (สามเหลี่ยมสีเขียว) ในระหว่างรอบแรกของการคัดเลือกในหนูที่ใส่ท่อ 2 ตัว หลังจากฉีดคลังเปปไทด์ T7 (ฟาจ 2 x 1012 ตัวต่อสัตว์) เข้าทางเส้นเลือด สี่เหลี่ยมสีน้ำเงินแสดงถึงความเข้มข้นเริ่มต้นเฉลี่ยของฟาจในเลือด ซึ่งคำนวณจากปริมาณของฟาจที่ฉีด โดยคำนึงถึงปริมาตรเลือดทั้งหมด สี่เหลี่ยมสีดำแสดงถึงจุดตัดของเส้น y ที่ประมาณจากความเข้มข้นของฟาจในเลือด (e,f) แสดงความถี่สัมพัทธ์และการกระจายของโมทีฟไตรเปปไทด์ที่ทับซ้อนกันทั้งหมดที่เป็นไปได้ที่พบในเปปไทด์ แสดงจำนวนโมทีฟที่พบในการอ่าน 1,000 ครั้ง โมทีฟที่เข้มข้นอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.001) จะถูกทำเครื่องหมายด้วยจุดสีแดง (e) กราฟกระจายความสัมพันธ์ที่เปรียบเทียบความถี่สัมพัทธ์ของโมทีฟไตรเปปไทด์ของไลบรารีที่ฉีดเข้ากับฟาจที่ได้จากเลือดจากสัตว์ #1.1 และ #1.2 (f) กราฟกระจายความสัมพันธ์ที่เปรียบเทียบความถี่สัมพัทธ์ของโมทีฟไตรเปปไทด์ของฟาจสัตว์ #1.1 และ #1.2 ที่แยกได้ในเลือดและน้ำไขสันหลัง (g, h) การแสดงรหัสลำดับของฟาจที่เพิ่มความเข้มข้นในเลือด (g) เทียบกับไลบรารีที่ฉีดและฟาจที่เพิ่มความเข้มข้นในน้ำไขสันหลัง (h) เทียบกับเลือดหลังจากการคัดเลือกในร่างกายรอบหนึ่งในสัตว์ทั้งสองตัว ขนาดของรหัสตัวอักษรหนึ่งตัวบ่งชี้ว่ากรดอะมิโนนั้นเกิดขึ้นบ่อยเพียงใดในตำแหน่งนั้น สีเขียว = ขั้ว สีม่วง = กลาง สีน้ำเงิน = เบส สีแดง = กรด และสีดำ = กรดอะมิโนไม่ชอบน้ำ รูปที่ 1a, b ออกแบบและผลิตโดย Eduard Urich
เราฉีดคลังข้อมูลเปปไทด์ฟาจเข้าไปในหนูทดลอง CM สองตัว (กลุ่ม A และ B) และแยกฟาจจากน้ำหล่อสมองไขสันหลังและเลือด (รูปที่ 1d) การกำจัดฟาจอย่างรวดเร็วในช่วงแรกนั้นไม่เด่นชัดนักเมื่อเทียบกับฟาจประเภทป่า ครึ่งชีวิตเฉลี่ยของคลังข้อมูลที่ฉีดในสัตว์ทั้งสองตัวคือ 24.8 นาทีในเลือด ซึ่งใกล้เคียงกับฟาจประเภทป่า และ 38.5 นาทีในน้ำหล่อสมองไขสันหลัง ตัวอย่างฟาจในเลือดและน้ำหล่อสมองไขสันหลังจากสัตว์แต่ละตัวถูกทำให้ผ่าน HTS และเปปไทด์ที่ระบุทั้งหมดถูกวิเคราะห์เพื่อหาการมีอยู่ของโมทีฟไตรเปปไทด์สั้น โมทีฟไตรเปปไทด์ถูกเลือกเนื่องจากให้พื้นฐานขั้นต่ำสำหรับการสร้างโครงสร้างและปฏิสัมพันธ์ระหว่างเปปไทด์และโปรตีน14,15 เราพบความสัมพันธ์ที่ดีในการกระจายของโมทีฟระหว่างคลังข้อมูลฟาจที่ฉีดและโคลนที่สกัดจากเลือดของสัตว์ทั้งสองตัว (รูปที่ 1e) ข้อมูลบ่งชี้ว่าองค์ประกอบของห้องสมุดมีการเพิ่มความเข้มข้นเพียงเล็กน้อยในช่องเลือด ความถี่ของกรดอะมิโนและลำดับคอนเซนซัสได้รับการวิเคราะห์เพิ่มเติมในแต่ละตำแหน่งโดยใช้การปรับซอฟต์แวร์ Weblogo16 ที่น่าสนใจคือ เราพบการเพิ่มความเข้มข้นอย่างมากในกากไกลซีนในเลือด (รูปที่ 1g) เมื่อเปรียบเทียบเลือดกับโคลนที่เลือกจาก CSF จะสังเกตเห็นการคัดเลือกที่รุนแรงและการยกเลิกการคัดเลือกโมทีฟบางส่วน (รูปที่ 1f) และกรดอะมิโนบางชนิดมีอยู่โดยเฉพาะในตำแหน่งที่กำหนดไว้ล่วงหน้าใน 12 สมาชิก (รูปที่ 1h) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง สัตว์แต่ละตัวมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในน้ำไขสันหลัง ในขณะที่การเพิ่มความเข้มข้นของไกลซีนในเลือดพบได้ในสัตว์ทั้งสองตัว (รูปเสริม 4a–j) หลังจากกรองข้อมูลลำดับอย่างเข้มงวดในน้ำไขสันหลังของสัตว์ #1.1 และ #1.2 แล้ว จะได้รับเปปไทด์ 12 เมอร์เฉพาะตัวทั้งหมด 964 และ 420 ตัว (รูปเสริม 1d–e) โคลนฟาจที่แยกออกมาได้รับการขยายพันธุ์และผ่านการคัดเลือกในร่างกายรอบที่สอง ฟาจที่สกัดจากการคัดเลือกรอบที่สองได้รับการทำให้ผ่าน HTS ในสัตว์แต่ละตัว และเปปไทด์ที่ระบุทั้งหมดจะถูกใช้เป็นอินพุตในโปรแกรมการจดจำโมทีฟเพื่อวิเคราะห์การเกิดขึ้นของโมทีฟไตรเปปไทด์ (รูปที่ 2a, b, ef) เมื่อเปรียบเทียบกับรอบแรกของฟาจที่กู้คืนจาก CSF เราสังเกตเห็นการคัดเลือกเพิ่มเติมและการยกเลิกการคัดเลือกของโมทีฟจำนวนมากใน CSF ในสาขา A และ B (รูปที่ 2) อัลกอริทึมการระบุเครือข่ายถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบว่าโมทีฟเหล่านี้แสดงรูปแบบที่แตกต่างกันของลำดับที่สอดคล้องกันหรือไม่ สังเกตเห็นความคล้ายคลึงกันอย่างชัดเจนระหว่างลำดับ 12 มิติที่กู้คืนโดย CSF ในแคลดทางเลือก A (รูปที่ 2c, d) และแคลด B (รูปที่ 2g, h) การวิเคราะห์แบบรวมกลุ่มในแต่ละสาขาเผยให้เห็นโปรไฟล์การเลือกที่แตกต่างกันสำหรับเปปไทด์ 12 เมอร์ (รูปเสริม 5c, d) และการเพิ่มขึ้นของอัตราส่วน CSF/ไทเตอร์เลือดเมื่อเวลาผ่านไปสำหรับโคลนแบบรวมกลุ่มหลังจากรอบที่สองของการคัดเลือกเมื่อเปรียบเทียบกับรอบแรกของการคัดเลือก (รูปเสริม 5e)
การเสริมความเข้มข้นของลวดลายและเปปไทด์ในน้ำไขสันหลังด้วยการคัดเลือกการแสดงฟาจเชิงฟังก์ชันในร่างกายสองรอบติดต่อกัน
แบคทีเรียโฟจในน้ำไขสันหลังทั้งหมดที่กู้คืนจากรอบแรกของสัตว์แต่ละตัว (สัตว์ #1.1 และ #1.2) ถูกนำมารวมกัน ขยายพันธุ์ จัดลำดับ HT และฉีดกลับเข้าไปด้วยกัน (แบคทีเรียโฟจ 2 x 1010 ตัวต่อสัตว์) หนูที่ใส่ท่อ SM 2 ตัว (#1.1 → #) 2.1 และ 2.2, 1.2 → 2.3 และ 2.4) (a,b,e,f) กราฟกระจายความสัมพันธ์ที่เปรียบเทียบความถี่สัมพันธ์ของโมทีฟไตรเปปไทด์ของแบคทีเรียโฟจที่ได้จากน้ำไขสันหลังทั้งหมดในรอบการคัดเลือกรอบแรกและรอบที่สอง ความถี่สัมพันธ์และการกระจายของโมทีฟที่แสดงถึงไตรเปปไทด์ที่ทับซ้อนกันทั้งหมดที่พบในเปปไทด์ในทั้งสองทิศทาง แสดงจำนวนโมทีฟที่พบในการอ่าน 1,000 ครั้ง รูปแบบที่ถูกเลือกหรือแยกออกอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.001) ในไลบรารีที่เปรียบเทียบกันจะถูกเน้นด้วยจุดสีแดง (c, d, g, h) การแสดงโลโก้ลำดับของลำดับกรดอะมิโน 12 ตัวที่อุดมด้วย CSF ทั้งหมดโดยอิงจากรอบที่ 2 และ 1 ของการคัดเลือกในร่างกาย ขนาดของรหัสตัวอักษรหนึ่งตัวระบุว่ากรดอะมิโนนั้นเกิดขึ้นบ่อยเพียงใดในตำแหน่งนั้น เพื่อแสดงโลโก้ ความถี่ของลำดับ CSF ที่สกัดจากสัตว์แต่ละตัวระหว่างรอบการคัดเลือกสองรอบจะถูกเปรียบเทียบ และแสดงลำดับที่เสริมประสิทธิภาพในรอบที่สอง: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 และ (h) #1.2–#2.4 กรดอะมิโนที่เสริมประสิทธิภาพสูงสุดในตำแหน่งที่กำหนดใน (c, d) สัตว์หมายเลข 2.1 และหมายเลข 2.2 หรือ (g, h) ในสัตว์หมายเลข 2.3 และหมายเลข 2.4 จะแสดงเป็นสี สีเขียว = ขั้ว, สีม่วง = สีกลาง, สีน้ำเงิน = เบส, สีแดง = กรด และสีดำ = กรดอะมิโนชนิดไม่ชอบน้ำ
