ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS แบบจำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้แน่ใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีรูปแบบและ JavaScript
อนุภาคซิลิกาที่มีรูพรุนถูกเตรียมโดยวิธีโซลเจลโดยมีการดัดแปลงบางอย่างเพื่อให้ได้อนุภาคที่มีรูพรุนขนาดมหึมา อนุภาคเหล่านี้ได้รับอนุพันธ์โดยการเติมโพลิเมอไรเซชันแบบแบ่งส่วนแบบย้อนกลับ (RAFT) ด้วย N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) และสไตรีนเพื่อเตรียม N-phenylmaleimide intercalation ของโพลีสไตรีน (PMP) เฟสนิ่ง คอลัมน์เหล็กกล้าไร้สนิมช่องแคบ (100 × 1.8 มม. id) ถูกบรรจุโดยการบรรจุสารละลาย ประเมินการแยกคอลัมน์ PMP ของส่วนผสมเปปไทด์ซึ่งประกอบด้วยเปปไทด์ห้าชนิด (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) ประสิทธิภาพโครมาโตกราฟี) และการย่อยทริปซินของซีรัมอัลบูมินของมนุษย์ (HAS) ภายใต้สภาวะการชะที่เหมาะสม สารผสม ide สูงถึง 280,000 แผ่น/ตร.ม. เมื่อเปรียบเทียบประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ที่พัฒนาแล้วกับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide เชิงพาณิชย์ พบว่าประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ PMP นั้นเหนือกว่าคอลัมน์เชิงพาณิชย์ในแง่ของประสิทธิภาพและความละเอียดในการแยกสาร
ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา อุตสาหกรรมชีวเภสัชกรรมได้กลายเป็นตลาดโลกที่กำลังขยายตัวโดยมีส่วนแบ่งการตลาดเพิ่มขึ้นอย่างมาก ด้วยการเติบโตอย่างก้าวกระโดดของอุตสาหกรรมชีวเวชภัณฑ์1,2,3 การวิเคราะห์เปปไทด์และโปรตีนจึงเป็นที่ต้องการอย่างมาก นอกจากเปปไทด์เป้าหมายแล้ว มีสิ่งเจือปนหลายอย่างเกิดขึ้นระหว่างการสังเคราะห์เปปไทด์ ดังนั้นจึงต้องมีการทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโตกราฟีเพื่อให้ได้เปปไทด์ที่มีความบริสุทธิ์ตามต้องการ การวิเคราะห์และการกำหนดคุณลักษณะของโปรตีนในของเหลวในร่างกาย เนื้อเยื่อ และ เซลล์เป็นงานที่ท้าทายอย่างยิ่งเนื่องจากสปีชีส์ที่อาจตรวจพบได้จำนวนมากในตัวอย่างเดียว แม้ว่าแมสสเปกโตรเมทรีเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการหาลำดับเปปไทด์และโปรตีน หากตัวอย่างดังกล่าวถูกฉีดเข้าไปในแมสสเปกโตรมิเตอร์ในครั้งเดียว การแยกจะไม่เหมาะ ปัญหานี้บรรเทาลงได้ด้วยการใช้การแยกโครมาโตกราฟีของเหลว (LC) ก่อนการวิเคราะห์ MS ซึ่งจะลดจำนวนของสารวิเคราะห์ที่เข้าสู่แมสสเปกโตรมิเตอร์ในเวลาที่กำหนด4,5,6นอกจากนี้ ในระหว่างการแยกเฟสของเหลว สามารถโฟกัสการวิเคราะห์ในพื้นที่แคบๆ ได้ ดังนั้นจึงเน้นการวิเคราะห์เหล่านี้และปรับปรุงความไวในการตรวจจับ MS โครมาโตกราฟีของเหลว (LC) ได้ก้าวหน้าไปอย่างมากในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา และกลายเป็นเทคนิคยอดนิยมในการวิเคราะห์โปรตีโอมิก7,8,9,10
โครมาโตกราฟีของเหลวแบบเฟสย้อนกลับ (RP-LC) ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการทำให้บริสุทธิ์และการแยกส่วนผสมของเปปไทด์โดยใช้ซิลิกาที่ดัดแปลงด้วยออกตาเดซิล (ODS) เป็นเฟสที่อยู่นิ่ง11,12,13 อย่างไรก็ตาม เฟสที่อยู่นิ่งของ RP ไม่ได้ให้การแยกเปปไทด์และโปรตีนที่น่าพอใจ เนื่องจากโครงสร้างที่ซับซ้อนและธรรมชาติของแอมฟิฟิลิก 14,15 ดังนั้น เฟสที่อยู่นิ่งที่ออกแบบเป็นพิเศษจึงจำเป็นในการวิเคราะห์เปปไทด์ s และโปรตีนที่มีมอยอิตีแบบมีขั้วและไม่มีขั้วเพื่อทำปฏิกิริยากับสารวิเคราะห์เหล่านี้ 16. โครมาโตกราฟีแบบโหมดผสมซึ่งมีอันตรกิริยาหลายรูปแบบ สามารถเป็นทางเลือกแทน RP-LC สำหรับการแยกเปปไทด์ โปรตีน และของผสมที่ซับซ้อนอื่นๆ มีการเตรียมเฟสโหมดผสมหลายเฟสที่อยู่นิ่ง และคอลัมน์ที่อัดแน่นด้วยเฟสเหล่านี้ได้ถูกนำมาใช้สำหรับการแยกเปปไทด์และโปรตีน17,18,19,20,21 