ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าจะได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงผลไซต์โดยไม่ใช้รูปแบบและ JavaScript
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) เป็นพืชตระกูลถั่วที่ใช้ในการผลิตอาหารและปรับปรุงดิน การขยายตัวของ NLL ทั่วโลกในฐานะพืชผลดึงดูดเชื้อราที่ก่อโรคหลายชนิด รวมถึงโรคแอนแทรคโนสลูพิน ซึ่งทำให้เกิดโรคแอนแทรคโนสที่ร้ายแรง มีการใช้แอลลีลสองตัวคือ Lanr1 และ AnMan ซึ่งช่วยเพิ่มความต้านทานในการปรับปรุงพันธุ์ NLL แต่กลไกโมเลกุลพื้นฐานยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด ในการศึกษานี้ มีการใช้เครื่องหมาย Lanr1 และ AnMan เพื่อคัดกรองตัวอย่าง NLL ของยุโรป การทดสอบวัคซีนในสภาพแวดล้อมที่ควบคุมได้ยืนยันประสิทธิภาพของผู้บริจาคที่ต้านทานทั้งสองราย โปรไฟล์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันดำเนินการกับสายพันธุ์ที่ต้านทานและอ่อนแอที่เป็นตัวแทน ความต้านทานโรคแอนแทรคโนสเกี่ยวข้องกับการแสดงออกมากเกินไปของเงื่อนไขออนโทโลยีของยีน "GO:0006952 Defense Response" "GO:0055114 Redox Process" และ "GO:0015979 Photosynthesis" นอกจากนี้ สายพันธุ์ Lanr1(83A:476) ยังแสดงให้เห็นการรีโปรแกรมทรานสคริปโตมอย่างมีนัยสำคัญอย่างรวดเร็วหลังจากการเพาะเชื้อ ในขณะที่สายพันธุ์อื่นๆ แสดงให้เห็นความล่าช้าในการตอบสนองนี้ประมาณ 42 ชั่วโมง การตอบสนองด้านการป้องกันเกี่ยวข้องกับยีน TIR-NBS, CC-NBS-LRR และ NBS-LRR โปรตีน 10 ชนิดที่เกี่ยวข้องกับการก่อโรค โปรตีนถ่ายโอนไขมัน เอนโดกลูแคน-1,3-β-กลูโคซิเดส โปรตีนผนังเซลล์ที่มีไกลซีนสูง และยีนจากเส้นทางปฏิกิริยาของออกซิเจน การตอบสนองในระยะเริ่มต้นต่อ 83A:476 รวมถึงการระงับยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสงอย่างระมัดระวัง สอดคล้องกับการป้องกันที่ประสบความสำเร็จในช่วงการเจริญเติบโตแบบพืชของชีววิทยาของเชื้อรา ซึ่งแสดงให้เห็นว่าตัวกระตุ้นกระตุ้นภูมิคุ้มกัน ปฏิกิริยาของ Mandeloop ช้าลง เช่นเดียวกับแรงลากแนวนอนโดยรวม
ลูพินใบแคบ (NLL, Lupinus angustifolius L.) เป็นธัญพืชโปรตีนสูงซึ่งมีต้นกำเนิดในภูมิภาคเมดิเตอร์เรเนียนตะวันตก1,2 ปัจจุบันมีการปลูกเพื่อเป็นพืชอาหารสำหรับสัตว์และมนุษย์ นอกจากนี้ยังถือเป็นปุ๋ยพืชสดในระบบการหมุนเวียนพืชผลเนื่องจากการตรึงไนโตรเจนโดยแบคทีเรียที่อาศัยร่วมกันและปรับปรุงโครงสร้างดินโดยรวม NLL ได้ผ่านกระบวนการทำให้เชื่องอย่างรวดเร็วในศตวรรษที่แล้วและยังคงอยู่ภายใต้แรงกดดันในการผสมพันธุ์ที่สูง3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ด้วยการเพาะปลูก NLL อย่างแพร่หลาย เชื้อราที่ทำให้เกิดโรคได้พัฒนาช่องทางการเกษตรใหม่ๆ และก่อให้เกิดโรคใหม่ที่จะทำลายพืชผล สิ่งที่น่าสังเกตมากที่สุดสำหรับเกษตรกรและผู้เพาะพันธุ์ลูพินคือการปรากฏตัวของโรคแอนแทรคโนส ซึ่งเกิดจากเชื้อราที่ทำให้เกิดโรค Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 สิ่งที่น่าสังเกตมากที่สุดสำหรับเกษตรกรและผู้เพาะพันธุ์ลูพินคือการปรากฏตัวของโรคแอนแทรคโนส ซึ่งเกิดจากเชื้อราที่ทำให้เกิดโรค Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. สิ่งที่น่าสังเกตมากที่สุดสำหรับเกษตรกรและผู้เพาะพันธุ์ลูพินคือการเกิดโรคแอนแทรคโนสที่เกิดจากเชื้อราที่ก่อโรคชื่อ Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. สิ่งที่สะดุดตาเกษตรกรและผู้เพาะพันธุ์ลูพินมากที่สุดคือการเกิดโรคแอนแทรคโนสที่เกิดจากเชื้อราที่ก่อโรคชื่อ Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13รายงานโรคนี้พบครั้งแรกในบราซิลและสหรัฐอเมริกา โดยมีอาการทั่วไปในปี 1912 และ 1929 ตามลำดับ อย่างไรก็ตาม หลังจากนั้นประมาณ 30 ปี เชื้อก่อโรคนี้จึงได้รับการระบุว่าเป็น Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (สโตนแมน) สเปลด์ & Sacc., teleomorph ของ Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld & Sacc.，มี目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，มี目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (สโตนแมน) Spauld в целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld ในสัณฐานวิทยาเป้าหมาย และ เอช. ชเรงก์, และ เอช. ชเรงก์, .และ H. Schrenk & H.施伦克，。 & H.施伦克，。และ H. Schlenk, .การตรวจลักษณะโรคเบื้องต้นที่ทำในช่วงกลางศตวรรษที่ 20 แสดงให้เห็นความต้านทานบางส่วนใน NLL และการเข้าถึงของลูพินสีเหลือง (L. luteus L.) แต่การเข้าถึงของลูพินสีขาว (L. albus L.) ทั้งหมดที่ทดสอบมีความอ่อนไหวสูง15,16 การศึกษาวิจัยแสดงให้เห็นว่าการพัฒนาของโรคแอนแทรคโนสสัมพันธ์กับปริมาณน้ำฝนที่เพิ่มขึ้น (ความชื้นในอากาศ) และอุณหภูมิ (ในช่วง 12-28°C) ซึ่งนำไปสู่การละเมิดความต้านทานที่อุณหภูมิที่สูงขึ้น17, 18 ในความเป็นจริง เวลาที่จำเป็นเพื่อให้โคนิเดียงอกและโรคเริ่มต้นนั้นสั้นลงสี่เท่าที่ 24°C (4 ชั่วโมง) เมื่อเทียบกับ 12°C (16 ชั่วโมง) ในสภาวะที่มีความชื้นสูง19 ดังนั้นภาวะโลกร้อนที่ดำเนินอยู่จึงนำไปสู่การแพร่กระจายของโรคแอนแทรคโนส อย่างไรก็ตาม โรคนี้ถูกพบในฝรั่งเศส (1982) และยูเครน (1983) ในฐานะสัญญาณบ่งชี้ถึงภัยคุกคามที่กำลังจะเกิดขึ้น แต่ดูเหมือนว่าอุตสาหกรรมลูพินจะละเลยในขณะนั้น20,21 ไม่กี่ปีต่อมา โรคร้ายแรงนี้แพร่กระจายไปทั่วโลกและยังส่งผลกระทบต่อประเทศผู้ผลิตลูพินรายใหญ่ เช่น ออสเตรเลีย โปแลนด์ และเยอรมนี22,23,24 หลังจากการระบาดของโรคแอนแทรคโนสในช่วงกลางทศวรรษ 1990 การคัดกรองอย่างละเอียดส่งผลให้ระบุตัวบริจาคที่ต้านทานได้หลายตัวในตัวอย่าง NLL19 ความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสของ NLL ถูกควบคุมโดยอัลลีลเด่นแยกกันสองตัวที่พบในแหล่งพลาสมาเชื้อพันธุ์ที่แตกต่างกัน: Lanr1 ในพันธุ์ Tanjil และ Wonga และ AnMan ในพันธุ์พันธุ์ Mandalay 25, 26 อัลลีลเหล่านี้เสริมเครื่องหมายโมเลกุลที่สนับสนุนการคัดเลือกพลาสมาเชื้อพันธุ์ที่ต้านทานได้ในโครงการปรับปรุงพันธุ์25,26,27,28,29,30 สายพันธุ์ที่ต้านทาน 83A:476 ซึ่งมีอัลลีล Lanr1 ถูกผสมข้ามสายพันธุ์กับสายพันธุ์ป่าที่อ่อนไหว P27255 เพื่อให้ได้ประชากร RIL ที่แยกตัวเพื่อต้านทานโรคแอนแทรคโนส ซึ่งทำให้สามารถกำหนดตำแหน่ง Lanr1 ให้กับโครโมโซม NLL-1131, 32, 33 ได้ การจัดตำแหน่งของเครื่องหมายแผนที่การเชื่อมโยงจากตำแหน่งต้านทานที่อยู่ติดกันไปยังโรคแอนแทรคโนสด้วยกรอบจีโนม NLL เปิดเผยตำแหน่งของอัลลีลทั้งสามบนโครโมโซมเดียวกัน (NLL-11) แต่ในตำแหน่งที่แตกต่างกัน29,34,35 อย่างไรก็ตาม เนื่องจาก RIL มีจำนวนน้อยและระยะห่างทางพันธุกรรมที่มากระหว่างเครื่องหมายและอัลลีลที่เกี่ยวข้อง จึงไม่สามารถสรุปได้อย่างน่าเชื่อถือเกี่ยวกับยีนพื้นฐานของพวกเขา ในทางกลับกัน การใช้พันธุกรรมย้อนกลับในลูพินนั้นทำได้ยากเนื่องจากมีศักยภาพในการสร้างใหม่ต่ำมาก ซึ่งทำให้การปรับแต่งพันธุกรรมยุ่งยาก37
การพัฒนาของเชื้อพันธุ์ที่เลี้ยงไว้ในบ้านซึ่งมีอัลลีลที่ต้องการในสถานะโฮโมไซกัส เช่น 83A:476 (Lanr1) และ Mandelup (AnMan) ได้เปิดประตูสู่การศึกษาความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสเมื่อเผชิญกับการมีอยู่ของการรวมกันของอัลลีลที่ตรงกันข้ามกันในประชากรป่า ความเป็นไปได้ของกลไกระดับโมเลกุล เปรียบเทียบการตอบสนองการป้องกันที่เกิดจากจีโนไทป์เฉพาะ การศึกษาครั้งนี้ประเมินการตอบสนองของทรานสคริปโตมในระยะเริ่มต้นของ NLL ต่อการฉีดวัคซีน C. lupini ขั้นแรก คัดกรองกลุ่มเชื้อพันธุ์ NLL ของยุโรปที่มี 215 สายพันธุ์โดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลที่ทำเครื่องหมายอัลลีล Lanr1 และ AnMan จากนั้นจึงทำการสร้างฟีโนไทป์โรคแอนแทรคโนสกับสายพันธุ์ NLL 50 สายพันธุ์ที่ได้รับการคัดเลือกไว้สำหรับเครื่องหมายโมเลกุลภายใต้สภาวะที่ควบคุม จากการทดลองเหล่านี้ สายพันธุ์ 4 สายพันธุ์ที่มีความต้านทานโรคแอนแทรคโนสที่แตกต่างกันและมีองค์ประกอบของอัลลีล Lanr1/AnMan ได้รับการคัดเลือกสำหรับโปรไฟล์การแสดงออกของยีนการป้องกันที่แตกต่างกันโดยใช้แนวทางที่เสริมกันสองแนวทาง ได้แก่ การจัดลำดับ RNA ปริมาณสูงและการวัดปริมาณ PCR แบบเรียลไทม์
