การตรวจสอบความหลากหลายของจุลินทรีย์ในระบบนิเวศชายฝั่งทะเลโดยใช้แนวคิดการตรวจชิ้นเนื้อของเหลว

ขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comเวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)ในระหว่างนี้ เพื่อให้แน่ใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
การตรวจชิ้นเนื้อของเหลว (LB) เป็นแนวคิดที่ได้รับความนิยมอย่างรวดเร็วในด้านชีวการแพทย์แนวคิดนี้มีพื้นฐานมาจากการตรวจจับชิ้นส่วนของ DNA นอกเซลล์ที่หมุนเวียน (ccfDNA) ซึ่งส่วนใหญ่จะถูกปล่อยออกมาเป็นชิ้นส่วนขนาดเล็กหลังจากการตายของเซลล์ในเนื้อเยื่อต่างๆชิ้นส่วนเหล่านี้มีสัดส่วนเล็กน้อยที่มาจากเนื้อเยื่อหรือสิ่งมีชีวิตแปลกปลอมในงานปัจจุบัน เราได้นำแนวคิดนี้ไปใช้กับหอยแมลงภู่ ซึ่งเป็นสายพันธุ์แมวมองที่ขึ้นชื่อเรื่องความสามารถในการกรองน้ำทะเลสูงเราใช้ความสามารถของหอยแมลงภู่ในการทำหน้าที่เป็นตัวกรองตามธรรมชาติในการจับชิ้นส่วน DNA ของสิ่งแวดล้อมจากแหล่งต่างๆ เพื่อให้ข้อมูลเกี่ยวกับความหลากหลายทางชีวภาพของระบบนิเวศทางทะเลชายฝั่งผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า hemolymph ของหอยแมลงภู่มีชิ้นส่วน DNA ที่มีขนาดแตกต่างกันมาก ตั้งแต่ 1 ถึง 5 kbการจัดลำดับปืนลูกซองแสดงให้เห็นว่าชิ้นส่วน DNA จำนวนมากมีต้นกำเนิดจากจุลินทรีย์ต่างประเทศในบรรดาสิ่งเหล่านี้ เราพบชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากแบคทีเรีย อาร์เคีย และไวรัส รวมถึงไวรัสที่ทราบว่าแพร่เชื้อไปยังโฮสต์ต่างๆ ที่พบได้ทั่วไปในระบบนิเวศทางทะเลชายฝั่งโดยสรุป การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าแนวคิดของ LB ที่ใช้กับหอยแมลงภู่แสดงถึงแหล่งความรู้ที่อุดมสมบูรณ์แต่ยังไม่ได้สำรวจเกี่ยวกับความหลากหลายของจุลินทรีย์ในระบบนิเวศชายฝั่งทะเล
ผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศ (CC) ต่อความหลากหลายทางชีวภาพของระบบนิเวศทางทะเลเป็นพื้นที่ของการวิจัยที่เติบโตอย่างรวดเร็วภาวะโลกร้อนไม่เพียงแต่ทำให้เกิดความเครียดทางสรีรวิทยาที่สำคัญเท่านั้น แต่ยังผลักดันขีดจำกัดทางวิวัฒนาการของเสถียรภาพทางความร้อนของสิ่งมีชีวิตในทะเล ส่งผลกระทบต่อที่อยู่อาศัยของสิ่งมีชีวิตหลายชนิด กระตุ้นให้พวกมันค้นหาสภาวะที่เอื้ออำนวยมากขึ้น [1, 2]นอกจากจะส่งผลต่อความหลากหลายทางชีวภาพของเมทาโซอันแล้ว CC ยังรบกวนสมดุลอันละเอียดอ่อนของปฏิสัมพันธ์ระหว่างโฮสต์และจุลินทรีย์อีกด้วยภาวะแบคทีเรียผิดปกติของจุลินทรีย์นี้เป็นภัยคุกคามร้ายแรงต่อระบบนิเวศทางทะเล เนื่องจากทำให้สิ่งมีชีวิตในทะเลมีความไวต่อเชื้อโรคที่ติดเชื้อ [3, 4]เชื่อกันว่า SS มีบทบาทสำคัญในการตายจำนวนมาก ซึ่งเป็นปัญหาร้ายแรงสำหรับการจัดการระบบนิเวศทางทะเลทั่วโลก [5, 6]นี่เป็นประเด็นสำคัญเนื่องจากผลกระทบทางเศรษฐกิจ ระบบนิเวศ และโภชนาการของสัตว์ทะเลหลายชนิดโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับหอยสองฝาที่อาศัยอยู่ในบริเวณขั้วโลก ซึ่งผลกระทบของ CK จะเกิดขึ้นทันทีและรุนแรงกว่า [6, 7]ในความเป็นจริง หอยสองฝาเช่น Mytilus spp.มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการตรวจสอบผลกระทบของ CC ต่อระบบนิเวศทางทะเลไม่น่าแปลกใจที่มีการพัฒนาตัวบ่งชี้ทางชีวภาพจำนวนมากเพื่อติดตามสุขภาพของพวกเขา โดยมักจะใช้วิธีแบบสองชั้นที่เกี่ยวข้องกับตัวบ่งชี้ทางชีวภาพเชิงหน้าที่ตามกิจกรรมของเอนไซม์หรือการทำงานของเซลล์ เช่น ความมีชีวิตของเซลล์และกิจกรรมฟาโกไซติก [8]วิธีการเหล่านี้รวมถึงการวัดความเข้มข้นของตัวบ่งชี้ความดันเฉพาะที่สะสมในเนื้อเยื่ออ่อนหลังจากการดูดซับน้ำทะเลจำนวนมากอย่างไรก็ตาม ความสามารถในการกรองสูงและระบบไหลเวียนเลือดแบบกึ่งเปิดของหอยสองฝาเปิดโอกาสให้พัฒนาตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของเม็ดเลือดใหม่โดยใช้แนวคิดของการตรวจชิ้นเนื้อของเหลว (LB) ซึ่งเป็นวิธีการที่ง่ายและมีการบุกรุกน้อยที่สุดในการจัดการผู้ป่วยตัวอย่างเลือด [9, 10].แม้ว่าจะพบโมเลกุลหมุนเวียนหลายประเภทใน LB ของมนุษย์ แต่แนวคิดนี้อิงจากการวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอของชิ้นส่วน DNA นอกเซลล์ที่หมุนเวียน (ccfDNA) ในพลาสมาเป็นหลักอันที่จริง การมีอยู่ของ DNA ที่หมุนเวียนในพลาสมาของมนุษย์นั้นเป็นที่รู้จักตั้งแต่กลางศตวรรษที่ 20 [11] แต่ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมานี้ การถือกำเนิดของวิธีการหาลำดับปริมาณงานสูงได้นำไปสู่การวินิจฉัยทางคลินิกโดยใช้ ccfDNAการปรากฏตัวของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่หมุนเวียนเหล่านี้มีสาเหตุส่วนหนึ่งมาจากการปลดปล่อยจีโนมดีเอ็นเอ (นิวเคลียร์และไมโทคอนเดรีย) แบบพาสซีฟหลังจากการตายของเซลล์ ในบุคคลที่มีสุขภาพปกติ ความเข้มข้นของ ccfDNA จะต่ำ (<10 ng/mL) แต่สามารถเพิ่มขึ้นได้ 5-10 เท่าในผู้ป่วยที่มีโรคต่างๆ หรือมีความเครียด ซึ่งส่งผลให้เนื้อเยื่อถูกทำลาย ในบุคคลที่มีสุขภาพปกติ ความเข้มข้นของ ccfDNA จะต่ำ (<10 ng/mL) แต่สามารถเพิ่มขึ้นได้ 5-10 เท่าในผู้ป่วยที่มีโรคต่างๆ หรือมีความเครียด ซึ่งส่งผลให้เนื้อเยื่อถูกทำลาย У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. ในคนที่มีสุขภาพปกติ ความเข้มข้นของ cccDNA จะต่ำ (<10 ng/mL) แต่สามารถเพิ่มขึ้นได้ 5-10 เท่าในผู้ป่วยที่มีโรคต่างๆ หรืออยู่ภายใต้ความเครียดที่นำไปสู่การทำลายเนื้อเยื่อ在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低(<10 ng/mL),但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍,从而导致组织损伤。在 健康 个体中, ccfdna 的 浓度 较 低 ((<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中 可 增加 5-10倍,从而组织。。。Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с различн ыми патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ความเข้มข้นของ ccfDNA มักจะต่ำ (<10 ng/ml) ในบุคคลที่มีสุขภาพดี แต่สามารถเพิ่มได้ 5-10 เท่าในผู้ป่วยที่มีโรคหรือความเครียดต่างๆ ซึ่งส่งผลให้เนื้อเยื่อถูกทำลายขนาดของชิ้นส่วน ccfDNA นั้นแตกต่างกันไปอย่างมาก แต่โดยทั่วไปแล้วจะมีขนาดตั้งแต่ 150 ถึง 200 bp[12].