ขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comเวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)ในระหว่างนี้ เพื่อให้แน่ใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
ความอุดมสมบูรณ์ของนกขึ้นอยู่กับความสามารถในการเก็บสเปิร์มที่มีชีวิตได้เพียงพอเป็นระยะเวลานานในท่อเก็บสเปิร์ม (SST)กลไกที่แน่นอนที่สเปิร์มมาโตซัวเข้าไป อาศัย และออกจาก SST ยังคงเป็นที่ถกเถียงกันอยู่สเปิร์มของแม่ไก่ Sharkasi มีแนวโน้มสูงที่จะเกาะติดกัน ก่อตัวเป็นเส้นใยเคลื่อนที่ที่มีเซลล์จำนวนมากเนื่องจากความยากลำบากในการสังเกตการเคลื่อนไหวและพฤติกรรมของตัวอสุจิในท่อนำไข่ทึบแสง เราจึงใช้อุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิคที่มีภาคตัดขวางไมโครแชนแนลคล้ายกับสเปิร์มมาโตซัวเพื่อศึกษาการเกาะติดกันและการเคลื่อนไหวของสเปิร์มมาโตซัวการศึกษานี้กล่าวถึงรูปแบบกลุ่มสเปิร์ม การเคลื่อนไหว และบทบาทที่เป็นไปได้ในการขยายถิ่นที่อยู่ของตัวอสุจิใน SSTเราตรวจสอบความเร็วของสเปิร์มและพฤติกรรมการไหลเมื่อการไหลของของไหลถูกสร้างขึ้นภายในช่องไมโครฟลูอิดิกโดยความดันไฮโดรสแตติก (อัตราการไหล = 33 µm/s)ตัวอสุจิมีแนวโน้มที่จะว่ายทวนกระแสน้ำ (กระแสน้ำบวก) และความเร็วของชุดตัวอสุจิจะลดลงอย่างมากเมื่อเทียบกับตัวอสุจิเดี่ยวมีการสังเกตว่ากลุ่มสเปิร์มเคลื่อนที่เป็นเกลียวและเพิ่มความยาวและความหนาเมื่อมีการคัดเลือกสเปิร์มเดี่ยวมากขึ้น กลุ่มสเปิร์มถูกสังเกตเข้าใกล้และเกาะติดกับผนังของช่องไมโครฟลูอิดิกเพื่อหลีกเลี่ยงการกวาดด้วยความเร็วการไหลของของไหล > 33 µm/s กลุ่มสเปิร์มถูกสังเกตเข้าใกล้และเกาะติดกับผนังของช่องไมโครฟลูอิดิกเพื่อหลีกเลี่ยงการกวาดด้วยความเร็วการไหลของของไหล > 33 µm/s Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избе жать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. มีการสังเกตว่ากลุ่มสเปิร์มเข้าใกล้และติดกับผนังด้านข้างของช่องไมโครฟลูอิดิกเพื่อหลีกเลี่ยงการถูกกวาดออกไปที่อัตราการไหลของของไหล >33 µm/s观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过。33 µm/s หรือ 33 µm/s Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избе жать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. มีการสังเกตว่ากลุ่มสเปิร์มเข้าใกล้และติดกับผนังด้านข้างของช่องไมโครฟลูอิดิกเพื่อหลีกเลี่ยงการถูกกวาดออกไปโดยการไหลของของไหลที่ >33 µm/sกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอนแบบส่องกราดและแบบส่องผ่านเผยให้เห็นว่ากลุ่มสเปิร์มรองรับด้วยวัสดุที่มีความหนาแน่นสูงจำนวนมากข้อมูลที่ได้รับแสดงให้เห็นถึงความคล่องตัวที่ไม่เหมือนใครของตัวอสุจิไก่ Sharkazi เช่นเดียวกับความสามารถของตัวอสุจิในการเกาะติดกันและสร้างกลุ่มมือถือซึ่งก่อให้เกิดความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับการจัดเก็บตัวอสุจิในระยะยาวใน SMT
เพื่อให้เกิดการปฏิสนธิในมนุษย์และสัตว์ส่วนใหญ่ สเปิร์มและไข่จะต้องมาถึงไซต์ที่มีการปฏิสนธิในเวลาที่เหมาะสมดังนั้นการผสมพันธุ์จะต้องเกิดขึ้นก่อนหรือในเวลาที่มีการตกไข่ในทางกลับกัน สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมบางชนิด เช่น สุนัข และสัตว์ที่ไม่ใช่สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เช่น แมลง ปลา สัตว์เลื้อยคลาน และนก เก็บสเปิร์มไว้ในอวัยวะสืบพันธุ์เป็นระยะเวลานานจนกว่าไข่ของพวกมันจะพร้อมสำหรับการปฏิสนธิ (การปฏิสนธิแบบอะซิงโครนัส 1 )นกสามารถรักษาความมีชีวิตของสเปิร์มมาโตซัวที่สามารถปฏิสนธิกับไข่ได้เป็นเวลา 2-10 สัปดาห์2
นี่เป็นลักษณะเฉพาะที่ทำให้นกแตกต่างจากสัตว์ชนิดอื่น เนื่องจากมีความเป็นไปได้สูงที่จะเกิดการปฏิสนธิหลังจากการผสมเทียมครั้งเดียวเป็นเวลาหลายสัปดาห์โดยไม่มีการผสมพันธุ์และการตกไข่พร้อมกันอวัยวะเก็บสเปิร์มหลักเรียกว่าท่อเก็บสเปิร์ม (SST) ตั้งอยู่ในเยื่อเมือกภายในที่จุดเชื่อมต่อของมดลูกจนถึงปัจจุบัน กลไกที่สเปิร์มเข้า อาศัย และออกจากธนาคารสเปิร์มยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างสมบูรณ์จากการศึกษาก่อนหน้านี้ มีการตั้งสมมติฐานมากมาย แต่ไม่มีการยืนยัน
Forman4 ตั้งสมมติฐานว่าสเปิร์มมาโตซัวรักษาที่อยู่อาศัยของพวกมันในโพรง SST ผ่านการเคลื่อนไหวแบบแกว่งไปมาอย่างต่อเนื่องกับทิศทางของการไหลของของไหลผ่านช่องโปรตีนที่อยู่บนเซลล์เยื่อบุผิว SST (รีโอโลยี)ATP หมดลงเนื่องจากกิจกรรมแฟลเจลลาร์คงที่ซึ่งจำเป็นต่อการเก็บสเปิร์มในลูเมน SST และการเคลื่อนไหวจะลดลงในที่สุดจนกว่าสเปิร์มจะถูกนำออกจากธนาคารสเปิร์มโดยการไหลของของเหลวและเริ่มการเดินทางครั้งใหม่ตามท่อนำไข่ที่ขึ้นไปเพื่อปฏิสนธิกับสเปิร์มไข่ (Forman4).แบบจำลองการจัดเก็บสเปิร์มนี้ได้รับการสนับสนุนโดยการตรวจจับโดยอิมมูโนไซโตเคมีของอะควาพอริน 2, 3 และ 9 ที่มีอยู่ในเซลล์เยื่อบุผิว SSTจนถึงปัจจุบัน ยังขาดการศึกษาเกี่ยวกับรีโอโลยีของน้ำเชื้อไก่และบทบาทในการเก็บรักษา SST การคัดเลือกอสุจิในช่องคลอด และการแข่งขันของตัวอสุจิในไก่ สเปิร์มจะเข้าสู่ช่องคลอดหลังจากการผสมพันธุ์ตามธรรมชาติ แต่มากกว่า 80% ของสเปิร์มมาโตซัวจะถูกขับออกจากช่องคลอดหลังจากผสมพันธุ์ได้ไม่นานสิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าช่องคลอดเป็นตำแหน่งหลักสำหรับการเลือกสเปิร์มของนกนอกจากนี้ยังมีรายงานว่าน้อยกว่า 1% ของตัวอสุจิที่ปฏิสนธิในช่องคลอดมี SSTs2ในการผสมเทียมลูกไก่ทางช่องคลอด จำนวนอสุจิถึง SST มีแนวโน้มที่จะเพิ่มขึ้น 24 ชั่วโมงหลังการผสมเทียมจนถึงตอนนี้ กลไกการเลือกสเปิร์มในระหว่างกระบวนการนี้ยังไม่ชัดเจน และการเคลื่อนไหวของสเปิร์มอาจมีบทบาทสำคัญในการดูดซึมสเปิร์ม SSTเนื่องจากผนังท่อนำไข่หนาและทึบแสง จึงยากต่อการตรวจสอบการเคลื่อนไหวของอสุจิโดยตรงในท่อนำไข่ของนกดังนั้นเราจึงขาดความรู้พื้นฐานเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงของตัวอสุจิเป็น SST หลังจากการปฏิสนธิ