การคัดกรองชุดเชื้อพันธุ์ NLL (N = 215) ที่มีเครื่องหมาย Lanr1 (Anseq3 และ Anseq4) และ AnMan (Anseq4) และ AnMan (AnManM1) แสดงให้เห็นว่ามีเพียงสายพันธุ์เดียว (95726 ใกล้กับ Salamanca-b) ที่เพิ่มจำนวนอัลลีล "ต้านทาน" สำหรับเครื่องหมายทั้งหมด ในขณะที่ "การมีอยู่ของอัลลีลที่ 'อ่อนไหว'" พบสัดส่วนของเครื่องหมายทั้งหมดใน 158 สายพันธุ์ (~73.5%) สายพันธุ์ 13 สายพันธุ์สร้างอัลลีล "ต้านทาน" สองอัลลีลของเครื่องหมาย Lanr1 และ 8 สายพันธุ์สร้างอัลลีล "ต้านทาน" ของเครื่องหมาย Lanr1 อัลลีล "ต้านทาน" ของเครื่องหมาย AnMan (ตารางเสริม S1) สายพันธุ์สองสายพันธุ์เป็นเฮเทอโรไซกัสสำหรับเครื่องหมาย Anseq3 และหนึ่งสายพันธุ์เป็นเฮเทอโรไซกัสสำหรับเครื่องหมาย AnManM1 สายพันธุ์ 42 สายพันธุ์ (19.5%) มีเฟสตรงข้ามกันของอัลลีล Anseq3 และ Anseq4 ซึ่งบ่งชี้ถึงความถี่สูงของการรวมตัวกันใหม่ระหว่างโลคัสทั้งสองนี้ ฟีโนไทป์ของแอนแทรคโนสภายใต้สภาวะที่ควบคุม (ตารางเสริม S2) เผยให้เห็นถึงความแปรปรวนในความต้านทานของจีโนไทป์ที่ทดสอบ ซึ่งสะท้อนให้เห็นในความรุนแรงของโรคแอนแทรคโนส ความแตกต่างของคะแนนเฉลี่ยมีตั้งแต่ 1.8 (ต้านทานปานกลาง) ถึง 6.9 (อ่อนไหว) และความแตกต่างของน้ำหนักพืชมีตั้งแต่ 0.62 (อ่อนไหว) ถึง 4.45 กรัม (ต้านทาน) มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างค่าที่สังเกตได้ในการจำลองการทดลองสองครั้ง (0.51 สำหรับคะแนนความรุนแรงของโรค P = 0.00017 และ 0.61 สำหรับน้ำหนักพืช P < 0.0001) เช่นเดียวกับระหว่างพารามิเตอร์ทั้งสองนี้ (− 0.59 และ − 0.77, P < 0.0001) มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างค่าที่สังเกตได้ในการจำลองการทดลองสองครั้ง (0.51 สำหรับคะแนนความรุนแรงของโรค P = 0.00017 และ 0.61 สำหรับน้ำหนักพืช P < 0.0001) เช่นเดียวกับระหว่างพารามิเตอร์ทั้งสองนี้ (− 0.59 และ − 0.77, P < 0.0001) Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 และ 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, ร< 0,0001) 0,0001). พบความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างค่าที่สังเกตได้จากการทดลองซ้ำ 2 ครั้ง (0.51 สำหรับคะแนนความรุนแรงของโรค P = 0.00017 และ 0.61 สำหรับน้ำหนักต้น P < 0.0001) เช่นเดียวกับระหว่างพารามิเตอร์ทั้งสองนี้ (- 0.59 และ -0.77, P < 0.0001) และ 0.0001)在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0.51,P = 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为 分为 0.51 , p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 , p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0.59 和– 0.59 和– 0.59 和– 0.59 和- 0.77,P<0.0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 และ масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างค่าที่สังเกตได้ซ้ำ (คะแนนความรุนแรงของโรค 0.51, P = 0.00017 และน้ำหนักต้น 0.61, P < 0.0001) และระหว่างพารามิเตอร์ทั้งสองนี้ (-0.59 และ -0.0001) 0.77, P<0.0001 ).อาการทั่วไปที่พบในพืชที่อ่อนไหว ได้แก่ ลำต้นงอและบิดเบี้ยวคล้ายโครงสร้าง "คันธนูของคนเลี้ยงแกะ" ตามด้วยรอยโรครูปไข่ที่มีสปอโรซอยต์สีส้ม/ชมพู (รูปเสริมที่ 1) กลุ่มยีนของออสเตรเลียที่มียีน Lanr1 (83A:476 และ Tanjil) และ AnMan (Mandelup) มีความต้านทานปานกลางที่ 0.0331 และ 0.0036) สายพันธุ์บางสายพันธุ์ที่มีอัลลีล Lanr1 และ/หรือ AnMan "ต้านทาน" ก็มีอาการของโรคเช่นกัน
ที่น่าสนใจคือ สายพันธุ์ NLL ไม่กี่สายพันธุ์ที่ไม่มีอัลลีลเครื่องหมาย "ต้านทาน" เผยให้เห็นระดับความต้านทานโรคแอนแทรคโนสสูง (เทียบเคียงหรือสูงกว่าในจีโนไทป์ Lanr1 หรือ AnMan) เช่น Boregine (ค่า P < 0.0001 สำหรับทั้งสองพารามิเตอร์) Bojar (ค่า P < 0.0001 สำหรับคะแนน และ 0.001 สำหรับน้ำหนักต้นพืช) และประชากร B-549/79b (ค่า P < 0.0001 สำหรับคะแนนและไม่สำคัญสำหรับน้ำหนัก) ที่น่าสนใจคือ สายพันธุ์ NLL ไม่กี่สายพันธุ์ที่ไม่มีอัลลีลเครื่องหมาย "ต้านทาน" เผยให้เห็นระดับความต้านทานโรคแอนแทรคโนสสูง (เทียบเคียงหรือสูงกว่าในจีโนไทป์ Lanr1 หรือ AnMan) เช่น Boregine (ค่า P < 0.0001 สำหรับทั้งสองพารามิเตอร์) Bojar (ค่า P < 0.0001 สำหรับคะแนน และ 0.001 สำหรับน้ำหนักต้นพืช) และประชากร B-549/79b (ค่า P < 0.0001 สำหรับคะแนนและไม่สำคัญสำหรับน้ำหนัก) Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы) ที่น่าสนใจคือ สายพันธุ์ NLL หลายสายพันธุ์ที่ไม่มีอัลลีลเครื่องหมาย 'ต้านทาน' ใดๆ แสดงให้เห็นระดับความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสในระดับสูง (เทียบได้กับหรือสูงกว่าในจีโนไทป์ Lanr1 หรือ AnMan) เช่น Boregine (ค่า P < 0.0001 สำหรับทั้งสองพารามิเตอร์) Bojar (ค่า P < 0.0001 สำหรับการประเมิน และ 0.001 สำหรับน้ำหนักต้นพืช) และประชากร B-549/79b (ค่า P < 0.0001 สำหรับการประเมิน และไม่สำคัญสำหรับน้ำหนัก)มี趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnMan基因型相当或更高),例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 สิ่งที่น่าสนใจคือระบบ NLL บางระบบที่ไม่มีเครื่องหมาย “แอนติเจน” ใดๆ กลับแสดงให้เห็นถึงความต้านทานแนวนอนสูง (เทียบเท่ากับยีน Lanr1 หรือ AnMan หรือสูงกว่า) เช่น Boregine (ทั้งสองพารามิเตอร์ P < 0.0001), Bojar (ค่า P < 0.0001, น้ำหนักต้น 0.001) และสายพันธุ์ B-549/79b (ค่า P < 0.0001, น้ำหนักไม่สำคัญ) Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). ที่น่าสนใจคือ สายพันธุ์ NLL บางสายพันธุ์ที่ไม่มีอัลลีลเครื่องหมาย 'ความต้านทาน' ใดๆ แสดงให้เห็นระดับความต้านทานโรคแอนแทรคโนสที่สูง (เทียบได้กับหรือสูงกว่าจีโนไทป์ Lanr1 หรือ AnMan) เช่น Boregine (ค่า P สำหรับทั้งสองพารามิเตอร์ <0.0001), Bojar (ค่า P < 0.0001, น้ำหนักต้น 0.001) และประชากร B-549/79b (ค่า P < 0.0001, น้ำหนักไม่สำคัญ)ปรากฏการณ์นี้ชี้ให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของแหล่งต้านทานทางพันธุกรรมใหม่ ซึ่งอธิบายถึงการขาดความสัมพันธ์ที่สังเกตได้ระหว่างจีโนไทป์ของเครื่องหมายและฟีโนไทป์ของโรค (ค่า P จาก ~0.42 ถึง ~0.98) ดังนั้น การทดสอบ Kolmogorov-Smirnov จึงแสดงให้เห็นว่าข้อมูลเกี่ยวกับความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสมีการแจกแจงแบบปกติโดยประมาณสำหรับคะแนน (ค่า P 0.25 และ 0.11) และมวลของพืช (ค่า P 0.47 และ 0.55) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าฉันตั้งสมมติฐานว่ามีส่วนเกี่ยวข้องกับอัลลีลมากกว่า Lanr1 และ AnMan
จากผลการคัดกรองความต้านทานต่อโรคแอนแทรกโนส มีการคัดเลือกสายพันธุ์ 4 สายพันธุ์สำหรับการวิเคราะห์ทรานสคริปโทม ได้แก่ 83A:476, Boregine, Mandelup และประชากร 22660 สายพันธุ์เหล่านี้ได้รับการทดสอบซ้ำสำหรับความต้านทานต่อโรคแอนแทรกซ์ในการทดลองการฉีดเชื้อโดยใช้การจัดลำดับ RNA โดยให้เหมือนกับในการทดสอบครั้งก่อน ค่าคะแนนมีดังนี้: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) และประชากร 22660 (6.11 ± 1.29 )
โปรโตคอล Illumina NovaSeq 6000 บรรลุค่าเฉลี่ย 40.5 Mread คู่ต่อตัวอย่าง (29.7 ถึง 54.4 Mreads) (ตารางเสริม S3) คะแนนการจัดตำแหน่งในลำดับอ้างอิงอยู่ในช่วง 75.5% ถึง 88.6% ความสัมพันธ์เฉลี่ยของข้อมูลจำนวนการอ่านระหว่างตัวแปรในการทดลองระหว่างการจำลองทางชีวภาพอยู่ในช่วง 0.812 ถึง 0.997 (ค่าเฉลี่ย 0.959) จากยีน 35,170 ยีนที่วิเคราะห์ มี 2,917 ยีนที่ไม่พบการแสดงออก ส่วนยีนอีก 4,785 ยีนมีการแสดงออกในระดับที่ไม่สำคัญ (ค่าเฉลี่ยพื้นฐาน < 5) จากยีน 35,170 ยีนที่วิเคราะห์ มี 2,917 ยีนที่ไม่พบการแสดงออก ส่วนยีนอีก 4,785 ยีนมีการแสดงออกในระดับที่ไม่สำคัญ (ค่าเฉลี่ยพื้นฐาน < 5) ที่ตั้ง 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). จากยีน 35,170 ยีนที่วิเคราะห์ มี 2,917 ยีนที่ไม่แสดงการแสดงออก และยีนที่เหลือ 4,785 ยีนมีการแสดงออกในระดับที่ไม่สำคัญ (ค่าเฉลี่ยพื้นฐาน < 5)在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 ที่ตั้ง 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). ในยีน 35,170 ยีนที่วิเคราะห์ มี 2,917 ยีนที่ไม่ได้แสดงออก และยีนที่เหลือ 4,785 ยีนมีการแสดงออกเล็กน้อย (ค่าเฉลี่ยพื้นฐาน <5)ดังนั้น จำนวนยีนที่ถือว่าแสดงออก (ค่าเฉลี่ยพื้นฐาน ≥ 5) ในระหว่างการทดลองคือ 27,468 (78.1%) (ตารางเสริม S4)
