ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com คุณกำลังใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันที่รองรับ CSS ได้จำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) นอกจากนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าจะได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจึงแสดงเว็บไซต์โดยไม่ใช้รูปแบบและ JavaScript
เมื่อไม่นานมานี้ ได้มีการพัฒนาแพลตฟอร์มต่อต้านจุลินทรีย์ปลอดสารเคมีที่ใช้เทคโนโลยีนาโนโดยใช้นาโนโครงสร้างน้ำเทียม (EWNS) EWNS มีประจุบนพื้นผิวสูงและอุดมไปด้วยออกซิเจนที่มีปฏิกิริยา (ROS) ซึ่งสามารถโต้ตอบและทำให้จุลินทรีย์หลายชนิดไม่ทำงานได้ รวมถึงเชื้อก่อโรคที่ปนเปื้อนในอาหาร ที่นี่จะแสดงให้เห็นว่าคุณสมบัติของจุลินทรีย์เหล่านี้ในระหว่างการสังเคราะห์สามารถปรับแต่งและเพิ่มประสิทธิภาพเพื่อเพิ่มศักยภาพในการต่อต้านแบคทีเรียได้อีกด้วย แพลตฟอร์มห้องปฏิบัติการ EWNS ได้รับการออกแบบมาเพื่อปรับแต่งคุณสมบัติของ EWNS โดยการเปลี่ยนพารามิเตอร์การสังเคราะห์ การกำหนดลักษณะของคุณสมบัติของ EWNS (ประจุ ขนาด และปริมาณ ROS) ดำเนินการโดยใช้วิธีการวิเคราะห์ที่ทันสมัย ​​นอกจากนี้ จุลินทรีย์ในอาหาร เช่น Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum และ Saccharomyces cerevisiae ได้รับการเพาะเลี้ยงบนพื้นผิวของมะเขือเทศองุ่นออร์แกนิกเพื่อประเมินศักยภาพในการทำให้จุลินทรีย์ไม่ทำงาน ผลลัพธ์ที่นำเสนอในที่นี้แสดงให้เห็นว่าคุณสมบัติของ EWNS สามารถปรับแต่งได้ในระหว่างการสังเคราะห์ ส่งผลให้ประสิทธิภาพการทำให้ไม่ทำงานเพิ่มขึ้นแบบทวีคูณ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ประจุบนพื้นผิวเพิ่มขึ้นเป็นสี่เท่า และปริมาณ ROS ก็เพิ่มขึ้น อัตราการกำจัดจุลินทรีย์ขึ้นอยู่กับจุลินทรีย์และอยู่ในช่วง 1.0 ถึง 3.8 log หลังจากสัมผัสกับ EWNS ปริมาณละอองลอย 40,000 #/cm3 เป็นเวลา 45 นาที
การปนเปื้อนของจุลินทรีย์เป็นสาเหตุหลักของการเจ็บป่วยจากอาหารที่เกิดจากการกินเชื้อโรคหรือสารพิษจากเชื้อโรค โรคจากอาหารเป็นสาเหตุของความเจ็บป่วยประมาณ 76 ล้านกรณี ผู้ป่วยต้องเข้ารักษาในโรงพยาบาล 325,000 ราย และผู้เสียชีวิต 5,000 รายต่อปีในสหรัฐอเมริกาเพียงประเทศเดียว1 นอกจากนี้ กระทรวงเกษตรสหรัฐอเมริกา (USDA) ประมาณการว่าการบริโภคผลิตผลสดที่เพิ่มขึ้นเป็นสาเหตุของโรคจากอาหารทั้งหมด 48 เปอร์เซ็นต์ในสหรัฐอเมริกา2 ค่าใช้จ่ายในการเจ็บป่วยและการเสียชีวิตจากเชื้อโรคจากอาหารในสหรัฐอเมริกาสูงมาก โดยศูนย์ควบคุมและป้องกันโรค (CDC) ประมาณการไว้ที่มากกว่า 15,600 ล้านดอลลาร์สหรัฐต่อปี3
ปัจจุบัน การแทรกแซงด้วยสารเคมี4 รังสี5 และความร้อน6 เพื่อรับประกันความปลอดภัยของอาหารนั้น ส่วนใหญ่จะดำเนินการในจุดควบคุมวิกฤต (CCP) ที่จำกัดในห่วงโซ่การผลิต (โดยปกติแล้วจะทำหลังการเก็บเกี่ยวและ/หรือระหว่างการบรรจุหีบห่อ) แทนที่จะดำเนินการอย่างต่อเนื่องในลักษณะที่ผลิตภัณฑ์สดอาจปนเปื้อนข้ามกันได้7 จำเป็นต้องมีการแทรกแซงด้วยสารต้านจุลชีพเพื่อควบคุมโรคจากอาหารและการเน่าเสียของอาหารได้ดีขึ้น และอาจนำไปใช้ได้ตั้งแต่ฟาร์มจนถึงโต๊ะอาหาร ผลกระทบและต้นทุนน้อยลง