รีโอโลยีเพิ่งได้รับการยอมรับว่าเป็นปัจจัยสำคัญที่ควบคุมการขนส่งสเปิร์มในอวัยวะเพศของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมขึ้นอยู่กับความสามารถของสเปิร์มที่เคลื่อนที่ได้ในการอพยพทวนกระแส Zaferani และคณะใช้ระบบไมโครฟลูอิดิกคอร์ราเพื่อแยกสเปิร์มที่เคลื่อนไหวได้แบบพาสซีฟจากตัวอย่างน้ำอสุจิการคัดแยกน้ำเชื้อประเภทนี้มีความจำเป็นสำหรับการรักษาภาวะมีบุตรยากทางการแพทย์และการวิจัยทางคลินิก และเป็นที่ต้องการมากกว่าวิธีการแบบดั้งเดิมที่ใช้เวลาและแรงงานมาก และอาจส่งผลต่อสัณฐานวิทยาของสเปิร์มและความสมบูรณ์ของโครงสร้างอย่างไรก็ตาม จนถึงปัจจุบัน ยังไม่มีการศึกษาเกี่ยวกับผลของการหลั่งจากอวัยวะสืบพันธ์ของไก่ต่อการเคลื่อนไหวของอสุจิ
โดยไม่คำนึงถึงกลไกที่เก็บรักษาสเปิร์มที่เก็บไว้ใน SST นักวิจัยจำนวนมากได้สังเกตว่าสเปิร์มที่อาศัยอยู่เกาะติดกันแบบตัวต่อตัวใน SST ของไก่ 9, 10, นกกระทา 2 และไก่งวง 11 เพื่อสร้างกลุ่มสเปิร์มที่เกาะติดกันผู้เขียนเสนอแนะว่ามีความเชื่อมโยงระหว่างการเกาะติดกันกับการเก็บสเปิร์มมาโตซัวในระยะยาวใน SST
Tingari และ Lake12 รายงานความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งระหว่างสเปิร์มมาโตซัวในต่อมรับสเปิร์มของไก่ และตั้งคำถามว่าสเปิร์มของนกเกาะติดกันในลักษณะเดียวกับสเปิร์มของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมหรือไม่พวกเขาเชื่อว่าการเชื่อมต่อลึกระหว่างตัวอสุจิใน vas deferens อาจเนื่องมาจากความเครียดที่เกิดจากการมีตัวอสุจิจำนวนมากในพื้นที่ขนาดเล็ก
เมื่อประเมินพฤติกรรมของตัวอสุจิบนสไลด์แก้วแขวนใหม่ สัญญาณชั่วคราวของการเกาะติดกันสามารถเห็นได้ โดยเฉพาะที่ขอบของหยดน้ำอสุจิอย่างไรก็ตาม การเกาะติดกันมักถูกรบกวนโดยการหมุนที่เกี่ยวข้องกับการเคลื่อนไหวต่อเนื่อง ซึ่งอธิบายลักษณะชั่วคราวของปรากฏการณ์นี้นักวิจัยยังสังเกตเห็นว่าเมื่อเพิ่มสารเจือจางลงในน้ำอสุจิ มวลรวมของเซลล์ที่ยืดยาวออกมาจะปรากฏขึ้น
ความพยายามในช่วงแรกๆ ในการเลียนแบบสเปิร์มมาซูนทำได้โดยการดึงลวดเส้นเล็กๆ ออกจากหยดที่ห้อยอยู่ ซึ่งส่งผลให้มีตุ่มคล้ายสเปิร์มยาวยื่นออกมาจากหยดของสเปิร์มสเปิร์มมาโตซัวเรียงตัวขนานกันภายในถุงทันที แต่หน่วยทั้งหมดหายไปอย่างรวดเร็วเนื่องจากข้อจำกัดของสามมิติดังนั้นในการศึกษาการเกาะติดกันของสเปิร์มจึงจำเป็นต้องสังเกตการเคลื่อนไหวและพฤติกรรมของตัวอสุจิโดยตรงในท่อเก็บสเปิร์มที่แยกออกมาซึ่งทำได้ยากดังนั้นจึงจำเป็นต้องพัฒนาเครื่องมือที่เลียนแบบสเปิร์มมาโตซัวเพื่อสนับสนุนการศึกษาการเคลื่อนไหวของสเปิร์มและพฤติกรรมการเกาะติดกันBrillard et al13 รายงานว่าความยาวเฉลี่ยของท่อเก็บสเปิร์มในลูกไก่โตเต็มวัยคือ 400–600 µm แต่ SST บางตัวอาจยาวถึง 2,000 µmMero และ Ogasawara14 แบ่งต่อม seminiferous ออกเป็นท่อเก็บสเปิร์มที่ขยายและไม่ขยาย ซึ่งทั้งสองท่อมีความยาวเท่ากัน (~500 µm) และความกว้างของคอ (~38 µm) แต่เส้นผ่านศูนย์กลางลูเมนเฉลี่ยของท่อคือ 56.6 และ 56.6 µm.ตามลำดับ 11.2 μm ตามลำดับในการศึกษาปัจจุบัน เราใช้อุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกที่มีขนาดช่องสัญญาณ 200 µm × 20 µm (W × H) ซึ่งมีหน้าตัดค่อนข้างใกล้เคียงกับ SST ที่ขยายนอกจากนี้ เรายังตรวจสอบการเคลื่อนไหวของสเปิร์มและพฤติกรรมการเกาะติดกันในของเหลวที่ไหล ซึ่งสอดคล้องกับสมมติฐานของโฟร์แมนที่ว่าของเหลวที่ผลิตโดยเซลล์เยื่อบุผิว SST ช่วยให้สเปิร์มอยู่ในลูเมนในทิศทางทวนกระแส (รีโอโลยี)
จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือเพื่อเอาชนะปัญหาในการสังเกตการเคลื่อนที่ของตัวอสุจิในท่อนำไข่และเพื่อหลีกเลี่ยงความยากลำบากในการศึกษารีโอโลยีและพฤติกรรมของตัวอสุจิในสภาพแวดล้อมแบบไดนามิกมีการใช้อุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิคที่สร้างแรงดันน้ำเพื่อจำลองการเคลื่อนไหวของสเปิร์มในอวัยวะเพศของไก่
เมื่อหยดตัวอย่างสเปิร์มที่เจือจางแล้ว (1:40) ถูกบรรจุลงในอุปกรณ์ไมโครแชนเนล จะสามารถระบุการเคลื่อนไหวของสเปิร์มได้ 2 ประเภท (สเปิร์มแยกและสเปิร์มที่ถูกมัด)นอกจากนี้ ตัวอสุจิมีแนวโน้มที่จะว่ายทวนกระแสน้ำ (การไหลในเชิงบวก; วิดีโอ 1, 2) แม้ว่ากลุ่มสเปิร์มจะมีความเร็วต่ำกว่าสเปิร์มโดดเดี่ยว (p < 0.001) แต่ก็เพิ่มเปอร์เซ็นต์ของสเปิร์มที่แสดง rheotaxis ในเชิงบวก (p <0.001; ตารางที่ 2) แม้ว่ากลุ่มสเปิร์มจะมีความเร็วต่ำกว่าสเปิร์มโดดเดี่ยว (p < 0.001) แต่ก็เพิ่มเปอร์เซ็นต์ของสเปิร์มที่แสดง rheotaxis ในเชิงบวก (p <0.001; ตารางที่ 2) Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процен т сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). แม้ว่ากลุ่มสเปิร์มมาโตซัวจะมีความเร็วต่ำกว่าสเปิร์มเดี่ยว (p <0.001) แต่ก็เพิ่มเปอร์เซ็นต์ของสเปิร์มมาโตซัวที่แสดงการเกิดโรคไขข้ออักเสบในเชิงบวก (p <0.001; ตารางที่ 2)尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.00 1；表2）。尽管精子束的速度低于孤独的速度（p<0.001），但增加了显示阳性流变性精子百分比（p<0 .001；2。。。。。。）））)）) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент спермат озоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). แม้ว่าความเร็วของการรวมกลุ่มของสเปิร์มจะต่ำกว่าของสเปิร์มเดี่ยว (p < 0.001) แต่ก็เพิ่มเปอร์เซ็นต์ของสเปิร์มที่มีรีโอโลจีเป็นบวก (p <0.001; ตารางที่ 2)รีโอโลยีที่เป็นบวกสำหรับสเปิร์มเดี่ยวและกระจุกอยู่ที่ประมาณ 53% และ 85% ตามลำดับ
มีการสังเกตว่าสเปิร์มของไก่ sharkasi ทันทีหลังจากการหลั่งจะรวมตัวกันเป็นเส้นตรงซึ่งประกอบด้วยหลายสิบตัวกระจุกเหล่านี้มีความยาวและความหนาเพิ่มขึ้นเมื่อเวลาผ่านไป และอาจยังคงอยู่ในหลอดทดลองเป็นเวลาหลายชั่วโมงก่อนที่จะสลายไป (วิดีโอ 3)กลุ่มเส้นใยเหล่านี้มีรูปร่างเหมือนสเปิร์มตัวตุ่นที่ก่อตัวขึ้นที่ส่วนท้ายของหลอดน้ำอสุจิพบว่าน้ำเชื้อแม่ไก่ Sharkashi มีแนวโน้มสูงที่จะจับตัวกันเป็นมัดและมัดเป็นร่างแหภายในเวลาไม่ถึงหนึ่งนาทีหลังการเก็บคานเหล่านี้มีไดนามิกและสามารถยึดติดกับผนังหรือวัตถุที่อยู่นิ่งใกล้เคียงได้แม้ว่ากลุ่มสเปิร์มจะลดความเร็วของเซลล์สเปิร์ม แต่เป็นที่ชัดเจนว่าพวกมันเพิ่มความเป็นเส้นตรงในระดับมหภาคความยาวของมัดแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับจำนวนสเปิร์มที่เก็บเป็นมัดแยกมัดออกเป็นสองส่วน: ส่วนแรกซึ่งรวมถึงส่วนหัวที่เป็นอิสระของตัวอสุจิที่เกาะติดกัน และส่วนปลาย ซึ่งรวมถึงหางและส่วนปลายสุดของตัวอสุจิการใช้กล้องความเร็วสูง (950 fps) สังเกตหัวสเปิร์มที่จับตัวเป็นก้อนอิสระในส่วนเริ่มต้นของมัดซึ่งรับผิดชอบการเคลื่อนไหวของมัดเนื่องจากการเคลื่อนที่แบบแกว่ง ลากส่วนที่เหลือเข้าไปในมัดด้วยการเคลื่อนที่แบบเกลียว (วิดีโอ 4)อย่างไรก็ตาม ในกระจุกยาว มีการสังเกตว่ามีหัวสเปิร์มอิสระบางส่วนเกาะติดกับลำตัวและส่วนปลายของกระจุกทำหน้าที่เป็นใบพัดเพื่อช่วยขับเคลื่อนกระจุก
