ขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comคุณกำลังใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันที่มีการรองรับ CSS ที่จำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)นอกจากนี้ เพื่อให้แน่ใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจึงแสดงไซต์ที่ไม่มีสไตล์และ JavaScript
แสดงภาพหมุนสามสไลด์พร้อมกันใช้ปุ่มก่อนหน้าและถัดไปเพื่อเลื่อนผ่านสามสไลด์พร้อมกัน หรือใช้ปุ่มตัวเลื่อนที่ส่วนท้ายเพื่อเลื่อนผ่านสามสไลด์พร้อมกัน
สิ่งกีดขวางระหว่างเลือดและสมองและสิ่งกีดขวางระหว่างเลือดและสมองป้องกันไม่ให้สารชีวบำบัดเข้าถึงเป้าหมายในระบบประสาทส่วนกลาง ดังนั้นจึงขัดขวางการรักษาโรคทางระบบประสาทอย่างมีประสิทธิภาพในการค้นพบสารขนส่งสมองชนิดใหม่ในร่างกาย เราได้แนะนำ T7 phage peptide library และเก็บเลือดและน้ำไขสันหลัง (CSF) ตามลำดับโดยใช้แบบจำลองสระน้ำขนาดใหญ่ที่มีสติสัมปชัญญะphage clones เฉพาะได้รับการเสริมคุณค่าอย่างสูงในน้ำไขสันหลังหลังการคัดเลือกสี่รอบการทดสอบเปปไทด์ของผู้สมัครแต่ละรายเผยให้เห็นถึงการเพิ่มคุณค่ามากกว่า 1,000 เท่าในน้ำไขสันหลังฤทธิ์ทางชีวภาพของการส่งเปปไทด์ไปยังสมองได้รับการยืนยันโดยการลดระดับของ amyloid-β 40% ในน้ำไขสันหลังโดยใช้ตัวยับยั้งเปปไทด์ BACE1 ที่เชื่อมโยงกับเปปไทด์ทรานสิทใหม่ที่ระบุผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าเปปไทด์ที่ระบุโดยวิธีการคัดเลือกฟาจในร่างกายอาจเป็นพาหนะที่มีประโยชน์สำหรับการนำส่งโมเลกุลขนาดใหญ่ไปยังสมองอย่างเป็นระบบโดยมีผลการรักษา
การวิจัยการบำบัดแบบกำหนดเป้าหมายของระบบประสาทส่วนกลาง (CNS) ส่วนใหญ่มุ่งเน้นไปที่การระบุยาและสารที่เหมาะสมที่สุดซึ่งแสดงคุณสมบัติการกำหนดเป้าหมายของระบบประสาทส่วนกลาง โดยไม่ต้องใช้ความพยายามน้อยลงในการค้นหากลไกที่ขับเคลื่อนการนำส่งยาที่ออกฤทธิ์ไปยังสมองสิ่งนี้เริ่มเปลี่ยนไปเนื่องจากการนำส่งยา โดยเฉพาะโมเลกุลขนาดใหญ่ เป็นส่วนสำคัญของการพัฒนายาทางประสาทวิทยาศาสตร์สมัยใหม่สภาพแวดล้อมของระบบประสาทส่วนกลางได้รับการปกป้องอย่างดีจากระบบกั้นหลอดเลือดสมอง ซึ่งประกอบด้วยสิ่งกีดขวางระหว่างเลือดและสมอง (BBB) ​​และสิ่งกีดขวางระหว่างเลือดและสมอง (BCBB)1 ทำให้ยากต่อการส่งยาไปยังสมอง1,2ประมาณว่ายาโมเลกุลใหญ่เกือบทั้งหมดและยาโมเลกุลเล็กกว่า 98% ถูกกำจัดออกจากสมอง3นั่นเป็นเหตุผลว่าทำไมจึงเป็นเรื่องสำคัญมากที่จะต้องระบุระบบขนส่งสมองใหม่ที่ให้การนำส่งยารักษาโรคไปยังระบบประสาทส่วนกลาง 4,5 ที่มีประสิทธิภาพและเฉพาะเจาะจงอย่างไรก็ตาม BBB และ BCSFB ยังนำเสนอโอกาสที่ยอดเยี่ยมสำหรับการนำส่งยา เนื่องจากพวกมันเจาะและเข้าสู่โครงสร้างทั้งหมดของสมองผ่านทางหลอดเลือดที่กว้างขวางดังนั้น ความพยายามในปัจจุบันในการใช้วิธีการส่งไปยังสมองแบบไม่รุกรานนั้นส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับกลไกของการขนส่งตัวรับ (PMT) โดยใช้ตัวรับ BBB6 ภายในร่างกายแม้จะมีความก้าวหน้าที่สำคัญเมื่อเร็วๆ นี้โดยใช้วิถีทรานเฟอร์รินรีเซพเตอร์7,8 แต่จำเป็นต้องมีการพัฒนาเพิ่มเติมของระบบการนำส่งใหม่ที่มีคุณสมบัติที่ดีขึ้นเพื่อจุดประสงค์นี้ เป้าหมายของเราคือการระบุเปปไทด์ที่สามารถไกล่เกลี่ยการขนส่ง CSF เนื่องจากโดยหลักการแล้วพวกมันสามารถใช้เพื่อส่งโมเลกุลขนาดใหญ่ไปยังระบบประสาทส่วนกลางหรือเพื่อเปิดทางเดินของตัวรับใหม่โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ตัวรับและตัวขนส่งเฉพาะของระบบหลอดเลือดสมอง (BBB และ BSCFB) สามารถทำหน้าที่เป็นเป้าหมายที่เป็นไปได้สำหรับการนำส่งยารักษาโรคทางชีวภาพที่ออกฤทธิ์และเฉพาะเจาะจงน้ำไขสันหลัง (CSF) เป็นผลิตภัณฑ์คัดหลั่งของ choroid plexus (CS) และสัมผัสโดยตรงกับของเหลวคั่นระหว่างหน้าของสมองผ่านทาง subarachnoid space และ ventricular space4เมื่อเร็ว ๆ นี้ มีการแสดงแล้วว่าน้ำไขสันหลังใต้วงแขนกระจายมากเกินไปในเนื้อเยื่อคั่นระหว่างหน้าของสมอง9เราหวังว่าจะเข้าถึงพื้นที่เนื้อเยื่อโดยใช้ทางเดินเข้าของ subarachnoid หรือผ่าน BBB โดยตรงเพื่อให้บรรลุเป้าหมายนี้ เราได้ใช้กลยุทธ์การเลือกฟาจในร่างกายที่มีประสิทธิภาพ ซึ่งระบุเปปไทด์ที่ขนส่งโดยเส้นทางที่แตกต่างกันสองเส้นทางนี้
ตอนนี้เราอธิบายวิธีการคัดกรอง phage display แบบลำดับใน vivo ด้วยการสุ่มตัวอย่าง CSF ควบคู่ไปกับการจัดลำดับปริมาณงานสูง (HTS) เพื่อตรวจสอบรอบการคัดเลือกเริ่มต้นที่มีความหลากหลายสูงสุดของไลบรารีทำการตรวจคัดกรองหนูที่รู้ตัวด้วย cannula ขนาดใหญ่ (CM) ที่ฝังอย่างถาวรเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของเลือดที่สำคัญ วิธีการนี้เลือกทั้งการกำหนดเป้าหมายของสมองและเปปไทด์ที่มีกิจกรรมการขนส่งข้ามสิ่งกีดขวางหลอดเลือดสมองเราใช้ T7 phages เนื่องจากมีขนาดเล็ก (~60 นาโนเมตร)10 และแนะนำว่าเหมาะสำหรับการขนส่งของถุงที่ช่วยให้ข้ามผ่านเซลล์ของสิ่งกีดขวางบุผนังหลอดเลือดและ/หรือเยื่อบุผิว-ไขกระดูกหลังจากการแพนกล้องสี่รอบ ประชากรฟาจถูกแยกออกซึ่งแสดงให้เห็นความแข็งแกร่งในการเพิ่มคุณค่า CSF ในร่างกายและความสัมพันธ์ของไมโครเวสเซลในสมองที่สำคัญ เราสามารถยืนยันการค้นพบของเราได้โดยการแสดงให้เห็นว่าเปปไทด์ตัวเลือกที่ดีที่สุดที่ต้องการและสังเคราะห์ทางเคมีสามารถขนส่งสินค้าโปรตีนไปยังน้ำไขสันหลังประการแรก ฤทธิ์ทางเภสัชพลศาสตร์ของระบบประสาทส่วนกลางถูกสร้างขึ้นโดยการรวมทรานสิทเปปไทด์ชั้นนำเข้ากับตัวยับยั้งของเปปไทด์ BACE1นอกเหนือจากการแสดงให้เห็นว่ากลยุทธ์การคัดกรองการทำงานของร่างกายในร่างกายสามารถระบุเปปไทด์การขนส่งสมองแบบใหม่ในฐานะพาหะขนส่งโปรตีนที่มีประสิทธิภาพ เราคาดว่าวิธีการเลือกการทำงานที่คล้ายกันจะมีความสำคัญในการระบุเส้นทางการขนส่งสมองแบบใหม่
ตามหน่วยที่ก่อตัวเป็นแผ่น (PFU) หลังจากขั้นตอนการบรรจุฟาจ คลังของเปปไทด์ฟาจ T7 เชิงเส้นแบบสุ่ม 12 เมอร์ที่มีความหลากหลายประมาณ 109 ได้รับการออกแบบและสร้าง (ดูวัสดุและวิธีการ)สิ่งสำคัญคือต้องทราบว่าเราได้วิเคราะห์ไลบรารีนี้อย่างรอบคอบก่อนการแพนกล้องในวิฟการขยาย PCR ของตัวอย่างไลบรารี phage โดยใช้ไพรเมอร์ที่ดัดแปลงสร้างแอมพลิคอนที่ใช้กับ HTS ได้โดยตรง (รูปที่ 1a เพิ่มเติม)เนื่องจาก a) ข้อผิดพลาดในการจัดลำดับ HTS11, b) ผลกระทบต่อคุณภาพของไพรเมอร์ (NNK) 1-12 และ c) การมีอยู่ของ wild-type (wt) phage (ส่วนแทรกของโครงกระดูก) ในไลบรารีสแตนด์บาย ขั้นตอนการกรองลำดับถูกนำมาใช้เพื่อแยกเฉพาะข้อมูลลำดับที่ผ่านการตรวจสอบแล้ว (รูปที่ 1b เพิ่มเติม)ขั้นตอนการกรองเหล่านี้นำไปใช้กับไลบรารีลำดับ HTS ทั้งหมดสำหรับไลบรารีมาตรฐาน ได้รับการอ่านทั้งหมด 233,868 ครั้ง ซึ่ง 39% ผ่านเกณฑ์ตัวกรองและใช้สำหรับการวิเคราะห์และคัดเลือกไลบรารีสำหรับรอบถัดไป (รูปที่ 1c-e เพิ่มเติม)การอ่านเป็นการทวีคูณของความยาวเบส 3 คู่โดยมีจุดสูงสุดที่ 36 นิวคลีโอไทด์ (รูปที่ 1c เพิ่มเติม) ยืนยันการออกแบบห้องสมุด (NNK) 1-12โดยเฉพาะอย่างยิ่ง สมาชิกห้องสมุดประมาณ 11% มีการแทรก PAGISRELVDKL แกนหลัก 12 มิติ (wt) และเกือบครึ่งหนึ่งของลำดับ (49%) มีการแทรกหรือการลบHTS ของห้องสมุดยืนยันความหลากหลายของเปปไทด์ในห้องสมุด: พบมากกว่า 81% ของลำดับเปปไทด์เพียงครั้งเดียวและมีเพียง 1.5% เกิดขึ้นในสำเนา≥4 (รูปที่ 2a เพิ่มเติม)ความถี่ของกรดอะมิโน (aa) ทั้ง 12 ตำแหน่งในตัวอย่างมีความสัมพันธ์กันอย่างดีกับความถี่ที่คาดไว้สำหรับจำนวนของโคดอนที่สร้างโดยรายการ NKK ที่เสื่อมสภาพ (รูปที่ 2b เพิ่มเติม)ความถี่ที่สังเกตได้ของสารตกค้าง aa ที่เข้ารหัสโดยเม็ดมีดเหล่านี้สัมพันธ์กันอย่างดีกับความถี่ที่คำนวณได้ (r = 0.893) (รูปที่ 2c เพิ่มเติม)การเตรียมคลังฟาจสำหรับการฉีดประกอบด้วยขั้นตอนการขยายและการกำจัดเอนโดทอกซินก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นแล้วว่าอาจลดความหลากหลายของไลบรารี phage12,13ดังนั้นเราจึงจัดลำดับคลังฟาจที่ขยายด้วยเพลทซึ่งผ่านการกำจัดเอนโดทอกซินแล้วเปรียบเทียบกับคลังดั้งเดิมเพื่อประเมินความถี่ของ AAความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่ง (r = 0.995) ถูกสังเกตระหว่างพูลดั้งเดิมกับพูลที่ขยายและทำให้บริสุทธิ์ (รูปที่ 2d เพิ่มเติม) ซึ่งบ่งชี้ว่าการแข่งขันระหว่างโคลนที่ขยายบนจานโดยใช้ T7 phage ไม่ทำให้เกิดอคติที่สำคัญการเปรียบเทียบนี้ขึ้นอยู่กับความถี่ของบรรทัดฐาน tripeptide ในแต่ละไลบรารี เนื่องจากความหลากหลายของไลบรารี (~109) ไม่สามารถบันทึกได้อย่างสมบูรณ์แม้ว่าจะใช้ HTSการวิเคราะห์ความถี่ของ aa ในแต่ละตำแหน่งเผยให้เห็นอคติที่ขึ้นกับตำแหน่งเล็กน้อยในสามตำแหน่งสุดท้ายของเพลงที่ป้อน (รูปที่ 2e เพิ่มเติม)โดยสรุป เราสรุปได้ว่าคุณภาพและความหลากหลายของไลบรารีเป็นที่ยอมรับได้ และมีเพียงการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในความหลากหลายเท่านั้นที่ถูกสังเกตเนื่องจากการขยายและการเตรียมไลบรารี phage ระหว่างการเลือกหลายรอบ