ตั้งแต่จุดเวลาแรก สายพันธุ์ NLL ทั้งหมดตอบสนองต่อการฉีด C. lupini (สายพันธุ์ Col-08) โดยทำการรีโปรแกรมทรานสคริปโทม (ตารางที่ 1) อย่างไรก็ตาม พบว่ามีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างสายพันธุ์ ดังนั้น สายพันธุ์ต้านทาน 83A:476 (ที่มียีน Lanr1) จึงแสดงการรีโปรแกรมทรานสคริปโทมอย่างมีนัยสำคัญ ณ จุดเวลาแรก (6 ชั่วโมงหลังจากฉีด) โดยมีจำนวนยีนขึ้นและลงที่แยกออกมาเพิ่มขึ้น 31-69 เท่าเมื่อเทียบกับจุดเวลาอื่นๆ ณ จุดเวลานี้ นอกจากนี้ จุดสูงสุดนี้มีอายุสั้น เนื่องจากการแสดงออกของยีนเพียงไม่กี่ยีนยังคงเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ ณ จุดเวลาที่สอง (12 ชั่วโมงหลังจากฉีด) ที่น่าสนใจคือ Boregine ซึ่งยังแสดงระดับความต้านทานสูงในการทดสอบกราฟต์ด้วย ไม่ได้ผ่านการรีโปรแกรมการถอดรหัสครั้งใหญ่เช่นนี้ระหว่างการทดลอง อย่างไรก็ตาม จำนวนยีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน (DEG) นั้นเท่ากันสำหรับ Boregine และ 83A:476 ที่ 12 ชั่วโมงหลังจากฉีด ทั้ง Mandelup และประชากร 22660 แสดงให้เห็นค่าสูงสุดของ DEG ในจุดเวลาสุดท้าย (48 ลิตรต่อวินาที) ซึ่งบ่งบอกถึงความล่าช้าสัมพันธ์กันในการตอบสนองการป้องกัน
เนื่องจาก 83A:476 ได้รับการรีโปรแกรมทรานสคริปโตมจำนวนมากเพื่อตอบสนองต่อ C. lupini ที่ 6 HPI เมื่อเทียบกับสายพันธุ์อื่นๆ ทั้งหมด ประมาณ 91% ของ DEG ที่สังเกตพบในช่วงเวลาดังกล่าวจึงจำเพาะต่อสายพันธุ์ (รูปที่ 1) อย่างไรก็ตาม มีการทับซ้อนกันบ้างในการตอบสนองในช่วงแรกระหว่างสายพันธุ์ที่ศึกษา เนื่องจาก 68.5%, 50.9% และ 52.6% DEG ใน Boregine, Mandelup และประชากร 22660 ตามลำดับ ทับซ้อนกับที่พบใน 83A:476 ในบางช่วงเวลา อย่างไรก็ตาม DEG เหล่านี้คิดเป็นเพียงเศษเสี้ยวเล็กน้อย (0.97–1.70%) ของ DEG ทั้งหมดที่ตรวจพบในปัจจุบันโดยใช้ 83A:476 นอกจากนี้ DEG ทั้ง 11 ชนิดจากทุกสายพันธุ์มีความสอดคล้องกันในเวลานี้ (ตารางเสริม S4-S6) ซึ่งรวมถึงส่วนประกอบทั่วไปของการตอบสนองการป้องกันพืช: โปรตีนถ่ายโอนไขมัน (TanjilG_32225), เอนไซม์เอนโดกลูแคน-1,3-β-กลูโคไซด์ (TanjilG_23384), โปรตีนเหนี่ยวนำให้เกิดความเครียด 2 ชนิด เช่น SAM22 (TanjilG_31528 และ TanjilG_31531), โปรตีนลาเท็กซ์เบส (TanjilG_32352) และโปรตีนผนังเซลล์โครงสร้างที่อุดมด้วยไกลซีน 2 ชนิด (TanjilG_19701 และ TanjilG_19702) นอกจากนี้ ยังมีการทับซ้อนกันค่อนข้างสูงในการตอบสนองของทรานสคริปโทมระหว่าง 83A:476 กับ Boregine ที่ 24 HPI (รวม 16-38% DEG) และระหว่าง Mandelup กับประชากร 22660 ที่ 48 HPI (รวม 14-20% DEG)
แผนภาพเวนน์แสดงจำนวนยีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน (DEG) ในสายพันธุ์ลูพินใบแคบ (NLL) ที่ได้รับการเพาะเชื้อ Colletotrichum lupini (สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้จากทุ่งลูพินในเวียร์เชนิเซ ประเทศโปแลนด์ พ.ศ. 2542) สายพันธุ์ NLL ที่วิเคราะห์ได้แก่ 83A:476 (ต้านทาน มีอัลลีล Lanr1) Boregine (ต้านทาน ไม่ทราบภูมิหลังทางพันธุกรรม) Mandelup (ต้านทานปานกลาง มีอัลลีล AnMan) และประชากร 22660 (อ่อนไหวมาก) ตัวย่อ hpi ย่อมาจากชั่วโมงหลังการฉีดวัคซีน ค่าศูนย์ถูกลบออกเพื่อทำให้กราฟง่ายขึ้น
ชุดของยีนที่แสดงออกมากเกินไปที่ 6 ชั่วโมงหลังจากการวิเคราะห์เพื่อหาการมีอยู่ของโดเมนยีน R แบบดั้งเดิม (ตารางเสริม S7) การศึกษาครั้งนี้เผยให้เห็นการเหนี่ยวนำทรานสคริปโทมของยีนต้านทานโรคแบบคลาสสิกที่มีโดเมน NBS-LRR ที่ 83A:476 เท่านั้น ชุดนี้ประกอบด้วยยีน TIR-NBS-LRR หนึ่งยีน (tanjilg_05042) ยีน CC-NBS-LRR ห้ายีน (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 และ tanjilg_16162) และ NBS-LR สี่ยีน Tanjilg_16162) และ NBS-LRRE สี่ยีน (tanjilg_16162) รวมทั้ง NBS-Lrr สี่ยีน (tanjilg_16162) และ NBS-LRR สี่ยีน (TANJILG_16162) ยีนทั้งหมดเหล่านี้มีโดเมนแบบดั้งเดิมที่จัดเรียงในลำดับอนุรักษ์ นอกเหนือจากยีนโดเมน NBS-LRR แล้ว ยังมีการเปิดใช้งานไคเนส RLL หลายตัวในเวลา 6 ชั่วโมงหลังจากการกระตุ้น ได้แก่ หนึ่งตัวใน Boregine (TanjilG_19877) สองตัวใน Mandelup (TanjilG_07141 และ TanjilG_19877) และในประชากร 22660 (TanjilG_09014 และ TanjilG_10361) และสองตัวใน 83A 27:476
ยีนที่แสดงออกเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในการตอบสนองต่อการฉีด C. lupini (สายพันธุ์ Col-08) จะถูกนำไปวิเคราะห์การเพิ่มความเข้มข้นของ Gene Ontology (GO) (ตารางเสริม S8) คำศัพท์เกี่ยวกับกระบวนการทางชีววิทยาที่ถูกแสดงเกินจริงบ่อยที่สุดคือ “การตอบสนองการป้องกัน GO:0006952” ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุดค่าผสม (เวลา × เส้น) ที่มีความสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูปที่ 2) คำศัพท์เกี่ยวกับกระบวนการทางชีววิทยาที่ถูกแสดงเกินจริงบ่อยที่สุดคือ “การตอบสนองการป้องกัน GO:0006952” ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุดค่าผสม (เวลา × เส้น) ที่มีความสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูปที่ 2) Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2) คำศัพท์เกี่ยวกับกระบวนการทางชีววิทยาที่ถูกแสดงเกินจริงบ่อยที่สุดคือ 'GO:0006952 defense response' ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุดค่าผสม (เวลา × สายพันธุ์) ที่มีความสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูปที่ 2)最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”,它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（จิน2）。 คำศัพท์กระบวนการทางชีววิทยาที่เป็นตัวแทนมากที่สุดคือ “GO:0006952 defense response” ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุดค่าผสม (时间×线) โดยมีความสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูป 2) Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2) คำศัพท์เกี่ยวกับกระบวนการทางชีววิทยาที่ถูกแสดงเกินจริงบ่อยที่สุดคือ 'GO:0006952 Defense Response' ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุดค่าผสม (เวลา × เส้น) ด้วยความสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูปที่ 2)คำศัพท์นี้ถูกแสดงซ้ำในสองช่วงเวลาใน 83A: 476 และ Boregine (6 และ 24 ชั่วโมงหลังจากการติดเชื้อ) และในช่วงเวลาหนึ่งใน Mandelup และประชากร 22660 (12 และ 6 ชั่วโมงหลังจากการติดเชื้อ ตามลำดับ) นี่คือผลลัพธ์ที่คาดหวังไว้ ซึ่งเน้นย้ำถึงการตอบสนองต่อต้านเชื้อราของสายพันธุ์ที่ต้านทาน นอกจากนี้ 83A:476 ตอบสนองต่อ C. lupini โดยกระตุ้นยีนที่เกี่ยวข้องกับการระเบิดออกซิเดชันที่แสดงโดยคำว่า "กระบวนการรีดอกซ์ GO:0055114" อย่างรวดเร็ว ซึ่งบ่งบอกถึงการตอบสนองการป้องกันที่เฉพาะเจาะจง ในขณะที่ Boregine เผยให้เห็นการตอบสนองการป้องกันที่เฉพาะเจาะจง ซึ่งเกี่ยวข้องกับคำว่า 'GO' :0006950 การตอบสนองต่อความเครียด” ประชากร 22660 กระตุ้นการตอบสนองความต้านทานในแนวนอนที่เกี่ยวข้องกับเมแทบอไลต์รอง ซึ่งเน้นย้ำถึงคำศัพท์จำนวนมากเกินไป “GO:0016104 กระบวนการสังเคราะห์ไตรเทอร์ปีน” และ “GO:0006722 กระบวนการเผาผลาญไตรเทอร์ปีน” (ทั้งสองคำอยู่ในชุดยีนเดียวกัน) โดยคำนึงถึงผลลัพธ์ของการวิเคราะห์การเพิ่มความเข้มข้นของคำศัพท์ GO ความเสถียรของปฏิกิริยา Mandelup อยู่ระหว่าง Boregine และประชากร 22660 นอกจากนี้ ปฏิกิริยาเริ่มต้น 83A:476 (6 ชั่วโมงหลังฉีด) และปฏิกิริยาล่าช้า Mandelup และประชากร 22660 รวมถึงคำศัพท์ GO:0015979 'การสังเคราะห์ด้วยแสง' และกระบวนการทางชีววิทยาอื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง
คำศัพท์เกี่ยวกับออนโทโลยีของยีนชีวกระบวนการที่เลือกในคำอธิบายประกอบของยีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกันระหว่างการตอบสนองของทรานสคริปโทมของลูพินใบแคบ (NLL) ที่ได้รับการเพาะพันธุ์ด้วยลูพินแอนแทรกซ์ (สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้จากทุ่งลูพินในเมืองเวียร์เชนิซ ประเทศโปแลนด์ ในปี 1999) นั้นเกินจริงอย่างมาก สายพันธุ์ NLL ที่วิเคราะห์ได้แก่ 83A:476 (ต้านทาน มีอัลลีล Lanr1 แบบโฮโมไซกัส) Boregine (ต้านทาน มีพื้นฐานทางพันธุกรรมไม่ทราบ) Mandelup (ต้านทานปานกลาง มีอัลลีล AnMan แบบโฮโมไซกัส) และประชากร 22660 (อ่อนไหว)
เนื่องจากการศึกษาครั้งนี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อระบุยีนที่มีส่วนทำให้เกิดความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนส จึงได้วิเคราะห์ยีนที่กำหนดให้กับเงื่อนไข GO “GO: 0006952 Defensive responses” และ “GO: 0055114 Redox processes” โดยใช้ค่า cut-offs เนื่องจากค่าเฉลี่ยพื้นฐาน ≥ 30 โดยมีอย่างน้อยหนึ่งบรรทัด × จุดในเวลาที่รวมค่า log2 (การเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัว) ที่มีนัยสำคัญทางสถิติ จำนวนยีนที่ตรงตามเกณฑ์เหล่านี้คือ 65 สำหรับ GO:0006952 และ 524 สำหรับ GO:0055114
83A:476 เผยให้เห็นจุดสูงสุดของ DEG สองจุดที่มีคำอธิบายด้วยคำว่า GO:0006952 จุดแรกอยู่ที่ 6 ยีนต่อนิ้ว (64 ยีน การควบคุมขึ้นและลง) และจุดที่สองอยู่ที่ 24 ยีนต่อนิ้ว (15 ยีน การควบคุมขึ้นเท่านั้น) Boregine ยังแสดงให้เห็นอีกด้วยว่า GO:0006952 มีจุดสูงสุดในช่วงเวลาเดียวกัน แต่มี DEG น้อยกว่า (11 และ 8) และการกระตุ้นที่ต้องการ Mandeloop แสดงจุดสูงสุดสองจุดของ GO:0006952 ที่ 12 และ 48 HPI โดยทั้งสองจุดมี 12 ยีน (จุดแรกมียีนที่กระตุ้น และจุดที่สองมีเฉพาะยีนที่ยับยั้ง) ในขณะที่ประชากร 22660 ที่ 6 HPI (13 ยีน) มีการครอบงำของจุดสูงสุดที่เพิ่มขึ้นมากกว่า ควรสังเกตว่า 96.4% ของ GO:0006952 DEG ในจุดสูงสุดเหล่านี้มีการตอบสนองประเภทเดียวกัน (ขึ้นหรือลง) ซึ่งบ่งชี้ถึงการทับซ้อนกันอย่างมีนัยสำคัญในการตอบสนองการป้องกันแม้จะมีความแตกต่างในจำนวนยีนที่เกี่ยวข้อง กลุ่มลำดับที่ใหญ่ที่สุดที่เกี่ยวข้องกับคำว่า GO:0006952 เข้ารหัส Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (คล้าย SAM22) ซึ่งอยู่ในกลุ่มโปรตีนคลาส 10 pathogenesis-associated protein (PR-10) และโปรตีนแกนกลาง latex (คล้าย MLP) (รูปที่ 3) ทั้งสองกลุ่มแตกต่างกันในลักษณะของการแสดงออกและทิศทางของการตอบสนอง ยีนที่เข้ารหัสโปรตีนคล้าย SAM22 แสดงการเหนี่ยวนำที่สม่ำเสมอและมีนัยสำคัญในช่วงเวลาเริ่มต้น (6 หรือ 12 ชั่วโมงหลังจากการทดลอง) และโดยทั่วไปจะไม่ตอบสนองเมื่อสิ้นสุดการทดลอง (48 ชั่วโมงหลังจากการทดลอง) ในขณะที่โปรตีนคล้าย MLP แสดงการประสานงานที่ 6 ชั่วโมงหลังจากการทดลอง 83A:476 และ Mandelup ที่ 48 hp/in จุดข้อมูลอื่นๆ เกือบทั้งหมดไม่ตอบสนอง นอกจากนี้ ความแตกต่างในโปรไฟล์การแสดงออกของยีนโปรตีนที่คล้าย SAM22 ยังสังเกตพบความแปรปรวนในการต้านทานโรคแอนแทรคโนส เนื่องจากสายพันธุ์ที่ต้านทานได้มากกว่ามีจุดเวลาที่เหนี่ยวนำยีนเหล่านี้ได้อย่างมีนัยสำคัญมากกว่ายีนที่อ่อนไหวกว่า ยีน PR-10 ที่คล้าย LlR18A/B อีกยีนแสดงรูปแบบการแสดงออกที่คล้ายกันมากกับยีนโปรตีนที่คล้าย SAM22
องค์ประกอบหลักของกระบวนการทางชีววิทยาที่เรียกว่า "GO:0006952 Defense Response" และรูปแบบการแสดงออกของยีนที่เป็นผู้สมัครของอัลลีล Lanr1 และ AnMan ได้รับการระบุแล้ว มาตราส่วน Log2 แสดงค่า log2 (การเปลี่ยนแปลงแบบเท่า) ระหว่างพืชที่ได้รับการเพาะเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้จากทุ่งลูพิน วิเซนิกา โปแลนด์ 2542) และพืชควบคุม (ที่ได้รับการเพาะเชื้อแบบหลอก) ในเวลาเดียวกัน สายพันธุ์ลูพินใบแคบต่อไปนี้ได้รับการวิเคราะห์: 83A:476 (ต้านทาน มีอัลลีล Lanr1 ที่เป็นโฮโมไซกัส), Boregine (ต้านทาน ไม่ทราบภูมิหลังทางพันธุกรรม), Mandelup (ต้านทานปานกลาง มีอัลลีล AnMan ที่เป็นโฮโมไซกัส) และประชากร 22,660 (อ่อนไหว)
นอกจากนี้ โปรไฟล์การแสดงออกของยีนตัวเลือก RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) และ AnMan (TanjilG_12861) ได้รับการประเมิน (รูปที่ 3) ยีน TanjilG_05042 แสดงการตอบสนองที่สำคัญ (การเปิดใช้งาน) ที่ 83A:476 เฉพาะในช่วงเวลาแรก (6 ชั่วโมงหลังจากการติดเชื้อ) ในขณะที่ TanjilG_12861 มีนัยสำคัญใน Mandeloop เฉพาะในช่วงเวลาสองช่วงเวลาเท่านั้น: 6 ชั่วโมงหลังจากการติดเชื้อ (การควบคุมระดับลง) และ 24 ชั่วโมงหลังจากการติดเชื้อ (6 ชั่วโมงหลังจากการติดเชื้อ) ด้วย.) ปรับได้)
ยีนที่มีการแสดงออกมากเกินไปมากที่สุดในคำว่า GO:0055114 “กระบวนการรีดอกซ์” คือยีนที่เข้ารหัสโปรตีนไซโตโครม P450 และเปอร์ออกซิเดส (รูปที่ 4) สำหรับตัวอย่างที่แยกได้จาก 83A:476 ที่ 6 HPI ค่า log2 สูงสุดหรือต่ำสุด (การเปลี่ยนแปลงเท่า) (สำหรับ 86.6% ของยีน) มักสังเกตได้ระหว่างพืชที่ได้รับการฉีดวัคซีนและพืชควบคุม ซึ่งเน้นถึงการตอบสนองที่สูงของจีโนไทป์นี้ต่อเพศที่ได้รับการฉีดวัคซีน 83A:476 แสดง DEG ของ GO: 0055114 ที่สำคัญที่สุดที่ 6 hpi (503 ยีน) ในขณะที่สายพันธุ์อื่นๆ ที่ 48 hpi (Boregine 31 ยีน Mandelup 85 ยีน และประชากร 22660 78 ยีน) ในยีนส่วนใหญ่ของตระกูล GO:0055114 สังเกตการตอบสนองสองประเภทต่อการฉีดวัคซีน (การกระตุ้นและการยับยั้ง) ที่น่าสนใจคือ พบว่า DEG สูงถึง 97.6% ที่ระบุสำหรับคำว่า GO: 0055114 ใน Mandelupe ที่ 48 hp ข้อสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าแม้จะมีขนาดเล็กกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (เช่น จำนวนยีนรีดอกซ์ที่กลายพันธุ์ 85 เทียบกับ 503) รูปแบบของการตอบสนองของทรานสคริปโทมที่ล่าช้าของแมนเดอลูปต่อแอนแทรคโนสก็คล้ายกับการตอบสนองในช่วงต้นของ 83A:476 ใน Boregine และ Population 22660 การบรรจบกันนี้ต่ำกว่าที่ 51.6% และ 75.6% ตามลำดับ
รูปแบบการแสดงออกขององค์ประกอบหลักของคำศัพท์ของกระบวนการทางชีวภาพ "GO:0055114 Redox process" ได้รับการเปิดเผยแล้ว มาตราส่วน Log2 แสดงค่า log2 (การเปลี่ยนแปลงแบบเท่า) ระหว่างพืชที่ได้รับการเพาะเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้จากทุ่งลูพิน วิเซนิกา โปแลนด์ 2542) และพืชควบคุม (ที่ได้รับการเพาะเชื้อแบบหลอก) ในเวลาเดียวกัน สายพันธุ์ลูพินใบแคบต่อไปนี้ได้รับการวิเคราะห์: 83A:476 (ต้านทาน มีอัลลีล Lanr1 ที่เป็นโฮโมไซกัส), Boregine (ต้านทาน ไม่ทราบภูมิหลังทางพันธุกรรม), Mandelup (ต้านทานปานกลาง มีอัลลีล AnMan ที่เป็นโฮโมไซกัส) และประชากร 22660 (อ่อนไหว)
83A:476 การตอบสนองของทรานสคริปโตมิกต่อการฉีด C. lupini (สายพันธุ์ Col-08) ยังรวมถึงการทำให้ยีนที่สัมพันธ์กับคำว่า GO:0015979 “การสังเคราะห์แสง” และกระบวนการทางชีววิทยาอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องเงียบลงอย่างประสานกัน (รูปที่ 5) ชุดยีน GO:0015979 DEG นี้ประกอบด้วยยีน 105 ยีนที่ถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญที่ 6 ชั่วโมงหลังจากฉีดที่ 83A:476 ในชุดย่อยนี้ ยีน 37 ยีนยังถูกควบคุมลงที่ Mandelup ที่ 48 ชั่วโมงหลังจากฉีด และ 35 ยีนที่จุดเวลาเดียวกันในประชากร 22,660 ซึ่งรวมถึง DEG 19 ตัวที่พบได้ทั่วไปในทั้งสองจีโนไทป์ ไม่มี DEG ที่เกี่ยวข้องกับคำว่า GO: 0015979 ที่ถูกกระตุ้นอย่างมีนัยสำคัญในการรวมกันใดๆ (สาย x เวลา)
รูปแบบการแสดงออกขององค์ประกอบหลักของคำศัพท์ของกระบวนการทางชีวภาพ "GO:0015979 การสังเคราะห์แสง" ได้รับการเปิดเผย มาตราส่วน Log2 แสดงค่า log2 (การเปลี่ยนแปลงแบบเท่า) ระหว่างพืชที่ได้รับการเพาะเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้จากทุ่งลูพิน วิเซนิกา โปแลนด์ 1999) และพืชควบคุม (ที่ได้รับการเพาะเชื้อแบบหลอก) ในเวลาเดียวกัน สายพันธุ์ลูพินใบแคบต่อไปนี้ได้รับการวิเคราะห์: 83A:476 (ต้านทาน มีอัลลีล Lanr1 ที่เป็นโฮโมไซกัส), Boregine (ต้านทาน ไม่ทราบภูมิหลังทางพันธุกรรม), Mandelup (ต้านทานปานกลาง มีอัลลีล AnMan ที่เป็นโฮโมไซกัส) และประชากร 22660 (อ่อนไหว)
จากผลการวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างกันและสันนิษฐานว่าเกี่ยวข้องกับการตอบสนองการป้องกันเชื้อราที่ทำให้เกิดโรค ยีนชุดนี้มีทั้งหมด 7 ตัว จึงได้รับการคัดเลือกสำหรับการวัดปริมาณโปรไฟล์การแสดงออกโดยใช้ PCR แบบเรียลไทม์ (ตารางเสริม S9)
ยีนโปรตีนที่คาดว่าจะเป็น TanjilG_10657 ถูกเหนี่ยวนำอย่างมีนัยสำคัญในทุกสายพันธุ์และจุดเวลาที่ศึกษาเมื่อเปรียบเทียบกับพืชควบคุม (เลียนแบบ) (ตารางเสริม S10, S11) นอกจากนี้ โปรไฟล์การแสดงออกของ TanjilG_10657 ยังแสดงให้เห็นแนวโน้มที่เพิ่มขึ้นตลอดระยะเวลาการทดลองสำหรับสายพันธุ์ทั้งหมด ประชากร 22660 แสดงให้เห็นความไวสูงสุดของ TanjilG_10657 ต่อการฉีดเชื้อโดยมีการกระตุ้น 114 เท่าและระดับการแสดงออกสัมพันธ์สูงสุด (4.4 ± 0.4) ที่ 24 HPI (รูปที่ 6a) ยีนโปรตีน PR10 LlR18A TanjilG_27015 ยังแสดงการกระตุ้นในทุกสายพันธุ์และจุดเวลา โดยมีความสำคัญทางสถิติที่จุดข้อมูลส่วนใหญ่ (รูปที่ 6b) คล้ายกับ TanjilG_10657 ระดับการแสดงออกสัมพันธ์สูงสุดของ TanjilG_27015 พบในประชากรที่ได้รับการฉีด 22660 ที่ 24 HPI (19.5 ± 2.4) ยีนเอนโดไคติเนสกรด TanjilG_04706 ถูกควบคุมขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในทุกสายและทุกจุดเวลา ยกเว้น Boregine 6 hpi (รูปที่ 6c) มันถูกเหนี่ยวนำอย่างรุนแรงที่จุดเวลาแรก (6 HPI) ที่ 83A:476 (10.5 เท่า) และเพิ่มขึ้นปานกลางในสายอื่น ๆ (6.6-7.5 เท่า) ในระหว่างการทดลอง การแสดงออกของ TanjilG_04706 ยังคงอยู่ในระดับที่คล้ายคลึงกันใน 83A:476 และ Boregine ในขณะที่ใน Mandelup และ Population 22660 มันเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ โดยไปถึงค่าที่ค่อนข้างสูง (5.9 ± 1.5 และ 6.2 ± 1.5 ตามลำดับ) ยีนที่คล้ายเอนโดกลูแคน-1,3-β-กลูโคซิเดส TanjilG_23384 แสดงการทำงานสูงในสองจุดเวลาแรก (6 และ 12 ชั่วโมงหลังจากการติดเชื้อ) ในสายพันธุ์ทั้งหมด ยกเว้นประชากร 22,660 (รูปที่ 6d) ระดับการแสดงออกสัมพันธ์สูงสุดของ TanjilG_23384 พบในจุดเวลาที่สอง (12 ชั่วโมงหลังจากการติดเชื้อ) ใน Mandelup (2.7 ± 0.3) และ 83A:476 (1.5 ± 0.1) ที่ 24 ชั่วโมงหลังจากการติดเชื้อ การแสดงออกของ TanjilG_23384 ค่อนข้างต่ำในสายพันธุ์ที่ศึกษาทั้งหมด (ตั้งแต่ 0.04 ± 0.009 ถึง 0.44 ± 0.12)
โปรไฟล์การแสดงออกของยีนที่เลือก (ag) เปิดเผยโดย PCR เชิงปริมาณ ตัวเลข 6, 12 และ 24 แสดงถึงชั่วโมงหลังการฉีดวัคซีน ยีน LanDExH7 และ LanTUB6 ถูกใช้สำหรับการทำให้เป็นมาตรฐาน และ LanTUB6 ถูกใช้สำหรับการปรับเทียบระหว่างชุด แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานโดยอิงจากการจำลองทางชีววิทยาสามครั้ง ซึ่งแต่ละครั้งเป็นค่าเฉลี่ยของการจำลองทางเทคนิคสามครั้ง ความสำคัญทางสถิติของความแตกต่างในระดับการแสดงออกระหว่างพืชที่ได้รับการเพาะเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้รับในปี 1999 จากทุ่งลูพินในเวียร์เซนิกา ประเทศโปแลนด์) และพืชควบคุม (เพาะเชื้อจำลอง) ถูกทำเครื่องหมายไว้เหนือจุดข้อมูล (*ค่า P < 0.05, **ค่า P ≤ 0.01, ***ค่า P ≤ 0.001) ความสำคัญทางสถิติของความแตกต่างในระดับการแสดงออกระหว่างพืชที่ได้รับการเพาะเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้รับในปี 1999 จากทุ่งลูพินในเวียร์เซนิกา ประเทศโปแลนด์) และพืชควบคุม (เพาะเชื้อจำลอง) ถูกทำเครื่องหมายไว้เหนือจุดข้อมูล (*ค่า P < 0.05, **ค่า P ≤ 0.01, ***ค่า P ≤ 0.001) Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, шtaмм Col-08, получен в 1999) г. с поля люпина в Верженице, POльша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001) ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติในระดับการแสดงออกระหว่างพืชที่ได้รับการเพาะเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้รับในปี 1999 จากทุ่งลูพินใน Wierzhenice ประเทศโปแลนด์) และพืชควบคุม (ที่ได้รับการเพาะเชื้อแบบหลอก) ถูกบันทึกไว้เหนือจุดข้อมูล (*ค่า P < 0.05, **ค่า P ≤ 0.01, ***ค่า P ≤ 0.001)接种(คอลเลโตตริชุม lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆unda获得（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 0.001)接种 （colletotrichum lupini , color-08 株 , 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对ภาพถ่าย （接种 植物 之间 水平差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, POльша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001) ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติในระดับการแสดงออกระหว่างพืชที่ได้รับการเพาะเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้จากทุ่งลูพินใน Verzhenice ประเทศโปแลนด์ ในปี 1999) และพืชควบคุม (ที่ได้รับการเพาะเชื้อแบบหลอก) ถูกบันทึกไว้เหนือจุดข้อมูล (*ค่า P < 0.05, **ค่า P ≤ 0.01, ***ค่า P ≤ 0.001)สายพันธุ์ NLL ที่วิเคราะห์ได้แก่ 83A:476 (ต้านทาน มีอัลลีล Lanr1 ที่เป็นโฮโมไซกัส), Mandelup (ต้านทานปานกลาง มีอัลลีล AnMan ที่เป็นโฮโมไซกัส), Boregine (ต้านทาน ไม่ทราบพื้นฐานทางพันธุกรรม) และจำนวนประชากร 22,660 (อ่อนไหว)
ยีนที่เป็นตัวเลือก TanjilG_05042 ที่ตำแหน่ง Lanr1 แสดงรูปแบบการแสดงออกที่แตกต่างอย่างเห็นได้ชัดจากโปรไฟล์ที่ได้จากการศึกษา RNA-seq (รูปที่ 6e) พบว่ามีการเปิดใช้งานยีนนี้อย่างมีนัยสำคัญใน Mandelup และประชากร 22660 (มากถึง 39.7 และ 11.7 เท่าตามลำดับ) ส่งผลให้ระดับการแสดงออกค่อนข้างสูง (มากถึง 1.4 ± 0.14 และ 7.2 ± 1.3 ตามลำดับ) 83A:476 ยังเผยให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นของยีน TanjilG_05042 บางส่วน (มากถึง 3.8 เท่า) อย่างไรก็ตาม ระดับการแสดงออกที่สัมพันธ์กันที่ทำได้ (0.044 ± 0.002) ต่ำกว่าระดับที่สังเกตได้ใน Mandelup และประชากร 22660 มากกว่า 30 เท่า เมื่อวิเคราะห์โดย qPCR แสดงให้เห็นความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในระดับการแสดงออกระหว่างจีโนไทป์ในตัวแปรที่ได้รับวัคซีนจำลอง (ควบคุม) โดยมีความแตกต่าง 58 เท่าระหว่างประชากร 22660 กับ 83A:476 เช่นเดียวกับระหว่างประชากร 22660 กับ 22660 มีความแตกต่างสองเท่าระหว่าง Boregine กับ Mandalup
ยีนที่เป็นตัวเลือกในตำแหน่ง AnMan คือ TanjilG_12861 ซึ่งได้รับการกระตุ้นเพื่อตอบสนองต่อการฉีดวัคซีนในตำแหน่ง 83A:476 และ Mandelup เป็นกลางในประชากร 22660 และถูกควบคุมให้ลดลงใน Boregine (รูปที่ 6f) การแสดงออกสัมพันธ์ของยีน TanjilG_12861 สูงที่สุดใน 83A:476 ที่ได้รับการฉีดวัคซีน (0.14±0.01) ยีนโปรตีน HSP17.4 คลาส I ที่เกิดภาวะช็อกจากความร้อน ขนาด 17.4 kDa TanjilG_05080 แสดงระดับการแสดงออกสัมพันธ์ที่ต่ำกว่าในทุกสายพันธุ์และจุดเวลาที่ศึกษา (รูปที่ 6g) พบค่าสูงสุดที่ 24 HPI ในประชากร 22660 (0.14 ± 0.02 เพิ่มขึ้นแปดเท่าในการตอบสนองต่อการฉีดวัคซีน)
การเปรียบเทียบโปรไฟล์การแสดงออกของยีน (รูปที่ 7) เผยให้เห็นความสัมพันธ์สูงระหว่าง TanjilG_10657 และยีนอื่นอีกสี่ยีน ได้แก่ TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) และ TanjilG_04706 (r = 0.79) ผลลัพธ์ดังกล่าวอาจบ่งชี้ถึงการควบคุมร่วมกันของยีนเหล่านี้ในระหว่างการตอบสนองต่อการป้องกัน ยีน TanjilG_12861 และ TanjilG_23384 แสดงโปรไฟล์การแสดงออกที่แตกต่างกันโดยมีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เพียร์สันต่ำกว่า (จาก 0.08 ถึง 0.43 และ -0.19 ถึง 0.28 ตามลำดับ) เมื่อเปรียบเทียบกับยีนอื่น
ความสัมพันธ์ระหว่างโปรไฟล์การแสดงออกของยีนถูกตรวจพบโดยใช้ PCR เชิงปริมาณ สายพันธุ์ลูพินใบแคบต่อไปนี้ถูกวิเคราะห์: 83A:476 (ต้านทาน มีอัลลีล Lanr1 ที่เป็นโฮโมไซกัส), Mandelup (ต้านทานปานกลาง มีอัลลีล AnMan ที่เป็นโฮโมไซกัส), Boregine (ต้านทาน ไม่ทราบภูมิหลังทางพันธุกรรม) และประชากร 22660 (อ่อนไหว) มีการคำนวณจุดเวลาสามจุด (6, 12 และ 24 ชั่วโมงหลังการเพาะเชื้อ) รวมถึงพืชที่ได้รับการเพาะเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้จากทุ่งลูพินในเวียร์เชนิเซ ประเทศโปแลนด์ ในปี 1999) และพืชควบคุม (ที่ได้รับการเพาะเชื้อแบบหลอก) มาตราส่วนแสดงค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เพียร์สัน
จากข้อมูลที่ได้รับที่ 6 แรงม้าต่อนิ้ว WGCNA ดำเนินการกับ 9981 DEG ที่ระบุโดยการเปรียบเทียบพืชที่ได้รับการเพาะเชื้อและพืชควบคุมเพื่อเน้นที่การตอบสนองการป้องกันในระยะเริ่มต้น (ตารางเสริม S12) พบโมดูลยีน 22 โมดูล (คลัสเตอร์) ที่มีโปรไฟล์การแสดงออกที่สัมพันธ์กัน (เชิงบวกหรือเชิงลบ) ระหว่างจีโนไทป์และตัวแปรทดลอง โดยเฉลี่ยแล้ว ระดับการแสดงออกของยีนลดลงตามลำดับ 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองรูปแบบ แนวโน้มนี้มีความแข็งแกร่งกว่าในพืชควบคุม) โดยเฉลี่ยแล้ว ระดับการแสดงออกของยีนลดลงตามลำดับ 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองรูปแบบ แนวโน้มนี้มีความแข็งแกร่งกว่าในพืชควบคุม) В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). โดยเฉลี่ยแล้ว ระดับการแสดงออกของยีนลดลงในลำดับ 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองรูปแบบ แนวโน้มนี้มีความแข็งแกร่งกว่าในพืชควบคุม)平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对Photo植物中更强）。平均 而 言 , 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine>ประชากร 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在 植物 中。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). โดยเฉลี่ยแล้ว ระดับการแสดงออกของยีนลดลงในซีรีส์ 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองตัวแปร แนวโน้มนี้มีความแข็งแกร่งกว่าในพืชควบคุม)การฉีดวัคซีนส่งผลให้การแสดงออกของยีนเพิ่มขึ้น โดยเฉพาะในโมดูล 18, 19, 14, 6 และ 1 (ตามลำดับผลกระทบจากน้อยไปมาก) การควบคุมเชิงลบ (เช่น โมดูล 9 และ 20) หรือผลกระทบที่เป็นกลาง (เช่น โมดูล 11, 22, 8 และ 13) การวิเคราะห์การเพิ่มความเข้มข้นของเทอม GO (ตารางเสริม S13) เผยให้เห็น "GO: 0006952 การตอบสนองการป้องกัน" สำหรับโมดูลที่ได้รับการฉีดวัคซีน (18) ที่มีการกระตุ้นสูงสุด รวมถึงยีนที่วิเคราะห์โดย qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 และ TanjilG_27015) เช่นเดียวกับโมดูลการสังเคราะห์แสงที่ถูกยับยั้งมากที่สุดของ Inoculate หลายโมดูล (9) ยีนที่เป็นตัวรวมโมดูล 18 (รูปที่ 8) ถูกระบุว่าเป็นยีน TanjilG_26536 ที่เข้ารหัสโปรตีน LlR18B ที่คล้าย PR-10 และยีนที่เป็นตัวรวมโมดูล 9 ถูกระบุว่าเป็นยีน TanjilG_28955 ที่เข้ารหัสโปรตีน PsbQ ของโฟโตซิสเต็ม II ยีนที่ต้านทานโรคแอนแทรคโนส Lanr1 ผู้สมัครคือ TanjilG_05042 ซึ่งพบในโมดูล 22 (รูปที่ 9) และเกี่ยวข้องกับเงื่อนไข "GO:0044260 กระบวนการเผาผลาญโมเลกุลขนาดใหญ่ของเซลล์" และ "GO:0006355 การควบคุมการถอดรหัส การสร้างเทมเพลต DNA" ที่มีฮับ TanjilG_01212 ยีนนี้เข้ารหัสปัจจัยการถอดรหัสจากความเครียดจากความร้อน A-4a (HSFA4a)
การวิเคราะห์เครือข่ายถ่วงน้ำหนักของการแสดงออกร่วมกันของยีนของโมดูลที่มีเงื่อนไขกระบวนการทางชีววิทยาที่แสดงเกินจริง "GO: 0006952 การตอบสนองการป้องกัน" การผูกมัดได้รับการทำให้เรียบง่ายขึ้นเพื่อเน้นยีนทั้งสี่ที่วิเคราะห์โดย qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 และ TanjilG_27015)
การวิเคราะห์เครือข่ายถ่วงน้ำหนักของการแสดงออกร่วมกันของยีนของโมดูลที่มีเงื่อนไขทางชีววิทยาที่แสดงเกินจริง "GO: 0006355: การควบคุมการถอดรหัส การสร้างเทมเพลต DNA" และการนำยีนต้านทานโรคแอนแทรคโนส Lanr1 TanjilG_05042 มาใช้ การเชื่อมโยงได้รับการทำให้เรียบง่ายขึ้นเพื่อแยกยีน TanjilG_05042 และยีน TanjilG_01212 ที่อยู่ตรงกลาง
การคัดกรองความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสที่รวบรวมในออสเตรเลียแสดงให้เห็นว่าพันธุ์ที่ปล่อยพันธุ์เร็วส่วนใหญ่อ่อนไหวต่อโรคนี้ Kalya, Coromup และ Mandelup ได้รับการระบุว่าต้านทานปานกลาง ในขณะที่ Wonga, Tanjil และ 83A:476 ได้รับการระบุว่าต้านทานสูง26,27,31 มีอัลลีลความต้านทานเดียวกัน กำหนดเป็น Lanr1 และ Coromup และ Mandelup มีอัลลีลที่แตกต่างกัน กำหนดเป็น AnMan10, 26, 39 ในขณะที่ Kalya ถ่ายทอดอัลลีลที่แตกต่างกัน , Lanr2 การคัดกรองความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสในเยอรมนีส่งผลให้ระบุสายพันธุ์ที่ต้านทาน Bo7212 ได้โดยมีอัลลีลตัวเลือกอื่นที่ไม่ใช่ Lanr1 กำหนดเป็น LanrBo36
การศึกษาของเราเผยให้เห็นความถี่ที่ต่ำมาก (ประมาณ 6%) ของอัลลีล Lanr1 ในพลาสมาเชื้อพันธุ์ที่ทดสอบ การสังเกตนี้สอดคล้องกับผลการคัดกรองพลาสมาเชื้อพันธุ์ยุโรปตะวันออกโดยใช้เครื่องหมาย Anseq3 และ Anseq4 ซึ่งแสดงให้เห็นว่าอัลลีล Lanr1 มีอยู่ในสายพันธุ์เบลารุสเพียงสองสายพันธุ์เท่านั้น ซึ่งแสดงให้เห็นว่าอัลลีล Lanr1 ยังไม่ได้ถูกใช้กันอย่างแพร่หลายในโครงการปรับปรุงพันธุ์ในท้องถิ่น ซึ่งแตกต่างจากในออสเตรเลีย ซึ่งเป็นหนึ่งในอัลลีลสำคัญสำหรับการปรับปรุงพันธุ์โดยใช้เครื่องหมาย ซึ่งอาจเป็นเพราะระดับความต้านทานที่ต่ำกว่าของอัลลีล Lanr1 ในสภาพทุ่งของยุโรปเมื่อเทียบกับรายงานของออสเตรเลีย นอกจากนี้ การศึกษาโรคแอนแทรคโนสในพื้นที่ที่มีฝนตกชุกในออสเตรเลียยังแสดงให้เห็นว่าการตอบสนองต่อความต้านทานที่เกิดจากอัลลีล Lanr1 อาจไม่มีประสิทธิผลในสภาพอากาศที่เอื้อต่อการเจริญเติบโตและการพัฒนาอย่างรวดเร็วของเชื้อก่อโรค19,42 ในความเป็นจริง ในการศึกษาปัจจุบันยังพบอาการบางอย่างของแอนแทรคโนสในจีโนไทป์ที่มีอัลลีล Lanr1 ซึ่งบ่งชี้ว่าความต้านทานอาจหายไปภายใต้เงื่อนไขที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการพัฒนาของ C. lupini นอกจากนี้ การตีความผลบวกปลอมของการมีอยู่ของเครื่องหมาย Anseq3 และ Anseq4 ซึ่งอยู่ห่างจากตำแหน่ง Lanr1 ประมาณ 1 cM เป็นไปได้ 28,30,43
การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่า 83A:476 ซึ่งมีอัลลีล Lanr1 ตอบสนองต่อการฉีดวัคซีน C. lupini ด้วยการรีโปรแกรมทรานสคริปโตมขนาดใหญ่ในช่วงเวลาที่วิเคราะห์ครั้งแรก (6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) ในขณะที่ใน Mandelup ซึ่งมีอัลลีล AnMan พบว่าการตอบสนองของทรานสคริปโตมเกิดขึ้นในเวลาต่อมามาก (จาก 24 เป็น 48 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) การเปลี่ยนแปลงตามเวลาเหล่านี้ในการตอบสนองการป้องกันเกี่ยวข้องกับความแตกต่างของอาการของโรค ซึ่งเน้นย้ำถึงความสำคัญของการจดจำเชื้อก่อโรคในระยะเริ่มต้นเพื่อตอบสนองต่อความต้านทานที่ประสบความสำเร็จ เพื่อติดเชื้อในเนื้อเยื่อพืช สปอร์ของเชื้อแอนแทรกซ์ต้องผ่านระยะการพัฒนาหลายระยะบนพื้นผิวของโฮสต์ รวมถึงการงอก การแบ่งเซลล์ และการสร้างแอปเพรสโซเรียม แอปเพรสโซเรียมเป็นโครงสร้างติดเชื้อที่เกาะติดกับพื้นผิวของโฮสต์และช่วยให้แทรกซึมเข้าไปในเนื้อเยื่อของโฮสต์ได้ ดังนั้น สปอร์ของ C. gloeosporioides ในสารสกัดถั่วจะแสดงการแบ่งตัวครั้งแรกของนิวเคลียสหลังจากฟักเป็นเวลา 75-90 นาที การสร้างท่อเชื้อโรคหลังจาก 90-120 นาที และการยับยั้งหลังจาก 4 ชั่วโมง 45 วินาที มะม่วง C. gloeosporioides แสดงการงอกของสปอร์มากกว่า 40% หลังจากฟักเป็นเวลา 3 ชั่วโมง และการสร้างแอปเพรสเซอร์ประมาณ 20% หลังจาก 4 ชั่วโมง ยีน CAP20 ที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงของเชื้อของ C. gloeosporioides แสดงกิจกรรมการถอดรหัสในสปอร์ที่สร้างพืชอาศัยหลังจากฟักเป็นเวลา 3.5 ชั่วโมงในขี้ผึ้งผิวอะโวคาโดที่มีโปรตีน CAP20 ความเข้มข้นสูงหลังจาก 4 ชั่วโมง 46 นาที ในทำนองเดียวกัน กิจกรรมของยีนการสังเคราะห์เมลานินใน C. trifolii ถูกเหนี่ยวนำระหว่างการฟักเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ตามด้วยการสร้างแอปเพรสเซอร์หลังจาก 1 ชั่วโมง การศึกษาเนื้อเยื่อใบแสดงให้เห็นว่าสตรอเบอร์รี่ที่ฉีด C. acutatum จะมีการกดภูมิคุ้มกันครั้งแรกที่ 8 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ ในขณะที่มะเขือเทศที่ฉีด C. coccode จะมีการกดภูมิคุ้มกันครั้งแรกที่ 4 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ48,49 ส่วนใหญ่สอดคล้องกับช่วงเวลาของกระบวนการติดเชื้อของ Colletotrichum spp. การตอบสนองการป้องกันอย่างรวดเร็วต่อ 83A:476 ชี้ให้เห็นถึงการมีส่วนร่วมของยีนต้านทานพืชและภูมิคุ้มกันที่กระตุ้นโดยเอฟเฟกเตอร์ (ETI) ในสายพันธุ์นี้ ในขณะที่การตอบสนองที่ล่าช้าของ Mandelup สนับสนุนสมมติฐานภูมิคุ้มกันที่กระตุ้นโดยรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับจุลภาค (MTI) 50 การตอบสนองในระยะเริ่มต้นต่อ 83A:476 และ Mandelup การทับซ้อนบางส่วนระหว่างยีนที่ควบคุมขึ้นหรือลงในการตอบสนองที่ล่าช้ายังสนับสนุนแนวคิดนี้ด้วย เนื่องจาก ETI มักถือว่าเป็นการตอบสนอง MTI ที่เร่งขึ้นและเพิ่มขึ้นซึ่งสิ้นสุดลงด้วยการตายของเซลล์ตามโปรแกรมที่บริเวณที่ติดเชื้อ ซึ่งเรียกว่าอาการช็อกจากภูมิแพ้ 51,52
ยีนส่วนใหญ่ที่มาจากคำว่า Gene Ontology GO:0006952 “Defense Response” ที่มีการแสดงซ้ำมากเกินไปนั้นประกอบด้วยโฮโมล็อก 11 ตัวของโปรตีนที่ส่งข้อความอดอาหารที่เกิดจากความเครียด 22 (คล้ายกับ SAM22) และโปรตีนที่คล้ายลาเท็กซ์ (MLP) หลัก 7 ตัว ได้แก่ โปรตีนที่คล้าย SAM22 31, 34, 43 และ 423 ซึ่งมีความคล้ายคลึงกันของลำดับ ยีนที่คล้าย SAM22 แสดงให้เห็นการกระตุ้นอย่างมีนัยสำคัญซึ่งกินเวลานานกว่า โดยแสดงให้เห็นถึงระดับความต้านทานโรคแอนแทรคโนสที่เพิ่มขึ้น (83A:476 และ Boregine) อย่างไรก็ตาม ยีนที่คล้าย MLP ถูกควบคุมระดับลงเฉพาะในสายพันธุ์ที่มีอัลลีลที่ต้านทานได้ (83A:476/Lanr1 ที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ และ Mandelup/AnMan ที่ 24 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) ควรสังเกตว่าโฮโมล็อกที่คล้าย SAM22 ที่ระบุทั้งหมดมีต้นกำเนิดมาจากคลัสเตอร์ยีนที่มีขนาดประมาณ 105 กิโลเบส ในขณะที่ยีนที่คล้าย MLP มีต้นกำเนิดมาจากบริเวณแยกกันของจีโนม การศึกษาครั้งก่อนของเราเกี่ยวกับความต้านทานต่อการฉีด Diaporthetoxica ของ NLL ยังพบการกระตุ้นยีนที่คล้าย SAM22 ร่วมกัน ซึ่งแสดงให้เห็นว่ายีนเหล่านี้มีส่วนเกี่ยวข้องกับองค์ประกอบแนวนอนของการตอบสนองการป้องกัน ข้อสรุปนี้ยังได้รับการสนับสนุนจากรายงานการตอบสนองเชิงบวกของยีนที่คล้าย SAM22 ต่อการบาดเจ็บหรือการรักษาด้วยกรดซาลิไซลิก สารกระตุ้นเชื้อรา หรือไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์