ในขณะที่ของเหลวไหลช้า กลุ่มสเปิร์มจะเคลื่อนที่ขนานกัน อย่างไรก็ตาม พวกมันจะเริ่มซ้อนทับกันและเกาะติดกับทุกสิ่งที่อยู่นิ่ง เพื่อไม่ให้ถูกกระแสน้ำพัดหายไปเมื่อความเร็วไหลเพิ่มขึ้นการรวมกลุ่มเกิดขึ้นเมื่อเซลล์สเปิร์มจำนวนหนึ่งเข้าหากัน พวกมันเริ่มเคลื่อนไหวพร้อมกันและพันรอบกันและกัน จากนั้นจึงเกาะติดกับสารเหนียวรูปที่ 1 และ 2 แสดงให้เห็นว่าสเปิร์มเข้าหากันอย่างไร ทำให้เกิดรอยแยกเมื่อหางพันรอบกันและกัน
นักวิจัยใช้แรงดันอุทกสถิตเพื่อสร้างการไหลของของไหลในช่องไมโครเพื่อศึกษารีโอโลยีของตัวอสุจิใช้ไมโครแชนเนลที่มีขนาด 200 µm × 20 µm (W × H) และความยาว 3.6 µmใช้ไมโครแชนแนลระหว่างภาชนะที่มีเข็มฉีดยาติดตั้งอยู่ที่ปลายใช้สีผสมอาหารเพื่อทำให้ช่องมองเห็นได้ชัดเจนขึ้น
มัดสายเชื่อมต่อและอุปกรณ์เสริมเข้ากับผนังวิดีโอนี้ถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟสในแต่ละภาพจะมีการนำเสนอกล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟสและภาพการทำแผนที่(A) การเชื่อมต่อระหว่างสองกระแสต่อต้านการไหลเนื่องจากการเคลื่อนที่แบบเกลียว (ลูกศรสีแดง)(B) การเชื่อมต่อระหว่างมัดท่อและผนังช่อง (ลูกศรสีแดง) ในขณะเดียวกันก็เชื่อมต่อกับอีกสองมัด (ลูกศรสีเหลือง)(C) กลุ่มสเปิร์มในช่องไมโครฟลูอิดิกเริ่มเชื่อมต่อกัน (ลูกศรสีแดง) ก่อตัวเป็นตาข่ายของกลุ่มสเปิร์ม(D) การก่อตัวของเครือข่ายมัดสเปิร์ม
เมื่อสเปิร์มที่เจือจางหยดหนึ่งถูกบรรจุลงในอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิคและมีการไหลเกิดขึ้น ลำแสงสเปิร์มจะเคลื่อนที่สวนทางกับทิศทางการไหลบันเดิลแนบสนิทกับผนังของไมโครแชนแนล และหัวอิสระในส่วนเริ่มต้นของบันเดิลก็แนบสนิทแนบสนิทกับพวกมัน (วิดีโอ 5)พวกมันยังยึดติดกับอนุภาคที่อยู่นิ่งในเส้นทางของมัน เช่น เศษซาก เพื่อต้านทานการถูกกระแสน้ำพัดพาไปเมื่อเวลาผ่านไป กระจุกเหล่านี้จะกลายเป็นเส้นใยยาวดักจับสเปิร์มเดี่ยวอื่นๆ และกระจุกที่สั้นกว่า (วิดีโอ 6)เมื่อการไหลเริ่มช้าลง สเปิร์มเป็นสายยาวเริ่มสร้างเครือข่ายของสเปิร์ม (วิดีโอ 7; รูปที่ 2)
ที่ความเร็วการไหลสูง (V > 33 µm/s) การเคลื่อนที่แบบเกลียวของเกลียวจะเพิ่มขึ้นเนื่องจากความพยายามที่จะจับตัวอสุจิหลายๆ ที่ความเร็วการไหลสูง (V > 33 µm/s) การเคลื่อนที่แบบเกลียวของเกลียวจะเพิ่มขึ้นเนื่องจากความพยายามที่จะจับตัวอสุจิหลายๆ При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множе ство отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. ที่อัตราการไหลสูง (V > 33 µm/s) การเคลื่อนที่แบบเกลียวของเกลียวจะเพิ่มขึ้นเนื่องจากพวกมันพยายามจับตัวอสุจิหลายตัวที่รวมตัวกันเป็นกลุ่มซึ่งสามารถต้านทานแรงเลื่อนของการไหลได้ดีกว่า在高流速(V > 33 µm/s)动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子， 从而 更 地 抵抗的漂移力。。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. ที่อัตราการไหลสูง (V > 33 µm/s) การเคลื่อนที่แบบเกลียวของเส้นใยจะเพิ่มขึ้นเพื่อพยายามจับสเปิร์มมาโตซัวหลายๆพวกเขายังพยายามติดไมโครแชนแนลที่แก้มยาง
กลุ่มสเปิร์มถูกระบุเป็นกลุ่มของหัวสเปิร์มและหางโค้งงอโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบแสง (LM)กลุ่มสเปิร์มที่มีการรวมกลุ่มต่างๆ ยังถูกระบุว่าเป็นหัวที่บิดเบี้ยวและกลุ่มแฟลเจลลาร์ หางสเปิร์มที่หลอมรวมกันหลายตัว หัวสเปิร์มที่ติดกับหาง และหัวสเปิร์มที่มีนิวเคลียสงอเป็นนิวเคลียสที่หลอมรวมกันหลายตัวกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM)กล้องจุลทรรศน์อิเล็คตรอนแบบส่องกราด (SEM) แสดงให้เห็นว่ากลุ่มสเปิร์มประกอบด้วยหัวสเปิร์มที่ห่อหุ้มไว้ และกลุ่มสเปิร์มแสดงเครือข่ายของหางที่ห่อหุ้มไว้
สัณฐานวิทยาและโครงสร้างพิเศษของตัวอสุจิ การก่อตัวของกลุ่มตัวอสุจิได้รับการศึกษาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (ครึ่งส่วน) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (SEM) และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) สเปิร์มสเมียร์ถูกย้อมด้วยสีส้มอะคริดีน และตรวจสอบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิพิฟลูออเรสเซนซ์
การย้อมสเปิร์มสเมียร์ด้วยสีส้มอะคริดีน (รูปที่ 3B) แสดงให้เห็นว่าหัวสเปิร์มติดกันและถูกปกคลุมด้วยสารคัดหลั่ง ซึ่งนำไปสู่การก่อตัวของกระจุกขนาดใหญ่ (รูปที่ 3 มิติ)กลุ่มสเปิร์มประกอบด้วยสเปิร์มรวมที่มีเครือข่ายหางติดอยู่ (รูปที่ 4A-C)กลุ่มสเปิร์มประกอบด้วยหางของตัวอสุจิหลายตัวติดกัน (รูปที่ 4D)ความลับ (รูปที่ 4E,F) ปกคลุมหัวของกลุ่มสเปิร์มมาโตซัว
การก่อตัวของมัดสเปิร์มมาโตซัว การใช้กล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟสและสเมียร์สเปิร์มย้อมด้วยสีส้มอะคริดีน แสดงให้เห็นว่าหัวสเปิร์มเกาะติดกัน(A) การสร้างกระจุกสเปิร์มในช่วงแรกเริ่มต้นด้วยสเปิร์ม (วงกลมสีขาว) และสเปิร์มสามตัว (วงกลมสีเหลือง) โดยเกลียวเริ่มต้นที่หางและสิ้นสุดที่ส่วนหัว(B) โฟโตไมโครกราฟของสเปิร์มสเมียร์ที่ย้อมด้วยสีส้มอะคริดีนซึ่งแสดงหัวสเปิร์มที่เกาะติด (ลูกศร)การปลดปล่อยครอบคลุมศีรษะกำลังขยาย × 1,000 (C) การพัฒนาลำแสงขนาดใหญ่ที่ขนส่งโดยการไหลในช่องไมโครฟลูอิดิก (โดยใช้กล้องความเร็วสูงที่ 950 fps)(D) ไมโครกราฟของสเปิร์มสเมียร์ที่ย้อมด้วยสีส้มอะคริดีนแสดงกระจุกขนาดใหญ่ (ลูกศร)กำลังขยาย: ×200.