การสุ่มตัวอย่างน้ำไขสันหลังแบบอนุกรมสามารถทำได้โดยการผ่าตัดฝัง cannula เข้าไปใน CM ของหนูที่มีสติเพื่ออำนวยความสะดวกในการระบุ T7 phage ที่ฉีดเข้าเส้นเลือดดำ (iv) ผ่าน BBB และ/หรือ BCSFB (รูปที่ 1a-b)เราใช้แขนคัดเลือกอิสระสองแขน (แขน A และ B) ในสามรอบแรกของการเลือกในร่างกาย (รูปที่ 1c)เราค่อยๆ เพิ่มความเข้มงวดในการคัดเลือกโดยลดจำนวนฟาจทั้งหมดที่นำมาใช้ในสามรอบแรกของการเลือกสำหรับการแพนกล้องรอบที่สี่ เราได้รวมตัวอย่างจากสาขา A และ B และทำการเลือกเพิ่มเติมอีกสามครั้งโดยอิสระเพื่อศึกษาคุณสมบัติภายในร่างกายของอนุภาคฟาจ T7 ในแบบจำลองนี้ ฟาจชนิดไวด์ (แทรกหลัก PAGISRELVDKL) ถูกฉีดเข้าไปในหนูผ่านทางหลอดเลือดดำส่วนหางการกู้คืน phages จากน้ำไขสันหลังและเลือดที่จุดเวลาต่าง ๆ แสดงให้เห็นว่า phages T7 icosahedral ที่ค่อนข้างเล็กมีระยะการกวาดล้างเริ่มต้นอย่างรวดเร็วจากช่องเลือด (รูปที่ 3 เพิ่มเติม)จากระดับไทเทอร์ที่ให้และปริมาณเลือดของหนู เราคำนวณว่ามีเพียงประมาณ 1% โดยน้ำหนักตรวจพบ phage จากขนาดยาที่ให้ในเลือด 10 นาทีหลังจากฉีดเข้าเส้นเลือดดำหลังจากการลดลงอย่างรวดเร็วในขั้นต้นนี้ การกวาดล้างหลักที่ช้าลงถูกวัดด้วยครึ่งชีวิต 27.7 นาทีที่สำคัญมีการดึง phages น้อยมากจากช่อง CSF ซึ่งบ่งชี้ว่าพื้นหลังต่ำสำหรับการย้าย phage แบบไวด์ไปยังช่อง CSF (รูปที่ 3 เพิ่มเติม)โดยเฉลี่ยแล้ว พบเพียง 1 x 10-3% titers ของ T7 phage ในเลือดและ 4 x 10-8% ของ phages ที่ฉีดครั้งแรกในน้ำไขสันหลังตลอดระยะเวลาสุ่มตัวอย่าง (0-250 นาที)โดยเฉพาะอย่างยิ่งครึ่งชีวิต (25.7 นาที) ของฟาจชนิดไวด์ในน้ำไขสันหลังมีความคล้ายคลึงกับที่พบในเลือดข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าสิ่งกีดขวางที่แยกช่อง CSF ออกจากเลือดนั้นไม่เสียหายในหนู CM-cannulated ทำให้สามารถเลือกคลัง phage ในร่างกายเพื่อระบุโคลนที่พร้อมขนส่งจากเลือดไปยังช่อง CSF
(a) การตั้งค่าวิธีการสุ่มตัวอย่างน้ำไขสันหลัง (CSF) ซ้ำจากสระขนาดใหญ่(b) แผนภาพแสดงตำแหน่งเซลล์ของสิ่งกีดขวางระบบประสาทส่วนกลาง (CNS) และกลยุทธ์การคัดเลือกที่ใช้ในการระบุเปปไทด์ที่ข้ามสิ่งกีดขวางระหว่างเลือดและสมอง (BBB) ​​และสิ่งกีดขวางระหว่างเลือดและสมอง(c) ผังงานการตรวจคัดกรองใน vivo phageในแต่ละรอบของการคัดเลือก เฟจ (ตัวระบุสัตว์ภายในลูกศร) ถูกฉีดเข้าทางหลอดเลือดดำสาขาทางเลือกอิสระสองสาขา (A, B) จะถูกแยกออกจากกันจนกว่าจะมีการคัดเลือกรอบที่ 4สำหรับการคัดเลือกรอบที่ 3 และ 4 แต่ละเฟจโคลนที่สกัดจาก CSF จะถูกจัดลำดับด้วยตนเอง(d) จลนพลศาสตร์ของฟาจที่แยกได้จากเลือด (วงกลมสีแดง) และน้ำไขสันหลัง (สามเหลี่ยมสีเขียว) ระหว่างรอบแรกของการคัดเลือกในหนูแรท 2 ตัวหลังการฉีดเข้าเส้นเลือดดำของคลังเปปไทด์ T7 (2 x 1012 เฟจ/สัตว์)สี่เหลี่ยมสีน้ำเงินแสดงถึงความเข้มข้นเริ่มต้นเฉลี่ยของฟาจในเลือด โดยคำนวณจากปริมาณของฟาจที่ฉีดเข้าไป โดยคำนึงถึงปริมาณเลือดทั้งหมดสี่เหลี่ยมสีดำระบุจุดตัดของเส้น y ที่คาดการณ์จากความเข้มข้นของเลือด(e,f) แสดงความถี่สัมพัทธ์และการกระจายตัวของลักษณะเด่นของไตรเปปไทด์ที่ทับซ้อนกันที่เป็นไปได้ทั้งหมดที่พบในเปปไทด์จำนวนของลวดลายที่พบในการอ่าน 1,000 ครั้งจะแสดงขึ้นลวดลายที่ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.001) จะถูกทำเครื่องหมายด้วยจุดสีแดง(e) แผนภาพกระจายความสัมพันธ์ที่เปรียบเทียบความถี่สัมพัทธ์ของบรรทัดฐานไตรเปปไทด์ของไลบรารีที่ฉีดกับฟาจที่ได้มาจากเลือดจากสัตว์ #1.1 และ #1.2(f) แผนภาพกระจายความสัมพันธ์เปรียบเทียบความถี่สัมพัทธ์ของ motifs phage tripeptide #1.1 และ #1.2 ที่แยกได้ในเลือดและน้ำไขสันหลัง(g, h) การแสดง ID ลำดับของฟาจที่อุดมด้วยเลือด (g) เทียบกับห้องสมุดที่ถูกฉีดและฟาจที่อุดมด้วย CSF (h) เทียบกับเลือดหลังจากรอบของการคัดเลือก ภายในร่างกาย ในสัตว์ทั้งสองขนาดของรหัสหนึ่งตัวอักษรบ่งชี้ว่ากรดอะมิโนนั้นเกิดขึ้นที่ตำแหน่งนั้นบ่อยเพียงใดสีเขียว = มีขั้ว, สีม่วง = เป็นกลาง, สีน้ำเงิน = พื้นฐาน, สีแดง = เป็นกรด และสีดำ = กรดอะมิโนที่ไม่ชอบน้ำรูปที่ 1a, b ออกแบบและผลิตโดย Eduard Urich
เราฉีดไลบรารีเปปไทด์ของ phage เข้าไปในหนูเครื่องมือ CM สองตัว (clades A และ B) และแยก phage ออกจากน้ำไขสันหลังและเลือด (รูปที่ 1d)การกวาดล้างห้องสมุดอย่างรวดเร็วในขั้นต้นนั้นไม่ชัดเจนเมื่อเทียบกับฟาจประเภทไวด์ครึ่งชีวิตเฉลี่ยของไลบรารีที่ถูกฉีดในสัตว์ทั้งสองคือ 24.8 นาทีในเลือด ซึ่งคล้ายกับฟาจชนิดป่า และ 38.5 นาทีในน้ำไขสันหลังตัวอย่างเลือดและน้ำไขสันหลังจากสัตว์แต่ละตัวอยู่ภายใต้ HTS และเปปไทด์ที่ระบุทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์สำหรับการมีอยู่ของบรรทัดฐานไตรเปปไทด์สั้นเลือกแรงจูงใจของ Tripeptide เนื่องจากเป็นพื้นฐานขั้นต่ำสำหรับการสร้างโครงสร้างและปฏิสัมพันธ์ระหว่างเปปไทด์กับโปรตีน 14,15เราพบความสัมพันธ์ที่ดีในการกระจายของ motifs ระหว่าง phage library ที่ฉีดเข้าไปและโคลนที่สกัดจากเลือดของสัตว์ทั้งสอง (รูปที่ 1e)ข้อมูลบ่งชี้ว่าองค์ประกอบของห้องสมุดมีความสมบูรณ์เพียงเล็กน้อยในช่องเลือดความถี่กรดอะมิโนและลำดับที่สอดคล้องกันได้รับการวิเคราะห์เพิ่มเติมในแต่ละตำแหน่งโดยใช้การปรับซอฟต์แวร์ Weblogo16ที่น่าสนใจคือ เราพบการเพิ่มปริมาณของไกลซีนตกค้างในเลือด (รูปที่ 1 ก.)เมื่อเปรียบเทียบเลือดกับโคลนที่เลือกจาก CSF จะมีการสังเกตการคัดเลือกที่แข็งแกร่งและการยกเลิกการเลือกบางส่วน (รูปที่ 1f) และกรดอะมิโนบางชนิดมีอยู่อย่างพิเศษในตำแหน่งที่กำหนดไว้ใน 12 สมาชิก (รูปที่ 1h)โดยเฉพาะอย่างยิ่ง สัตว์แต่ละตัวแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในน้ำไขสันหลัง ในขณะที่การเสริมระดับไกลซีนในเลือดนั้นพบได้ในสัตว์ทั้งสอง (รูปที่ 4a-j เพิ่มเติม)หลังจากการกรองข้อมูลลำดับอย่างเข้มงวดในน้ำไขสันหลังของสัตว์ #1.1 และ #1.2 จะได้เปปไทด์ 12-mer ที่ไม่ซ้ำกันทั้งหมด 964 และ 420 รายการ (รูปที่ 1d–e เพิ่มเติม)โคลนของฟาจที่แยกได้นั้นถูกขยายและอยู่ภายใต้การคัดเลือกรอบที่สองของสัตว์ทดลองPhage ที่สกัดจากการคัดเลือกรอบที่สองอยู่ภายใต้ HTS ในสัตว์แต่ละตัวและเปปไทด์ที่ระบุทั้งหมดถูกใช้เป็นอินพุตในโปรแกรมการรู้จำมาตรฐานเพื่อวิเคราะห์การเกิดขึ้นของบรรทัดฐานไตรเปปไทด์ (รูปที่ 2a, b, ef)เมื่อเปรียบเทียบกับรอบแรกของ phage ที่กู้คืนจาก CSF เราสังเกตเห็นการเลือกเพิ่มเติมและการยกเลิกการเลือก motifs จำนวนมากใน CSF ในสาขา A และ B (รูปที่ 2)มีการใช้อัลกอริธึมการระบุเครือข่ายเพื่อตรวจสอบว่าแสดงรูปแบบต่างๆ ของลำดับที่สอดคล้องกันหรือไม่สังเกตความคล้ายคลึงกันที่ชัดเจนระหว่างลำดับ 12 มิติที่กู้คืนโดย CSF ในกลุ่มทางเลือก A (รูปที่ 2c, d) และกลุ่ม B (รูปที่ 2g, h)การวิเคราะห์แบบรวมในแต่ละสาขาเผยให้เห็นโปรไฟล์การเลือกที่แตกต่างกันสำหรับเปปไทด์ 12-mer (รูปที่ 5c, d เพิ่มเติม) และการเพิ่มขึ้นของอัตราส่วน CSF / titer ของเลือดเมื่อเวลาผ่านไปสำหรับโคลนที่รวมกันหลังจากการคัดเลือกรอบที่สองเมื่อเทียบกับการคัดเลือกรอบแรก (รูปที่ 5e เพิ่มเติม)).