แพลตฟอร์มต่อต้านจุลินทรีย์ปลอดสารเคมีที่ใช้เทคโนโลยีนาโนได้รับการพัฒนาขึ้นเมื่อไม่นานนี้เพื่อทำลายแบคทีเรียบนพื้นผิวและในอากาศโดยใช้โครงสร้างนาโนน้ำเทียม (EWNS) สำหรับการสังเคราะห์ EVNS มีการใช้กระบวนการคู่ขนานสองกระบวนการ ได้แก่ อิเล็กโทรสเปรย์และการแตกตัวของน้ำ (รูปที่ 1a) ก่อนหน้านี้ EWNS ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีคุณสมบัติทางกายภาพและทางชีวภาพเฉพาะตัว8,9,10 EWNS มีอิเล็กตรอนเฉลี่ย 10 ตัวต่อโครงสร้างและมีขนาดนาโนเมตรเฉลี่ย 25 ​​นาโนเมตร (รูปที่ 1b,c)8,9,10 นอกจากนี้ การสั่นพ้องของสปินอิเล็กตรอน (ESR) แสดงให้เห็นว่า EWNS มีอนุมูลออกซิเจนที่มีปฏิกิริยา (ROS) จำนวนมาก โดยส่วนใหญ่เป็นไฮดรอกซิล (OH•) และซูเปอร์ออกไซด์ (O2-) (รูปที่ 1c)8 EWNS อยู่ในอากาศเป็นเวลานานและอาจชนกับจุลินทรีย์ที่แขวนลอยอยู่ในอากาศและอยู่บนพื้นผิว ส่งผลให้จุลินทรีย์ได้รับ ROS และทำให้จุลินทรีย์ไม่ทำงาน (รูปที่ 1d) จากการศึกษาในช่วงก่อนหน้านี้ยังแสดงให้เห็นอีกด้วยว่า EWNS สามารถโต้ตอบและทำให้แบคทีเรียแกรมลบและแกรมบวกที่มีความสำคัญต่อสุขภาพของประชาชน รวมถึงไมโคแบคทีเรีย ไม่ทำงานบนพื้นผิวและในอากาศได้8,9 กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านแสดงให้เห็นว่าการทำให้ไม่ทำงานนั้นเกิดจากการทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ นอกจากนี้ การศึกษาการสูดดมแบบเฉียบพลันยังแสดงให้เห็นว่า EWNS ปริมาณสูงไม่ก่อให้เกิดความเสียหายหรือการอักเสบของปอด8
(ก) การพ่นไฟฟ้าเกิดขึ้นเมื่อมีแรงดันไฟฟ้าสูงเกิดขึ้นระหว่างของเหลวในเส้นเลือดฝอยและเคาน์เตอร์อิเล็กโทรด (ข) การใช้แรงดันไฟฟ้าสูงส่งผลให้เกิดปรากฏการณ์สองประการที่แตกต่างกัน: (i) การพ่นน้ำด้วยไฟฟ้า และ (ii) การสร้างออกซิเจนที่มีปฏิกิริยา (ไอออน) ที่ดักจับอยู่ใน EWNS (ค) โครงสร้างเฉพาะตัวของ EWNS (ง) EWNS มีการเคลื่อนที่ได้สูงเนื่องจากลักษณะในระดับนาโน และสามารถโต้ตอบกับเชื้อโรคในอากาศได้
นอกจากนี้ ความสามารถของแพลตฟอร์มต่อต้านจุลินทรีย์ EWNS ในการทำให้จุลินทรีย์ที่ปนเปื้อนในอาหารที่อยู่บนพื้นผิวของอาหารสดไม่ทำงานยังได้รับการพิสูจน์แล้วเมื่อไม่นานมานี้ นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นอีกด้วยว่าสามารถใช้ประจุบนพื้นผิวของ EWNS ร่วมกับสนามไฟฟ้าเพื่อส่งไปยังเป้าหมายได้ ที่สำคัญกว่านั้น ผลลัพธ์เริ่มต้นที่มีแนวโน้มดีคือกิจกรรมมะเขือเทศอินทรีย์ลดลงประมาณ 1.4 log ต่อจุลินทรีย์ในอาหารต่างๆ เช่น E. coli และ Listeria ซึ่งสังเกตได้ภายใน 90 นาทีหลังจากสัมผัสกับ EWNS ที่ความเข้มข้นประมาณ 50,000#/cm311 นอกจากนี้ การทดสอบประเมินทางประสาทสัมผัสเบื้องต้นยังไม่พบผลทางประสาทสัมผัสเมื่อเทียบกับมะเขือเทศควบคุม แม้ว่าผลการทำให้ไม่ทำงานเบื้องต้นเหล่านี้จะรับประกันความปลอดภัยของอาหารได้แม้จะใช้ EWNS ในปริมาณต่ำมากที่ 50,000#/cc ก็ตาม แต่ก็ชัดเจนว่าศักยภาพในการทำให้ไม่ทำงานที่สูงขึ้นจะมีประโยชน์มากกว่าในการลดความเสี่ยงของการติดเชื้อและการเน่าเสียต่อไป
