ขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comเวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)ในระหว่างนี้ เพื่อให้แน่ใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) เป็นพืชตระกูลถั่วที่ใช้ในการผลิตอาหารและปรับปรุงดินการขยายตัวของ NLL ทั่วโลกในฐานะพืชได้ดึงดูดเชื้อราที่ทำให้เกิดโรคจำนวนมาก รวมทั้งลูปินแอนแทรคโนส ซึ่งเป็นสาเหตุของโรคแอนแทรคโนสที่ทำลายล้างอัลลีลสองตัวคือ Lanr1 และ AnMan ซึ่งให้ความต้านทานเพิ่มขึ้น ถูกนำมาใช้ในการผสมพันธุ์ NLL แต่ยังไม่ทราบกลไกระดับโมเลกุลพื้นฐานในการศึกษานี้ ใช้เครื่องหมาย Lanr1 และ AnMan เพื่อคัดกรองตัวอย่าง NLL ของยุโรปการทดสอบวัคซีนในสภาพแวดล้อมที่มีการควบคุมยืนยันประสิทธิภาพของผู้บริจาคดื้อยาทั้งคู่การทำโปรไฟล์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันได้ดำเนินการในสายที่ดื้อยาและอ่อนแอการต้านทานโรคแอนแทรคโนสสัมพันธ์กับการแสดงออกมากเกินไปของคำศัพท์เกี่ยวกับภววิทยาของยีน “GO:0006952 Defense Response”, “GO:0055114 Redox Process” และ “GO:0015979 Photosynthesis”นอกจากนี้ บรรทัด Lanr1(83A:476) แสดงการตั้งโปรแกรมใหม่อย่างรวดเร็วหลังการฉีดวัคซีน ขณะที่บรรทัดอื่นๆ แสดงความล่าช้าในการตอบสนองนี้ประมาณ 42 ชั่วโมงการตอบสนองการป้องกันเกี่ยวข้องกับยีน TIR-NBS, CC-NBS-LRR และ NBS-LRR, โปรตีน 10 ชนิดที่เกี่ยวข้องกับการเกิดโรค, โปรตีนถ่ายโอนไขมัน, เอนโดกลูแคน-1,3-β-กลูโคซิเดส, โปรตีนผนังเซลล์ที่อุดมด้วยไกลซีน และยีนจากเส้นทางปฏิกิริยาของออกซิเจนการตอบสนองในระยะแรกต่อ 83A:476 รวมถึงการยับยั้งยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ด้วยแสงอย่างระมัดระวัง สอดคล้องกับการป้องกันที่ประสบความสำเร็จในช่วงการเจริญเติบโตของพืชของชีววิทยาของเชื้อรา ซึ่งบ่งชี้ว่าเอฟเฟกต์กระตุ้นภูมิคุ้มกันปฏิกิริยาของแมนเดอลูปจะช้าลง เช่นเดียวกับการลากแนวนอนโดยรวม
ลูปินใบแคบ (NLL, Lupinus angustifolius L.) เป็นธัญพืชโปรตีนสูงที่มีถิ่นกำเนิดในภูมิภาคเมดิเตอร์เรเนียนตะวันตก1,2ปัจจุบันปลูกเพื่อเป็นพืชอาหารสำหรับสัตว์และมนุษย์นอกจากนี้ยังถือว่าเป็นปุ๋ยพืชสดในระบบหมุนเวียนของพืชเนื่องจากการตรึงไนโตรเจนโดยแบคทีเรียที่ตรึงไนโตรเจนทางชีวภาพและการปรับปรุงโครงสร้างดินโดยรวมNLL ได้ผ่านกระบวนการเลี้ยงอย่างรวดเร็วในศตวรรษที่ผ่านมาและยังคงอยู่ภายใต้แรงกดดันในการผสมพันธุ์สูง3,4,5,6,7,8,9,10,11,12ด้วยการเพาะปลูก NLL อย่างแพร่หลาย เชื้อราก่อโรคที่สืบทอดมาจึงพัฒนาช่องทางการเกษตรใหม่ ๆ และทำให้เกิดโรคทำลายพืชผลใหม่ สิ่งที่โดดเด่นที่สุดสำหรับผู้เลี้ยงและผู้เพาะพันธุ์ลูปินคือการปรากฏตัวของโรคแอนแทรคโนสซึ่งเกิดจากเชื้อราที่ทำให้เกิดโรค Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 สิ่งที่โดดเด่นที่สุดสำหรับผู้เลี้ยงและผู้เพาะพันธุ์ลูปินคือการปรากฏตัวของโรคแอนแทรคโนสซึ่งเกิดจากเชื้อราที่ทำให้เกิดโรค Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибко Colle totrichum lupini (บอนดาร์) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. สิ่งที่น่าสังเกตมากที่สุดสำหรับเกษตรกรและผู้เพาะพันธุ์ลูปินคือการเกิดโรคแอนแทรคโนสที่เกิดจากเชื้อราก่อโรค Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибк ом Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hageorn13. ที่โดดเด่นที่สุดสำหรับเกษตรกรและผู้เพาะพันธุ์ลูปินคือการเกิดโรคแอนแทรคโนสที่เกิดจากเชื้อราก่อโรค Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13รายงานแรกของโรคนี้มาจากบราซิลและสหรัฐอเมริกา โดยอาการทั่วไปปรากฏในปี พ.ศ. 2455 และ พ.ศ. 2472 ตามลำดับอย่างไรก็ตาม หลังจากนั้นประมาณ 30 ปี เชื้อโรคถูกกำหนดให้เป็น Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (สโตนแมน) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (สโตนแมน) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (สโตนแมน) Spauld. & Sacc., teleomorph ของ Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld ในสัณฐานวิทยาที่เป็นเป้าหมาย & เอช. เชรงค์,. & เอช. เชรงค์, .และเอช. เชรงค์ & H.施伦克，。 & H.施伦克，。และ H. Schlenk, .ฟีโนไทป์ของโรคเบื้องต้นที่เกิดขึ้นในช่วงกลางศตวรรษที่ 20 แสดงให้เห็นถึงการดื้อยาในยา NLL และลูปินเหลือง (L. luteus L.) แต่การทดสอบยาลูปินขาว (L. albus L.) ทั้งหมดมีความไวสูง15,16จากการศึกษาพบว่าการพัฒนาของแอนแทรคโนสนั้นสัมพันธ์กับปริมาณน้ำฝน (ความชื้นในอากาศ) และอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้น (ในช่วง 12-28°C) ซึ่งนำไปสู่การละเมิดการดื้อยาที่อุณหภูมิสูงขึ้น17, 18 ในความเป็นจริง เวลาที่จำเป็นสำหรับโคนิเดียในการงอกและโรคเริ่มต้น นั้นสั้นกว่าสี่เท่าที่อุณหภูมิ 24°C (4 ชั่วโมง) มากกว่าที่ 12°C (16 ชั่วโมง) ภายใต้สภาวะที่มีความชื้นสูง19ดังนั้น ภาวะโลกร้อนที่ดำเนินอยู่ได้นำไปสู่การแพร่ระบาดของโรคแอนแทรคโนสอย่างไรก็ตาม โรคนี้ถูกพบในฝรั่งเศส (พ.ศ. 2525) และยูเครน (พ.ศ. 2526) ว่าเป็นลางสังหรณ์ของภัยคุกคามที่กำลังจะเกิดขึ้น แต่เห็นได้ชัดว่าอุตสาหกรรมลูปินเพิกเฉยในเวลานั้น20,21ไม่กี่ปีต่อมา โรคร้ายแรงนี้ได้แพร่กระจายไปทั่วโลก และยังส่งผลกระทบต่อประเทศผู้ผลิตลูปินรายใหญ่ เช่น ออสเตรเลีย โปแลนด์ และเยอรมนี22,23,24หลังจากการระบาดของโรคแอนแทรคโนสในช่วงกลางทศวรรษที่ 1990 การตรวจคัดกรองอย่างละเอียดส่งผลให้สามารถระบุผู้บริจาคที่ดื้อยาหลายรายในตัวอย่าง NLL19การต้านทาน NLL ต่อโรคแอนแทรคโนสถูกควบคุมโดยอัลลีลเด่นสองตัวที่แยกจากกันซึ่งพบในแหล่งเพาะพันธุ์ที่แตกต่างกัน: Lanr1 ในพันธุ์ Tanjil และ Wonga และ AnMan ในพันธุ์มัณฑะเลย์ 25, 26 อัลลีลเหล่านี้เสริมเครื่องหมายโมเลกุลที่สนับสนุนการคัดเลือกเชื้อโรคที่ดื้อยาในโครงการปรับปรุงพันธุ์25,26,27,28,29,30สายพันธุ์ต้านทาน 83A:476 ที่มีอัลลีล Lanr1 ถูกข้ามกับสายพันธุ์ป่าที่อ่อนแอ P27255 เพื่อให้ได้ประชากร RIL ที่แยกจากกันสำหรับการต้านทานโรคแอนแทรคโนส ซึ่งทำให้สามารถกำหนดตำแหน่ง Lanr1 ให้กับโครโมโซม NLL-1131, 32, 33 LL เปิดเผยตำแหน่งของอัลลีลทั้งสามบนโครโมโซมเดียวกัน (NLL-11) แต่อยู่ในตำแหน่งต่างกัน29,34,35อย่างไรก็ตาม เนื่องจาก RILs จำนวนน้อยและระยะห่างทางพันธุกรรมที่มากระหว่างเครื่องหมายและอัลลีลที่สอดคล้องกัน จึงไม่สามารถสรุปผลที่เชื่อถือได้เกี่ยวกับยีนต้นแบบของพวกมันในทางกลับกัน การใช้พันธุกรรมย้อนกลับใน lupins นั้นทำได้ยากเนื่องจากมีศักยภาพในการฟื้นฟูต่ำมาก ซึ่งทำให้การจัดการทางพันธุกรรมยุ่งยาก
การพัฒนาของเชื้อที่เลี้ยงในบ้านซึ่งมีอัลลีลที่ต้องการในสถานะโฮโมไซกัส เช่น 83A:476 (Lanr1) และ Mandelup (AnMan) ได้เปิดประตูสู่การศึกษาการดื้อยาแอนแทรคโนสเมื่อเผชิญกับการมีอยู่ของอัลลีลที่ตรงข้ามกันในประชากรป่าความเป็นไปได้ของกลไกระดับโมเลกุลเปรียบเทียบการตอบสนองการป้องกันที่เกิดจากจีโนไทป์เฉพาะการศึกษานี้ประเมินการตอบสนองของการถอดเสียงในระยะแรกของการฉีดวัคซีน NLL ต่อ C. lupiniประการแรก แผงเซลล์สืบพันธุ์ NLL ของยุโรปที่มี 215 บรรทัดได้รับการคัดกรองโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลที่ทำเครื่องหมายอัลลีลของ Lanr1 และ AnManจากนั้นทำการสร้างฟีโนไทป์ของแอนแทรคโนสบน 50 สาย NLL ซึ่งเลือกไว้ก่อนหน้านี้สำหรับเครื่องหมายโมเลกุล ภายใต้สภาวะที่มีการควบคุมจากการทดลองเหล่านี้ สี่สายพันธุ์ที่แตกต่างกันในการต้านทานโรคแอนแทรคโนสและองค์ประกอบของอัลลีล Lanr1/AnMan ถูกเลือกสำหรับการทำโปรไฟล์การแสดงออกของยีนป้องกันที่แตกต่างกันโดยใช้สองแนวทางเสริม: การหาลำดับ RNA ปริมาณงานสูงและการหาปริมาณ PCR แบบเรียลไทม์