หลังจากรอบที่สามของการคัดเลือก เราได้ระบุลำดับเปปไทด์เฉพาะ 124 ลำดับ (#3.1 และ #3.2) จากโคลนฟาจที่สร้างใหม่ใน CSF จำนวน 332 โคลนที่แยกได้จากสัตว์สองตัว (รูปเสริม 6a) ลำดับ LGSVS (18.7%) มีสัดส่วนสัมพัทธ์สูงสุด รองลงมาคือ PAGISRELVDKL (8.2%) MRWFFSHASQGR (3%) DVAKVS (3%) TWLFSLG (2.2%) และ SARGSWREIVSLS (2.2%) ในรอบสุดท้ายที่สี่ เราได้รวบรวมสาขาที่เลือกโดยอิสระสองสาขาจากสัตว์สามตัวที่แยกจากกัน (รูปที่ 1c) จากโคลนฟาจที่สร้างลำดับ 925 โคลนที่แยกได้จาก CSF ในรอบที่สี่ เราพบลำดับเปปไทด์เฉพาะ 64 ลำดับ (รูปเสริม 6b) ซึ่งสัดส่วนสัมพัทธ์ของฟาจประเภทป่าลดลงเหลือ 0.8% โคลน CSF ที่พบมากที่สุดในรอบที่สี่คือ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) และ RLSSVDSDLSGC (3, 2%) ))) ช่วงความยาวของเปปไทด์ที่เลือกนั้นเกิดจากการแทรก/การลบของนิวคลีโอไทด์หรือโคดอนหยุดก่อนกำหนดในไพรเมอร์ไลบรารีเมื่อใช้โคดอนที่เสื่อมสภาพสำหรับการออกแบบไลบรารี NNK โคดอนหยุดก่อนกำหนดจะสร้างเปปไทด์ที่สั้นกว่าและถูกเลือกเนื่องจากมีโมทีฟ aa ที่เหมาะสม เปปไทด์ที่ยาวกว่าอาจเกิดจากการแทรก/การลบในไพรเมอร์ของไลบรารีสังเคราะห์ ซึ่งจะทำให้โคดอนหยุดที่ออกแบบไว้อยู่ภายนอกกรอบและอ่านโคดอนนั้นจนกระทั่งโคดอนหยุดใหม่ปรากฏขึ้นด้านล่าง โดยทั่วไป เราคำนวณปัจจัยการเพิ่มความเข้มข้นสำหรับรอบการคัดเลือกทั้งสี่รอบโดยเปรียบเทียบข้อมูลอินพุตกับข้อมูลเอาต์พุตของตัวอย่าง สำหรับการคัดกรองรอบแรก เราใช้ไทเตอร์ฟาจชนิดป่าเป็นข้อมูลอ้างอิงพื้นหลังที่ไม่จำเพาะเจาะจง ที่น่าสนใจคือ การคัดเลือกฟาจเชิงลบมีความเข้มข้นมากในรอบ CSF รอบแรก แต่ไม่ใช่ในเลือด (รูปที่ 3a) ซึ่งอาจเป็นเพราะความน่าจะเป็นต่ำของการแพร่กระจายแบบพาสซีฟของสมาชิกส่วนใหญ่ของคลังเปปไทด์เข้าไปในช่อง CSF หรือฟาจที่เกี่ยวข้องมีแนวโน้มที่จะถูกเก็บรักษาหรือกำจัดออกจากกระแสเลือดได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าแบคทีเรียโฟจ อย่างไรก็ตาม ในรอบที่สองของการแยกตัวอย่าง พบว่ามีการคัดเลือกฟาจใน CSF จำนวนมากในทั้งสองกลุ่ม ซึ่งแสดงให้เห็นว่ารอบก่อนหน้ามีความเข้มข้นในฟาจที่แสดงเปปไทด์ที่ส่งเสริมการดูดซึม CSF (รูปที่ 3a) อีกครั้ง โดยไม่มีการเพิ่มประสิทธิภาพในเลือดอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ ในรอบที่สามและสี่ โคลนฟาจยังมีความเข้มข้นใน CSF อย่างมีนัยสำคัญ เมื่อเปรียบเทียบความถี่สัมพันธ์ของลำดับเปปไทด์เฉพาะแต่ละลำดับระหว่างรอบคัดเลือกสองรอบสุดท้าย พบว่าลำดับมีความเข้มข้นมากขึ้นในรอบคัดเลือกที่สี่ (รูปที่ 3b) โมทีฟไตรเปปไทด์ทั้งหมด 931 โมทีฟถูกสกัดจากลำดับเปปไทด์เฉพาะทั้งหมด 64 ลำดับโดยใช้การวางแนวเปปไทด์ทั้งสองแบบ โมทีฟที่มีความเข้มข้นมากที่สุดในรอบที่สี่ได้รับการตรวจสอบอย่างใกล้ชิดมากขึ้นสำหรับโปรไฟล์ความเข้มข้นในทุกรอบเมื่อเทียบกับไลบรารีที่ฉีดเข้าไป (จุดตัด: ความเข้มข้น 10%) (รูปเสริม 6c) รูปแบบทั่วไปของการคัดเลือกแสดงให้เห็นว่าโมทีฟที่ศึกษาส่วนใหญ่มีความเข้มข้นในรอบก่อนหน้าทั้งหมดของสาขาการคัดเลือกทั้งสอง อย่างไรก็ตาม โมทีฟบางส่วน (เช่น SGL, VSG, LGS GSV) มาจากกลุ่มทางเลือก A เป็นหลัก ในขณะที่โมทีฟอื่นๆ (เช่น FGW, RTN, WGF, NTR) มีความเข้มข้นในกลุ่มทางเลือก B
การตรวจสอบความถูกต้องของการขนส่ง CSF ของเปปไทด์ที่แสดงฟาจที่เสริมด้วย CSF และเปปไทด์ผู้นำที่ถูกไบโอตินิเลตที่จับคู่กับเพย์โหลดสเตรปตาติดิน
(a) อัตราส่วนการเพิ่มความเข้มข้นที่คำนวณในทั้งสี่รอบ (R1-R4) โดยอิงตามไทเตอร์ฟาจที่ฉีด (อินพุต = I) (PFU) และไทเตอร์ฟาจ CSF ที่กำหนด (เอาท์พุต = O) ปัจจัยการเพิ่มความเข้มข้นสำหรับสามรอบสุดท้าย (R2-R4) คำนวณโดยเปรียบเทียบกับรอบก่อนหน้าและรอบแรก (R1) ด้วยข้อมูลน้ำหนัก แท่งเปิดคือน้ำไขสันหลัง แท่งแรเงาคือพลาสมา (***p<0.001 โดยอิงตามการทดสอบ t ของนักเรียน) (b) รายชื่อเปปไทด์ฟาจที่พบมากที่สุด จัดอันดับตามสัดส่วนสัมพันธ์กับฟาจทั้งหมดที่รวบรวมใน CSF หลังจากรอบที่ 4 ของการคัดเลือก โคลนฟาจที่พบมากที่สุดหกโคลนจะถูกเน้นด้วยสี หมายเลข และปัจจัยการเพิ่มความเข้มข้นระหว่างรอบที่ 3 และ 4 ของการคัดเลือก (ภาพขยาย) (c,d) โคลนฟาจที่เสริมสมรรถนะมากที่สุด 6 โคลนฟาจเปล่า และคลังเปปไทด์ฟาจของพ่อแม่จากรอบที่ 4 ได้รับการวิเคราะห์ทีละรายการในแบบจำลองการสุ่มตัวอย่าง CSF เก็บตัวอย่าง CSF และเลือด ณ จุดเวลาที่ระบุ (c) โคลนฟาจที่เป็นตัวเลือก 6 โคลนในปริมาณเท่ากัน (2 x 1,010 ฟาจ/สัตว์) ฟาจเปล่า (#1779) (2 x 1,010 ฟาจ/สัตว์) และคลังเปปไทด์ฟาจสต็อก (2 x 1,012 ฟาจ/สัตว์) ฉีด CM อย่างน้อย 3 ครั้งให้กับสัตว์ที่ใส่ท่อแยกกันผ่านเส้นเลือดที่หาง เภสัชจลนศาสตร์ CSF ของโคลนฟาจที่ฉีดและคลังเปปไทด์ฟาจแต่ละตัวในช่วงเวลาต่างๆ จะแสดงไว้ (d) แสดงอัตราส่วน CSF/เลือดเฉลี่ยสำหรับฟาจที่กู้คืนทั้งหมด/มล. ในช่วงเวลาการสุ่มตัวอย่าง (e) เปปไทด์ตัวนำสังเคราะห์สี่ตัวและเปปไทด์ควบคุมแบบสับเปลี่ยนหนึ่งตัวถูกเชื่อมกับไบโอตินกับสเตรปตาติดินผ่านปลายด้าน N (จอแสดงผลเททระเมอร์) ตามด้วยการฉีด (หลอดเลือดดำหาง iv, สเตรปตาติดิน 10 มก./กก.) หนูที่ใส่ท่อช่วยหายใจอย่างน้อยสามตัว (N = 3) ) ตัวอย่างน้ำไขสันหลังถูกเก็บรวบรวม ณ จุดเวลาที่ระบุ และวัดความเข้มข้นของสเตรปตาติดินโดยใช้ ELISA ของแอนติสเตรปตาติดินในน้ำไขสันหลัง (nd = ไม่ตรวจพบ) (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 จากการทดสอบ ANOVA) (f) การเปรียบเทียบลำดับกรดอะมิโนของโคลนเปปไทด์ฟาจที่มีความเข้มข้นสูงสุด #2002 (สีม่วง) กับโคลนเปปไทด์ฟาจอื่นๆ ที่เลือกจากการคัดเลือกรอบที่ 4 เศษกรดอะมิโนที่เหมือนกันและคล้ายคลึงกันจะถูกระบุด้วยรหัสสี