ที่นี่ เราจะมุ่งเน้นการวิจัยของเราไปที่การพัฒนาแพลตฟอร์มการสร้าง EWNS เพื่อปรับแต่งพารามิเตอร์การสังเคราะห์และปรับคุณสมบัติทางฟิสิกเคมีของ EWNS ให้เหมาะสมเพื่อเพิ่มศักยภาพในการต่อต้านแบคทีเรีย โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การเพิ่มประสิทธิภาพมุ่งเน้นไปที่การเพิ่มประจุบนพื้นผิว (เพื่อปรับปรุงการส่งมอบแบบกำหนดเป้าหมาย) และปริมาณ ROS (เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการทำให้ไม่ทำงาน) การกำหนดลักษณะคุณสมบัติทางฟิสิกเคมีที่เหมาะสมที่สุด (ขนาด ประจุ และปริมาณ ROS) โดยใช้วิธีการวิเคราะห์สมัยใหม่และการใช้จุลินทรีย์ในอาหารทั่วไป เช่น E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae และ M. parafortuitum
EVNS สังเคราะห์ขึ้นโดยการพ่นไฟฟ้าพร้อมกันและการแตกตัวเป็นไอออนของน้ำที่มีความบริสุทธิ์สูง (18 MΩ cm–1) โดยทั่วไปแล้วอะตอมไมเซอร์ไฟฟ้า 12 จะใช้เพื่อทำให้ของเหลวและพอลิเมอร์สังเคราะห์และอนุภาคเซรามิก 13 และเส้นใย 14 มีขนาดที่ควบคุมได้เป็นละออง
ตามที่ระบุโดยละเอียดในเอกสารเผยแพร่ก่อนหน้านี้ 8, 9, 10, 11 ในการทดลองทั่วไป แรงดันไฟฟ้าสูงจะถูกจ่ายระหว่างแคปิลลารีโลหะและเคาน์เตอร์อิเล็กโทรดที่ต่อสายดิน ในระหว่างกระบวนการนี้ จะเกิดปรากฏการณ์ที่แตกต่างกันสองอย่างคือ 1) สเปรย์ไฟฟ้า และ 2) การแตกตัวของน้ำ สนามไฟฟ้าแรงสูงระหว่างอิเล็กโทรดทั้งสองทำให้ประจุลบก่อตัวขึ้นบนพื้นผิวของน้ำที่ควบแน่น ส่งผลให้เกิดการก่อตัวของกรวยเทย์เลอร์ เป็นผลให้เกิดหยดน้ำที่มีประจุสูง ซึ่งแตกตัวเป็นอนุภาคขนาดเล็กลงเรื่อยๆ ตามทฤษฎีของเรย์ลี16 ในเวลาเดียวกัน สนามไฟฟ้าแรงสูงทำให้โมเลกุลของน้ำบางส่วนแตกตัวและดึงอิเล็กตรอนออก (การแตกตัว) จึงสร้างอนุมูลออกซิเจนที่มีปฏิกิริยา (ROS) จำนวนมาก17 แพ็คเก็ต ROS18 ที่เกิดขึ้นพร้อมกันถูกห่อหุ้มไว้ใน EWNS (รูปที่ 1c)
รูปที่ 2a แสดงระบบสร้าง EWNS ที่พัฒนาและใช้ในการสังเคราะห์ EWNS ในการศึกษานี้ น้ำบริสุทธิ์ที่เก็บไว้ในขวดปิดจะถูกป้อนผ่านท่อเทฟลอน (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 2 มม.) ไปยังเข็มสเตนเลสสตีล 30G (เส้นเลือดฝอยโลหะ) ตามที่แสดงในรูปที่ 2b การไหลของน้ำจะถูกควบคุมโดยแรงดันอากาศภายในขวด เข็มติดอยู่กับคอนโซลเทฟลอนซึ่งสามารถปรับด้วยมือให้ห่างจากเคาน์เตอร์อิเล็กโทรดในระยะหนึ่ง เคาน์เตอร์อิเล็กโทรดเป็นแผ่นอะลูมิเนียมขัดเงาที่มีรูตรงกลางสำหรับการสุ่มตัวอย่าง ด้านล่างของเคาน์เตอร์อิเล็กโทรดเป็นกรวยสุ่มตัวอย่างอะลูมิเนียม ซึ่งเชื่อมต่อกับส่วนที่เหลือของการตั้งค่าการทดลองผ่านพอร์ตสุ่มตัวอย่าง (รูปที่ 2b) ส่วนประกอบของเครื่องสุ่มตัวอย่างทั้งหมดได้รับการต่อสายดินเพื่อหลีกเลี่ยงการสะสมประจุซึ่งอาจทำให้การสุ่มตัวอย่างอนุภาคเสื่อมลง
(ก) ระบบสร้างโครงสร้างนาโนของน้ำวิศวกรรม (EWNS) (ข) หน้าตัดของเครื่องเก็บตัวอย่างและหน่วยอิเล็กโทรสเปรย์ที่แสดงพารามิเตอร์ที่สำคัญที่สุด (ค) การตั้งค่าการทดลองสำหรับการทำให้แบคทีเรียไม่ทำงาน
ระบบสร้าง EWNS ที่อธิบายไว้ข้างต้นสามารถเปลี่ยนพารามิเตอร์การทำงานหลักเพื่ออำนวยความสะดวกในการปรับแต่งคุณสมบัติของ EWNS ให้ละเอียดขึ้น ปรับแรงดันไฟฟ้าที่ใช้ (V) ระยะห่างระหว่างเข็มและเคาน์เตอร์อิเล็กโทรด (L) และการไหลของน้ำ (φ) ผ่านเส้นเลือดฝอยเพื่อปรับแต่งคุณสมบัติของ EWNS ให้ละเอียดขึ้น สัญลักษณ์ [V (kV), L (cm)] ใช้เพื่อระบุการรวมกันที่แตกต่างกัน ปรับการไหลของน้ำเพื่อให้ได้กรวยเทย์เลอร์ที่เสถียรตามชุดที่กำหนด [V, L] สำหรับวัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้ รูรับแสงของเคาน์เตอร์อิเล็กโทรด (D) ถูกตั้งค่าไว้ที่ 0.5 นิ้ว (1.29 ซม.)