การคัดกรองชุดของเชื้อโรค NLL (N = 215) ที่มีเครื่องหมาย Lanr1 (Anseq3 และ Anseq4) และ AnMan (Anseq4) และ AnMan (AnManM1) แสดงให้เห็นว่ามีเพียงบรรทัดเดียว (95726 ใกล้กับ Salamanca-b) ที่ขยายอัลลีล “ความต้านทาน” สำหรับเครื่องหมายทั้งหมด ในขณะที่ “การมีอยู่ของอัลลีลที่ 'อ่อนแอ' พบสัดส่วนของเครื่องหมายทั้งหมดใน 158 (~ 73.5%) เส้น.สิบสามบรรทัดสร้างอัลลีลที่ "ต้านทาน" สองตัวของเครื่องหมาย Lanr1 และ 8 บรรทัดสร้างอัลลีลที่ "ต้านทาน" ของ Lanr1เครื่องหมายอัลลีล "ความต้านทาน" ของเครื่องหมาย AnMan (ตารางเสริม S1)เส้นสองเส้นเป็นเฮเทอโรไซกัสสำหรับเครื่องหมาย Anseq3 และหนึ่งเส้นเป็นเฮเทอโรไซกัสสำหรับเครื่องหมาย AnManM142 บรรทัด (19.5%) มีเฟสตรงข้ามกันของอัลลีล Anseq3 และ Anseq4 ซึ่งบ่งชี้ความถี่สูงของการรวมตัวกันอีกครั้งระหว่างสองตำแหน่งนี้ฟีโนไทป์ของแอนแทรคโนสภายใต้สภาวะควบคุม (ตารางเสริม S2) เผยให้เห็นความแปรปรวนในการต้านทานของจีโนไทป์ที่ทดสอบ ซึ่งสะท้อนให้เห็นในความรุนแรงของโรคแอนแทรกโนสความแตกต่างของคะแนนเฉลี่ยอยู่ระหว่าง 1.8 (ต้านทานปานกลาง) ถึง 6.9 (อ่อนแอ) และความแตกต่างของน้ำหนักพืชอยู่ระหว่าง 0.62 (อ่อนแอ) ถึง 4.45 กรัม (ต้านทาน) มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างค่าที่สังเกตได้ในการทำซ้ำสองครั้งของการทดลอง (0.51 สำหรับคะแนนความรุนแรงของโรค, P = 0.00017 และ 0.61 สำหรับน้ำหนักพืช, P < 0.0001) รวมทั้งระหว่างพารามิเตอร์ทั้งสองนี้ (− 0.59 และ −0.77, P < 0.0001) มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างค่าที่สังเกตได้ในการทำซ้ำสองครั้งของการทดลอง (0.51 สำหรับคะแนนความรุนแรงของโรค, P = 0.00017 และ 0.61 สำหรับน้ำหนักพืช, P < 0.0001) รวมถึงระหว่างพารามิเตอร์ทั้งสองนี้ (- 0.59 และ - 0.77, P < 0.0001) Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 และ 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0 001). พบความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างค่าที่สังเกตได้จากการทดลองซ้ำสองครั้ง (0.51 สำหรับคะแนนความรุนแรงของโรค, P = 0.00017 และ 0.61 สำหรับน้ำหนักพืช, P < 0.0001) รวมถึงระหว่างพารามิเตอร์ทั้งสองนี้ (- 0.59 และ -0.77, P < 0.0001) 0.0001)在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0.51，P = 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。在两次重复实验中观察的值之间存在相关性（疾病严重程度评分为分为0.51，p= 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（- 0.59 和– 0.59 和– 0.59 和– 0.59 和- 0.77， P < 0.0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,5 1, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างค่าที่สังเกตได้ในการทำซ้ำ (คะแนนความรุนแรงของโรค 0.51, P = 0.00017 และน้ำหนักพืช 0.61, P < 0.0001) และระหว่างพารามิเตอร์ทั้งสองนี้ (-0.59 และ -0 .0001) 0.77, P<0.0001 ).อาการโดยทั่วไปที่พบในพืชที่อ่อนแอ ได้แก่ การหงิกงอและบิดของลำต้นคล้ายโครงสร้าง "ธนูของคนเลี้ยงแกะ" ตามด้วยแผลรูปวงรีที่มีสปอโรซอยต์สีส้ม/ชมพู (รูปที่ 1 เพิ่มเติม)การเข้าใช้ของออสเตรเลียที่มียีน Lanr1 (83A:476 และ Tanjil) และ AnMan (Mandelup) นั้นต้านทานได้ปานกลาง 0.0331 และ 0.0036)บางสายพันธุ์ที่มีอัลลีล Lanr1 ที่ "ดื้อยา" และ/หรือ AnMan แสดงอาการของโรค
ที่น่าสนใจคือ สาย NLL สองสามสายที่ไม่มีอัลลีลเครื่องหมาย "ดื้อยา" เผยให้เห็นระดับการดื้อยาแอนแทรคโนสในระดับสูง (เทียบเคียงหรือสูงกว่าจีโนไทป์ Lanr1 หรือ AnMan) เช่น Boregine (ค่า P < 0.0001 สำหรับทั้งสองพารามิเตอร์), Bojar (ค่า P < 0.0001 สำหรับคะแนน และ 0.001 สำหรับน้ำหนักพืช) และประชากร B-549/79b (ค่า P < 0.0001 สำหรับคะแนนและไม่ใช่ สำคัญต่อน้ำหนัก) ที่น่าสนใจคือ สาย NLL สองสามสายที่ไม่มีอัลลีลเครื่องหมาย "ดื้อยา" เผยให้เห็นระดับการดื้อยาแอนแทรคโนสในระดับสูง (เทียบเคียงหรือสูงกว่าจีโนไทป์ Lanr1 หรือ AnMan) เช่น Boregine (ค่า P < 0.0001 สำหรับทั้งสองพารามิเตอร์), Bojar (ค่า P < 0.0001 สำหรับคะแนน และ 0.001 สำหรับน้ำหนักพืช) และประชากร B-549/79b (ค่า P < 0.0001 สำหรับคะแนนและไม่ใช่ สำคัญต่อน้ำหนัก) Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойч ивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих пар аметров), โบจาร์ (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). ที่น่าสนใจคือ สาย NLL หลายสายที่ไม่มีอัลลีลเครื่องหมาย 'ต้านทาน' ใด ๆ แสดงระดับการต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสในระดับสูง (เทียบเคียงหรือสูงกว่าจีโนไทป์ของ Lanr1 หรือ AnMan) เช่น Boregine (ค่า P < 0.0001 สำหรับพารามิเตอร์ทั้งสอง ), Bojar (ค่า P < 0.0001 สำหรับการประเมิน และ 0.001 สำหรับน้ำหนักพืช) และประชากร B-549/79b (ค่า P < 0.0001 สำหรับการประเมินและ ไม่มีนัยสำคัญต่อน้ำหนัก)有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 เป็นที่น่าสนใจว่าระบบ NLL บางระบบที่ไม่มีเครื่องหมาย "แอนติเจน" ใด ๆ แสดงความต้านทานในแนวนอนสูง (เทียบเท่ากับยีน Lanr1 หรือ AnMan หรือสูงกว่า) เช่น Boregine (พารามิเตอร์ทั้งสอง P < 0.0001), Bojar (ค่า P < 0.0001, น้ำหนักพืช 0.001) และสายพันธุ์ B-549/79b (ค่า P < 0.0001, น้ำหนักไม่มีนัยสำคัญ) Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчи вости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), โบจาร์ (зна чение P <0,0001, масса растения 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). ที่น่าสนใจคือ สาย NLL บางสายที่ไม่มีอัลลีลเครื่องหมาย 'การต้านทาน' แสดงการต้านทานโรคแอนแทรกโนสในระดับสูง (เปรียบเทียบได้กับหรือสูงกว่าจีโนไทป์ของ Lanr1 หรือ AnMan) เช่น Boregine (ค่า P สำหรับพารามิเตอร์ทั้งสอง <0.0001) Bojar (ค่า P < 0.0001 น้ำหนักพืช 0.001) และประชากร B-549/79b (ค่า P < 0.0001 น้ำหนัก ไม่มีนัยสำคัญ)ปรากฏการณ์นี้ชี้ให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของการต่อต้านพันธุกรรมใหม่ โดยอธิบายถึงการขาดความสัมพันธ์ที่สังเกตได้ระหว่างยีนเครื่องหมายและฟีโนไทป์ของโรค (ค่า P จาก ~0.42 ถึง ~0.98)ดังนั้น การทดสอบคอลโมโกรอฟ-สเมียร์นอฟแสดงให้เห็นว่าข้อมูลการต้านทานโรคแอนแทรกโนสมีการแจกแจงโดยประมาณสำหรับคะแนน (ค่า P-value 0.25 และ 0.11) และมวลของพืช (ค่า P-value 0.47 และ 0.55) ซึ่งบ่งชี้ว่าฉันตั้งสมมติฐานว่าเกี่ยวข้องกับอัลลีลมากกว่า Lanr1 และ AnMan
จากผลการคัดกรองการดื้อต่อแอนแทรคโนส 4 สายพันธุ์ถูกเลือกสำหรับการวิเคราะห์การถอดเสียง: 83A:476, Boregine, Mandelup และประชากร 22660 สายพันธุ์เหล่านี้ได้รับการทดสอบซ้ำสำหรับการดื้อยาแอนแทรกซ์ในการทดลองการเพาะเชื้อโดยลำดับ RNA โดยมีเงื่อนไขว่าเหมือนกันในการทดสอบก่อนหน้าค่าคะแนนมีดังนี้: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) และประชากร 22660 (6.11 ± 1.29 ).
โปรโตคอล Illumina NovaSeq 6000 ได้รับค่าเฉลี่ย 40.5 คู่ Mread ต่อตัวอย่าง (29.7 ถึง 54.4 Mreads) (ตารางเสริม S3)คะแนนการจัดตำแหน่งในลำดับอ้างอิงอยู่ในช่วงตั้งแต่ 75.5% ถึง 88.6%ความสัมพันธ์เฉลี่ยของข้อมูลจำนวนการอ่านระหว่างตัวแปรการทดลองระหว่างการจำลองแบบทางชีวภาพอยู่ระหว่าง 0.812 ถึง 0.997 (ค่าเฉลี่ย 0.959) จากการวิเคราะห์ยีน 35,170 ยีน 2917 ไม่พบการแสดงออก และอีก 4785 ยีนแสดงออกในระดับเล็กน้อย (ค่าเฉลี่ยฐาน < 5) จากการวิเคราะห์ยีน 35,170 ยีน 2917 ไม่พบการแสดงออก และอีก 4785 ยีนแสดงออกในระดับเล็กน้อย (ค่าเฉลี่ยฐาน < 5) Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначитель ном уровне (базовое среднее <5). จากการวิเคราะห์ยีน 35,170 ยีน 2917 ไม่มีการแสดงออก และยีนที่เหลืออีก 4785 ยีนแสดงออกในระดับเล็กน้อย (ค่าเฉลี่ยฐาน <5)在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (б азовое среднее значение <5). จากการวิเคราะห์ยีน 35,170 ยีน 2917 ยีนไม่แสดงออก และยีนที่เหลืออีก 4785 ยีนมีการแสดงออกเล็กน้อย (ค่าเฉลี่ยฐาน <5)ดังนั้น จำนวนของยีนที่ถือว่าแสดงออก (ค่าเฉลี่ยฐาน ≥ 5) ในระหว่างการทดลองคือ 27,468 (78.1%) (ตารางเสริม S4)
จากจุดเวลาแรก สาย NLL ทั้งหมดตอบสนองต่อการฉีดวัคซีนของ C. lupini (สายพันธุ์ Col-08) โดยการตั้งโปรแกรมใหม่ของการถอดเสียง (ตารางที่ 1) อย่างไรก็ตาม สังเกตเห็นความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างบรรทัดดังนั้น แนวต้าน 83A:476 (ซึ่งมียีน Lanr1) แสดงการตั้งโปรแกรมใหม่ของการถอดรหัสอย่างมีนัยสำคัญที่จุดเวลาแรก (6 hpi) โดยมีจำนวนเพิ่มขึ้นและลดลงของยีนที่แยกได้เพิ่มขึ้น 31-69 เท่าเมื่อเทียบกับจุดเวลาอื่น ณ จุดเวลานี้นอกจากนี้ จุดสูงสุดนี้มีอายุสั้น เนื่องจากการแสดงออกของยีนเพียงไม่กี่ตัวยังคงมีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญที่จุดเวลาที่สอง (12 hpi)ที่น่าสนใจคือ Boregine ซึ่งมีความต้านทานในระดับสูงเช่นกันในการทดสอบการต่อกิ่ง ไม่ได้รับการตั้งโปรแกรมใหม่ของการถอดรหัสขนาดใหญ่เช่นนี้ในระหว่างการทดลองอย่างไรก็ตาม จำนวนของยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน (DEG) เท่ากันสำหรับ Boregine และ 83A:476 ที่ 12 HPIทั้ง Mandelup และประชากร 22660 แสดงค่า DEG สูงสุดที่จุดเวลาสุดท้าย (48 ลิตร/วินาที) ซึ่งบ่งชี้ถึงความล่าช้าสัมพัทธ์ในการตอบสนองการป้องกัน
เนื่องจาก 83A:476 ผ่านการตั้งโปรแกรมใหม่ของการถอดเสียงครั้งใหญ่เพื่อตอบสนองต่อ C. lupini ที่ 6 HPI เมื่อเทียบกับบรรทัดอื่นทั้งหมด ~ 91% ของ DEGs ที่สังเกต ณ จุดเวลานี้เป็นสายเลือดเฉพาะ (รูปที่ 1)อย่างไรก็ตาม มีการทับซ้อนกันในการตอบสนองในช่วงต้นระหว่างสายการศึกษา เช่น 68.5%, 50.9% และ 52.6% DEG ใน Boregine, Mandelup และประชากร 22660 ตามลำดับ ซึ่งทับซ้อนกับที่พบใน 83A:476 ในบางช่วงเวลาอย่างไรก็ตาม DEG เหล่านี้คิดเป็นเพียงเศษส่วนเล็กน้อย (0.97–1.70%) ของ DEG ทั้งหมดที่ตรวจพบในปัจจุบันโดยใช้ 83A:476นอกจากนี้ 11 DEGs จากทุกบรรทัดมีความสอดคล้องกันในเวลานี้ (ตารางเสริม S4-S6) รวมถึงส่วนประกอบทั่วไปของการตอบสนองการป้องกันพืช: โปรตีนถ่ายโอนไขมัน (TanjilG_32225), เอ็นโดกลูแคน-1,3-β-glucoside เอนไซม์ (TanjilG_23384), โปรตีนที่กระตุ้นความเครียดสองตัวเช่น SAM22 (TanjilG_31528 และ TanjilG_31 531), โปรตีนลาเท็กซ์พื้นฐาน (TanjilG_32352) และโปรตีนผนังเซลล์ที่มีโครงสร้างอุดมด้วยไกลซีนสองตัว (TanjilG_19701 และ TanjilG_19702)นอกจากนี้ยังมีการเหลื่อมกันค่อนข้างสูงในการตอบสนองของทรานสคริปต์ระหว่าง 83A:476 และ Boregine ที่ 24 HPI (รวม 16-38% DEG) และระหว่าง Mandelup และประชากร 22660 ที่ 48 HPI (รวม 14-20% DEG)
แผนภาพเวนน์แสดงจำนวนของยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน (DEG) ในสายพันธุ์ดอกลูปินใบแคบ (NLL) ที่ได้รับเชื้อ Colletotrichum lupini (สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้จากทุ่งหมาป่าใน Wierzhenice ประเทศโปแลนด์ ปี 1999)สาย NLL ที่วิเคราะห์คือ: 83A:476 (ดื้อยา, มีอัลลีล Lanr1), Boregine (ดื้อยา, ไม่ทราบภูมิหลังทางพันธุกรรม), Mandelup (ดื้อยาปานกลาง, มี AnMan allele) และประชากร 22660 (อ่อนแอมาก)ตัวย่อ hpi หมายถึงชั่วโมงหลังการฉีดวัคซีนลบค่าศูนย์ออกเพื่อทำให้กราฟง่ายขึ้น
ชุดของยีนที่แสดงออกมากเกินไปที่ 6 hpi ได้รับการวิเคราะห์สำหรับการมีอยู่ของโดเมนยีน R ที่เป็นที่ยอมรับ (ตารางเสริม S7)การศึกษานี้เปิดเผยการชักนำการถอดรหัสของยีนต้านทานโรคแบบคลาสสิกที่มีโดเมน NBS-LRR ที่ 83A:476 เท่านั้นชุดนี้ประกอบด้วยยีน TIR-NBS-LRR หนึ่งยีน (tanjilg_05042) ยีน CC-NBS-LRR ห้ายีน (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 และ tanjilg_16162) และ NBS-LR สี่ตัว Tanjilg_16162) และ NBS-LRRE สี่ตัว (tanjilg_1 6162) รวมถึง NBS-Lrr สี่ตัว (tanjilg_16162) และ NBS-LRR สี่ตัว (TANJILG_16162)ยีนทั้งหมดเหล่านี้มีโดเมนแบบบัญญัติที่จัดเรียงตามลำดับที่อนุรักษ์ไว้นอกเหนือจากยีนของโดเมน NBS-LRR แล้ว ไคเนส RLL หลายตัวถูกเปิดใช้งานที่ 6 hpi กล่าวคือ หนึ่งตัวใน Boregine (TanjilG_19877) สองตัวใน Mandelup (TanjilG_07141 และ TanjilG_19877) และในประชากร 22660 (TanjilG_09014 และ TanjilG_10361) และสองตัวใน 83A 27:476 .
ยีนที่มีการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกอย่างมีนัยสำคัญในการตอบสนองต่อการฉีดวัคซีนด้วย C. lupini (สายพันธุ์ Col-08) อยู่ภายใต้การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่ายีน Ontology (GO) (ตารางเสริม S8) คำศัพท์เกี่ยวกับกระบวนการทางชีววิทยาที่ใช้บ่อยที่สุดคือ “GO:0006952 defense response” ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุดค่าผสม (เวลา × บรรทัด) ที่มีนัยสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูปที่ 2) คำศัพท์เกี่ยวกับกระบวนการทางชีววิทยาที่ใช้บ่อยที่สุดคือ “GO:0006952 defense response” ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุดค่าผสม (เวลา × บรรทัด) ที่มีนัยสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูปที่ 2) Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появля лся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). คำว่ากระบวนการทางชีววิทยาที่ใช้บ่อยที่สุดคือ 'GO:0006952 การตอบสนองการป้องกัน' ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุดค่าผสม (เวลา × เชื้อสาย) ที่มีความสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูปที่ 2)最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（ภาพ 2）。 คำศัพท์กระบวนการทางชีววิทยาที่เป็นตัวแทนมากที่สุดคือ “GO:0006952 defense response” ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุด (时间×线) โดยมีความหมายสูง (ค่า P < 0.001) ( jpg2) Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). คำว่ากระบวนการทางชีววิทยาที่ใช้บ่อยที่สุดคือ 'GO:0006952 Defense Response' ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุดค่าผสม (เวลา × บรรทัด) ที่มีความสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูปที่ 2)คำนี้แสดงเกินเวลาสองจุดใน 83A: 476 และ Boregine (6 และ 24 hpi) และที่จุดเดียวใน Mandelup และประชากร 22660 (12 และ 6 hpi ตามลำดับ)นี่คือผลลัพธ์ที่คาดหวัง โดยเน้นการตอบสนองของเชื้อราที่ดื้อยานอกจากนี้ 83A:476 ยังตอบสนองต่อ C. lupini โดยกระตุ้นยีนที่เกี่ยวข้องกับการระเบิดออกซิเดชันอย่างรวดเร็ว ซึ่งแสดงโดยคำว่า “GO:0055114 กระบวนการรีดอกซ์” ซึ่งบ่งชี้ถึงการตอบสนองการป้องกันที่เฉพาะเจาะจง ในขณะที่ Boregine เปิดเผยการตอบสนองการป้องกันที่เฉพาะเจาะจง ซึ่งเกี่ยวข้องกับคำว่า 'GO':0006950 การตอบสนองความเครียด”.ประชากร 22660 เปิดใช้งานการตอบสนองการดื้อยาในแนวนอนที่เกี่ยวข้องกับสารทุติยภูมิ โดยเน้นที่คำศัพท์จำนวนมากเกินไป “GO:0016104 Process of triterpene biosynthesis” และ “GO:0006722 Process of triterpene metabolite” (ทั้งสองคำอยู่ในยีนชุดเดียวกัน ) โดยคำนึงถึงผลลัพธ์ของการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าคำศัพท์ GO ความเสถียรของปฏิกิริยา Mandelup อยู่ระหว่าง Boregine และประชากร 22660 นอกจากนี้ ปฏิกิริยาในช่วงต้น 83A:476 (6 hpi) และปฏิกิริยาที่ล่าช้า Mandelup และประชากร 22660 รวมถึงคำว่า GO:0015979 'การสังเคราะห์ด้วยแสง' และกระบวนการทางชีววิทยาอื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง
คำศัพท์เกี่ยวกับออนโทโลจีของยีนกระบวนการทางชีวภาพที่เลือกในหมายเหตุประกอบของยีนที่แสดงออกแตกต่างกันระหว่างการตอบสนองของยีนของดอกลูปินใบแคบ (NLL) ที่ได้รับการฉีดวัคซีนแอนแทรกซ์ลูปิน (สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้จากทุ่งลูปินใน Wierzhenice ประเทศโปแลนด์ ในปี 1999) นั้นเกินจริงอย่างมากสาย NLL ที่วิเคราะห์คือ: 83A:476 (ดื้อยา, มีอัลลีล Lanr1 แบบโฮโมไซกัส), Boregine (ดื้อยา, ไม่ทราบภูมิหลังทางพันธุกรรม), Mandelup (ดื้อยาปานกลาง, มีอัลลีล AnMan แบบโฮโมไซกัส) และประชากร 22660 (อ่อนแอ)
เนื่องจากการศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อระบุยีนที่มีส่วนในการต้านทานโรคแอนแทรกโนส ยีนที่กำหนดให้กับเงื่อนไข GO “GO: 0006952 การตอบสนองเชิงป้องกัน” และ “GO: 0055114 กระบวนการรีดอกซ์” จึงถูกวิเคราะห์ด้วยจุดตัดเนื่องจากค่าพื้นฐานหมายถึง ≥ 30 โดยมีอย่างน้อยหนึ่งบรรทัดจุด x ในเวลาที่รวมค่าที่มีนัยสำคัญทางสถิติของ log2 (การเปลี่ยนแปลงการพับ)จำนวนยีนที่ตรงตามเกณฑ์เหล่านี้คือ 65 สำหรับ GO:0006952 และ 524 สำหรับ GO:0055114
83A:476 เผยให้เห็นจุดสูงสุด DEG สองตัวที่มีคำอธิบายประกอบคำว่า GO:0006952 ครั้งแรกที่ 6 ยีนต่อนิ้ว (64 ยีน การควบคุมขึ้นและลง) และครั้งที่สองที่ 24 ยีนต่อนิ้ว (15 ยีน การควบคุมขึ้นเท่านั้น)นอกจากนี้ Boregine ยังแสดงให้เห็นว่า GO:0006952 ถึงจุดสูงสุด ณ เวลาเดียวกัน แต่มี DEG น้อยกว่า (11 และ 8) และการเปิดใช้งานแบบพิเศษMandeloop แสดงจุดสูงสุดสองจุดของ GO:0006952 ที่ 12 และ 48 HPI ทั้งคู่มียีน 12 ยีน (อันแรกมียีนที่กระตุ้น และอันที่สองมียีนที่ยับยั้งเท่านั้น) ในขณะที่ประชากร 22660 ที่ 6 HPI (13 ยีน) มีความเด่นกว่าของการเพิ่มสูงสุดระเบียบข้อบังคับ.ควรสังเกตว่า 96.4% ของ GO:0006952 DEG ในจุดสูงสุดเหล่านี้มีการตอบสนองประเภทเดียวกัน (ขึ้นหรือลง) ซึ่งบ่งชี้ถึงการซ้อนทับกันอย่างมีนัยสำคัญในการตอบสนองการป้องกัน แม้ว่าจำนวนยีนที่เกี่ยวข้องจะต่างกันก็ตามกลุ่มที่ใหญ่ที่สุดของลำดับที่เกี่ยวข้องกับคำว่า GO:0006952 เข้ารหัสโปรตีนข้อความที่เกี่ยวข้องกับความเครียดจากการอดอาหาร 22 (เหมือน SAM22) ซึ่งเป็นของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการก่อโรคคลาส 10 (PR-10) และลาเท็กซ์โปรตีนแกนโปรตีนที่คล้ายกัน (คล้าย MLP)) โปรตีน (รูปที่ 3)ทั้งสองกลุ่มแตกต่างกันในลักษณะของการแสดงออกและทิศทางของการตอบสนองยีนที่เข้ารหัสโปรตีนคล้าย SAM22 แสดงการเหนี่ยวนำที่สม่ำเสมอและมีนัยสำคัญ ณ จุดเวลาเริ่มต้น (6 หรือ 12 hpi) และโดยทั่วไปไม่ตอบสนองเมื่อสิ้นสุดการทดลอง (48 hpi) ในขณะที่โปรตีนคล้าย MLP แสดงการประสานกันที่ 6 hpihpi83A:476 และ Mandelup ที่ 48 แรงม้า/นิ้ว จุดข้อมูลอื่นๆ เกือบทั้งหมดไม่ตอบสนองนอกจากนี้ ความแตกต่างในโปรไฟล์การแสดงออกของยีนโปรตีนที่คล้าย SAM22 ตามความแปรปรวนที่สังเกตได้ในการต้านทานโรคแอนแทรคโนส เนื่องจากสายต้านทานที่มากกว่ามีจุดเวลามากกว่าที่เหนี่ยวนำยีนเหล่านี้อย่างมีนัยสำคัญมากกว่ายีนที่อ่อนแอกว่ายีน PR-10 ที่คล้าย LlR18A/B อีกยีนหนึ่งแสดงรูปแบบการแสดงออกที่คล้ายกันมากกับยีนโปรตีนที่คล้าย SAM22
องค์ประกอบหลักของคำว่ากระบวนการทางชีวภาพ “GO:0006952 Defense Response” และรูปแบบการแสดงออกของยีนที่เป็นตัวเลือกของอัลลีล Lanr1 และ AnMan ถูกระบุมาตราส่วน Log2 แสดงถึงค่า log2 (การเปลี่ยนแปลงแบบพับ) ระหว่างการปลูกเชื้อ (Colletotrichum lupini, สายพันธุ์ Col-08, ที่ได้จากทุ่งหมาป่า, Wizhenica, โปแลนด์, 1999) และพืชควบคุม (ปลูกเชื้อแซม) ที่จุดเวลาเดียวกันวิเคราะห์สายพันธุ์ลูปินใบแคบต่อไปนี้: 83A:476 (ดื้อยา, มีอัลลีล Lanr1 แบบโฮโมไซกัส), Boregine (ดื้อยา, ไม่ทราบภูมิหลังทางพันธุกรรม), Mandelup (ดื้อยาปานกลาง, มีอัลลีล AnMan แบบโฮโมไซกัส) และประชากร 22660 (อ่อนแอ)
นอกจากนี้ยังมีการประเมินโปรไฟล์การแสดงออกของยีนผู้สมัคร RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) และ AnMan (TanjilG_12861) (รูปที่ 3)ยีน TanjilG_05042 แสดงการตอบสนองที่สำคัญ (การเปิดใช้งาน) ที่ 83A:476 ที่จุดเวลาแรกเท่านั้น (6 hpi) ในขณะที่ TanjilG_12861 มีนัยสำคัญใน Mandeloop ที่จุดเวลาสองจุดเท่านั้น: 6 hpi (การควบคุมแบบลง) และ 24 hpi (6 hpi)กับ.).ปรับได้) ).
ยีนที่แสดงออกมากเกินไปที่สุดในคำว่า GO:0055114 “กระบวนการรีดอกซ์” คือยีนที่เข้ารหัสโปรตีนไซโตโครม P450 และเปอร์ออกซิเดส (รูปที่ 4)สำหรับตัวอย่างที่แยกได้จาก 83A:476 ที่ 6 HPI ค่า log2 สูงสุดหรือต่ำสุด (การเปลี่ยนแปลงการพับ) (สำหรับ 86.6% ของยีน) โดยทั่วไปถูกสังเกตระหว่างพืชที่ได้รับการฉีดวัคซีนและพืชควบคุม โดยเน้นการตอบสนองสูงของยีนชนิดนี้ต่อการฉีดวัคซีนเพศ83A:476 แสดง GO ที่สำคัญที่สุด: 0055114 DEG ที่ 6 hpi (503 ยีน) ในขณะที่บรรทัดที่เหลือที่ 48 hpi (Boregine, 31 ยีน; Mandelup, 85 ยีน; และประชากร 22660, 78 ยีน))ในยีนส่วนใหญ่ของตระกูล GO:0055114 มีการสังเกตการตอบสนองสองประเภทต่อการฉีดวัคซีน (การกระตุ้นและการยับยั้ง)น่าสนใจ มากถึง 97.6% ของ DEGs ที่ระบุสำหรับคำว่า GO: 0055114 ใน Mandelupe ที่ 48 hp ข้อสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าแม้จะมีขนาดที่เล็กลงอย่างมาก (เช่น จำนวนของยีนรีดอกซ์กลายพันธุ์ 85 เทียบกับ 503) รูปแบบของการตอบสนองการถอดเสียงที่ล่าช้าของแมนเดลูปต่อโรคแอนแทรคโนสนั้นคล้ายคลึงกับการตอบสนองในช่วงต้นของ 83A:476ใน Boregine และประชากร 22660 การบรรจบกันนี้ต่ำกว่าที่ 51.6% และ 75.6% ตามลำดับ
รูปแบบการแสดงออกขององค์ประกอบหลักของคำศัพท์ของกระบวนการทางชีวภาพ “GO:0055114 กระบวนการรีดอกซ์” ถูกเปิดเผยมาตราส่วน Log2 แสดงถึงค่า log2 (การเปลี่ยนแปลงแบบพับ) ระหว่างการปลูกเชื้อ (Colletotrichum lupini, สายพันธุ์ Col-08, ที่ได้จากทุ่งหมาป่า, Wizhenica, โปแลนด์, 1999) และพืชควบคุม (ปลูกเชื้อแซม) ที่จุดเวลาเดียวกันวิเคราะห์สายพันธุ์ลูปินใบแคบต่อไปนี้: 83A:476 (ดื้อยา, มีอัลลีล Lanr1 แบบโฮโมไซกัส), Boregine (ดื้อยา, ไม่ทราบภูมิหลังทางพันธุกรรม), Mandelup (ดื้อยาปานกลาง, มีอัลลีล AnMan แบบโฮโมไซกัส) และประชากร 22660 (อ่อนแอ)
83A:476 การตอบสนองทางทรานสคริปโตมิกต่อการฉีดวัคซีนด้วย C. lupini (สายพันธุ์ Col-08) ยังรวมถึงการปิดเสียงที่ประสานกันของยีนที่มาจากคำว่า GO:0015979 “การสังเคราะห์ด้วยแสง” และกระบวนการทางชีวภาพที่เกี่ยวข้องอื่นๆ (รูปที่ 5)ชุด GO:0015979 DEG นี้มียีน 105 ยีนที่ถูกกดอย่างมีนัยสำคัญที่ 6 hpi ที่ 83A:476ในชุดย่อยนี้ ยีน 37 ยีนถูกควบคุมใน Mandelup ที่ 48 HPI และ 35 ยีนในเวลาเดียวกันในประชากร 22660 รวมถึง 19 DEGs ที่เหมือนกันกับทั้งสองจีโนไทป์ไม่มี DEG ที่เกี่ยวข้องกับคำว่า GO: 0015979 ถูกเปิดใช้งานอย่างมีนัยสำคัญในชุดค่าผสมใดๆ (บรรทัด x เวลา)
รูปแบบการแสดงออกของส่วนประกอบหลักของคำศัพท์ของกระบวนการทางชีวภาพ “GO:0015979 การสังเคราะห์ด้วยแสง” ถูกเปิดเผยมาตราส่วน Log2 แสดงถึงค่า log2 (การเปลี่ยนแปลงแบบพับ) ระหว่างการปลูกเชื้อ (Colletotrichum lupini, สายพันธุ์ Col-08, ที่ได้จากทุ่งหมาป่า, Wizhenica, โปแลนด์, 1999) และพืชควบคุม (ปลูกเชื้อแซม) ที่จุดเวลาเดียวกันวิเคราะห์สายพันธุ์ลูปินใบแคบต่อไปนี้: 83A:476 (ดื้อยา, มีอัลลีล Lanr1 แบบโฮโมไซกัส), Boregine (ดื้อยา, ไม่ทราบภูมิหลังทางพันธุกรรม), Mandelup (ดื้อยาปานกลาง, มีอัลลีล AnMan แบบโฮโมไซกัส) และประชากร 22660 (อ่อนแอ)
จากผลการวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างกันและน่าจะเกี่ยวข้องกับการตอบสนองการป้องกันต่อเชื้อราที่ทำให้เกิดโรค ชุดของยีนเจ็ดตัวนี้ถูกเลือกสำหรับการหาปริมาณของโปรไฟล์การแสดงออกโดย PCR แบบเรียลไทม์ (ตารางเสริม S9)
ยีนโปรตีนสมมุติ TanjilG_10657 ถูกเหนี่ยวนำอย่างมีนัยสำคัญในทุกเส้นและจุดที่ศึกษาเมื่อเปรียบเทียบกับพืชควบคุม (เลียนแบบ) (ตารางเสริม S10, S11)นอกจากนี้ โปรไฟล์นิพจน์ของ TanjilG_10657 ยังแสดงแนวโน้มที่เพิ่มขึ้นตลอดการทดสอบสำหรับทุกบรรทัดประชากร 22660 แสดงความไวสูงสุดของ TanjilG_10657 ต่อการฉีดวัคซีนด้วยการเปิดใช้งาน 114 เท่าและระดับการแสดงออกสัมพัทธ์สูงสุด (4.4 ± 0.4) ที่ 24 HPI (รูปที่ 6a)ยีนโปรตีน PR10 LlR18A TanjilG_27015 ยังแสดงการเปิดใช้งานในทุกเส้นและจุดเวลา โดยมีนัยสำคัญทางสถิติที่จุดข้อมูลส่วนใหญ่ (รูปที่ 6b)เช่นเดียวกับ TanjilG_10657 ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์สูงสุดของ TanjilG_27015 ถูกสังเกตพบในประชากรที่ได้รับวัคซีน 22660 ตัวที่ 24 HPI (19.5 ± 2.4)ยีนเอนโดไคติเนสของกรด TanjilG_04706 ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญในทุกบรรทัดและทุกจุดเวลายกเว้น Boregine 6 hpi (รูปที่ 6c)มันถูกเหนี่ยวนำอย่างมากที่จุดเวลาแรก (6 HPI) ที่ 83A:476 (10.5 เท่า) และเพิ่มขึ้นในระดับปานกลางในบรรทัดอื่นๆ (โดย 6.6-7.5 เท่า)ในระหว่างการทดลอง การแสดงออกของ TanjilG_04706 ยังคงอยู่ในระดับใกล้เคียงกันใน 83A:476 และ Boregine ในขณะที่ Mandelup และประชากร 22660 นั้นเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ โดยถึงค่าที่ค่อนข้างสูง (5.9 ± 1.5 และ 6.2 ± 1.5 ตามลำดับ)endoglucan-1,3-β-glucosidase-like ยีน TanjilG_23384 แสดงการเปิดใช้งานสูงที่จุดเวลาสองจุดแรก (6 และ 12 hpi) ในทุกบรรทัดยกเว้นประชากร 22660 (รูปที่ 6d)ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์สูงสุดของ TanjilG_23384 ถูกสังเกตที่จุดเวลาที่สอง (12 hpi) ใน Mandelup (2.7 ± 0.3) และ 83A:476 (1.5 ± 0.1)ที่ 24 HPI การแสดงออกของ TanjilG_23384 ค่อนข้างต่ำในทุกบรรทัดที่ศึกษา (จาก 0.04 ± 0.009 ถึง 0.44 ± 0.12)
โปรไฟล์การแสดงออกของยีนที่เลือก (ag) เปิดเผยโดย PCR เชิงปริมาณตัวเลข 6, 12 และ 24 หมายถึงชั่วโมงหลังจากการฉีดวัคซีนใช้ยีน LanDExH7 และ LanTUB6 สำหรับการทำให้เป็นมาตรฐาน และ LanTUB6 ใช้สำหรับการสอบเทียบระหว่างอนุกรมแถบข้อผิดพลาดแสดงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานตามการจำลองแบบทางชีวภาพสามแบบ ซึ่งแต่ละแบบคือค่าเฉลี่ยของการจำลองทางเทคนิคสามแบบ นัยสำคัญทางสถิติของความแตกต่างของระดับการแสดงออกระหว่างต้นที่ได้รับวัคซีน (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ซึ่งได้รับในปี 2542 จากทุ่งดอกลูปินใน Wierzenica ประเทศโปแลนด์) และพืชควบคุม (ปลูกเชื้อจำลอง) ถูกทำเครื่องหมายไว้เหนือจุดข้อมูล (*ค่า P < 0.05, **ค่า P ≤ 0.01, ***ค่า P ≤ 0.001) นัยสำคัญทางสถิติของความแตกต่างของระดับการแสดงออกระหว่างต้นที่ได้รับวัคซีน (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ซึ่งได้รับในปี 2542 จากทุ่งดอกลูปินใน Wierzenica ประเทศโปแลนด์) และพืชควบคุม (ปลูกเชื้อจำลอง) ถูกทำเครื่องหมายไว้เหนือจุดข้อมูล (*ค่า P < 0.05, **ค่า P ≤ 0.01, ***ค่า P ≤ 0.001) Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999 г. с п оля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติของระดับการแสดงออกระหว่างการปลูกเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้รับในปี 2542 จากทุ่งเลี้ยงหมาป่าใน Wierzhenice ประเทศโปแลนด์) และพืชกลุ่มควบคุม接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 0.001)。接种（colletotrichum lupini， color-08 株， 1999 年波兰 wierzenica 的 羽扇获得） 和对照（接种植物之间水平差异的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпи на в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значени е P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติของระดับการแสดงออกระหว่างเชื้อ (Colletotrichum lupini, สายพันธุ์ Col-08, ที่ได้จากทุ่งหมาป่าใน Verzhenice, Poland ในปี 1999) และพืชกลุ่มควบคุม (ปลูกเชื้อแซม) ระบุไว้เหนือจุดข้อมูล (*ค่า P < 0.05 , **ค่า P ≤ 0.01, ***ค่า P ≤ 0.001)สาย NLL ที่วิเคราะห์คือ: 83A:476 (ดื้อยา, มีอัลลีล Lanr1 ที่เป็นโฮโมไซกัส), แมนเดลลัป (ดื้อยาปานกลาง, มีแอนแมนอัลลีลที่เป็นโฮโมไซกัส), Boregine (ดื้อยา, ไม่ทราบภูมิหลังทางพันธุกรรม) และประชากร 22660 (อ่อนแอ)
ยีนผู้สมัคร TanjilG_05042 ที่ Lanr1 locus แสดงรูปแบบการแสดงออกที่แตกต่างกันอย่างชัดเจนจากโปรไฟล์ที่ได้รับจากการศึกษา RNA-seq (รูปที่ 6e)การกระตุ้นยีนนี้อย่างมีนัยสำคัญพบได้ใน Mandelup และประชากร 22660 (มากถึง 39.7 และ 11.7 เท่าตามลำดับ) ส่งผลให้ระดับการแสดงออกค่อนข้างสูง (สูงถึง 1.4 ± 0.14 และ 7.2 ± 1.3 ตามลำดับ)83A:476 ยังเผยให้เห็นการควบคุมบางอย่างของยีน TanjilG_05042 (มากถึง 3.8 เท่า) อย่างไรก็ตาม ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ที่ทำได้ (0.044 ± 0.002) นั้นต่ำกว่าระดับที่สังเกตได้ใน Mandelup และประชากร 22660 มากกว่า 30 เท่าวิเคราะห์โดย qPCR แสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญของระดับการแสดงออกระหว่างจีโนไทป์ในตัวแปรจำลองที่ได้รับการฉีดวัคซีน (กลุ่มควบคุม) ซึ่งมีความแตกต่างกันถึง 58 เท่าระหว่างประชากร 22660 และ 83A:476 รวมถึงระหว่างประชากร 22660 และ 22660 ความแตกต่างสองเท่าเกิดขึ้นระหว่าง Boregine และ Mandalup
ยีนตัวเลือกที่ AnMan locus, TanjilG_12861 ถูกเปิดใช้งานเพื่อตอบสนองต่อการให้วัคซีนใน 83A:476 และ Mandelup ซึ่งเป็นกลางในประชากร 22660 และลดการควบคุมใน Boregine (รูปที่ 6f)การแสดงออกสัมพัทธ์ของยีน TanjilG_12861 สูงที่สุดใน 83A ที่ได้รับการฉีดวัคซีน: 476 (0.14±0.01)ยีนโปรตีนช็อตความร้อนคลาส I 17.4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 แสดงระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ที่ต่ำกว่าในสายพันธุ์และจุดเวลาที่ศึกษาทั้งหมด (รูปที่ 6g)ค่าสูงสุดสังเกตได้ที่ 24 HPI ในประชากร 22660 คน (0.14 ± 0.02 ซึ่งเพิ่มขึ้นแปดเท่าในการตอบสนองต่อการให้วัคซีน)
การเปรียบเทียบโปรไฟล์การแสดงออกของยีน (รูปที่ 7) เผยให้เห็นความสัมพันธ์สูงระหว่าง TanjilG_10657 กับยีนอีกสี่ตัว: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) และ TanjilG_04706 (r = 0.79)ผลลัพธ์ดังกล่าวอาจบ่งบอกถึงการควบคุมร่วมกันของยีนเหล่านี้ในระหว่างการตอบสนองการป้องกันยีน TanjilG_12861 และ TanjilG_23384 แสดงโปรไฟล์การแสดงออกที่แตกต่างกันโดยมีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์แบบเพียร์สันต่ำกว่า (จาก 0.08 ถึง 0.43 และ -0.19 ถึง 0.28 ตามลำดับ) เมื่อเทียบกับยีนอื่นๆ
ตรวจพบความสัมพันธ์ระหว่างโปรไฟล์การแสดงออกของยีนโดยใช้ PCR เชิงปริมาณวิเคราะห์สายพันธุ์ลูปินใบแคบต่อไปนี้: 83A:476 (ต้านทาน, มีอัลลีล Lanr1 ที่เป็นโฮโมไซกัส), Mandelup (ต้านทานปานกลาง, มีแอนแมนอัลลีลที่เป็นโฮโมไซกัส), Boregine (ดื้อยา, ไม่ทราบภูมิหลังทางพันธุกรรม) และประชากร 22660 (อ่อนแอ)คำนวณจุดเวลาสามจุด (6, 12 และ 24 ชั่วโมงหลังการฉีดวัคซีน) รวมถึงการฉีดวัคซีน (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้จากทุ่งลูปินใน Wierzhenice ประเทศโปแลนด์ ในปี 1999) และพืชควบคุม (วัคซีนหลอก)มาตราส่วนแสดงค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์แบบเพียร์สัน
จากข้อมูลที่ได้รับที่ 6 แรงม้าต่อนิ้ว WGCNA ดำเนินการที่ 9981 DEG ที่ระบุโดยการเปรียบเทียบพืชที่ได้รับการฉีดวัคซีนและควบคุมเพื่อมุ่งเน้นไปที่การตอบสนองการป้องกันในช่วงต้น (ตารางเสริม S12)พบโมดูลยีนยี่สิบสองโมดูล (คลัสเตอร์) ที่มีโปรไฟล์การแสดงออกที่สัมพันธ์กัน (บวกหรือลบ) ระหว่างจีโนไทป์และตัวแปรทดลอง โดยเฉลี่ยแล้ว ระดับการแสดงออกของยีนลดหลั่นลงมาตามลำดับ 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองตัวแปร แนวโน้มนี้แข็งแกร่งกว่าในพืชควบคุม) โดยเฉลี่ยแล้ว ระดับการแสดงออกของยีนลดหลั่นลงมาตามลำดับ 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองตัวแปร แนวโน้มนี้แข็งแกร่งกว่าในพืชควบคุม) В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). โดยเฉลี่ยแล้ว ระดับการแสดงออกของยีนลดลงตามลำดับ 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองสายพันธุ์ แนวโน้มนี้แข็งแกร่งกว่าในพืชควบคุม)平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均而言，基因水平按 83a:476>mandelup>boregine>จำนวนประชากร 22660 的顺序下降（，在种中，这种在植物中更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). โดยเฉลี่ยแล้ว ระดับการแสดงออกของยีนลดลงในซีรีส์ 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองตัวแปร แนวโน้มนี้แข็งแกร่งกว่าในพืชควบคุม)การฉีดวัคซีนส่งผลให้เกิดการควบคุมการแสดงออกของยีน โดยเฉพาะอย่างยิ่งในโมดูล 18, 19, 14, 6 และ 1 (เรียงตามลำดับผลกระทบจากมากไปน้อย) การควบคุมเชิงลบ (เช่น โมดูล 9 และ 20) หรือมีผลเป็นกลาง (เช่น โมดูล 11, 22, 8 และ 13)การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าคำศัพท์ GO (ตารางเสริม S13) เปิดเผย "GO: 0006952 การตอบสนองเชิงป้องกัน" สำหรับโมดูลที่ได้รับการฉีดวัคซีน (18) พร้อมการเปิดใช้งานสูงสุด รวมถึงยีนที่วิเคราะห์โดย qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 และ TanjilG_27015) รวมถึงโมดูลการสังเคราะห์ด้วยแสงที่ถูกระงับมากที่สุดของ Inoculate (9)หัววัดโมดูล 18 (รูปที่ 8) ถูกระบุว่าเป็นยีน TanjilG_26536 ที่เข้ารหัสโปรตีน LlR18B ที่เหมือน PR-10 และหัววัดโมดูล 9 ถูกระบุว่าเป็นยีน TanjilG_28955 ที่เข้ารหัสโปรตีน PsbQ ของระบบภาพถ่าย IIยีนต้านทานโรคแอนแทรกโนส Lanr1, TanjilG_05042 ที่พบในโมดูล 22 (รูปที่ 9) และเกี่ยวข้องกับคำว่า “GO:0044260 กระบวนการเมตาบอลิซึมของโมเลกุลขนาดใหญ่ระดับเซลล์” และ “GO:0006355 ระเบียบการถอดความ แม่แบบดีเอ็นเอ” ที่มีฮับ TanjilG_01212ยีนเข้ารหัสปัจจัยการถอดรหัสความเครียดจากความร้อน A-4a (HSFA4a)
การวิเคราะห์เครือข่ายแบบถ่วงน้ำหนักของการแสดงออกร่วมของยีนของโมดูลที่มีเงื่อนไขกระบวนการทางชีวภาพที่นำเสนอเกินจริง “GO: 0006952 Defense responses”Ligation ถูกทำให้ง่ายขึ้นเพื่อเน้นสี่ยีนที่วิเคราะห์โดย qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 และ TanjilG_27015)
การวิเคราะห์เครือข่ายแบบถ่วงน้ำหนักของการแสดงออกร่วมของยีนของโมดูลที่มีคำว่า "GO: 0006355: Transcriptional Regulation, DNA templating" และการมียีนต้านทานโรคแอนแทรกโนส Lanr1 TanjilG_05042การทำ Ligation ถูกทำให้ง่ายขึ้นเพื่อแยกยีน TanjilG_05042 และยีน TanjilG_01212 ส่วนกลาง
การตรวจคัดกรองความต้านทานโรคแอนแทรคโนสที่รวบรวมในออสเตรเลียพบว่าพันธุ์ที่ปล่อยเร็วส่วนใหญ่มีความอ่อนแอKalya, Coromup และ Mandelup ได้รับการอธิบายว่าดื้อยาปานกลาง ในขณะที่ Wonga, Tanjil และ 83A:476 ได้รับการอธิบายว่าดื้อยาสูง26,27,31มีอัลลีลต้านทานเดียวกันซึ่งกำหนดว่า Lanr1 และ Coromup และ Mandelup มีอัลลีลที่แตกต่างกันซึ่งกำหนดเป็น AnMan10, 26, 39 ในขณะที่ Kalya ส่งต่ออัลลีลที่ต่างกัน,แลนอาร์2.การคัดกรองการดื้อยาแอนแทรคโนสในเยอรมนีทำให้เกิดการระบุสายพันธุ์ต้านทาน Bo7212 ด้วยอัลลีลอื่นที่ไม่ใช่ Lanr1 ซึ่งกำหนดเป็น LanrBo36
การศึกษาของเราเผยให้เห็นความถี่ต่ำมาก (ประมาณ 6%) ของอัลลีล Lanr1 ในเชื้อโรคที่ทดสอบการสังเกตนี้สอดคล้องกับผลการคัดกรองเชื้อโรคในยุโรปตะวันออกโดยใช้เครื่องหมาย Anseq3 และ Anseq4 ซึ่งแสดงให้เห็นว่าอัลลีล Lanr1 มีอยู่ในสายพันธุ์เบลารุสเพียงสองสายเท่านั้นสิ่งนี้บ่งชี้ว่าอัลลีล Lanr1 ยังไม่ถูกใช้อย่างแพร่หลายในโครงการปรับปรุงพันธุ์ในท้องถิ่น ซึ่งแตกต่างจากในออสเตรเลีย ซึ่งอัลลีลนี้เป็นหนึ่งในอัลลีลหลักสำหรับการผสมพันธุ์โดยใช้เครื่องหมายช่วยอาจเป็นเพราะระดับความต้านทานที่ต่ำกว่าโดยอัลลีล Lanr1 ในสภาพภาคสนามของยุโรปเมื่อเทียบกับรายงานของออสเตรเลียนอกจากนี้ การศึกษาโรคแอนแทรคโนสในพื้นที่ที่มีฝนตกชุกในออสเตรเลียแสดงให้เห็นว่าการตอบสนองของเชื้อดื้อยาที่สื่อกลางโดย Lanr1 allele อาจไม่ได้ผลในสภาพอากาศที่สนับสนุนการเจริญเติบโตและการพัฒนาอย่างรวดเร็วของเชื้อโรค19,42ในความเป็นจริง ในการศึกษาปัจจุบัน อาการบางอย่างของโรคแอนแทรคโนสยังพบในจีโนไทป์ที่มีอัลลีล Lanr1 ซึ่งบ่งชี้ว่าการดื้อยาอาจหายไปภายใต้สภาวะที่เหมาะสมสำหรับการพัฒนาของ C. lupiniนอกจากนี้ การตีความเชิงบวกที่ผิดพลาดของการมีอยู่ของเครื่องหมาย Anseq3 และ Anseq4 ซึ่งอยู่ห่างจากตำแหน่ง Lanr1 ประมาณ 1 cM นั้นเป็นไปได้ 28,30,43
การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่า 83A:476 ซึ่งมีอัลลีล Lanr1 ตอบสนองต่อการฉีดวัคซีน C. lupini ด้วยโปรแกรมถอดเสียงขนาดใหญ่ที่จุดเวลาที่วิเคราะห์ครั้งแรก (6 hpi) ในขณะที่ Mandelup ซึ่งมีอัลลีล AnMan อยู่(จาก 24 ถึง 48 แรงม้า)ความผันแปรทางเวลาเหล่านี้ในการตอบสนองการป้องกันมีความสัมพันธ์กับความแตกต่างของอาการของโรค โดยเน้นถึงความสำคัญของการรับรู้เชื้อโรคในระยะแรกสำหรับการตอบสนองต่อการดื้อยาที่ประสบความสำเร็จในการทำลายเนื้อเยื่อพืช สปอร์ของเชื้อแอนแทรกซ์ต้องผ่านขั้นตอนการพัฒนาหลายขั้นตอนบนพื้นผิวโฮสต์ รวมถึงการงอก การแบ่งเซลล์ และการก่อตัวของแอปเพรสโซเรียมส่วนต่อท้ายเป็นโครงสร้างติดเชื้อที่ยึดติดกับพื้นผิวของโฮสต์และอำนวยความสะดวกในการเจาะเข้าไปในเนื้อเยื่อของโฮสต์ดังนั้น สปอร์ของ C. gloeosporioides ในสารสกัดจากถั่วลันเตาจึงแสดงการแบ่งนิวเคลียสครั้งแรกหลังจาก 75-90 นาทีของการฟักตัว การก่อตัวของท่อสืบพันธุ์หลังจาก 90-120 นาที และการยับยั้งหลังจาก 4 ชั่วโมง 45Mango C. gloeosporioides แสดงการงอกของ conidial มากกว่า 40% หลังจากการบ่ม 3 ชั่วโมง และประมาณ 20% ของการก่อตัวของ appressors หลังจาก 4 ชั่วโมงยีน CAP20 ที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงของ C. gloeosporioides แสดงกิจกรรมการถอดรหัสใน conidia ที่ก่อตัวเป็น epiphyte หลังจากการบ่ม 3.5 ชั่วโมงในขี้ผึ้งผิวอะโวคาโดที่มีโปรตีน CAP20 ความเข้มข้นสูงหลังจาก 4 ชั่วโมง 46 นาทีในทำนองเดียวกัน กิจกรรมของยีนการสังเคราะห์เมลานินใน C. trifolii ถูกกระตุ้นในระหว่างการฟักตัว 2 ชั่วโมง ตามด้วยการก่อตัวของ appressorium หลังจาก 1 ชั่วโมงการศึกษาเนื้อเยื่อใบแสดงให้เห็นว่าสตรอเบอร์รี่ที่ปลูกเชื้อ C. acutatum มีการยับยั้งครั้งแรกที่ 8 hpi ในขณะที่มะเขือเทศที่ปลูกเชื้อ C. coccodes มีการยับยั้งครั้งแรกที่ 4 hpi48,49สอดคล้องกับช่วงเวลาของ Colletotrichum spp.กระบวนการติดเชื้อการตอบสนองการป้องกันอย่างรวดเร็วต่อ 83A:476 บ่งชี้ถึงการมีส่วนร่วมของยีนต้านทานพืชและยีนภูมิคุ้มกันกระตุ้นเอฟเฟกต์ (ETI) ในบรรทัดนี้ ในขณะที่การตอบสนองที่ล่าช้าของ Mandelup สนับสนุนสมมติฐานภูมิคุ้มกันที่กระตุ้นรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับไมโคร (MTI) 50 การตอบสนองในช่วงแรกต่อ 83A: 476 และ Mandelupการซ้อนทับบางส่วนระหว่างยีนที่ควบคุมขึ้นหรือลงในการตอบสนองที่ล่าช้าก็สนับสนุนแนวคิดนี้เช่นกัน เนื่องจาก ETI มักถูกพิจารณาว่าเป็นการตอบสนองของ MTI ที่เร่งและปรับปรุง ซึ่งนำไปสู่การตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้ ณ ตำแหน่งของการติดเชื้อ หรือที่เรียกว่า ช็อกจากอะนาไฟแล็กติก 51,52
ยีนส่วนใหญ่มาจากคำว่า Gene Ontology GO:0006952 “Defense Response” ที่มีการใช้เกินจริง คือ 11 ยีนที่เหมือนกันของโปรตีน 22 ข้อความการอดอาหารที่เกิดจากความเครียด (คล้ายกับ SAM22) และโปรตีนคล้ายยางธรรมชาติที่สำคัญ 7 ชนิด (MLPs)-โปรตีนที่เหมือนกัน 31, 34, 43 และ 423 แสดงความคล้ายคลึงกันของลำดับยีนที่คล้าย SAM22 แสดงการกระตุ้นที่มีนัยสำคัญซึ่งกินเวลานานขึ้น โดยแสดงระดับความต้านทานโรคแอนแทรคโนสที่เพิ่มขึ้น (83A:476 และ Boregine)อย่างไรก็ตาม ยีนที่คล้าย MLP ถูกลดการควบคุมเฉพาะในสายที่มีอัลลีลต้านทานของผู้สมัคร (83A:476/Lanr1 ที่ 6 hpi และ Mandelup/AnMan ที่ 24 hpi)ควรสังเกตว่า homologues ที่เหมือน SAM22 ที่ระบุทั้งหมดนั้นมาจากคลัสเตอร์ของยีนที่มีขนาดประมาณ 105 kb ในขณะที่ยีนที่คล้าย MLP นั้นมาจากบริเวณต่างๆ ของจีโนมการเปิดใช้งานร่วมกันของยีนที่คล้าย SAM22 นั้นพบในการศึกษาก่อนหน้าของเราเกี่ยวกับการดื้อต่อ NLL ต่อการฉีดวัคซีน Diaporthetoxica ซึ่งบ่งชี้ว่าพวกมันมีส่วนร่วมในองค์ประกอบแนวนอนของการตอบสนองการป้องกันข้อสรุปนี้ยังได้รับการสนับสนุนจากรายงานการตอบสนองเชิงบวกของยีนที่คล้าย SAM22 ต่อการบาดเจ็บหรือการรักษาด้วยกรดซาลิไซลิก สารกระตุ้นเชื้อรา หรือไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์
ยีนที่คล้าย MLP ได้รับการแสดงเพื่อตอบสนองต่อความเครียดแบบ abiotic และ biotic ต่างๆ รวมถึงการติดเชื้อแบคทีเรีย ไวรัส และเชื้อราที่ทำให้เกิดโรคในพืชหลายชนิด55ทิศทางของการตอบสนองต่ออันตรกิริยาบางอย่างระหว่างพืชและเชื้อโรคมีตั้งแต่การเพิ่มขึ้นอย่างมาก (เช่น ระหว่างการเข้าทำลายของฝ้ายด้วย Verticillium dahliae) ไปจนถึงการลดลงอย่างมาก (เช่น หลังจากการติดเชื้อของต้นแอปเปิลด้วย Alternaria spp.)56,57มีการสังเกตการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของยีน MLP-like 423 ระหว่างการป้องกันอะโวคาโดต่อการติดเชื้อ F. niger และระหว่างการติดเชื้อของต้นแอปเปิ้ล Botryosphaeria berengeriana f.ซีเอ็นpiricola และ Alternaria alternata เป็นโรคแอปเปิ้ล 58,59นอกจากนี้ apple calli ที่แสดงออกมากเกินไปของยีน MLP-like 423 มีการแสดงออกที่ต่ำกว่าของยีนที่เกี่ยวข้องกับการดื้อยาและมีความไวต่อการติดเชื้อรามากกว่าตาม Fusarium oxysporum f ยีน MLP-like 423 ก็ถูกยับยั้งในเชื้อโรคของถั่วทั่วไปที่ดื้อยาเช่นกันซีเอ็นเชื้อถั่ว60.
สมาชิกอื่นๆ ของตระกูล PR-10 ที่ระบุในการศึกษา RNA-seq ของเราคือยีน LlR18A และ LlR18B ในการตอบสนองต่อการควบคุม เช่นเดียวกับยีนแบบควบคุม (1 ยีน) หรือยีนแบบควบคุม (3 ยีน) สำหรับโปรตีนถ่ายโอนไขมัน DIR1.นอกจากนี้ WGCNA ยังเน้นยีน LlR18B เป็นศูนย์กลางในโมดูลนี้ ซึ่งไวต่อการฉีดวัคซีนสูงและมียีนตอบสนองการป้องกันหลายตัวยีน LlR18A และ LlR18B ถูกกระตุ้นในใบลูปินสีเหลืองเพื่อตอบสนองต่อแบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรค เช่นเดียวกับในลำต้น NLL หลังจากปลูกเชื้อ D. toxica ในขณะที่ข้าวที่คล้ายคลึงกันของยีนเหล่านี้ RSOsPR10 ถูกชักนำอย่างรวดเร็วจากการติดเชื้อรา ซึ่งน่าจะเกี่ยวข้องกับวิถีการส่งสัญญาณของกรดแจสโมนิก ยีน DIR1 เข้ารหัสโปรตีนขนส่งไขมันที่ไม่จำเพาะซึ่งจำเป็นสำหรับการเริ่มต้นของ การต่อต้านที่ได้รับอย่างเป็นระบบ (SAR)ด้วยการพัฒนาปฏิกิริยาป้องกัน โปรตีน DIR1 จะถูกขนส่งจากจุดโฟกัสของการติดเชื้อผ่านทางต้นตอเพื่อกระตุ้น SAR ในอวัยวะที่อยู่ห่างไกลที่น่าสนใจคือ ยีน TanjilG_02313 DIR1 ถูกเหนี่ยวนำอย่างมีนัยสำคัญที่จุดเวลาแรกในบรรทัดที่ 84A:476 และประชากร 22660 แต่การต้านทานโรคแอนแทรคโนสพัฒนาได้สำเร็จในบรรทัดที่ 84A:476 เท่านั้นสิ่งนี้อาจบ่งบอกถึงการทำงานย่อยของยีน DIR1 ใน NLL เนื่องจากโฮโลล็อกที่เหลืออีกสามตัวตอบสนองต่อการฉีดวัคซีนในบรรทัด 83A:476 ที่ 6 hpi เท่านั้น และการตอบสนองนี้มุ่งลงด้านล่าง
ในการศึกษาของเรา ส่วนประกอบที่พบมากที่สุดที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีวภาพที่เรียกว่า “กระบวนการรีดอกซ์ GO:0055114” ได้แก่ โปรตีนไซโตโครม P450, เปอร์ออกซิเดส, กรดลิโนเลอิก 9S-/13S-ลิพอกซีจีเนส และ 1-อะมิโนไซโคลโพรเพน-1-คาร์บอกซิลิกแอซิดออกซิเดสนอกจากนี้ WGCNA ของเรายังกำหนดโฮโมโลเก HSFA4a ว่าเป็นโมดูลที่บรรทุกฮับ เช่น ตัวเลือกยีนต้านทาน Lanr1 TanjilG_05042HSFA4a เป็นส่วนประกอบของการควบคุมการถอดความนิวเคลียร์ในพืชที่ขึ้นกับรีดอกซ์
โปรตีน Cytochrome P450 เป็นออกซิโดเรสดักเตสที่เร่งปฏิกิริยา NADPH และ/หรือปฏิกิริยาไฮดรอกซิเลชั่นที่ขึ้นกับ O2 ในเมแทบอลิซึมปฐมภูมิและทุติยภูมิ รวมถึงเมแทบอลิซึมของซีโนไบโอติก เช่นเดียวกับฮอร์โมน กรดไขมัน สเตอรอล ส่วนประกอบผนังเซลล์ พอลิเมอร์ชีวภาพ และการสังเคราะห์ทางชีวภาพของสารป้องกัน ) ถึง 5.7 เนื่องจากมีโฮโลล็อกที่เปลี่ยนแปลงจำนวนมาก (37) และความแตกต่างในรูปแบบการตอบสนองระหว่างยีนเฉพาะ ซึ่งสะท้อนถึงการปรับขึ้น.การใช้เฉพาะข้อมูล RNA-seq เพื่ออธิบายการทำงานทางชีวภาพสมมุติของยีน NLL ใน superfamily โปรตีนขนาดใหญ่เช่นนี้จะเป็นการเก็งกำไรสูงอย่างไรก็ตาม เป็นที่น่าสังเกตว่ายีนของไซโตโครม P450 บางตัวมีความสัมพันธ์กับความต้านทานต่อเชื้อราหรือแบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรคที่เพิ่มขึ้น รวมถึงมีส่วนทำให้เกิดปฏิกิริยาภูมิแพ้69,70,71
เปอร์ออกซิเดสคลาส III เป็นเอนไซม์อเนกประสงค์ของพืชที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการเมแทบอลิซึมที่หลากหลายระหว่างการเจริญเติบโตและการพัฒนาของพืช เช่นเดียวกับการตอบสนองต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อม เช่น ความเค็ม ความแห้งแล้ง ความเข้มของแสงสูง และการโจมตีของเชื้อโรค72เปอร์ออกซิเดสเกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ของพืชหลายชนิดกับโรคแอนแทรกซ์ ได้แก่ Stylosanthes humilis และ C. gloeosporioides, Lens culinaris และ C. truncatum, Phaseolus vulgaris และ C. lindemuthianum, Cucumis sativus และ C. lagenarium73,74,75,76การตอบสนองรวดเร็วมาก บางครั้งถึง 4 HPI ก่อนที่เชื้อราจะแทรกซึมเข้าไปในเนื้อเยื่อพืช73ยีนเปอร์ออกซิเดสยังตอบสนองต่อการฉีดวัคซีน D. toxica NLLนอกเหนือจากหน้าที่ทั่วไปในการควบคุมการระเบิดออกซิเดชันหรือขจัดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันแล้ว เปอร์ออกซิเดสยังรบกวนการเจริญเติบโตของเชื้อโรคโดยการสร้างสิ่งกีดขวางทางกายภาพโดยอาศัยการเสริมแรงของผนังเซลล์ในระหว่างการทำให้เป็นลิกไนต์ หน่วยย่อย หรือการเชื่อมโยงข้ามของสารประกอบเฉพาะฟังก์ชั่นนี้สามารถนำมาประกอบในซิลิโกกับยีน TanjilG_03329 ที่เข้ารหัสแอนไอออนเปอร์ออกซิเดสที่ก่อตัวด้วยลิกนินซึ่งถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญในการศึกษาของเราในสายต้านทาน 83A: 476 ที่ 6 HPI แต่ไม่อยู่ในสายพันธุ์และจุดเวลาอื่นที่ไม่ตอบสนอง
9S-/13S-lipoxygenase ของกรดไลโนเลอิกเป็นขั้นตอนแรกในวิถีออกซิเดชันของการสังเคราะห์ไขมันในเลือด78ผลิตภัณฑ์ของทางเดินนี้มีหน้าที่หลายอย่างในการป้องกันพืช รวมถึงการเสริมความแข็งแรงของผนังเซลล์ผ่านการก่อตัวของแคลโลสและเพคติน และการควบคุมความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันผ่านการผลิตสายพันธุ์ออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยา79,80,81,82,83ในการศึกษาปัจจุบัน การแสดงออกของกรดไลโนเลอิก 9S-/13S-lipoxygenase มีการเปลี่ยนแปลงในทุกสายพันธุ์ แต่ในประชากรที่อ่อนแอ 22660 การควบคุมจะมีชัยเหนือที่จุดเวลาที่ต่างกัน ในขณะที่สายพันธุ์ที่มีความต้านทาน Lanr1 และ AnMan อัลลีล มันเน้นความหลากหลายของชั้นออกซีลิพินในปฏิกิริยาป้องกันแอนแทรกซ์ระหว่างจีโนไทป์เหล่านี้
1-อะมิโนไซโคลโพรเพน-1-คาร์บอกซีเลตออกซิเดส (ACO) คล้ายคลึงกันถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (9 ยีน) หรือควบคุมลง (2 ยีน) เมื่อฉีดวัคซีนด้วยลูปินด้วยข้อยกเว้นสองประการ การตอบสนองทั้งหมดนี้เกิดขึ้นที่ 6 แรงม้าที่ 83A:476.ปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่สื่อกลางโดยโปรตีน ACO เป็นขั้นตอนที่จำกัดอัตราในการผลิตเอทิลีน ดังนั้นจึงมีการควบคุมอย่างเข้มงวด84เอทิลีนเป็นฮอร์โมนพืชที่มีบทบาทหลากหลายในการควบคุมการพัฒนาของพืชและการตอบสนองต่อสภาวะความเครียดทางชีวภาพและทางชีวภาพการเหนี่ยวนำการถอดรหัส ACO และการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณเอทิลีนนั้นเกี่ยวข้องกับการเพิ่มความต้านทานของข้าวต่อเชื้อราเฮมิไบโอโทรฟิค oryzae oryzae โดยควบคุมการผลิตสายพันธุ์ออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาและไฟโตอะเลกซินกระบวนการติดเชื้อในใบที่คล้ายกันมากซึ่งพบระหว่าง M. oryzae และ C. lupini88,89 เทียบกับฉากหลังของการควบคุมที่คล้ายคลึงกันอย่างมีนัยสำคัญของ ACO homologues ในสาย 83A:476 ที่รายงานในการศึกษานี้ เปลี่ยนความเป็นไปได้ของการต้านทานต่อ NLL anthracnose Ethylene ซึ่งเป็นสัญญาณขั้นตอนสำคัญในวิถีทางของโมเลกุล
ในการศึกษาปัจจุบัน การยับยั้งยีนจำนวนมากที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ด้วยแสงถูกสังเกตที่ 6 hpi ใน 83A:476 และที่ 48 hpi ใน Mandeloop และประชากร 22660ขอบเขตและความก้าวหน้าของการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้เป็นสัดส่วนกับระดับการทดลองนี้พบการดื้อยาแอนแทรคโนสเมื่อเร็ว ๆ นี้มีรายงานการปราบปรามการถอดเสียงที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ด้วยแสงอย่างรวดเร็วและรุนแรงในแบบจำลองปฏิสัมพันธ์ระหว่างพืชกับเชื้อโรคหลายรุ่นรวมถึงแบคทีเรียและเชื้อราที่ทำให้เกิดโรคความเร่งรีบ (จาก 2 HPI ในการโต้ตอบบางอย่าง) และการปราบปรามทั่วโลกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ด้วยแสงเพื่อตอบสนองต่อการติดเชื้อสามารถกระตุ้นภูมิคุ้มกันของพืชโดยอิงจากการใช้ออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาและการมีปฏิสัมพันธ์กับเส้นทางกรดซาลิไซลิกเพื่อไกล่เกลี่ยปฏิกิริยาการแพ้ 90,94
โดยสรุป กลไกการตอบสนองการป้องกันที่เสนอสำหรับสายเลือดที่ดื้อยามากที่สุด (83A:476) รวมถึงการจดจำเชื้อโรคอย่างรวดเร็วโดยยีน R (สันนิษฐานว่า TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) และการส่งสัญญาณกรดซาลิไซลิกและเอทิลีนที่ตอบสนองต่อการแพ้ ตามมาด้วยการสร้าง SAR ระยะไกลการกระทำได้รับการสนับสนุนโดยโปรตีน DIR-1ควรสังเกตว่าระยะเวลา biotrophic สำหรับการติดเชื้อ C. lupini นั้นสั้นมาก (ประมาณ 2 วัน) ตามด้วยการเจริญของเนื้อตาย95การเปลี่ยนแปลงระหว่างขั้นตอนเหล่านี้อาจเกี่ยวข้องกับเนื้อร้ายและการแสดงออกของโปรตีนที่เหนี่ยวนำด้วยเอทิลีนซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวกระตุ้นให้เกิดปฏิกิริยาภูมิไวเกินในพืชเจ้าบ้านดังนั้นกรอบเวลาสำหรับความสำเร็จในการจับ C. lupini ในระยะ biotrophic จึงแคบมากการตั้งโปรแกรมซ้ำของยีนที่เกี่ยวข้องกับรีดอกซ์และการสังเคราะห์ด้วยแสงที่สังเกตได้ใน 83A:476 ที่ 6 hpi นั้นสอดคล้องกับความก้าวหน้าของเส้นใยเชื้อราและประกาศการพัฒนาของการตอบสนองการป้องกันที่ประสบความสำเร็จในระยะ biotrophicการตอบสนองของการถอดเสียงของ Mandelup และประชากร 22660 อาจล่าช้าเกินไปในการจับเชื้อราก่อนที่จะเปลี่ยนเป็นการเจริญเติบโตแบบเนื้อตาย อย่างไรก็ตาม Mandelup อาจมีประสิทธิภาพมากกว่าประชากร 22660 เนื่องจากการควบคุมโปรตีน PR-10 ที่ค่อนข้างรวดเร็วส่งเสริมการดื้อยาในแนวนอน
ETI ซึ่งขับเคลื่อนโดยยีน R แบบบัญญัติ ดูเหมือนจะเป็นกลไกทั่วไปในการต้านทานโรคแอนแทรคโนสของถั่วดังนั้น ในพืชตระกูลถั่วรุ่น Medicago truncatula ความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสเกิดจากยีน RCT1 ซึ่งเป็นสมาชิกของกลุ่มยีน R ของพืช TIR-NBS-LRR97ยีนนี้ยังให้ความต้านทานโรคแอนแทรคโนสในวงกว้างในอัลฟัลฟ่าเมื่อถ่ายโอนไปยังพืชที่อ่อนแอในถั่วทั่วไป (P. vulgaris) มีการระบุยีนต้านทานโรคแอนแทรคโนสมากกว่าสองโหลจนถึงปัจจุบันยีนเหล่านี้บางส่วนพบในบริเวณที่ไม่มียีน R ที่เป็นที่ยอมรับ อย่างไรก็ตาม ยีนอื่นๆ จำนวนมากอยู่ที่ขอบของโครโมโซมที่มีคลัสเตอร์ยีน NBS-LRR รวมถึง TIR-NBS-LRRs99การศึกษา SSR ทั่วทั้งจีโนมยังยืนยันความสัมพันธ์ของยีน NBS-LRR กับการต้านทานโรคแอนแทรกโนสในถั่วทั่วไปนอกจากนี้ยังพบยีน Canonical R ในบริเวณจีโนมซึ่งมีตำแหน่งการดื้อยาแอนแทรคโนสที่สำคัญในลูปินขาว 101
ผลงานของเราแสดงให้เห็นว่าปฏิกิริยาการดื้อยาที่เกิดขึ้นทันที ซึ่งเริ่มทำงานตั้งแต่ระยะแรกของการติดเชื้อในพืช (ไม่ควรเกิน 12 hpi) สามารถป้องกันลูปินใบแคบจากโรคแอนแทรคโนสที่เกิดจากเชื้อรา Collelotrichum lupini ที่ทำให้เกิดโรคได้อย่างมีประสิทธิภาพการใช้การจัดลำดับปริมาณงานสูง เราแสดงโปรไฟล์การแสดงออกที่แตกต่างกันของยีนต้านทานโรคแอนแทรกโนสในพืช NLL ที่อาศัยโดยยีนต้านทาน Lanr1 และ AnManการป้องกันที่ประสบความสำเร็จเกี่ยวข้องกับการออกแบบยีนอย่างระมัดระวังสำหรับโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับรีดอกซ์ การสังเคราะห์ด้วยแสง และการเกิดโรคภายในไม่กี่ชั่วโมงหลังจากที่พืชสัมผัสกับเชื้อโรคเป็นครั้งแรกปฏิกิริยาการป้องกันที่คล้ายคลึงกัน แต่เกิดขึ้นช้า มีประสิทธิภาพน้อยกว่ามากในการปกป้องพืชจากโรคการดื้อยาของแอนแทรกซ์ที่สื่อกลางโดยยีน Lanr1 คล้ายกับการตอบสนองอย่างรวดเร็วโดยทั่วไปของยีน R (ภูมิคุ้มกันที่กระตุ้นโดยเอฟเฟกเตอร์) ในขณะที่ยีน AnMan มักจะให้การตอบสนองในแนวนอน (ภูมิคุ้มกันที่ถูกกระตุ้นโดยรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับจุลินทรีย์) ซึ่งให้ความยั่งยืนในระดับปานกลาง
สายพันธุ์ NLL 215 สายพันธุ์ที่ใช้ในการคัดกรองเครื่องหมายโรคแอนแทรกโนสประกอบด้วยสายพันธุ์ 74 สายพันธุ์ 60 สายพันธุ์ที่ได้จากการผสมข้ามพันธุ์หรือการผสมพันธุ์ 5 สายพันธุ์ และ 76 สายพันธุ์ดั้งเดิมหรือดั้งเดิมสายการเดินเรือมาจาก 17 ประเทศ ส่วนใหญ่มาจากโปแลนด์ (58) สเปน (47) เยอรมนี (27) ออสเตรเลีย (26) รัสเซีย (19) เบลารุส (7) อิตาลี (5) และสายอื่นๆจาก 10 ประเทศชุดนี้ยังรวมถึงเส้นต้านทานอ้างอิง: 83A:476, Tanjil, Wonga ที่มีอัลลีล Lanr1 และ Mandelup ที่มีอัลลีล AnManบรรทัดนี้ได้มาจากฐานข้อมูลทรัพยากรพันธุกรรมลูปินแห่งยุโรปที่ดูแลโดยPoznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, โปแลนด์ (ตารางเสริม S1)
พืชเติบโตภายใต้สภาวะควบคุม (ช่วงแสง 16 ชั่วโมง อุณหภูมิ 25°C ในตอนกลางวัน และ 18°C ​​ในตอนกลางคืน)วิเคราะห์การจำลองแบบทางชีวภาพสองครั้งแยก DNA ได้จากใบไม้อายุสามสัปดาห์โดยใช้ DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) ตามโปรโตคอลคุณภาพและความเข้มข้นของ DNA ที่แยกได้ได้รับการประเมินโดยวิธีสเปกโตรโฟโตเมตริก (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)เครื่องหมาย AnManM1 ทำเครื่องหมายยีนต้านทานแอนแทรคโนส AnMan (มาจากพันธุ์ Mandelup) และเครื่องหมาย Anseq3 และ Anseq4 ขนาบข้างยีน Lanr1 (มาจากพันธุ์ Tanjil) ได้รับการวิเคราะห์ 11,26,28โฮโมไซโกตสำหรับอัลลีลที่ดื้อยาได้รับคะแนนเป็น “1″, ไว – เป็น “0″ และเฮเทอโรไซโกต – เป็น 0.5
จากผลการคัดกรองเครื่องหมาย AnManM1, AnSeq3 และ AnSeq4 และความพร้อมใช้งานของเมล็ดพันธุ์สำหรับการทดลองติดตามผลขั้นสุดท้าย สายพันธุ์ NLL 50 สายถูกเลือกสำหรับฟีโนไทป์การดื้อต่อโรคแอนแทรคโนสการวิเคราะห์ดำเนินการซ้ำกันในเรือนกระจกที่ควบคุมด้วยคอมพิวเตอร์ซึ่งมีช่วงแสง 14 ชั่วโมง โดยมีช่วงอุณหภูมิ 22°C ในตอนกลางวันและ 19°C ในตอนกลางคืนเมล็ดจะถูกขูด (ตัดเปลือกหุ้มเมล็ดที่อยู่ฝั่งตรงข้ามของตัวอ่อนออกด้วยใบมีดที่คม) ก่อนหว่านเพื่อป้องกันการพักตัวของเมล็ดเนื่องจากเยื่อหุ้มเมล็ดแข็งเกินไป และเพื่อความงอกอย่างสม่ำเสมอปลูกพืชในกระถาง (11 × 11 × 21 ซม.) ด้วยดินปลอดเชื้อ (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Poland)ดำเนินการปลูกเชื้อด้วยสายพันธุ์ Colletotrichum lupini Col-08 ซึ่งปลูกในปี 2542 จากลำต้นของต้นลูปินใบแคบที่ปลูกในทุ่งใน Verzhenitsa ประเทศโปแลนด์ (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E )รับพื้นที่.เพาะเลี้ยงเชื้อที่แยกได้ในอาหารเลี้ยงเชื้อ SNA ที่อุณหภูมิ 20°C ภายใต้แสงสีดำเป็นเวลา 21 วันเพื่อกระตุ้นการสร้างสปอร์สี่สัปดาห์หลังหยอดเมล็ด เมื่อพืชถึงระยะใบ 4-6 ใบ ดำเนินการปลูกเชื้อโดยการฉีดพ่นโคนิเดียแขวนลอยที่ความเข้มข้น 0.5 x 106 โคนิเดียต่อมล.หลังจากฉีดวัคซีน พืชจะถูกเก็บไว้ในที่มืดเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ความชื้นประมาณ 98% และอุณหภูมิ 25°C เพื่ออำนวยความสะดวกในการงอกของโคนิเดียและกระบวนการติดเชื้อจากนั้นจึงปลูกพืชภายใต้ช่วงแสง 14 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 22°C กลางวัน/19°C กลางคืน และความชื้น 70%คะแนนโรคทำขึ้นหลังจากฉีดวัคซีน 22 วันและมีค่าตั้งแต่ 0 (ภูมิคุ้มกัน) ถึง 9 (อ่อนแอมาก) ขึ้นอยู่กับการมีหรือไม่มีแผลเนื้อตายบนลำต้นและใบนอกจากนี้หลังจากให้คะแนนแล้วจะมีการวัดน้ำหนักของต้นไม้ความสัมพันธ์ระหว่างมาร์คเกอร์จีโนไทป์และฟีโนไทป์ของโรคถูกคำนวณเป็นความสัมพันธ์แบบสองลำดับจุด