เฟสคงที่โหมดผสม (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, โพลาร์อินเทอร์คาเลชัน/RPLC) เหมาะสำหรับการแยกเปปไทด์และโปรตีนเนื่องจากมีทั้งกลุ่มที่มีขั้วและไม่มีขั้ว22,23,24,25,26,27,28 ในทำนองเดียวกัน เฟสที่มีขั้วแทรกซ้อนแบบมีขั้วกับกลุ่มมีขั้วที่มีพันธะโควาเลนต์แสดงพลังการแยกที่ดีและการเลือกเฉพาะสำหรับการวิเคราะห์แบบมีขั้วและไม่มีขั้ว เนื่องจากการแยกขึ้นอยู่กับ ปฏิสัมพันธ์ระหว่างการวิเคราะห์และเฟสนิ่งการโต้ตอบต่อเนื่องหลายรูปแบบ 29, 30, 31, 32. เมื่อเร็วๆ นี้ Zhang et al.30 เตรียมเฟสโพลิเอมีนที่สิ้นสุดด้วยโดเดซิลและประสบความสำเร็จในการแยกไฮโดรคาร์บอน ยาต้านอาการซึมเศร้า ฟลาโวนอยด์ นิวคลีโอไซด์ เอสโตรเจน และสารวิเคราะห์อื่นๆ อีกหลายชนิด อินเตอร์คาเลเตอร์ที่มีขั้วมีทั้งกลุ่มที่มีขั้วและไม่มีขั้ว ดังนั้นจึงสามารถใช้แยกเปปไทด์และโปรตีนที่มีทั้งมอยอิตีที่ไม่ชอบน้ำและชอบน้ำได้ คอลัมน์ฝังขั้ว (เช่น คอลัมน์ C18 ที่ฝังด้วยเอไมด์) มีจำหน่ายเชิงพาณิชย์ มีจำหน่ายภายใต้ชื่อการค้าคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide แต่คอลัมน์เหล่านี้ใช้สำหรับการวิเคราะห์เอมีน 33 เท่านั้น
ในการศึกษาปัจจุบัน เฟสที่อยู่นิ่งที่มีขั้ว (N-phenylmaleimide-embedded polystyrene) ได้รับการเตรียมและประเมินเพื่อแยกเปปไทด์และทริปซินย่อยของ HSA เฟสที่อยู่นิ่งถูกเตรียมโดยใช้กลยุทธ์ต่อไปนี้ อนุภาคซิลิกาที่มีรูพรุนถูกเตรียมตามขั้นตอนที่ให้ไว้ในเอกสารเผยแพร่ก่อนหน้าของเราโดยมีการปรับเปลี่ยนโปรโตคอลการเตรียมอัตราส่วนของยูเรีย โพลิเอทิลีนไกลคอล (PEG) TMOS กรดอะซิติกน้ำถูกปรับเพื่อเตรียมซิล อนุภาค ica ที่มีขนาดรูพรุนขนาดใหญ่ ประการที่สอง ลิแกนด์ใหม่ ฟีนิลมาเลไมด์-เมทิลไวนิลไอโซไซยาเนต ถูกสังเคราะห์และใช้ในการอนุพันธ์ของอนุภาคซิลิกาเพื่อเตรียมเฟสที่อยู่นิ่งที่มีขั้วฝังตัว เฟสที่อยู่นิ่งที่เป็นผลลัพธ์ถูกบรรจุลงในคอลัมน์เหล็กกล้าไร้สนิม (100 × 1.8 มม. id) โดยใช้แผนการบรรจุที่เหมาะสมที่สุด การบรรจุคอลัมน์ได้รับความช่วยเหลือจากการสั่นสะเทือนทางกลเพื่อให้แน่ใจว่าเบดที่เป็นเนื้อเดียวกันจะเกิดขึ้นภายในคอลัมน์ ประเมินการแยกคอลัมน์ที่บรรจุของส่วนผสมเปปไทด์ ประกอบด้วยห้าเปปไทด์(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) และการย่อย Trypsin ของซีรั่มอัลบูมินของมนุษย์ (HAS) ส่วนผสมของเปปไทด์และการย่อยทริปซินของ HSA ถูกสังเกตพบว่าแยกได้ด้วยความละเอียดและมีประสิทธิภาพที่ดี ประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ PMP เปรียบเทียบกับของคอลัมน์ Ascentis Express RP-Aide ทั้งเปปไทด์และ สังเกตพบว่าโปรตีนได้รับการแก้ไขอย่างดีและมีประสิทธิภาพในคอลัมน์ PMP ซึ่งมีประสิทธิภาพมากกว่าคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amite
PEG (โพลีเอทิลีนไกลคอล), ยูเรีย, กรดอะซิติก, ไตรเมทอกซีออร์โธซิลิเกต (TMOS), ไตรเมทิลคลอโรไซเลน (TMCS), ทริปซิน, อัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์ (HSA), แอมโมเนียมคลอไรด์, ยูเรีย, เฮกเซนเมทิลไดซิลาเซน (HMDS), เมทาไครโลอิลคลอไรด์ (MC), สไตรีน, 4-ไฮดรอกซี-เทมโป, เบนโซอิลเปอร์ออกไซด์ (BPO), HPLC เกรดอะซีโทไนไทรล์ (ACN ), เมทานอล, 2-โพรพานอล, และอะซีโตน ซื้อจาก Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์, มิสซูรี่, สหรัฐอเมริกา)
ของผสมของยูเรีย (8 ก.), โพลิเอทิลีนไกลคอล (8 ก.) และกรดอะซิติก 0.01 N 8 มล. ถูกคนเป็นเวลา 10 นาที จากนั้นเติม TMOS 24 มล. ภายใต้สภาวะน้ำแข็งเย็น ส่วนผสมของปฏิกิริยาถูกให้ความร้อนที่ 40°C เป็นเวลา 6 ชั่วโมง และจากนั้นที่ 120°C เป็นเวลา 8 ชั่วโมงในหม้อนึ่งความดันสแตนเลส น้ำถูกเทออกและวัสดุที่เหลือถูกทำให้แห้งที่ 70° C เป็นเวลา 12 ชั่วโมง นำมวลอ่อนที่แห้งแล้วมาบดให้เรียบในเตาอบและเผาที่อุณหภูมิ 550°C เป็นเวลา 12 ชั่วโมง มีการเตรียมและจำแนกชุดสามชุดเพื่อตรวจสอบความสามารถในการทำซ้ำในขนาดอนุภาค ขนาดรูพรุน และพื้นที่ผิว