เนื่องจากรูปทรงเรขาคณิตและความไม่สมมาตรมีจำกัด จึงไม่สามารถคำนวณความเข้มของสนามไฟฟ้าจากหลักการพื้นฐานได้ จึงต้องนำซอฟต์แวร์ QuickField™ (Svendborg, Denmark)19 มาใช้เพื่อคำนวณสนามไฟฟ้าแทน สนามไฟฟ้าไม่สม่ำเสมอ ดังนั้นจึงใช้ค่าของสนามไฟฟ้าที่ปลายแคปิลลารีเป็นค่าอ้างอิงสำหรับการกำหนดค่าต่างๆ
ระหว่างการศึกษา มีการประเมินค่าแรงดันไฟฟ้าและระยะห่างระหว่างเข็มกับเคาน์เตอร์อิเล็กโทรดหลายค่าในแง่ของการสร้างกรวยเทย์เลอร์ ความเสถียรของกรวยเทย์เลอร์ ความเสถียรของการผลิต EWNS และความสามารถในการทำซ้ำได้ ค่าต่างๆ แสดงอยู่ในตารางเสริม S1
เอาต์พุตของระบบสร้าง EWNS เชื่อมต่อโดยตรงกับ Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, รุ่น 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) เพื่อวัดความเข้มข้นของจำนวนอนุภาค และใช้ร่วมกับเครื่องวัดการไหลของละอองลอยฟาราเดย์ (TSI, รุ่น 3068B, Shoreview, USA) (MN) เพื่อวัดการไหลของละอองลอยตามที่อธิบายไว้ในสิ่งพิมพ์ก่อนหน้าของเรา9 ทั้ง SMPS และเครื่องวัดการไหลของละอองลอยถูกสุ่มตัวอย่างที่อัตราการไหล 0.5 ลิตร/นาที (การไหลของตัวอย่างทั้งหมด 1 ลิตร/นาที) วัดความเข้มข้นของอนุภาคและฟลักซ์ของละอองลอยเป็นเวลา 120 วินาที ทำซ้ำการวัด 30 ครั้ง ประจุละอองลอยทั้งหมดคำนวณจากการวัดปัจจุบัน และประจุเฉลี่ยของ EWNS ประมาณการจากจำนวนอนุภาค EWNS ทั้งหมดที่สุ่มตัวอย่าง ต้นทุนเฉลี่ยของ EWNS สามารถคำนวณได้โดยใช้สมการ (1):
โดยที่ IEl คือกระแสที่วัดได้ NSMPS คือจำนวนความเข้มข้นที่วัดได้ด้วย SMPS และ φEl คืออัตราการไหลไปยังอิเล็กโตรมิเตอร์
เนื่องจากความชื้นสัมพัทธ์ (RH) ส่งผลต่อประจุพื้นผิว จึงทำให้อุณหภูมิและ (RH) คงที่ที่ 21°C และ 45% ตามลำดับ ในระหว่างการทดลอง
กล้องจุลทรรศน์แรงอะตอม (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) และหัววัด AC260T (Olympus, Tokyo, Japan) ถูกใช้เพื่อวัดขนาดและอายุการใช้งานของ EWNS อัตราการสแกน AFM คือ 1 Hz และพื้นที่การสแกนคือ 5 µm×5 µm พร้อมเส้นสแกน 256 เส้น ภาพทั้งหมดได้รับการปรับตำแหน่งภาพลำดับแรกโดยใช้ซอฟต์แวร์ Asylum (มาส์กที่มีช่วง 100 นาโนเมตรและเกณฑ์ 100 พีเอ็ม)
ถอดกรวยเก็บตัวอย่างออกและวางพื้นผิวไมก้าห่างจากเคาน์เตอร์อิเล็กโทรด 2.0 ซม. เป็นเวลาเฉลี่ย 120 วินาที เพื่อหลีกเลี่ยงการรวมตัวของอนุภาคและการเกิดหยดน้ำที่ไม่สม่ำเสมอบนพื้นผิวไมก้า EWNS ถูกนำไปใช้กับพื้นผิวไมก้าที่เพิ่งตัดใหม่โดยตรง (Ted Pella, Redding, CA) ทันทีหลังจากการสปัตเตอร์ พื้นผิวไมก้าจะถูกมองเห็นโดยใช้ AFM มุมสัมผัสพื้นผิวของไมก้าที่เพิ่งตัดใหม่ที่ไม่ได้ดัดแปลงนั้นใกล้เคียงกับ 0° ดังนั้น EWNS จึงแพร่กระจายไปบนพื้นผิวไมก้าในรูปทรงโดม20 เส้นผ่านศูนย์กลาง (a) และความสูง (h) ของหยดน้ำที่กระจายตัวถูกวัดโดยตรงจากภูมิประเทศ AFM และใช้ในการคำนวณปริมาตรการแพร่กระจายทรงโดมของ EWNS โดยใช้วิธีที่ผ่านการตรวจสอบแล้วของเรา8 โดยถือว่า EVNS บนเครื่องมีปริมาตรเท่ากัน เส้นผ่านศูนย์กลางเทียบเท่าสามารถคำนวณได้จากสมการ (2):
ตามวิธีที่เราพัฒนาไว้ก่อนหน้านี้ กับดักสปินเรโซแนนซ์อิเล็กตรอน (ESR) ถูกใช้เพื่อตรวจจับการปรากฏตัวของสารตัวกลางอนุมูลอิสระอายุสั้นใน EWNS ละอองลอยถูกส่งผ่านสารละลายที่มี DEPMPO 235 มิลลิโมลาร์ (5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) (Oxis International Inc., พอร์ตแลนด์, ออริกอน) การวัด EPR ทั้งหมดดำเนินการโดยใช้เครื่องสเปกโตรมิเตอร์ Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) และอาร์เรย์เซลล์แบบแบน ใช้ซอฟต์แวร์ Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) เพื่อรวบรวมและวิเคราะห์ข้อมูล การกำหนดลักษณะของ ROS ดำเนินการเฉพาะสำหรับเงื่อนไขการทำงานชุดหนึ่ง [-6.5 kV, 4.0 ซม.] ความเข้มข้นของ EWNS ถูกวัดโดยใช้ SMPS หลังจากคำนึงถึงการสูญเสีย EWNS ในเครื่องกระทบ
ระดับโอโซนถูกตรวจสอบโดยใช้เครื่อง 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10
สำหรับคุณสมบัติ EWNS ทั้งหมด ค่าการวัดคือค่าเฉลี่ยของการวัด และข้อผิดพลาดในการวัดคือค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน ดำเนินการทดสอบ t เพื่อเปรียบเทียบค่าแอตทริบิวต์ EWNS ที่ปรับให้เหมาะสมกับค่าที่สอดคล้องกันของ EWNS ฐาน
รูปที่ 2c แสดงระบบ Electrostatic Precipitation Pass Through System (EPES) ที่ได้รับการพัฒนาและมีลักษณะเฉพาะก่อนหน้านี้ ซึ่งสามารถใช้เพื่อกำหนดเป้าหมาย EWNS11 บนพื้นผิว EPES ใช้ประจุ EWNS ร่วมกับสนามไฟฟ้าแรงสูงเพื่อ "ชี้" ไปที่พื้นผิวของเป้าหมายโดยตรง รายละเอียดของระบบ EPES นำเสนอในเอกสารเผยแพร่ล่าสุดของ Pyrgiotakis et al.11 ดังนั้น EPES จึงประกอบด้วยห้อง PVC ที่พิมพ์ 3 มิติที่มีปลายเรียวซึ่งมีแผ่นโลหะสเตนเลสสตีลขนานกันสองแผ่น (สเตนเลสสตีล 304 ขัดเงาเป็นกระจก) อยู่ตรงกลาง ห่างกัน 15.24 ซม. แผ่นโลหะเชื่อมต่อกับแหล่งจ่ายแรงดันไฟฟ้าสูงภายนอก (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY) แผ่นโลหะด้านล่างเป็นบวกเสมอ และแผ่นโลหะด้านบนเป็นกราวด์ (ลอย) เสมอ ผนังห้องถูกปกคลุมด้วยแผ่นอลูมิเนียมฟอยล์ ซึ่งต่อลงกราวด์ด้วยไฟฟ้าเพื่อป้องกันการสูญเสียอนุภาค ห้องนี้มีประตูโหลดด้านหน้าที่ปิดผนึกซึ่งช่วยให้สามารถวางพื้นผิวการทดสอบบนชั้นวางพลาสติกได้ โดยยกออกจากแผ่นโลหะด้านล่างเพื่อหลีกเลี่ยงการรบกวนแรงดันไฟฟ้าสูง
ประสิทธิภาพการสะสมของ EWNS ใน EPES ได้รับการคำนวณตามโปรโตคอลที่พัฒนาขึ้นก่อนหน้านี้ซึ่งมีรายละเอียดอยู่ในรูปเสริมที่ S111
ในห้องควบคุม กระแสที่สองที่ไหลผ่านห้องทรงกระบอกจะเชื่อมต่อแบบอนุกรมกับระบบ EPES โดยใช้ตัวกรอง HEPA ตัวกลางเพื่อกำจัด EWNS ตามที่แสดงในรูปที่ 2c ละอองลอยของ EWNS จะถูกสูบผ่านห้องสองห้องที่เชื่อมต่อแบบอนุกรม ตัวกรองระหว่างห้องควบคุมและ EPES จะกำจัด EWNS ที่เหลือทั้งหมด ส่งผลให้มีอุณหภูมิ (T) ความชื้นสัมพัทธ์ (RH) และระดับโอโซนเท่ากัน
พบว่าจุลินทรีย์ในอาหารที่สำคัญสามารถปนเปื้อนผลิตผลสดได้ เช่น Escherichia coli (ATCC #27325) ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ในอุจจาระ, Salmonella enterica (ATCC #53647) ซึ่งเป็นเชื้อก่อโรคในอาหาร, Listeria innocua (ATCC #33090) ซึ่งเป็นทางเลือกแทน Listeria monocytogenes ที่ทำให้เกิดโรค , Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) ซึ่งเป็นทางเลือกแทนยีสต์ที่ทำให้เน่าเสีย และ Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) ซึ่งเป็นแบคทีเรียที่มีชีวิตที่ต้านทานได้ดีกว่า ซึ่งซื้อจาก ATCC (เมือง Manassas รัฐเวอร์จิเนีย)
ซื้อมะเขือเทศองุ่นออร์แกนิกจากตลาดใกล้บ้านแบบสุ่ม แล้วแช่เย็นที่อุณหภูมิ 4°C จนกว่าจะใช้ (นานถึง 3 วัน) เลือกมะเขือเทศขนาดทดลองที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 1/2 นิ้ว
โปรโตคอลสำหรับการฟัก การเพาะเชื้อ การสัมผัส และการนับโคโลนีได้มีการระบุรายละเอียดไว้ในเอกสารเผยแพร่ก่อนหน้านี้ของเรา และได้อธิบายไว้อย่างละเอียดในข้อมูลเสริม 11 ประสิทธิภาพของ EWNS ได้รับการประเมินโดยการนำมะเขือเทศที่เพาะเชื้อไปสัมผัสกับสาร 40,000 #/cm3 เป็นเวลา 45 นาที โดยสรุป ในเวลา t = 0 นาที มะเขือเทศสามลูกถูกนำมาใช้เพื่อประเมินจุลินทรีย์ที่รอดชีวิต มะเขือเทศสามลูกถูกวางไว้ใน EPES และสัมผัสกับ EWNS ที่สาร 40,000 #/cc (มะเขือเทศที่สัมผัสกับ EWNS) และอีกสามลูกถูกวางไว้ในห้องควบคุม (มะเขือเทศควบคุม) ไม่มีกลุ่มมะเขือเทศใดถูกนำไปผ่านกระบวนการเพิ่มเติม มะเขือเทศที่สัมผัสกับ EWNS และกลุ่มควบคุมถูกนำออกหลังจาก 45 นาทีเพื่อประเมินผลของ EWNS
การทดลองแต่ละครั้งดำเนินการซ้ำสามครั้ง การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการตามโปรโตคอลที่อธิบายไว้ในข้อมูลเสริม
ตัวอย่างแบคทีเรีย E. coli, Enterobacter และ L. innocua ที่สัมผัสกับ EWNS (45 นาที ความเข้มข้นของละออง EWNS 40,000 #/cm3) และไม่ได้รับแสงจะถูกทำให้เป็นเม็ดเพื่อประเมินกลไกการทำให้ไม่ทำงาน ตะกอนถูกตรึงไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมงในสารละลายโซเดียมคาโคไดเลต 0.1 M (pH 7.4) พร้อมสารตรึงรูปกลูตารัลดีไฮด์ 2.5% พาราฟอร์มาลดีไฮด์ 1.25% และกรดพิคริก 0.03% หลังจากล้างแล้ว พวกมันจะถูกตรึงด้วยออสเมียมเตตรอกไซด์ 1% (OsO4)/โพแทสเซียมเฟอร์โรไซยาไนด์ 1.5% (KFeCN6) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ล้างด้วยน้ำ 3 ครั้ง และฟักในยูรานิลอะซิเตท 1% เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นล้างด้วยน้ำ 2 ครั้ง จากนั้นทำการทำให้แห้งด้วยแอลกอฮอล์ 50%, 70%, 90% และ 100% เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นนำตัวอย่างไปวางในโพรพิลีนออกไซด์เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วชุบด้วยส่วนผสมโพรพิลีนออกไซด์และ TAAP Epon ในอัตราส่วน 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) นำตัวอย่างไปฝังใน TAAB Epon แล้วทำการโพลีเมอร์ที่อุณหภูมิ 60°C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นจึงตัดเรซินเม็ดที่บ่มแล้วและตรวจดูด้วย TEM โดยใช้ JEOL 1200EX (JEOL, โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) ซึ่งเป็นกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านธรรมดาที่ติดตั้งกล้อง AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA)
การทดลองทั้งหมดดำเนินการซ้ำสามครั้ง สำหรับแต่ละจุดเวลา การล้างแบคทีเรียจะถูกเพาะซ้ำสามครั้ง ส่งผลให้มีจุดข้อมูลทั้งหมดเก้าจุดต่อจุด โดยค่าเฉลี่ยจะใช้เป็นความเข้มข้นของแบคทีเรียสำหรับสิ่งมีชีวิตนั้นๆ ส่วนค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานจะใช้เป็นข้อผิดพลาดในการวัด จุดทั้งหมดนับรวม
ลอการิทึมของการลดลงของความเข้มข้นของแบคทีเรียเมื่อเทียบกับ t = 0 นาที ถูกคำนวณโดยใช้สูตรต่อไปนี้:
โดยที่ C0 คือความเข้มข้นของแบคทีเรียในตัวอย่างควบคุม ณ เวลา 0 (กล่าวคือ หลังจากที่พื้นผิวแห้งแต่ก่อนที่จะถูกวางไว้ในห้อง) และ Cn คือความเข้มข้นของแบคทีเรียบนพื้นผิวหลังจากสัมผัสเป็นเวลา n นาที
เพื่อให้คำนึงถึงการย่อยสลายตามธรรมชาติของแบคทีเรียในช่วงเวลาการสัมผัส 45 นาที จึงได้คำนวณ Log-Reduction เมื่อเทียบกับการควบคุมที่ 45 นาที ดังนี้
โดยที่ Cn คือความเข้มข้นของแบคทีเรียในตัวอย่างควบคุม ณ เวลา n และ Cn-Control คือความเข้มข้นของแบคทีเรียควบคุม ณ เวลา n ข้อมูลจะแสดงเป็นค่าลอการิทึมที่ลดลงเมื่อเทียบกับตัวอย่างควบคุม (ไม่มีการสัมผัสกับ EWNS)
ระหว่างการศึกษา ได้มีการประเมินค่าแรงดันไฟฟ้าและระยะห่างระหว่างเข็มกับเคาน์เตอร์อิเล็กโทรดหลายแบบในแง่ของการสร้างกรวยเทย์เลอร์ ความเสถียรของกรวยเทย์เลอร์ ความเสถียรของการผลิต EWNS และความสามารถในการทำซ้ำได้ โดยแสดงค่าต่างๆ ไว้ในตารางเสริม S1 มีการเลือกสองกรณีศึกษาที่สมบูรณ์เพื่อแสดงคุณสมบัติที่เสถียรและทำซ้ำได้ (กรวยเทย์เลอร์ การผลิต EWNS และความเสถียรเมื่อเวลาผ่านไป) ในรูปที่ 3 แสดงผลของประจุ ขนาด และเนื้อหาของ ROS สำหรับสองกรณี ผลลัพธ์ยังสรุปไว้ในตารางที่ 1 สำหรับการอ้างอิง รูปที่ 3 และตารางที่ 1 ประกอบด้วยคุณสมบัติของ EWNS8, 9, 10, 11 ที่สังเคราะห์ขึ้นก่อนหน้านี้ซึ่งไม่ได้รับการปรับให้เหมาะสม (ค่าพื้นฐาน-EWNS) การคำนวณความสำคัญทางสถิติโดยใช้การทดสอบ t สองหางได้รับการตีพิมพ์ซ้ำในตารางเสริม S2 นอกจากนี้ ข้อมูลเพิ่มเติมยังรวมถึงการศึกษาเกี่ยวกับผลกระทบของเส้นผ่านศูนย์กลางรูสุ่มตัวอย่างเคาน์เตอร์อิเล็กโทรด (D) และระยะห่างระหว่างอิเล็กโทรดกราวด์กับปลายเข็ม (L) (รูปเสริม S2 และ S3)
(a–c) การกระจายขนาดของ AFM (d–f) ลักษณะประจุพื้นผิว (g) ลักษณะของ ROS และ ESR
สิ่งสำคัญที่ต้องทราบก็คือ สำหรับเงื่อนไขทั้งหมดข้างต้น กระแสไอออไนเซชันที่วัดได้จะอยู่ในช่วง 2-6 µA และแรงดันไฟฟ้าจะอยู่ในช่วง -3.8 ถึง -6.5 kV ส่งผลให้ EWNS ขั้วเดียวนี้มีการใช้พลังงานน้อยกว่า 50 mW . โมดูลการผลิต แม้ว่า EWNS จะสังเคราะห์ภายใต้แรงดันสูง แต่ระดับโอโซนก็ต่ำมาก โดยไม่เกิน 60 ppb
รูปเสริม S4 แสดงสนามไฟฟ้าจำลองสำหรับสถานการณ์ [-6.5 kV, 4.0 ซม.] และ [-3.8 kV, 0.5 ซม.] ตามลำดับ สนามไฟฟ้าตามสถานการณ์ [-6.5 kV, 4.0 ซม.] และ [-3.8 kV, 0.5 ซม.] คำนวณได้ 2 × 105 V/ม. และ 4.7 × 105 V/ม. ตามลำดับ ซึ่งถือเป็นสิ่งที่คาดไว้ เนื่องจากอัตราส่วนของแรงดันไฟฟ้าต่อระยะทางจะสูงกว่ามากในกรณีที่สอง
รูปที่ 3a,b แสดงเส้นผ่านศูนย์กลาง EWNS ที่วัดด้วย AFM8 เส้นผ่านศูนย์กลาง EWNS เฉลี่ยสำหรับสถานการณ์ [-6.5 kV, 4.0 ซม.] และ [-3.8 kV, 0.5 ซม.] คำนวณเป็น 27 นาโนเมตรและ 19 นาโนเมตรตามลำดับ ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานทางเรขาคณิตของการกระจายสำหรับกรณี [-6.5 kV, 4.0 ซม.] และ [-3.8 kV, 0.5 ซม.] คือ 1.41 และ 1.45 ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ถึงการกระจายขนาดที่แคบ ทั้งขนาดเฉลี่ยและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานทางเรขาคณิตนั้นใกล้เคียงกับค่า EWNS พื้นฐานมาก โดยอยู่ที่ 25 นาโนเมตรและ 1.41 ตามลำดับ รูปที่ 3c แสดงการกระจายขนาดของ EWNS พื้นฐานที่วัดโดยใช้วิธีเดียวกันภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน
รูปที่ 3d แสดงผลลัพธ์ของลักษณะประจุ ข้อมูลเป็นการวัดค่าเฉลี่ยของการวัดความเข้มข้น (#/cm3) และกระแสไฟฟ้า (I) พร้อมกัน 30 ครั้ง การวิเคราะห์แสดงให้เห็นว่าประจุเฉลี่ยบน EWNS คือ 22 ± 6 e- และ 44 ± 6 e- สำหรับ [-6.5 kV, 4.0 cm] และ [-3.8 kV, 0.5 cm] ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับ Baseline-EWNS (10 ± 2 e-) ประจุบนพื้นผิวจะสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ โดยสูงกว่าสถานการณ์ [-6.5 kV, 4.0 cm] สองเท่า และสูงกว่าสถานการณ์ [-3.8 kV, 0.5 cm] สี่เท่า รูปที่ 3f แสดงข้อมูลการชำระเงินพื้นฐานของ EWNS
จากแผนที่ความเข้มข้นของจำนวนอนุภาค EWNS (รูปเสริม S5 และ S6) จะเห็นได้ว่าฉาก [-6.5 kV, 4.0 ซม.] มีจำนวนอนุภาคที่สูงกว่าฉาก [-3.8 kV, 0.5 ซม.] อย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ ควรสังเกตด้วยว่าความเข้มข้นของจำนวนอนุภาค EWNS ได้รับการตรวจสอบนานถึง 4 ชั่วโมง (รูปเสริม S5 และ S6) โดยที่ความเสถียรของการสร้าง EWNS แสดงระดับความเข้มข้นของจำนวนอนุภาคเท่ากันในทั้งสองกรณี
รูปที่ 3g แสดงสเปกตรัม EPR หลังจากการลบค่าควบคุม (พื้นหลัง) สำหรับ EWNS ที่ปรับให้เหมาะสมที่ [-6.5 kV, 4.0 ซม.] สเปกตรัม ROS ยังถูกเปรียบเทียบกับค่าพื้นฐานของ EWNS ในเอกสารที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ จำนวน EWNS ที่คำนวณได้ซึ่งทำปฏิกิริยากับกับดักสปินคือ 7.5 × 104 EWNS/s ซึ่งใกล้เคียงกับ Baseline-EWNS8 ที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ สเปกตรัม EPR แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงการมีอยู่ของ ROS สองประเภท โดย O2- มีอยู่เป็นส่วนใหญ่ ในขณะที่ OH• มีอยู่ในปริมาณที่น้อยกว่า นอกจากนี้ การเปรียบเทียบโดยตรงของความเข้มสูงสุดยังแสดงให้เห็นว่า EWNS ที่ปรับให้เหมาะสมมีปริมาณ ROS สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับ EWNS พื้นฐาน
รูปที่ 4 แสดงประสิทธิภาพการสะสมของ EWNS ใน EPES ข้อมูลยังสรุปไว้ในตาราง I และเปรียบเทียบกับข้อมูล EWNS ดั้งเดิม สำหรับกรณี EUNS ทั้งสองกรณี การสะสมอยู่ใกล้ 100% แม้จะอยู่ที่แรงดันไฟฟ้าต่ำ 3.0 กิโลโวลต์ โดยทั่วไป 3.0 กิโลโวลต์ก็เพียงพอที่จะบรรลุการสะสม 100% โดยไม่คำนึงถึงการเปลี่ยนแปลงประจุบนพื้นผิว ภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน ประสิทธิภาพการสะสมของ Baseline-EWNS อยู่ที่เพียง 56% เนื่องมาจากประจุที่ต่ำกว่า (เฉลี่ย 10 อิเล็กตรอนต่อ EWNS)
รูปที่ 5 และตารางที่ 2 สรุประดับการหยุดการทำงานของจุลินทรีย์ที่เพาะไว้บนพื้นผิวของมะเขือเทศหลังจากสัมผัสกับ EWNS ประมาณ 40,000 #/cm3 เป็นเวลา 45 นาทีภายใต้สถานการณ์ที่เหมาะสม [-6.5 kV, 4.0 ซม.] เชื้อ E. coli และ L. innocua ที่ได้รับการเพาะแสดงให้เห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญที่ 3.8 log หลังจากสัมผัสเป็นเวลา 45 นาที ภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน S. enterica แสดงให้เห็นการลดลงที่ต่ำกว่าที่ 2.2 log ในขณะที่ S. cerevisiae และ M. parafortuitum แสดงให้เห็นการลดลงที่ 1.0 log
ภาพจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (รูปที่ 6) แสดงการเปลี่ยนแปลงทางกายภาพที่เกิดจาก EWNS ในเซลล์ E. coli, Salmonella enterica และ L. innocua ซึ่งนำไปสู่การไม่ทำงาน แบคทีเรียกลุ่มควบคุมแสดงให้เห็นว่าเยื่อหุ้มเซลล์ยังคงสมบูรณ์ ในขณะที่แบคทีเรียที่ถูกเปิดเผยจะทำให้เยื่อหุ้มภายนอกเสียหาย
การถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนของแบคทีเรียควบคุมและแบคทีเรียที่ถูกสัมผัสเผยให้เห็นความเสียหายของเยื่อหุ้มเซลล์
ข้อมูลเกี่ยวกับคุณสมบัติทางฟิสิกเคมีของ EWNS ที่ปรับให้เหมาะสมแล้วแสดงให้เห็นโดยรวมว่าคุณสมบัติของ EWNS (ประจุบนพื้นผิวและปริมาณ ROS) ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับข้อมูลพื้นฐานของ EWNS ที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้8,9,10,11 ในทางกลับกัน ขนาดของอนุภาคยังคงอยู่ในช่วงนาโนเมตร ซึ่งใกล้เคียงกับผลลัพธ์ที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้มาก ทำให้อนุภาคเหล่านี้ลอยอยู่ในอากาศได้เป็นเวลานาน การกระจายตัวของอนุภาคที่สังเกตได้นั้นสามารถอธิบายได้ด้วยการเปลี่ยนแปลงของประจุบนพื้นผิว ซึ่งกำหนดขนาดของเอฟเฟกต์เรย์ลี ความสุ่ม และศักยภาพในการรวมตัวของ EWNS อย่างไรก็ตาม ตามที่ Nielsen et al.22 ให้รายละเอียดไว้ ประจุบนพื้นผิวที่สูงจะลดการระเหยโดยเพิ่มพลังงาน/แรงตึงบนพื้นผิวของหยดน้ำได้อย่างมีประสิทธิภาพ ทฤษฎีนี้ได้รับการยืนยันในเชิงทดลองสำหรับไมโครดรอปเล็ต22 และ EWNS ในเอกสารเผยแพร่ฉบับก่อนหน้าของเรา8 การสูญเสียเวลาล่วงเวลาอาจส่งผลต่อขนาดและมีส่วนทำให้เกิดการกระจายตัวของขนาดที่สังเกตได้
นอกจากนี้ ประจุต่อโครงสร้างอยู่ที่ประมาณ 22–44 e- ขึ้นอยู่กับสถานการณ์ ซึ่งสูงกว่า EWNS พื้นฐานอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งมีประจุเฉลี่ย 10 ± 2 อิเล็กตรอนต่อโครงสร้าง อย่างไรก็ตาม ควรสังเกตว่านี่คือประจุเฉลี่ยของ EWNS Seto et al. ได้แสดงให้เห็นว่าประจุไม่สม่ำเสมอและเป็นไปตามการแจกแจงแบบลอการิทึมปกติ21 เมื่อเปรียบเทียบกับงานก่อนหน้าของเรา การเพิ่มประจุพื้นผิวเป็นสองเท่าจะทำให้ประสิทธิภาพการสะสมในระบบ EPES เป็นสองเท่าเกือบ 100%11