การสแกนไมโครกราฟอิเลคตรอนของลำแสงสเปิร์มและสเปิร์มสเมียร์ที่ย้อมด้วยสีส้มอะคริดีน(A, B, D, E) เป็นไมโครกราฟอิเลคตรอนสแกนสีแบบดิจิทัลของตัวอสุจิ และ C และ F เป็นไมโครกราฟของรอยเปื้อนสเปิร์มย้อมสีส้มอะคริดีน ซึ่งแสดงการติดของสเปิร์มมาโตซัวหลายตัวที่พันใยหาง(AC) การรวมตัวของสเปิร์มจะแสดงเป็นเครือข่ายของหางที่แนบมา (ลูกศร)(D) การยึดเกาะของตัวอสุจิหลายตัว (ด้วยกาว, โครงร่างสีชมพู, ลูกศร) พันรอบหาง(E และ F) หัวสเปิร์มรวม (พอยน์เตอร์) หุ้มด้วยวัสดุกาว (พอยน์เตอร์)สเปิร์มมาโตซัวรวมตัวกันเป็นกลุ่มที่มีโครงสร้างคล้ายกระแสน้ำวน (F)กำลังขยาย (C) ×400 และ (F) ×200
การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน เราพบว่ามัดสเปิร์มติดหาง (รูปที่ 6A, C) หัวติดกับหาง (รูปที่ 6B) หรือหัวติดกับหาง (รูปที่ 6D)หัวของสเปิร์มมาโตซัวในกลุ่มนั้นโค้ง นำเสนอในส่วนที่สองของส่วนนิวเคลียร์ (รูปที่ 6D)ในชุดรอยบาก สเปิร์มมาโตซัวมีหัวบิดที่มีบริเวณนิวเคลียสสองแห่งและบริเวณแฟลเจลลาร์หลายแห่ง (รูปที่ 5A)
ไมโครกราฟอิเลคตรอนสีแบบดิจิทัลแสดงหางที่เชื่อมต่อกันในชุดสเปิร์มและวัสดุที่เกาะติดกันซึ่งเชื่อมต่อระหว่างหัวสเปิร์ม(A) ติดหางของตัวอสุจิจำนวนมากสังเกตว่าหางมีลักษณะอย่างไรในการฉายภาพแนวตั้ง (ลูกศร) และแนวนอน (ลูกศร)(B) หัว (ลูกศร) ของตัวอสุจิเชื่อมต่อกับหาง (ลูกศร)(C) ติดหางสเปิร์ม (ลูกศร) หลายอัน(D) วัสดุเกาะติดกัน (AS, สีน้ำเงิน) เชื่อมต่อหัวสเปิร์มสี่หัว (สีม่วง)
ใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดเพื่อตรวจจับหัวสเปิร์มในกลุ่มสเปิร์มที่ปกคลุมด้วยสารคัดหลั่งหรือเยื่อหุ้มเซลล์ (รูปที่ 6B) ซึ่งบ่งชี้ว่ากลุ่มสเปิร์มถูกยึดด้วยวัสดุนอกเซลล์วัสดุที่จับตัวเป็นก้อนมีความเข้มข้นในหัวสเปิร์ม (ส่วนประกอบคล้ายหัวแมงกะพรุน รูปที่ 5B) และขยายออกทางไกล ทำให้มีลักษณะเป็นสีเหลืองสดใสภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์เมื่อย้อมด้วยสีส้มอะคริดีน (รูปที่ 6C)สารนี้มองเห็นได้ชัดเจนภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบส่องกราดและถือเป็นสารยึดเกาะส่วนกึ่งบาง (รูปที่ 5C) และสเปิร์มสเมียร์ที่ย้อมด้วยสีส้มอะคริดีนแสดงกลุ่มสเปิร์มที่มีส่วนหัวและหางม้วนงออย่างหนาแน่น (รูปที่ 5D)
โฟโตไมโครกราฟต่างๆ แสดงการรวมตัวของหัวสเปิร์มและหางที่พับด้วยวิธีการต่างๆ(A) ไมโครกราฟอิเลคตรอนการส่งผ่านสีแบบดิจิทัลแบบภาคตัดขวางของกลุ่มสเปิร์มแสดงหัวสเปิร์มขดที่มีนิวเคลียสสองส่วน (สีน้ำเงิน) และส่วนแฟลเจลลาร์หลายส่วน (สีเขียว)(B) ไมโครกราฟอิเลคตรอนสแกนสีแบบดิจิทัลแสดงกระจุกหัวสเปิร์มคล้ายแมงกะพรุน (ลูกศร) ที่ดูเหมือนถูกปกคลุม(C) ส่วนกึ่งบางแสดงหัวสเปิร์มรวม (ลูกศร) และหางที่โค้งงอ (ลูกศร)(D) ไมโครกราฟของสเปิร์มสเมียร์ที่ย้อมด้วยสีส้มอะคริดีนแสดงการรวมตัวของหัวสเปิร์ม (ลูกศร) และส่วนหางที่ม้วนงอ (ลูกศร)โปรดทราบว่าสารเหนียว (S) ปกคลุมส่วนหัวของตัวอสุจิกำลังขยาย (D) × 1,000
การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอนแบบส่องผ่าน (รูปที่ 7A) ยังสังเกตได้ว่าหัวสเปิร์มบิดเบี้ยวและนิวเคลียสมีรูปร่างเป็นเกลียว ดังที่ได้รับการยืนยันจากรอยเปื้อนสเปิร์มที่ย้อมด้วยสีส้มอะคริดีน และตรวจสอบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ (รูปที่ 7B)
(A) ไมโครกราฟอิเลคตรอนแบบส่งผ่านสีแบบดิจิตอล และ (B) สเปิร์มสเมียร์ย้อมสีส้มอะคริดีน แสดงหัวขดและส่วนต่อของหัวและหางสเปิร์ม (ลูกศร)(B) × 1,000 กำลังขยาย
การค้นพบที่น่าสนใจคือสเปิร์มของ Sharkazi รวมตัวกันเพื่อสร้างกลุ่มเส้นใยที่เคลื่อนที่ได้คุณสมบัติของชุดรวมเหล่านี้ช่วยให้เราเข้าใจบทบาทที่เป็นไปได้ในการดูดซึมและการเก็บรักษาสเปิร์มมาโตซัวใน SST
หลังจากการผสมพันธุ์ สเปิร์มจะเข้าสู่ช่องคลอดและผ่านกระบวนการคัดเลือกอย่างเข้มข้น ส่งผลให้สเปิร์มเข้าสู่ SST15,16 ได้ในจำนวนจำกัดจนถึงปัจจุบัน กลไกที่สเปิร์มเข้าและออกจาก SST ยังไม่มีความชัดเจนในสัตว์ปีก ตัวอสุจิจะถูกเก็บไว้ใน SST เป็นเวลานาน 2 ถึง 10 สัปดาห์ ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์6ข้อโต้แย้งยังคงอยู่เกี่ยวกับสภาพของน้ำอสุจิระหว่างการเก็บรักษาใน SSTพวกเขากำลังเคลื่อนไหวหรือพักผ่อน?กล่าวอีกนัยหนึ่งเซลล์สเปิร์มจะรักษาตำแหน่งใน SST ได้นานเพียงใด
Forman4 แนะนำว่าสามารถอธิบายที่อยู่และการดีดออกของ SST ในแง่ของการเคลื่อนไหวของตัวอสุจิผู้เขียนตั้งสมมติฐานว่าสเปิร์มคงตำแหน่งของตนโดยการว่ายทวนกระแสของเหลวที่สร้างขึ้นโดยเยื่อบุผิว SST และสเปิร์มนั้นจะถูกขับออกจาก SST เมื่อความเร็วลดลงต่ำกว่าจุดที่พวกมันเริ่มเคลื่อนถอยหลังเนื่องจากขาดพลังงานZaniboni5 ยืนยันการมีอยู่ของ aquaporins 2, 3 และ 9 ในส่วนยอดของเซลล์เยื่อบุผิว SST ซึ่งอาจสนับสนุนแบบจำลองการเก็บสเปิร์มของ Foreman ทางอ้อมในการศึกษาปัจจุบัน เราพบว่าสเปิร์มของ Sharkashi เกือบครึ่งหนึ่งแสดงรีโอโลยีในของเหลวที่ไหล และชุดสเปิร์มที่เกาะติดกันจะเพิ่มจำนวนสเปิร์มที่แสดงรีโอโลยีในเชิงบวก แม้ว่าการเกาะติดกันจะทำให้พวกมันช้าลงเซลล์สเปิร์มเดินทางขึ้นท่อนำไข่ของนกไปยังจุดปฏิสนธิอย่างไรนั้นยังไม่เป็นที่เข้าใจแน่ชัดในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เคมีบำบัดของของเหลวในฟอลลิคูลาร์จะดึงดูดสเปิร์มมาโตซัวอย่างไรก็ตาม