การเพิ่มความเข้มข้นของ motifs และ peptides ในน้ำไขสันหลังโดยสองรอบต่อเนื่องของการเลือก phage functional ในวิฟ
เฟสของน้ำไขสันหลังทั้งหมดที่กู้คืนจากรอบแรกของสัตว์แต่ละตัว (สัตว์ #1.1 และ #1.2) ถูกรวบรวม ขยาย ลำดับ HT และฉีดซ้ำเข้าด้วยกัน (2 x 1010 เฟส/สัตว์) 2 SM cannulated rats (#1.1 → #)2.1 และ 2.2, 1.2 → 2.3 และ 2.4)(a,b,e,f) แผนภาพกระจายความสัมพันธ์ที่เปรียบเทียบความถี่สัมพัทธ์ของแรงจูงใจ tripeptide ของ phages ที่ได้จาก CSF ทั้งหมดในรอบคัดเลือกที่หนึ่งและสองความถี่สัมพัทธ์และการกระจายของลวดลายที่แสดงถึงไตรเปปไทด์ที่ทับซ้อนกันที่เป็นไปได้ทั้งหมดที่พบในเปปไทด์ทั้งสองทิศทางจำนวนของลวดลายที่พบในการอ่าน 1,000 ครั้งจะแสดงขึ้นลวดลายที่มีนัยสำคัญ (p < 0.001) ถูกเลือกหรือไม่รวมอยู่ในหนึ่งในไลบรารีที่เปรียบเทียบจะถูกเน้นด้วยจุดสีแดง(c, d, g, h) การแสดงโลโก้ลำดับของลำดับยาวของกรดอะมิโน 12 ตัวที่อุดมด้วย CSF ทั้งหมดตามรอบ 2 และ 1 ของการเลือกในร่างกายขนาดของรหัสหนึ่งตัวอักษรบ่งชี้ว่ากรดอะมิโนนั้นเกิดขึ้นที่ตำแหน่งนั้นบ่อยเพียงใดเพื่อแสดงโลโก้ ความถี่ของลำดับ CSF ที่สกัดจากสัตว์แต่ละตัวระหว่างรอบการคัดเลือกสองรอบจะถูกเปรียบเทียบและแสดงลำดับที่สมบูรณ์ในรอบที่สอง: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 และ (h) #1.2–#2.4กรดอะมิโนที่สมบูรณ์ที่สุด ณ ตำแหน่งที่กำหนดใน (c, d) สัตว์หมายเลข2.1 และไม่2.2 หรือ (g, h) ในสัตว์หมายเลข2.3 และไม่2.4 แสดงเป็นสีสีเขียว = มีขั้ว, สีม่วง = เป็นกลาง, สีน้ำเงิน = พื้นฐาน, สีแดง = เป็นกรด และสีดำ = กรดอะมิโนที่ไม่ชอบน้ำ
หลังจากการคัดเลือกรอบที่สาม เราระบุลำดับเปปไทด์ที่ไม่ซ้ำกัน 124 ลำดับ (#3.1 และ #3.2) จากฟาจโคลนที่สร้างใหม่จาก CSF 332 ตัวที่แยกได้จากสัตว์สองตัว (รูปที่ 6a เพิ่มเติม)ลำดับ LGSVS (18.7%) มีสัดส่วนสัมพัทธ์สูงที่สุด ตามด้วยเม็ดมีดชนิดไวด์ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) และ SARGSWREIVSLS (2.2%)ในรอบที่สี่สุดท้าย เราได้รวบรวมกิ่งไม้สองกิ่งที่แยกจากกันโดยอิสระจากสัตว์สามตัว (รูปที่ 1c)จาก 925 phage clones ที่มีลำดับที่กู้คืนจาก CSF ในรอบที่สี่เราพบ 64 ​​ลำดับเปปไทด์ที่ไม่ซ้ำกัน (รูปที่ 6b เพิ่มเติม) ซึ่งสัดส่วนสัมพัทธ์ของ phage ชนิด wild ลดลงเหลือ 0.8%โคลน CSF ที่พบมากที่สุดในรอบที่สี่ ได้แก่ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) และ RLSSVDSDLSGC (3, 2%)%))ช่วงความยาวของเปปไทด์ที่เลือกเกิดจากการแทรก/การลบนิวคลีโอไทด์ หรือการหยุดโคดอนก่อนกำหนดในไลบรารีไพรเมอร์ เมื่อใช้โคดอนที่เสื่อมสภาพสำหรับการออกแบบไลบรารี NNKโคดอนที่หยุดทำงานก่อนวัยสร้างเปปไทด์ที่สั้นกว่าและถูกเลือกเนื่องจากมีมาตรฐาน aa ที่ดีเปปไทด์ที่ยาวขึ้นอาจเกิดจากการแทรก/ลบในไพรเมอร์ของไลบรารีสังเคราะห์สิ่งนี้วางตำแหน่งโคดอนหยุดที่ออกแบบไว้นอกเฟรมและอ่านจนกว่าโคดอนหยุดใหม่จะปรากฏขึ้นที่ปลายน้ำโดยทั่วไป เราคำนวณปัจจัยการเพิ่มคุณค่าสำหรับรอบการเลือกทั้งสี่โดยการเปรียบเทียบข้อมูลอินพุตกับข้อมูลเอาต์พุตตัวอย่างสำหรับรอบแรกของการคัดกรอง เราใช้ phage titers ชนิด wild เป็นข้อมูลอ้างอิงที่ไม่เฉพาะเจาะจงที่น่าสนใจคือการเลือกฟาจเชิงลบนั้นแข็งแกร่งมากในรอบ CSF แรก แต่ไม่ใช่ในเลือด (รูปที่ 3a) ซึ่งอาจเป็นเพราะความน่าจะเป็นต่ำของการแพร่กระจายแบบพาสซีฟของสมาชิกส่วนใหญ่ของไลบรารีเปปไทด์ในช่อง CSF หรือ phages สัมพัทธ์มีแนวโน้มที่จะถูกเก็บรักษาหรือกำจัดออกจากกระแสเลือดอย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าแบคทีเรียอย่างไรก็ตาม ในการแพนกล้องรอบที่สอง พบว่ามีการเลือกเฟจจำนวนมากใน CSF ในทั้งสองเคลด ซึ่งบ่งชี้ว่ารอบก่อนหน้านี้อุดมไปด้วยเฟจที่แสดงเปปไทด์ที่ส่งเสริมการดูดซึม CSF (รูปที่ 3a)อีกครั้งโดยไม่มีการเสริมเลือดอย่างมีนัยสำคัญนอกจากนี้ ในรอบที่สามและสี่ โคลนของฟาจได้รับการเสริมคุณค่าในน้ำไขสันหลังอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบความถี่สัมพัทธ์ของลำดับเปปไทด์แต่ละลำดับระหว่างการคัดเลือกสองรอบล่าสุด เราพบว่าลำดับนั้นสมบูรณ์ยิ่งขึ้นในรอบที่สี่ของการคัดเลือก (รูปที่ 3b)แรงจูงใจของไตรเปปไทด์ทั้งหมด 931 รายการถูกสกัดจากลำดับเปปไทด์ที่ไม่ซ้ำกันทั้งหมด 64 ลำดับโดยใช้การวางแนวของเปปไทด์ทั้งสองลวดลายที่ได้รับการเสริมคุณค่ามากที่สุดในรอบที่สี่ได้รับการตรวจสอบอย่างใกล้ชิดยิ่งขึ้นสำหรับโปรไฟล์การตกแต่งในทุกรอบเมื่อเทียบกับไลบรารีที่ถูกฉีด (การตัดออก: การเพิ่มคุณค่า 10%) (รูปที่ 6c เพิ่มเติม)รูปแบบทั่วไปของการคัดเลือกแสดงให้เห็นว่าแรงจูงใจที่ศึกษาส่วนใหญ่ได้รับการเติมเต็มในรอบก่อนหน้าของสาขาการคัดเลือกทั้งสองอย่างไรก็ตาม ลวดลายบางอย่าง (เช่น SGL, VSG, LGS GSV) มาจากกลุ่มทางเลือก A เป็นหลัก ในขณะที่รูปแบบอื่นๆ (เช่น FGW, RTN, WGF, NTR) ได้รับการเติมเต็มในทางเลือกกลุ่ม B
การตรวจสอบความถูกต้องของการขนส่ง CSF ของเปปไทด์ที่แสดงด้วยฟาจที่อุดมด้วย CSF และเปปไทด์ผู้นำที่เติมด้วยไบโอทินิเลตที่ผสานเข้ากับเพย์โหลดของสเตรปตาวิดิน
(a) อัตราส่วนการเพิ่มคุณค่าคำนวณในรอบทั้งสี่ (R1-R4) ตามไทเทอร์ของฟาจ (PFU) ที่ฉีด (อินพุต = I) และไทเทอร์ของฟาจ CSF (เอาต์พุต = O) ที่กำหนดปัจจัยการเพิ่มคุณค่าสำหรับสามรอบล่าสุด (R2-R4) คำนวณโดยเปรียบเทียบกับรอบก่อนหน้าและรอบแรก (R1) ด้วยข้อมูลน้ำหนักแถบเปิดคือน้ำไขสันหลัง แถบสีเทาคือพลาสมา(***p<0.001 จากการทดสอบของนักเรียน)(b) รายชื่อเพปไทด์ฟาจที่มีมากที่สุด จัดอันดับตามสัดส่วนสัมพัทธ์กับเฟจทั้งหมดที่รวบรวมใน CSF หลังจากรอบที่ 4 ของการคัดเลือกphage clones ที่พบมากที่สุดหกตัวจะถูกเน้นด้วยสี ตัวเลข และปัจจัยการเพิ่มคุณค่าระหว่างรอบที่ 3 และ 4 ของการเลือก (สิ่งที่ใส่เข้าไป)(c, d) phage clones ที่สมบูรณ์ที่สุด 6 แหล่ง, คลังเปปไทด์ phage เปล่าและ phage ผู้ปกครองจากรอบที่ 4 ได้รับการวิเคราะห์ทีละรายการในแบบจำลองการสุ่มตัวอย่าง CSFเก็บตัวอย่างน้ำไขสันหลังและเลือด ณ เวลาที่กำหนด(c) phage clones ตัวเลือก 6 ตัวในปริมาณเท่ากัน (2 x 1010 phages/สัตว์), phages เปล่า (#1779) (2 x 1010 phages/สัตว์) และ stock phage peptide libraries (2 x 1012 phages/สัตว์) ฉีดอย่างน้อย 3 CM ให้กับสัตว์ที่อยู่ในกระป๋องแยกกันผ่านทางหลอดเลือดดำส่วนหางเภสัชจลนศาสตร์ของ CSF ของ phage clone และ phage peptide library ที่ถูกฉีดแต่ละครั้งจะแสดงขึ้นเมื่อเวลาผ่านไป(d) แสดงอัตราส่วน CSF/เลือดโดยเฉลี่ยสำหรับ phages/mL ที่กู้คืนทั้งหมดในช่วงเวลาสุ่มตัวอย่าง(e) เปปไทด์ผู้นำสังเคราะห์สี่ตัวและตัวควบคุมสัญญาณรบกวนหนึ่งตัวเชื่อมโยงกับไบโอตินกับสเตรปตาวิดินผ่านปลาย N (จอแสดงผล tetramer) ตามด้วยการฉีด (หลอดเลือดดำส่วนหาง iv, สเตรปตาวิดิน 10 มก./กก.)หนูที่ใส่ท่อช่วยหายใจอย่างน้อยสามตัว (N = 3)).ตัวอย่างน้ำไขสันหลังถูกรวบรวม ณ จุดเวลาที่ระบุและความเข้มข้นของสเตรปตาวิดินถูกวัดโดย CSF anti-streptavidin ELISA (nd = ตรวจไม่พบ)(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 ตามการทดสอบ ANOVA)(f) การเปรียบเทียบลำดับกรดอะมิโนของ phage peptide โคลน #2002 ที่อุดมมากที่สุด (สีม่วง) กับ phage peptide โคลนอื่น ๆ ที่เลือกจากรอบที่ 4 ของการคัดเลือกชิ้นส่วนกรดอะมิโนที่เหมือนกันและคล้ายคลึงกันจะมีรหัสสีกำกับไว้
ในบรรดาเฟจที่ได้รับการเสริมคุณค่าทั้งหมดในรอบที่สี่ (รูปที่ 3b) โคลนตัวเลือกหกตัวถูกเลือกสำหรับการวิเคราะห์รายบุคคลเพิ่มเติมในแบบจำลองการสุ่มตัวอย่าง CSFจำนวนที่เท่ากันของ phage ของผู้สมัครหกตัว, phage เปล่า (ไม่มีการแทรก) และห้องสมุดเปปไทด์ของ prophage ถูกฉีดเข้าไปในสัตว์ CM cannated สามตัวและเภสัชจลนศาสตร์ถูกกำหนดในน้ำไขสันหลัง (รูปที่ 3c) และเลือด (รูปที่ 7 เพิ่มเติม) การทดสอบphage clones ทั้งหมดที่ทดสอบกำหนดเป้าหมายช่อง CSF ที่ระดับ 10-1000 สูงกว่าของ phage ควบคุมที่ว่างเปล่า (#1779)ตัวอย่างเช่น โคลน #2020 และ #2077 มีไทเทอร์ของ CSF สูงกว่าฟาจควบคุมประมาณ 1,000 เท่ารายละเอียดทางเภสัชจลนศาสตร์ของเปปไทด์ที่เลือกแต่ละชนิดนั้นแตกต่างกัน แต่ทั้งหมดมีความสามารถในการกลับบ้านของ CSF สูงเราสังเกตเห็นการลดลงอย่างต่อเนื่องเมื่อเวลาผ่านไปสำหรับโคลน #1903 และ #2011 ในขณะที่สำหรับโคลน #2077, #2002 และ #2009 การเพิ่มขึ้นในช่วง 10 นาทีแรกอาจบ่งชี้ถึงการขนส่งที่ใช้งานอยู่ แต่จำเป็นต้องได้รับการตรวจสอบโคลน #2020, #2002 และ #2077 คงตัวที่ระดับสูง ในขณะที่ความเข้มข้นของน้ำไขสันหลังของโคลน #2009 ลดลงอย่างช้าๆ หลังจากการเพิ่มขึ้นครั้งแรกจากนั้นเราเปรียบเทียบความถี่สัมพัทธ์ของผู้สมัครจากน้ำไขสันหลังแต่ละคนกับความเข้มข้นของเลือด (รูปที่ 3 มิติ)ความสัมพันธ์ของค่า titer เฉลี่ยของผู้สมัครจากน้ำไขสันหลังแต่ละคนกับระดับไตเตอร์ของเลือดตลอดเวลาที่สุ่มตัวอย่างแสดงให้เห็นว่าผู้สมัคร 3 ใน 6 คนมีความสมบูรณ์ในน้ำไขสันหลังที่มีนัยสำคัญน่าสนใจ โคลน #2077 แสดงความคงตัวของเลือดสูงกว่า (รูปที่ 7 เพิ่มเติม)เพื่อยืนยันว่าเปปไทด์เองมีความสามารถในการขนส่งสินค้านอกเหนือจากอนุภาคฟาจเข้าสู่ช่อง CSF เราจึงสังเคราะห์เปปไทด์ชั้นนำ 4 ชนิดที่อนุพันธ์ด้วยไบโอตินที่ปลาย N ซึ่งเปปไทด์ยึดติดกับอนุภาคฟาจเปปไทด์ที่มีไบโอทินิเลต (หมายเลขปี 2002, 2009, 2020 และ 2077) ถูกควบรวมกับสเตรปตาวิดิน (SA) เพื่อให้ได้รูปแบบมัลติเมอริกที่ค่อนข้างเลียนแบบเรขาคณิตฟาจรูปแบบนี้ยังช่วยให้เราสามารถวัดการสัมผัส SA ในเลือดและน้ำไขสันหลังในรูปของเปปไทด์โปรตีนที่ขนส่งสินค้าที่สำคัญ ข้อมูลฟาจสามารถทำซ้ำได้บ่อยครั้งเมื่อให้เปปไทด์สังเคราะห์ในรูปแบบ SA-conjugated นี้ (รูปที่ 3e)เปปไทด์ที่มีสัญญาณรบกวนมีการสัมผัสครั้งแรกน้อยกว่าและการกวาดล้าง CSF เร็วขึ้นด้วยระดับที่ตรวจไม่พบภายใน 48 ชั่วโมงเพื่อให้ได้รับข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับเส้นทางการนำส่งของเปปไทด์ phage โคลนเหล่านี้ไปยังพื้นที่ CSF เราได้วิเคราะห์การแปลของ phage peptide แต่ละตัวโดยใช้อิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC) เพื่อตรวจจับอนุภาคของ phage โดยตรง 1 ชั่วโมงหลังจากการฉีดเข้าเส้นเลือดดำ ในร่างกายโดยเฉพาะอย่างยิ่ง โคลน #2002, #2077 และ #2009 สามารถตรวจจับได้โดยการย้อมสีที่รุนแรงในเส้นเลือดฝอยในสมอง ในขณะที่ฟาจควบคุม (#1779) และโคลน #2020 ไม่ถูกตรวจพบ (รูปที่ 8 เพิ่มเติม)สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าเปปไทด์เหล่านี้ส่งผลต่อสมองอย่างแม่นยำโดยการข้าม BBBจำเป็นต้องมีการวิเคราะห์รายละเอียดเพิ่มเติมเพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ เนื่องจากเส้นทาง BSCFB อาจเกี่ยวข้องด้วยเมื่อเปรียบเทียบลำดับกรดอะมิโนของโคลนที่มีความสมบูรณ์มากที่สุด (#2002) กับเปปไทด์อื่นๆ ที่เลือก พบว่าบางชนิดมีส่วนขยายของกรดอะมิโนที่คล้ายกัน ซึ่งอาจบ่งบอกถึงกลไกการขนส่งที่คล้ายคลึงกัน (รูปที่ 3f)
เนื่องจากโปรไฟล์พลาสมาที่เป็นเอกลักษณ์และการเพิ่มขึ้นอย่างมากของ CSF เมื่อเวลาผ่านไป phage display clone #2077 จึงได้รับการสำรวจเพิ่มเติมในระยะเวลา 48 ชั่วโมงที่ยาวนานขึ้น และสามารถสร้างการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของ CSF ที่สังเกตได้จากระดับ SA ที่คงอยู่ (รูปที่ 4a)เกี่ยวกับฟาจโคลนนิ่งอื่นๆ ที่ระบุ #2077 ย้อมอย่างรุนแรงสำหรับเส้นเลือดฝอยในสมอง และแสดงการรวมสีอย่างมีนัยสำคัญด้วยแคปิลลารีมาร์กเกอร์เลคตินเมื่อดูที่ความละเอียดสูงกว่า และอาจมีการย้อมบางส่วนในปริภูมิพาร์เรงไคมอล (รูปที่ 4b)เพื่อตรวจสอบว่าสามารถรับผลทางเภสัชวิทยาที่อาศัยเปปไทด์ในระบบประสาทส่วนกลางได้หรือไม่ เราทำการทดลองโดยให้ i) ทรานซิทเปปไทด์ #2077 เวอร์ชันไบโอทินิเลต และ ii) เปปไทด์ยับยั้ง BACE1 ผสมกับ SA ในอัตราส่วนที่แตกต่างกันสองส่วนสำหรับชุดค่าผสมหนึ่ง เราใช้เฉพาะตัวยับยั้งเปปไทด์ BACE1 และสำหรับอีกชุดหนึ่ง เราใช้อัตราส่วน 1:3 ของตัวยับยั้งเปปไทด์ BACE1 ต่อเปปไทด์ #2077ทั้งสองตัวอย่างถูกบริหารให้ทางหลอดเลือดดำและวัดระดับเบต้า-อะไมลอยด์เปปไทด์ 40 (Abeta40) ในเลือดและน้ำไขสันหลังในช่วงเวลาหนึ่งวัด Abeta40 ในน้ำไขสันหลังเนื่องจากสะท้อนการยับยั้ง BACE1 ในเนื้อเยื่อสมองตามที่คาดไว้ คอมเพล็กซ์ทั้งสองลดระดับเลือดของ Abeta40 ลงอย่างมาก (รูปที่ 4c, d)อย่างไรก็ตาม เฉพาะตัวอย่างที่มีส่วนผสมของเปปไทด์หมายเลข2077 และตัวยับยั้งของเปปไทด์ BACE1 ที่ควบกับ SA ทำให้ Abeta40 ในน้ำไขสันหลังลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4c)ข้อมูลแสดงว่าเปปไทด์ไม่มี2077 สามารถขนส่งโปรตีน 60 kDa SA เข้าสู่ระบบประสาทส่วนกลาง และยังกระตุ้นผลทางเภสัชวิทยาด้วยสารยับยั้ง SA-conjugated ของเปปไทด์ BACE1
(a) การฉีดโคลน (2 × 10 เฟส/สัตว์) ของ T7 phage แสดงโปรไฟล์เภสัชจลนศาสตร์ระยะยาวของเปปไทด์ CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) และ phage ควบคุมที่ไม่ได้ฉีด (#1779) ในหนูแรทที่ใส่ท่อช่วยหายใจ CM อย่างน้อยสามตัว(b) ภาพถ่ายจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลของ microvessels เยื่อหุ้มสมองที่เป็นตัวแทนในหนูแรทที่ถูกฉีดด้วยฟาจ (2 × 10 10 เฟจ/สัตว์) ซึ่งแสดงการปนเปื้อนของเปปไทด์ #2077 และหลอดเลือด (เลคติน)phage clones เหล่านี้ถูกบริหารให้หนู 3 ตัวและปล่อยให้หมุนเวียนเป็นเวลา 1 ชั่วโมงก่อนการให้เลือดสมองถูกแบ่งส่วนและย้อมด้วยแอนติบอดีที่ติดฉลาก FITC แบบโพลีโคลนอลกับ T7 phage capsidสิบนาทีก่อนการไหลเวียนเลือดและการตรึงที่ตามมา เลคตินที่มีฉลาก DyLight594 จะถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำภาพเรืองแสงแสดงการย้อมสีเลคติน (สีแดง) ของด้านแสงของไมโครเวสเซลและฟาจ (สีเขียว) ในรูของหลอดเลือดฝอยและเนื้อเยื่อรอบหลอดเลือดสมองแถบมาตราส่วนสอดคล้องกับ 10 µm(c, d) เปปไทด์ที่ยับยั้ง BACE1 ที่มีไบโอทินิเลตเพียงอย่างเดียวหรือในการรวมกันกับเพปไทด์ทรานสิท #2077 ที่มีไบโอทินิเลตถูกจับคู่กับสเตรปตาวิดินที่ตามด้วยการฉีดเข้าเส้นเลือดดำของหนูแรท CM ที่ถูกอัดกระป๋องอย่างน้อยสามตัว (10 มก. สเตรปตาวิดิน/กก.)การลดลงของสารยับยั้งเปปไทด์ BACE1 ใน Aβ40 วัดโดย Aβ1-40 ELISA ในเลือด (สีแดง) และน้ำไขสันหลัง (สีส้ม) ที่จุดเวลาที่ระบุเพื่อความชัดเจนยิ่งขึ้น เส้นประจะถูกวาดบนกราฟในระดับ 100%(c) เปอร์เซ็นต์การลดลงของ Aβ40 ในเลือด (รูปสามเหลี่ยมสีแดง) และน้ำไขสันหลัง (รูปสามเหลี่ยมสีส้ม) ในหนูแรทที่ได้รับการรักษาด้วยสเตรปตาวิดินที่เชื่อมกับเพปไทด์ทรานสิท #2077 และเปปไทด์ยับยั้ง BACE1 ในอัตราส่วน 3:1(d) เปอร์เซ็นต์การลดลงของ Aβ40 ในเลือด (วงกลมสีแดง) และน้ำไขสันหลัง (วงกลมสีส้ม) ของหนูที่ได้รับการรักษาด้วยสเตรปตาวิดินควบคู่กับเปปไทด์ยับยั้ง BACE1 เท่านั้นความเข้มข้นของ Aβ ในกลุ่มควบคุมคือ 420 pg/ml (ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน = 101 pg/ml)