โดยการดัดแปลงพื้นผิวของอนุภาคซิลิกาด้วยลิแกนด์ฟีนิลมาเลอิไมด์-เมทิลไวนิลลิโซไซยาเนตที่สังเคราะห์ไว้ล่วงหน้า (PCMP) ตามด้วยพอลิเมอไรเซชันในแนวรัศมีด้วยสไตรีน สารประกอบที่มีกลุ่มขั้วถูกเตรียมขึ้นเฟสคงที่สำหรับมวลรวมและโซ่พอลิสไตรีน กระบวนการเตรียมการอธิบายไว้ด้านล่าง
N-phenylmaleimide (200 mg) และ methyl vinyl isocyanate (100 mg) ถูกละลายในโทลูอีนแห้ง และ 0.1 mL ของ 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) ถูกเติมลงในขวดปฏิกิริยาเพื่อเตรียม phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate copolymer (PMCP) ส่วนผสมถูกให้ความร้อนที่ 60°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง กรองและทำให้แห้งในเตาอบที่ 40°C สำหรับ 3 ชั่วโมง
อนุภาคซิลิกาแห้ง (2 กรัม) ถูกกระจายตัวในโทลูอีนแห้ง (100 มล.) กวนและโซนิคในขวดก้นกลมขนาด 500 มล. เป็นเวลา 10 นาที PMCP (10 มก.) ถูกละลายในโทลูอีนและเติมทีละหยดลงในขวดปฏิกิริยาโดยใช้กรวยหยด ของผสมถูกไหลย้อนที่ 100°C เป็นเวลา 8 ชั่วโมง กรองและล้างด้วยอะซีโตน และทำให้แห้งที่อุณหภูมิ 60°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง จากนั้น PMCP - อนุภาคซิลิกาที่ถูกพันธะ (100 กรัม) ถูกละลายในโทลูอีน (200 มล.) และเติม 4-ไฮดรอกซี-TEMPO (2 มล.) โดยมีไดบิวทิลติน ไดลอเรต 100 ไมโครลิตรเป็นตัวเร่งปฏิกิริยา ส่วนผสมถูกกวนที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 8 ชั่วโมง กรองและทำให้แห้งที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง
สไตรีน (1 มล.), เบนโซอิลเปอร์ออกไซด์ BPO (0.5 มล.) และอนุภาคซิลิกาที่จับกับ TEMPO-PMCP (1.5 ก.) ถูกกระจายตัวในโทลูอีนและกำจัดด้วยไนโตรเจน โพลิเมอไรเซชันของสไตรีนถูกดำเนินการที่อุณหภูมิ 100°C เป็นเวลา 12 ชั่วโมง ผลิตภัณฑ์ที่เป็นผลลัพธ์ถูกล้างด้วยเมทานอลและทำให้แห้งที่อุณหภูมิ 60°C ในชั่วข้ามคืน รูปแบบปฏิกิริยาโดยรวมแสดงในรูปที่ 1
ตัวอย่างถูกไล่ก๊าซที่ 393 K เป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อให้ได้แรงดันตกค้างน้อยกว่า 10-3 Torr ปริมาณของ N2 ที่ถูกดูดซับที่ความดันสัมพัทธ์ของ P/P0 = 0.99 ถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดปริมาตรรูพรุนทั้งหมด สัณฐานวิทยาของอนุภาคซิลิกาเปล่าและลิแกนด์ที่ถูกพันธะถูกตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (เทคโนโลยีชั้นสูงของฮิตาชิ โตเกียว ญี่ปุ่น) ตัวอย่างแห้ง (ซิลิกาเปลือยและลิแกนด์ที่ถูกผูกมัด อนุภาคซิลิกา) ถูกวางบนคอลัมน์อะลูมิเนียมโดยใช้เทปกาวคาร์บอน ทองคำถูกชุบบนตัวอย่างโดยใช้เครื่องเคลือบสปัตเตอร์ Q150T และชั้น Au 5 นาโนเมตรถูกฝากไว้บนตัวอย่าง สิ่งนี้ช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพของกระบวนการโดยใช้แรงดันไฟฟ้าต่ำและให้เกรนละเอียด การสปัตเตอร์เย็นเทอร์โมอิเลคตรอน (วอลแทม แมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา) ใช้เครื่องวิเคราะห์ธาตุ Flash EA1112 สำหรับการวิเคราะห์ธาตุ อนุภาค Malvern (Worcestershire สหราชอาณาจักร) Mastersizer 2000 เครื่องวิเคราะห์ขนาดถูกใช้เพื่อให้ได้การกระจายขนาดอนุภาค อนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่ถูกยึดเกาะด้วยลิแกนด์ (อย่างละ 5 มก.) ถูกกระจายในไอโซโพรพานอล 5 มล. โซนิเคเต็ดเป็นเวลา 10 นาที วอร์เท็กซ์เป็นเวลา 5 นาที และวางบนแท่นออปติกของ Mastersizer การวิเคราะห์เทอร์โมกราวิเมตริกดำเนินการในอัตรา 5 °C ต่อนาทีในช่วงอุณหภูมิ 30 ถึง 800 °C