จากฟาจที่เสริมสมรรถนะทั้งหมดในรอบที่สี่ (รูปที่ 3b) มีการเลือกโคลนผู้สมัครหกโคลนสำหรับการวิเคราะห์รายบุคคลเพิ่มเติมในแบบจำลองการสุ่มตัวอย่าง CSF โคลนฟาจผู้สมัครหกโคลน ฟาจเปล่า (ไม่มีตัวแทรก) และห้องสมุดเปปไทด์โปรฟาจในปริมาณที่เท่ากันถูกฉีดเข้าไปในสัตว์ CM ที่ใส่ท่อสามตัว และเภสัชจลนศาสตร์ถูกกำหนดใน CSF (รูปที่ 3c) และเลือด (รูปเสริมที่ 7) โคลนฟาจทั้งหมดที่ทดสอบกำหนดเป้าหมายช่อง CSF ที่ระดับที่สูงกว่าฟาจควบคุมเปล่า (#1779) 10-1000 เท่า ตัวอย่างเช่น โคลน #2020 และ #2077 มีระดับไทเตอร์ CSF สูงกว่าฟาจควบคุมประมาณ 1000 เท่า โปรไฟล์เภสัชจลนศาสตร์ของเปปไทด์ที่เลือกแต่ละตัวนั้นแตกต่างกัน แต่ทั้งหมดมีความสามารถในการกลับสู่ CSF สูง เราสังเกตเห็นการลดลงอย่างต่อเนื่องเมื่อเวลาผ่านไปสำหรับโคลน #1903 และ #2011 ในขณะที่โคลน #2077, #2002 และ #2009 การเพิ่มขึ้นในช่วง 10 นาทีแรกอาจบ่งชี้ถึงการขนส่งที่ใช้งานอยู่ แต่ต้องมีการตรวจยืนยัน โคลน #2020, #2002 และ #2077 คงตัวที่ระดับสูง ในขณะที่ความเข้มข้นของ CSF ของโคลน #2009 ลดลงอย่างช้าๆ หลังจากการเพิ่มขึ้นเริ่มต้น จากนั้นเราจึงเปรียบเทียบความถี่สัมพันธ์ของผู้สมัคร CSF แต่ละตัวกับความเข้มข้นในเลือด (รูปที่ 3d) ความสัมพันธ์ของค่าไทเตอร์เฉลี่ยของผู้สมัคร CSF แต่ละตัวกับค่าไทเตอร์ในเลือดในทุกช่วงเวลาการสุ่มตัวอย่างแสดงให้เห็นว่าผู้สมัคร 3 ใน 6 รายมี CSF ในเลือดเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ที่น่าสนใจคือ โคลน #2077 แสดงให้เห็นเสถียรภาพของเลือดที่สูงกว่า (รูปภาพเสริมที่ 7) เพื่อยืนยันว่าเปปไทด์นั้นสามารถขนส่งสิ่งของอื่นๆ นอกเหนือจากอนุภาคฟาจเข้าไปในช่อง CSF ได้อย่างแข็งขัน เราจึงสังเคราะห์เปปไทด์ตัวนำสี่ตัวที่มีอนุพันธ์เป็นไบโอตินที่ปลายด้าน N ซึ่งเป็นจุดที่เปปไทด์จะเกาะติดกับอนุภาคฟาจ เปปไทด์ที่ถูกไบโอตินิเลต (หมายเลข 2002, 2009, 2020 และ 2077) ถูกจับคู่กับสเตรปตาวิดิน (SA) เพื่อให้ได้รูปแบบมัลติเมอร์ที่เลียนแบบรูปทรงของฟาจได้ในระดับหนึ่ง รูปแบบนี้ยังช่วยให้เราสามารถวัดการสัมผัส SA ในเลือดและน้ำไขสันหลังเป็นเปปไทด์โปรตีนที่ขนส่งสิ่งของได้ สิ่งสำคัญคือ มักจะสามารถจำลองข้อมูลฟาจได้เมื่อมีการให้เปปไทด์สังเคราะห์ในรูปแบบที่จับคู่ SA นี้ (รูปที่ 3e) เปปไทด์ที่ผสมกันจะมีการสัมผัสเริ่มต้นน้อยกว่าและเคลียร์ CSF ได้เร็วกว่าด้วยระดับที่ตรวจไม่พบภายใน 48 ชั่วโมง เพื่อให้เข้าใจอย่างลึกซึ้งถึงเส้นทางการขนส่งของโคลนฟาจเปปไทด์เหล่านี้เข้าไปในช่องว่างของน้ำไขสันหลัง เราได้วิเคราะห์ตำแหน่งของเปปไทด์ฟาจแต่ละตัวโดยใช้ภูมิคุ้มกันเนื้อเยื่อ (IHC) เพื่อตรวจจับอนุภาคฟาจโดยตรง 1 ชั่วโมงหลังจากฉีดเข้าเส้นเลือดในร่างกาย โดยเฉพาะอย่างยิ่ง โคลน #2002, #2077 และ #2009 สามารถตรวจพบได้โดยการย้อมสีอย่างเข้มข้นในเส้นเลือดฝอยของสมอง ในขณะที่ไม่พบฟาจควบคุม (#1779) และโคลน #2020 (ภาพเสริมที่ 8) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าเปปไทด์เหล่านี้มีส่วนสนับสนุนผลกระทบต่อสมองอย่างแม่นยำโดยการผ่าน BBB จำเป็นต้องมีการวิเคราะห์โดยละเอียดเพิ่มเติมเพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ เนื่องจากเส้นทาง BSCFB อาจเกี่ยวข้องด้วย เมื่อเปรียบเทียบลำดับกรดอะมิโนของโคลนที่มีความเข้มข้นมากที่สุด (#2002) กับเปปไทด์ที่เลือกอื่นๆ พบว่าเปปไทด์บางตัวมีส่วนขยายของกรดอะมิโนที่คล้ายกัน ซึ่งอาจบ่งชี้ถึงกลไกการขนส่งที่คล้ายกัน (รูปที่ 3f)
เนื่องจากโปรไฟล์พลาสมาที่ไม่เหมือนใครและการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของ CSF เมื่อเวลาผ่านไป โคลนแสดงฟาจ #2077 จึงได้รับการสำรวจเพิ่มเติมในช่วงเวลา 48 ชั่วโมงที่ยาวนานขึ้น และสามารถสร้างการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของ CSF ที่สังเกตได้ร่วมกับระดับ SA ที่คงที่ (รูปที่ 4a) สำหรับโคลนฟาจที่ระบุอื่นๆ #2077 ย้อมได้อย่างชัดเจนสำหรับเส้นเลือดฝอยในสมองและแสดงการอยู่ร่วมกันอย่างมีนัยสำคัญกับเลกตินซึ่งเป็นมาร์กเกอร์เส้นเลือดฝอยเมื่อมองด้วยความละเอียดสูงขึ้น และอาจมีการย้อมบางส่วนในช่องว่างของเนื้อเยื่อ (รูปที่ 4b) เพื่อศึกษาว่าสามารถรับผลทางเภสัชวิทยาที่ควบคุมโดยเปปไทด์ใน CNS ได้หรือไม่ เราได้ทำการทดลองโดยผสมเวอร์ชันไบโอตินิเลตของ i) เปปไทด์ทรานสิต #2077 และ ii) เปปไทด์ยับยั้ง BACE1 กับ SA ในอัตราส่วนที่แตกต่างกันสองแบบ สำหรับการรวมกันแบบหนึ่ง เราใช้เฉพาะสารยับยั้งเปปไทด์ BACE1 และสำหรับการรวมกันแบบอื่น เราใช้อัตราส่วน 1:3 ของสารยับยั้งเปปไทด์ BACE1 ต่อเปปไทด์ #2077 ตัวอย่างทั้งสองตัวอย่างได้รับการฉีดเข้าเส้นเลือดดำ และวัดระดับของเบตาอะไมลอยด์เปปไทด์ 40 (Abeta40) ในเลือดและน้ำไขสันหลังในช่วงเวลาหนึ่ง วัด Abeta40 ใน CSF เนื่องจากสะท้อนถึงการยับยั้ง BACE1 ในเนื้อสมอง ตามที่คาดไว้ คอมเพล็กซ์ทั้งสองสามารถลดระดับ Abeta40 ในเลือดได้อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4c, d) อย่างไรก็ตาม มีเพียงตัวอย่างที่มีส่วนผสมของเปปไทด์หมายเลข 2077 และสารยับยั้งของเปปไทด์ BACE1 ที่จับคู่กับ SA เท่านั้นที่ทำให้ Abeta40 ในน้ำไขสันหลังลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4c) ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าเปปไทด์หมายเลข 2077 สามารถขนส่งโปรตีน SA ขนาด 60 kDa เข้าไปใน CNS ได้ และยังกระตุ้นให้เกิดผลทางเภสัชวิทยาด้วยสารยับยั้งของเปปไทด์ BACE1 ที่จับคู่กับ SA