Phage display ประสบความสำเร็จในการนำไปใช้ในงานวิจัยด้านชีวการแพทย์หลายด้าน17วิธีนี้ใช้สำหรับการศึกษาความหลากหลายของหลอดเลือดในร่างกาย รวมถึงการศึกษาที่กำหนดเป้าหมายหลอดเลือดสมอง20,21,22,23,24,25,26ในการศึกษานี้ เราได้ขยายการประยุกต์ใช้วิธีการคัดเลือกนี้ไม่เพียงแต่เพื่อการระบุโดยตรงของเปปไทด์ที่กำหนดเป้าหมายไปยังหลอดเลือดสมองเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการค้นพบผู้สมัครที่มีคุณสมบัติในการขนส่งเพื่อข้ามสิ่งกีดขวางระหว่างเลือดและสมองตอนนี้เราอธิบายถึงการพัฒนาขั้นตอนการคัดเลือก ในร่างกาย ในหนูที่ใส่ท่อช่วยหายใจ CM และแสดงให้เห็นถึงศักยภาพในการระบุเปปไทด์ที่มีคุณสมบัติในการกลับบ้านของ CSFการใช้ T7 phage ที่แสดงไลบรารีของเปปไทด์แบบสุ่ม 12 เมอร์ เราสามารถแสดงให้เห็นว่า T7 phage มีขนาดเล็กพอ (เส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 60 นาโนเมตร)10 ที่ปรับให้เข้ากับสิ่งกีดขวางระหว่างเลือดและสมอง ซึ่งจะเป็นการข้ามสิ่งกีดขวางระหว่างเลือดและสมองโดยตรงหรือ choroid plexusเราสังเกตว่าการเก็บเกี่ยวน้ำไขสันหลังจากหนู CM ที่เลี้ยงในกระป๋องเป็นวิธีการตรวจคัดกรองการทำงานของร่างกายที่มีการควบคุมอย่างดี และฟาจที่สกัดได้ไม่เพียงแต่จับกับหลอดเลือดเท่านั้น แต่ยังทำหน้าที่เป็นตัวขนส่งข้ามสิ่งกีดขวางระหว่างเลือดและสมองด้วยนอกจากนี้ ด้วยการเก็บเลือดและใช้ HTS กับ CSF และเฟจที่ได้มาจากเลือดพร้อมกัน เรายืนยันว่าการเลือก CSF ของเราไม่ได้รับอิทธิพลจากการเพิ่มปริมาณเลือดหรือความเหมาะสมสำหรับการขยายตัวระหว่างรอบการคัดเลือกอย่างไรก็ตาม ช่องเก็บเลือดเป็นส่วนหนึ่งของกระบวนการคัดเลือก เนื่องจากเฟสที่สามารถเข้าถึงช่อง CSF จะต้องอยู่รอดและไหลเวียนในกระแสเลือดนานพอที่จะเสริมสร้างตัวเองในสมองในการดึงข้อมูลลำดับที่เชื่อถือได้จากข้อมูล HTS ดิบ เราได้ใช้ตัวกรองที่ปรับให้เข้ากับข้อผิดพลาดในการจัดลำดับเฉพาะแพลตฟอร์มในเวิร์กโฟลว์การวิเคราะห์ด้วยการรวมพารามิเตอร์จลน์ศาสตร์เข้ากับวิธีการคัดกรอง เรายืนยันเภสัชจลนศาสตร์อย่างรวดเร็วของฟาจ T7 ชนิดไวด์ (t½ ~ 28 นาที) ในเลือด24, 27, 28 และยังกำหนดครึ่งชีวิตในน้ำไขสันหลัง (t½ ~ 26 นาที) ต่อนาที)แม้จะมีโปรไฟล์ทางเภสัชจลนศาสตร์ในเลือดและน้ำไขสันหลังที่คล้ายคลึงกัน แต่สามารถตรวจพบความเข้มข้นของ phage ในเลือดเพียง 0.001% ในน้ำไขสันหลัง ซึ่งบ่งชี้ว่า phage ชนิด wild-type T7 เคลื่อนที่ผ่านสิ่งกีดขวางระหว่างเลือดและสมองในระดับต่ำงานนี้เน้นย้ำถึงความสำคัญของการคัดเลือกรอบแรกเมื่อใช้กลยุทธ์การแพนกล้องในร่างกาย โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับระบบฟาจที่ถูกล้างออกจากการไหลเวียนอย่างรวดเร็ว เนื่องจากมีโคลนไม่กี่ตัวที่สามารถเข้าถึงช่องระบบประสาทส่วนกลางได้ดังนั้นในรอบแรก ความหลากหลายของไลบรารีที่ลดลงจึงมีขนาดใหญ่มาก เนื่องจากมีการรวบรวมโคลนจำนวนจำกัดในโมเดล CSF ที่เข้มงวดมากนี้ในที่สุดกลยุทธ์การแพนกล้องในร่างกายนี้รวมถึงขั้นตอนการคัดเลือกหลายขั้นตอน เช่น การสะสมที่ใช้งานอยู่ในช่อง CSF การอยู่รอดของโคลนในช่องเลือด และการกำจัดอย่างรวดเร็วของโคลนฟาจ T7 ออกจากเลือดภายใน 10 นาทีแรก (รูปที่ 1d และรูปที่ 4M เพิ่มเติม)).ดังนั้น หลังจากรอบแรก โคลนของฟาจที่แตกต่างกันถูกระบุใน CSF แม้ว่าจะใช้แหล่งรวมเดียวกันสำหรับสัตว์แต่ละตัวสิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าขั้นตอนการเลือกที่เข้มงวดหลายขั้นตอนสำหรับห้องสมุดต้นทางที่มีสมาชิกห้องสมุดจำนวนมากส่งผลให้ความหลากหลายลดลงอย่างมากดังนั้น เหตุการณ์สุ่มจะกลายเป็นส่วนสำคัญของกระบวนการคัดเลือกเริ่มต้น ซึ่งมีผลอย่างมากต่อผลลัพธ์เป็นไปได้ว่าโคลนหลายตัวในไลบรารี่ดั้งเดิมนั้นมีแนวโน้มที่จะเพิ่มคุณค่า CSF ที่คล้ายกันมากอย่างไรก็ตาม แม้จะอยู่ภายใต้เงื่อนไขการทดลองเดียวกัน ผลการเลือกอาจแตกต่างกันเนื่องจากแต่ละโคลนในพูลเริ่มต้นมีจำนวนน้อย
แรงจูงใจที่อุดมไปด้วยน้ำไขสันหลังแตกต่างจากในเลือดที่น่าสนใจคือ เราสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงครั้งแรกต่อเปปไทด์ที่อุดมด้วยไกลซีนในเลือดของสัตว์แต่ละตัว(รูปที่ 1g, รูปเสริม 4e, 4f)Phage ที่มี glycine peptides อาจมีความเสถียรมากกว่าและมีโอกาสน้อยที่จะถูกนำออกจากการไหลเวียนอย่างไรก็ตาม ไม่พบเปปไทด์ที่อุดมด้วยไกลซีนในตัวอย่างน้ำไขสันหลัง ซึ่งบ่งชี้ว่าห้องสมุดที่ดูแลจัดการได้ผ่านขั้นตอนการคัดเลือกที่แตกต่างกันสองขั้นตอน: ขั้นตอนหนึ่งในเลือดและอีกขั้นตอนหนึ่งปล่อยให้สะสมในน้ำไขสันหลังโคลนที่อุดมด้วย CSF ซึ่งเป็นผลมาจากการคัดเลือกรอบที่สี่ได้รับการทดสอบอย่างครอบคลุมโคลนที่ผ่านการทดสอบแต่ละรายการเกือบทั้งหมดได้รับการยืนยันว่าได้รับการเสริมคุณค่าใน CSF เมื่อเทียบกับเฟจควบคุมเปล่าตรวจสอบเปปไทด์หนึ่งครั้ง (#2077) ในรายละเอียดเพิ่มเติมมันแสดงให้เห็นครึ่งชีวิตในพลาสมาที่ยาวนานกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการโจมตีอื่นๆ (รูปที่ 3 มิติและรูปที่ 7 เพิ่มเติม) และที่น่าสนใจคือเปปไทด์นี้มีซีสเตอีนตกค้างที่ปลาย Cเมื่อเร็ว ๆ นี้แสดงให้เห็นว่าการเติมซีสเตอีนในเปปไทด์สามารถปรับปรุงคุณสมบัติทางเภสัชจลนศาสตร์ได้โดยการจับกับอัลบูมิน 29ขณะนี้ยังไม่ทราบสำหรับเปปไทด์ #2077 และต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเปปไทด์บางชนิดแสดงการขึ้นต่อกันของวาเลนซ์ในการเพิ่มคุณค่า CSF (ไม่แสดงข้อมูล) ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับรูปทรงเรขาคณิตพื้นผิวที่แสดงของแคปซิด T7ระบบ T7 ที่เราใช้แสดงสำเนาของเปปไทด์แต่ละรายการ 5-15 ชุดต่ออนุภาคฟาจIHC ดำเนินการกับผู้สมัครนำโคลนฟาจที่ฉีดเข้าเส้นเลือดดำเข้าไปในเปลือกสมองของหนู (รูปที่ 8 เพิ่มเติม)ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าโคลนอย่างน้อยสามตัว (หมายเลข 2002, หมายเลข 2009 และหมายเลข 2077) มีปฏิสัมพันธ์กับ BBBยังคงต้องมีการพิจารณาว่าปฏิสัมพันธ์ของ BBB นี้ส่งผลให้เกิดการสะสมของ CSF หรือการเคลื่อนที่ของโคลนเหล่านี้ไปยัง BCSFB โดยตรงหรือไม่ที่สำคัญ เราแสดงให้เห็นว่าเปปไทด์ที่เลือกยังคงความสามารถในการขนส่งน้ำไขสันหลังเมื่อสังเคราะห์และจับกับโปรตีนการจับเปปไทด์ของไบโอติไนเลตที่ปลาย N กับ SA นั้นเป็นการทำซ้ำผลลัพธ์ที่ได้รับด้วย phage clones ที่เกี่ยวข้องในเลือดและน้ำไขสันหลัง (รูปที่ 3e)ในที่สุด เราแสดงให้เห็นว่าเปปไทด์ตะกั่ว #2077 สามารถส่งเสริมการทำงานของสมองของตัวยับยั้งเปปไทด์ biotinylated ของ BACE1 ที่รวมกับ SA ทำให้เกิดผลทางเภสัชพลศาสตร์ที่เด่นชัดในระบบประสาทส่วนกลางโดยการลดระดับ Abeta40 ในน้ำไขสันหลังลงอย่างมาก (รูปที่ 4)เราไม่สามารถระบุความคล้ายคลึงกันใดๆ ในฐานข้อมูลโดยการค้นหาความคล้ายคลึงกันของลำดับเปปไทด์ของจำนวนทั้งหมดสิ่งสำคัญคือต้องสังเกตว่าขนาดของไลบรารี T7 อยู่ที่ประมาณ 109 ในขณะที่ขนาดไลบรารีตามทฤษฎีสำหรับ 12-mers คือ 4 x 1,015 ดังนั้น เราจึงเลือกเพียงส่วนเล็กๆ ของพื้นที่ความหลากหลายของไลบรารีเปปไทด์ 12-mer ซึ่งอาจหมายความว่าสามารถระบุเปปไทด์ที่เหมาะสมที่สุดได้โดยการประเมินพื้นที่ลำดับที่อยู่ติดกันของ Hit ที่ระบุเหล่านี้ตามสมมุติฐานแล้ว สาเหตุหนึ่งที่เราไม่พบความคล้ายคลึงตามธรรมชาติของเปปไทด์เหล่านี้อาจเกิดจากการไม่เลือกในระหว่างวิวัฒนาการเพื่อป้องกันไม่ให้แรงจูงใจของเปปไทด์บางชนิดเข้าสู่สมองอย่างควบคุมไม่ได้
เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์ของเราเป็นพื้นฐานสำหรับงานในอนาคตเพื่อระบุและระบุลักษณะของระบบขนส่งของสิ่งกีดขวางหลอดเลือดสมองในร่างกายโดยละเอียดยิ่งขึ้นการตั้งค่าพื้นฐานของวิธีการนี้ขึ้นอยู่กับกลยุทธ์การเลือกหน้าที่ ซึ่งไม่เพียงแต่ระบุโคลนที่มีคุณสมบัติจับกับหลอดเลือดในสมองเท่านั้น แต่ยังรวมถึงขั้นตอนสำคัญที่โคลนที่ประสบความสำเร็จจะมีฤทธิ์ภายในเพื่อข้ามสิ่งกีดขวางทางชีววิทยาภายในร่างกายเข้าไปในช่องระบบประสาทส่วนกลางคือการอธิบายกลไกการขนส่งของเปปไทด์เหล่านี้และความชอบในการจับกับหลอดเลือดขนาดเล็กที่จำเพาะต่อบริเวณสมองสิ่งนี้อาจนำไปสู่การค้นพบเส้นทางใหม่สำหรับการขนส่ง BBB และตัวรับเราคาดว่าเปปไทด์ที่ระบุสามารถจับโดยตรงกับตัวรับหลอดเลือดสมองหรือลิแกนด์หมุนเวียนที่ขนส่งผ่าน BBB หรือ BCSFBเวกเตอร์เปปไทด์ที่มีกิจกรรมการขนส่ง CSF ที่พบในงานนี้จะได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมขณะนี้เรากำลังตรวจสอบความจำเพาะของสมองของเปปไทด์เหล่านี้สำหรับความสามารถในการข้าม BBB และ/หรือ BCSFBเปปไทด์ใหม่เหล่านี้จะเป็นเครื่องมือที่มีค่าอย่างยิ่งสำหรับการค้นพบตัวรับหรือเส้นทางใหม่ที่เป็นไปได้ และสำหรับการพัฒนาแพลตฟอร์มใหม่ที่มีประสิทธิภาพสูงสำหรับการนำส่งโมเลกุลขนาดใหญ่ เช่น สารชีวภาพ ไปยังสมอง
เจาะถังเก็บน้ำขนาดใหญ่ (CM) โดยใช้การปรับเปลี่ยนวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้หนู Wistar ที่ได้รับยาสลบ (200-350 กรัม) ถูกติดตั้งบนเครื่องมือ stereotaxic และทำแผลผ่ากลางบนหนังศีรษะที่โกนแล้วและเตรียมปลอดเชื้อเพื่อให้เห็นกะโหลกศีรษะเจาะสองรูที่บริเวณสายสะพายด้านบนและขันสกรูยึดให้แน่นในรูมีการเจาะรูเพิ่มเติมที่ยอดท้ายทอยด้านข้างเพื่อนำทาง stereotactic ของ cannula สแตนเลสเข้าไปใน CMทาซีเมนต์ฟันรอบๆ cannula และยึดด้วยสกรูหลังจากการบ่มด้วยแสงและการทำให้แข็งด้วยซีเมนต์ บาดแผลที่ผิวหนังถูกปิดด้วยไหมซูปรามิด 4/0ตำแหน่งที่ถูกต้องของ cannula ได้รับการยืนยันโดยการรั่วไหลของน้ำไขสันหลัง (CSF) ที่เกิดขึ้นเองนำหนูออกจากเครื่อง Stereotaxic รับการดูแลหลังการผ่าตัดและการจัดการความเจ็บปวดที่เหมาะสม และปล่อยให้หนูฟื้นตัวเป็นเวลาอย่างน้อยหนึ่งสัปดาห์จนกว่าจะสังเกตเห็นสัญญาณของเลือดในน้ำไขสันหลังหนูวิสตาร์ (Crl:WI/Han) ได้มาจากแม่น้ำชาร์ลส์ (ฝรั่งเศส)หนูทุกตัวถูกเก็บไว้ภายใต้สภาวะปลอดเชื้อโรคโดยเฉพาะการทดลองในสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากสำนักงานสัตวแพทย์แห่งเมืองบาเซิล ประเทศสวิตเซอร์แลนด์ และดำเนินการตามใบอนุญาตสัตว์เลขที่ 2474 (การประเมินการขนส่งสมองที่เคลื่อนไหวโดยการวัดระดับของผู้เข้ารับการบำบัดในน้ำไขสันหลังและสมองของหนู)
ค่อยๆ ทำให้หนูมีสติด้วย CM cannula ในมือนำ Datura ออกจาก cannula และเก็บน้ำไขสันหลังที่ไหลเอง 10 µlเนื่องจากความชัดเจนของ cannula ถูกทำลายในท้ายที่สุด จึงรวมเฉพาะตัวอย่างน้ำไขสันหลังที่ชัดเจนซึ่งไม่มีหลักฐานการปนเปื้อนของเลือดหรือการเปลี่ยนสีในการศึกษานี้ในเวลาเดียวกัน เลือดประมาณ 10–20 ไมโครลิตรถูกนำมาจากแผลเล็ก ๆ ที่ปลายหางเข้าไปในท่อที่มีเฮปาริน (ซิกมา-อัลดริช)น้ำไขสันหลังและเลือดถูกรวบรวม ณ เวลาต่างๆ หลังจากฉีด T7 phage ทางหลอดเลือดดำของเหลวประมาณ 5–10 ไมโครลิตรถูกทิ้งก่อนที่จะเก็บตัวอย่างน้ำไขสันหลังแต่ละตัวอย่าง ซึ่งสอดคล้องกับปริมาตรที่ตายแล้วของสายสวน
ไลบรารีถูกสร้างขึ้นโดยใช้เวกเตอร์ T7Select 10-3b ตามที่อธิบายไว้ในคู่มือระบบ T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996)โดยสังเขป การแทรก DNA แบบสุ่ม 12 เมอร์ถูกสังเคราะห์ในรูปแบบต่อไปนี้:
โคดอน NNK ถูกใช้เพื่อหลีกเลี่ยงโคดอนดับเบิ้ลสต็อปและกรดอะมิโนที่แสดงออกมากเกินไปในส่วนแทรกN คืออัตราส่วนสมมูลแบบผสมด้วยตนเองของนิวคลีโอไทด์แต่ละตัว และ K คืออัตราส่วนสมมูลแบบผสมด้วยตนเองของนิวคลีโอไทด์อะดีนีนและไซโตซีนบริเวณที่มีเกลียวเดี่ยวถูกแปลงเป็น DNA ที่มีเกลียวคู่โดยการบ่มต่อไปด้วย dNTP (Novagen) และเอนไซม์ Klenow (New England Biolabs) ใน Klenow buffer (New England Biolabs) เป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 37°Cหลังจากเกิดปฏิกิริยา DNA ที่มีเกลียวสองเส้นถูกกู้คืนโดยการตกตะกอนของ EtOHDNA ที่เป็นผลลัพธ์ถูกย่อยด้วยเอ็นไซม์จำกัด EcoRI และ HindIII (จาก Roche ทั้งคู่)เม็ดมีดที่แยกและทำให้บริสุทธิ์ (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) ถูกต่อเชื่อมในเฟรมเข้ากับเวกเตอร์ T7 ที่ตัดก่อนหลังกรดอะมิโน 348 ของยีนแคปซิด 10Bปฏิกิริยาลิเกชันถูกบ่มที่อุณหภูมิ 16°ซ เป็นเวลา 18 ชั่วโมงก่อนการบรรจุในหลอดทดลองการบรรจุ Phage ในหลอดทดลอง ดำเนินการตามคำแนะนำที่มาพร้อมกับชุดการโคลน T7Select 10-3b (Novagen) และสารละลายบรรจุภัณฑ์ถูกขยายหนึ่งครั้งเพื่อสลายโดยใช้ Escherichia coli (BLT5615, Novagen)ไลเซทถูกหมุนเหวี่ยง ไทเทรต และแช่แข็งที่ -80°ซ เป็นสารละลายสต็อกของกลีเซอรอล
การขยายสัญญาณ PCR โดยตรงของพื้นที่ตัวแปรฟาจที่ขยายในน้ำซุปหรือจานโดยใช้ฟิวชั่นไพรเมอร์ 454/Roche-amplicon ที่เป็นกรรมสิทธิ์ไพรเมอร์ฟิวชันไปข้างหน้าประกอบด้วยลำดับที่ขนาบข้างขอบเขตตัวแปร (NNK) 12 (เฉพาะเทมเพลต), GS FLX Titanium Adapter A และลำดับคีย์ไลบรารีสี่ฐาน (TCAG) (รูปที่ 1a เพิ่มเติม):
ไพรเมอร์ฟิวชันแบบย้อนกลับยังมีไบโอตินที่ติดอยู่กับการดักจับเม็ดบีดและ GS FLX Titanium Adapter B ที่จำเป็นสำหรับการขยายโคลนระหว่างอิมัลชัน PCR:
จากนั้น แอมพลิคอนจะอยู่ภายใต้ 454/Roche pyrosequencing ตามโปรโตคอล 454 GS-FLX Titaniumสำหรับการจัดลำดับ Sanger ด้วยตนเอง (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) T7 phage DNA ถูกขยายโดย PCR และจัดลำดับด้วยคู่ไพรเมอร์ต่อไปนี้:
เม็ดมีดจากแผ่นโลหะแต่ละแผ่นได้รับการขยาย PCR โดยใช้ Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (ตามคำแนะนำของผู้ผลิต)ทำการสตาร์ทแบบร้อน (10 นาทีที่ 95 °C) และ 35 รอบการบูสต์ (50 วินาทีที่ 95 °C, 1 นาทีที่ 50 °C และ 1 นาทีที่ 72 °C)
Phage จากห้องสมุด, wild-type phage, phage ที่ได้รับการช่วยเหลือจาก CSF และเลือด หรือแต่ละโคลนถูกขยายใน Escherichia coli BL5615 ในน้ำซุป TB (Sigma Aldrich) หรือในจานขนาด 500 cm2 (Thermo Scientific) เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 37°Cฟาจถูกสกัดออกจากเพลตโดยการล้างเพลตด้วยบัฟเฟอร์ Tris-EDTA (Fluka Analytical) หรือโดยการรวบรวมแผ่นโลหะด้วยปลายปิเปตที่ปราศจากเชื้อPhage ถูกแยกออกจากสิ่งลอยเหนือตะกอนจากการเพาะเลี้ยงหรือบัฟเฟอร์การสกัดด้วยการตกตะกอนของโพลีเอทิลีนไกลคอล (PEG 8000) หนึ่งรอบ (Promega) และแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ Tris-EDTA