เชื่อว่าสารดึงดูดทางเคมีจะสั่งให้สเปิร์มมาโตซัวเข้าใกล้ระยะทางไกล7ดังนั้นกลไกอื่น ๆ จึงมีหน้าที่ในการขนส่งสเปิร์มมีรายงานว่าความสามารถของสเปิร์มในทิศทางและไหลต้านของเหลวในท่อนำไข่ที่ปล่อยออกมาหลังการผสมพันธุ์เป็นปัจจัยสำคัญในการกำหนดเป้าหมายสเปิร์มในหนูParker 17 เสนอว่าสเปิร์มมาโตซัวข้ามท่อนำไข่โดยการว่ายทวนกระแสน้ำปรับเลนส์ในนกและสัตว์เลื้อยคลานแม้ว่าจะยังไม่มีการทดลองในนก แต่ Adolphi18 เป็นคนแรกที่พบว่าสเปิร์มของนกให้ผลลัพธ์ที่เป็นบวก เมื่อมีการสร้างชั้นของเหลวบางๆ ระหว่างใบปิดและแผ่นสไลด์ด้วยแถบกระดาษกรองรีโอโลยีHino และ Yanagimachi [19] วางสารเชิงซ้อนของรังไข่-ท่อนำไข่-มดลูกของหนูในวงแหวนกำบังและฉีดหมึก 1 µl เข้าไปในคอคอดเพื่อให้เห็นภาพการไหลของของไหลในท่อนำไข่พวกเขาสังเกตเห็นการเคลื่อนไหวอย่างแข็งขันของการหดตัวและการคลายตัวในท่อนำไข่ ซึ่งลูกหมึกทั้งหมดเคลื่อนที่ไปยังแอมพูลลาของท่อนำไข่อย่างต่อเนื่องผู้เขียนได้เน้นย้ำถึงความสำคัญของการไหลของของเหลวในท่อนำไข่จากส่วนล่างไปยังท่อนำไข่ส่วนบนเพื่อการเพิ่มจำนวนสเปิร์มและการปฏิสนธิBrillard20 รายงานว่าในไก่และไก่งวง สเปิร์มมาโตซัวจะย้ายโดยการเคลื่อนไหวอย่างแข็งขันจากทางเข้าช่องคลอดซึ่งเป็นที่เก็บพวกมัน ไปจนถึงทางแยกระหว่างมดลูกและช่องคลอด ซึ่งพวกมันถูกเก็บไว้อย่างไรก็ตาม การเคลื่อนไหวนี้ไม่จำเป็นระหว่างจุดเชื่อมต่อระหว่างมดลูกกับ infundibulum เนื่องจากสเปิร์มถูกขนส่งโดยการเคลื่อนตัวแบบพาสซีฟเมื่อทราบคำแนะนำก่อนหน้านี้และผลที่ได้รับจากการศึกษาในปัจจุบัน จึงสามารถสันนิษฐานได้ว่าความสามารถของสเปิร์มมาโตซัวในการเคลื่อนทวนกระแสน้ำ (รีโอโลยี) เป็นหนึ่งในคุณสมบัติที่ใช้กับกระบวนการคัดเลือกสิ่งนี้กำหนดทางเดินของตัวอสุจิผ่านช่องคลอดและการเข้าสู่ CCT เพื่อจัดเก็บตามที่ Forman4 แนะนำไว้ วิธีนี้อาจช่วยอำนวยความสะดวกให้สเปิร์มเข้าสู่ SST และที่อยู่อาศัยของมันชั่วระยะเวลาหนึ่ง และจากนั้นจะออกมาเมื่อความเร็วของสเปิร์มเริ่มช้าลง
ในทางกลับกัน มัตสึซากิและซาซานามิ 21 เสนอว่าสเปิร์มมาโตซัวของนกมีการเปลี่ยนแปลงการเคลื่อนไหวจากการพักตัวเป็นการเคลื่อนไหวในระบบสืบพันธุ์เพศผู้และเพศเมียมีการเสนอการยับยั้งการเคลื่อนไหวของสเปิร์มที่อาศัยอยู่ใน SST เพื่ออธิบายระยะเวลาการเก็บสเปิร์มที่ยาวนานและการฟื้นฟูหลังจากออกจาก SSTภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน มัตสึซากิและคณะ1 รายงานการผลิตและการปล่อยแลคเตตสูงใน SST ซึ่งอาจนำไปสู่การยับยั้งการเคลื่อนไหวของตัวอสุจิในกรณีนี้ ความสำคัญของการไหลของสเปิร์มจะสะท้อนให้เห็นในการคัดเลือกและการดูดซึมสเปิร์มมาโตซัว ไม่ใช่ในการเก็บรักษา
รูปแบบการเกาะติดกันของสเปิร์มถือเป็นคำอธิบายที่สมเหตุสมผลสำหรับระยะเวลาการเก็บสเปิร์มที่ยาวนานใน SST เนื่องจากเป็นรูปแบบทั่วไปของการกักเก็บสเปิร์มในสัตว์ปีก2,22,23Bakst และคณะ2 พบว่าสเปิร์มมาโตซัวส่วนใหญ่เกาะติดกัน ก่อตัวเป็นมวลรวมแบบพังผืด และสเปิร์มมาโตซัวเดี่ยวมักไม่ค่อยพบใน CCM ของนกกระทาในทางกลับกัน เวินและคณะ24 คนสังเกตเห็นสเปิร์มมาโตซัวที่กระจัดกระจายมากขึ้นและกระจุกตัวอสุจิน้อยลงในลูเมน SST ในไก่จากข้อสังเกตเหล่านี้ สันนิษฐานได้ว่าแนวโน้มการเกาะติดกันของสเปิร์มแตกต่างกันระหว่างนกและสเปิร์มในอุทานเดียวกันนอกจากนี้ Van Krey และคณะ9 แนะนำว่าการแยกตัวแบบสุ่มของตัวอสุจิที่เกาะติดกันมีหน้าที่รับผิดชอบในการค่อยๆแทรกซึมของตัวอสุจิเข้าไปในรูของท่อนำไข่ตามสมมติฐานนี้ ตัวอสุจิที่มีความสามารถในการจับตัวกันต่ำกว่าควรถูกขับออกจาก SST ก่อนในบริบทนี้ ความสามารถของสเปิร์มมาโตซัวในการเกาะติดกันอาจเป็นปัจจัยที่มีอิทธิพลต่อผลลัพธ์ของการแข่งขันของตัวอสุจิในนกที่สกปรกนอกจากนี้ ยิ่งสเปิร์มที่เกาะติดกันแยกตัวออกไปนานเท่าใด ภาวะเจริญพันธุ์ก็จะคงอยู่ได้นานขึ้นเท่านั้น
แม้ว่าจะมีการสังเกตการรวมตัวของสเปิร์มมาโตซัวและการรวมตัวเป็นกลุ่มก้อนในการศึกษาหลายชิ้น 2,22,24 แต่ก็ไม่ได้อธิบายโดยละเอียดเนื่องจากความซับซ้อนของการสังเกตทางจลนศาสตร์ภายใน SSTมีความพยายามหลายครั้งในการศึกษาการเกาะติดกันของสเปิร์มในหลอดทดลองมีการสังเกตการรวมตัวที่กว้างขวางแต่ชั่วคราวเมื่อนำลวดเส้นเล็กออกจากหยดเมล็ดที่ห้อยอยู่สิ่งนี้นำไปสู่ความจริงที่ว่าฟองยาวยื่นออกมาจากหยดน้ำเลียนแบบต่อมน้ำเชื้อเนื่องจากข้อจำกัดของ 3D และเวลาในการทำให้แห้งแบบหยดน้ำสั้น บล็อกทั้งหมดจึงอยู่ในสภาพทรุดโทรมอย่างรวดเร็ว9ในการศึกษาปัจจุบัน โดยใช้ไก่ Sharkashi และชิปไมโครฟลูอิดิก เราสามารถอธิบายได้ว่ากระจุกเหล่านี้ก่อตัวอย่างไรและเคลื่อนไหวอย่างไรกลุ่มสเปิร์มเกิดขึ้นทันทีหลังจากการเก็บน้ำอสุจิ และพบว่าเคลื่อนที่เป็นเกลียว ซึ่งแสดงให้เห็นรีโอโลยีเชิงบวกเมื่ออยู่ในกระแสนอกจากนี้ เมื่อดูด้วยกล้องจุลทรรศน์พบว่ากลุ่มสเปิร์มเพิ่มความเป็นเส้นตรงของการเคลื่อนที่เมื่อเปรียบเทียบกับสเปิร์มที่แยกได้สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าการเกาะติดกันของสเปิร์มอาจเกิดขึ้นก่อนการเจาะ SST และการผลิตสเปิร์มไม่ได้จำกัดอยู่ในพื้นที่ขนาดเล็กเนื่องจากความเครียดตามที่แนะนำไว้ก่อนหน้านี้ (Tingari และ Lake12)ระหว่างการก่อตัวเป็นกระจุก ตัวอสุจิจะว่ายน้ำเป็นจังหวะพร้อมกันจนเกิดเป็นทางแยก จากนั้นหางจะพันรอบกันและกัน และส่วนหัวของตัวอสุจิยังคงเป็นอิสระ แต่ส่วนหางและส่วนปลายของตัวอสุจิจะเกาะติดกันด้วยสารเหนียวดังนั้นหัวอิสระของเอ็นมีหน้าที่ในการเคลื่อนไหวโดยลากเอ็นที่เหลือกล้องจุลทรรศน์อิเล็คตรอนแบบส่องกราดของกลุ่มสเปิร์มแสดงให้เห็นหัวสเปิร์มที่ติดอยู่ซึ่งปกคลุมด้วยวัสดุเหนียวจำนวนมาก แสดงว่าหัวสเปิร์มติดอยู่ในกลุ่มพัก ซึ่งอาจเกิดขึ้นหลังจากไปถึงที่เก็บ (SST)