(a) การฉีดโคลน (2 × 10 ฟาจต่อสัตว์) ของฟาจ T7 ที่แสดงโปรไฟล์เภสัชจลนศาสตร์ระยะยาวของเปปไทด์ CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) และฟาจควบคุมที่ไม่ได้ฉีด (#1779) ในหนูที่ใส่ท่อช่วยหายใจด้วย CM อย่างน้อยสามตัว (b) ภาพกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคัลของไมโครเวสเซลในคอร์เทกซ์ที่เป็นตัวแทนในหนูที่ฉีดฟาจ (2 × 10 10 ฟาจต่อสัตว์) ที่แสดงการย้อมสีตรงกันข้ามของเปปไทด์ #2077 และหลอดเลือด (เลกติน) โคลนฟาจเหล่านี้ถูกให้กับหนู 3 ตัวและปล่อยให้หมุนเวียนเป็นเวลา 1 ชั่วโมงก่อนการไหลเวียนเลือด สมองถูกแบ่งส่วนและย้อมด้วยแอนติบอดีที่ติดฉลาก FITC โพลีโคลนัลต่อแคปซิดของฟาจ T7 สิบนาทีก่อนการไหลเวียนเลือดและการตรึงในภายหลัง เลกตินที่ติดฉลาก DyLight594 จะถูกให้ทางเส้นเลือดดำ ภาพฟลูออเรสเซนต์แสดงการย้อมเลกติน (สีแดง) ของด้านลูเมนของไมโครเวสเซลและฟาจ (สีเขียว) ในลูเมนของเส้นเลือดฝอยและเนื้อเยื่อสมองรอบหลอดเลือด แถบมาตราส่วนสอดคล้องกับ 10 µm (c, d) เปปไทด์ยับยั้ง BACE1 ที่ถูกไบโอตินิเลตเพียงอย่างเดียวหรือร่วมกับเปปไทด์ทรานซิตไบโอตินิเลต #2077 ถูกจับคู่กับสเตรปตาวิดิน ตามด้วยการฉีดเข้าเส้นเลือดดำของหนู CM ที่ใส่ท่ออย่างน้อยสามตัว (สเตรปตาวิดิน 10 มก./กก.) การลดลงของ Aβ40 ที่เกิดจากสารยับยั้งเปปไทด์ BACE1 ถูกวัดโดยวิธี ELISA Aβ1-40 ในเลือด (สีแดง) และน้ำไขสันหลัง (สีส้ม) ณ จุดเวลาที่ระบุ เพื่อความชัดเจนยิ่งขึ้น เส้นประจะถูกวาดบนกราฟที่มาตราส่วน 100% (c) การลดลงของ Aβ40 ในเลือด (สามเหลี่ยมสีแดง) และน้ำไขสันหลัง (สามเหลี่ยมสีส้ม) ในหนูที่ได้รับการรักษาด้วยสเตรปตาวิดินที่จับคู่กับเปปไทด์ทรานสิต #2077 และเปปไทด์ยับยั้ง BACE1 ในอัตราส่วน 3:1 (d) การลดลงของ Aβ40 ในเลือด (วงกลมสีแดง) และน้ำไขสันหลัง (วงกลมสีส้ม) ในหนูที่ได้รับการรักษาด้วยสเตรปตาวิดินที่จับคู่กับเปปไทด์ยับยั้ง BACE1 เท่านั้น ความเข้มข้นของ Aβ ในกลุ่มควบคุมคือ 420 pg/ml (ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน = 101 pg/ml)
การแสดงผลของฟาจได้รับการนำไปใช้สำเร็จแล้วในหลายพื้นที่ของการวิจัยทางชีวการแพทย์17 วิธีนี้ใช้สำหรับการศึกษาความหลากหลายของหลอดเลือดในร่างกาย18,19 เช่นเดียวกับการศึกษาที่กำหนดเป้าหมายไปที่หลอดเลือดสมอง20,21,22,23,24,25,26 ในการศึกษานี้ เราได้ขยายการประยุกต์ใช้ของวิธีการคัดเลือกนี้ไม่เพียงแต่เพื่อระบุเปปไทด์ที่กำหนดเป้าหมายไปที่หลอดเลือดสมองโดยตรงเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการค้นพบผู้สมัครที่มีคุณสมบัติในการขนส่งที่ใช้งานเพื่อข้ามผ่านอุปสรรคเลือดสมองอีกด้วย ขณะนี้ เราได้อธิบายการพัฒนากระบวนการคัดเลือกในร่างกายในหนูที่ใส่ท่อช่วยหายใจ CM และแสดงศักยภาพในการระบุเปปไทด์ที่มีคุณสมบัติในการนำน้ำไขสันหลังกลับคืนสู่ CSF ด้วยการใช้ฟาจ T7 ที่แสดงคลังเปปไทด์สุ่ม 12 เมอร์ เราสามารถแสดงให้เห็นว่าฟาจ T7 มีขนาดเล็กเพียงพอ (เส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 60 นาโนเมตร)10 ที่จะปรับให้เข้ากับอุปสรรคเลือดสมองได้ จึงข้ามผ่านอุปสรรคเลือดสมองหรือกลุ่มเส้นประสาทโครอยด์ได้โดยตรง เราพบว่าการเก็บเกี่ยว CSF จากหนู CM ที่ใส่ท่อเป็นวิธีการคัดกรองการทำงานในร่างกายที่ควบคุมได้ดี และฟาจที่สกัดได้ไม่เพียงแต่จับกับหลอดเลือดเท่านั้น แต่ยังทำหน้าที่เป็นตัวขนส่งข้ามอุปสรรคเลือด-สมองอีกด้วย ยิ่งไปกว่านั้น ด้วยการเก็บเลือดและนำ HTS ไปใช้กับ CSF และฟาจที่ได้จากเลือดพร้อมกัน เราจึงยืนยันได้ว่าการเลือก CSF ของเราไม่ได้รับอิทธิพลจากการเสริมความเข้มข้นของเลือดหรือความเหมาะสมในการขยายตัวระหว่างรอบการคัดเลือก อย่างไรก็ตาม ช่องเลือดเป็นส่วนหนึ่งของขั้นตอนการคัดเลือก เนื่องจากฟาจที่สามารถเข้าถึงช่อง CSF ได้จะต้องอยู่รอดและหมุนเวียนอยู่ในกระแสเลือดได้นานพอที่จะเพิ่มความเข้มข้นในสมองได้ เพื่อสกัดข้อมูลลำดับที่เชื่อถือได้จากข้อมูล HTS ดิบ เราได้นำตัวกรองที่ปรับให้เข้ากับข้อผิดพลาดในการจัดลำดับเฉพาะแพลตฟอร์มมาใช้ในเวิร์กโฟลว์การวิเคราะห์ โดยการรวมพารามิเตอร์จลนศาสตร์เข้าในวิธีการคัดกรอง เราได้ยืนยันเภสัชจลนศาสตร์ที่รวดเร็วของฟาจ T7 ชนิดป่า (t½ ~ 28 นาที) ในเลือด24, 27, 28 และยังได้กำหนดครึ่งชีวิตของฟาจในน้ำไขสันหลัง (t½ ~ 26 นาที) ต่อนาทีอีกด้วย แม้จะมีโปรไฟล์เภสัชจลนศาสตร์ที่คล้ายกันในเลือดและ CSF แต่สามารถตรวจพบความเข้มข้นของฟาจในเลือดได้เพียง 0.001% ใน CSF ซึ่งบ่งชี้ถึงการเคลื่อนที่พื้นหลังที่ต่ำของฟาจ T7 ชนิดป่าข้ามอุปสรรคเลือด-สมอง งานนี้เน้นย้ำถึงความสำคัญของการคัดเลือกรอบแรกเมื่อใช้กลยุทธ์การแพนนิ่งในร่างกาย โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับระบบฟาจที่ถูกกำจัดออกจากการไหลเวียนอย่างรวดเร็ว เนื่องจากโคลนเพียงไม่กี่ตัวสามารถเข้าถึงช่อง CNS ได้ ดังนั้น ในรอบแรก ความหลากหลายของคลังข้อมูลลดลงอย่างมาก เนื่องจากในท้ายที่สุดมีการรวบรวมโคลนเพียงจำนวนจำกัดในแบบจำลอง CSF ที่เข้มงวดมากนี้ กลยุทธ์การคัดกรองแบบ in vivo นี้รวมถึงขั้นตอนการคัดเลือกหลายขั้นตอน เช่น การสะสมอย่างแข็งขันในช่อง CSF การอยู่รอดของโคลนในช่องเลือด และการกำจัดโคลนฟาจ T7 ออกจากเลือดอย่างรวดเร็วภายใน 10 นาทีแรก (รูปที่ 1d และรูปที่เสริม 4M) ดังนั้น หลังจากรอบแรก โคลนฟาจที่แตกต่างกันจึงถูกระบุใน CSF แม้ว่าจะใช้กลุ่มเริ่มต้นเดียวกันสำหรับสัตว์แต่ละตัว สิ่งนี้บ่งชี้ว่าขั้นตอนการคัดเลือกที่เข้มงวดหลายขั้นตอนสำหรับไลบรารีแหล่งที่มาที่มีสมาชิกในไลบรารีจำนวนมากส่งผลให้ความหลากหลายลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ดังนั้น เหตุการณ์สุ่มจะกลายเป็นส่วนสำคัญของกระบวนการคัดเลือกเริ่มต้น ซึ่งมีอิทธิพลอย่างมากต่อผลลัพธ์ มีแนวโน้มว่าโคลนจำนวนมากในไลบรารีดั้งเดิมมีแนวโน้มในการเพิ่มความเข้มข้นของ CSF ที่คล้ายกันมาก อย่างไรก็ตาม แม้จะอยู่ในสภาวะการทดลองเดียวกัน ผลการคัดเลือกอาจแตกต่างกันเนื่องจากโคลนเฉพาะแต่ละตัวมีจำนวนน้อยในกลุ่มเริ่มต้น