ยีนที่คล้าย MLP ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าตอบสนองต่อความเครียดจากปัจจัยภายนอกและภายในต่างๆ รวมทั้งการติดเชื้อแบคทีเรีย ไวรัส และเชื้อราที่ก่อโรคในพืชหลายชนิด55 ทิศทางการตอบสนองต่อปฏิสัมพันธ์บางอย่างระหว่างพืชและเชื้อโรคมีตั้งแต่เพิ่มขึ้นอย่างมาก (เช่น ระหว่างการระบาดของ Verticillium dahliae ในฝ้าย) ไปจนถึงลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (เช่น หลังจากการติดเชื้อ Alternaria spp. ในต้นแอปเปิล)56,57 มีการสังเกตการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของยีน 423 ที่คล้าย MLP ระหว่างการป้องกันของอะโวคาโดต่อการติดเชื้อ F. niger และระหว่างการติดเชื้อของต้นแอปเปิล Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola และ Alternaria alternata เป็นพาหะของแอปเปิล58,59 นอกจากนี้ แคลลัสแอปเปิลที่มีการแสดงออกของยีน 423 ที่คล้าย MLP มากเกินไปจะมีการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับความต้านทานน้อยลง และมีความอ่อนไหวต่อการติดเชื้อรามากกว่า59 จากเชื้อรา Fusarium oxysporum f พบว่ายีน MLP-like 423 ถูกยับยั้งในเชื้อพันธุ์ถั่วทั่วไปที่ต้านทานโรคได้ด้วย cn การติดเชื้อถั่ว 60
สมาชิกอื่นๆ ของตระกูล PR-10 ที่ระบุในการศึกษา RNA-seq ของเรา ได้แก่ ยีน LlR18A และ LlR18B ในการตอบสนองต่อการควบคุมระดับขึ้น รวมถึงยีนควบคุมระดับขึ้น (1 ยีน) หรือควบคุมระดับลง (3 ยีน) สำหรับโปรตีนถ่ายโอนไขมัน DIR1 นอกจากนี้ WGCNA ยังเน้นย้ำถึงยีน LlR18B ในฐานะศูนย์กลางในโมดูลนี้ ซึ่งมีความอ่อนไหวสูงต่อการฉีดวัคซีนและมียีนตอบสนองการป้องกันหลายตัว ยีน LlR18A และ LlR18B ถูกเหนี่ยวนำในใบลูพินสีเหลืองเพื่อตอบสนองต่อแบคทีเรียก่อโรค เช่นเดียวกับในลำต้น NLL หลังจากการฉีดวัคซีน D. toxica ในขณะที่ยีนโฮโมล็อกของข้าวเหล่านี้ RSOsPR10 ถูกเหนี่ยวนำอย่างรวดเร็วโดยการติดเชื้อราที่คาดว่าเกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณของกรดจัสมอนิก53,61,62 ยีน DIR1 เข้ารหัสโปรตีนขนส่งไขมันที่ไม่จำเพาะซึ่งจำเป็นสำหรับการเริ่มต้นของความต้านทานที่ได้มาอย่างเป็นระบบ (SAR) ด้วยการพัฒนาของปฏิกิริยาป้องกัน โปรตีน DIR1 จะถูกขนส่งจากจุดโฟกัสของการติดเชื้อผ่านท่ออาหารเพื่อเหนี่ยวนำ SAR ในอวัยวะที่อยู่ห่างไกล ที่น่าสนใจคือยีน DIR1 TanjilG_02313 ถูกเหนี่ยวนำอย่างมีนัยสำคัญที่จุดเวลาแรกในสายพันธุ์ 84A:476 และประชากร 22660 แต่ความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสพัฒนาได้สำเร็จในสายพันธุ์ 84A:476 เท่านั้น สิ่งนี้อาจบ่งชี้ถึงการทำงานย่อยของยีน DIR1 ใน NLL เนื่องจากโฮโมล็อกที่เหลืออีกสามตัวตอบสนองต่อการฉีดเข้าเซลล์ในสายพันธุ์ 83A:476 เท่านั้นที่ 6 ชั่วโมงหลังจากฉีด และการตอบสนองนี้มุ่งไปทางด้านล่าง
ในการศึกษาของเรา ส่วนประกอบที่พบมากที่สุดที่สอดคล้องกับกระบวนการทางชีวภาพที่เรียกว่า "กระบวนการ GO:0055114 Redox" ได้แก่ โปรตีนไซโตโครม P450, เปอร์ออกซิเดส, กรดไลโนเลอิก 9S-/13S-ไลโปออกซิเจเนส และ 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase นอกจากนี้ WGCNA ของเรายังกำหนดให้โฮโมล็อก HSFA4a เป็นโมดูลฮับที่พกพา เช่น ยีนที่เป็นผู้สมัครของ Lanr1 ที่มีความต้านทาน TanjilG_05042 HSFA4a เป็นส่วนประกอบของการควบคุมการถอดรหัสนิวเคลียสที่ขึ้นอยู่กับรีดอกซ์ในพืช
โปรตีนไซโตโครม P450 เป็นออกซิโดเรดักเตสที่เร่งปฏิกิริยาไฮดรอกซิเลชันที่ขึ้นอยู่กับ NADPH และ/หรือ O2 ในเมแทบอลิซึมขั้นต้นและขั้นที่สอง รวมถึงเมแทบอลิซึมของซีนไบโอติกส์ ตลอดจนฮอร์โมน กรดไขมัน สเตอรอล ส่วนประกอบของผนังเซลล์ ไบโอโพลีเมอร์ และการสังเคราะห์สารป้องกันทางชีวภาพ 69 ในการศึกษาของเรา ความแปรปรวนในการทำงานของไซโตโครม P450 ในพืชลดลงจาก -10.6 log2 (การเปลี่ยนแปลงแบบเท่า) เป็น 5.7 เนื่องมาจากโฮโมล็อกที่เปลี่ยนแปลงจำนวนมาก (37) และความแตกต่างในรูปแบบการตอบสนองระหว่างยีนเฉพาะ ซึ่งสะท้อนถึงการแก้ไขแบบเพิ่มขึ้น การใช้เฉพาะข้อมูล RNA-seq เพื่ออธิบายหน้าที่ทางชีววิทยาที่คาดว่าจะเกิดขึ้นของยีน NLL ในโปรตีนกลุ่มใหญ่เช่นนี้ถือเป็นการคาดเดาที่สูงมาก อย่างไรก็ตาม เป็นที่น่าสังเกตว่ายีนไซโตโครม P450 บางตัวมีความเกี่ยวข้องกับความต้านทานต่อเชื้อราหรือแบคทีเรียที่ก่อโรคเพิ่มขึ้น รวมถึงการมีส่วนทำให้เกิดปฏิกิริยาภูมิแพ้69,70,71
เอนไซม์เปอร์ออกซิเดสคลาส III เป็นเอนไซม์พืชที่มีหน้าที่หลากหลายซึ่งเกี่ยวข้องกับกระบวนการเผาผลาญต่างๆ มากมายในระหว่างการเจริญเติบโตและการพัฒนาของพืช รวมถึงการตอบสนองต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อม เช่น ความเค็ม ภัยแล้ง ความเข้มแสงสูง และการโจมตีของเชื้อโรค72 เอนไซม์เปอร์ออกซิเดสเกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาระหว่างพืชหลายชนิดกับโรคแอนทราซิส รวมถึง Stylosanthes humilis และ C. gloeosporioides, Lens culinaris และ C. truncatum, Phaseolus vulgaris และ C. lindemuthianum, Cucumis sativus และ C. lagenarium73,74,75,76 การตอบสนองเกิดขึ้นอย่างรวดเร็ว บางครั้งถึง 4 HPI ก่อนที่เชื้อราจะแทรกซึมเข้าไปในเนื้อเยื่อของพืช73 ยีนเปอร์ออกซิเดสยังตอบสนองต่อการฉีดวัคซีน NLL ของ D. toxica อีกด้วย นอกเหนือจากหน้าที่ทั่วไปในการควบคุมการแตกตัวของออกซิเดชันหรือขจัดความเครียดออกซิเดชันแล้ว เปอร์ออกซิเดสยังสามารถรบกวนการเติบโตของเชื้อโรคได้ด้วยการสร้างกำแพงทางกายภาพตามการเสริมความแข็งแรงของผนังเซลล์ระหว่างกระบวนการลิกนิน การแบ่งย่อยหน่วยย่อย หรือการเชื่อมโยงขวางของสารประกอบเฉพาะ หน้าที่นี้สามารถระบุได้ในซิลิโคจากยีน TanjilG_03329 ที่เข้ารหัสเปอร์ออกซิเดสแอนไอออนที่สร้างลิกนินซึ่งคาดว่าจะมีการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการศึกษาของเราในสายพันธุ์ที่ต้านทาน 83A:476 ที่ 6 HPI แต่ไม่พบในสายพันธุ์และจุดเวลาอื่นที่ไม่ตอบสนอง
9S-/13S-lipoxygenase ของกรดลิโนเลอิกเป็นขั้นตอนแรกในเส้นทางออกซิเดชันของการสังเคราะห์ไขมัน78 ผลิตภัณฑ์ของเส้นทางนี้มีหน้าที่หลายอย่างในการป้องกันพืช รวมทั้งการเสริมความแข็งแรงของผนังเซลล์ผ่านการก่อตัวของแคลโลสและเพกติน และการควบคุมความเครียดออกซิเดชันผ่านการผลิตออกซิเจนชนิดรีแอคทีฟ79,80,81,82,83 ในการศึกษานี้ การแสดงออกของกรดลิโนเลอิก 9S-/13S-lipoxygenase ถูกเปลี่ยนแปลงในสายพันธุ์ทั้งหมด แต่ในประชากรที่อ่อนไหว 22660 การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นเกิดขึ้นในช่วงเวลาที่แตกต่างกัน ในขณะที่ในสายพันธุ์ที่มี Lanr1 ที่ต้านทานและอัลลีล AnMan การแสดงออกดังกล่าวจะเน้นที่การกระจายตัวของชั้นออกซิลิปินในปฏิกิริยาแอนแทรกซ์ที่ป้องกันระหว่างจีโนไทป์เหล่านี้
โฮโมล็อก 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) ถูกควบคุมให้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (9 ยีน) หรือลดลง (2 ยีน) เมื่อได้รับการฉีดลูพิน โดยมีข้อยกเว้นสองประการ การตอบสนองทั้งหมดนี้เกิดขึ้นที่ 6 แรงม้า ที่ 83A:476 ปฏิกิริยาทางเอนไซม์ที่เกิดจากโปรตีน ACO เป็นขั้นตอนที่จำกัดอัตราในการผลิตเอทิลีน จึงได้รับการควบคุมอย่างมาก84 เอทิลีนเป็นฮอร์โมนพืชที่มีบทบาทหลากหลายในการควบคุมการพัฒนาของพืชและการตอบสนองต่อสภาวะเครียดจากปัจจัยภายนอกและปัจจัยภายใน การเหนี่ยวนำการถอดรหัส ACO และการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณเอทิลีนเกี่ยวข้องกับการเพิ่มความต้านทานของข้าวต่อเชื้อราเฮมิไบโอโทรฟิก oryzae oryzae โดยการควบคุมการผลิตอนุมูลออกซิเจนที่มีปฏิกิริยาและไฟโตอเล็กซิน กระบวนการติดเชื้อที่ใบที่คล้ายกันมากที่พบระหว่าง M. oryzae และ C. lupini88,89 เมื่อเทียบกับการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของโฮโมล็อก ACO ในสายพันธุ์ 83A:476 ที่รายงานในการศึกษานี้ ทำให้ความเป็นไปได้ในการมอบความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนส NLL เอทิลีนซึ่งเป็นขั้นตอนสำคัญในการส่งสัญญาณในเส้นทางโมเลกุลเปลี่ยนไป
ในการศึกษาปัจจุบัน พบว่ามีการยับยั้งยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสงจำนวนมากในเวลา 6 ชั่วโมงหลังจากปลูกใน 83A:476 และในเวลา 48 ชั่วโมงหลังจากปลูกใน Mandeloop และประชากร 22660 ในระดับใหญ่ ขอบเขตและความก้าวหน้าของการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ขึ้นอยู่กับระดับ พบว่ามีการต้านทานโรคแอนแทรคโนสในการทดลองนี้ เมื่อไม่นานมานี้ มีรายงานการยับยั้งการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสงอย่างรวดเร็วและรวดเร็วในแบบจำลองหลายแบบของปฏิสัมพันธ์ระหว่างพืชกับเชื้อก่อโรค รวมถึงแบคทีเรียและเชื้อราที่ก่อโรค การเร่งรีบ (จาก 2 ชั่วโมงหลังจากปลูกในบางปฏิสัมพันธ์) และการยับยั้งยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสงโดยรวมเพื่อตอบสนองต่อการติดเชื้อสามารถกระตุ้นภูมิคุ้มกันของพืชได้ โดยอาศัยการใช้ออกซิเจนที่มีปฏิกิริยาและปฏิสัมพันธ์กับกรดซาลิไซลิกเพื่อควบคุมปฏิกิริยาภูมิแพ้ 90,94
โดยสรุป กลไกการตอบสนองการป้องกันที่เสนอสำหรับสายพันธุ์ที่ต้านทานมากที่สุด (83A:476) ได้แก่ การจดจำเชื้อก่อโรคอย่างรวดเร็วโดยยีน R (สันนิษฐานว่าเป็น TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) และการส่งสัญญาณกรดซาลิไซลิกและเอทิลีนที่ตอบสนองต่อการแพ้ ตามด้วยการสร้าง SAR ระยะไกล การกระทำได้รับการสนับสนุนจากโปรตีน DIR-1 ควรสังเกตว่าระยะเวลาการเจริญเติบโตทางชีวภาพสำหรับการติดเชื้อ C. lupini นั้นสั้นมาก (ประมาณ 2 วัน) ตามด้วยการเจริญเติบโตแบบเน่าเปื่อย95 การเปลี่ยนผ่านระหว่างระยะเหล่านี้อาจเกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์และการแสดงออกของโปรตีนที่เหนี่ยวนำได้ด้วยเอทิลีนซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวกระตุ้นให้เกิดปฏิกิริยาไวเกินในพืชโฮสต์ ดังนั้น ช่วงเวลาสำหรับการจับ C. lupini ได้สำเร็จในระยะการเจริญเติบโตทางชีวภาพจึงแคบมาก การรีโปรแกรมยีนที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยารีดอกซ์และการสังเคราะห์แสงที่สังเกตได้ใน 83A:476 ที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อสอดคล้องกับความก้าวหน้าของเส้นใยราและบ่งบอกถึงการพัฒนาของการตอบสนองการป้องกันที่ประสบความสำเร็จในระยะไบโอโทรฟิก การตอบสนองของทรานสคริปโตมิกของ Mandelup และประชากร 22660 อาจล่าช้าเกินไปที่จะจับเชื้อราได้ก่อนที่จะเปลี่ยนไปเป็นการเจริญเติบโตแบบเนโครซิส อย่างไรก็ตาม Mandelup อาจมีประสิทธิภาพมากกว่าประชากร 22660 เนื่องจากการควบคุมโปรตีน PR-10 ที่ค่อนข้างรวดเร็วส่งเสริมความต้านทานในแนวนอน
ยีน R ที่เป็นมาตรฐานของถั่ว ETI ดูเหมือนจะเป็นกลไกทั่วไปที่ทำให้ถั่วต้านทานโรคแอนแทรคโนสได้ ดังนั้น ในพืชตระกูลถั่วจำลอง Medicago truncatula ความต้านทานโรคแอนแทรคโนสจึงเกิดจากยีน RCT1 ซึ่งเป็นสมาชิกของยีน R ของพืชในกลุ่ม TIR-NBS-LRR97 ยีนนี้ยังช่วยให้ถั่วอัลฟัลฟาต้านทานโรคแอนแทรคโนสได้กว้างขึ้นเมื่อถ่ายโอนไปยังพืชที่อ่อนไหวต่อโรค ในถั่วทั่วไป (P. vulgaris) พบยีนต้านทานโรคแอนแทรคโนสมากกว่าสองโหลจนถึงปัจจุบัน ยีนบางส่วนพบในบริเวณที่ไม่มียีน R ที่เป็นมาตรฐาน อย่างไรก็ตาม ยีนอื่นๆ จำนวนมากอยู่ที่ขอบของโครโมโซมที่มีคลัสเตอร์ยีน NBS-LRR รวมถึง TIR-NBS-LRRs99 การศึกษา SSR ทั่วจีโนมยังยืนยันความสัมพันธ์ของยีน NBS-LRR กับความต้านทานโรคแอนแทรคโนสในถั่วทั่วไปอีกด้วย นอกจากนี้ ยังพบยีน R แบบดั้งเดิมในบริเวณจีโนมที่มีตำแหน่งต้านทานโรคแอนแทรคโนสหลักในลูพินสีขาว 101 อีกด้วย
งานของเราแสดงให้เห็นว่าปฏิกิริยาการต้านทานทันทีที่เกิดขึ้นในระยะเริ่มต้นของการติดเชื้อในพืช (ไม่ควรเกิน 12 ชั่วโมงหลังจากติดเชื้อ) ช่วยปกป้องลูพินใบแคบจากโรคแอนแทรกโนสที่เกิดจากเชื้อราที่ก่อโรค Collelotrichum lupini ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยใช้การจัดลำดับข้อมูลปริมาณสูง เราได้สาธิตโปรไฟล์การแสดงออกที่แตกต่างกันของยีนต้านทานโรคแอนแทรกโนสในพืช NLL ที่ถูกควบคุมโดยยีนต้านทาน Lanr1 และ AnMan การป้องกันที่ประสบความสำเร็จเกี่ยวข้องกับการออกแบบยีนสำหรับโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยารีดอกซ์ การสังเคราะห์แสง และการเกิดโรคอย่างระมัดระวังภายในไม่กี่ชั่วโมงหลังจากที่พืชสัมผัสกับเชื้อก่อโรคเป็นครั้งแรก ปฏิกิริยาการป้องกันที่คล้ายกันแต่ล่าช้าไปตามเวลา มีประสิทธิผลน้อยกว่ามากในการปกป้องพืชจากโรค ความต้านทานโรคแอนแทรกซ์ที่เกิดจากยีน Lanr1 นั้นคล้ายคลึงกับการตอบสนองอย่างรวดเร็วแบบทั่วไปของยีน R (ภูมิคุ้มกันที่กระตุ้นโดยเอฟเฟกเตอร์) ในขณะที่ยีน AnMan นั้นน่าจะให้การตอบสนองในแนวนอน (ภูมิคุ้มกันที่กระตุ้นโดยรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับจุลินทรีย์) ซึ่งทำให้มีความยั่งยืนในระดับปานกลาง
สายพันธุ์ NLL จำนวน 215 สายพันธุ์ที่ใช้ในการคัดกรองเครื่องหมายแอนแทรคโนสประกอบด้วยพันธุ์ปลูก 74 สายพันธุ์ สายพันธุ์ที่ได้จากการผสมพันธุ์หรือการผสมพันธุ์ 60 สายพันธุ์ สายพันธุ์กลายพันธุ์ 5 สายพันธุ์ และสายพันธุ์ดั้งเดิมหรือสายพันธุ์ป่า 76 สายพันธุ์ สายพันธุ์เหล่านี้มาจาก 17 ประเทศ โดยส่วนใหญ่มาจากโปแลนด์ (58) สเปน (47) เยอรมนี (27) ออสเตรเลีย (26) รัสเซีย (19) เบลารุส (7) อิตาลี (5) และสายพันธุ์อื่นๆ จาก 10 ประเทศ ชุดนี้ยังรวมถึงสายพันธุ์ต้านทานอ้างอิง ได้แก่ 83A:476, Tanjil, Wonga ที่มีอัลลีล Lanr1 และ Mandelup ที่มีอัลลีล AnMan สายพันธุ์เหล่านี้ได้มาจากฐานข้อมูลทรัพยากรพันธุกรรมลูพินของยุโรปที่ดูแลโดย Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, โปแลนด์ (ตารางเสริม S1)
พืชถูกปลูกภายใต้สภาวะควบคุม (ช่วงแสง 16 ชั่วโมง อุณหภูมิ 25°C ในระหว่างวันและ 18°C ​​ในเวลากลางคืน) มีการวิเคราะห์แบบจำลองทางชีวภาพสองชุด แยก DNA จากใบอายุสามสัปดาห์โดยใช้ DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) ตามโปรโตคอล คุณภาพและความเข้มข้นของ DNA ที่แยกได้นั้นได้รับการประเมินโดยวิธีการสเปกโตรโฟโตเมตริก (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) เครื่องหมาย AnManM1 ที่ทำเครื่องหมายยีนต้านทานโรคแอนแทรคโนส AnMan (ได้มาจากพันธุ์ Mandelup) และเครื่องหมาย Anseq3 และ Anseq4 ที่อยู่ติดกับยีน Lanr1 (ได้มาจากพันธุ์ Tanjil) ได้รับการวิเคราะห์ 11,26,28 โฮโมไซโกตสำหรับอัลลีลที่ต้านทานได้นั้นได้รับคะแนนเป็น "1" อ่อนไหว - เป็น "0" และเฮเทอโรไซโกต - เป็น 0.5
จากผลการคัดกรองเครื่องหมาย AnManM1, AnSeq3 และ AnSeq4 และความพร้อมของเมล็ดพันธุ์สำหรับการทดลองติดตามผลขั้นสุดท้าย ได้มีการเลือกสายพันธุ์ NLL จำนวน 50 สายพันธุ์สำหรับการสร้างฟีโนไทป์ต้านทานโรคแอนแทรคโนส การวิเคราะห์ดำเนินการซ้ำในเรือนกระจกที่ควบคุมด้วยคอมพิวเตอร์ซึ่งมีช่วงเวลาแสง 14 ชั่วโมง โดยมีอุณหภูมิในช่วง 22°C ในระหว่างวันและ 19°C ในเวลากลางคืน เมล็ดจะถูกขูด (โดยตัดเปลือกเมล็ดที่อยู่ด้านตรงข้ามของตัวอ่อนออกด้วยใบมีดคม) ก่อนหว่านเพื่อป้องกันการพักตัวของเมล็ดเนื่องจากเปลือกเมล็ดแข็งเกินไปและเพื่อให้แน่ใจว่าการงอกจะสม่ำเสมอ ปลูกต้นไม้ในกระถาง (11 × 11 × 21 ซม.) ที่มีดินปลอดเชื้อ (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Poland) การฉีดเชื้อจะดำเนินการโดยใช้สายพันธุ์ Colletotrichum lupini Col-08 ซึ่งปลูกในปี 1999 จากลำต้นของต้นลูพินใบแคบที่ปลูกในทุ่งแห่งหนึ่งในเมือง Verzhenitsa ประเทศโปแลนด์ (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) หาพื้นที่ เชื้อแยกได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหาร SNA ที่อุณหภูมิ 20° C ภายใต้แสงสีดำเป็นเวลา 21 วันเพื่อกระตุ้นการสร้างสปอร์ สี่สัปดาห์หลังจากหว่านเมล็ด เมื่อต้นไม้ถึงระยะใบ 4-6 ใบ การฉีดเชื้อจะดำเนินการโดยพ่นสารแขวนลอยของสปอร์ในความเข้มข้น 0.5 x 106 สปอร์ต่อมิลลิลิตร หลังจากการฉีดเชื้อแล้ว ให้เก็บต้นไม้ไว้ในที่มืดเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ความชื้นประมาณ 98% และอุณหภูมิ 25°C เพื่อให้สปอร์งอกและกระบวนการติดเชื้อได้สะดวก จากนั้นจึงปลูกพืชภายใต้ช่วงแสง 14 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 22°C ในตอนกลางวัน/19°C ในตอนกลางคืน และความชื้น 70% คะแนนโรคจะถูกทำขึ้น 22 วันหลังจากการเพาะเชื้อ และอยู่ในช่วงตั้งแต่ 0 (มีภูมิคุ้มกัน) ถึง 9 (อ่อนไหวมาก) ขึ้นอยู่กับการมีหรือไม่มีรอยโรคเน่าตายบนลำต้นและใบ นอกจากนี้ หลังจากให้คะแนนแล้ว จะวัดน้ำหนักของพืช ความสัมพันธ์ระหว่างจีโนไทป์ของเครื่องหมายและฟีโนไทป์ของโรคจะถูกคำนวณโดยใช้ความสัมพันธ์ของลำดับจุดสอง (ไม่มีเครื่องหมายเฮเทอโรไซกัสในชุดของสายพันธุ์สำหรับการวิเคราะห์ฟีโนไทป์ต้านทานโรคแอนแทรคโนส)