เมื่อสเปิร์มสเมียร์ถูกย้อมด้วยสีส้มอะคริดีน จะสามารถเห็นวัสดุกาวนอกเซลล์รอบๆ เซลล์สเปิร์มภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงสารนี้ช่วยให้กลุ่มสเปิร์มเกาะติดและเกาะติดกับพื้นผิวหรืออนุภาครอบๆ เพื่อไม่ให้ไหลไปตามกระแสรอบๆดังนั้นการสังเกตของเราจึงแสดงบทบาทของการเกาะตัวของสเปิร์มมาโตซัวในรูปแบบของการรวมกลุ่มแบบเคลื่อนที่ความสามารถในการว่ายทวนกระแสน้ำและเกาะพื้นผิวใกล้เคียงช่วยให้สเปิร์มอยู่ใน SST ได้นานขึ้น
Rothschild25 ใช้กล้อง hemocytometry เพื่อศึกษาการกระจายตัวแบบลอยตัวของน้ำเชื้อวัวในหยดสารแขวนลอย โดยถ่ายภาพด้วยโฟโตไมโครกราฟผ่านกล้องที่มีแกนลำแสงทั้งแนวตั้งและแนวนอนของกล้องจุลทรรศน์ผลการทดลองพบว่าสเปิร์มมาโตซัวถูกดึงดูดไปที่พื้นผิวของห้องผู้เขียนแนะนำว่าอาจมีปฏิกิริยาทางอุทกพลศาสตร์ระหว่างสเปิร์มและพื้นผิวเมื่อคำนึงถึงสิ่งนี้ควบคู่ไปกับความสามารถของน้ำเชื้อลูกไก่ Sharkashi ในการสร้างกระจุกเหนียว อาจเพิ่มโอกาสที่น้ำเชื้อจะเกาะติดกับผนัง SST และถูกเก็บไว้เป็นเวลานาน
Bccetti และ Afzeliu26 รายงานว่าสเปิร์ม glycocalyx จำเป็นสำหรับการรับรู้ gamete และการเกาะติดกันForman10 สังเกตว่าการไฮโดรไลซิสของพันธะ α-glycosidic ในการเคลือบ glycoprotein-glycolipid โดยการบำบัดน้ำอสุจินกด้วย neuraminidase ทำให้การเจริญพันธุ์ลดลงโดยไม่ส่งผลต่อการเคลื่อนไหวของสเปิร์มผู้เขียนเสนอว่าผลของ neuraminidase ต่อ glycocalyx ทำให้การกักเก็บตัวอสุจิลดลงที่ทางแยกมดลูกและช่องคลอด ซึ่งจะช่วยลดภาวะเจริญพันธุ์การสังเกตของพวกเขาไม่สามารถเพิกเฉยต่อความเป็นไปได้ที่การรักษาด้วย neuraminidase อาจลดการรับรู้สเปิร์มและโอโอไซต์Forman และ Engel10 พบว่าภาวะเจริญพันธุ์ลดลงเมื่อแม่ไก่ได้รับการผสมเทียมทางช่องคลอดด้วยน้ำอสุจิที่ได้รับ neuraminidaseอย่างไรก็ตาม การทำเด็กหลอดแก้วด้วยสเปิร์มที่ได้รับ neuraminidase ไม่ส่งผลต่อการเจริญพันธุ์เมื่อเทียบกับไก่ควบคุมผู้เขียนสรุปได้ว่าการเปลี่ยนแปลงของไกลโคโปรตีน-ไกลโคลิพิดที่เคลือบรอบๆ เยื่อหุ้มสเปิร์มลดความสามารถของสเปิร์มในการปฏิสนธิโดยทำให้การกักเก็บสเปิร์มที่ทางแยกมดลูก-ช่องคลอดลดลง ซึ่งส่งผลให้การสูญเสียสเปิร์มเพิ่มขึ้นเนื่องจากความเร็วของจุดเชื่อมต่อระหว่างมดลูกและช่องคลอด แต่ไม่ส่งผลต่อการจดจำสเปิร์มและไข่
ในไก่งวง Bakst และ Bauchan 11 พบถุงน้ำขนาดเล็กและชิ้นส่วนของเยื่อหุ้มเซลล์ในลูเมนของ SST และสังเกตว่าบางส่วนของเม็ดเหล่านี้ได้หลอมรวมกับเยื่อหุ้มสเปิร์มผู้เขียนแนะนำว่าความสัมพันธ์เหล่านี้อาจนำไปสู่การเก็บสเปิร์มมาโตซัวใน SST ในระยะยาวอย่างไรก็ตาม นักวิจัยไม่ได้ระบุแหล่งที่มาของอนุภาคเหล่านี้ว่าอนุภาคเหล่านี้หลั่งออกมาจากเซลล์เยื่อบุผิว CCT ผลิตและหลั่งโดยระบบสืบพันธุ์เพศชาย หรือผลิตโดยสเปิร์มเองนอกจากนี้ อนุภาคเหล่านี้มีหน้าที่ในการเกาะติดกันGrützner et al27 รายงานว่าเซลล์เยื่อบุผิว epididymal ผลิตและหลั่งโปรตีนเฉพาะที่จำเป็นสำหรับการก่อตัวของทางเดินน้ำเชื้อที่มีรูพรุนเดี่ยวผู้เขียนยังรายงานด้วยว่าการกระจายของกลุ่มเหล่านี้ขึ้นอยู่กับปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนในหลอดน้ำอสุจิNixon และคณะพบว่า adnexa หลั่งโปรตีนซึ่งเป็น osteonectin ที่อุดมด้วยซิสเทอีนที่เป็นกรดSPARC มีส่วนร่วมในการก่อตัวของกระจุกสเปิร์มในตัวตุ่นปากเป็ดและตุ่นปากเป็ดจงอยปากสั้นการกระเจิงของลำแสงเหล่านี้เกี่ยวข้องกับการสูญเสียโปรตีนนี้
ในการศึกษาในปัจจุบัน การวิเคราะห์โครงสร้างพิเศษโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนพบว่าสเปิร์มมาโตซัวเกาะติดกับวัสดุที่หนาแน่นจำนวนมากคิดว่าสารเหล่านี้มีส่วนรับผิดชอบต่อการเกาะติดกันที่ควบแน่นระหว่างและรอบๆ หัวที่เกาะติด แต่ที่ความเข้มข้นต่ำกว่าในบริเวณหางเราคิดว่าสารที่จับตัวเป็นก้อนนี้ถูกขับออกจากระบบสืบพันธุ์เพศชาย (epididymis หรือ vas deferens) พร้อมกับน้ำอสุจิ เนื่องจากเรามักจะสังเกตเห็นน้ำอสุจิที่แยกออกจากน้ำเหลืองและพลาสมาของน้ำเชื้อในระหว่างการหลั่งมีรายงานว่าเมื่อสเปิร์มมาโตซัวของนกผ่าน epididymis และ vas deferens พวกมันได้รับการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องกับการเจริญเต็มที่ซึ่งสนับสนุนความสามารถในการจับโปรตีนและรับไกลโคโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับพลาสมาเล็มมาการคงอยู่ของโปรตีนเหล่านี้บนเยื่อหุ้มสเปิร์มที่อาศัยอยู่ใน SST แสดงให้เห็นว่าโปรตีนเหล่านี้อาจมีอิทธิพลต่อการได้มาซึ่งความเสถียรของเยื่อหุ้มสเปิร์ม 30 และกำหนดภาวะเจริญพันธุ์ของพวกมัน 31Ahammad et al32 รายงานว่าสเปิร์มที่ได้จากส่วนต่าง ๆ ของระบบสืบพันธุ์เพศชาย (จากอัณฑะถึงส่วนปลายของท่อนำไข่) แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการมีชีวิตที่เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องภายใต้สภาวะการเก็บของเหลว โดยไม่คำนึงถึงอุณหภูมิการเก็บรักษา และความสามารถในการมีชีวิตในไก่ยังเพิ่มขึ้นในท่อนำไข่หลังจากการผสมเทียม