รูปแบบที่เพิ่มความเข้มข้นในน้ำไขสันหลังแตกต่างจากในเลือด ที่น่าสนใจคือ เราสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงครั้งแรกสู่เปปไทด์ที่อุดมด้วยไกลซีนในเลือดของสัตว์แต่ละตัว (รูปที่ 1g, รูปเสริม 4e, 4f) ฟาจที่มีเปปไทด์ไกลซีนอาจเสถียรกว่าและมีโอกาสถูกนำออกจากการไหลเวียนน้อยกว่า อย่างไรก็ตาม เปปไทด์ที่อุดมด้วยไกลซีนเหล่านี้ไม่ถูกตรวจพบในตัวอย่างน้ำไขสันหลัง ซึ่งแสดงให้เห็นว่าห้องสมุดที่ดูแลนั้นผ่านขั้นตอนการคัดเลือกที่แตกต่างกันสองขั้นตอน ขั้นตอนหนึ่งอยู่ในเลือดและอีกขั้นตอนหนึ่งปล่อยให้สะสมในน้ำไขสันหลัง โคลนที่เพิ่มความเข้มข้นในน้ำไขสันหลังซึ่งเป็นผลมาจากการคัดเลือกรอบที่สี่ได้รับการทดสอบอย่างกว้างขวาง โคลนที่ทดสอบทีละตัวเกือบทั้งหมดได้รับการยืนยันว่ามีการเพิ่มความเข้มข้นในน้ำไขสันหลังเมื่อเปรียบเทียบกับฟาจควบคุมเปล่า มีการตรวจสอบเปปไทด์หนึ่งรายการ (#2077) อย่างละเอียดมากขึ้น พบว่ามีอายุครึ่งชีวิตของพลาสมายาวนานกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการพบแบบอื่น (รูปที่ 3d และรูปที่ 7 เสริม) และที่น่าสนใจคือเปปไทด์นี้มีสารตกค้างของซิสเทอีนที่ปลาย C เมื่อไม่นานมานี้มีการแสดงให้เห็นว่าการเพิ่มซิสเทอีนลงในเปปไทด์สามารถปรับปรุงคุณสมบัติทางเภสัชจลนศาสตร์ของเปปไทด์ได้โดยการจับกับอัลบูมิน 29 ซึ่งปัจจุบันยังไม่ทราบแน่ชัดสำหรับเปปไทด์ #2077 และต้องมีการศึกษาเพิ่มเติม เปปไทด์บางชนิดแสดงการพึ่งพาวาเลนซ์ในการเพิ่มความเข้มข้นของน้ำหล่อสมอง (ไม่มีการแสดงข้อมูล) ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับรูปทรงพื้นผิวที่แสดงของแคปซิด T7 ระบบ T7 ที่เราใช้แสดงเปปไทด์แต่ละชุดจำนวน 5-15 ชุดต่ออนุภาคฟาจ IHC ดำเนินการกับโคลนฟาจตะกั่วที่ฉีดเข้าเส้นเลือดดำในเปลือกสมองของหนู (รูปที่ 8 เสริม) ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าโคลนอย่างน้อยสามโคลน (หมายเลข 2002 หมายเลข 2009 และหมายเลข 2077) โต้ตอบกับ BBB ยังคงต้องพิจารณาว่าการโต้ตอบกับ BBB นี้ส่งผลให้เกิดการสะสมของ CSF หรือการเคลื่อนที่ของโคลนเหล่านี้โดยตรงไปยัง BCSFB หรือไม่ สิ่งสำคัญคือ เราแสดงให้เห็นว่าเปปไทด์ที่เลือกยังคงความสามารถในการขนส่ง CSF ไว้ได้เมื่อสังเคราะห์และผูกกับโปรตีน การจับของเปปไทด์ที่ถูกไบโอตินิเลตที่ปลาย N กับ SA จะทำให้ผลลัพธ์ที่ได้จากโคลนฟาจที่เกี่ยวข้องในเลือดและน้ำไขสันหลังทำซ้ำได้ (รูปที่ 3e) สุดท้าย เราแสดงให้เห็นว่าเปปไทด์ตะกั่ว #2077 สามารถส่งเสริมการทำงานของสมองของสารยับยั้งเปปไทด์ที่ถูกไบโอตินิเลตของ BACE1 ที่จับกับ SA ทำให้เกิดผลทางเภสัชพลวัตที่ชัดเจนใน CNS โดยลดระดับ Abeta40 ใน CSF อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4) เราไม่สามารถระบุโฮโมล็อกใดๆ ในฐานข้อมูลได้โดยการค้นหาโฮโมล็อกลำดับเปปไทด์จากข้อมูลทั้งหมด สิ่งสำคัญคือต้องทราบว่าขนาดของไลบรารี T7 อยู่ที่ประมาณ 109 ในขณะที่ขนาดไลบรารีเชิงทฤษฎีสำหรับ 12 เมอร์คือ 4 x 1015 ดังนั้น เราจึงเลือกเฉพาะเศษส่วนเล็กๆ ของพื้นที่ความหลากหลายของไลบรารีเปปไทด์ 12 เมอร์เท่านั้น ซึ่งอาจหมายความว่าสามารถระบุเปปไทด์ที่เหมาะสมยิ่งขึ้นได้โดยการประเมินพื้นที่ลำดับที่อยู่ติดกันของข้อมูลที่ระบุเหล่านี้ ตามสมมติฐาน เหตุผลประการหนึ่งที่เราไม่พบโฮโมล็อกตามธรรมชาติของเปปไทด์เหล่านี้อาจเป็นเพราะการไม่เลือกระหว่างวิวัฒนาการเพื่อป้องกันการเข้าสู่สมองโดยไม่ได้รับการควบคุมของลวดลายเปปไทด์บางชนิด
เมื่อนำมารวมกันแล้ว ผลลัพธ์ของเราจะเป็นพื้นฐานสำหรับงานในอนาคตเพื่อระบุและกำหนดลักษณะระบบการขนส่งของอุปสรรคหลอดเลือดสมองในร่างกายอย่างละเอียดมากขึ้น การตั้งค่าพื้นฐานของวิธีนี้ขึ้นอยู่กับกลยุทธ์การคัดเลือกการทำงานที่ไม่เพียงแต่ระบุโคลนที่มีคุณสมบัติในการจับกับหลอดเลือดสมองเท่านั้น แต่ยังรวมถึงขั้นตอนสำคัญที่โคลนที่ประสบความสำเร็จจะมีกิจกรรมโดยธรรมชาติในการข้ามอุปสรรคทางชีวภาพในร่างกายเข้าไปในช่อง CNS คือการอธิบายกลไกการขนส่งของเปปไทด์เหล่านี้และความต้องการในการจับกับไมโครหลอดเลือดที่เฉพาะเจาะจงกับบริเวณสมอง ซึ่งอาจนำไปสู่การค้นพบเส้นทางใหม่สำหรับการขนส่ง BBB และตัวรับ เราคาดว่าเปปไทด์ที่ระบุสามารถจับกับตัวรับหลอดเลือดสมองหรือกับลิแกนด์ที่ไหลเวียนซึ่งขนส่งผ่าน BBB หรือ BCSFB ได้โดยตรง เวกเตอร์เปปไทด์ที่มีกิจกรรมการขนส่ง CSF ที่ค้นพบในงานนี้จะได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติม ขณะนี้ เรากำลังตรวจสอบความจำเพาะของเปปไทด์เหล่านี้ในสมองสำหรับความสามารถในการข้าม BBB และ/หรือ BCSFB เปปไทด์ใหม่เหล่านี้จะเป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าอย่างยิ่งสำหรับการค้นพบตัวรับหรือเส้นทางใหม่ๆ ที่อาจเกิดขึ้น และสำหรับการพัฒนาแพลตฟอร์มใหม่ที่มีประสิทธิภาพสูงในการส่งมอบโมเลกุลขนาดใหญ่ เช่น ผลิตภัณฑ์ทางชีวภาพ ไปยังสมอง
ทำการใส่ท่อในโถปัสสาวะขนาดใหญ่ (CM) โดยใช้วิธีการดัดแปลงที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ หนูวิสตาร์ที่ได้รับยาสลบ (น้ำหนัก 200-350 กรัม) ถูกติดตั้งบนเครื่องสเตอริโอแท็กซิก และทำการกรีดบริเวณกลางศีรษะที่โกนและเตรียมโดยปราศจากเชื้อเพื่อเปิดเผยกะโหลกศีรษะ เจาะรูสองรูในบริเวณของแถบด้านบนและขันสกรูยึดในรู เจาะรูเพิ่มเติมที่สันท้ายทอยด้านข้างเพื่อนำทางแบบสเตอริโอแท็กซิกของเข็มสเตนเลสเข้าไปใน CM ทาซีเมนต์สำหรับทันตกรรมรอบเข็มและยึดด้วยสกรู หลังจากบ่มด้วยแสงและทำให้ซีเมนต์แข็งตัวแล้ว แผลที่ผิวหนังจะถูกปิดด้วยการเย็บแบบซูปรามิด 4/0 ยืนยันการวางเข็มที่ถูกต้องโดยสังเกตการรั่วของน้ำไขสันหลัง (CSF) ที่เกิดขึ้นเอง นำหนูออกจากเครื่อง stereotaxic รับการดูแลหลังผ่าตัดและการจัดการความเจ็บปวดที่เหมาะสม และปล่อยให้หนูฟื้นตัวอย่างน้อยหนึ่งสัปดาห์จนกว่าจะสังเกตเห็นสัญญาณของเลือดในน้ำไขสันหลัง หนูวิสตาร์ (Crl:WI/Han) ได้มาจาก Charles River (ฝรั่งเศส) หนูทุกตัวถูกเลี้ยงไว้ในสภาวะที่ปราศจากเชื้อโรคเฉพาะ การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากสำนักงานสัตวแพทย์ของเมืองบาเซิล ประเทศสวิตเซอร์แลนด์ และดำเนินการตามใบอนุญาตสัตว์หมายเลข 2474 (การประเมินการขนส่งสมองที่ทำงานอยู่โดยการวัดระดับของสารออกฤทธิ์ในน้ำไขสันหลังและสมองของหนู)
ให้หนูมีสติโดยถือเข็ม CM ไว้ในมือ นำ Datura ออกจากเข็มและเก็บน้ำไขสันหลังที่ไหลเอง 10 µl เนื่องจากความสามารถในการเปิดของเข็มลดลง จึงรวมเฉพาะตัวอย่างน้ำไขสันหลังที่ใสและไม่มีหลักฐานของการปนเปื้อนของเลือดหรือการเปลี่ยนสีเท่านั้นในการศึกษานี้ ในเวลาเดียวกัน เลือดประมาณ 10–20 µl จะถูกเก็บจากแผลเล็ก ๆ ที่ปลายหางลงในหลอดที่มีเฮปาริน (Sigma-Aldrich) น้ำไขสันหลังและเลือดจะถูกเก็บในช่วงเวลาต่าง ๆ หลังจากการฉีด T7 phage เข้าทางเส้นเลือดดำ ของเหลวประมาณ 5–10 µl จะถูกทิ้งก่อนที่จะเก็บตัวอย่างน้ำไขสันหลังแต่ละตัวอย่าง ซึ่งสอดคล้องกับปริมาตรที่หมดไปของสายสวน