คอลัมน์เจาะแคบสเตนเลสสตีลบุกระจกขนาด (100 × 1.8 มม. id) ถูกบรรจุโดยใช้วิธีการบรรจุสารละลาย ใช้ขั้นตอนเดียวกับที่ใช้ในอ้างอิง31. คอลัมน์เหล็กกล้าไร้สนิม (กระจก, 100 × 1.8 มม. id) พร้อมข้อต่อทางออกที่มีฟริต 1 µm เชื่อมต่อกับเครื่องบรรจุสารละลาย (Alltech Deerfield, IL, USA) เตรียมสารละลายเฟสนิ่งโดยการระงับเฟสนิ่ง 150 มก. ในเมทานอล 1.2 มล. และส่งไปยังคอลัมน์จัดเก็บ ใช้เมทานอลเป็นตัวทำละลายสารละลายเช่นเดียวกับตัวทำละลายขับเคลื่อน เติมคอลัมน์ตามลำดับโดยใช้แรงกด 100 MP เป็นเวลา 10 นาที 80 MP เป็นเวลา 15 นาที และ 60 MP เป็นเวลา 30 นาที ในระหว่างการบรรจุ มีการใช้การสั่นสะเทือนเชิงกลกับเครื่องเขย่าคอลัมน์ GC สองเครื่อง (Alltech, Deerfield, IL, USA) เพื่อให้แน่ใจว่ามีการบรรจุคอลัมน์ที่สม่ำเสมอ ปิดเครื่องบรรจุสารละลายและปล่อยแรงดันอย่างช้าๆ เพื่อป้องกันความเสียหายใดๆ ภายในคอลัมน์ ให้และไปยังระบบ LC เพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพ
ปั๊ม LC (10AD Shimadzu ประเทศญี่ปุ่น), หัวฉีด (Valco (สหรัฐอเมริกา) C14 W.05) พร้อมวงฉีด 50nL, เครื่องกำจัดก๊าซเมมเบรน (Shimadzu DGU-14A), หน้าต่างเส้นเลือดฝอย UV-VIS ถูกสร้างขึ้น ตัวตรวจจับอุปกรณ์ µLC พิเศษ (UV-2075) และไมโครคอลัมน์ที่บุด้วยกระจก ใช้ท่อเชื่อมต่อที่แคบและสั้นมากเพื่อลดผลกระทบของการขยายแถบคอลัมน์พิเศษ หลังจากบรรจุภัณฑ์ เส้นเลือดฝอย (50 μm id 365 และรีดิวซ์ยูเนี่ยนคาพิลลารี (50 ไมครอน) ถูกติดตั้งที่เต้ารับ 1/16″ ของรีดิวซ์ ยูเนี่ยน การรวบรวมข้อมูลและการประมวลผลโครมาโตกราฟีทำได้โดยใช้ซอฟต์แวร์ Multichro 2000 การตรวจสอบที่ 254 นาโนเมตร Analytes ได้รับการทดสอบสำหรับการดูดกลืนแสง UV ข้อมูลโครมาโตกราฟีถูกวิเคราะห์โดย OriginPro8 (นอร์ทแธมป์ตัน แมสซาชูเซตส์)
อัลบูมินจากซีรั่มของมนุษย์ ผงไลโอฟิไลซ์ ≥ 96% (อะกาโรสเจล อิเล็กโตรโฟรีซิส) 3 มก. ผสมกับทริปซิน (1.5 มก.) ยูเรีย 4.0 โมลาร์ (1 มล.) และแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 0.2 โมลาร์ (1 มล.) คนสารละลายเป็นเวลา 10 นาที และเก็บไว้ในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 6 ชั่วโมง จากนั้นดับด้วย 1 มล. ของ TFA 0.1% กรองสารละลาย และเก็บที่อุณหภูมิต่ำกว่า 4 องศาเซลเซียส
การแยกของผสมเปปไทด์และย่อยทริปซิน HSA ได้รับการประเมินแยกกันในคอลัมน์ PMP ตรวจสอบการแยกของผสมเปปไทด์และย่อยทริปซินของ HSA โดยคอลัมน์ PMP และเปรียบเทียบผลลัพธ์กับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide หมายเลขจานตามทฤษฎีคำนวณดังนี้:
ภาพ SEM ของอนุภาคซิลิกาเปลือยและอนุภาคซิลิกาที่จับกับลิแกนด์ถูกแสดงไว้ในรูปที่2 ภาพ SEM ของอนุภาคซิลิกาเปล่า (A, B) แสดงให้เห็นว่า ตรงกันข้ามกับการศึกษาก่อนหน้าของเรา อนุภาคเหล่านี้มีลักษณะเป็นทรงกลมซึ่งอนุภาคนั้นยาวหรือมีความสมมาตรไม่สม่ำเสมอ พื้นผิวของอนุภาคซิลิกาที่มีพันธะลิแกนด์ (C, D) นั้นเรียบกว่าอนุภาคซิลิกาเปล่า ซึ่งอาจเกิดจากการเคลือบของสายโซ่พอลิสไตรีนบนพื้นผิวของอนุภาคซิลิกา
ภาพจากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดของอนุภาคซิลิกาเปล่า (A, B) และอนุภาคซิลิกาที่มีพันธะเป็นแกนด์ (C, D)
การกระจายขนาดอนุภาคของอนุภาคซิลิกาเปลือยและอนุภาคซิลิกาที่มีพันธะลิแกนด์แสดงในรูปที่ 3(A) เส้นโค้งการกระจายขนาดอนุภาคตามปริมาตรแสดงให้เห็นว่าขนาดของอนุภาคซิลิกาเพิ่มขึ้นหลังจากการดัดแปลงทางเคมี (รูปที่ 3A) ข้อมูลการกระจายขนาดอนุภาคของอนุภาคซิลิกาจากการศึกษาปัจจุบันและการศึกษาก่อนหน้าเปรียบเทียบได้ในตารางที่ 1(A) ขนาดอนุภาคตามปริมาตร d(0.5) ของ PMP คือ 3.36 ไมโครเมตร เมื่อเปรียบเทียบ จากการศึกษาก่อนหน้าของเราที่มีค่าโฆษณา (0.5) เท่ากับ 3.05 ไมโครเมตร (อนุภาคซิลิกาที่จับกับโพลิสไตรีน)34 ชุดนี้มีการกระจายขนาดอนุภาคที่แคบกว่าเมื่อเทียบกับการศึกษาก่อนหน้าของเรา เนื่องจากอัตราส่วนที่แตกต่างกันของ PEG, ยูเรีย, TMOS และกรดอะซิติกในส่วนผสมของปฏิกิริยา ขนาดอนุภาคของเฟส PMP นั้นใหญ่กว่าของเฟสอนุภาคซิลิกาที่จับกับโพลีสไตรีนที่เราศึกษาก่อนหน้านี้เล็กน้อย ซึ่งหมายความว่าการทำงานของพื้นผิวของซิลิกา อนุภาคที่มีสไตรีนจะสะสมชั้นพอลิสไตรีน (0.97 µm) ไว้บนผิวซิลิกาเท่านั้น ในขณะที่เฟส PMP ความหนาของชั้นคือ 1.38 µm