การวิเคราะห์ ccfDNA ที่ได้มาจากตัวเอง เช่น ccfDNA จากเซลล์เจ้าบ้านปกติหรือเซลล์ที่ถูกเปลี่ยนรูป สามารถใช้เพื่อตรวจหาการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมและ epigenetic ที่มีอยู่ในจีโนมนิวเคลียร์และ/หรือไมโทคอนเดรีย ซึ่งช่วยให้แพทย์เลือกวิธีการรักษาที่กำหนดเป้าหมายระดับโมเลกุลโดยเฉพาะ [13]อย่างไรก็ตาม ccfDNA สามารถหาได้จากแหล่งต่างประเทศ เช่น ccfDNA จากเซลล์ของทารกในครรภ์ระหว่างตั้งครรภ์หรือจากอวัยวะที่ปลูกถ่าย [14,15,16,17]ccfDNA ยังเป็นแหล่งข้อมูลสำคัญในการตรวจหาการมีอยู่ของกรดนิวคลีอิกของสารที่ติดเชื้อ (ต่างประเทศ) ซึ่งช่วยให้สามารถตรวจหาเชื้อที่แพร่กระจายอย่างกว้างขวางโดยไม่รุกล้ำซึ่งไม่ได้ระบุโดยการเพาะเชื้อในเลือด หลีกเลี่ยงการตรวจชิ้นเนื้อของเนื้อเยื่อที่ติดเชื้อ [18]การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้แสดงให้เห็นว่าเลือดของมนุษย์มีแหล่งข้อมูลมากมายที่สามารถใช้ในการระบุไวรัสและแบคทีเรียที่ก่อโรคได้ และประมาณ 1% ของ ccfDNA ที่พบในพลาสมาของมนุษย์มีแหล่งกำเนิดจากต่างประเทศ [19]การศึกษาเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าความหลากหลายทางชีวภาพของไมโครไบโอมหมุนเวียนของสิ่งมีชีวิตสามารถประเมินได้โดยใช้การวิเคราะห์ ccfDNAอย่างไรก็ตาม จนกระทั่งเมื่อไม่นานมานี้ แนวคิดนี้ถูกใช้เฉพาะในมนุษย์และในสัตว์มีกระดูกสันหลังอื่นๆ ในระดับที่น้อยกว่า [20, 21]
ในบทความนี้ เราใช้ศักยภาพของ LB ในการวิเคราะห์ ccfDNA ของ Aulacomya atra ซึ่งเป็นสายพันธุ์ทางตอนใต้ที่พบได้ทั่วไปในหมู่เกาะ Kerguelen ใต้ทะเล ซึ่งเป็นกลุ่มเกาะบนที่ราบสูงขนาดใหญ่ที่ก่อตัวขึ้นเมื่อ 35 ล้านปีก่อนภูเขาไฟระเบิด.จากการใช้ระบบทดลองในหลอดทดลอง เราพบว่าชิ้นส่วนดีเอ็นเอในน้ำทะเลถูกหอยแมลงภู่ดึงขึ้นไปอย่างรวดเร็วและเข้าสู่ช่องเก็บน้ำเหลืองการจัดลำดับปืนลูกซองแสดงให้เห็นว่า ccfDNA ของหอยแมลงภู่มีชิ้นส่วน DNA ที่มาจากตัวเองและไม่ใช่ตัวเอง รวมถึงแบคทีเรียที่อยู่ร่วมกันและชิ้นส่วน DNA จาก biomes ทั่วไปของระบบนิเวศชายฝั่งทะเลภูเขาไฟเย็นHemolymph ccfDNA ยังมีลำดับของไวรัสที่ได้มาจากไวรัสที่มีช่วงโฮสต์ต่างกันนอกจากนี้เรายังพบชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากสัตว์หลายเซลล์ เช่น ปลากระดูกอ่อน ดอกไม้ทะเล สาหร่าย และแมลงโดยสรุป การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าแนวคิด LB สามารถนำไปใช้กับสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังในทะเลได้สำเร็จ เพื่อสร้างรายการจีโนมที่หลากหลายในระบบนิเวศทางทะเล
ผู้ใหญ่ (ยาว 55-70 มม.) Mytilus platensis (M. platensis) และ Aulacomya atra (A. atra) ถูกรวบรวมจากชายฝั่งหินน้ำขึ้นน้ำลงของ Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .)หมู่เกาะ Kerguelen ในเดือนธันวาคม 2018 หอยแมลงภู่ตัวเต็มวัยอื่นๆ (Mytilus spp.) ได้มาจากซัพพลายเออร์เชิงพาณิชย์ (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) และวางไว้ในถังเติมอากาศควบคุมอุณหภูมิ (4°C) ที่บรรจุน้ำเกลือเทียม 32‰ 10–20 ลิตร(เกลือทะเลเทียม Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA)สำหรับการทดลองแต่ละครั้ง วัดความยาวและน้ำหนักของกระสุนแต่ละนัด
โปรโตคอลการเข้าถึงแบบเปิดฟรีสำหรับโปรแกรมนี้มีให้ทางออนไลน์ (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)โดยสังเขป LB hemolymph ถูกรวบรวมจากกล้ามเนื้อ abductor ตามที่อธิบายไว้ [22]ฮีโมลิมฟ์ถูกทำให้ใสโดยการปั่นแยกที่ 1200×g เป็นเวลา 3 นาที ส่วนเหนือตะกอนถูกแช่แข็ง (-20°C) จนกระทั่งใช้งานสำหรับการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของ cfDNA ตัวอย่าง (1.5-2.0 มล.) ถูกละลายและดำเนินการโดยใช้ชุด NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตccfDNA ถูกเก็บไว้ที่ -80°C จนกว่าจะมีการวิเคราะห์เพิ่มเติมในการทดลองบางอย่าง ccfDNA ถูกแยกและทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, โทรอนโต, ออนแทรีโอ, แคนาดา)DNA บริสุทธิ์ถูกวัดปริมาณโดยใช้ PicoGreen assay มาตรฐานการกระจายชิ้นส่วนของ ccfDNA ที่แยกได้นั้นวิเคราะห์โดยคาพิลลารีอิเล็กโตรโฟรีซิสโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ทางชีวภาพ Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., ซานตาคลารา, แคลิฟอร์เนีย) โดยใช้ชุดตรวจดีเอ็นเอความไวสูงการทดสอบดำเนินการโดยใช้ตัวอย่าง ccfDNA 1 µl ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
สำหรับการหาลำดับของชิ้นส่วน hemolymph ccfDNA Génome Québec (มอนทรีออล ควิเบก แคนาดา) ได้เตรียมคลังปืนลูกซองโดยใช้ชุด Illumina DNA Mix ของชุด Illumina MiSeq PE75ใช้อะแดปเตอร์มาตรฐาน (BioO)ไฟล์ข้อมูลดิบมีอยู่ใน NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 และ SRR8924809)คุณภาพการอ่านขั้นพื้นฐานได้รับการประเมินโดยใช้ FastQC [23]มีการใช้ Trimmomatic [24] สำหรับการตัดอะแดปเตอร์และการอ่านที่มีคุณภาพต่ำการอ่าน Shotgun ที่มีปลายคู่ถูกรวมเข้าด้วยกันเป็นการอ่านเดี่ยวที่ยาวขึ้นโดยมีความเหลื่อมกันขั้นต่ำ 20 bp เพื่อหลีกเลี่ยงความไม่ตรงกัน [25] การอ่านที่ผสานได้รับคำอธิบายประกอบด้วย BLASTN โดยใช้ฐานข้อมูล NCBI Taxonomy แบบ bivalve (ค่า e < 1e−3 และ 90% homology) และการปิดบังลำดับที่มีความซับซ้อนต่ำได้ดำเนินการโดยใช้ DUST [26] การอ่านที่ผสานได้รับคำอธิบายประกอบด้วย BLASTN โดยใช้ฐานข้อมูล NCBI Taxonomy แบบ bivalve (ค่า e < 1e−3 และ 90% homology) และการปิดบังลำดับที่มีความซับซ้อนต่ำได้ดำเนินการโดยใช้ DUST [26] Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 และ 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26] . การอ่านแบบรวมได้รับคำอธิบายประกอบด้วย BLASTN โดยใช้ฐานข้อมูลอนุกรมวิธานของ NCBI bivalve (ค่า e < 1e-3 และ 90% ความคล้ายคลึงกัน) และการปิดบังลำดับความซับซ้อนต่ำดำเนินการโดยใช้ DUST [26]使用双壳类NCBI 分类数据库(e 值< 1e-3 和90% 同源性)用BLASTN 注释合并的读数,并使用DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 ((<1e-3 和 90% 同源) 用 用 注释 合并 读数, 并 使用 ฝุ่น [26] 进行 复杂度序列的。。。。Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюск ов NCBI (значение e <1e-3 และ 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием ฝุ่น [26]. การอ่านแบบรวมได้รับคำอธิบายประกอบด้วย BLASTN โดยใช้ฐานข้อมูลอนุกรมวิธานของ NCBI bivalve (ค่า e <1e-3 และ 90% ความคล้ายคลึงกัน) และการปิดบังลำดับความซับซ้อนต่ำดำเนินการโดยใช้ DUST [26]การอ่านแบ่งออกเป็นสองกลุ่ม: เกี่ยวข้องกับลำดับของหอยสองฝา (ในที่นี้เรียกว่าอ่านเอง) และไม่เกี่ยวข้องกัน (ไม่อ่านเอง)สองกลุ่มแยกกันโดยใช้ MEGAHIT เพื่อสร้าง contigs [27]ในขณะเดียวกัน การกระจายอนุกรมวิธานของการอ่าน microbiome ของมนุษย์ต่างดาวถูกจัดประเภทโดยใช้ Kraken2 [28] และแสดงกราฟิกด้วยแผนภูมิวงกลม Krona บน Galaxy [29, 30]kmers ที่เหมาะสมถูกกำหนดให้เป็น kmers-59 จากการทดลองเบื้องต้นของเรา จากนั้นระบุตัวตนด้วยตนเองโดยการจัดแนวกับ BLASTN (ฐานข้อมูล NCBI สองวาล์ว, ค่า e < 1e−10 และ 60% คล้ายคลึงกัน) สำหรับคำอธิบายประกอบขั้นสุดท้าย จากนั้นระบุตัวตนด้วยตนเองโดยการจัดแนวกับ BLASTN (ฐานข้อมูล NCBI สองวาล์ว, ค่า e < 1e−10 และ 60% คล้ายคลึงกัน) สำหรับคำอธิบายประกอบขั้นสุดท้าย Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, знач ение e <1e-10 และ гомология 60%) для окончательной аннотации. จากนั้นระบุตัวตนที่ติดกันโดยจับคู่กับ BLASTN (ฐานข้อมูล NCBI bivalve, ค่า e <1e-10 และ 60% ที่คล้ายคลึงกัน) สำหรับคำอธิบายประกอบขั้นสุดท้าย然后通过与BLASTN(双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性)对齐来识别自身重叠群以进行最终注释然后通过与BLASTN(双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI д ля двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 และ гомология 60%). จากนั้นระบุตัวตนที่เชื่อมโยงกันสำหรับคำอธิบายประกอบขั้นสุดท้ายโดยจับคู่กับ BLASTN (ฐานข้อมูล NCBI bivalve, ค่า e <1e-10 และ 60% ความคล้ายคลึงกัน) ในแบบคู่ขนาน contigs กลุ่ม nonself ถูกใส่คำอธิบายประกอบด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล nt NCBI, ค่า e < 1e−10 และ 60% ความคล้ายคลึงกัน) ในแบบคู่ขนาน contigs กลุ่ม nonself ถูกใส่คำอธิบายประกอบด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล nt NCBI, ค่า e < 1e−10 และ 60% ความคล้ายคลึงกัน) Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 และ гомология 6 0%). ในแบบคู่ขนาน contigs กลุ่มต่างประเทศถูกเพิ่มความคิดเห็นด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล NT NCBI, ค่า e <1e-10 และ 60% ความคล้ายคลึงกัน)平行地,用BLASTN(nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性)注释非自身组重叠群。平行地,用BLASTN(nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性)注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1 e-10 และ гомология 60%). ในแบบคู่ขนาน contigs กลุ่มที่ไม่ใช่ตัวเองถูกเพิ่มความคิดเห็นด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล nt NCBI, ค่า e <1e-10 และ 60% ความคล้ายคลึงกัน) BLASTX ยังดำเนินการใน contigs ที่ไม่ใช่ตัวเองโดยใช้ฐานข้อมูล NCBI โปรตีน nr และ RefSeq (ค่า e < 1e−10 และ 60% ความคล้ายคลึงกัน) BLASTX ยังดำเนินการใน contigs ที่ไม่ใช่ตัวเองโดยใช้ฐานข้อมูล NCBI โปรตีน nr และ RefSeq (ค่า e < 1e−10 และ 60% ความคล้ายคลึงกัน) BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 และ гомоло เงิน 60%). BLASTX ยังดำเนินการบน contigs ที่ไม่ใช่ตัวเองโดยใช้ฐานข้อมูลโปรตีน nr และ RefSeq NCBI (ค่า e < 1e-10 และ 60% ความคล้ายคลึงกัน)还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 和60% 同源性)。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 和60% 同源性)。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 และ гомология 60%). BLASTX ยังดำเนินการบน contigs ที่ไม่ใช่ตัวเองโดยใช้ฐานข้อมูลโปรตีน nr และ RefSeq NCBI (ค่า e <1e-10 และ 60% ความคล้ายคลึงกัน)พูล BLASTN และ BLASTX ของ non-self-contigs เป็นตัวแทนของ contigs สุดท้าย (ดูไฟล์เสริม)
ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ PCR แสดงอยู่ในตาราง S1Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) ถูกนำมาใช้เพื่อขยายยีนเป้าหมาย ccfDNAเงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยาต่อไปนี้ถูกนำมาใช้: การสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 95°C เป็นเวลา 3 นาที, 95°C เป็นเวลา 1 นาที, ตั้งอุณหภูมิการหลอมเป็นเวลา 1 นาที, การยืดตัวที่ 72°C เป็นเวลา 1 นาที, 35 รอบ และสุดท้ายที่ 72°C ภายใน 10 นาที.ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกแยกออกโดยอิเล็กโตรโฟรีซิสในเจลอะกาโรส (1.5%) ที่มี SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ที่ 95 V
หอยแมลงภู่ (Mytilus spp.) ถูกปรับสภาพในน้ำทะเลที่มีออกซิเจน 500 มล. (32 PSU) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 4°Cพลาสมิดดีเอ็นเอที่มีการแทรกซึ่งเข้ารหัสลำดับ galectin-7 cDNA ของมนุษย์ (หมายเลขทะเบียน NCBI L07769) ถูกเติมลงในขวดที่ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 190 ไมโครกรัม/ไมโครลิตรหอยแมลงภู่ที่บ่มภายใต้เงื่อนไขเดียวกันโดยไม่มีการเติมดีเอ็นเอเป็นตัวควบคุมถังควบคุมที่สามบรรจุ DNA ที่ไม่มีหอยแมลงภู่ในการตรวจสอบคุณภาพของ DNA ในน้ำทะเล ตัวอย่างน้ำทะเล (20 ไมโครลิตร; การทำซ้ำสามครั้ง) ถูกนำมาจากแต่ละถังตามเวลาที่กำหนดสำหรับการตรวจสอบย้อนกลับของพลาสมิดดีเอ็นเอ หอยแมลงภู่ LB ถูกเก็บเกี่ยวตามเวลาที่กำหนดและวิเคราะห์โดย qPCR และ ddPCRเนื่องจากน้ำทะเลมีปริมาณเกลือสูง จึงมีการเจือจางส่วนลงตัวในน้ำที่มีคุณภาพ PCR (1:10) ก่อนการตรวจวิเคราะห์ PCR ทั้งหมด
Digital droplet PCR (ddPCR) ดำเนินการโดยใช้โปรโตคอล BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada)ใช้โปรไฟล์อุณหภูมิเพื่อกำหนดอุณหภูมิที่เหมาะสม (ตาราง S1)การหยดถูกสร้างขึ้นโดยใช้เครื่องกำเนิดการหยด QX200 (BioRad)ddPCR ถูกดำเนินการดังต่อไปนี้: 95°C เป็นเวลา 5 นาที, 50 รอบที่ 95°C เป็นเวลา 30 วินาที และอุณหภูมิการหลอมที่กำหนดเป็นเวลา 1 นาที และ 72°C เป็นเวลา 30 วินาที, 4°C เป็นเวลา 5 นาที และ 90°C ภายใน 5 นาทีวัดจำนวนหยดและปฏิกิริยาเชิงบวก (จำนวนสำเนา/ไมโครลิตร) โดยใช้เครื่องอ่านหยด QX200 (BioRad)ตัวอย่างที่มีหยดน้อยกว่า 10,000 ถูกปฏิเสธการควบคุมรูปแบบไม่ได้ดำเนินการทุกครั้งที่เรียกใช้ ddPCR
qPCR ดำเนินการโดยใช้ Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, ซิดนีย์, ออสเตรเลีย) และไพรเมอร์เฉพาะ LGALS7PCR เชิงปริมาณทั้งหมดดำเนินการใน 20 µl โดยใช้ QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN)qPCR เริ่มต้นด้วยการบ่ม 15 นาทีที่ 95°C ตามด้วย 40 รอบที่ 95°C เป็นเวลา 10 วินาที และที่ 60°C เป็นเวลา 60 วินาทีด้วยการรวบรวมข้อมูลหนึ่งครั้งเส้นโค้งการหลอมละลายถูกสร้างขึ้นโดยใช้การวัดต่อเนื่องที่ 95°C เป็นเวลา 5 วินาที, 65°C เป็นเวลา 60 วินาที และ 97°C ที่ส่วนท้ายของ qPCRqPCR แต่ละรายการดำเนินการเพิ่มขึ้นสามเท่า ยกเว้นตัวอย่างควบคุม