ห้องสมุดถูกสร้างขึ้นโดยใช้เวกเตอร์ T7Select 10-3b ตามที่อธิบายไว้ในคู่มือระบบ T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) โดยสรุปแล้ว จะมีการสังเคราะห์ดีเอ็นเอแบบสุ่ม 12 เมอร์ในรูปแบบต่อไปนี้:
โคดอน NNK ถูกใช้เพื่อหลีกเลี่ยงโคดอนหยุดคู่และการแสดงออกของกรดอะมิโนมากเกินไปในแผ่นแทรก N คืออัตราส่วนโมลาร์เท่ากันของนิวคลีโอไทด์แต่ละตัวที่ผสมด้วยมือ และ K คืออัตราส่วนโมลาร์เท่ากันของนิวคลีโอไทด์อะดีนีนและไซโทซีนที่ผสมด้วยมือ บริเวณสายเดี่ยวถูกแปลงเป็นดีเอ็นเอสายคู่โดยการบ่มเพิ่มเติมกับ dNTP (Novagen) และเอนไซม์ Klenow (New England Biolabs) ในบัฟเฟอร์ Klenow (New England Biolabs) เป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 37°C หลังจากปฏิกิริยา ดีเอ็นเอสายคู่จะถูกกู้คืนโดยการตกตะกอน EtOH ดีเอ็นเอที่ได้จะถูกย่อยด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ EcoRI และ HindIII (ทั้งคู่จาก Roche) จากนั้นทำการผูกแผ่นแทรกที่แยกและทำให้บริสุทธิ์ (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) เข้ากับเวกเตอร์ T7 ที่แยกไว้ล่วงหน้าหลังจากกรดอะมิโน 348 ของยีนแคปซิด 10B จากนั้นทำการฟักปฏิกิริยาผูกแผ่นที่ 16°C เป็นเวลา 18 ชั่วโมงก่อนการบรรจุในหลอดทดลอง การบรรจุฟาจในหลอดทดลองดำเนินการตามคำแนะนำที่ให้มาพร้อมกับชุดโคลนนิ่ง T7Select 10-3b (Novagen) และขยายสารละลายสำหรับการบรรจุหนึ่งครั้งเพื่อสลายโดยใช้ Escherichia coli (BLT5615, Novagen) ไลเสทถูกปั่นเหวี่ยง ไทเทรต และแช่แข็งที่ -80°C เป็นสารละลายสต็อกของกลีเซอรอล
การขยาย PCR โดยตรงของบริเวณแปรผันของฟาจที่ขยายในน้ำซุปหรือแผ่นโดยใช้ไพรเมอร์ฟิวชัน 454/Roche-amplicon ที่เป็นกรรมสิทธิ์ ไพรเมอร์ฟิวชันไปข้างหน้าประกอบด้วยลำดับที่อยู่ติดกับบริเวณแปรผัน (NNK) 12 (เฉพาะเทมเพลต) อะแดปเตอร์ไททาเนียม GS FLX A และลำดับคีย์ไลบรารีเบสสี่ตัว (TCAG) (รูปภาพเสริม 1a):
ไพรเมอร์ฟิวชันย้อนกลับยังประกอบด้วยไบโอตินที่ติดอยู่กับลูกปัดจับและอะแดปเตอร์ไททาเนียม GS FLX B ที่จำเป็นสำหรับการขยายโคลนระหว่าง PCR แบบอิมัลชัน:
จากนั้นแอมพลิคอนจะถูกทำให้มีลำดับไพโรซีเควนซิ่ง 454/Roche ตามโปรโตคอล 454 GS-FLX Titanium สำหรับการจัดลำดับแซงเกอร์แบบแมนนวล (เครื่องวิเคราะห์ดีเอ็นเอ Hitachi 3730 xl ของ Applied Biosystems) ดีเอ็นเอฟาจ T7 จะถูกขยายด้วย PCR และจัดลำดับด้วยไพรเมอร์คู่ต่อไปนี้:
นำแผ่นแทรกจากแผ่นแยกแต่ละแผ่นไปขยายด้วย PCR โดยใช้ Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (ตามคำแนะนำของผู้ผลิต) ทำการสตาร์ทแบบร้อน (10 นาทีที่อุณหภูมิ 95 °C) และเร่งรอบ 35 รอบ (50 วินาทีที่อุณหภูมิ 95 °C, 1 นาทีที่อุณหภูมิ 50 °C และ 1 นาทีที่อุณหภูมิ 72 °C)
ฟาจจากห้องสมุด ฟาจชนิดป่า ฟาจที่กู้คืนมาจาก CSF และเลือด หรือโคลนแต่ละตัวถูกขยายพันธุ์ใน Escherichia coli BL5615 ในน้ำซุป TB (Sigma Aldrich) หรือในจานขนาด 500 ซม.2 (Thermo Scientific) เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 37°C ฟาจถูกสกัดออกจากเพลตโดยการล้างเพลตด้วยบัฟเฟอร์ Tris-EDTA (Fluka Analytical) หรือโดยการรวบรวมคราบจุลินทรีย์ด้วยปลายปิเปตที่ผ่านการฆ่าเชื้อ ฟาจถูกแยกออกจากวัฒนธรรมของเหลวเหนือตะกอนหรือบัฟเฟอร์การสกัดด้วยตะกอนโพลีเอทิลีนไกลคอล (PEG 8000) หนึ่งรอบ (Promega) และถูกทำให้เป็นสารแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ Tris-EDTA
แบคทีเรียโฟจที่ขยายตัวถูกกำจัดเอนโดทอกซิน 2-3 รอบโดยใช้ลูกปัดกำจัดเอนโดทอกซิน (Miltenyi Biotec) ก่อนฉีดเข้าเส้นเลือดดำ (IV) (500 μl/ตัว) ในรอบแรก แบคทีเรียโฟจ 2x1012 ตัวถูกนำเข้ามา ในรอบที่สอง แบคทีเรียโฟจ 2x1010 ตัว ในรอบการคัดเลือกรอบที่สามและสี่ แบคทีเรียโฟจ 2x109 ตัวต่อตัว ปริมาณแบคทีเรียโฟจในน้ำหล่อสมองไขสันหลังและตัวอย่างเลือดที่เก็บในช่วงเวลาที่ระบุจะถูกกำหนดโดยการนับคราบจุลินทรีย์ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (คู่มือระบบ T7Select) การคัดเลือกฟาจดำเนินการโดยการฉีดไลบรารีที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์เข้าทางเส้นเลือดดำที่บริเวณหาง หรือโดยการฉีดฟาจที่สกัดจาก CSF จากรอบการคัดเลือกครั้งก่อนกลับเข้าไปใหม่ และทำการเก็บเกี่ยวในเวลา 10 นาที 30 นาที 60 นาที 90 นาที 120 นาที 180 นาที และ 240 นาที ตามลำดับ โดยใช้ CSF และตัวอย่างเลือด มีการดำเนินการแยกตัวอย่างในร่างกายทั้งหมด 4 รอบ โดยเก็บและวิเคราะห์กิ่งที่เลือกไว้แยกกันสองกิ่งในช่วงสามรอบแรกของการคัดเลือก ฟาจแทรกทั้งหมดที่สกัดจาก CSF จากสองรอบแรกของการคัดเลือกได้รับการจัดลำดับไพโรซีเควนซิ่งด้วย 454/Roche ในขณะที่โคลนทั้งหมดที่สกัดจาก CSF จากสองรอบสุดท้ายของการคัดเลือกได้รับการจัดลำดับด้วยมือ ฟาจในเลือดทั้งหมดจากรอบแรกของการคัดเลือกได้รับการจัดลำดับไพโรซีเควนซิ่งด้วย 454/Roche เช่นกัน สำหรับการฉีดโคลนฟาจ ฟาจที่เลือกจะถูกขยายใน E. coli (BL5615) บนจานขนาด 500 ซม.2 ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 4 ชั่วโมง โคลนที่เลือกทีละตัวและเรียงลำดับด้วยมือถูกขยายพันธุ์ในอาหารเลี้ยงเชื้อ TB หลังจากการสกัดฟาจ การทำให้บริสุทธิ์ และการกำจัดเอนโดทอกซิน (ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น) ฟาจ 2×1010 ตัวต่อสัตว์ในปริมาตร 300 μl ถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำที่หางข้างหนึ่ง