ฟาจที่ถูกขยายจะต้องได้รับการกำจัดเอนโดท็อกซิน 2-3 รอบโดยใช้เม็ดบีดสำหรับกำจัดเอนโดทอกซิน (Miltenyi Biotec) ก่อนการฉีดเข้าเส้นเลือดดำ (IV) (500 ไมโครลิตร/สัตว์)ในรอบแรก เฟส 2×1012 ถูกนำมาใช้;ในเฟสที่สอง 2×1010;ในรอบคัดเลือกที่สามและสี่ เฟส 2×109 ต่อสัตว์หนึ่งตัวปริมาณฟาจในน้ำไขสันหลังและตัวอย่างเลือดที่เก็บ ณ เวลาที่ระบุถูกกำหนดโดยการนับคราบจุลินทรีย์ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (คู่มือระบบ T7Select)การคัดเลือกฟาจดำเนินการโดยการฉีดไลบรารีที่บริสุทธิ์เข้าไปในเส้นเลือดดำทางหลอดเลือดดำหรือโดยการฉีดฟาจที่สกัดจาก CSF จากรอบการคัดเลือกครั้งก่อนอีกครั้ง และการเก็บเกี่ยวที่ตามมาถูกดำเนินการที่ 10 นาที 30 นาที 60 นาที 90 นาที 120 นาที 180 นาที และ 240 นาทีตามลำดับ CSF และตัวอย่างเลือดมีการดำเนินการการแพนกล้องในร่างกายทั้งหมดสี่รอบ โดยที่สาขาที่เลือกสองสาขาถูกจัดเก็บแยกจากกันและวิเคราะห์ระหว่างสามรอบแรกของการคัดเลือกส่วนแทรกของฟาจทั้งหมดที่สกัดจาก CSF จากสองรอบแรกของการคัดเลือกอยู่ภายใต้ 454/Roche pyrosequencing ในขณะที่โคลนทั้งหมดที่สกัดจาก CSF จากการคัดเลือกสองรอบสุดท้ายถูกจัดลำดับด้วยตนเองการตรวจเลือดทั้งหมดจากการคัดเลือกรอบแรกยังอยู่ภายใต้ 454/Roche pyrosequencingสำหรับการฉีดฟาจโคลน เฟจที่เลือกถูกขยายใน E. coli (BL5615) บนจานขนาด 500 ซม. 2 ที่ 37°ซ เป็นเวลา 4 ชั่วโมงโคลนที่เลือกเป็นรายบุคคลและจัดลำดับด้วยตนเองได้รับการเผยแพร่ในสื่อ TBหลังจากการสกัดฟาจ การทำให้บริสุทธิ์และการกำจัดเอนโดท็อกซิน (ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น) ฟาจ/สัตว์ขนาด 2×1010 ใน 300 ไมโครลิตร ถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำที่หางหนึ่งเส้น
การประมวลผลล่วงหน้าและการกรองเชิงคุณภาพของข้อมูลลำดับข้อมูล Raw 454/Roche ถูกแปลงจากรูปแบบไบนารีมาตรฐานสตรีมแมป (sff) เป็นรูปแบบ Pearson ที่มนุษย์อ่านได้ (fasta) โดยใช้ซอฟต์แวร์ของผู้จำหน่ายการประมวลผลเพิ่มเติมของลำดับนิวคลีโอไทด์ดำเนินการโดยใช้โปรแกรมและสคริปต์ C ที่เป็นกรรมสิทธิ์ (ชุดซอฟต์แวร์ที่ไม่ได้เผยแพร่) ตามที่อธิบายไว้ด้านล่างการวิเคราะห์ข้อมูลปฐมภูมิประกอบด้วยขั้นตอนการกรองแบบหลายขั้นตอนที่เข้มงวดในการกรองการอ่านที่ไม่มีลำดับ DNA แทรก 12mer ที่ถูกต้อง การอ่านจะถูกจัดแนวตามลำดับเพื่อเริ่มต้นฉลากการจัดตำแหน่งช่วยให้เกิดความไม่สอดคล้องกันได้ถึง 2 ครั้งต่อการจัดตำแหน่ง 31ดังนั้น การอ่านโดยไม่มีแท็กเริ่มต้นและหยุด และการอ่านที่มีการแทรกพื้นหลัง เช่น การจัดตำแหน่งที่เกินจำนวนที่ไม่ตรงกันที่อนุญาต ถูกลบออกจากไลบรารีสำหรับการอ่านค่าที่เหลือ ลำดับดีเอ็นเอ N-mer ที่ขยายจากเครื่องหมายเริ่มต้นและสิ้นสุดก่อนเครื่องหมายหยุดถูกตัดออกจากลำดับการอ่านต้นฉบับและดำเนินการเพิ่มเติม (ต่อไปนี้จะเรียกว่า “ส่วนแทรก”)หลังจากการแปลส่วนแทรก ส่วนหลังจาก codon หยุดแรกที่ปลาย 5 'ของไพรเมอร์จะถูกลบออกจากส่วนแทรกนอกจากนี้ยังลบนิวคลีโอไทด์ที่นำไปสู่โคดอนที่ไม่สมบูรณ์ที่ปลาย 3 ′ของไพรเมอร์ด้วยหากต้องการแยกเม็ดมีดที่มีเฉพาะลำดับพื้นหลัง เม็ดมีดที่แปลที่ขึ้นต้นด้วยรูปแบบกรดอะมิโน “PAG” ก็ถูกลบออกเช่นกันเปปไทด์ที่มีความยาวหลังการแปลของกรดอะมิโนน้อยกว่า 3 ตัวถูกนำออกจากคลังสุดท้าย ลบความซ้ำซ้อนในกลุ่มเม็ดมีดและกำหนดความถี่ของเม็ดมีดที่ไม่ซ้ำกันแต่ละรายการผลลัพธ์ของการวิเคราะห์นี้รวมถึงรายการของลำดับนิวคลีโอไทด์ (ส่วนแทรก) และความถี่ (อ่าน) ของมัน (รูปที่ 1c และ 2 เพิ่มเติม)
จัดกลุ่มการแทรก DNA N-mer ตามความคล้ายคลึงกันของลำดับ: เพื่อขจัดข้อผิดพลาดในการจัดลำดับ 454/Roche ที่เจาะจง (เช่น ปัญหาเกี่ยวกับการจัดลำดับส่วนขยายของโฮโมโพลิเมอร์) และขจัดความซ้ำซ้อนที่มีความสำคัญน้อยกว่า การแทรกลำดับ DNA N-mer ที่กรองไว้ก่อนหน้านี้ (การแทรก) จะถูกจัดเรียงตามความคล้ายคลึงกันการแทรก (อนุญาตให้มีฐานที่ไม่ตรงกันได้สูงสุด 2 ฐาน) โดยใช้อัลกอริธึมวนซ้ำที่กำหนดไว้ดังนี้ การแทรกจะถูกจัดเรียงก่อนตามความถี่ (สูงสุดไปต่ำสุด) และถ้าเหมือนกัน จะเรียงตามความยาวรอง (ยาวที่สุดไปสั้นที่สุด) )ดังนั้น การแทรกที่บ่อยที่สุดและยาวที่สุดจึงกำหนด "กลุ่ม" แรกความถี่กลุ่มถูกตั้งค่าเป็นความถี่คีย์จากนั้น การแทรกแต่ละครั้งที่เหลืออยู่ในรายการที่เรียงลำดับถูกพยายามเพิ่มลงในกลุ่มโดยการจัดตำแหน่ง Needleman-Wunsch แบบจับคู่ถ้าจำนวนของการจับคู่ การแทรก หรือการลบที่ไม่ตรงกันในการจัดตำแหน่งไม่เกินเกณฑ์ 2 การแทรกจะถูกเพิ่มลงในกลุ่ม และความถี่ของกลุ่มโดยรวมจะเพิ่มขึ้นตามความถี่ของการเพิ่มการแทรกส่วนแทรกที่เพิ่มลงในกลุ่มจะถูกทำเครื่องหมายว่าใช้แล้วและไม่รวมอยู่ในการประมวลผลเพิ่มเติมหากไม่สามารถเพิ่มลำดับการแทรกลงในกลุ่มที่มีอยู่แล้ว ลำดับการแทรกจะถูกใช้เพื่อสร้างกลุ่มใหม่ที่มีความถี่การแทรกที่เหมาะสมและทำเครื่องหมายว่าใช้แล้วการวนซ้ำจะสิ้นสุดลงเมื่อแต่ละลำดับการแทรกถูกใช้เพื่อสร้างกลุ่มใหม่หรืออาจรวมอยู่ในกลุ่มที่มีอยู่แล้วในที่สุด เม็ดมีดที่จัดกลุ่มซึ่งประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์จะถูกแปลเป็นลำดับเปปไทด์ (ไลบรารีเปปไทด์) ในที่สุดผลลัพธ์ของการวิเคราะห์นี้คือชุดของการแทรกและความถี่ที่สอดคล้องกันซึ่งประกอบเป็นจำนวนการอ่านที่ต่อเนื่องกัน (รูปที่ 2 เพิ่มเติม)
การสร้างแรงจูงใจ: จากรายการเปปไทด์ที่ไม่ซ้ำกัน ไลบรารีถูกสร้างขึ้นซึ่งประกอบด้วยรูปแบบกรดอะมิโน (aa) ที่เป็นไปได้ทั้งหมดดังที่แสดงด้านล่างแต่ละรูปแบบที่เป็นไปได้ของความยาว 3 ถูกดึงออกมาจากเปปไทด์และรูปแบบผกผันของมันถูกเพิ่มเข้าไปพร้อมกับไลบรารีมาตรฐานทั่วไปที่มีรูปแบบทั้งหมด (ไตรเปปไทด์)ไลบรารี่ของลวดลายซ้ำๆ ถูกจัดลำดับและลบความซ้ำซ้อนออกจากนั้นสำหรับไตรเปปไทด์แต่ละรายการในไลบรารี motif เราตรวจสอบการมีอยู่ของไตรเปปไทด์ในไลบรารีโดยใช้เครื่องมือคำนวณในกรณีนี้ ความถี่ของเปปไทด์ที่มี motif tripeptide ที่พบจะถูกเพิ่มและกำหนดให้กับ motif ในไลบรารี motif ("จำนวน motifs")ผลลัพธ์ของการสร้าง motif คืออาร์เรย์สองมิติที่มีการเกิดขึ้นทั้งหมดของ tripeptides (motifs) และค่าตามลำดับ ซึ่งเป็นจำนวนการอ่านลำดับที่ส่งผลให้เกิด motif ที่สอดคล้องกันเมื่อการอ่านถูกกรอง จัดกลุ่ม และแปลเมตริกตามที่อธิบายในรายละเอียดข้างต้น
การทำให้เป็นมาตรฐานของจำนวน motifs และ scatterplot ที่สอดคล้องกัน: จำนวน motifs สำหรับแต่ละตัวอย่างถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยใช้
โดยที่ ni คือจำนวนการอ่านที่มีหัวข้อ iดังนั้น vi แสดงถึงความถี่เปอร์เซ็นต์ของการอ่าน (หรือเปปไทด์) ที่มี motif i ในตัวอย่างค่า P สำหรับจำนวน motifs ที่ไม่เป็นมาตรฐานคำนวณโดยใช้การทดสอบที่แน่นอนของ Fisherเกี่ยวกับคอร์เรโลแกรมของจำนวนแรงจูงใจ ความสัมพันธ์ของสเปียร์แมนคำนวณโดยใช้จำนวนแรงจูงใจที่ทำให้เป็นมาตรฐานกับอาร์
เพื่อให้เห็นภาพเนื้อหาของกรดอะมิโนในแต่ละตำแหน่งในไลบรารีเปปไทด์ เว็บโลโกแกรม 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) จึงถูกสร้างขึ้นประการแรก ปริมาณกรดอะมิโนในแต่ละตำแหน่งของเปปไทด์ 12 เมอร์จะถูกเก็บไว้ในเมทริกซ์ขนาด 20×12จากนั้น ชุดของเปปไทด์ 1,000 รายการที่มีปริมาณกรดอะมิโนสัมพัทธ์เดียวกันในแต่ละตำแหน่งจะถูกสร้างขึ้นในรูปแบบลำดับฟาสตาและจัดเตรียมเป็นอินพุตให้กับโลโก้เว็บ 3 ซึ่งสร้างการแสดงกราฟิกของปริมาณกรดอะมิโนสัมพัทธ์ในแต่ละตำแหน่งสำหรับไลบรารีเปปไทด์ที่กำหนดเพื่อให้เห็นภาพชุดข้อมูลหลายมิติ แผนที่ความร้อนถูกสร้างขึ้นโดยใช้เครื่องมือที่พัฒนาขึ้นภายในใน R (biosHeatmap ซึ่งเป็นแพ็คเกจ R ที่ยังไม่เปิดตัว)dendrograms ที่แสดงในแผนที่ความร้อนคำนวณโดยใช้วิธีการจัดกลุ่มแบบลำดับชั้นของ Ward ด้วยเมตริกระยะทางแบบยุคลิดสำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติของข้อมูลการให้คะแนนบรรทัดฐาน ค่า P สำหรับการให้คะแนนที่ไม่ปกติถูกคำนวณโดยใช้การทดสอบที่แน่นอนของฟิชเชอร์ค่า P สำหรับชุดข้อมูลอื่นคำนวณใน R โดยใช้ Student's t-test หรือ ANOVA
phage clones ที่เลือกและ phages ที่ไม่มีส่วนแทรกถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำผ่านทางหลอดเลือดดำส่วนหาง (2 × 1010 phages/สัตว์ใน 300 μl PBS)สิบนาทีก่อนการไหลเวียนเลือดและการตรึงที่ตามมา สัตว์ชนิดเดียวกันนี้ถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำด้วยเลคตินที่มีฉลาก DyLight594 ขนาด 100 ไมโครลิตร (Vector Laboratories Inc., DL-1177)60 นาทีหลังการฉีดด้วยฟาจ หนูถูกกระจายผ่านหัวใจด้วย PBS 50 มล. ตามด้วย PFA/PBS 50 มล. 4%ตัวอย่างสมองได้รับการแก้ไขเพิ่มเติมข้ามคืนใน 4% PFA/PBS และแช่ใน 30% ซูโครสค้างคืนที่ 4°Cตัวอย่างถูกแช่แข็งแบบแฟลชในส่วนผสม OCTการวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมีของตัวอย่างแช่แข็งถูกดำเนินการที่อุณหภูมิห้องบนการแช่แข็ง 30 µm ที่บล็อกด้วย 1% BSA และบ่มด้วยโพลีโคลนอล FITC แอนติบอดีต่อ T7 phage (Novus NB 600-376A) ที่ 4 °Cบ่มข้ามคืนสุดท้าย ล้างชิ้นส่วน 3 ครั้งด้วย PBS และตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์เลเซอร์คอนโฟคอล (Leica TCS SP5)
เปปไทด์ทั้งหมดที่มีความบริสุทธิ์ขั้นต่ำ 98% ถูกสังเคราะห์โดย GenScript USA, biotinylated และ lyophilizedไบโอตินถูกจับผ่านทางตัวเว้นระยะทริปเปิลไกลซีนเพิ่มเติมที่ปลาย Nตรวจสอบเปปไทด์ทั้งหมดโดยใช้แมสสเปกโตรเมตรี
Streptavidin (Sigma S0677) ผสมกับเปปไทด์ที่ยับยั้ง biotinylated ที่มากเกินไป 5 เท่า, เปปไทด์ที่ยับยั้ง BACE1 ที่มี biotinylated หรือส่วนผสม (อัตราส่วน 3:1) ของเปปไทด์ที่ยับยั้ง BACE1 ที่ยับยั้ง biotinylated และเปปไทด์ที่ยับยั้ง BACE1 ใน 5–10% DMSO/บ่มใน PBS1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องก่อนฉีดStreptavidin-conjugated peptides ถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำในขนาด 10 มก./กก. เข้าทางหลอดเลือดดำส่วนหางของหนูที่มีโพรงสมอง
ประเมินความเข้มข้นของสเตรปตาวิดิน-เปปไทด์คอมเพล็กซ์โดย ELISAแผ่นไมโครไตเตอร์ Nunc Maxisorp (Sigma) ถูกเคลือบข้ามคืนที่ 4°C ด้วยแอนติบอดีต้านสเตรปตาวิดินของหนูเมาส์ 1.5 ไมโครกรัม/มล. (Thermo, MA1-20011)หลังจากการบล็อก (บัฟเฟอร์การบล็อก: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% เจลาติน, 1% BSA) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ล้างจานด้วย 0.05% Tween-20/PBS (วอชบัฟเฟอร์) เป็นเวลา 3 วินาที น้ำไขสันหลังและตัวอย่างพลาสมาถูกเพิ่มลงในหลุมที่เจือจางด้วยบัฟเฟอร์การปิดกั้น (พลาสมา 1:10,0 00, CSF 1:115).จากนั้น จานถูกบ่มข้ามคืนที่ 4°ซ ด้วยแอนติบอดีตรวจจับ (1 ไมโครกรัม/มล., ต้านสเตรปตาวิดิน-HRP, Novus NB120-7239)หลังจากการซักสามขั้นตอน ตรวจพบสเตรปตาวิดินโดยการบ่มในสารละลายซับสเตรต TMB (โรช) นานถึง 20 นาทีหลังจากหยุดการพัฒนาสีด้วย 1M H2SO4 ให้วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร
การทำงานของคอมเพล็กซ์ตัวยับยั้ง streptavidin-peptide-BACE1 ได้รับการประเมินโดย Aβ(1-40) ELISA ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (Wako, 294-64701)โดยสังเขป ตัวอย่าง CSF ถูกเจือจางในสารเพิ่มปริมาณมาตรฐาน (1:23) และบ่มค้างคืนที่ 4°ซ ในจาน 96 หลุมที่เคลือบด้วยแอนติบอดีดักจับ BNT77หลังจากการล้างห้าขั้นตอน แอนติบอดี BA27 ที่ควบกับ HRP ถูกเติมและบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 4° C ตามด้วยการล้างห้าขั้นตอนตรวจพบ Aβ(1–40) โดยการบ่มในสารละลาย TMB เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องหลังจากหยุดการพัฒนาสีด้วยสารละลายหยุด ให้วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตรตัวอย่างพลาสมาถูกสกัดด้วยเฟสของแข็งก่อน Aβ(1–40) ELISAพลาสมาถูกเติมลงใน 0.2% DEA (Sigma) ในเพลต 96 หลุมและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาทีหลังจากล้างเพลต SPE (Oasis, 186000679) ด้วยน้ำและเมทานอล 100% อย่างต่อเนื่อง ตัวอย่างพลาสมาจะถูกเติมลงในเพลต SPE และนำของเหลวทั้งหมดออกตัวอย่างถูกล้าง (ครั้งแรกด้วย 5% เมทานอล จากนั้น 30% เมทานอล) และชะด้วย 2% NH4OH/90% เมทานอลหลังจากการอบแห้งสารชะที่ 55°C เป็นเวลา 99 นาทีที่กระแส N2 คงที่ ตัวอย่างจะถูกรีดิวซ์ในสารเจือจางมาตรฐานและวัดค่า Aβ(1–40) ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
วิธีอ้างอิงบทความนี้: Urich, E. et al.การส่งสินค้าไปยังสมองโดยใช้เปปไทด์ขนส่งที่ระบุในร่างกายวิทยาศาสตร์.5, 14104;ดอย:10.1038/srep14104 (2558).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB และ Moos T. การนำส่งยาระดับโมเลกุลขนาดใหญ่ไปยังสมองโดยใช้การบำบัดแบบกำหนดเป้าหมายวารสารประสาทเคมี 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)
Brasnjevic, I. , Steinbusch, HW, Schmitz, C. , และ Martinez-Martinez, P. การส่งมอบยาเปปไทด์และโปรตีนข้ามสิ่งกีดขวางเลือดและสมองProg Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)
Pardridge, WM สิ่งกีดขวางระหว่างเลือดและสมอง: คอขวดในการพัฒนายาในสมองNeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG และ Byrd, A. โอกาสสำหรับการส่งมอบยาที่ดีขึ้นและการกำหนดเป้าหมายไปยังสมองผ่านทางทางเดิน choroid plexus-CSFการวิจัยทางเภสัชกรรม 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)
Pardridge, WM การปรับปรุงชีวเภสัชภัณฑ์ให้ทันสมัยด้วยม้าโทรจันระดับโมเลกุลสำหรับการนำส่งสมองBioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008)
Pardridge, WM receptor-mediated peptide ขนส่งข้ามสิ่งกีดขวางเลือดและสมองEndocr Rev. 7, 314–330 (1986)
Niewoehner, J. และคณะเพิ่มการแทรกซึมของสมองและประสิทธิภาพของแอนติบอดีที่ใช้รักษาโรคโดยใช้กระสวยโมเลกุลชนิดโมโนวาเลนต์เซลล์ประสาท 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)
Bien-Lee, N. และคณะการขนส่งทรานเฟอร์รินรีเซพเตอร์ (TfR) กำหนดการดูดซึมของสมองของแวเรียนต์ที่มีสัมพรรคภาพของแอนติบอดี TfRJ Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)