เนื่องจากหอยแมลงภู่ขึ้นชื่อว่ามีอัตราการกรองสูง เราจึงทำการตรวจสอบก่อนว่าหอยแมลงภู่สามารถกรองและเก็บชิ้นส่วน DNA ที่อยู่ในน้ำทะเลได้หรือไม่นอกจากนี้เรายังสนใจด้วยว่าชิ้นส่วนเหล่านี้สะสมอยู่ในระบบน้ำเหลืองกึ่งเปิดหรือไม่เราแก้ไขปัญหานี้ด้วยการทดลองโดยการติดตามชะตากรรมของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ละลายน้ำได้ซึ่งเติมลงในถังหอยแมลงภู่สีน้ำเงินเพื่ออำนวยความสะดวกในการติดตามชิ้นส่วน DNA เราใช้พลาสมิด DNA ต่างประเทศ (ไม่ใช่ตัวเอง) ที่มียีน galectin-7 ของมนุษย์ddPCR ติดตามชิ้นส่วน DNA ของพลาสมิดในน้ำทะเลและหอยแมลงภู่ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าหากปริมาณของชิ้นส่วน DNA ในน้ำทะเลยังคงค่อนข้างคงที่เมื่อเวลาผ่านไป (ไม่เกิน 7 วัน) โดยไม่มีหอยแมลงภู่ ระดับนี้จะหายไปเกือบหมดภายใน 8 ชั่วโมง (รูปที่ 1a,b)ตรวจพบชิ้นส่วนของ DNA ภายนอกได้ง่ายภายใน 15 นาทีในของเหลวในช่องปากและ hemolymph (รูปที่ 1c)ชิ้นส่วนเหล่านี้ยังคงสามารถตรวจจับได้จนถึง 4 ชั่วโมงหลังการสัมผัสกิจกรรมการกรองในส่วนที่เกี่ยวข้องกับชิ้นส่วน DNA เทียบได้กับกิจกรรมการกรองของแบคทีเรียและสาหร่าย [31]ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าหอยแมลงภู่สามารถกรองและสะสม DNA แปลกปลอมในช่องของเหลวได้
ความเข้มข้นสัมพัทธ์ของพลาสมิด DNA ในน้ำทะเลที่มี (A) หรือไม่มี (B) ของหอยแมลงภู่ วัดโดย ddPCRใน A ผลลัพธ์จะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ โดยมีเส้นขอบของกล่องแทนเปอร์เซ็นไทล์ที่ 75 และ 25เส้นโค้งลอการิทึมพอดีจะแสดงเป็นสีแดง และพื้นที่สีเทาแสดงถึงช่วงความเชื่อมั่น 95%ใน B เส้นสีแดงแสดงถึงค่าเฉลี่ยและเส้นสีน้ำเงินแสดงถึงช่วงความเชื่อมั่น 95% สำหรับความเข้มข้นC การสะสมของพลาสมิดดีเอ็นเอในเม็ดเลือดแดงและของเหลวในลิ้นของหอยแมลงภู่ในเวลาต่างๆ หลังจากเติมพลาสมิดดีเอ็นเอผลลัพธ์แสดงเป็นสำเนาสมบูรณ์ที่ตรวจพบ/มล. (±SE)
ต่อไป เราตรวจสอบที่มาของ ccfDNA ในหอยแมลงภู่ที่เก็บจากเตียงหอยแมลงภู่บนเกาะ Kerguelen ซึ่งเป็นหมู่เกาะห่างไกลที่มีอิทธิพลต่อมนุษย์อย่างจำกัดเพื่อจุดประสงค์นี้ cccDNA จาก hemolymphs ของหอยแมลงภู่ถูกแยกและทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธีที่ใช้ทั่วไปในการทำให้บริสุทธิ์ cccDNA ของมนุษย์ [32, 33]เราพบว่าความเข้มข้นของ hemolymph ccfDNA เฉลี่ยในหอยแมลงภู่นั้นอยู่ในช่วง micrograms ต่ำต่อ ml hemolymph (ดูตารางที่ S2 ข้อมูลเพิ่มเติม)ช่วงของความเข้มข้นนี้มากกว่าในคนที่มีสุขภาพดีมาก (นาโนกรัมต่ำต่อมิลลิลิตร) แต่ในบางกรณีที่พบไม่บ่อย ในผู้ป่วยมะเร็ง ระดับของ ccfDNA อาจสูงถึงหลายไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร [34, 35]การวิเคราะห์การกระจายขนาดของ hemolymph ccfDNA แสดงให้เห็นว่าชิ้นส่วนเหล่านี้มีขนาดแตกต่างกันอย่างมาก ตั้งแต่ 1,000 bp ถึง 1,000 bpมากถึง 5,000 bp (รูปที่ 2)ผลลัพธ์ที่คล้ายกันได้รับโดยใช้ชุดตรวจสอบ QIAamp Investigator ที่ใช้ซิลิกา ซึ่งเป็นวิธีการที่ใช้กันทั่วไปในนิติวิทยาศาสตร์เพื่อแยกและทำให้ DNA จีโนมบริสุทธิ์อย่างรวดเร็วจากตัวอย่าง DNA ความเข้มข้นต่ำ รวมถึง ccfDNA [36]
อิเล็กโทรโฟเรแกรม ccfDNA ของหอยแมลงภู่สกัดด้วย NucleoSnap Plasma Kit (บนสุด) และ QIAamp DNA Investigator Kitแผนผังไวโอลิน B แสดงการกระจายของความเข้มข้นของ hemolymph ccfDNA (±SE) ในหอยแมลงภู่เส้นสีดำและสีแดงแสดงถึงค่ามัธยฐานและควอไทล์ที่หนึ่งและสามตามลำดับ
ประมาณ 1% ของ ccfDNA ในมนุษย์และไพรเมตมีแหล่งที่มาจากต่างประเทศ [21, 37]จากระบบไหลเวียนเลือดแบบกึ่งเปิดของหอยสองฝา น้ำทะเลที่อุดมด้วยจุลินทรีย์ และการกระจายขนาดของหอยแมลงภู่ ccfDNA เราตั้งสมมติฐานว่า hemolymph ของหอยแมลงภู่ ccfDNA อาจมีกลุ่ม DNA ของจุลินทรีย์ที่อุดมสมบูรณ์และหลากหลายเพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ เราจัดลำดับ hemolymph ccfDNA จากตัวอย่าง Aulacomya atra ที่รวบรวมจากหมู่เกาะ Kerguelen ซึ่งให้ผลการอ่านมากกว่า 10 ล้านครั้ง โดย 97.6% ผ่านการควบคุมคุณภาพจากนั้นการอ่านจะถูกจำแนกตามแหล่งที่มาของตนเองและไม่ใช่ตนเองโดยใช้ฐานข้อมูล BLASTN และ NCBI bivalve (รูปที่ S1, ข้อมูลเพิ่มเติม)
ในมนุษย์ ทั้งนิวเคลียสและไมโตคอนเดรีย DNA สามารถถูกปล่อยเข้าสู่กระแสเลือดได้ [38]อย่างไรก็ตาม ในการศึกษาปัจจุบัน ไม่สามารถอธิบายรายละเอียดเกี่ยวกับ DNA จีโนมนิวเคลียร์ของหอยแมลงภู่ได้ เนื่องจากจีโนม A. atra ยังไม่ได้รับการจัดลำดับหรืออธิบายอย่างไรก็ตาม เราสามารถระบุชิ้นส่วน ccfDNA จำนวนหนึ่งจากแหล่งกำเนิดของเราได้โดยใช้ไลบรารี bivalve (รูปที่ S2, ข้อมูลเพิ่มเติม)นอกจากนี้เรายังยืนยันการมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA จากแหล่งกำเนิดของเราโดยการขยาย PCR โดยตรงของยีน A. atra เหล่านั้นที่ถูกจัดลำดับ (รูปที่ 3)ในทำนองเดียวกัน เนื่องจากจีโนมไมโทคอนเดรียของ A. atra มีอยู่ในฐานข้อมูลสาธารณะ เราสามารถหาหลักฐานสำหรับการมีอยู่ของชิ้นส่วนไมโทคอนเดรีย ccfDNA ในเม็ดเลือดแดงของ A. atraการมีอยู่ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอของไมโทคอนเดรียได้รับการยืนยันโดยการขยาย PCR (รูปที่ 3)
ยีนไมโทคอนเดรียหลายตัวมีอยู่ในฮีโมลิมฟ์ของ A. atra (จุดสีแดง – หมายเลขสต็อก: SRX5705969) และ M. platensis (จุดสีน้ำเงิน – หมายเลขสต็อก: SRX5705968) ขยายโดย PCRรูปที่ดัดแปลงจาก Breton et al., 2011 B การขยายของ hemolymph supernatant จาก A. atra เก็บไว้ในกระดาษ FTAใช้เจาะ 3 มม. เพื่อเพิ่มโดยตรงกับท่อ PCR ที่มี PCR ผสม
เมื่อพิจารณาจากปริมาณจุลินทรีย์ที่มีอยู่มากมายในน้ำทะเล เริ่มแรกเรามุ่งเน้นไปที่ลักษณะเฉพาะของลำดับดีเอ็นเอของจุลินทรีย์ในเม็ดเลือดแดงในการทำเช่นนี้ เราใช้สองกลยุทธ์ที่แตกต่างกันกลยุทธ์แรกใช้ Kraken2 ซึ่งเป็นโปรแกรมการจำแนกลำดับตามอัลกอริทึมที่สามารถระบุลำดับของจุลินทรีย์ด้วยความแม่นยำเทียบเท่ากับ BLAST และเครื่องมืออื่นๆ [28]การอ่านมากกว่า 6719 รายการได้รับการพิจารณาว่ามีต้นกำเนิดจากแบคทีเรีย ในขณะที่ 124 และ 64 รายการมาจากอาร์เคียและไวรัสตามลำดับ (รูปที่ 4)ชิ้นส่วนดีเอ็นเอของแบคทีเรียที่มีมากที่สุด ได้แก่ Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) และ Bacteroidetes (17%) (รูปที่ 4a)การกระจายนี้สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้าของ microbiome หอยแมลงภู่สีน้ำเงินในทะเล [39, 40]Gammaproteobacteria เป็นคลาสหลักของ Proteobacteria (44%) รวมถึง Vibrionales จำนวนมาก (รูปที่ 4b)วิธี ddPCR ยืนยันการมีอยู่ของชิ้นส่วน Vibrio DNA ใน ccfDNA ของ A. atra hemolymph (รูปที่ 4c) [41]ในการรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับต้นกำเนิดแบคทีเรียของ ccfDNA ได้มีการใช้วิธีเพิ่มเติม (รูปที่ S2, ข้อมูลเพิ่มเติม) ในกรณีนี้ การอ่านที่ทับซ้อนกันถูกรวบรวมเป็นการอ่านแบบคู่และถูกจำแนกเป็นของตนเอง (หอยสองฝา) หรือแหล่งกำเนิดที่ไม่ใช่ตัวเองโดยใช้ BLASTN และค่า e ที่ 1e−3 และจุดตัดที่มีความคล้ายคลึงกัน >90% ในกรณีนี้ การอ่านที่ทับซ้อนกันถูกรวบรวมเป็นการอ่านแบบคู่และถูกจำแนกเป็นของตนเอง (หอยสองฝา) หรือแหล่งกำเนิดที่ไม่ใช่ตัวเองโดยใช้ BLASTN และค่า e ที่ 1e−3 และจุดตัดที่มีความคล้ายคลึงกัน >90% втомслаеерекрывающиесячтенияисобраныкакчтенияสอบ створчатыемолски) ичиеороисхожениюเช่า 9e-3 ในกรณีนี้ การอ่านที่ทับซ้อนกันถูกรวบรวมเป็นการอ่านแบบจับคู่และถูกจัดประเภทเป็นแบบเนทีฟ (หอยสองฝา) หรือไม่ใช่ต้นฉบับโดยใช้ BLASTN และค่า e ของ 1e-3 และจุดตัดที่มีความคล้ายคลึงกัน >90%在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身(双壳类)或非自身来源。在这种情况下,重叠读数组装为配末端读数,使用使用 blastn和 1e-3 的值和> 90%同源性的分类自身(双壳类)非自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (дв) устворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN และ 1e-3 и порога гомологии> 90%. ในกรณีนี้ การอ่านที่ทับซ้อนกันถูกรวบรวมเป็นการอ่านแบบจับคู่และจำแนกเป็นของตนเอง (หอยสองฝา) หรือไม่ใช่ต้นฉบับโดยใช้ค่า e BLASTN และ 1e-3 และเกณฑ์ความคล้ายคลึงกัน >90%เนื่องจากจีโนม A. atra ยังไม่ได้รับการจัดลำดับ เราจึงใช้กลยุทธ์การประกอบ de novo ของแอสเซมเบลอร์ MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS)มีการระบุ contigs ทั้งหมด 147,188 รายการว่าขึ้นอยู่กับแหล่งกำเนิด (bivalves)Contigs เหล่านี้ถูกระเบิดด้วย e-value 1e-10 โดยใช้ BLASTN และ BLASTXกลยุทธ์นี้ช่วยให้เราสามารถระบุชิ้นส่วนที่ไม่ใช่สองวาล์ว 482 ชิ้นที่มีอยู่ใน A. atra ccfDNAมากกว่าครึ่ง (57%) ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอเหล่านี้ได้มาจากแบคทีเรีย ส่วนใหญ่มาจากสัญลักษณ์ของเหงือก รวมทั้งสัญลักษณ์ของซัลโฟโทรฟิก และจากสัญลักษณ์ของเหงือก Solemya velum (รูปที่ 5)
ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ในระดับประเภทB ความหลากหลายของจุลินทรีย์ของไฟลาหลัก 2 ไฟลา (Firmicutes และ Proteobacteria)การขยายตัวแทนของ ddPCR C Vibrio spp.A. ชิ้นส่วนของยีน 16S rRNA (สีน้ำเงิน) ในเซลล์เม็ดเลือดแดง atra 3 ก้อน
มีการวิเคราะห์ contigs ที่รวบรวมได้ทั้งหมด 482 รายการโปรไฟล์ทั่วไปของการแจกแจงอนุกรมวิธานของคำอธิบายประกอบ contig metagenomic (โปรคารีโอตและยูคารีโอต)B การกระจายโดยละเอียดของชิ้นส่วน DNA ของแบคทีเรียที่ระบุโดย BLASTN และ BLASTX
การวิเคราะห์ Kraken2 ยังแสดงให้เห็นว่าหอยแมลงภู่ ccfDNA มีชิ้นส่วน DNA ของโบราณคดี รวมถึงชิ้นส่วน DNA ของ Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) และ Thaurmarcheota (11%) (รูปที่ 6a)การปรากฏตัวของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ได้จาก Euryarchaeota และ Crenarchaeota ซึ่งก่อนหน้านี้พบในชุมชนจุลินทรีย์ของหอยแมลงภู่แคลิฟอร์เนีย ไม่ใช่เรื่องน่าแปลกใจ [42]แม้ว่า Euryarchaeota มักเกี่ยวข้องกับสภาวะที่รุนแรง แต่ตอนนี้เป็นที่ทราบกันดีว่าทั้ง Euryarchaeota และ Crenarcheota เป็นโปรคาริโอตที่พบได้บ่อยที่สุดในสภาพแวดล้อมการแช่แข็งในทะเล [43, 44]การปรากฏตัวของจุลินทรีย์มีเทนในหอยแมลงภู่นั้นไม่น่าแปลกใจ เมื่อพิจารณาจากรายงานล่าสุดเกี่ยวกับการรั่วไหลของมีเทนอย่างกว้างขวางจากการรั่วไหลด้านล่างบนที่ราบสูงเคอเกอเลิน [45] และการผลิตมีเทนจากจุลินทรีย์ที่เป็นไปได้ที่สังเกตได้จากชายฝั่งของหมู่เกาะเคอเกอเลิน [46]
จากนั้นความสนใจของเราก็เปลี่ยนไปสู่การอ่านค่าจากไวรัสดีเอ็นเอเท่าที่เราทราบ นี่เป็นการศึกษานอกเป้าหมายครั้งแรกเกี่ยวกับปริมาณไวรัสในหอยแมลงภู่ตามที่คาดไว้ เราพบชิ้นส่วน DNA ของแบคเทอริโอฟาจ (Caudovirales) (รูปที่ 6b)อย่างไรก็ตาม DNA ของไวรัสที่พบบ่อยที่สุดมาจากไฟลัมของ nucleocytoviruses หรือที่เรียกว่าไวรัส DNA ขนาดใหญ่ของนิวเคลียสของไซโตพลาสซึม (NCLDV) ซึ่งมีจีโนมที่ใหญ่ที่สุดในบรรดาไวรัสใดๆภายในไฟลัมนี้ ลำดับดีเอ็นเอส่วนใหญ่เป็นของตระกูล Mimimidoviridae (58%) และ Poxviridae (21%) ซึ่งมีโฮสต์ตามธรรมชาติรวมถึงสัตว์มีกระดูกสันหลังและสัตว์ขาปล้อง ในขณะที่สัดส่วนเล็กน้อยของลำดับ DNA เหล่านี้เป็นของสาหร่ายไวรัสที่รู้จักติดเชื้อสาหร่ายทะเลยูคาริโอตลำดับดังกล่าวยังได้มาจากไวรัสแพนดอร่า ซึ่งเป็นไวรัสยักษ์ที่มีขนาดจีโนมที่ใหญ่ที่สุดในบรรดาไวรัสสกุลใด ๆ ที่รู้จักที่น่าสนใจคือช่วงของโฮสต์ที่ทราบว่าติดเชื้อไวรัสซึ่งพิจารณาจากการจัดลำดับ hemolymph ccfDNA นั้นค่อนข้างใหญ่ (รูปที่ S3, ข้อมูลเพิ่มเติม)ซึ่งรวมถึงไวรัสที่ติดเชื้อในแมลง เช่น Baculoviridae และ Iridoviridae ตลอดจนไวรัสที่ติดเชื้ออะมีบา สาหร่าย และสัตว์มีกระดูกสันหลังเรายังพบลำดับที่ตรงกับจีโนมของ Pithovirus sibericumPitoviruses (หรือที่เรียกว่า “ไวรัสซอมบี้”) ถูกแยกได้ครั้งแรกจากชั้นเยือกแข็งถาวรอายุ 30,000 ปีในไซบีเรีย [47]ดังนั้น ผลลัพธ์ของเราจึงสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ที่แสดงว่าไม่ใช่สายพันธุ์ที่ทันสมัยทั้งหมดของไวรัสเหล่านี้ที่สูญพันธุ์ไปแล้ว [48] และไวรัสเหล่านี้อาจมีอยู่ในระบบนิเวศใต้ทะเลบริเวณกึ่งขั้วโลกที่ห่างไกล
สุดท้าย เราทดสอบเพื่อดูว่าเราสามารถหาชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากสัตว์หลายเซลล์อื่นๆ ได้หรือไม่BLASTN และ BLASTX มีการระบุสิ่งแปลกปลอมทั้งหมด 482 รายการด้วยไลบรารี nt, nr และ RefSeq (จีโนมและโปรตีน)ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าในบรรดาชิ้นส่วนแปลกปลอมของ ccfDNA ของสัตว์หลายเซลล์ DNA ของกระดูกที่มีกระดูกเด่นกว่า (รูปที่ 5)นอกจากนี้ยังพบชิ้นส่วน DNA จากแมลงและสายพันธุ์อื่นๆชิ้นส่วนดีเอ็นเอส่วนใหญ่ยังไม่ได้รับการระบุ อาจเป็นเพราะการแสดงพันธุ์สัตว์ทะเลจำนวนมากในฐานข้อมูลจีโนมต่ำกว่าความเป็นจริงเมื่อเทียบกับพันธุ์บนบก [49]
ในเอกสารปัจจุบัน เราใช้แนวคิด LB กับหอยแมลงภู่ โดยอ้างว่าการจัดลำดับการยิงของ hemolymph ccfDNA สามารถให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับองค์ประกอบของระบบนิเวศชายฝั่งทะเลโดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราพบว่า 1) hemolymph ของหอยแมลงภู่มีความเข้มข้นค่อนข้างสูง (ระดับไมโครกรัม) ของชิ้นส่วน DNA ที่ค่อนข้างใหญ่ (~1-5 kb) หมุนเวียน;2) ชิ้นส่วน DNA เหล่านี้มีทั้งอิสระและไม่เป็นอิสระ 3) ในบรรดาแหล่งที่มาต่างประเทศของชิ้นส่วน DNA เหล่านี้ เราพบ DNA ของแบคทีเรีย โบราณคดี และไวรัส รวมถึง DNA ของสัตว์หลายเซลล์อื่นๆ4) การสะสมของชิ้นส่วน ccfDNA แปลกปลอมเหล่านี้ใน hemolymph เกิดขึ้นอย่างรวดเร็วและก่อให้เกิดกิจกรรมการกรองภายในของหอยแมลงภู่โดยสรุป การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าแนวคิดของ LB ซึ่งได้ถูกนำไปใช้เป็นหลักในสาขาชีวเวชศาสตร์ เข้ารหัสแหล่งความรู้ที่สมบูรณ์แต่ยังไม่ได้สำรวจ ซึ่งสามารถนำมาใช้เพื่อทำความเข้าใจปฏิสัมพันธ์ระหว่างสปีชีส์แมวมองและสภาพแวดล้อมของพวกมันได้ดียิ่งขึ้น
นอกจากไพรเมตแล้ว ยังมีรายงานการแยก ccfDNA ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม รวมทั้งหนู สุนัข แมว และม้าด้วย [50, 51, 52]อย่างไรก็ตาม จากความรู้ของเรา การศึกษาของเราเป็นครั้งแรกที่รายงานการตรวจหาและจัดลำดับของ ccfDNA ในสัตว์ทะเลด้วยระบบหมุนเวียนเปิดคุณลักษณะทางกายวิภาคและความสามารถในการกรองของหอยแมลงภู่นี้ อย่างน้อยในบางส่วนอาจอธิบายลักษณะขนาดที่แตกต่างกันของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่หมุนเวียนเมื่อเปรียบเทียบกับสายพันธุ์อื่นในมนุษย์ ชิ้นส่วน DNA ส่วนใหญ่ที่ไหลเวียนอยู่ในเลือดเป็นชิ้นส่วนขนาดเล็กที่มีขนาดตั้งแต่ 150 ถึง 200 bpด้วยจุดสูงสุดสูงสุด 167 bp [34, 53]ชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาดเล็กแต่มีนัยสำคัญมีขนาดระหว่าง 300 ถึง 500 bp และประมาณ 5% มีความยาวมากกว่า 900 bp[54].สาเหตุของการกระจายขนาดนี้คือแหล่งที่มาหลักของ ccfDNA ในพลาสมาเกิดขึ้นจากการตายของเซลล์ ไม่ว่าจะเป็นจากการตายของเซลล์หรือเนื่องจากการตายของเซลล์เม็ดเลือดที่หมุนเวียนในคนที่มีสุขภาพดี หรือจากการตายของเซลล์มะเร็งในผู้ป่วยมะเร็ง (เรียกว่า circulating tumor DNA), ctDNA).การกระจายขนาดของ hemolymph ccfDNA ที่เราพบในหอยแมลงภู่มีค่าตั้งแต่ 1,000 ถึง 5,000 bp ซึ่งบ่งชี้ว่า ccfDNA ของหอยแมลงภู่มีต้นกำเนิดที่แตกต่างกันนี่คือสมมติฐานเชิงตรรกะ เนื่องจากหอยแมลงภู่มีระบบหลอดเลือดกึ่งเปิดและอาศัยอยู่ในสภาพแวดล้อมทางน้ำในทะเลที่มีความเข้มข้นสูงของจีโนมของจุลินทรีย์ในดีเอ็นเอในความเป็นจริง การทดลองในห้องปฏิบัติการของเราโดยใช้ DNA ภายนอกแสดงให้เห็นว่าหอยแมลงภู่สะสมชิ้นส่วน DNA ในน้ำทะเล อย่างน้อยหลังจากผ่านไปสองสามชั่วโมง พวกมันจะถูกย่อยสลายหลังจากการดูดซึมของเซลล์ และ/หรือถูกปล่อย และ/หรือเก็บไว้ในองค์กรต่างๆเนื่องจากความหายากของเซลล์ (ทั้งโปรคารีโอตและยูคาริโอต) การใช้ช่องในลิ้นจะช่วยลดปริมาณ ccfDNA จากแหล่งที่มาของตนเองและจากแหล่งต่างประเทศเมื่อพิจารณาถึงความสำคัญของภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของหอยสองฝาและฟาโกไซต์หมุนเวียนจำนวนมาก เราตั้งสมมติฐานเพิ่มเติมว่าแม้ ccfDNA ต่างประเทศจะอุดมไปด้วยฟาโกไซต์หมุนเวียนที่สะสม DNA แปลกปลอมเมื่อกลืนกินจุลินทรีย์และ/หรือเศษเซลล์เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า bivalve hemolymph ccfDNA เป็นที่เก็บข้อมูลระดับโมเลกุลที่ไม่เหมือนใครและเสริมสถานะของพวกมันในฐานะสปีชีส์แมวมอง
ข้อมูลของเราบ่งชี้ว่าการจัดลำดับและการวิเคราะห์ชิ้นส่วน hemolymph ccfDNA ที่ได้จากแบคทีเรียสามารถให้ข้อมูลสำคัญเกี่ยวกับแบคทีเรียที่เป็นโฮสต์และแบคทีเรียที่มีอยู่ในระบบนิเวศทางทะเลโดยรอบเทคนิคการหาลำดับการยิงได้เปิดเผยลำดับของแบคทีเรียร่วม A. atra gill ที่อาจพลาดไปหากใช้วิธีการระบุ 16S rRNA แบบเดิม เนื่องจากส่วนหนึ่งมาจากอคติของไลบรารีอ้างอิงในความเป็นจริงการใช้ข้อมูล LB ที่รวบรวมจาก M. platensis ในชั้นหอยแมลงภู่เดียวกันที่ Kerguelen แสดงให้เห็นว่าองค์ประกอบของ symbionts แบคทีเรียที่เกี่ยวข้องกับเหงือกนั้นเหมือนกันสำหรับหอยแมลงภู่ทั้งสองชนิด (รูปที่ S4, ข้อมูลเพิ่มเติม)ความคล้ายคลึงกันของหอยแมลงภู่สองตัวที่แตกต่างกันทางพันธุกรรมนี้อาจสะท้อนถึงองค์ประกอบของชุมชนแบคทีเรียในตะกอนที่เย็นจัด กำมะถัน และภูเขาไฟของ Kerguelen [55, 56, 57, 58]จุลินทรีย์ที่ลดกำมะถันในระดับที่สูงขึ้นได้รับการอธิบายไว้อย่างดีเมื่อทำการเก็บเกี่ยวหอยแมลงภู่จากพื้นที่ชายฝั่งทะเลที่มีการปั่นป่วนทางชีวภาพ [59] เช่น ชายฝั่งปอร์โตแปรงซ์ความเป็นไปได้อีกอย่างคือพืชในหอยแมลงภู่อาจได้รับผลกระทบจากการแพร่กระจายในแนวนอน [60, 61]จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อหาความสัมพันธ์ระหว่างสภาพแวดล้อมทางทะเล พื้นผิวก้นทะเล และองค์ประกอบของแบคทีเรียชีวภาพในหอยแมลงภู่การศึกษาเหล่านี้กำลังดำเนินการอยู่
ความยาวและความเข้มข้นของ hemolymph ccfDNA ความสะดวกในการทำให้บริสุทธิ์ และคุณภาพสูงเพื่อให้จัดลำดับปืนลูกซองได้อย่างรวดเร็วคือข้อดีบางประการของการใช้ ccfDNA ของหอยแมลงภู่เพื่อประเมินความหลากหลายทางชีวภาพในระบบนิเวศชายฝั่งทะเลวิธีนี้มีประสิทธิภาพโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการระบุลักษณะของชุมชนไวรัส (viromes) ในระบบนิเวศที่กำหนด [62, 63]ซึ่งแตกต่างจากแบคทีเรีย อาร์เคีย และยูคาริโอต จีโนมของไวรัสไม่มียีนที่อนุรักษ์ทางสายวิวัฒนาการ เช่น ลำดับ 16Sผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่าการตรวจชิ้นเนื้อของเหลวจากสปีชีส์บ่งชี้ เช่น หอยแมลงภู่ สามารถใช้เพื่อระบุชิ้นส่วนไวรัส ccfDNA จำนวนมากที่ทราบกันดีว่าติดเชื้อโฮสต์ซึ่งโดยทั่วไปอาศัยอยู่ในระบบนิเวศทางทะเลชายฝั่งซึ่งรวมถึงไวรัสที่ทราบว่าติดเชื้อโปรโตซัว สัตว์ขาปล้อง แมลง พืช และไวรัสจากแบคทีเรีย (เช่น แบคเทอริโอฟาจ)พบการกระจายที่คล้ายกันเมื่อเราตรวจสอบ hemolymph ccfDNA virome ของหอยแมลงภู่สีน้ำเงิน (M. platensis) ที่รวบรวมในชั้นหอยแมลงภู่เดียวกันที่ Kerguelen (ตาราง S2, ข้อมูลเพิ่มเติม)การจัดลำดับปืนลูกซองของ ccfDNA เป็นวิธีการใหม่ที่ได้รับแรงผลักดันในการศึกษา virome ของมนุษย์หรือสายพันธุ์อื่น ๆ [21, 37, 64]วิธีการนี้มีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการศึกษาไวรัสดีเอ็นเอสายคู่ เนื่องจากไม่มียีนเดี่ยวใดที่ได้รับการอนุรักษ์จากไวรัสดีเอ็นเอสายคู่ทั้งหมด ซึ่งเป็นตัวแทนของไวรัสประเภทต่างๆ ที่หลากหลายและกว้างขวางที่สุดในบัลติมอร์ [65]แม้ว่าไวรัสเหล่านี้ส่วนใหญ่ยังไม่จำแนกประเภทและอาจรวมถึงไวรัสจากส่วนที่ไม่รู้จักทั้งหมดของโลกไวรัส [66] เราพบว่าไวโรเมสและโฮสต์ของหอยแมลงภู่ A. atra และ M. platensis อยู่ระหว่างสองสปีชีส์ในทำนองเดียวกัน (ดูรูปที่ S3 ข้อมูลเพิ่มเติม)ความคล้ายคลึงกันนี้ไม่น่าแปลกใจ เนื่องจากอาจสะท้อนถึงการขาดการคัดเลือกในการดูดซึม DNA ที่มีอยู่ในสิ่งแวดล้อมปัจจุบันจำเป็นต้องมีการศึกษาในอนาคตโดยใช้ RNA ที่บริสุทธิ์เพื่อระบุลักษณะของ RNA virome