การประมวลผลล่วงหน้าและการกรองข้อมูลลำดับเชิงคุณภาพ ข้อมูลดิบ 454/Roche ถูกแปลงจากรูปแบบสตรีมแมปมาตรฐานไบนารี (sff) เป็นรูปแบบที่มนุษย์อ่านได้ของ Pearson (fasta) โดยใช้ซอฟต์แวร์ของผู้ขาย การประมวลผลลำดับนิวคลีโอไทด์เพิ่มเติมดำเนินการโดยใช้โปรแกรมและสคริปต์ C ที่เป็นกรรมสิทธิ์ (ชุดซอฟต์แวร์ที่ยังไม่ได้เผยแพร่) ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง การวิเคราะห์ข้อมูลหลักรวมถึงขั้นตอนการกรองหลายขั้นตอนที่เข้มงวด เพื่อกรองการอ่านที่ไม่มีลำดับดีเอ็นเอแทรก 12 เมอร์ที่ถูกต้อง การอ่านจะถูกจัดตำแหน่งตามลำดับตามป้ายกำกับเริ่มต้น (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT) ป้ายกำกับหยุด (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) และการแทรกพื้นหลัง (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) โดยใช้การทดสอบ Needleman-Wunsch ทั่วโลก การจัดตำแหน่งอนุญาตให้มีความไม่สอดคล้องกันสูงสุด 2 รายการต่อการจัดตำแหน่ง31 ดังนั้น การอ่านที่ไม่มีแท็กเริ่มต้นและหยุด และการอ่านที่มีการแทรกพื้นหลัง กล่าวคือ การจัดตำแหน่งที่เกินจำนวนความไม่ตรงกันที่อนุญาต จะถูกลบออกจากไลบรารี สำหรับการอ่านที่เหลือ ลำดับดีเอ็นเอ N-mer ที่ขยายจากจุดเริ่มต้นและสิ้นสุดก่อนจุดหยุดจะถูกตัดออกจากลำดับการอ่านดั้งเดิมและประมวลผลต่อไป (ต่อไปนี้เรียกว่า "แทรก") หลังจากการแปลแทรก ส่วนที่อยู่หลังโคดอนหยุดแรกที่ปลาย 5' ของไพรเมอร์จะถูกลบออกจากแทรก นอกจากนี้ นิวคลีโอไทด์ที่นำไปสู่โคดอนที่ไม่สมบูรณ์ที่ปลาย 3' ของไพรเมอร์ก็จะถูกลบออกเช่นกัน เพื่อแยกแทรกที่มีเฉพาะลำดับพื้นหลัง แทรกที่แปลแล้วซึ่งเริ่มต้นด้วยรูปแบบกรดอะมิโน "PAG" ก็จะถูกลบออกเช่นกัน เปปไทด์ที่มีความยาวหลังการแปลน้อยกว่า 3 กรดอะมิโนจะถูกลบออกจากไลบรารี ในที่สุด ให้ลบความซ้ำซ้อนในกลุ่มแทรกและกำหนดความถี่ของแทรกที่ไม่ซ้ำกันแต่ละรายการ ผลการวิเคราะห์นี้ประกอบด้วยรายการลำดับนิวคลีโอไทด์ (ส่วนแทรก) และความถี่ (การอ่าน) (ภาพเสริม 1c และ 2)
การจัดกลุ่มการแทรก DNA N-mer ตามความคล้ายคลึงของลำดับ: เพื่อขจัดข้อผิดพลาดในการจัดลำดับเฉพาะของ 454/Roche (เช่น ปัญหาในการขยายโฮโมโพลีเมอร์ในการจัดลำดับ) และลบความซ้ำซ้อนที่มีความสำคัญน้อยกว่า การแทรกลำดับ DNA N-mer ที่ผ่านการกรองก่อนหน้านี้ (การแทรก) จะถูกเรียงลำดับตามความคล้ายคลึง การแทรก (อนุญาตให้มีเบสที่ไม่ตรงกันสูงสุด 2 เบส) โดยใช้อัลกอริทึมแบบวนซ้ำที่กำหนดดังต่อไปนี้ การแทรกจะถูกเรียงลำดับก่อนตามความถี่ (จากสูงสุดไปต่ำสุด) และถ้าเหมือนกัน จะถูกเรียงลำดับรองตามความยาว (จากยาวที่สุดไปสั้นที่สุด) ดังนั้น การแทรกที่บ่อยที่สุดและยาวที่สุดจะกำหนด "กลุ่ม" แรก ความถี่ของกลุ่มจะถูกตั้งค่าเป็นความถี่หลัก จากนั้น การแทรกแต่ละครั้งที่เหลืออยู่ในรายการที่เรียงลำดับจะถูกพยายามเพิ่มเข้าในกลุ่มโดยการจัดตำแหน่ง Needleman-Wunsch แบบคู่กัน หากจำนวนของความไม่ตรงกัน การแทรก หรือการลบในการจัดตำแหน่งไม่เกินเกณฑ์ 2 การแทรกจะถูกเพิ่มเข้าในกลุ่ม และความถี่ของกลุ่มโดยรวมจะเพิ่มขึ้นตามความถี่ที่เพิ่มการแทรก ข้อมูลที่แทรกเพิ่มเข้าไปในกลุ่มจะถูกทำเครื่องหมายว่าใช้แล้วและจะถูกแยกออกจากการประมวลผลเพิ่มเติม หากไม่สามารถเพิ่มลำดับข้อมูลที่แทรกเข้าไปในกลุ่มที่มีอยู่แล้วได้ ลำดับข้อมูลที่แทรกจะถูกใช้เพื่อสร้างกลุ่มใหม่ที่มีความถี่ข้อมูลที่แทรกที่เหมาะสมและทำเครื่องหมายว่าใช้แล้ว การวนซ้ำจะสิ้นสุดลงเมื่อลำดับข้อมูลที่แทรกแต่ละลำดับถูกใช้เพื่อสร้างกลุ่มใหม่หรือสามารถรวมอยู่ในกลุ่มที่มีอยู่แล้วได้ ท้ายที่สุด ข้อมูลที่แทรกที่จัดกลุ่มซึ่งประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์จะถูกแปลเป็นลำดับเปปไทด์ (ไลบรารีเปปไทด์) ในที่สุด ผลลัพธ์ของการวิเคราะห์นี้คือชุดข้อมูลที่แทรกและความถี่ที่เกี่ยวข้องซึ่งประกอบเป็นจำนวนการอ่านต่อเนื่อง (รูปเสริม 2)
การสร้างโมทีฟ: จากรายการของเปปไทด์เฉพาะตัว ห้องสมุดจึงถูกสร้างขึ้นโดยมีรูปแบบกรดอะมิโนที่เป็นไปได้ทั้งหมด (aa) ดังที่แสดงด้านล่าง รูปแบบที่เป็นไปได้แต่ละรูปแบบที่มีความยาว 3 ถูกแยกออกมาจากเปปไทด์ และรูปแบบผกผันของเปปไทด์จะถูกเพิ่มเข้าไปพร้อมกับห้องสมุดโมทีฟทั่วไปที่มีรูปแบบทั้งหมด (ไตรเปปไทด์) ห้องสมุดของโมทีฟที่ซ้ำกันอย่างมากจะถูกจัดลำดับและลบความซ้ำซ้อนออก จากนั้น สำหรับไตรเปปไทด์แต่ละตัวในห้องสมุดโมทีฟ เราจะตรวจสอบการมีอยู่ของไตรเปปไทด์ในห้องสมุดโดยใช้เครื่องมือคำนวณ ในกรณีนี้ ความถี่ของเปปไทด์ที่มีไตรเปปไทด์โมทีฟที่พบจะถูกเพิ่มเข้าไป และกำหนดให้กับโมทีฟในห้องสมุดโมทีฟ (“จำนวนโมทีฟ”) ผลลัพธ์ของการสร้างโมทีฟคืออาร์เรย์สองมิติที่มีการเกิดขึ้นของไตรเปปไทด์ (โมทีฟ) ทั้งหมดและค่าที่เกี่ยวข้อง ซึ่งเป็นจำนวนการอ่านลำดับที่ส่งผลให้เกิดโมทีฟที่สอดคล้องกันเมื่ออ่านถูกกรอง จัดกลุ่ม และแปล เมตริกตามที่อธิบายไว้โดยละเอียดข้างต้น
การทำให้จำนวนโมทีฟและกราฟกระจายที่สอดคล้องกันเป็นมาตรฐาน: จำนวนโมทีฟสำหรับแต่ละตัวอย่างได้รับการทำให้เป็นมาตรฐานโดยใช้
โดยที่ ni คือจำนวนการอ่านที่มีหัวข้อ i ดังนั้น vi จึงแสดงถึงความถี่ร้อยละของการอ่าน (หรือเปปไทด์) ที่มีโมทีฟ i ในตัวอย่าง ค่า p สำหรับจำนวนโมทีฟที่ไม่ได้ทำให้เป็นมาตรฐานนั้นคำนวณโดยใช้การทดสอบที่แน่นอนของ Fisher ในส่วนของสหสัมพันธ์ของจำนวนแรงจูงใจ สหสัมพันธ์ของ Spearman นั้นคำนวณโดยใช้จำนวนแรงจูงใจที่ทำให้เป็นมาตรฐานด้วย R
เพื่อแสดงเนื้อหาของกรดอะมิโนในแต่ละตำแหน่งในคลังเปปไทด์ จึงได้สร้างเว็บโลโกแกรม 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ขึ้นมา ขั้นแรก เนื้อหาของกรดอะมิโนในแต่ละตำแหน่งของเปปไทด์ 12 เมอร์จะถูกเก็บไว้ในเมทริกซ์ 20×12 จากนั้น ชุดของเปปไทด์ 1,000 ตัวที่มีเนื้อหากรดอะมิโนสัมพันธ์กันเท่ากันในแต่ละตำแหน่งจะถูกสร้างขึ้นในรูปแบบลำดับฟาสต์ แล้วนำไปใส่เป็นอินพุตให้กับเว็บโลโกแกรม 3 ซึ่งจะสร้างการแสดงภาพกราฟิกของเนื้อหากรดอะมิโนสัมพันธ์กันในแต่ละตำแหน่งสำหรับคลังเปปไทด์ที่กำหนด เพื่อแสดงชุดข้อมูลหลายมิติ จึงได้สร้างแผนที่ความร้อนโดยใช้เครื่องมือที่พัฒนาภายในใน R (biosHeatmap ซึ่งเป็นแพ็คเกจ R ที่ยังไม่ได้เปิดตัว) เดนโดรแกรมที่นำเสนอในแผนที่ความร้อนถูกคำนวณโดยใช้เมธอดการจัดกลุ่มตามลำดับชั้นของ Ward โดยใช้เมตริกระยะทางแบบยุคลิด สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติของข้อมูลคะแนนโมทีฟ ค่า P ของคะแนนที่ไม่ได้ปรับมาตรฐานจะคำนวณโดยใช้การทดสอบที่แน่นอนของฟิชเชอร์ ค่า P สำหรับชุดข้อมูลอื่น ๆ จะคำนวณใน R โดยใช้การทดสอบ t ของนักเรียนหรือ ANOVA
