ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าจะได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงผลไซต์โดยไม่ใช้รูปแบบและ JavaScript
การตรวจชิ้นเนื้อทางของเหลว (Liquid Biopsy: LB) เป็นแนวคิดที่ได้รับความนิยมอย่างรวดเร็วในสาขาชีวการแพทย์ แนวคิดนี้ส่วนใหญ่มีพื้นฐานมาจากการตรวจหาชิ้นส่วนของดีเอ็นเอนอกเซลล์ที่ไหลเวียนอยู่ (ccfDNA) ซึ่งส่วนใหญ่จะถูกปล่อยออกมาเป็นชิ้นส่วนขนาดเล็กหลังจากเซลล์ตายในเนื้อเยื่อต่างๆ ชิ้นส่วนเหล่านี้จำนวนเล็กน้อยมาจากเนื้อเยื่อหรือสิ่งมีชีวิตต่างถิ่น ในงานปัจจุบัน เราได้นำแนวคิดนี้ไปใช้กับหอยแมลงภู่ ซึ่งเป็นสัตว์เฝ้ายามที่ขึ้นชื่อเรื่องความสามารถในการกรองน้ำทะเลสูง เราใช้ความสามารถของหอยแมลงภู่ในการทำหน้าที่เป็นตัวกรองตามธรรมชาติเพื่อจับชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากสิ่งแวดล้อมจากแหล่งต่างๆ เพื่อให้ข้อมูลเกี่ยวกับความหลากหลายทางชีวภาพของระบบนิเวศชายฝั่งทะเล ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าน้ำเหลืองของหอยแมลงภู่มีชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีขนาดแตกต่างกันมาก ตั้งแต่ 1 ถึง 5 กิโลเบส การจัดลำดับยีนแบบ Shotgun แสดงให้เห็นว่าชิ้นส่วนดีเอ็นเอจำนวนมากมีต้นกำเนิดจากจุลินทรีย์ต่างถิ่น ในจำนวนนี้ เราพบชิ้นส่วน DNA จากแบคทีเรีย อาร์เคีย และไวรัส รวมถึงไวรัสที่ทราบกันว่าติดเชื้อในโฮสต์ต่างๆ ที่มักพบในระบบนิเวศทางทะเลชายฝั่ง สรุปได้ว่า การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าแนวคิด LB ที่ใช้กับหอยแมลงภู่เป็นแหล่งความรู้เกี่ยวกับความหลากหลายของจุลินทรีย์ในระบบนิเวศชายฝั่งทะเลชายฝั่งที่ยังไม่ได้รับการสำรวจมากนัก
ผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศ (CC) ต่อความหลากหลายทางชีวภาพของระบบนิเวศทางทะเลเป็นสาขาการวิจัยที่เติบโตอย่างรวดเร็ว ภาวะโลกร้อนไม่เพียงแต่ก่อให้เกิดความเครียดทางสรีรวิทยาที่สำคัญเท่านั้น แต่ยังผลักดันขีดจำกัดวิวัฒนาการของเสถียรภาพทางความร้อนของสิ่งมีชีวิตในทะเล ส่งผลกระทบต่อที่อยู่อาศัยของสิ่งมีชีวิตหลายชนิด ทำให้สิ่งมีชีวิตเหล่านี้ต้องค้นหาเงื่อนไขที่เอื้ออำนวยมากขึ้น [1, 2] นอกจากจะส่งผลกระทบต่อความหลากหลายทางชีวภาพของสัตว์หลายสายพันธุ์แล้ว CC ยังทำลายสมดุลที่ละเอียดอ่อนของปฏิสัมพันธ์ระหว่างโฮสต์กับจุลินทรีย์อีกด้วย ภาวะแบคทีเรียผิดปกติของจุลินทรีย์นี้ก่อให้เกิดภัยคุกคามร้ายแรงต่อระบบนิเวศทางทะเล เนื่องจากทำให้สิ่งมีชีวิตในทะเลอ่อนไหวต่อเชื้อก่อโรคติดเชื้อมากขึ้น [3, 4] เชื่อกันว่า SS มีบทบาทสำคัญในการตายจำนวนมาก ซึ่งเป็นปัญหาที่ร้ายแรงสำหรับการจัดการระบบนิเวศทางทะเลทั่วโลก [5, 6] นี่เป็นปัญหาสำคัญเมื่อพิจารณาถึงผลกระทบทางเศรษฐกิจ นิเวศวิทยา และโภชนาการของสิ่งมีชีวิตในทะเลหลายชนิด โดยเฉพาะหอยสองฝาที่อาศัยอยู่ในบริเวณขั้วโลก ซึ่งผลกระทบของ CK นั้นเกิดขึ้นทันทีและรุนแรงกว่า [6, 7] ในความเป็นจริง หอยสองฝา เช่น Mytilus spp. ถูกใช้กันอย่างแพร่หลายในการติดตามผลกระทบของ CC ต่อระบบนิเวศทางทะเล ไม่น่าแปลกใจที่ไบโอมาร์กเกอร์จำนวนมากได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อติดตามสุขภาพของพวกมัน โดยมักใช้แนวทางสองชั้นที่เกี่ยวข้องกับไบโอมาร์กเกอร์ที่มีหน้าที่ตามกิจกรรมของเอนไซม์หรือการทำงานของเซลล์ เช่น ความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์และกิจกรรมการจับกิน [8] วิธีการเหล่านี้ยังรวมถึงการวัดความเข้มข้นของตัวบ่งชี้ความดันเฉพาะที่สะสมในเนื้อเยื่ออ่อนหลังจากการดูดซึมน้ำทะเลในปริมาณมาก อย่างไรก็ตาม ความสามารถในการกรองที่สูงและระบบไหลเวียนแบบกึ่งเปิดของหอยสองฝาทำให้มีโอกาสในการพัฒนาไบโอมาร์กเกอร์ของเลือดชนิดใหม่โดยใช้แนวคิดของการตรวจชิ้นเนื้อของเหลว (LB) ซึ่งเป็นวิธีการที่เรียบง่ายและรุกรานน้อยที่สุดในการจัดการผู้ป่วย ตัวอย่างเลือด [9, 10] แม้ว่าจะพบโมเลกุลที่หมุนเวียนหลายประเภทใน LB ของมนุษย์ แต่แนวคิดนี้ส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอของชิ้นส่วนดีเอ็นเอนอกเซลล์ที่หมุนเวียน (ccfDNA) ในพลาสมา อันที่จริงแล้ว การมีอยู่ของดีเอ็นเอที่หมุนเวียนในพลาสมาของมนุษย์เป็นที่ทราบกันมาตั้งแต่กลางศตวรรษที่ 20 [11] แต่เพิ่งจะเกิดวิธีการจัดลำดับข้อมูลปริมาณสูงในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมานี้เองที่นำไปสู่การวินิจฉัยทางคลินิกโดยอาศัย ccfDNA การมีอยู่ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่หมุนเวียนเหล่านี้เกิดจากการปลดปล่อยดีเอ็นเอจีโนม (นิวเคลียสและไมโตคอนเดรีย) อย่างเฉื่อยชาหลังจากเซลล์ตาย ในบุคคลที่มีสุขภาพแข็งแรง ความเข้มข้นของ ccfDNA โดยปกติจะต่ำ (<10 ng/mL) แต่สามารถเพิ่มขึ้นได้ 5–10 เท่าในผู้ป่วยที่เป็นโรคต่างๆ หรือผู้ป่วยที่เครียด ซึ่งส่งผลให้เนื้อเยื่อเสียหาย ในบุคคลที่มีสุขภาพแข็งแรง ความเข้มข้นของ ccfDNA โดยปกติจะต่ำ (<10 ng/mL) แต่สามารถเพิ่มขึ้นได้ 5–10 เท่าในผู้ป่วยที่เป็นโรคต่างๆ หรือผู้ป่วยที่เครียด ซึ่งส่งผลให้เนื้อเยื่อเสียหาย У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. ในคนสุขภาพดี ความเข้มข้นของ cccDNA โดยปกติจะต่ำ (<10 ng/mL) แต่ความเข้มข้นอาจเพิ่มขึ้นได้ 5–10 เท่าในผู้ป่วยที่มีโรคต่างๆ หรืออยู่ในภาวะเครียดซึ่งส่งผลให้เนื้อเยื่อเสียหาย在健康个体中，ccfDNA ของ浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10倍，从而导致组织损伤。อยู่ที่ 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中 可 增加 5-10倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. โดยปกติความเข้มข้นของ ccfDNA มักจะต่ำ (<10 ng/ml) ในบุคคลที่มีสุขภาพแข็งแรง แต่สามารถเพิ่มขึ้นได้ 5-10 เท่าในผู้ป่วยที่มีโรคต่างๆ หรือภาวะเครียด ส่งผลให้เนื้อเยื่อเสียหายได้ขนาดของชิ้นส่วน ccfDNA แตกต่างกันมาก แต่โดยปกติแล้วจะอยู่ระหว่าง 150 ถึง 200 bp [12] การวิเคราะห์ ccfDNA ที่ได้จากตัวเอง เช่น ccfDNA จากเซลล์โฮสต์ปกติหรือที่เปลี่ยนแปลงไป สามารถใช้ตรวจหาการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมและเอพิเจเนติกส์ที่มีอยู่ในจีโนมนิวเคลียสและ/หรือไมโตคอนเดรีย จึงช่วยให้แพทย์สามารถเลือกการบำบัดที่กำหนดเป้าหมายที่โมเลกุลเฉพาะได้ [13] อย่างไรก็ตาม ccfDNA สามารถหาได้จากแหล่งต่างประเทศ เช่น ccfDNA จากเซลล์ของทารกในครรภ์ระหว่างตั้งครรภ์หรือจากอวัยวะที่ได้รับการปลูกถ่าย [14,15,16,17] ccfDNA ยังเป็นแหล่งข้อมูลที่สำคัญสำหรับการตรวจหาการมีอยู่ของกรดนิวคลีอิกของตัวการก่อโรค (จากภายนอก) ซึ่งช่วยให้สามารถตรวจจับการติดเชื้อในวงกว้างที่ไม่สามารถระบุได้จากการเพาะเชื้อในเลือดได้แบบไม่รุกราน และหลีกเลี่ยงการตัดชิ้นเนื้อเพื่อตรวจเนื้อเยื่อที่ติดเชื้อ [18] การศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าเลือดมนุษย์มีแหล่งข้อมูลมากมายที่สามารถนำมาใช้ระบุเชื้อก่อโรคไวรัสและแบคทีเรียได้ และพบว่า ccfDNA ประมาณ 1% ที่พบในพลาสมาของมนุษย์มีแหล่งกำเนิดจากต่างประเทศ [19] การศึกษาเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าความหลากหลายทางชีวภาพของไมโครไบโอมที่ไหลเวียนของสิ่งมีชีวิตสามารถประเมินได้โดยใช้การวิเคราะห์ ccfDNA อย่างไรก็ตาม จนกระทั่งเมื่อไม่นานนี้ แนวคิดนี้ใช้เฉพาะในมนุษย์เท่านั้น และใช้ในสัตว์มีกระดูกสันหลังอื่นๆ ในระดับที่น้อยกว่า [20, 21]
ในเอกสารฉบับนี้ เราใช้ศักยภาพของ LB เพื่อวิเคราะห์ ccfDNA ของ Aulacomya atra ซึ่งเป็นสายพันธุ์ทางใต้ที่มักพบในหมู่เกาะ Kerguelen ใต้แอนตาร์กติก ซึ่งเป็นกลุ่มเกาะที่อยู่บนที่ราบสูงขนาดใหญ่ที่ก่อตัวขึ้นเมื่อ 35 ล้านปีก่อน การระเบิดของภูเขาไฟ เราใช้ระบบทดลองในหลอดทดลอง พบว่าชิ้นส่วน DNA ในน้ำทะเลจะถูกหอยแมลงภู่ดูดซับอย่างรวดเร็วและเข้าสู่ช่องฮีโมลิมฟ์ การจัดลำดับแบบ Shotgun แสดงให้เห็นว่าฮีโมลิมฟ์ ccfDNA ของหอยแมลงภู่ประกอบด้วยชิ้นส่วน DNA ที่มีต้นกำเนิดจากตัวเองและจากแหล่งอื่น รวมถึงแบคทีเรียที่อาศัยร่วมกันและชิ้นส่วน DNA จากไบโอมที่พบได้ในระบบนิเวศชายฝั่งทะเลภูเขาไฟเย็น นอกจากนี้ ฮีโมลิมฟ์ ccfDNA ยังมีลำดับไวรัสที่ได้มาจากไวรัสที่มีช่วงโฮสต์ต่างกัน นอกจากนี้ เรายังพบชิ้นส่วน DNA จากสัตว์หลายเซลล์ เช่น ปลากระดูกแข็ง ดอกไม้ทะเล สาหร่าย และแมลง จากการสรุป การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าแนวคิด LB สามารถนำไปประยุกต์ใช้กับสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังในทะเลเพื่อสร้างกลุ่มจีโนมที่หลากหลายในระบบนิเวศทางทะเลได้สำเร็จ
หอยแมลงภู่ Mytilus platensis (M. platensis) ตัวเต็มวัย (ยาว 55-70 มม.) และ Aulacomya atra (A. atra) ถูกเก็บรวบรวมจากชายฝั่งหินระหว่างน้ำขึ้นน้ำลงของ Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .) หมู่เกาะ Kerguelen ในเดือนธันวาคม 2018 หอยแมลงภู่สีน้ำเงินตัวเต็มวัยอื่นๆ (Mytilus spp.) ได้รับมาจากซัพพลายเออร์เชิงพาณิชย์ (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) และนำไปใส่ในถังอากาศที่มีการควบคุมอุณหภูมิ (4°C) ที่บรรจุน้ำเกลือเทียม 32‰ 10-20 ลิตร (เกลือทะเลเทียม Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA) สำหรับการทดลองแต่ละครั้ง จะมีการวัดความยาวและน้ำหนักของเปลือกหอยแต่ละตัว
โปรโตคอลการเข้าถึงแบบเปิดฟรีสำหรับโปรแกรมนี้มีให้ใช้งานทางออนไลน์ (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1) โดยสรุปแล้ว เลือดเหลวของ LB ถูกเก็บรวบรวมจากกล้ามเนื้อที่ดึงออกตามที่อธิบายไว้ [22] เลือดเหลวจะถูกทำให้บริสุทธิ์โดยการปั่นเหวี่ยงที่ 1200×g เป็นเวลา 3 นาที ส่วนที่เป็นของเหลวจะถูกแช่แข็ง (-20°C) จนกว่าจะใช้งาน สำหรับการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของ cfDNA ตัวอย่าง (1.5-2.0 มล.) จะถูกละลายและประมวลผลโดยใช้ชุด cfDNA ของ NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ccfDNA ถูกเก็บไว้ที่ -80°C จนกว่าจะมีการวิเคราะห์เพิ่มเติม ในการทดลองบางอย่าง ccfDNA จะถูกแยกและการทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ชุด QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, โทรอนโต, ออนแทรีโอ, แคนาดา) DNA ที่บริสุทธิ์จะถูกวัดปริมาณโดยใช้วิธีทดสอบ PicoGreen มาตรฐาน การกระจายตัวของชิ้นส่วนของ ccfDNA ที่แยกออกมาจะถูกวิเคราะห์โดยอิเล็กโทรโฟรีซิสแบบแคปิลลารีโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ชีวภาพ Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) โดยใช้ชุดตรวจ DNA ที่มีความไวสูง การทดสอบจะดำเนินการโดยใช้ตัวอย่าง ccfDNA 1 µl ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
เพื่อจัดลำดับชิ้นส่วน ccfDNA ของเลือด Génome Québec (มอนทรีออล ควิเบก แคนาดา) ได้จัดทำไลบรารีแบบช็อตกันโดยใช้ชุด Illumina DNA Mix ของชุด Illumina MiSeq PE75 โดยใช้ตัวแปลงมาตรฐาน (BioO) ไฟล์ข้อมูลดิบมีอยู่ใน NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 และ SRR8924809) คุณภาพการอ่านพื้นฐานได้รับการประเมินโดยใช้ FastQC [23] Trimmomatic [24] ถูกใช้สำหรับการตัดตัวแปลงและการอ่านคุณภาพต่ำ การอ่านแบบช็อตกันที่มีปลายคู่กันจะรวม FLASH เข้ากับการอ่านเดี่ยวที่ยาวขึ้นโดยมีการทับซ้อนขั้นต่ำ 20 bp เพื่อหลีกเลี่ยงความไม่ตรงกัน [25] การอ่านที่รวมกันได้รับการอธิบายด้วย BLASTN โดยใช้ฐานข้อมูล NCBI Taxonomy ของหอยสองฝา (ค่า e < 1e−3 และมีความคล้ายคลึงกัน 90%) และการปกปิดลำดับที่มีความซับซ้อนต่ำดำเนินการโดยใช้ DUST [26] การอ่านที่รวมกันได้รับการอธิบายด้วย BLASTN โดยใช้ฐานข้อมูล NCBI Taxonomy ของหอยสองฝา (ค่า e < 1e−3 และมีความคล้ายคลึงกัน 90%) และการปกปิดลำดับที่มีความซับซ้อนต่ำดำเนินการโดยใช้ DUST [26] Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием ฝุ่น [26]. การอ่านแบบรวมได้รับการอธิบายประกอบด้วย BLASTN โดยใช้ฐานข้อมูลอนุกรมวิธานหอยสองฝา NCBI (ค่า e < 1e-3 และมีความคล้ายคลึงกัน 90%) และทำการปิดบังลำดับที่มีความซับซ้อนต่ำโดยใช้ DUST [26]使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 ฝุ่น [26] 进行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием ฝุ่น [26]. การอ่านแบบรวมได้รับการอธิบายประกอบด้วย BLASTN โดยใช้ฐานข้อมูลทางอนุกรมวิธานหอยสองฝา NCBI (ค่า e <1e-3 และมีความคล้ายคลึงกัน 90%) และทำการปิดบังลำดับที่มีความซับซ้อนต่ำโดยใช้ DUST [26]การอ่านถูกแบ่งออกเป็นสองกลุ่ม: เกี่ยวข้องกับลำดับหอยสองฝา (ที่นี่เรียกว่าการอ่านด้วยตนเอง) และไม่เกี่ยวข้อง (การอ่านด้วยตนเอง) สองกลุ่มถูกประกอบแยกกันโดยใช้ MEGAHIT เพื่อสร้างคอนติก [27] ในขณะเดียวกัน การกระจายทางอนุกรมวิธานของการอ่านไมโครไบโอมต่างดาวได้รับการจำแนกประเภทโดยใช้ Kraken2 [28] และแสดงในรูปแบบกราฟิกด้วยแผนภูมิวงกลมของ Krona บนกาแล็กซี [29, 30] kmers ที่เหมาะสมที่สุดถูกกำหนดให้เป็น kmers-59 จากการทดลองเบื้องต้นของเรา จากนั้นจึงระบุคอนติกของตนเองโดยการจัดตำแหน่งด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล NCBI หอยสองฝา ค่า e < 1e−10 และมีความคล้ายคลึงกัน 60%) สำหรับคำอธิบายประกอบขั้นสุดท้าย จากนั้นจึงระบุคอนติกของตนเองโดยการจัดตำแหน่งด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล NCBI หอยสองฝา ค่า e < 1e−10 และมีความคล้ายคลึงกัน 60%) สำหรับคำอธิบายประกอบขั้นสุดท้าย Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. จากนั้นจึงระบุตัวตนแบบคอนติกด้วยการจับคู่กับ BLASTN (ฐานข้อมูลหอยสองฝา NCBI ค่า e <1e-10 และมีความคล้ายคลึงกัน 60%) เพื่อคำอธิบายประกอบขั้นสุดท้าย然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI) для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). จากนั้นจึงระบุ self-contigs สำหรับคำอธิบายประกอบขั้นสุดท้ายโดยการจับคู่กับ BLASTN (ฐานข้อมูลหอยสองฝา NCBI, ค่า e <1e-10 และมีความคล้ายคลึงกัน 60%) ในแบบคู่ขนาน คอนติกกลุ่มที่ไม่ใช่ตนเองได้รับการอธิบายประกอบด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล nt NCBI, ค่า e < 1e−10 และมีความคล้ายคลึงกัน 60%) ในแบบคู่ขนาน คอนติกกลุ่มที่ไม่ใช่ตนเองได้รับการอธิบายประกอบด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล nt NCBI, ค่า e < 1e−10 และมีความคล้ายคลึงกัน 60%) Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). ในแบบคู่ขนาน คอนติกกลุ่มต่างประเทศได้รับการอธิบายประกอบด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล NT NCBI, ค่า e <1e-10 และมีความคล้ายคลึงกัน 60%)平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение อี <1e-10 и гомология 60%). ในแบบคู่ขนาน คอนติกกลุ่มที่ไม่ใช่ตนเองได้รับการอธิบายประกอบด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล nt NCBI, ค่า e <1e-10 และมีความคล้ายคลึงกัน 60%) นอกจากนี้ BLASTX ยังดำเนินการกับคอนติกที่ไม่ใช่ตนเองโดยใช้ฐานข้อมูล NCBI ของโปรตีน nr และ RefSeq (ค่า e < 1e−10 และมีความคล้ายคลึงกัน 60%) นอกจากนี้ BLASTX ยังดำเนินการกับคอนติกที่ไม่ใช่ตนเองโดยใช้ฐานข้อมูล NCBI ของโปรตีน nr และ RefSeq (ค่า e < 1e−10 และมีความคล้ายคลึงกัน 60%) BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). นอกจากนี้ BLASTX ยังดำเนินการกับคอนติกที่ไม่ใช่ของตนเองโดยใช้ฐานข้อมูลโปรตีน NCBI nr และ RefSeq (ค่า e < 1e-10 และมีความคล้ายคลึงกัน 60%)还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). นอกจากนี้ BLASTX ยังดำเนินการกับคอนติกที่ไม่ใช่ของตนเองโดยใช้ฐานข้อมูลโปรตีน NCBI nr และ RefSeq (ค่า e <1e-10 และมีความคล้ายคลึงกัน 60%)พูล BLASTN และ BLASTX ของคอนติกที่ไม่ขึ้นอยู่กับตัวเองแสดงถึงคอนติกสุดท้าย (ดูไฟล์เสริม)
ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ PCR จะแสดงอยู่ในตาราง S1 ใช้ Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) เพื่อขยายยีนเป้าหมาย ccfDNA เงื่อนไขปฏิกิริยาต่อไปนี้ถูกใช้: การเปลี่ยนสภาพที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 3 นาที 95°C เป็นเวลา 1 นาที ตั้งอุณหภูมิการอบให้คงที่เป็นเวลา 1 นาที ยืดออกที่อุณหภูมิ 72°C เป็นเวลา 1 นาที 35 รอบ และสุดท้ายที่อุณหภูมิ 72°C ภายใน 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกแยกด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสในเจลอะกาโรส (1.5%) ที่มี SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ที่ 95 V
หอยแมลงภู่ (Mytilus spp.) ได้รับการปรับสภาพในน้ำทะเลที่มีออกซิเจน 500 มล. (32 PSU) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4°C ดีเอ็นเอพลาสมิดที่มีอินเซิร์ตที่เข้ารหัสลำดับ cDNA ของกาแลกติน-7 ของมนุษย์ (หมายเลขเข้าถึง NCBI L07769) ถูกเติมลงในขวดที่ความเข้มข้นสุดท้าย 190 μg/μl หอยแมลงภู่ที่ฟักในสภาวะเดียวกันโดยไม่เติมดีเอ็นเอเป็นตัวควบคุม ถังควบคุมที่สามมีดีเอ็นเอที่ไม่มีหอยแมลงภู่ เพื่อตรวจสอบคุณภาพของดีเอ็นเอในน้ำทะเล จึงเก็บตัวอย่างน้ำทะเล (20 μl; 3 ครั้ง) จากแต่ละถังในเวลาที่ระบุ เพื่อการติดตามดีเอ็นเอพลาสมิด หอยแมลงภู่ LB ได้รับการเก็บเกี่ยวในเวลาที่ระบุ และวิเคราะห์โดย qPCR และ ddPCR เนื่องจากน้ำทะเลมีปริมาณเกลือสูง จึงเจือจางส่วนย่อยในน้ำที่มีคุณภาพ PCR (1:10) ก่อนการทดสอบ PCR ทั้งหมด
ดำเนินการ PCR แบบหยดดิจิทัล (ddPCR) โดยใช้โปรโตคอล BioRad QX200 (เมืองมิสซิสซอกา รัฐออนแทรีโอ ประเทศแคนาดา) ใช้โปรไฟล์อุณหภูมิเพื่อกำหนดอุณหภูมิที่เหมาะสม (ตาราง S1) หยดต่างๆ ถูกสร้างขึ้นโดยใช้เครื่องกำเนิดหยด QX200 (BioRad) ดำเนินการ ddPCR ดังนี้: 95°C เป็นเวลา 5 นาที 50 รอบที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 30 วินาที และอุณหภูมิการอบที่กำหนดเป็นเวลา 1 นาที และ 72°C เป็นเวลา 30 วินาที 4°C เป็นเวลา 5 นาที และ 90°C ภายใน 5 นาที จำนวนหยดและปฏิกิริยาเชิงบวก (จำนวนสำเนา/µl) ถูกวัดโดยใช้เครื่องอ่านหยด QX200 (BioRad) ตัวอย่างที่มีหยดน้อยกว่า 10,000 หยดจะถูกปฏิเสธ การควบคุมรูปแบบไม่ได้ดำเนินการทุกครั้งที่ดำเนินการ ddPCR
qPCR ดำเนินการโดยใช้ Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, ซิดนีย์, ออสเตรเลีย) และไพรเมอร์เฉพาะ LGALS7 ทำการ PCR เชิงปริมาณทั้งหมดในปริมาตร 20 µl โดยใช้ QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) เริ่ม qPCR ด้วยการฟักที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 15 นาที ตามด้วยรอบ 40 รอบที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 10 วินาที และที่อุณหภูมิ 60°C เป็นเวลา 60 วินาทีด้วยการรวบรวมข้อมูลหนึ่งครั้ง สร้างเส้นโค้งการหลอมเหลวโดยใช้การวัดต่อเนื่องที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 5 วินาที 65°C เป็นเวลา 60 วินาที และ 97°C เมื่อสิ้นสุด qPCR qPCR แต่ละครั้งดำเนินการซ้ำสามครั้ง ยกเว้นตัวอย่างควบคุม
เนื่องจากหอยแมลงภู่ขึ้นชื่อในเรื่องอัตราการกรองที่สูง เราจึงเริ่มศึกษาก่อนว่าหอยแมลงภู่สามารถกรองและเก็บชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่อยู่ในน้ำทะเลได้หรือไม่ นอกจากนี้ เรายังสนใจด้วยว่าชิ้นส่วนเหล่านี้จะสะสมอยู่ในระบบน้ำเหลืองกึ่งเปิดหรือไม่ เราแก้ปัญหานี้โดยการทดลองติดตามชะตากรรมของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ละลายน้ำได้ที่ใส่ลงไปในถังหอยแมลงภู่สีน้ำเงิน เพื่ออำนวยความสะดวกในการติดตามชิ้นส่วนดีเอ็นเอ เราใช้พลาสมิดดีเอ็นเอจากต่างประเทศ (ไม่ใช่จากตัวเอง) ที่มียีนกาแลกติน-7 ของมนุษย์ ddPCR ติดตามชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากพลาสมิดในน้ำทะเลและหอยแมลงภู่ ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าหากปริมาณของชิ้นส่วนดีเอ็นเอในน้ำทะเลยังคงค่อนข้างคงที่ตลอดเวลา (นานถึง 7 วัน) ในกรณีที่ไม่มีหอยแมลงภู่ ระดับนี้จะหายไปเกือบหมดภายใน 8 ชั่วโมงหากมีหอยแมลงภู่ (รูปที่ 1a,b) สามารถตรวจพบชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากภายนอกได้อย่างง่ายดายภายใน 15 นาทีในของเหลวในช่องลิ้นหัวใจและน้ำเหลืองในเฮโมลิมฟ์ (รูปที่ 1c) ชิ้นส่วนเหล่านี้ยังคงสามารถตรวจพบได้หลังจากสัมผัสนานถึง 4 ชั่วโมง กิจกรรมการกรองที่เกี่ยวข้องกับชิ้นส่วน DNA นี้เทียบได้กับกิจกรรมการกรองของแบคทีเรียและสาหร่าย [31] ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าหอยแมลงภู่สามารถกรองและสะสม DNA แปลกปลอมในช่องของเหลวได้
ความเข้มข้นสัมพันธ์ของดีเอ็นเอพลาสมิดในน้ำทะเลเมื่อมี (A) หรือไม่มี (B) ของหอยแมลงภู่ วัดโดย ddPCR ใน A ผลลัพธ์จะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ โดยขอบของกล่องแสดงเปอร์เซ็นต์ที่ 75 และ 25 กราฟลอการิทึมที่ปรับให้เหมาะสมจะแสดงเป็นสีแดง และพื้นที่ที่แรเงาด้วยสีเทาแสดงช่วงความเชื่อมั่น 95% ใน B เส้นสีแดงแสดงค่าเฉลี่ย และเส้นสีน้ำเงินแสดงช่วงความเชื่อมั่น 95% สำหรับความเข้มข้น C การสะสมของดีเอ็นเอพลาสมิดในเฮโมลิมฟ์และของเหลวในลิ้นหัวใจของหอยแมลงภู่ในเวลาต่างๆ หลังจากเติมดีเอ็นเอพลาสมิด ผลลัพธ์จะแสดงเป็นสำเนาสัมบูรณ์ที่ตรวจพบ/มล. (±SE)
จากนั้น เราได้ตรวจสอบแหล่งกำเนิดของ ccfDNA ในหอยแมลงภู่ที่เก็บมาจากแหล่งหอยแมลงภู่บนเกาะ Kerguelen ซึ่งเป็นกลุ่มเกาะห่างไกลที่มีอิทธิพลจากมนุษย์อย่างจำกัด เพื่อจุดประสงค์นี้ cccDNA จากเลือดของหอยแมลงภู่ถูกแยกและทำให้บริสุทธิ์โดยใช้วิธีการที่ใช้กันทั่วไปในการทำให้ cccDNA ของมนุษย์บริสุทธิ์ [32, 33] เราพบว่าความเข้มข้นของ ccfDNA ในเลือดเฉลี่ยในหอยแมลงภู่อยู่ในช่วงไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรต่ำ (ดูตาราง S2 ข้อมูลเสริม) ช่วงความเข้มข้นนี้มากกว่าในคนปกติมาก (นาโนกรัมต่อมิลลิลิตรต่ำ) แต่ในบางกรณี ในผู้ป่วยมะเร็ง ระดับของ ccfDNA อาจสูงถึงหลายไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร [34, 35] การวิเคราะห์การกระจายขนาดของ ccfDNA ในเลือดแสดงให้เห็นว่าชิ้นส่วนเหล่านี้มีขนาดแตกต่างกันมาก โดยอยู่ระหว่าง 1,000 bp ถึง 1,000 bp สูงถึง 5,000 bp (รูปที่ 2) ได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันโดยใช้ชุด QIAamp Investigator Kit ที่ใช้ซิลิกาเป็นฐาน ซึ่งเป็นวิธีการที่ใช้กันทั่วไปในวิทยาศาสตร์นิติเวชเพื่อแยกและแยก DNA จีโนมออกจากตัวอย่าง DNA ที่มีความเข้มข้นต่ำอย่างรวดเร็ว รวมทั้ง ccfDNA [36]
ตัวแทนอิเล็กโทรโฟเรแกรม ccfDNA ของเฮโมลิมฟ์ของหอยแมลงภู่ สกัดด้วยชุด NucleoSnap Plasma (ด้านบน) และชุด QIAamp DNA Investigator กราฟไวโอลิน B แสดงการกระจายของความเข้มข้นของ ccfDNA ในเฮโมลิมฟ์ (±SE) ในหอยแมลงภู่ เส้นสีดำและสีแดงแสดงค่ามัธยฐานและควอร์ไทล์ที่หนึ่งและสามตามลำดับ
ประมาณ 1% ของ ccfDNA ในมนุษย์และไพรเมตมีแหล่งที่มาจากสิ่งแปลกปลอม [21, 37] เมื่อพิจารณาจากระบบไหลเวียนแบบกึ่งเปิดของหอยสองฝา น้ำทะเลที่มีจุลินทรีย์อุดมสมบูรณ์ และการกระจายขนาดของ ccfDNA ของหอยแมลงภู่ เราตั้งสมมติฐานว่า ccfDNA ของเลือดในหอยแมลงภู่อาจมี DNA ของจุลินทรีย์ที่อุดมสมบูรณ์และหลากหลาย เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ เราได้จัดลำดับ ccfDNA ของเลือดจากตัวอย่าง Aulacomya atra ที่เก็บรวบรวมจากหมู่เกาะ Kerguelen ซึ่งให้ผลการอ่านมากกว่า 10 ล้านครั้ง โดย 97.6% ผ่านการควบคุมคุณภาพ จากนั้นจึงจำแนกการอ่านตามแหล่งที่มาของตนเองและแหล่งที่มาที่ไม่ใช่ของตนเองโดยใช้ฐานข้อมูลหอยสองฝา BLASTN และ NCBI (รูป S1 ข้อมูลเสริม)
ในมนุษย์ DNA ทั้งนิวเคลียสและไมโตคอนเดรียสามารถถูกปล่อยเข้าสู่กระแสเลือดได้ [38] อย่างไรก็ตาม ในการศึกษานี้ ไม่สามารถอธิบาย DNA จีโนมนิวเคลียสของหอยแมลงภู่ได้อย่างละเอียด เนื่องจากจีโนมของ A. atra ยังไม่ผ่านการจัดลำดับหรืออธิบาย อย่างไรก็ตาม เราสามารถระบุชิ้นส่วน ccfDNA ของแหล่งกำเนิดของเราเองได้หลายชิ้นโดยใช้ห้องสมุดหอยสองฝา (รูปที่ S2 ข้อมูลเสริม) นอกจากนี้ เรายังยืนยันการมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA ของแหล่งกำเนิดของเราเองโดยการขยายยีน A. atra ที่ถูกจัดลำดับด้วย PCR (รูปที่ 3) ในทำนองเดียวกัน เนื่องจากจีโนมไมโตคอนเดรียของ A. atra มีอยู่ในฐานข้อมูลสาธารณะ จึงสามารถพบหลักฐานการมีอยู่ของชิ้นส่วน ccfDNA ของไมโตคอนเดรียในเฮโมลิมฟ์ของ A. atra การมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA ของไมโตคอนเดรียได้รับการยืนยันโดยการขยาย PCR (รูปที่ 3)
มียีนไมโตคอนเดรียต่างๆ อยู่ในน้ำเลือดของ A. atra (จุดสีแดง – หมายเลขสต็อก: SRX5705969) และ M. platensis (จุดสีน้ำเงิน – หมายเลขสต็อก: SRX5705968) ที่ขยายโดย PCR รูปภาพดัดแปลงจาก Breton et al., 2011 B การขยายของของเหลวเหนือตะกอนของน้ำเลือดจาก A. atra จัดเก็บบนกระดาษ FTA ใช้ที่เจาะขนาด 3 มม. เติมลงในหลอด PCR ที่มีส่วนผสมของ PCR โดยตรง
เนื่องจากมีจุลินทรีย์จำนวนมากในน้ำทะเล เราจึงมุ่งเน้นไปที่การจำแนกลักษณะลำดับดีเอ็นเอของจุลินทรีย์ในเฮโมลิมฟ์ในเบื้องต้น เพื่อดำเนินการนี้ เราใช้กลยุทธ์ที่แตกต่างกันสองแบบ กลยุทธ์แรกใช้ Kraken2 ซึ่งเป็นโปรแกรมจำแนกลำดับตามอัลกอริทึมที่สามารถระบุลำดับของจุลินทรีย์ได้อย่างแม่นยำเทียบเท่ากับ BLAST และเครื่องมืออื่นๆ [28] มีการระบุการอ่านมากกว่า 6,719 รายการว่าเป็นของแบคทีเรีย ในขณะที่ 124 และ 64 รายการมาจากอาร์เคียและไวรัสตามลำดับ (รูปที่ 4) ชิ้นส่วนดีเอ็นเอของแบคทีเรียที่พบมากที่สุดคือ Firmicutes (46%) Proteobacteria (27%) และ Bacteroidetes (17%) (รูปที่ 4a) การกระจายนี้สอดคล้องกับการศึกษาไมโครไบโอมของหอยแมลงภู่ทะเลก่อนหน้านี้ [39, 40] Gammaproteobacteria เป็นกลุ่มหลักของ Proteobacteria (44%) รวมถึง Vibrionales จำนวนมาก (รูปที่ 4b) วิธี ddPCR ยืนยันการมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA ของ Vibrio ใน ccfDNA ของ A. atra hemolymph (รูปที่ 4c) [41] เพื่อให้ได้ข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับแหล่งกำเนิดแบคทีเรียของ ccfDNA จึงได้ใช้วิธีการเพิ่มเติม (รูปที่ S2 ข้อมูลเสริม) ในกรณีนี้ การอ่านที่ทับซ้อนกันนั้นจะถูกประกอบเป็นการอ่านแบบปลายคู่ และจะถูกจำแนกประเภทว่าเป็นการอ่านแบบมีต้นกำเนิดจากตัวเอง (หอยสองฝา) หรือไม่มีต้นกำเนิดจากตัวเอง โดยใช้ BLASTN และค่า e ที่ 1e−3 และค่าตัดขาดที่มีความคล้ายคลึงกันมากกว่า 90% ในกรณีนี้ การอ่านที่ทับซ้อนกันนั้นจะถูกประกอบเป็นการอ่านแบบปลายคู่ และจะถูกจำแนกประเภทว่าเป็นการอ่านแบบมีต้นกำเนิดจากตัวเอง (หอยสองฝา) หรือไม่มีต้นกำเนิดจากตัวเอง โดยใช้ BLASTN และค่า e ที่ 1e−3 และค่าตัดขาดที่มีความคล้ายคลึงกันมากกว่า 90% В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как. собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с โกโมโลจิสติก> 90% ในกรณีนี้ การอ่านที่ทับซ้อนกันจะถูกเก็บรวบรวมเป็นการอ่านแบบปลายคู่ และจะถูกจำแนกประเภทให้เป็นแบบดั้งเดิม (หอยสองฝา) หรือไม่ใช่ต้นฉบับ โดยใช้ค่า BLASTN และ e ที่ 1e-3 และค่าตัดขาดด้วยความคล้ายคลึงมากกว่า 90%在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。อยู่ที่ 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные. (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога กอมอลโลจี> 90% ในกรณีนี้ การอ่านที่ทับซ้อนกันจะถูกเก็บรวบรวมเป็นการอ่านแบบปลายคู่ และจำแนกเป็นของตนเอง (หอยสองฝา) หรือไม่ใช่ต้นฉบับ โดยใช้ค่า e BLASTN และ 1e-3 และเกณฑ์ความคล้ายคลึงกัน >90%เนื่องจากจีโนมของ A. atra ยังไม่ได้ถูกถอดรหัส เราจึงใช้กลยุทธ์การประกอบใหม่ของเครื่องประกอบ MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) คอนติกทั้งหมด 147,188 คอนติกได้รับการระบุว่าเป็นหอยสองฝาที่ขึ้นกับแหล่งกำเนิด จากนั้นคอนติกเหล่านี้จะถูกแยกย่อยด้วยค่า e 1e-10 โดยใช้ BLASTN และ BLASTX กลยุทธ์นี้ทำให้เราสามารถระบุชิ้นส่วนที่ไม่ใช่หอยสองฝา 482 ชิ้นที่มีอยู่ใน ccfDNA ของ A. atra ได้ ชิ้นส่วน DNA เหล่านี้มากกว่าครึ่งหนึ่ง (57%) ได้มาจากแบคทีเรีย โดยส่วนใหญ่มาจากซิมไบโอนเหงือก รวมถึงซิมไบโอนซัลโฟโทรฟิก และจากซิมไบโอนเหงือก Solemya velum (รูปที่ 5)
ความอุดมสมบูรณ์สัมพันธ์ที่ระดับประเภท B ความหลากหลายของจุลินทรีย์ในไฟลาหลักสองไฟลา (Firmicutes และ Proteobacteria) การขยายพันธุ์แบบตัวแทนของ ddPCR C Vibrio spp. A ชิ้นส่วนของยีน 16S rRNA (สีน้ำเงิน) ในเฮโมลิมฟ์สามแห่ง
มีการวิเคราะห์คอนติกที่รวบรวมได้ทั้งหมด 482 รายการ โปรไฟล์ทั่วไปของการกระจายทางอนุกรมวิธานของคำอธิบายคอนติกเมตาจีโนม (โพรคาริโอตและยูคาริโอต) B การกระจายโดยละเอียดของชิ้นส่วน DNA ของแบคทีเรียที่ระบุโดย BLASTN และ BLASTX
การวิเคราะห์ Kraken2 ยังแสดงให้เห็นว่า ccfDNA ของหอยแมลงภู่มีชิ้นส่วน DNA โบราณ รวมถึงชิ้นส่วน DNA ของ Euryarchaeota (65%) Crenarchaeota (24%) และ Thaurmarcheota (11%) (รูปที่ 6a) การมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA ที่ได้จาก Euryarchaeota และ Crenarchaeota ซึ่งพบก่อนหน้านี้ในชุมชนจุลินทรีย์ของหอยแมลงภู่แคลิฟอร์เนียไม่ควรเป็นเรื่องน่าประหลาดใจ [42] แม้ว่า Euryarchaeota มักเกี่ยวข้องกับสภาวะที่รุนแรง แต่ปัจจุบันได้รับการยอมรับแล้วว่าทั้ง Euryarchaeota และ Crenarcheota อยู่ในกลุ่มโพรคาริโอตที่พบได้บ่อยที่สุดในสภาพแวดล้อมที่เย็นจัดของทะเล [43, 44] การมีอยู่ของจุลินทรีย์สร้างมีเทนในหอยแมลงภู่ไม่ใช่เรื่องน่าประหลาดใจ เนื่องจากมีรายงานล่าสุดเกี่ยวกับการรั่วไหลของมีเทนจำนวนมากจากการรั่วไหลที่ก้นทะเลบนที่ราบสูง Kerguelen [45] และการผลิตมีเทนจากจุลินทรีย์ที่อาจเกิดขึ้นได้นอกชายฝั่งของหมู่เกาะ Kerguelen [46]
จากนั้นความสนใจของเราก็เปลี่ยนไปที่การอ่านค่าจากไวรัส DNA เท่าที่เรารู้ นี่เป็นการศึกษานอกเป้าหมายครั้งแรกเกี่ยวกับปริมาณไวรัสในหอยแมลงภู่ ตามที่คาดไว้ เราพบชิ้นส่วน DNA ของแบคทีเรียโฟจ (Caudovirales) (รูปที่ 6b) อย่างไรก็ตาม DNA ของไวรัสที่พบมากที่สุดมาจากไฟลัมของนิวคลีโอไซโตไวรัส ซึ่งเรียกอีกอย่างว่าไวรัส DNA ขนาดใหญ่ไซโตพลาสมิกนิวเคลียร์ (NCLDV) ซึ่งมีจีโนมที่ใหญ่ที่สุดในบรรดาไวรัสทั้งหมด ภายในไฟลัมนี้ ลำดับ DNA ส่วนใหญ่จัดอยู่ในวงศ์ Mimimidoviridae (58%) และ Poxviridae (21%) ซึ่งมีสัตว์มีกระดูกสันหลังและสัตว์ขาปล้องเป็นโฮสต์ตามธรรมชาติ ในขณะที่ลำดับ DNA เหล่านี้ส่วนเล็กน้อยจัดอยู่ในสาหร่ายไวรัสที่รู้จัก ไวรัสชนิดนี้แพร่เชื้อไปยังสาหร่ายยูคาริโอตในทะเล ลำดับ DNA ยังได้รับมาจากไวรัสแพนโดรา ซึ่งเป็นไวรัสยักษ์ที่มีขนาดจีโนมใหญ่ที่สุดในบรรดาไวรัสสกุลอื่นๆ ที่รู้จัก ที่น่าสนใจคือ ช่วงของโฮสต์ที่ทราบว่าติดเชื้อไวรัส ซึ่งกำหนดโดยการจัดลำดับ ccfDNA ของเลือดนั้นค่อนข้างกว้าง (รูปภาพ S3 ข้อมูลเสริม) ซึ่งรวมถึงไวรัสที่ติดเชื้อแมลง เช่น Baculoviridae และ Iridoviridae ตลอดจนไวรัสที่ติดเชื้ออะมีบา สาหร่าย และสัตว์มีกระดูกสันหลัง นอกจากนี้ เรายังพบลำดับที่ตรงกับจีโนมของ Pithovirus sibericum อีกด้วย โดยแยก Pitovirus (หรือที่เรียกว่า "ไวรัสซอมบี้") ครั้งแรกจากชั้นดินเยือกแข็งอายุ 30,000 ปีในไซบีเรีย [47] ดังนั้น ผลลัพธ์ของเราจึงสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ที่แสดงให้เห็นว่าไวรัสสายพันธุ์ใหม่เหล่านี้ไม่ได้สูญพันธุ์ทั้งหมด [48] และไวรัสเหล่านี้อาจพบอยู่ในระบบนิเวศทางทะเลซับอาร์กติกที่ห่างไกล
ในที่สุด เราได้ทดสอบเพื่อดูว่าเราสามารถค้นหาชิ้นส่วน DNA จากสัตว์หลายเซลล์ชนิดอื่นได้หรือไม่ โดย BLASTN และ BLASTX ได้ระบุคอนติกต่างถิ่นทั้งหมด 482 รายการด้วยไลบรารี nt, nr และ RefSeq (จีโนมและโปรตีน) ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าในบรรดาชิ้นส่วนต่างถิ่นของ ccfDNA ของสัตว์หลายเซลล์นั้น DNA ของกระดูกเป็นส่วนใหญ่ (รูปที่ 5) นอกจากนี้ยังพบชิ้นส่วน DNA จากแมลงและสปีชีส์อื่นอีกด้วย ชิ้นส่วน DNA ส่วนใหญ่ไม่ได้รับการระบุ ซึ่งอาจเป็นเพราะฐานข้อมูลจีโนมมีสปีชีส์ทางทะเลไม่มากนักเมื่อเทียบกับสปีชีส์บนบก [49]
ในเอกสารฉบับนี้ เราใช้แนวคิด LB กับหอยแมลงภู่ โดยให้เหตุผลว่าการจัดลำดับยีนด้วย ccfDNA ของเฮโมลิมฟ์สามารถให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับองค์ประกอบของระบบนิเวศชายฝั่งทะเลได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราพบว่า 1) เฮโมลิมฟ์ของหอยแมลงภู่มีชิ้นส่วนดีเอ็นเอหมุนเวียนในปริมาณค่อนข้างสูง (ระดับไมโครกรัม) (~1-5 kb) 2) ชิ้นส่วนดีเอ็นเอเหล่านี้ทั้งเป็นอิสระและไม่เป็นอิสระ 3) ในบรรดาแหล่งดีเอ็นเอแปลกปลอมเหล่านี้ เราพบดีเอ็นเอของแบคทีเรีย โบราณ และไวรัส รวมถึงดีเอ็นเอของสัตว์หลายเซลล์อื่นๆ 4) การสะสมของชิ้นส่วน ccfDNA แปลกปลอมเหล่านี้ในเฮโมลิมฟ์เกิดขึ้นอย่างรวดเร็วและส่งผลต่อกิจกรรมการกรองภายในของหอยแมลงภู่ จากการสรุป การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าแนวคิดของ LB ซึ่งได้มีการนำมาใช้ในสาขาชีวการแพทย์เป็นหลักจนถึงปัจจุบัน เป็นแหล่งความรู้ที่มีคุณค่าแต่ยังไม่ได้รับการสำรวจ ซึ่งสามารถใช้เพื่อทำความเข้าใจปฏิสัมพันธ์ระหว่างสายพันธุ์เฝ้ายามและสภาพแวดล้อมของพวกมันได้ดียิ่งขึ้น
นอกจากไพรเมตแล้ว ยังมีรายงานการแยก ccfDNA ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เช่น หนู สุนัข แมว และม้า [50, 51, 52] อย่างไรก็ตาม จากความรู้ของเรา การศึกษาของเราเป็นการศึกษาแรกที่รายงานการตรวจจับและการจัดลำดับ ccfDNA ในสัตว์ทะเลที่มีระบบไหลเวียนแบบเปิด ลักษณะทางกายวิภาคและความสามารถในการกรองของหอยแมลงภู่ อาจอธิบายลักษณะขนาดที่แตกต่างกันของชิ้นส่วน DNA ที่ไหลเวียนเมื่อเทียบกับสัตว์ชนิดอื่นได้อย่างน้อยก็บางส่วน ในมนุษย์ ชิ้นส่วน DNA ส่วนใหญ่ที่ไหลเวียนในเลือดเป็นชิ้นส่วนขนาดเล็กที่มีขนาดตั้งแต่ 150 ถึง 200 bp โดยมีจุดสูงสุดที่ 167 bp [34, 53] ชิ้นส่วน DNA บางส่วนที่มีขนาดเล็กแต่มีนัยสำคัญมีขนาดระหว่าง 300 ถึง 500 bp และประมาณ 5% มีความยาวมากกว่า 900 bp [54] เหตุผลของการกระจายขนาดนี้ก็คือ แหล่งหลักของ ccfDNA ในพลาสมาเกิดขึ้นจากการตายของเซลล์ ซึ่งอาจเกิดขึ้นจากการตายของเซลล์หรือจากการตายของเซลล์ของเซลล์เม็ดเลือดที่ไหลเวียนอยู่ในบุคคลที่มีสุขภาพดี หรือจากการตายของเซลล์เนื้องอกในผู้ป่วยมะเร็ง (เรียกว่า DNA ของเนื้องอกที่ไหลเวียน) การกระจายขนาดของ ccfDNA ของเฮโมลิมฟ์ที่เราพบในหอยแมลงภู่มีตั้งแต่ 1,000 ถึง 5,000 bp ซึ่งแสดงให้เห็นว่า ccfDNA ของหอยแมลงภู่มีต้นกำเนิดที่แตกต่างกัน นี่เป็นสมมติฐานเชิงตรรกะ เนื่องจากหอยแมลงภู่มีระบบหลอดเลือดกึ่งเปิดและอาศัยอยู่ในสภาพแวดล้อมทางน้ำที่มี DNA ของจุลินทรีย์ในความเข้มข้นสูง ในความเป็นจริง การทดลองในห้องปฏิบัติการของเราโดยใช้ DNA จากภายนอกได้แสดงให้เห็นว่าหอยแมลงภู่สะสมชิ้นส่วน DNA ในน้ำทะเล อย่างน้อยหลังจากผ่านไปไม่กี่ชั่วโมง ชิ้นส่วน DNA จะถูกย่อยสลายหลังจากการดูดซึมเข้าเซลล์ และ/หรือถูกปลดปล่อยและ/หรือถูกเก็บไว้ในองค์กรต่างๆ เนื่องจากเซลล์ (ทั้งแบบโพรคาริโอตและยูคาริโอต) มีน้อย การใช้ช่องภายในลิ้นหัวใจจะช่วยลดปริมาณ ccfDNA จากแหล่งของตัวเองและจากแหล่งอื่น เมื่อพิจารณาถึงความสำคัญของภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดของหอยสองฝาและจำนวนเซลล์ฟาโกไซต์ที่หมุนเวียนอยู่จำนวนมาก เราจึงตั้งสมมติฐานเพิ่มเติมว่าแม้แต่ ccfDNA จากแหล่งอื่นก็ยังเพิ่มขึ้นในเซลล์ฟาโกไซต์ที่หมุนเวียนอยู่ซึ่งสะสม DNA จากแหล่งอื่นเมื่อกินจุลินทรีย์และ/หรือเศษเซลล์ เมื่อพิจารณาโดยรวมแล้ว ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่า ccfDNA จากเฮโมลิมฟ์ของหอยสองฝาเป็นแหล่งเก็บข้อมูลโมเลกุลเฉพาะตัวและเสริมสถานะของเซลล์เหล่านี้ในฐานะสปีชีส์เฝ้าระวัง
ข้อมูลของเราบ่งชี้ว่าการจัดลำดับและการวิเคราะห์ชิ้นส่วน ccfDNA ของเลือดที่ได้จากแบคทีเรียสามารถให้ข้อมูลสำคัญเกี่ยวกับแบคทีเรียในโฮสต์และแบคทีเรียที่มีอยู่ในระบบนิเวศทางทะเลโดยรอบ เทคนิคการจัดลำดับแบบช็อตได้เปิดเผยลำดับของแบคทีเรียคอมเมนซัล A. atra gill ที่จะหายไปหากใช้วิธีการระบุด้วย 16S rRNA แบบเดิม ซึ่งส่วนหนึ่งเป็นเพราะอคติจากห้องสมุดอ้างอิง ในความเป็นจริง การใช้ข้อมูล LB ที่รวบรวมจาก M. platensis ในชั้นหอยแมลงภู่เดียวกันที่ Kerguelen แสดงให้เห็นว่าองค์ประกอบของซิมไบโอนต์แบคทีเรียที่เกี่ยวข้องกับเหงือกนั้นเหมือนกันสำหรับหอยแมลงภู่ทั้งสองสายพันธุ์ (รูปที่ S4 ข้อมูลเสริม) ความคล้ายคลึงกันของหอยแมลงภู่สองสายพันธุ์ที่มีพันธุกรรมต่างกันนี้อาจสะท้อนถึงองค์ประกอบของชุมชนแบคทีเรียในแหล่งตะกอนที่หนาวเย็น มีกำมะถัน และภูเขาไฟของ Kerguelen [55, 56, 57, 58] มีการอธิบายระดับจุลินทรีย์ที่ลดกำมะถันในระดับสูงไว้อย่างชัดเจนเมื่อเก็บเกี่ยวหอยแมลงภู่จากพื้นที่ชายฝั่งที่มีการปนเปื้อนทางชีวภาพ [59] เช่น ชายฝั่งปอร์โตฟรองซ์ อีกความเป็นไปได้คือพืชในหอยแมลงภู่คอมเมนซัลอาจได้รับผลกระทบจากการแพร่กระจายในแนวนอน [60, 61] จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อพิจารณาความสัมพันธ์ระหว่างสภาพแวดล้อมทางทะเล พื้นผิวท้องทะเล และองค์ประกอบของแบคทีเรียที่อาศัยร่วมกันในหอยแมลงภู่ ปัจจุบันการศึกษาเหล่านี้กำลังดำเนินการอยู่
ความยาวและความเข้มข้นของ ccfDNA ของเลือด ความสะดวกในการทำให้บริสุทธิ์ และคุณภาพสูงที่ช่วยให้สามารถจัดลำดับยีนแบบช็อตกันได้อย่างรวดเร็ว เป็นข้อดีบางประการจากการใช้ ccfDNA ของหอยแมลงภู่ในการประเมินความหลากหลายทางชีวภาพในระบบนิเวศชายฝั่งทะเล แนวทางนี้มีประสิทธิภาพโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการระบุลักษณะของชุมชนไวรัส (ไวรัส) ในระบบนิเวศที่กำหนด [62, 63] ซึ่งแตกต่างจากแบคทีเรีย อาร์เคีย และยูคาริโอต จีโนมของไวรัสไม่มียีนที่ได้รับการอนุรักษ์ทางสายวิวัฒนาการ เช่น ลำดับ 16S ผลการศึกษาของเราบ่งชี้ว่าชิ้นเนื้อของเหลวจากสปีชีส์ตัวบ่งชี้ เช่น หอยแมลงภู่ สามารถใช้ระบุชิ้นส่วนไวรัส ccfDNA จำนวนมากที่ทราบว่าติดเชื้อโฮสต์ที่มักอาศัยอยู่ในระบบนิเวศชายฝั่งทะเล ซึ่งรวมถึงไวรัสที่ทราบว่าติดเชื้อโปรโตซัว สัตว์ขาปล้อง แมลง พืช และไวรัสแบคทีเรีย (เช่น แบคทีเรียโฟจ) พบว่าการกระจายตัวที่คล้ายกันเมื่อเราตรวจสอบไวรัส ccfDNA ของเฮโมลิมฟ์ในหอยแมลงภู่สีน้ำเงิน (M. platensis) ที่เก็บรวบรวมในชั้นหอยแมลงภู่เดียวกันที่ Kerguelen (ตาราง S2, ข้อมูลเสริม) การจัดลำดับ ccfDNA แบบช็อตกันเป็นแนวทางใหม่ที่ได้รับแรงผลักดันในการศึกษาไวรัสของมนุษย์หรือสปีชีส์อื่น [21, 37, 64] แนวทางนี้มีประโยชน์โดยเฉพาะในการศึกษาไวรัส DNA สายคู่ เนื่องจากไม่มียีนเดี่ยวที่อนุรักษ์ไว้ในไวรัส DNA สายคู่ทั้งหมด ซึ่งเป็นกลุ่มไวรัสที่มีความหลากหลายและกว้างที่สุดในบัลติมอร์ [65] แม้ว่าไวรัสเหล่านี้ส่วนใหญ่จะยังไม่ได้รับการจำแนกประเภทและอาจรวมถึงไวรัสจากส่วนที่ไม่รู้จักเลยของโลกไวรัส [66] แต่เราพบว่าไวรัสและช่วงโฮสต์ของหอยแมลงภู่ A. atra และ M. platensis อยู่ในกลุ่มระหว่างสองสปีชีส์ในลักษณะเดียวกัน (ดูรูป S3 ข้อมูลเพิ่มเติม) ความคล้ายคลึงกันนี้ไม่ใช่เรื่องน่าแปลกใจ เนื่องจากอาจสะท้อนถึงการขาดการคัดเลือกในการดูดซึม DNA ที่มีอยู่ในสิ่งแวดล้อม ปัจจุบันจำเป็นต้องมีการศึกษาในอนาคตโดยใช้ RNA ที่บริสุทธิ์เพื่อระบุลักษณะของไวรัส RNA
ในการศึกษาของเรา เราใช้ขั้นตอนที่เข้มงวดมากซึ่งดัดแปลงมาจากงานของ Kowarski และเพื่อนร่วมงาน [37] ซึ่งใช้การลบข้อมูลแบบสองขั้นตอนของข้อมูลรวมและคอนติกก่อนและหลังการประกอบ ccfDNA ดั้งเดิม ส่งผลให้มีข้อมูลที่ไม่ได้แมปในสัดส่วนสูง ดังนั้น เราไม่สามารถตัดทิ้งได้ว่าข้อมูลที่ไม่ได้แมปบางส่วนเหล่านี้อาจยังคงมีต้นกำเนิดของตัวเอง เนื่องจากเราไม่มีจีโนมอ้างอิงสำหรับหอยแมลงภู่สายพันธุ์นี้ นอกจากนี้ เรายังใช้ขั้นตอนนี้เนื่องจากเรากังวลเกี่ยวกับไคเมร่าระหว่างข้อมูลตนเองและข้อมูลที่ไม่เป็นตนเอง และความยาวของข้อมูลที่สร้างขึ้นโดย Illumina MiSeq PE75 อีกเหตุผลหนึ่งที่ข้อมูลส่วนใหญ่ไม่ได้รับการแมปคือจุลินทรีย์ในทะเลจำนวนมาก โดยเฉพาะในพื้นที่ห่างไกล เช่น เคอร์เกเลน ไม่ได้รับการอธิบายประกอบ เราใช้ Illumina MiSeq PE75 โดยถือว่าความยาวของชิ้นส่วน ccfDNA ใกล้เคียงกับ ccfDNA ของมนุษย์ สำหรับการศึกษาในอนาคต เมื่อพิจารณาจากผลการศึกษาของเราที่แสดงให้เห็นว่า ccfDNA ของเฮโมลิมฟ์มีระยะการอ่านที่ยาวนานกว่าของมนุษย์และ/หรือสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เราขอแนะนำให้ใช้แพลตฟอร์มการจัดลำดับที่เหมาะสมกว่าสำหรับชิ้นส่วน ccfDNA ที่ยาวกว่า การปฏิบัตินี้จะทำให้ระบุข้อบ่งชี้เพิ่มเติมได้ง่ายขึ้นมากสำหรับการวิเคราะห์เชิงลึก การได้รับลำดับจีโนมนิวเคลียร์ A. atra ที่สมบูรณ์ซึ่งไม่มีให้บริการในปัจจุบันยังช่วยให้สามารถแยกแยะ ccfDNA จากแหล่งที่มาของตนเองและจากแหล่งอื่นได้เป็นอย่างมาก เนื่องจากการวิจัยของเราเน้นไปที่ความเป็นไปได้ของการนำแนวคิดของการตรวจชิ้นเนื้อในของเหลวไปใช้กับหอยแมลงภู่ เราหวังว่าเมื่อแนวคิดนี้ถูกนำมาใช้ในการวิจัยในอนาคต เครื่องมือและขั้นตอนการทำงานใหม่ๆ จะได้รับการพัฒนาเพื่อเพิ่มศักยภาพของวิธีนี้ในการศึกษาความหลากหลายของจุลินทรีย์ในหอยแมลงภู่ ระบบนิเวศทางทะเล
เนื่องจากเป็นไบโอมาร์กเกอร์ทางคลินิกที่ไม่รุกราน ระดับ ccfDNA ในพลาสมาของมนุษย์ที่สูงจึงเกี่ยวข้องกับโรคต่างๆ ความเสียหายของเนื้อเยื่อ และสภาวะเครียด [67,68,69] การเพิ่มขึ้นนี้เกี่ยวข้องกับการปลดปล่อยชิ้นส่วน DNA ของต้นกำเนิดของมันเองหลังจากเนื้อเยื่อได้รับความเสียหาย เราแก้ไขปัญหานี้โดยใช้ความเครียดจากความร้อนเฉียบพลัน ซึ่งหอยแมลงภู่จะถูกสัมผัสกับอุณหภูมิ 30 °C เป็นเวลาสั้นๆ เราได้ทำการวิเคราะห์นี้กับหอยแมลงภู่สามประเภทในสามการทดลองอิสระ อย่างไรก็ตาม เราไม่พบการเปลี่ยนแปลงใดๆ ในระดับ ccfDNA หลังจากความเครียดจากความร้อนเฉียบพลัน (ดูรูปที่ S5 ข้อมูลเพิ่มเติม) การค้นพบนี้อาจอธิบายได้อย่างน้อยบางส่วนว่าหอยแมลงภู่มีระบบไหลเวียนเลือดแบบกึ่งเปิดและสะสม DNA แปลกปลอมในปริมาณมากเนื่องจากกิจกรรมการกรองที่สูง ในทางกลับกัน หอยแมลงภู่ เช่นเดียวกับสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังหลายชนิด อาจต้านทานต่อความเสียหายของเนื้อเยื่อที่เกิดจากความเครียดได้ดีกว่า จึงจำกัดการปล่อย ccfDNA ในเฮโมลิมฟ์ของพวกมัน [70, 71]
จนถึงปัจจุบัน การวิเคราะห์ DNA ของความหลากหลายทางชีวภาพในระบบนิเวศทางน้ำนั้นมุ่งเน้นไปที่เมตาบาร์โคดิ้งของ DNA สิ่งแวดล้อม (eDNA) เป็นหลัก อย่างไรก็ตาม วิธีนี้มักมีข้อจำกัดในการวิเคราะห์ความหลากหลายทางชีวภาพเมื่อใช้ไพรเมอร์ การใช้การจัดลำดับแบบช็อตกันช่วยหลีกเลี่ยงข้อจำกัดของ PCR และการเลือกชุดไพรเมอร์แบบลำเอียง ดังนั้น ในแง่หนึ่ง วิธีของเราจึงใกล้เคียงกับวิธีการจัดลำดับ eDNA Shotgun ที่มีปริมาณงานสูงที่ใช้ล่าสุด ซึ่งสามารถจัดลำดับ DNA ที่แตกเป็นชิ้นเล็กชิ้นน้อยได้โดยตรงและวิเคราะห์สิ่งมีชีวิตเกือบทั้งหมด [72, 73] อย่างไรก็ตาม มีปัญหาพื้นฐานหลายประการที่ทำให้ LB แตกต่างจากวิธี eDNA มาตรฐาน แน่นอนว่าความแตกต่างหลักระหว่าง eDNA และ LB คือการใช้โฮสต์ตัวกรองตามธรรมชาติ มีการรายงานการใช้สิ่งมีชีวิตในทะเล เช่น ฟองน้ำและหอยสองฝา (Dresseina spp.) เป็นตัวกรองตามธรรมชาติในการศึกษา eDNA [74, 75] อย่างไรก็ตาม การศึกษาของ Dreissena ใช้ชิ้นเนื้อเนื้อเยื่อที่สกัด DNA ออกมา การวิเคราะห์ ccfDNA จาก LB ไม่จำเป็นต้องมีการตัดชิ้นเนื้อ อุปกรณ์เฉพาะทางและบางครั้งมีราคาแพง รวมถึงการขนส่งที่เกี่ยวข้องกับ eDNA หรือการตัดชิ้นเนื้อเนื้อเยื่อ ในความเป็นจริง เราได้รายงานเมื่อไม่นานนี้ว่า ccfDNA จาก LB สามารถจัดเก็บและวิเคราะห์ได้ด้วยการสนับสนุน FTA โดยไม่ต้องรักษาห่วงโซ่ความเย็น ซึ่งเป็นความท้าทายที่สำคัญสำหรับการวิจัยในพื้นที่ห่างไกล [76] การสกัด ccfDNA จากชิ้นเนื้อของเหลวก็ทำได้ง่ายเช่นกัน และให้ DNA คุณภาพสูงสำหรับการจัดลำดับแบบช็อตกันและการวิเคราะห์ PCR ถือเป็นข้อได้เปรียบที่ยอดเยี่ยมเมื่อพิจารณาจากข้อจำกัดทางเทคนิคบางประการที่เกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์ eDNA [77] ความเรียบง่ายและต้นทุนต่ำของวิธีการสุ่มตัวอย่างยังเหมาะเป็นพิเศษสำหรับโปรแกรมการติดตามในระยะยาว นอกเหนือจากความสามารถในการกรองที่สูงแล้ว คุณสมบัติที่รู้จักกันดีอีกประการหนึ่งของหอยสองฝาคือองค์ประกอบทางเคมีของมิวโคโพลีแซ็กคาไรด์ในเมือก ซึ่งส่งเสริมการดูดซึมของไวรัส [78, 79] ซึ่งทำให้หอยสองฝาเป็นตัวกรองตามธรรมชาติในอุดมคติสำหรับการกำหนดลักษณะความหลากหลายทางชีวภาพและผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศในระบบนิเวศทางน้ำที่กำหนด แม้ว่าการมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA ที่ได้จากโฮสต์อาจถือเป็นข้อจำกัดของวิธีการนี้เมื่อเทียบกับ eDNA แต่ค่าใช้จ่ายที่เกี่ยวข้องกับการมี ccfDNA ดั้งเดิมดังกล่าวเมื่อเทียบกับ eDNA นั้นสามารถเข้าใจได้พร้อมกันสำหรับปริมาณข้อมูลจำนวนมากที่มีให้สำหรับการศึกษาสุขภาพ ซึ่งรวมถึงการมีลำดับไวรัสที่รวมเข้ากับจีโนมของโฮสต์โฮสต์ สิ่งนี้มีความสำคัญโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับหอยแมลงภู่ เนื่องจากมีไวรัสเรโทรมะเร็งเม็ดเลือดขาวที่ถ่ายทอดในแนวนอนในหอยสองฝา [80, 81] ข้อดีอีกประการของ LB เมื่อเทียบกับ eDNA ก็คือมันใช้ประโยชน์จากกิจกรรมการจับกินของเซลล์เม็ดเลือดที่หมุนเวียนอยู่ในน้ำเหลืองซึ่งกลืนกินจุลินทรีย์ (และจีโนมของจุลินทรีย์เหล่านั้น) การจับกินเป็นหน้าที่หลักของเซลล์เม็ดเลือดในหอยสองฝา [82] ในที่สุด วิธีการดังกล่าวใช้ประโยชน์จากความสามารถในการกรองสูงของหอยแมลงภู่ (เฉลี่ย 1.5 ลิตรต่อชั่วโมงของน้ำทะเล) และการหมุนเวียนสองวัน ซึ่งเพิ่มการผสมของชั้นน้ำทะเลที่แตกต่างกัน ทำให้สามารถจับ eDNA ต่างสายพันธุ์ได้ [83, 84] ดังนั้น การวิเคราะห์ ccfDNA ของหอยแมลงภู่จึงเป็นแนวทางที่น่าสนใจเมื่อพิจารณาถึงผลกระทบด้านโภชนาการ เศรษฐกิจ และสิ่งแวดล้อมของหอยแมลงภู่ วิธีนี้ยังเปิดโอกาสให้วัดการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมและเอพิเจเนติกส์ในดีเอ็นเอของโฮสต์ในการตอบสนองต่อสารภายนอกเช่นเดียวกับการวิเคราะห์ LB ที่เก็บจากมนุษย์ ตัวอย่างเช่น เทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นที่สามสามารถนำไปใช้ในการวิเคราะห์เมทิลเลชันทั่วทั้งจีโนมใน ccfDNA ดั้งเดิมโดยใช้การจัดลำดับนาโนพอร์ กระบวนการนี้ควรได้รับการอำนวยความสะดวกจากข้อเท็จจริงที่ว่าความยาวของชิ้นส่วน ccfDNA ของหอยแมลงภู่เข้ากันได้ดีกับแพลตฟอร์มการจัดลำดับแบบอ่านยาวซึ่งช่วยให้วิเคราะห์เมทิลเลชันของดีเอ็นเอทั่วทั้งจีโนมจากการดำเนินการจัดลำดับเพียงครั้งเดียวโดยไม่จำเป็นต้องทำการเปลี่ยนแปลงทางเคมี85,86] นี่เป็นความเป็นไปได้ที่น่าสนใจ เนื่องจากได้แสดงให้เห็นแล้วว่ารูปแบบเมทิลเลชันของดีเอ็นเอสะท้อนถึงการตอบสนองต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อมและคงอยู่ต่อไปหลายชั่วอายุคน ดังนั้น จึงสามารถให้ข้อมูลเชิงลึกอันมีค่าเกี่ยวกับกลไกพื้นฐานที่ควบคุมการตอบสนองหลังจากสัมผัสกับการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศหรือมลพิษ [87] อย่างไรก็ตาม การใช้ LB ก็มีข้อจำกัดเช่นกัน ไม่จำเป็นต้องพูดว่าสิ่งนี้ต้องการการมีอยู่ของสปีชีส์ตัวบ่งชี้ในระบบนิเวศ ดังที่กล่าวไว้ข้างต้น การใช้ LB เพื่อประเมินความหลากหลายทางชีวภาพของระบบนิเวศที่กำหนดยังต้องการกระบวนการชีวสารสนเทศที่เข้มงวดซึ่งคำนึงถึงการมีอยู่ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากแหล่งที่มา ปัญหาสำคัญอีกประการหนึ่งคือความพร้อมของจีโนมอ้างอิงสำหรับสปีชีส์ทางทะเล หวังว่าโครงการริเริ่มต่างๆ เช่น Marine Mammal Genomes Project และ Fish10k project ที่เพิ่งจัดตั้งขึ้น [88] จะช่วยอำนวยความสะดวกในการวิเคราะห์ดังกล่าวในอนาคต การนำแนวคิด LB ไปใช้กับสิ่งมีชีวิตที่กินอาหารกรองในทะเลยังเข้ากันได้กับความก้าวหน้าล่าสุดในเทคโนโลยีการจัดลำดับ ทำให้แนวคิดนี้เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการพัฒนาไบโอมาร์กเกอร์มัลติโอห์มเพื่อให้ข้อมูลสำคัญเกี่ยวกับสุขภาพของแหล่งที่อยู่อาศัยของสัตว์ทะเลเพื่อตอบสนองต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อม
ข้อมูลการจัดลำดับจีโนมได้รับการฝากไว้ใน NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ภายใต้ Bioprojects SRR8924808
Brierley AS, Kingsford MJ ผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงสภาพอากาศต่อชีวิตทางทะเลและระบบนิเวศ Cole Biology 2009; 19: P602–P614
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S และคณะ พิจารณาผลกระทบร่วมกันของการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศและความเครียดในท้องถิ่นอื่นๆ ต่อสิ่งแวดล้อมทางทะเล สภาพแวดล้อมทางวิทยาศาสตร์ทั่วไป 2021;755:142564
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, และคณะ - ศาสตร์แห่งวันที่ 1 มีนาคม 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. ความทนทานต่อความร้อนที่ลดลงภายใต้สภาวะที่มีความเครียดจากความร้อนซ้ำๆ อธิบายถึงอัตราการตายของหอยแมลงภู่สีน้ำเงินในช่วงฤดูร้อนที่สูง รายงานทางวิทยาศาสตร์ 2019; 9:17498
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER และคณะ การเปลี่ยนแปลงล่าสุดในความถี่ สาเหตุ และขอบเขตของการตายของสัตว์ Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, และคณะ เชื้อโรคที่ไม่เฉพาะเจาะจงหลายชนิดอาจทำให้ Pinna nobilis เสียชีวิตจำนวนมาก ชีวิต. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM ผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นจากการเปลี่ยนแปลงสภาพอากาศต่อโรคติดต่อจากสัตว์สู่คนในอาร์กติก Int J Circumpolar health 2005; 64:468–77
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. และคณะ หอยแมลงภู่สีน้ำเงิน (Mytilus edulis spp.) เป็นสิ่งมีชีวิตส่งสัญญาณในการติดตามมลพิษชายฝั่ง: การทบทวน Mar Environ Res 2017; 130:338-65
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. การผสานรวมของการตรวจชิ้นเนื้อของเหลวในการรักษามะเร็ง Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C และคณะ การทำให้ชิ้นเนื้อในของเหลวสุก ช่วยให้ DNA ของเนื้องอกสามารถหมุนเวียนได้ Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. กรดนิวคลีอิกในพลาสมาของมนุษย์ บันทึกการประชุมของบริษัทในเครือ Soc Biol 1948; 142:241-3
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. บทบาทใหม่ของ DNA ปลอดเซลล์ในฐานะเครื่องหมายโมเลกุลสำหรับการรักษามะเร็ง การวัดปริมาณการวิเคราะห์ทางชีวโมลาร์ 2019;17:100087
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS การตรวจชิ้นเนื้อด้วยของเหลวเข้าสู่คลินิก – ปัญหาในการนำไปปฏิบัติและความท้าทายในอนาคต Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW และคนอื่นๆ พบ DNA ของทารกในครรภ์ในพลาสมาและซีรั่มของมารดา Lancet 1997; 350:485-7
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR การศึกษาแนวทางการตั้งครรภ์และภาวะแทรกซ้อนโดยใช้ RNA นอกเซลล์ที่หมุนเวียนในเลือดของผู้หญิงระหว่างตั้งครรภ์ Dopediatrics 2020;8:605219
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J และคณะ การตรวจชิ้นเนื้อด้วยของเหลว: DNA ที่ปราศจากเซลล์ของผู้บริจาคใช้ในการตรวจหารอยโรคจากพันธุกรรมอื่นในเนื้อเยื่อไต Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603
Juan FC, Lo YM นวัตกรรมในการวินิจฉัยก่อนคลอด: การจัดลำดับจีโนมในพลาสมาของมารดา Anna MD. 2016;67:419-32
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D และคณะ การตรวจจับเชื้อโรคอย่างรวดเร็วด้วยการจัดลำดับเมตาจีโนมรุ่นถัดไปของของเหลวในร่างกายที่ติดเชื้อ Nat Medicine 2021;27:115-24