ในการศึกษาของเรา เราใช้ไปป์ไลน์ที่เข้มงวดมากซึ่งดัดแปลงมาจากงานของ Kowarski และเพื่อนร่วมงาน [37] ซึ่งใช้การลบการอ่านแบบรวมสองขั้นตอนและ contigs ก่อนและหลังการประกอบ ccfDNA ดั้งเดิม ส่งผลให้การอ่านที่ไม่ได้แมปมีสัดส่วนสูงดังนั้นเราจึงไม่สามารถแยกออกได้ว่าการอ่านที่ไม่ได้แมปเหล่านี้บางส่วนอาจยังคงมีต้นกำเนิดของตัวเอง เนื่องจากเราไม่มีจีโนมอ้างอิงสำหรับหอยแมลงภู่ชนิดนี้เรายังใช้ไปป์ไลน์นี้เพราะเรากังวลเกี่ยวกับความฝันระหว่างการอ่านด้วยตัวเองและไม่ใช่ตัวเอง และความยาวในการอ่านที่สร้างขึ้นโดย Illumina MiSeq PE75อีกเหตุผลหนึ่งที่ทำให้การอ่านข้อมูลส่วนใหญ่ไม่อยู่ในแผนที่ก็คือจุลินทรีย์ในทะเลส่วนใหญ่ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในพื้นที่ห่างไกล เช่น Kerguelen ยังไม่ได้รับคำอธิบายประกอบเราใช้ Illumina MiSeq PE75 โดยถือว่าความยาวของชิ้นส่วน ccfDNA ใกล้เคียงกับ ccfDNA ของมนุษย์สำหรับการศึกษาในอนาคต จากผลลัพธ์ของเราที่แสดงว่า hemolymph ccfDNA อ่านค่าได้นานกว่ามนุษย์และ/หรือสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เราขอแนะนำให้ใช้แพลตฟอร์มการหาลำดับที่เหมาะสมสำหรับชิ้นส่วน ccfDNA ที่ยาวกว่าแนวทางปฏิบัตินี้จะทำให้ง่ายต่อการระบุตัวบ่งชี้เพิ่มเติมสำหรับการวิเคราะห์เชิงลึกการได้รับลำดับจีโนมนิวเคลียร์ A. atra ที่สมบูรณ์ซึ่งยังไม่พร้อมใช้งานในปัจจุบันจะช่วยอำนวยความสะดวกอย่างมากในการแยกแยะ ccfDNA จากแหล่งที่มาของตนเองและไม่ใช่ตนเองเนื่องจากการวิจัยของเรามุ่งเน้นไปที่ความเป็นไปได้ในการใช้แนวคิดของการตรวจชิ้นเนื้อของเหลวกับหอยแมลงภู่ เราหวังว่าเมื่อแนวคิดนี้ถูกนำมาใช้ในการวิจัยในอนาคต เครื่องมือและท่อส่งใหม่ๆ จะได้รับการพัฒนาเพื่อเพิ่มศักยภาพของวิธีนี้ในการศึกษาความหลากหลายของจุลินทรีย์ในหอยแมลงภู่ระบบนิเวศทางทะเล
ในฐานะที่เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพทางคลินิกที่ไม่รุกราน ระดับ ccfDNA ในพลาสมาของมนุษย์ที่สูงขึ้นนั้นสัมพันธ์กับโรคต่างๆ ความเสียหายของเนื้อเยื่อ และสภาวะความเครียด [67,68,69]การเพิ่มขึ้นนี้เกี่ยวข้องกับการปลดปล่อยชิ้นส่วน DNA จากแหล่งกำเนิดของมันเองหลังจากเนื้อเยื่อถูกทำลายเราแก้ไขปัญหานี้โดยใช้ความเครียดจากความร้อนเฉียบพลัน ซึ่งหอยแมลงภู่สัมผัสกับอุณหภูมิ 30 °C ในช่วงสั้นๆเราทำการวิเคราะห์นี้กับหอยแมลงภู่สามชนิดในการทดลองอิสระสามครั้งอย่างไรก็ตาม เราไม่พบการเปลี่ยนแปลงใดๆ ในระดับ ccfDNA หลังจากความเครียดจากความร้อนเฉียบพลัน (ดูรูปที่ S5 ข้อมูลเพิ่มเติม)การค้นพบนี้อาจอธิบายข้อเท็จจริงที่ว่าหอยแมลงภู่มีระบบไหลเวียนเลือดแบบกึ่งเปิดและสะสม DNA ต่างประเทศจำนวนมากเนื่องจากกิจกรรมการกรองสูงในทางกลับกัน หอยแมลงภู่ก็เหมือนกับสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังหลายชนิด อาจมีความทนทานต่อความเสียหายของเนื้อเยื่อที่เกิดจากความเครียด จึงจำกัดการปลดปล่อย ccfDNA ในเม็ดเลือดแดง [70, 71]
จนถึงปัจจุบัน การวิเคราะห์ DNA ของความหลากหลายทางชีวภาพในระบบนิเวศทางน้ำได้เน้นที่ metabarcoding ของ DNA สิ่งแวดล้อม (eDNA) เป็นหลักอย่างไรก็ตาม วิธีนี้มักจะถูกจำกัดในการวิเคราะห์ความหลากหลายทางชีวภาพเมื่อใช้ไพรเมอร์การใช้การจัดลำดับปืนลูกซองเป็นการหลีกเลี่ยงข้อจำกัดของ PCR และการเลือกชุดไพรเมอร์ที่มีอคติดังนั้น ในแง่หนึ่ง วิธีการของเราใกล้เคียงกับวิธีการหาลำดับเบส eDNA Shotgun ความเร็วสูงที่ใช้ล่าสุด ซึ่งสามารถจัดลำดับ DNA ที่แยกส่วนได้โดยตรงและวิเคราะห์สิ่งมีชีวิตเกือบทั้งหมด [72, 73]อย่างไรก็ตาม มีปัญหาพื้นฐานหลายอย่างที่ทำให้ LB แตกต่างจากวิธี eDNA มาตรฐานแน่นอน ความแตกต่างที่สำคัญระหว่าง eDNA และ LB คือการใช้โฮสต์ตัวกรองตามธรรมชาติมีรายงานการใช้สัตว์ทะเล เช่น ฟองน้ำและหอยสองฝา (Dresseina spp.) เป็นตัวกรองธรรมชาติสำหรับศึกษา eDNA [74, 75]อย่างไรก็ตาม การศึกษาของ Dreissena ใช้การตรวจชิ้นเนื้อเนื้อเยื่อที่สกัดดีเอ็นเอออกมาการวิเคราะห์ ccfDNA จาก LB ไม่จำเป็นต้องมีการตรวจชิ้นเนื้อเนื้อเยื่อ อุปกรณ์เฉพาะทางและบางครั้งมีราคาแพง และการขนส่งที่เกี่ยวข้องกับ eDNA หรือการตรวจชิ้นเนื้อเนื้อเยื่อในความเป็นจริง เราเพิ่งรายงานว่า ccfDNA จาก LB สามารถจัดเก็บและวิเคราะห์ได้ด้วยการรองรับ FTA โดยไม่ต้องบำรุงรักษาห่วงโซ่ความเย็น ซึ่งเป็นความท้าทายที่สำคัญสำหรับการวิจัยในพื้นที่ห่างไกล [76]การสกัด ccfDNA จากชิ้นเนื้อเหลวยังทำได้ง่ายและให้ DNA คุณภาพสูงสำหรับการจัดลำดับปืนลูกซองและการวิเคราะห์ PCRนี่เป็นข้อได้เปรียบอย่างมากเนื่องจากข้อจำกัดทางเทคนิคบางประการที่เกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์ eDNA [77]ความเรียบง่ายและต้นทุนต่ำของวิธีการสุ่มตัวอย่างยังเหมาะอย่างยิ่งสำหรับโปรแกรมการตรวจสอบระยะยาวนอกจากความสามารถในการกรองที่สูงแล้ว คุณสมบัติที่เป็นที่รู้จักกันดีอีกอย่างของหอยสองฝาคือองค์ประกอบทางเคมีของเมือกโพลีแซคคาไรด์ในเมือก ซึ่งส่งเสริมการดูดซึมของไวรัส [78, 79]สิ่งนี้ทำให้หอยสองฝาเป็นตัวกรองธรรมชาติในอุดมคติสำหรับการระบุลักษณะความหลากหลายทางชีวภาพและผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศในระบบนิเวศทางน้ำที่กำหนดแม้ว่าการมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA ที่ได้มาจากโฮสต์จะถูกมองว่าเป็นข้อจำกัดของวิธีการเมื่อเทียบกับ eDNA แต่ค่าใช้จ่ายที่เกี่ยวข้องกับการมี ccfDNA ดั้งเดิมดังกล่าวเมื่อเทียบกับ eDNA นั้นสามารถเข้าใจได้พร้อมๆ กันสำหรับข้อมูลจำนวนมหาศาลสำหรับการศึกษาด้านสุขภาพชดเชยโฮสต์ซึ่งรวมถึงการมีอยู่ของลำดับไวรัสที่รวมอยู่ในจีโนมของโฮสต์โฮสต์สิ่งนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งสำหรับหอยแมลงภู่ เนื่องจากมีรีโทรไวรัสลิวคีมิกที่ส่งผ่านแนวนอนในหอยสองฝา [80, 81]ข้อดีอีกประการของ LB เหนือ eDNA คือใช้ประโยชน์จากกิจกรรมทำลายเซลล์ของการหมุนเวียนเซลล์เม็ดเลือดใน hemolymph ซึ่งกลืนกินจุลินทรีย์ (และจีโนมของพวกมัน)ฟาโกไซโทซิสเป็นหน้าที่หลักของเซลล์เม็ดเลือดในหอยสองฝา [82]สุดท้าย วิธีการนี้ใช้ประโยชน์จากความสามารถในการกรองหอยแมลงภู่สูง (น้ำทะเลเฉลี่ย 1.5 ลิตร/ชม.) และการหมุนเวียน 2 วัน ซึ่งเพิ่มการผสมกันของชั้นต่างๆ ของน้ำทะเล ทำให้สามารถจับ eDNA ที่ต่างกันได้[83, 84].ดังนั้นการวิเคราะห์ ccfDNA ของหอยแมลงภู่จึงเป็นช่องทางที่น่าสนใจเนื่องจากผลกระทบทางโภชนาการ เศรษฐกิจ และสิ่งแวดล้อมของหอยแมลงภู่เช่นเดียวกับการวิเคราะห์ LB ที่เก็บจากมนุษย์ วิธีนี้ยังเปิดโอกาสให้วัดการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมและ epigenetic ใน DNA ของโฮสต์เพื่อตอบสนองต่อสารภายนอกตัวอย่างเช่น สามารถจินตนาการถึงเทคโนโลยีการหาลำดับยุคที่สามเพื่อทำการวิเคราะห์เมทิลเลชันทั่วทั้งจีโนมใน ccfDNA ดั้งเดิมโดยใช้การจัดลำดับนาโนพอร์กระบวนการนี้ควรได้รับการอำนวยความสะดวกโดยข้อเท็จจริงที่ว่าความยาวของชิ้นส่วน ccfDNA ของหอยแมลงภู่นั้นเข้ากันได้อย่างดีเยี่ยมกับแพลตฟอร์มการหาลำดับที่อ่านได้นานซึ่งช่วยให้การวิเคราะห์ DNA methylation ทั่วทั้งจีโนมจากการจัดลำดับเดียวโดยไม่จำเป็นต้องมีการเปลี่ยนแปลงทางเคมี 85,86] นี่เป็นความเป็นไปได้ที่น่าสนใจ เนื่องจากแสดงให้เห็นว่ารูปแบบ DNA methylation สะท้อนการตอบสนองต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อมและคงอยู่มาหลายชั่วอายุคนดังนั้นจึงสามารถให้ข้อมูลเชิงลึกที่มีค่าเกี่ยวกับกลไกพื้นฐานที่ควบคุมการตอบสนองหลังจากสัมผัสกับการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศหรือมลพิษ [87]อย่างไรก็ตาม การใช้ LB นั้นไม่มีข้อจำกัดจำเป็นต้องพูดสิ่งนี้จำเป็นต้องมีตัวบ่งชี้ชนิดในระบบนิเวศดังที่กล่าวไว้ข้างต้น การใช้ LB เพื่อประเมินความหลากหลายทางชีวภาพของระบบนิเวศหนึ่งๆ ยังต้องการระบบชีวสารสนเทศที่เข้มงวด ซึ่งคำนึงถึงการมีอยู่ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากแหล่งที่มาปัญหาสำคัญอีกประการหนึ่งคือความพร้อมใช้งานของจีโนมอ้างอิงสำหรับสัตว์ทะเลหวังว่าความคิดริเริ่มต่างๆ เช่น โครงการจีโนมของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมในทะเล และโครงการ Fish10k ที่จัดตั้งขึ้นเมื่อเร็วๆ นี้ [88] จะช่วยอำนวยความสะดวกในการวิเคราะห์ดังกล่าวในอนาคตการประยุกต์ใช้แนวคิด LB กับสิ่งมีชีวิตในตัวกรองในทะเลยังเข้ากันได้กับความก้าวหน้าล่าสุดในเทคโนโลยีการหาลำดับ ทำให้เหมาะสมอย่างยิ่งสำหรับการพัฒนาตัวบ่งชี้ทางชีวภาพแบบหลายโอห์มเพื่อให้ข้อมูลที่สำคัญเกี่ยวกับสุขภาพของแหล่งที่อยู่อาศัยในทะเลเพื่อตอบสนองต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อม
ข้อมูลการจัดลำดับจีโนมถูกฝากไว้ใน NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ภายใต้ Bioprojects SRR8924808
Brierley AS, Kingsford MJ ผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศต่อสิ่งมีชีวิตในทะเลและระบบนิเวศโคลชีววิทยา.2552;19: P602–P614
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S และคณะพิจารณาผลกระทบโดยรวมของการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศและปัจจัยกดดันอื่นๆ ในท้องถิ่นที่มีต่อสิ่งแวดล้อมทางทะเลสภาพแวดล้อมทางวิทยาศาสตร์ทั่วไป2564;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P และอื่นๆ).วิทยาศาสตร์ของวันที่ 1 มีนาคม2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. การทนต่อความร้อนที่ลดลงภายใต้สภาวะความเครียดจากความร้อนซ้ำๆ อธิบายถึงอัตราการตายสูงในฤดูร้อนของหอยแมลงภู่สีน้ำเงินรายงานทางวิทยาศาสตร์ พ.ศ. 2562;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER และอื่นๆการเปลี่ยนแปลงล่าสุดของความถี่ สาเหตุ และขอบเขตของการตายของสัตว์Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา2558;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S และอื่น ๆเชื้อโรคที่ไม่จำเพาะหลายสายพันธุ์อาจทำให้ Pinna nobilis เสียชีวิตจำนวนมากชีวิต.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TMผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นจากการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศต่อโรคติดต่อจากสัตว์สู่คนในอาร์กติกInt J Circumpolar สุขภาพ2548;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. และคณะหอยแมลงภู่สีน้ำเงิน (Mytilus edulis spp.) เป็นสิ่งมีชีวิตที่ส่งสัญญาณในการตรวจวัดมลพิษชายฝั่ง: บทวิจารณ์มี.ค. สภาพแวดล้อม Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. การบูรณาการของการตรวจชิ้นเนื้อของเหลวในการรักษามะเร็งแนท เรฟ คลีน อองคอล.2560;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C และอื่น ๆการเจริญเติบโตของการตรวจชิ้นเนื้อของเหลว: ช่วยให้ DNA ของเนื้องอกไหลเวียนได้นัท เรฟ กรกฎ.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. กรดนิวคลีอิกในพลาสมาของมนุษย์รายงานการประชุมของบริษัทย่อย Soc Biol2491;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. บทบาทใหม่สำหรับ DNA ที่ปราศจากเซลล์ในฐานะเครื่องหมายโมเลกุลสำหรับการรักษามะเร็งปริมาณของการวิเคราะห์ทางชีวโมลาร์2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS การตรวจชิ้นเนื้อของเหลวเข้าสู่คลินิก – ปัญหาในการดำเนินการและความท้าทายในอนาคตณัฐเรฟ คลินิค อองคอล.2564;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW และอื่นๆDNA ของทารกในครรภ์มีอยู่ในพลาสมาและซีรั่มของมารดามีดหมอ.2540;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR การศึกษาการตั้งครรภ์และภาวะแทรกซ้อนโดยใช้การไหลเวียนของ RNA นอกเซลล์ในเลือดของผู้หญิงระหว่างตั้งครรภ์กุมารเวชศาสตร์.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J และคณะการตรวจชิ้นเนื้อของเหลว: ใช้ DNA ที่ปราศจากเซลล์ของผู้บริจาคเพื่อตรวจหารอยโรค allogeneic ในการปลูกถ่ายไตแนท เรฟ เนฟรอล2564;17:591–603.
Juan FC, Lo YM นวัตกรรมในการวินิจฉัยก่อนคลอด: การจัดลำดับจีโนมในพลาสมาของมารดาแอนนา นพ.2559;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D และอื่น ๆการตรวจจับเชื้อโรคอย่างรวดเร็วด้วยการจัดลำดับเมตาโนมิกของของเหลวในร่างกายที่ติดเชื้อในยุคต่อไปณัฐ ยา.2021;27:115-24.


เวลาโพสต์: 14 ส.ค.-2565