การกระจายขนาดอนุภาค (A) และการกระจายขนาดรูพรุน (B) ของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาจับกับลิแกนด์
ขนาดรูพรุน ปริมาตรรูพรุน และพื้นที่ผิวของอนุภาคซิลิกาของการศึกษาปัจจุบันแสดงไว้ในตารางที่ 1 (B) โปรไฟล์ PSD ของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่ยึดเกาะด้วยลิแกนด์แสดงในรูปที่ 3 (B) ผลลัพธ์เทียบได้กับการศึกษาก่อนหน้าของเรา ขนาดรูพรุนของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่จับกับลิแกนด์คือ 310 และ 241 ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ว่าขนาดรูพรุนลดลง 69 หลังการปรับเปลี่ยนทางเคมี ดังแสดงในตาราง 1(B) และการเปลี่ยนแปลงของเส้นโค้งแสดงในรูปที่ 3(B) ในทำนองเดียวกัน ปริมาตรรูพรุนของอนุภาคซิลิกาลดลงจาก 0.67 เป็น 0.58 cm3/g หลังจากการดัดแปลงทางเคมี พื้นที่ผิวจำเพาะของอนุภาคซิลิกาที่ทำการศึกษาในปัจจุบันคือ 116 m2/g ซึ่งเทียบได้กับการศึกษาก่อนหน้าของเรา (124 m2/g) ดังแสดงในตารางที่ 1(B) พื้นที่ผิว (m2/g) ของอนุภาคซิลิกา ยังลดลงจาก 116 ตร.ม./ก. เป็น 105 ตร.ม./ก. หลังการดัดแปลงทางเคมี
ผลการวิเคราะห์องค์ประกอบของเฟสที่อยู่นิ่งแสดงไว้ในตารางที่ 2 ปริมาณคาร์บอนของเฟสที่อยู่นิ่งในปัจจุบันคือ 6.35% ซึ่งต่ำกว่าโหลดคาร์บอนของการศึกษาก่อนหน้าของเรา (อนุภาคซิลิกาที่ถูกผูกมัดด้วยโพลิสไตรีน 7.93%35 และ 10.21% ตามลำดับ) ใช้ imide-methylvinylisocyanate (PCMP) และ 4-hydroxy-TEMPO เปอร์เซ็นต์น้ำหนักไนโตรเจนของเฟสที่อยู่นิ่งปัจจุบันคือ 2.21% เทียบกับ 0.1735 และ 0.85% โดยน้ำหนักของไนโตรเจนในการศึกษาก่อนหน้า ตามลำดับ ซึ่งหมายความว่า % โดยน้ำหนักของไนโตรเจนสูงกว่าในเฟสอยู่กับที่ปัจจุบันเนื่องจากฟีนิลมาลีอิไมด์ ในทำนองเดียวกัน การโหลดคาร์บอนของผลิตภัณฑ์ (4) และ (5) คือ 2.7% และ 2.9% ตามลำดับ ในขณะที่การโหลดคาร์บอนของผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย (6) เท่ากับ 6.35% ดังแสดงในตารางที่ 2 การสูญเสียน้ำหนักถูกตรวจสอบด้วย PMP stationary phase และเส้นโค้ง TGA แสดงไว้ในรูปที่ 4 เส้นโค้ง TGA แสดงการสูญเสียน้ำหนัก 8.6% ซึ่งสอดคล้องกับการโหลดคาร์บอน (6.35%) เนื่องจากลิแกนด์ไม่ได้มีเพียง C เท่านั้น แต่ยังรวมถึง N, O และ H
ลิแกนด์ phenylmaleimide-methylvinylisocyanate ถูกเลือกสำหรับการดัดแปลงพื้นผิวของอนุภาคซิลิกาเนื่องจากมีกลุ่มฟีนิลมาลีอิไมด์ที่มีขั้วและกลุ่มไวนิลไอโซไซยาเนต กลุ่มไวนิลไอโซไซยาเนตสามารถทำปฏิกิริยาเพิ่มเติมกับสไตรีนโดยการเกิดพอลิเมอไรเซชันแบบอนุมูลที่มีชีวิต เหตุผลที่สองคือการแทรกกลุ่มที่มีอันตรกิริยาปานกลางกับสารวิเคราะห์และไม่มีอันตรกิริยาไฟฟ้าสถิตที่รุนแรงระหว่างสารวิเคราะห์และเฟสที่อยู่นิ่ง เนื่องจากมอยอิตีของฟีนิลมาลีอิไมด์ไม่มีประจุเสมือนตามปกติ pH ความเป็นขั้วของเฟสที่อยู่นิ่งสามารถควบคุมได้โดยปริมาณที่เหมาะสมของสไตรีนและเวลาปฏิกิริยาของพอลิเมอไรเซชันจากอนุมูลอิสระ ขั้นตอนสุดท้ายของปฏิกิริยา (พอลิเมอไรเซชันจากอนุมูลอิสระ) มีความสำคัญอย่างยิ่งและสามารถเปลี่ยนขั้วของเฟสที่อยู่นิ่งได้ การวิเคราะห์องค์ประกอบได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบการโหลดคาร์บอนของเฟสที่อยู่นิ่งเหล่านี้ พบว่าการเพิ่มปริมาณของสไตรีนและเวลาในการทำปฏิกิริยาจะเพิ่มการโหลดคาร์บอนของเฟสที่อยู่นิ่ง และในทางกลับกัน SP ที่เตรียมด้วยความเข้มข้นของสไตรีนต่างกันมี การโหลดคาร์บอนที่แตกต่างกัน อีกครั้ง ให้โหลดเฟสที่อยู่นิ่งเหล่านี้ลงในคอลัมน์เหล็กกล้าไร้สนิมและตรวจสอบประสิทธิภาพของโครมาโตกราฟี (การเลือกใช้ ความละเอียด ค่า N ฯลฯ) จากการทดลองเหล่านี้ ได้มีการเลือกสูตรที่เหมาะสมที่สุดเพื่อเตรียมเฟสที่อยู่นิ่งของ PMP เพื่อให้แน่ใจว่ามีขั้วที่ควบคุมได้และการคงตัวของสารวิเคราะห์ที่ดี