กระจุกสเปิร์มไก่ Sharkashi มีลักษณะและหน้าที่แตกต่างจากสายพันธุ์อื่นๆ เช่น ตัวตุ่น ตุ่นปากเป็ด หนูไม้ หนูกวาง และหนูตะเภาในไก่ Sharkasi การก่อตัวของกลุ่มตัวอสุจิลดความเร็วในการว่ายน้ำเมื่อเทียบกับตัวอสุจิเดี่ยวอย่างไรก็ตาม การรวมกลุ่มเหล่านี้เพิ่มเปอร์เซ็นต์ของสเปิร์มมาโตซัวที่เป็นบวกทางรีโอโลจิคัล และเพิ่มความสามารถของสเปิร์มมาโตซัวเพื่อทำให้ตัวเองเสถียรในสภาพแวดล้อมแบบไดนามิกดังนั้น ผลลัพธ์ของเราจึงยืนยันข้อเสนอแนะก่อนหน้านี้ว่าการเกาะติดกันของสเปิร์มใน SST นั้นสัมพันธ์กับการเก็บสเปิร์มในระยะยาวเรายังตั้งสมมติฐานว่าแนวโน้มของสเปิร์มที่จะก่อตัวเป็นกระจุกอาจควบคุมอัตราการสูญเสียสเปิร์มใน SST ซึ่งอาจเปลี่ยนแปลงผลลัพธ์ของการแข่งขันสเปิร์มตามสมมติฐานนี้ ตัวอสุจิที่มีความสามารถในการจับตัวกันต่ำจะปล่อย SST ก่อน ในขณะที่ตัวอสุจิที่มีความสามารถในการเกาะติดกันสูงจะผลิตลูกหลานส่วนใหญ่การก่อตัวของกลุ่มสเปิร์มรูขุมขนเดียวมีประโยชน์และส่งผลต่ออัตราส่วนพ่อแม่ลูก แต่ใช้กลไกที่แตกต่างกันตัวตุ่นและตุ่นปากเป็ดจะจัดเรียงตัวอสุจิให้ขนานกันเพื่อเพิ่มความเร็วไปข้างหน้าของลำแสงตัวตุ่นกลุ่มหนึ่งเคลื่อนไหวเร็วกว่าสเปิร์มเดี่ยวประมาณสามเท่าเชื่อกันว่าการก่อตัวของกระจุกตัวอสุจิในตัวตุ่นเป็นการปรับตัวทางวิวัฒนาการเพื่อรักษาอำนาจ เนื่องจากตัวเมียจะสำส่อนและมักจะผสมพันธุ์กับตัวผู้หลายตัวดังนั้นสเปิร์มจากอุทานต่าง ๆ จึงแข่งขันกันอย่างดุเดือดเพื่อการปฏิสนธิของไข่
สเปิร์มมาโตซัวที่จับตัวเป็นก้อนของไก่ฉลามกาซีมองเห็นได้ง่ายโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟส ซึ่งถือว่ามีประโยชน์เพราะช่วยให้ศึกษาพฤติกรรมของสเปิร์มมาโตซัวในหลอดทดลองได้ง่ายกลไกที่การสร้างกระจุกสเปิร์มส่งเสริมการสืบพันธุ์ในไก่ Sharkasi ยังแตกต่างจากที่พบในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีรกบางชนิดซึ่งแสดงพฤติกรรมของตัวอสุจิแบบร่วมมือ เช่น หนูไม้ ซึ่งสเปิร์มมาโตซัวบางตัวไปถึงไข่ ช่วยให้บุคคลอื่นเข้าถึงและทำให้ไข่ของพวกมันเสียหายเพื่อพิสูจน์ตัวเองพฤติกรรมที่เห็นแก่ผู้อื่นการปฏิสนธิในตัวเอง 34. อีกตัวอย่างหนึ่งของพฤติกรรมการทำงานร่วมกันในตัวอสุจิที่พบในหนูกวาง ซึ่งตัวอสุจิสามารถระบุและรวมกับตัวอสุจิที่เกี่ยวข้องทางพันธุกรรมมากที่สุดและสร้างกลุ่มความร่วมมือเพื่อเพิ่มความเร็วเมื่อเทียบกับตัวอสุจิที่ไม่เกี่ยวข้องกัน
ผลลัพธ์ที่ได้จากการศึกษานี้ไม่ขัดแย้งกับทฤษฎีของ Foman เกี่ยวกับการเก็บรักษาสเปิร์มมาโตซัวในระยะยาวใน SWSนักวิจัยรายงานว่าเซลล์สเปิร์มยังคงเคลื่อนที่ต่อไปในการไหลของเซลล์เยื่อบุผิวที่ซับใน SST เป็นระยะเวลานาน และหลังจากช่วงระยะเวลาหนึ่ง แหล่งเก็บพลังงานของเซลล์สเปิร์มจะหมดลง ส่งผลให้ความเร็วลดลง ซึ่งช่วยให้ขับสารที่มีน้ำหนักโมเลกุลขนาดเล็กออกได้พลังงานของตัวอสุจิกับการไหลของของเหลวจากลูเมนของ SST โพรงของท่อนำไข่ในการศึกษาปัจจุบัน เราสังเกตเห็นว่าสเปิร์มครึ่งหนึ่งแสดงความสามารถในการว่ายน้ำกับของเหลวที่ไหล และการยึดเกาะของสเปิร์มในห่อเพิ่มความสามารถในการแสดงรีโอโลยีในเชิงบวกนอกจากนี้ ข้อมูลของเรายังสอดคล้องกับข้อมูลของ Matsuzaki และคณะ1 ที่รายงานว่าการหลั่งแลคเตทที่เพิ่มขึ้นใน SST อาจขัดขวางการเคลื่อนไหวของสเปิร์มที่อาศัยอยู่อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ของเราอธิบายถึงการก่อตัวของเส้นเอ็นที่เคลื่อนที่ได้ของตัวอสุจิและพฤติกรรมการไหลของมันในที่ที่มีสภาพแวดล้อมแบบไดนามิกภายในไมโครแชนเนลเพื่อพยายามอธิบายพฤติกรรมของพวกมันใน SSTการวิจัยในอนาคตอาจมุ่งเน้นไปที่การกำหนดองค์ประกอบทางเคมีและที่มาของสารที่จับตัวเป็นก้อน ซึ่งจะช่วยให้นักวิจัยพัฒนาวิธีใหม่ในการเก็บน้ำอสุจิและเพิ่มระยะเวลาของการเจริญพันธุ์อย่างไม่ต้องสงสัย
ปลาฉลามเพศผู้คอเปลือยอายุ 30 สัปดาห์จำนวน 15 ตัว (homozygous Dominant; Na Na) ได้รับเลือกให้เป็นผู้บริจาคสเปิร์มในการศึกษานกเหล่านี้ถูกเลี้ยงที่ฟาร์มสัตว์ปีกวิจัยของคณะเกษตรศาสตร์ มหาวิทยาลัยอาชิต เขตอาชิต เวอร์นนอเรท ประเทศอียิปต์นกถูกขังอยู่ในกรงเดี่ยว (30 x 40 x 40 ซม.) ภายใต้โปรแกรมแสง (แสง 16 ชั่วโมงและความมืด 8 ชั่วโมง) และให้อาหารที่มีโปรตีนหยาบ 160 กรัม พลังงานที่เผาผลาญได้ 2,800 กิโลแคลอรี แคลเซียม 35 กรัมต่อตัวฟอสฟอรัสที่มีอยู่ 5 กรัมต่ออาหารหนึ่งกิโลกรัม