โคลนฟาจที่เลือกและฟาจที่ไม่มีตัวแทรกถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำทางหลอดเลือดดำที่หาง (ฟาจ 2x1010 ตัวต่อสัตว์ใน PBS 300 μl) สิบนาทีก่อนการไหลเวียนเลือดและการตรึงในภายหลัง สัตว์ตัวเดียวกันจะถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำด้วยเลกตินที่มีฉลาก DyLight594 100 μl (Vector Laboratories Inc., DL-1177) 60 นาทีหลังจากการฉีดฟาจ หนูจะถูกฉีดเข้าหัวใจด้วย PBS 50 มล. ตามด้วย PFA/PBS 4% 50 มล. ตัวอย่างสมองจะถูกตรึงด้วย PFA/PBS 4% ข้ามคืน และแช่ในซูโครส 30% ข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4°C ตัวอย่างจะถูกแช่แข็งทันทีในส่วนผสม OCT การวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมีของตัวอย่างแช่แข็งดำเนินการที่อุณหภูมิห้องบน cryosection 30 µm ที่บล็อกด้วย 1% BSA และฟักกับแอนติบอดีโพลีโคลนัลที่ติดฉลาก FITC กับฟาจ T7 (Novus NB 600-376A) ที่อุณหภูมิ 4 °C ฟักค้างคืน ในที่สุด ล้างส่วนต่างๆ ด้วย PBS 3 ครั้งและตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคัลเลเซอร์ (Leica TCS SP5)
เปปไทด์ทั้งหมดที่มีความบริสุทธิ์ขั้นต่ำ 98% ได้รับการสังเคราะห์โดย GenScript USA ผ่านการไบโอตินิเลตและการทำให้แห้งแบบแห้ง ไบโอตินจะถูกจับด้วยสเปเซอร์ไกลซีนสามตัวเพิ่มเติมที่ปลาย N ตรวจสอบเปปไทด์ทั้งหมดโดยใช้แมสสเปกโตรเมทรี
สเตรปตาวิดิน (Sigma S0677) ผสมกับเปปไทด์ที่ไบโอตินิเลตเกิน 5 เท่า เปปไทด์ยับยั้ง BACE1 ที่ไบโอตินิเลต หรือส่วนผสม (อัตราส่วน 3:1) ของเปปไทด์ยับยั้ง BACE1 ที่ไบโอตินิเลตและเปปไทด์ยับยั้ง BACE1 ใน DMSO 5–10%/ฟักใน PBS 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องก่อนฉีด เปปไทด์ที่จับคู่สเตรปตาวิดินถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำในปริมาณ 10 มก./กก. เข้าไปในหลอดเลือดดำที่หางของหนูที่มีโพรงสมอง
ความเข้มข้นของคอมเพล็กซ์สเตรปตาติดิน-เปปไทด์ประเมินโดย ELISA เคลือบแผ่นไมโครไทเตอร์ Nunc Maxisorp (Sigma) ค้างคืนที่อุณหภูมิ 4°C ด้วยแอนติบอดีต่อสเตรปตาติดินของเมาส์ 1.5 μg/ml (Thermo, MA1-20011) หลังจากบล็อก (บัฟเฟอร์บล็อก: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% เจลาติน, 1% BSA) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ล้างแผ่นด้วย 0.05% Tween-20/PBS (บัฟเฟอร์ล้าง) เป็นเวลา 3 วินาที เติม CSF และตัวอย่างพลาสมาลงในหลุมที่เจือจางด้วยบัฟเฟอร์บล็อก (พลาสมา 1:10,000, CSF 1:115) จากนั้นฟักแผ่นเพลทไว้ข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4°C ด้วยแอนติบอดีตรวจจับ (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) หลังจากล้าง 3 ขั้นตอน สเตรปตาวิดินจะถูกตรวจจับโดยฟักในสารละลายซับสเตรต TMB (Roche) นานถึง 20 นาที หลังจากหยุดการพัฒนาสีด้วย H2SO4 1M แล้ว ให้วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร
หน้าที่ของสารเชิงซ้อนยับยั้งสเตรปตาวิดิน-เปปไทด์-BACE1 ได้รับการประเมินโดยวิธี Aβ(1-40) ELISA ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (Wako, 294-64701) โดยย่อ ตัวอย่าง CSF ถูกเจือจางในสารเจือจางมาตรฐาน (1:23) และฟักค้างคืนที่อุณหภูมิ 4°C ในเพลต 96 หลุมที่เคลือบด้วยแอนติบอดีจับ BNT77 หลังจากขั้นตอนการล้าง 5 ขั้นตอน แอนติบอดี BA27 ที่จับกับ HRP จะถูกเติมลงไปและฟักเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4°C ตามด้วยขั้นตอนการล้าง 5 ขั้นตอน ตรวจพบ Aβ(1–40) โดยการฟักในสารละลาย TMB เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากหยุดการพัฒนาสีด้วยสารละลายหยุดแล้ว ให้วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร ตัวอย่างพลาสมาจะถูกสกัดด้วยเฟสแข็งก่อนวิธี Aβ(1–40) ELISA พลาสมาถูกเติมลงใน DEA 0.2% (Sigma) ในเพลต 96 หลุม และฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที หลังจากล้างเพลต SPE (Oasis, 186000679) ด้วยน้ำและเมทานอล 100% ตามลำดับแล้ว ให้เติมตัวอย่างพลาสมาลงในเพลต SPE และเอาของเหลวทั้งหมดออก ตัวอย่างถูกล้าง (ก่อนด้วยเมทานอล 5% จากนั้นด้วยเมทานอล 30%) และชะออกด้วย NH4OH 2%/เมทานอล 90% หลังจากทำให้สารละลายแห้งที่ 55°C เป็นเวลา 99 นาทีด้วยกระแส N2 คงที่ ให้ลดตัวอย่างในสารละลายมาตรฐาน และวัด Aβ(1–40) ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
วิธีการอ้างอิงบทความนี้: Urich, E. et al. Cargo delivery to the brain using transit peptides identify in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015)
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB และ Moos T. การนำส่งยาโมเลกุลขนาดใหญ่ไปยังสมองโดยใช้การบำบัดแบบกำหนดเป้าหมาย Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. และ Martinez-Martinez, P. การนำส่งยาเปปไทด์และโปรตีนผ่านอุปสรรคเลือด-สมอง Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)
Pardridge, WM อุปสรรคเลือด-สมอง: คอขวดในการพัฒนายาในสมอง NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG และ Byrd, A. แนวโน้มของการส่งยาและการกำหนดเป้าหมายที่ดีขึ้นไปยังสมองผ่านทางทางเดิน choroid plexus-CSF Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)
Pardridge, WM การปรับปรุงผลิตภัณฑ์ชีวเภสัชกรรมด้วยม้าโทรจันระดับโมเลกุลเพื่อการส่งมอบสมอง Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008)
Pardridge, WM ขนส่งเปปไทด์ผ่านตัวรับเลือด-สมอง Endocr Rev. 7, 314–330 (1986)
Niewoehner, J. et al. เพิ่มการแทรกซึมของสมองและประสิทธิผลของแอนติบอดีที่ใช้ในการรักษาโดยใช้การขนส่งโมเลกุลแบบโมโนวาเลนต์ Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)
Bien-Lee, N. et al. การขนส่งตัวรับทรานสเฟอร์ริน (TfR) กำหนดการดูดซึมของตัวแปรที่มีความสัมพันธ์ของแอนติบอดี TfR ในสมอง J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)