ห้าส่วนผสมของเปปไทด์ (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) ได้รับการประเมินโดยใช้คอลัมน์ PMP โดยใช้เฟสเคลื่อนที่60/40 (v/v) อะซีโตไนไตรล์/น้ำ (0.1% TFA) ที่อัตราการไหล 80 ไมโครลิตร/นาที ภายใต้สภาวะการชะที่เหมาะสมที่สุด หมายเลขจานตามทฤษฎี (N) ต่อคอลัมน์ (100 × 1.8 มม. id) คือ 20,000 ± 100 (200,000 แผ่น/ตร.ม.) ตารางที่ 3 แสดงค่า N สำหรับคอลัมน์ PMP สามคอลัมน์และโครมาโตแกรม s แสดงในรูปที่ 5A การวิเคราะห์อย่างรวดเร็วบนคอลัมน์ PMP ที่อัตราการไหลสูง (700 ไมโครลิตร/นาที) เปปไทด์ 5 ชนิดถูกชะออกภายในหนึ่งนาที ค่า N ดีมาก 13,500 ± 330 ต่อคอลัมน์ (100 × 1.8 มม. id) สอดคล้องกับ 135,000 แผ่น/เมตร (รูปที่ 5B) คอลัมน์ขนาดเท่ากันสามคอลัมน์ (100 × 1.8) mm id) ถูกบรรจุด้วยเฟสคงที่ของ PMP ที่แตกต่างกันสามล็อตเพื่อตรวจสอบความสามารถในการทำซ้ำ ความเข้มข้นของสารวิเคราะห์สำหรับแต่ละคอลัมน์ได้รับการบันทึกโดยใช้เงื่อนไขการชะที่เหมาะสมที่สุดและจำนวนจานทางทฤษฎี N และเวลาการกักเก็บเพื่อแยกส่วนผสมทดสอบเดียวกันในแต่ละคอลัมน์ ข้อมูลความสามารถในการทำซ้ำสำหรับคอลัมน์ PMP แสดงไว้ในตารางที่ 4 ความสามารถในการทำซ้ำของคอลัมน์ PMP มีความสัมพันธ์อย่างดีกับค่า %RSD ที่ต่ำมาก ดังที่แสดงในตารางที่ 3
การแยกส่วนผสมของเปปไทด์ในคอลัมน์ PMP (B) และคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide (A);เฟสเคลื่อนที่ 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%) ขนาดคอลัมน์ PMP (รหัส 100 × 1.8 มม.);เชิงวิเคราะห์ ลำดับการชะของสารประกอบ: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) และ 5 (ลิวซีน) แอซิดเอนเคฟาลิน))
คอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. id) ได้รับการประเมินสำหรับการแยกย่อยทริปทิกของซีรัมอัลบูมินของมนุษย์ในโครมาโตกราฟีแบบของเหลวประสิทธิภาพสูง โครมาโตกราฟีในรูปที่ 6 แสดงให้เห็นว่าตัวอย่างแยกได้ดีและมีความละเอียดดีมาก HSA ย่อยถูกวิเคราะห์โดยใช้อัตราการไหล 100 µL/นาที, เฟสเคลื่อนที่ 70/30 อะซีโตไนไตรล์/น้ำ และ 0.1% TFA ดังที่แสดงในโครมาโตแกรม ( รูปที่ 6) การย่อย HSA แบ่งออกเป็น 17 พีคที่สอดคล้องกับเปปไทด์ 17 ชนิด ประสิทธิภาพการแยกของแต่ละพีคในการย่อย HSA ได้รับการคำนวณและค่าต่างๆ ระบุไว้ในตารางที่ 5
การย่อย tryptic ของ HSA (100 × 1.8 มม. id) ถูกแยกออกจากคอลัมน์ PMP;อัตราการไหล (100 µL/นาที), เฟสเคลื่อนที่ 60/40 อะซีโตไนไตรล์/น้ำที่มี TFA 0.1%
โดยที่ L คือความยาวของคอลัมน์ η คือความหนืดของเฟสการเคลื่อนที่ ΔP คือแรงดันย้อนกลับของคอลัมน์ และ u คือความเร็วเชิงเส้นของเฟสการเคลื่อนที่ ความสามารถในการซึมผ่านของคอลัมน์ PMP คือ 2.5 × 10-14 ตร.ม. อัตราการไหลคือ 25 μL/นาที และใช้ 60/40 v/v ACN/น้ำ ความสามารถในการซึมผ่านของคอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. id) มีความคล้ายคลึงกับการศึกษาก่อนหน้าของเรา Ref.34 ความสามารถในการซึมผ่านของคอลัมน์ที่บรรจุอนุภาคที่มีรูพรุนเผินๆ คือ: 1.7 × 10-15 สำหรับอนุภาค 1.3 μm, 3.1 × 10-15 สำหรับอนุภาค 1.7 μm, 5.2 × 10-15 และ 2.5 × 10-14 m2 สำหรับอนุภาค 2.6 μm สำหรับอนุภาค 5 μm 43.ดังนั้น ความสามารถในการซึมผ่านของเฟส PMP นั้นคล้ายกับของอนุภาคเปลือกแกนกลางขนาด 5 ไมครอน
โดยที่ Wx คือน้ำหนักของคอลัมน์ที่บรรจุด้วยคลอโรฟอร์ม Wy คือน้ำหนักของคอลัมน์ที่บรรจุด้วยเมทานอล และ ρ คือความหนาแน่นของตัวทำละลายความหนาแน่นของเมทานอล (ρ = 0.7866) และคลอโรฟอร์ม (ρ = 1.484) ความพรุนทั้งหมดของคอลัมน์ SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1.8 มม. id) 34 และคอลัมน์ C18-ยูเรีย 31 ที่เรา การศึกษาก่อนหน้านี้มีค่าเท่ากับ 0.63 และ 0.55 ตามลำดับ ซึ่งหมายความว่าการมียูเรียลิแกนด์ช่วยลดการซึมผ่านของเฟสที่อยู่นิ่ง ในทางกลับกัน ความพรุนทั้งหมดของคอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. id) คือ 0.60 ความสามารถในการซึมผ่านของคอลัมน์ PMP ต่ำกว่าของคอลัมน์ที่บรรจุด้วยอนุภาคซิลิกาที่มีพันธะ C18 เนื่องจากลิแกนด์ C18 ในเฟสนิ่งประเภท C18 s ถูกยึดติดกับอนุภาคซิลิกาเป็นสายโซ่เชิงเส้น ในขณะที่เฟสโพลิเมอร์ชนิดพอลิสไตรีนอยู่นิ่ง จะเกิดชั้นโพลิเมอร์ที่ค่อนข้างหนาขึ้นรอบๆ ในการทดลองทั่วไป ความพรุนของคอลัมน์คำนวณได้ดังนี้
รูปที่ 7A,B แสดงคอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. id) และคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 มม. id) โดยใช้เงื่อนไขการชะเดียวกัน (เช่น 60/40 ACN/H2O และ 0.1% TFA)) ของโครงเรื่อง van Deemterส่วนผสมของเปปไทด์ที่เลือก (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ถูกเตรียมใน 20 µL/ อัตราการไหลต่ำสุดสำหรับทั้งสองคอลัมน์คือ 800 µL/นาที ค่า HETP ขั้นต่ำที่อัตราการไหลที่เหมาะสม (80 µL/นาที) สำหรับคอลัมน์ PMP และ Ascentis Express คอลัมน์ RP-Amide คือ 2.6 µm และ 3.9 µm ตามลำดับ ค่า HETP บ่งชี้ว่าประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. id) ดีกว่าคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide ที่มีจำหน่ายทั่วไป (100 × 1.8 มม. id) มาก โครงเรื่อง van Deemter ในรูปที่ 7(A) แสดงให้เห็นว่าการลดลงของค่า N พร้อมกับการไหลที่เพิ่มขึ้นนั้นไม่มีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับการศึกษาก่อนหน้าของเรา การแยกที่สูงขึ้น ประสิทธิภาพของคอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. id) เมื่อเปรียบเทียบกับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Aide ขึ้นอยู่กับการปรับปรุงรูปร่างของอนุภาค ขนาด และขั้นตอนการบรรจุคอลัมน์ที่ซับซ้อนที่ใช้ในงานปัจจุบัน34
(A) พล็อต van Deemter (HETP เทียบกับความเร็วเชิงเส้นเฟสเคลื่อนที่) ได้รับโดยใช้คอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. id) ใน 60/40 ACN/H2O กับ 0.1% TFA (B) พล็อต van Deemter (HETP เทียบกับความเร็วเชิงเส้นเฟสเคลื่อนที่) ที่ได้รับโดยใช้คอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 มม. id) ใน 60/40 ACN/H 2O กับ 0.1% TFA
เฟสโพลิสไตรีนที่ฝังตัวแบบมีขั้วถูกเตรียมและประเมินสำหรับการแยกของผสมเปปไทด์สังเคราะห์และการย่อยทริปซินของซีรัมอัลบูมินของมนุษย์ (HAS) ในโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง ประสิทธิภาพทางโครมาโตกราฟีของคอลัมน์ PMP สำหรับส่วนผสมของเปปไทด์นั้นยอดเยี่ยมในด้านประสิทธิภาพและความละเอียดในการแยก ประสิทธิภาพการแยกที่ดีขึ้นของคอลัมน์ PMP เกิดจากหลายสาเหตุ เช่น ขนาดอนุภาคและขนาดรูพรุนของอนุภาคซิลิกา การสังเคราะห์แบบควบคุมของเฟสที่อยู่นิ่ง และการบรรจุคอลัมน์ที่ซับซ้อน นอกจากประสิทธิภาพในการแยกที่สูงแล้ว แรงดันย้อนกลับของคอลัมน์ต่ำที่อัตราการไหลสูงยังเป็นข้อได้เปรียบอีกประการหนึ่งของเฟสที่อยู่นิ่งนี้ คอลัมน์ PMP แสดงความสามารถในการทำซ้ำที่ดีและสามารถใช้สำหรับการวิเคราะห์ส่วนผสมของเปปไทด์และการย่อยโปรตีนของทริปซิน เราตั้งใจที่จะใช้คอลัมน์นี้ในการแยกผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ สารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากพืชสมุนไพร และสารสกัดจากเชื้อราในโครมาโตกราฟีแบบของเหลว ในอนาคต คอลัมน์ PMP จะได้รับการประเมินสำหรับการแยกโปรตีนและโมโนโคลนอลแอนติบอดีด้วย อี
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. งานวิจัยเกี่ยวกับระบบแยกเปปไทด์โดยโครมาโตกราฟีแบบเฟสย้อนกลับ ตอนที่ 1: การพัฒนาโปรโตคอลการกำหนดลักษณะคอลัมน์ J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019)
Gomez, B. et al. ปรับปรุงเปปไทด์ที่ออกฤทธิ์ซึ่งออกแบบมาสำหรับการรักษาโรคติดเชื้อเทคโนโลยีชีวภาพขั้นสูง 36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018)
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. เปปไทด์เพื่อการรักษาสังเคราะห์: วิทยาศาสตร์และตลาดการค้นพบยา 15 (1-2) วันนี้ 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010)
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.โครมาโทกราฟี อ. 1261, 78–90 (2555).
Liu, W. et al. โครมาโตกราฟี-แมสสเปกโตรเมตรีของเหลวขั้นสูงช่วยให้สามารถรวมตัวกันของเมแทบอโลมิกส์และโปรตีโอมิกส์ที่เป็นเป้าหมายในวงกว้างได้ anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019)
Chesnut, SM & Salisbury, JJ บทบาทของ UHPLC ในการพัฒนายา J.ก.ย. วท.30(8), 1183-1190 (2550).
Wu, N. & Clausen, AM แง่มุมพื้นฐานและการปฏิบัติของโครมาโตกราฟีของเหลวความดันสูงพิเศษสำหรับการแยกสารอย่างรวดเร็วJ.ก.ย. วท.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2550).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. การประยุกต์ใช้โครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงพิเศษในการพัฒนายา J.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2549).
Gu, H. et al. Monolithic macroporous hydrogels เตรียมจากอิมัลชันที่มีเฟสภายในสูงแบบน้ำมันในน้ำเพื่อการทำให้บริสุทธิ์ของ enteroviruses อย่างมีประสิทธิภาพ Chemical.Britain.J.401, 126051 (2563).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA บทบาทของโครมาโตกราฟีของเหลวในโปรตีโอมิกส์.J.โครมาโทกราฟี อ. 1053(1-2), 27-36 (2547).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. แนวโน้มที่เกิดขึ้นใหม่ในการแยกโครมาโตกราฟีของเหลวแบบเฟสย้อนกลับของเปปไทด์และโปรตีนเพื่อการรักษา: ทฤษฎีและการใช้งาน J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012)
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC การแยกเปปไทด์สองมิติโดยใช้ระบบ RP-RP-HPLC โดยใช้ค่า pH ที่แตกต่างกันในมิติการแยกที่หนึ่งและสอง J.ก.ย. วิทย์ 28(14), 1694-1703 (2548).
Feletti, S. et al. ตรวจสอบลักษณะการถ่ายโอนมวลและประสิทธิภาพจลนศาสตร์ของคอลัมน์โครมาโตกราฟีประสิทธิภาพสูงที่บรรจุด้วย C18 sub-2 μm อย่างเต็มที่และอนุภาคที่มีรูพรุนเผินๆก.ย. วท.43 (9-10), 1737-1745 (2563).
Piovesana, S. et al. แนวโน้มล่าสุดและความท้าทายในการวิเคราะห์ในการแยก การระบุ และการตรวจสอบความถูกต้องของเปปไทด์ที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากพืช
Mueller, JB และคณะ ภูมิโปรตีโอมิกของอาณาจักรแห่งชีวิต ธรรมชาติ 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020)
DeLuca, C. et al. การประมวลผลปลายน้ำของเปปไทด์เพื่อการบำบัดโดยโครมาโตกราฟีของเหลวเพื่อการเตรียมโมเลกุล (บาเซิล สวิตเซอร์แลนด์) 26(15), 4688(2021)
Yang, Y. & Geng, X. โครมาโตกราฟีแบบโหมดผสมและการประยุกต์ใช้กับโพลิเมอร์ชีวภาพ J.โครมาโทกราฟี อ. 1218(49), 8813–8825 (2554).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands สำหรับโครมาโตกราฟีโปรตีนโหมดผสม: หลักการ ลักษณะเฉพาะ และการออกแบบ J.เทคโนโลยีชีวภาพ.144(1), 3-11 (2552).