จากข้อมูล 36, 37 เก็บน้ำเชื้อจากตัวผู้โดยการนวดท้องเก็บตัวอย่างน้ำอสุจิทั้งหมด 45 ตัวอย่างจากผู้ชาย 15 คนในระยะเวลา 3 วันน้ำอสุจิ (n = 15/วัน) ถูกเจือจางทันที 1:1 (v:v) ด้วยสารเจือจางน้ำเชื้อสัตว์ปีก Belsville ซึ่งประกอบด้วยโพแทสเซียมไดฟอสเฟต (1.27 ก.) โมโนโซเดียมกลูตาเมต โมโนไฮเดรต (0.867 ก.) ฟรุกโตส (0.5 วัน) โซเดียมปราศจากน้ำอะซีเตต (0.43 ก.), ไตร (ไฮดรอกซีเมทิล)อะมิโนมีเทน (0.195 ก.), โพแทสเซียมซิเตรตโมโนไฮเดรต (0.064 ก.), โพแทสเซียมโมโนฟอสเฟต (0.065 ก.), แมกนีเซียมคลอไรด์ (0.034 ก.) และ H2O (100 มล.), pH = 7, 5, ออสโมลาริตี 333 mOsm/กก.38ตัวอย่างน้ำเชื้อที่เจือจางถูกตรวจสอบก่อนด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงเพื่อให้แน่ใจว่าน้ำเชื้อมีคุณภาพ (ความชื้น) ดี จากนั้นจึงเก็บไว้ในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C จนกระทั่งใช้ภายในครึ่งชั่วโมงหลังการเก็บ
จลนพลศาสตร์และการไหลของสเปิร์มถูกอธิบายโดยใช้ระบบของอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิคตัวอย่างน้ำอสุจิถูกเจือจางเพิ่มเติมเป็น 1:40 ในสารเจือจางน้ำเชื้อนก Beltsville Avian บรรจุลงในอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิก (ดูด้านล่าง) และกำหนดพารามิเตอร์จลนพลศาสตร์โดยใช้ระบบ Computerized Semen Analysis (CASA) ที่พัฒนาขึ้นก่อนหน้านี้สำหรับการวิเคราะห์ลักษณะเฉพาะของไมโครฟลูอิดิกส์เกี่ยวกับการเคลื่อนที่ของตัวอสุจิในสื่อของเหลว (ภาควิชาวิศวกรรมเครื่องกล คณะวิศวกรรมศาสตร์ Assiut University ประเทศอียิปต์)สามารถดาวน์โหลดปลั๊กอินได้ที่: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39วัดความเร็วเส้นโค้ง (VCL, μm/s), ความเร็วเชิงเส้น (VSL, μm/s) และความเร็ววิถีเฉลี่ย (VAP, μm/s)วิดีโอของตัวอสุจิถ่ายโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟส Optika XDS-3 แบบกลับหัว (โดยมีวัตถุประสงค์ 40x) ที่เชื่อมต่อกับกล้อง Tucson ISH1000 ที่ 30 fps เป็นเวลา 3 วินาทีใช้ซอฟต์แวร์ CASA เพื่อศึกษาพื้นที่อย่างน้อย 3 แห่งและเส้นทางโคจรของตัวอสุจิ 500 ตัวต่อตัวอย่างวิดีโอที่บันทึกได้รับการประมวลผลโดยใช้ CASA แบบโฮมเมดคำจำกัดความของการเคลื่อนที่ในปลั๊กอิน CASA ขึ้นอยู่กับความเร็วในการว่ายน้ำของตัวอสุจิเมื่อเทียบกับอัตราการไหล และไม่รวมถึงพารามิเตอร์อื่นๆ เช่น การเคลื่อนที่จากด้านหนึ่งไปอีกด้านหนึ่ง เนื่องจากพบว่ามีความเชื่อถือได้มากกว่าในการไหลของของไหลการเคลื่อนที่แบบรีโอโลจีเป็นการเคลื่อนที่ของเซลล์สเปิร์มสวนทางกับทิศทางการไหลของของไหลสเปิร์มมาโตซัวที่มีคุณสมบัติการไหลถูกหารด้วยจำนวนสเปิร์มที่เคลื่อนไหวได้ตัวอสุจิที่อยู่นิ่งและตัวอสุจิที่เคลื่อนที่แบบพาความร้อนไม่รวมอยู่ในจำนวน
สารเคมีทั้งหมดที่ใช้ได้มาจาก Elgomhoria Pharmaceuticals (ไคโร ประเทศอียิปต์) เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่นอุปกรณ์นี้ผลิตขึ้นตามที่อธิบายโดย El-sherry และคณะ40 มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยวัสดุที่ใช้ในการประดิษฐ์ไมโครแชนเนลประกอบด้วยแผ่นแก้ว (Howard Glass, Worcester, MA), ตัวต้านทานเชิงลบ SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), ไดอะซีโทนแอลกอฮอล์ (Sigma Aldrich, Steinheim, เยอรมนี) และโพลิอะซิโตน-184, ดาวโจนส์ คอร์นนิ่ง, มิดแลนด์, มิชิแกน)ไมโครแชนเนลถูกสร้างขึ้นโดยใช้การพิมพ์หินแบบอ่อนประการแรก หน้ากากป้องกันแบบใสที่มีการออกแบบไมโครแชนเนลที่ต้องการพิมพ์บนเครื่องพิมพ์ความละเอียดสูง (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON)ต้นแบบถูกสร้างขึ้นโดยใช้แผ่นกระจกเป็นพื้นผิวจานถูกทำความสะอาดในอะซีโตน, ไอโซโพรพานอลและน้ำปราศจากไอออนและจากนั้นเคลือบด้วยชั้น 20 µm ของ SU8-25 โดยการเคลือบแบบหมุน (3000 รอบต่อนาที, 1 นาที)จากนั้น ชั้น SU-8 ถูกทำให้แห้งอย่างเบามือ (65°C, 2 นาที และ 95°C, 10 นาที) และสัมผัสกับรังสี UV เป็นเวลา 50 วินาทีอบหลังการอบที่อุณหภูมิ 65°C และ 95°C เป็นเวลา 1 นาที และ 4 นาที เพื่อเชื่อมขวางชั้น SU-8 ที่สัมผัส ตามด้วยการพัฒนาในไดอะซีโทนแอลกอฮอล์เป็นเวลา 6.5 นาทีอบวาฟเฟิลอย่างหนัก (200°C เป็นเวลา 15 นาที) เพื่อให้ชั้น SU-8 แข็งขึ้น
PDMS เตรียมโดยการผสมโมโนเมอร์และสารเพิ่มความแข็งในอัตราส่วนน้ำหนัก 10:1 จากนั้นไล่ก๊าซในเครื่องดูดความชื้นและเทลงบนโครงหลักของ SU-8PDMS ถูกบ่มในเตาอบ (120°C, 30 นาที) จากนั้นจึงตัดช่องออก แยกออกจากตัวหลัก และเจาะรูเพื่อให้ติดท่อที่ทางเข้าและทางออกของไมโครแชนเนลได้สุดท้าย ไมโครแชนเนล PDMS ถูกแนบอย่างถาวรกับสไลด์กล้องจุลทรรศน์โดยใช้ตัวประมวลผลโคโรนาแบบพกพา (ผลิตภัณฑ์อิเล็กโทรเทคนิค ชิคาโก อิลลินอยส์) ตามที่อธิบายไว้ที่อื่นช่องไมโครที่ใช้ในการศึกษานี้มีขนาด 200 µm × 20 µm (กว้าง × สูง) และมีความยาว 3.6 ซม.
การไหลของของไหลที่เกิดจากความดันอุทกสถิตภายในไมโครแชนเนลสามารถทำได้โดยการรักษาระดับของไหลในอ่างเก็บน้ำทางเข้าให้สูงกว่าความแตกต่างของความสูง Δh39 ในอ่างเก็บน้ำทางออก (รูปที่ 1)
โดยที่ f คือค่าสัมประสิทธิ์แรงเสียดทาน กำหนดเป็น f = C/Re สำหรับการไหลแบบราบเรียบในช่องสี่เหลี่ยม โดยที่ C เป็นค่าคงที่ขึ้นอยู่กับอัตราส่วนของช่อง L คือความยาวของช่องไมโคร Vav คือความเร็วเฉลี่ยภายในช่องไมโคร Dh คือเส้นผ่านศูนย์กลางไฮดรอลิกของช่อง g คือความเร่งของแรงโน้มถ่วงเมื่อใช้สมการนี้ ความเร็วของช่องสัญญาณเฉลี่ยสามารถคำนวณได้โดยใช้สมการต่อไปนี้: