ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าจะได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงผลไซต์โดยไม่ใช้รูปแบบและ JavaScript
มีความจำเป็นต้องมีระบบในหลอดทดลองที่เชื่อถือได้ซึ่งสามารถสร้างสภาพแวดล้อมทางสรีรวิทยาของหัวใจได้อย่างแม่นยำเพื่อการทดสอบยา ระบบเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจของมนุษย์ที่มีจำกัดทำให้การตีความผลของยาต่อหัวใจไม่แม่นยำ ในที่นี้ เราได้พัฒนาแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจ (CTCM) ที่กระตุ้นชิ้นเนื้อหัวใจด้วยไฟฟ้ากลและยืดส่วนสรีรวิทยาในช่วงซิสโตลิกและไดแอสโตลิกของวงจรหัวใจ หลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน แนวทางนี้ช่วยปรับปรุงความมีชีวิตของชิ้นเนื้อหัวใจได้บางส่วน แต่ไม่ได้รักษาความสมบูรณ์ของโครงสร้างได้อย่างสมบูรณ์ ดังนั้น หลังจากการตรวจคัดกรองโมเลกุลขนาดเล็กแล้ว เราพบว่าการเติมไตรไอโอโดไทรโอนีน (T3) 100 นาโนโมลาร์และเดกซาเมทาโซน (Dex) 1 ไมโครโมลาร์ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อของเราช่วยรักษาโครงสร้างจุลภาคของชิ้นเนื้อได้เป็นเวลา 12 วัน เมื่อใช้ร่วมกับการรักษาด้วย T3/Dex ระบบ CTCM จะรักษาโปรไฟล์การถอดรหัส ความมีชีวิต กิจกรรมการเผาผลาญ และความสมบูรณ์ของโครงสร้างในระดับเดียวกับเนื้อเยื่อหัวใจสดเป็นเวลา 12 วัน นอกจากนี้ การยืดตัวของเนื้อเยื่อหัวใจมากเกินไปในการเพาะเลี้ยงยังทำให้เกิดการส่งสัญญาณของหัวใจโต ซึ่งเป็นหลักฐานที่แสดงให้เห็นถึงความสามารถของ CTCM ในการเลียนแบบภาวะโตที่เกิดจากการยืดตัวของหัวใจ สรุปได้ว่า CTCM สามารถสร้างแบบจำลองสรีรวิทยาและพยาธิสรีรวิทยาของหัวใจในการเพาะเลี้ยงได้เป็นเวลานาน ทำให้สามารถคัดกรองยาได้อย่างน่าเชื่อถือ
ก่อนการวิจัยทางคลินิก จำเป็นต้องมีระบบในหลอดทดลองที่เชื่อถือได้ซึ่งสามารถสร้างสภาพแวดล้อมทางสรีรวิทยาของหัวใจมนุษย์ได้อย่างแม่นยำ ระบบดังกล่าวควรเลียนแบบการยืดตัวทางกลที่เปลี่ยนแปลงไป อัตราการเต้นของหัวใจ และคุณสมบัติทางไฟฟ้าวิทยา โดยทั่วไปแล้ว แบบจำลองสัตว์มักใช้เป็นแพลตฟอร์มคัดกรองสรีรวิทยาของหัวใจ โดยมีความน่าเชื่อถือจำกัดในการสะท้อนผลของยาในหัวใจมนุษย์1,2 ในที่สุด แบบจำลองการทดลองเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจในอุดมคติ (CTCM) คือแบบจำลองที่มีความไวสูงและเฉพาะเจาะจงสำหรับการแทรกแซงทางการรักษาและทางเภสัชวิทยาต่างๆ โดยสามารถจำลองสรีรวิทยาและพยาธิสรีรวิทยาของหัวใจมนุษย์ได้อย่างแม่นยำ3 การไม่มีระบบดังกล่าวจำกัดการค้นพบการรักษาใหม่ๆ สำหรับภาวะหัวใจล้มเหลว4,5 และนำไปสู่พิษต่อหัวใจจากยาเป็นสาเหตุหลักที่ทำให้ต้องออกจากตลาด6
ในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา ยาที่ไม่เกี่ยวข้องกับหลอดเลือดหัวใจแปดชนิดถูกถอนออกจากการใช้ทางคลินิกเนื่องจากยาเหล่านี้ทำให้ช่วง QT ยาวนานขึ้น ส่งผลให้เกิดภาวะหัวใจเต้นผิดจังหวะและเสียชีวิตกะทันหัน7 ดังนั้น จึงมีความจำเป็นที่ต้องมีกลยุทธ์การคัดกรองก่อนทางคลินิกที่เชื่อถือได้มากขึ้น เพื่อประเมินประสิทธิผลและความเป็นพิษต่อระบบหัวใจและหลอดเลือด การใช้เซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพของมนุษย์ที่เหนี่ยวนำ (hiPS-CM) ในการคัดกรองยาและการทดสอบความเป็นพิษเมื่อไม่นานนี้ถือเป็นวิธีแก้ปัญหาบางส่วนสำหรับปัญหานี้ อย่างไรก็ตาม ลักษณะที่ยังไม่โตเต็มที่ของ hiPS-CM และการขาดความซับซ้อนของเนื้อเยื่อหัวใจหลายเซลล์เป็นข้อจำกัดที่สำคัญของวิธีนี้ การศึกษาเมื่อไม่นานนี้แสดงให้เห็นว่าข้อจำกัดนี้สามารถเอาชนะได้บางส่วนโดยใช้ hiPS-CM ในระยะเริ่มต้นเพื่อสร้างไฮโดรเจลของเนื้อเยื่อหัวใจไม่นานหลังจากเริ่มมีการหดตัวตามธรรมชาติ และค่อยๆ เพิ่มการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าเมื่อเวลาผ่านไป อย่างไรก็ตาม ไมโครทิวทิวชัน hiPS-CM เหล่านี้ขาดคุณสมบัติทางไฟฟ้าและการหดตัวที่สมบูรณ์ของกล้ามเนื้อหัวใจในผู้ใหญ่ นอกจากนี้ เนื้อเยื่อหัวใจของมนุษย์ยังมีโครงสร้างที่ซับซ้อนกว่า ซึ่งประกอบด้วยเซลล์ประเภทต่างๆ ที่หลากหลาย เช่น เซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือด เซลล์ประสาท และไฟโบรบลาสต์ของเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน ซึ่งเชื่อมต่อกันด้วยโปรตีนเมทริกซ์นอกเซลล์ชุดเฉพาะ ความหลากหลายของประชากรที่ไม่ใช่กล้ามเนื้อหัวใจ11,12,13 ในหัวใจของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่โตเต็มวัยเป็นอุปสรรคสำคัญในการสร้างแบบจำลองเนื้อเยื่อหัวใจโดยใช้เซลล์แต่ละประเภท ข้อจำกัดที่สำคัญเหล่านี้เน้นย้ำถึงความสำคัญของการพัฒนาวิธีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อหัวใจที่สมบูรณ์ภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยาและพยาธิวิทยา
ส่วนต่างๆ ของหัวใจมนุษย์ที่เพาะเลี้ยงด้วยเนื้อเยื่อบาง (300 µm) ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นแบบจำลองที่น่าสนใจของกล้ามเนื้อหัวใจมนุษย์ที่สมบูรณ์ วิธีนี้ช่วยให้เข้าถึงระบบหลายเซลล์ 3 มิติที่สมบูรณ์ซึ่งคล้ายกับเนื้อเยื่อหัวใจของมนุษย์ อย่างไรก็ตาม จนถึงปี 2019 การใช้ส่วนต่างๆ ของหัวใจที่เพาะเลี้ยงด้วยเนื้อเยื่อถูกจำกัดด้วยการอยู่รอดที่สั้น (24 ชั่วโมง) เนื่องมาจากปัจจัยหลายประการ เช่น การขาดการยืดทางกายภาพและทางกล อินเทอร์เฟซระหว่างอากาศและของเหลว และการใช้สื่อที่เรียบง่ายซึ่งไม่รองรับความต้องการของเนื้อเยื่อหัวใจ ในปี 2019 กลุ่มวิจัยหลายกลุ่มได้แสดงให้เห็นว่าการรวมปัจจัยทางกลเข้ากับระบบเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจสามารถยืดอายุการเพาะเลี้ยง ปรับปรุงการแสดงออกของหัวใจ และเลียนแบบพยาธิวิทยาของหัวใจได้ การศึกษาวิจัยอันวิจิตรบรรจงสองชิ้นที่ 17 และ 18 แสดงให้เห็นว่าการโหลดเชิงกลแบบแกนเดียวมีผลในเชิงบวกต่อลักษณะทางฟีโนไทป์ของหัวใจระหว่างการเพาะเลี้ยง อย่างไรก็ตาม การศึกษาเหล่านี้ไม่ได้ใช้การโหลดแบบไดนามิกในเชิงฟิสิกส์และกลศาสตร์สามมิติของรอบการเต้นของหัวใจ เนื่องจากส่วนต่างๆ ของหัวใจถูกโหลดด้วยแรงดึงแบบไอโซเมตริก 17 หรือแรงดึงแบบออโซโทนิกเชิงเส้น 18 วิธีการยืดเนื้อเยื่อเหล่านี้ส่งผลให้ยีนหัวใจหลายตัวถูกระงับ หรือยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองการยืดที่ผิดปกติแสดงออกมากเกินไป ที่น่าสังเกตคือ Pitoulis และคณะ 19 ได้พัฒนาอ่างเพาะเลี้ยงชิ้นเนื้อหัวใจแบบไดนามิกสำหรับการสร้างรอบการเต้นของหัวใจใหม่โดยใช้การป้อนกลับของตัวแปลงแรงและแรงขับของแรงดึง แม้ว่าระบบนี้จะช่วยให้สร้างแบบจำลองรอบการเต้นของหัวใจในหลอดทดลองได้แม่นยำยิ่งขึ้น แต่ความซับซ้อนและปริมาณงานที่น้อยของวิธีนี้จำกัดการใช้งานระบบนี้ ห้องปฏิบัติการของเราได้พัฒนาระบบเพาะเลี้ยงที่เรียบง่ายขึ้นโดยใช้การกระตุ้นไฟฟ้าและตัวกลางที่เหมาะสมเพื่อรักษาความมีชีวิตของส่วนต่างๆ ของเนื้อเยื่อหัวใจของหมูและมนุษย์ได้นานถึง 6 วัน20,21
ในต้นฉบับปัจจุบันนี้ เราอธิบายแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจ (CTCM) โดยใช้ส่วนต่างๆ ของหัวใจหมูที่รวมเอาข้อมูลฮิวมอรัลเพื่อสรุปสรีรวิทยาของหัวใจแบบสามมิติและการขยายตัวทางพยาธิสรีรวิทยาในระหว่างรอบการเต้นของหัวใจ CTCM นี้สามารถเพิ่มความแม่นยำของการทำนายยาก่อนการทดลองทางคลินิกไปสู่ระดับที่ไม่เคยทำได้มาก่อน โดยจัดทำระบบหัวใจที่มีประสิทธิภาพด้านต้นทุนและประสิทธิภาพการทำงานระดับกลางที่เลียนแบบสรีรวิทยา/พยาธิสรีรวิทยาของหัวใจของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมสำหรับการทดสอบยาก่อนการทดลองทางคลินิก
สัญญาณกลศาสตร์เฮโมไดนามิกมีบทบาทสำคัญในการรักษาการทำงานของกล้ามเนื้อหัวใจในหลอดทดลอง 22,23,24 ในต้นฉบับปัจจุบัน เราได้พัฒนา CTCM (รูปที่ 1a) ที่สามารถเลียนแบบสภาพแวดล้อมของหัวใจในผู้ใหญ่ได้โดยการเหนี่ยวนำการกระตุ้นทั้งทางไฟฟ้าและทางกลที่ความถี่ทางสรีรวิทยา (1.2 เฮิรตซ์ 72 ครั้งต่อนาที) เพื่อหลีกเลี่ยงการยืดตัวของเนื้อเยื่อมากเกินไปในช่วงไดแอสโทล จึงมีการใช้เครื่องพิมพ์ 3 มิติเพื่อเพิ่มขนาดเนื้อเยื่อขึ้น 25% (รูปที่ 1b) การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าที่เหนี่ยวนำโดยระบบ C-PACE จะถูกตั้งเวลาให้เริ่มต้น 100 มิลลิวินาทีก่อนซิสโทลโดยใช้ระบบรับข้อมูลเพื่อจำลองวงจรการเต้นของหัวใจอย่างสมบูรณ์ ระบบเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อใช้ตัวกระตุ้นลมแบบตั้งโปรแกรมได้ (LB Engineering, เยอรมนี) เพื่อขยายเมมเบรนซิลิโคนที่ยืดหยุ่นได้แบบเป็นรอบเพื่อทำให้ชิ้นเนื้อหัวใจในห้องบนขยายตัว ระบบเชื่อมต่อกับสายอากาศภายนอกผ่านเครื่องแปลงสัญญาณความดัน ซึ่งทำให้สามารถปรับความดัน (± 1 mmHg) และเวลา (± 1 ms) ได้อย่างแม่นยำ (รูปที่ 1c)
ก. ติดส่วนเนื้อเยื่อเข้ากับวงแหวนรองรับขนาด 7 มม. ซึ่งแสดงเป็นสีน้ำเงิน ภายในห้องเพาะเลี้ยงของอุปกรณ์ ห้องเพาะเลี้ยงจะถูกแยกจากห้องอากาศด้วยแผ่นซิลิโคนที่ยืดหยุ่นได้บางๆ วางปะเก็นไว้ระหว่างห้องแต่ละห้องเพื่อป้องกันการรั่วซึม ฝาปิดของอุปกรณ์มีอิเล็กโทรดกราไฟต์ซึ่งทำหน้าที่กระตุ้นไฟฟ้า ข. การแสดงภาพแผนผังของอุปกรณ์เนื้อเยื่อขนาดใหญ่ วงแหวนนำทาง และวงแหวนรองรับ ส่วนเนื้อเยื่อ (สีน้ำตาล) วางบนอุปกรณ์ขนาดใหญ่ โดยวางวงแหวนนำทางไว้ในร่องที่ขอบด้านนอกของอุปกรณ์ ใช้วงแหวนนำทางเพื่อวางวงแหวนรองรับที่เคลือบด้วยกาวอะคริลิกสำหรับเนื้อเยื่อไว้เหนือส่วนของเนื้อเยื่อหัวใจอย่างระมัดระวัง ค. กราฟแสดงเวลาของการกระตุ้นไฟฟ้าตามฟังก์ชันของแรงดันในห้องอากาศที่ควบคุมโดยตัวกระตุ้นลมแบบตั้งโปรแกรมได้ (PPD) อุปกรณ์รวบรวมข้อมูลถูกใช้เพื่อซิงโครไนซ์การกระตุ้นไฟฟ้าโดยใช้เซ็นเซอร์แรงดัน เมื่อแรงดันในห้องเพาะเลี้ยงถึงเกณฑ์ที่ตั้งไว้ สัญญาณพัลส์จะถูกส่งไปยัง C-PACE-EM เพื่อกระตุ้นไฟฟ้า ง. ภาพของ CTCM สี่ตัวที่วางอยู่บนชั้นวางตู้ฟัก อุปกรณ์สี่ชิ้นเชื่อมต่อกับ PPD หนึ่งชิ้นผ่านวงจรลม และเซ็นเซอร์แรงดันจะถูกใส่ไว้ในวาล์วห้ามเลือดเพื่อตรวจสอบแรงดันในวงจรลม อุปกรณ์แต่ละชิ้นประกอบด้วยเนื้อเยื่อ 6 ส่วน
การใช้ตัวกระตุ้นลมเพียงตัวเดียว ทำให้เราสามารถควบคุมอุปกรณ์ CTCM 4 เครื่อง ซึ่งแต่ละเครื่องสามารถยึดเนื้อเยื่อได้ 6 ส่วน (รูปที่ 1d) ใน CTCM ความดันอากาศในห้องอากาศจะถูกแปลงเป็นความดันแบบซิงโครนัสในห้องของเหลว และกระตุ้นให้ชิ้นเนื้อขยายตัวตามสรีรวิทยา (รูปที่ 2a และภาพยนตร์เสริม 1) การประเมินการยืดตัวของเนื้อเยื่อที่ความดัน 80 มม. ปรอท ภาพแสดงการยืดตัวของชิ้นเนื้อ 25% (รูปที่ 2b) เปอร์เซ็นต์การยืดตัวนี้แสดงให้เห็นว่าสอดคล้องกับความยาวซาร์โคเมียร์ทางสรีรวิทยา 2.2–2.3 ไมโครเมตรสำหรับการหดตัวของส่วนหัวใจปกติ17,19,25 การเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อได้รับการประเมินโดยใช้การตั้งค่ากล้องแบบกำหนดเอง (รูปภาพเสริม 1) แอมพลิจูดและความเร็วของการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อ (รูปที่ 2c, d) สอดคล้องกับการยืดตัวในระหว่างรอบการเต้นของหัวใจและเวลาในช่วงซิสโทลและไดแอสโทล (รูปที่ 2b) การยืดตัวและความเร็วของเนื้อเยื่อหัวใจระหว่างการหดตัวและการคลายตัวคงที่เป็นเวลา 12 วันในการเพาะเลี้ยง (รูปที่ 2f) เพื่อประเมินผลของการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าต่อการหดตัวระหว่างการเพาะเลี้ยง เราได้พัฒนาวิธีการสำหรับการกำหนดความผิดปกติที่เกิดขึ้นจริงโดยใช้อัลกอริทึมการแรเงา (รูปเสริม 2a,b) และสามารถแยกแยะระหว่างความผิดปกติที่มีและไม่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าได้ ส่วนเดียวกันของหัวใจ (รูปที่ 2f) ในบริเวณที่เคลื่อนไหวได้ของรอยตัด (R6-9) แรงดันไฟฟ้าระหว่างการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าจะสูงกว่า 20% เมื่อเทียบกับในกรณีที่ไม่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้า ซึ่งบ่งชี้ถึงการมีส่วนสนับสนุนของการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าต่อการหดตัว
ร่องรอยที่เป็นตัวแทนของความดันในห้องอากาศ ความดันในห้องของเหลว และการวัดการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อ ยืนยันว่าความดันในห้องเปลี่ยนแปลงความดันในห้องของเหลว ส่งผลให้ชิ้นเนื้อเยื่อเคลื่อนไหวตามไปด้วย b ร่องรอยที่เป็นตัวแทนของเปอร์เซ็นต์การยืด (สีน้ำเงิน) ของส่วนเนื้อเยื่อที่สอดคล้องกับเปอร์เซ็นต์การยืด (สีส้ม) c การเคลื่อนไหวที่วัดได้ของชิ้นเนื้อหัวใจสอดคล้องกับความเร็วในการเคลื่อนไหวที่วัดได้ (d) เส้นทางที่เป็นตัวแทนของการเคลื่อนไหวแบบเป็นวงจร (เส้นสีน้ำเงิน) และความเร็ว (เส้นประสีส้ม) ในชิ้นเนื้อหัวใจ e การวัดปริมาณเวลาในรอบ (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูที่แตกต่างกัน) เวลาหดตัว (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม) เวลาผ่อนคลาย (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูที่แตกต่างกัน) การเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อ (n = 25 ) ชิ้นเนื้อ)/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน) ความเร็วซิสโตลิกสูงสุด (n = 24(D0), 25(D12) ชิ้นเนื้อ/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน) และอัตราการผ่อนคลายสูงสุด (n = 24(D0), 25(D12) ชิ้นเนื้อ/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน) การทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองหางแสดงให้เห็นว่าไม่มีความแตกต่างที่สำคัญในพารามิเตอร์ใดๆ f ร่องรอยการวิเคราะห์ความเครียดที่เป็นตัวแทนของส่วนเนื้อเยื่อที่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้า (สีแดง) และไม่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้า (สีน้ำเงิน) พื้นที่ภูมิภาคสิบแห่งของส่วนเนื้อเยื่อจากส่วนเดียวกัน แผงด้านล่างแสดงการวัดปริมาณความแตกต่างของเปอร์เซ็นต์ของความเครียดในส่วนเนื้อเยื่อที่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าและไม่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าในสิบพื้นที่จากส่วนต่างๆ (n = 8 ชิ้น/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ t-test นักเรียนสองหาง ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05) (n = 8 ชิ้น/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ t-test นักเรียนสองหาง ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05) (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05) (n = 8 ส่วนต่อกลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน, การทดสอบ t แบบสองหางของ Student; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05) （n = 8 ฝา/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验;****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 ฝา/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验;****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05) (n = 8 ส่วนต่อกลุ่ม จากหมูที่แตกต่างกัน การทดสอบ t แบบสองหางของ Student; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
ในระบบการเพาะเลี้ยงชิ้นเนื้อหัวใจเลียนแบบชีวภาพแบบสถิตย์ก่อนหน้านี้ [20, 21] เราคงความสามารถในการมีชีวิต การทำงาน และความสมบูรณ์ของโครงสร้างของชิ้นเนื้อหัวใจไว้ได้ 6 วันโดยการใช้การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าและปรับองค์ประกอบของตัวกลางให้เหมาะสมที่สุด อย่างไรก็ตาม หลังจากผ่านไป 10 วัน ตัวเลขเหล่านี้ก็ลดลงอย่างรวดเร็ว เราจะอ้างถึงส่วนที่เพาะเลี้ยงในระบบการเพาะเลี้ยงชิ้นเนื้อหัวใจเลียนแบบชีวภาพแบบสถิตย์ก่อนหน้านี้ 20, 21 เงื่อนไขควบคุม (Ctrl) และเราจะใช้ตัวกลางที่ปรับให้เหมาะสมก่อนหน้านี้เป็นเงื่อนไข MC และเพาะเลี้ยงภายใต้การกระตุ้นทางกลและไฟฟ้าพร้อมกัน (CTCM) ที่เรียกว่า . ขั้นแรก เราได้กำหนดว่าการกระตุ้นทางกลโดยไม่ใช้การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าไม่เพียงพอที่จะรักษาความสามารถในการมีชีวิตของเนื้อเยื่อไว้ได้ 6 วัน (รูปเสริม 3a,b) ที่น่าสนใจคือ เมื่อมีการนำการกระตุ้นทางฟิสิกส์-กลและไฟฟ้ามาใช้โดยใช้ STCM ความสามารถในการมีชีวิตของชิ้นเนื้อหัวใจที่มีอายุ 12 วันยังคงเท่าเดิมกับชิ้นเนื้อหัวใจสดภายใต้เงื่อนไข MS แต่ไม่ใช่ภายใต้เงื่อนไข Ctrl ดังที่แสดงโดยการวิเคราะห์ MTT (รูปที่ 1) 3a) สิ่งนี้แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นทางกลและการจำลองวงจรการเต้นของหัวใจสามารถทำให้ส่วนเนื้อเยื่อมีชีวิตอยู่ได้นานเป็นสองเท่าของที่รายงานไว้ในระบบการเพาะเลี้ยงแบบคงที่ก่อนหน้านี้ของเรา อย่างไรก็ตาม การประเมินความสมบูรณ์ของโครงสร้างของส่วนเนื้อเยื่อโดยการติดฉลากภูมิคุ้มกันของโทรโปนินทีของหัวใจและคอนเน็กซิน 43 แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของคอนเน็กซิน 43 สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเนื้อเยื่อ MC ในวันที่ 12 เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมในวันเดียวกัน อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของคอนเน็กซิน 43 ที่สม่ำเสมอและการก่อตัวของดิสก์ Z ไม่ได้รับการบำรุงรักษาอย่างเต็มที่ (รูปที่ 3b) เราใช้กรอบงานปัญญาประดิษฐ์ (AI) เพื่อวัดความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อ26 ซึ่งเป็นกระบวนการเรียนรู้เชิงลึกที่ใช้ภาพซึ่งอิงจากการย้อมโทรโปนินทีและคอนเน็กซิน43 เพื่อวัดความสมบูรณ์ของโครงสร้างและการเรืองแสงของชิ้นเนื้อหัวใจโดยอัตโนมัติในแง่ของความแรงของตำแหน่ง วิธีนี้ใช้เครือข่ายประสาทเทียมแบบ Convolutional (CNN) และกรอบงานการเรียนรู้เชิงลึกเพื่อวัดความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจได้อย่างน่าเชื่อถือในลักษณะอัตโนมัติและไม่มีอคติ ดังที่อธิบายไว้ในเอกสารอ้างอิง 26. เนื้อเยื่อ MC แสดงให้เห็นความคล้ายคลึงของโครงสร้างที่ดีขึ้นเมื่อเทียบกับส่วนควบคุมแบบคงที่ในวันที่ 0 นอกจากนี้ การย้อม Masson's trichrome ยังเผยให้เห็นเปอร์เซ็นต์ของพังผืดที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญภายใต้สภาวะ MS เมื่อเทียบกับสภาวะควบคุมในวันที่ 12 ของการเพาะเลี้ยง (รูปที่ 3c) แม้ว่า CTCM จะเพิ่มความสามารถในการมีชีวิตของส่วนเนื้อเยื่อหัวใจในวันที่ 12 ในระดับที่ใกล้เคียงกับเนื้อเยื่อหัวใจสด แต่ไม่ได้ปรับปรุงความสมบูรณ์ของโครงสร้างของส่วนหัวใจอย่างมีนัยสำคัญ
กราฟแท่งแสดงปริมาณความสามารถในการมีชีวิตของ MTT ของชิ้นหัวใจสด (D0) หรือการเพาะเลี้ยงชิ้นหัวใจเป็นเวลา 12 วัน ไม่ว่าจะในวัฒนธรรมแบบคงที่ (D12 Ctrl) หรือใน CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มจากหมูต่างสายพันธุ์ โดยทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) กราฟแท่งแสดงปริมาณความสามารถในการมีชีวิตของ MTT ของชิ้นหัวใจสด (D0) หรือการเพาะเลี้ยงชิ้นหัวใจเป็นเวลา 12 วัน ไม่ว่าจะในวัฒนธรรมแบบคงที่ (D12 Ctrl) หรือใน CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มจากหมูต่างพันธุ์ โดยทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl)ฮิสโทแกรมแสดงปริมาณความสามารถในการมีชีวิตของส่วนตัดหัวใจสดจาก MTT (D0) หรือการเพาะเลี้ยงส่วนตัดหัวใจเป็นเวลา 12 วันในวัฒนธรรมแบบคงที่ (กลุ่มควบคุม D12) หรือ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (กลุ่มควบคุม D12)) ) ), ส่วนตัดหัวใจ 12 ส่วน/กลุ่มจากหมูต่างชนิดกัน โดยทำการทดสอบ ANOVA ทางเดียว####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl) ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) a 条形Image显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜heart脏切上(D0) 或heart脏切本培养12 天的MTT活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切组/组,进行单向ANOVA 测试;与D0 相比,####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p < 0.01)。 a 条形Image显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜heart脏切上(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC)切组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)ฮิสโทแกรมแสดงปริมาณความสามารถในการมีชีวิตของ MTT ในส่วนของหัวใจสด (D0) หรือในส่วนของหัวใจที่เพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วันในวัฒนธรรมแบบคงที่ (กลุ่มควบคุม D12) หรือ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (กลุ่มควบคุม D12)) , 12 ส่วน (D12 MC) ต่อกลุ่มจากหมูต่างชนิดกัน การทดสอบ ANOVA ทางเดียว####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl) ####p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0, **p < 0.01 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl)b Troponin-T (สีเขียว) connexin 43 (สีแดง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) ในส่วนของหัวใจที่แยกได้สดๆ (D0) หรือส่วนของหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะคงที่ (Ctrl) หรือสภาวะ CTCM (MC) เป็นเวลา 12 วัน) ของภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ที่เป็นตัวแทน (มาตราส่วนว่าง = 100 µm) การวัดความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจด้วยปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ ****p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) การวัดความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจด้วยปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ####p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ ****p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению ด้วย D12 Ctrl). การวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจโดยใช้ปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ส่วน/กลุ่มจากหมูต่างชนิดกัน ทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl)人工智能量化จิตวิญญาณ脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่ม แต่ละหมูที่แตกต่างกัน, การทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว;####p < 0.0001 ถึง D0 相比,****p < 0.0001 ถึง D12 Ctrl 相比)人工智能量化จิตวิญญาณ脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่ม แต่ละหมูที่แตกต่างกัน, การทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว;####p < 0.0001 ถึง D0相比,****p < 0.0001 ถึง D12 Ctrl 相比) Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению ด้วย D12 Ctrl). ปัญญาประดิษฐ์ในการวัดความสมบูรณ์ของโครงสร้างของเนื้อเยื่อหัวใจ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ตัดส่วน/กลุ่มหมูแต่ละตัวที่แตกต่างกัน, การทดสอบ ANOVA ทางเดียว; ####p<0.0001 เมื่อเทียบกับ .D0 เพื่อการเปรียบเทียบ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) c ภาพตัวแทน (ซ้าย) และการวัดปริมาณ (ขวา) สำหรับชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วยการย้อม Masson's trichrome (สเกลเปล่า = 500 µm) (n = 10 ชิ้น/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA ทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) c ภาพตัวแทน (ซ้าย) และการวัดปริมาณ (ขวา) สำหรับชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วยการย้อม Masson's trichrome (สเกลเปล่า = 500 µm) (n = 10 ชิ้น/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน ทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว #### p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест การวิเคราะห์ความแปรปรวน; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl) c ภาพตัวแทน (ซ้าย) และการวัดปริมาณ (ขวา) ของส่วนต่างๆ ของหัวใจที่ย้อมด้วยการย้อม Masson's trichrome (มาตราส่วนไม่เคลือบ = 500 µm) (n = 10 ส่วนต่อกลุ่มจากหมูต่างพันธุ์ ทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว #### p < 0 .0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) c 用Masson 三色染料染色的heart脏切的代表性Images（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 คลิกตกลง/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试;#### p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比). C 用masson 三 色 染料 的 heart脏 切ע 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切พรีเมี่ยม 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试;#### p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001 ถึง D12 Ctrl 相比) c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c ภาพตัวแทน (ซ้าย) และการหาปริมาณ (ขวา) ของส่วนต่างๆ ของหัวใจที่ย้อมด้วยการย้อม Masson's trichrome (ช่องว่าง = 500 µm) (n = 10 ส่วนต่อกลุ่ม โดยแต่ละส่วนมาจากหมูที่แตกต่างกัน ทดสอบโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว ;### # p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0, ***p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl)แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
เราตั้งสมมติฐานว่าการเพิ่มโมเลกุลขนาดเล็กลงในอาหารเลี้ยงเชื้อจะทำให้ความสมบูรณ์ของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจดีขึ้นและลดการเกิดพังผืดระหว่างการเพาะเลี้ยง CTCM ดังนั้น เราจึงคัดกรองโมเลกุลขนาดเล็กโดยใช้อาหารเลี้ยงเชื้อควบคุมแบบคงที่20,21 เนื่องจากมีปัจจัยรบกวนจำนวนน้อย จึงเลือกใช้เดกซาเมทาโซน (Dex) ไตรไอโอโดไทรโอนีน (T3) และ SB431542 (SB) สำหรับการคัดกรองนี้ โมเลกุลขนาดเล็กเหล่านี้เคยใช้ในอาหารเลี้ยงเชื้อ hiPSC-CM เพื่อกระตุ้นให้เซลล์กล้ามเนื้อหัวใจเจริญเติบโตโดยเพิ่มความยาวของซาร์โคเมียร์ ท่อที และความเร็วการนำไฟฟ้า นอกจากนี้ ทั้งเดกซาเมทาโซน (กลูโคคอร์ติคอยด์) และ SB ยังทราบกันดีว่าสามารถยับยั้งการอักเสบ29,30 ดังนั้น เราจึงทดสอบว่าการรวมโมเลกุลขนาดเล็กเหล่านี้เข้าด้วยกันหรือการรวมกันของโมเลกุลขนาดเล็กเหล่านี้จะช่วยปรับปรุงความสมบูรณ์ของโครงสร้างของส่วนต่างๆ ของหัวใจได้หรือไม่ สำหรับการคัดกรองเบื้องต้น ปริมาณของสารประกอบแต่ละชนิดจะถูกเลือกตามความเข้มข้นที่ใช้กันทั่วไปในแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเซลล์ (Dex27 1 μM, T327 100 nM และ SB31 2.5 μM) หลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน การรวมกันของ T3 และ Dex ส่งผลให้โครงสร้างกล้ามเนื้อหัวใจแข็งแรงเหมาะสมที่สุดและเส้นใยได้รับการปรับโครงสร้างใหม่ในระดับต่ำ (ภาพเสริม 4 และ 5) นอกจากนี้ การใช้ T3 และ Dex ในปริมาณสองเท่าหรือสองเท่าของความเข้มข้นเหล่านี้ยังก่อให้เกิดผลเสียเมื่อเทียบกับความเข้มข้นปกติ (ภาพเสริม 6a,b)
หลังจากการตรวจคัดกรองเบื้องต้น เราได้ทำการเปรียบเทียบแบบตัวต่อตัวของสภาวะการเพาะเลี้ยง 4 สภาวะ (รูปที่ 4a): Ctrl: ส่วนต่างๆ ของหัวใจที่เพาะเลี้ยงในวัฒนธรรมแบบคงที่ที่เราได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยใช้ตัวกลางที่ปรับให้เหมาะสมของเรา 20.21 TD: T3 และ Ctrl s เพิ่ม Dex ในวันพุธ MC: ส่วนต่างๆ ของหัวใจที่เพาะเลี้ยงใน CTCM โดยใช้ตัวกลางที่ปรับให้เหมาะสมของเราก่อนหน้านี้ และ MT: CTCM ที่เติม T3 และ Dex ลงในตัวกลาง หลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน ความสามารถในการมีชีวิตของเนื้อเยื่อ MS และ MT ยังคงเท่าเดิมเมื่อเทียบกับเนื้อเยื่อสดที่ประเมินโดยการทดสอบ MTT (รูปที่ 4b) ที่น่าสนใจคือ การเติม T3 และ Dex ลงในวัฒนธรรมทรานส์เวลล์ (TD) ไม่ได้ส่งผลให้ความสามารถในการมีชีวิตดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับสภาวะ Ctrl ซึ่งบ่งชี้ถึงบทบาทสำคัญของการกระตุ้นทางกลในการรักษาความสามารถในการมีชีวิตของส่วนต่างๆ ของหัวใจ
แผนภาพการออกแบบการทดลองที่แสดงสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้งสี่ประการที่ใช้ในการประเมินผลของการกระตุ้นทางกลและการเสริม T3/Dex บนตัวกลางเป็นเวลา 12 วัน กราฟแท่งแสดงปริมาณความสามารถในการมีชีวิต 12 วันหลังการเพาะเลี้ยงในสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 สภาวะ (Ctrl, TD, MC และ MT) เมื่อเปรียบเทียบกับชิ้นหัวใจสด (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT), 12 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มจากหมูต่างพันธุ์ ดำเนินการทดสอบ ANOVA ทางเดียว; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) กราฟแท่งแสดงปริมาณความสามารถในการมีชีวิต 12 วันหลังการเพาะเลี้ยงในสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 สภาวะ (Ctrl, TD, MC และ MT) เมื่อเปรียบเทียบกับชิ้นหัวใจสด (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT), 12 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มจากหมูต่างพันธุ์ ดำเนินการทดสอบ ANOVA ทางเดียว ####p < 0.0001, ###p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 ctrl) b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl) b กราฟแท่งแสดงปริมาณความสามารถในการมีชีวิตที่ 12 วันหลังการเพาะเลี้ยงในสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 สภาวะ (ควบคุม TD MC และ MT) เปรียบเทียบกับส่วนของหัวใจสด (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT), 12 (D12 MC) ส่วนต่อกลุ่มจากหมูต่างชนิดกัน, การทดสอบ ANOVA ทางเดียว; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) b 条形Image显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜heart脏切 วอลล์เปเปอร์(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比，**p < 0.01与D12控制).ข 4 12 (D12 ม.ค.) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT), หรือ 12 (D12 MC) ให้เลือก, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12) b ฮิสโทแกรมที่แสดงสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้งหมด 4 สภาวะ (ควบคุม, TD, MC และ MT) เปรียบเทียบกับส่วนของหัวใจสด (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT) จากส่วนต่างๆ ของสุกร 12 ตัว/กลุ่ม (D12 MC) การทดสอบ ANOVA ทางเดียว; ####p<0.0001, ###p<0.001 เมื่อเทียบกับ D0, **p<0.01 เมื่อเทียบกับ D12 ควบคุม) กราฟแท่งแสดงปริมาณการไหลของกลูโคส 12 วันหลังการเพาะเลี้ยงในสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 สภาวะ (Ctrl, TD, MC และ MT) เมื่อเปรียบเทียบกับชิ้นหัวใจสด (D0) (n = 6 ชิ้น/กลุ่มจากหมูต่างพันธุ์ ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ###p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) กราฟแท่งแสดงปริมาณการไหลของกลูโคส 12 วันหลังการเพาะเลี้ยงในสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 สภาวะ (Ctrl, TD, MC และ MT) เมื่อเปรียบเทียบกับชิ้นหัวใจสด (D0) (n = 6 ชิ้น/กลุ่มจากหมูต่างพันธุ์ ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ###p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 และ ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl) c ฮิสโทแกรมแสดงปริมาณการไหลของกลูโคส 12 วันหลังการเพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 สภาวะ (ควบคุม, TD, MC และ MT) เปรียบเทียบกับส่วนของหัวใจสด (D0) (n = 6 ส่วนต่อกลุ่มจากหมูต่างพันธุ์ ทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ; ###p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) c 条形上显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜heart脏切 วอลล์เปเปอร์(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通量定量（n = 6 รูปภาพ/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试;###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形Image 显示 所มี 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 heart脏 切ئ 切ئ 切相比 ， 培养 后 后 12 天 的通量 定量 （n = 6 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比,***p < 0.001 ถึง D12 Ctrl 相比). c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль) c ฮิสโทแกรมแสดงปริมาณการไหลของกลูโคสในวันที่ 12 หลังการเพาะเลี้ยงสำหรับสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 สภาวะ (ควบคุม TD MC และ MT) เปรียบเทียบกับส่วนของหัวใจสด (D0) (n = 6 ส่วนต่อกลุ่ม จากหมูต่างชนิดกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบข้างเดียว ###p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0, ***p < 0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 (ควบคุม)ง กราฟการวิเคราะห์ความเครียดของเนื้อเยื่อสด (สีน้ำเงิน) MC วันที่ 12 (สีเขียว) และ MT วันที่ 12 (สีแดง) ที่จุดตัดเนื้อเยื่อตามภูมิภาค 10 จุด (n = 4 ชิ้นต่อกลุ่ม การทดสอบ ANOVA ทางเดียว ไม่มีความแตกต่างที่สำคัญระหว่างกลุ่ม) ง กราฟภูเขาไฟแสดงยีนที่แสดงออกแตกต่างกันในส่วนตัดของหัวใจสด (D0) เมื่อเปรียบเทียบกับส่วนตัดของหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะคงที่ (Ctrl) หรือภายใต้สภาวะ MT (MT) เป็นเวลา 10-12 วัน ง แผนที่ความร้อนของยีนซาร์โคเมียร์สำหรับส่วนตัดของหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงแต่ละสภาวะ แถบข้อผิดพลาดแสดงค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
การพึ่งพาการเผาผลาญจากการเปลี่ยนจากการออกซิเดชันของกรดไขมันเป็นไกลโคไลซิสเป็นลักษณะเด่นของการแยกตัวของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ เซลล์กล้ามเนื้อหัวใจที่ยังไม่เจริญเต็มที่ใช้กลูโคสเป็นหลักในการผลิต ATP และมีไมโตคอนเดรียที่ไม่สมบูรณ์พร้อมคริสตีเพียงเล็กน้อย5,32 การวิเคราะห์การใช้กลูโคสแสดงให้เห็นว่าภายใต้สภาวะ MC และ MT การใช้กลูโคสจะใกล้เคียงกับในเนื้อเยื่อวันที่ 0 (รูปที่ 4c) อย่างไรก็ตาม ตัวอย่าง Ctrl แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการใช้กลูโคสเมื่อเทียบกับเนื้อเยื่อสด ซึ่งบ่งชี้ว่าการใช้ CTCM ร่วมกับ T3/Dex ช่วยเพิ่มความสามารถในการมีชีวิตของเนื้อเยื่อและรักษาลักษณะทางการเผาผลาญของส่วนหัวใจที่เพาะเลี้ยงไว้ 12 วัน นอกจากนี้ การวิเคราะห์สายพันธุ์ยังแสดงให้เห็นว่าระดับสายพันธุ์ยังคงเท่าเดิมในเนื้อเยื่อหัวใจสดเป็นเวลา 12 วันภายใต้สภาวะ MT และ MS (รูปที่ 4d)
เพื่อวิเคราะห์ผลกระทบโดยรวมของ CTCM และ T3/Dex ต่อภูมิทัศน์การถอดรหัสทั่วโลกของเนื้อเยื่อหัวใจ เราดำเนินการ RNAseq กับเนื้อเยื่อหัวใจจากสภาพการเพาะเลี้ยงที่แตกต่างกันทั้งสี่แบบ (ข้อมูลเสริม 1) ที่น่าสนใจคือ ส่วน MT แสดงให้เห็นความคล้ายคลึงในการถอดรหัสสูงกับเนื้อเยื่อหัวใจสด โดยมียีนที่แสดงออกแตกต่างกันเพียง 16 ยีนจากทั้งหมด 13,642 ยีน อย่างไรก็ตาม ดังที่เราได้แสดงให้เห็นก่อนหน้านี้ ส่วน Ctrl แสดงยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน 1,229 ยีนหลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 10–12 วัน (รูปที่ 4e) ข้อมูลเหล่านี้ได้รับการยืนยันโดย qRT-PCR ของยีนหัวใจและไฟโบรบลาสต์ (รูปเสริม 7a-c) ที่น่าสนใจคือ ส่วน Ctrl แสดงให้เห็นการลดการควบคุมของยีนหัวใจและวงจรเซลล์ และการกระตุ้นโปรแกรมยีนที่ก่อให้เกิดการอักเสบ ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าการแยกความแตกต่างซึ่งโดยปกติเกิดขึ้นหลังจากการเพาะเลี้ยงในระยะยาวนั้นลดลงอย่างสมบูรณ์ภายใต้สภาพ MT (รูปเสริม 8a,b) การศึกษาอย่างละเอียดเกี่ยวกับยีนซาร์โคเมียร์แสดงให้เห็นว่าภายใต้สภาวะ MT เท่านั้นที่ยีนที่เข้ารหัสซาร์โคเมียร์ (รูปที่ 4f) และช่องไอออน (รูปเสริม 9) จะถูกเก็บรักษาไว้ โดยปกป้องไม่ให้ถูกกดภายใต้สภาวะ Ctrl, TD และ MC ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าด้วยการกระตุ้นทางกลและฮิวมอรัลร่วมกัน (T3/Dex) ทรานสคริปโทมของชิ้นหัวใจสามารถคงอยู่คล้ายกับชิ้นหัวใจสดได้หลังจาก 12 วันในการเพาะเลี้ยง
ผลการวิจัยการถอดรหัสเหล่านี้ได้รับการสนับสนุนจากข้อเท็จจริงที่ว่าความสมบูรณ์ของโครงสร้างของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจในส่วนของหัวใจจะคงอยู่ได้ดีที่สุดภายใต้สภาวะ MT เป็นเวลา 12 วัน ดังที่แสดงโดยคอนเน็กซิน 43 ที่อยู่ในสภาพสมบูรณ์และอยู่ในตำแหน่งเฉพาะ (รูปที่ 5a) นอกจากนี้ การเกิดพังผืดในส่วนของหัวใจภายใต้สภาวะ MT ยังลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับ Ctrl และใกล้เคียงกับส่วนของหัวใจที่เพิ่งสร้างใหม่ (รูปที่ 5b) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการผสมผสานการกระตุ้นด้วยกลไกและการรักษาด้วย T3/Dex ช่วยรักษาโครงสร้างของหัวใจในส่วนของหัวใจในการเพาะเลี้ยงได้อย่างมีประสิทธิภาพ
ภาพตัวแทนอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ของโทรโปนิน-ที (สีเขียว) คอนเน็กซิน 43 (สีแดง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) ในส่วนของหัวใจที่แยกได้ใหม่ๆ (D0) หรือเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วันในสภาวะการเพาะเลี้ยงในส่วนของหัวใจทั้งสี่ส่วน (แถบมาตราส่วน = 100 µm) การวัดความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจด้วยปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 ชิ้น/กลุ่ม (D12 TD, D12 MC และ D12 MT) จากหมูต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ####p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ *p < 0.05 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) การวัดความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจด้วยปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 ชิ้น/กลุ่ม (D12 TD, D12 MC และ D12 MT) จากหมูต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว #### p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ *p < 0.05 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 หรือ ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl) การวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจโดยใช้ปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), ส่วน/กลุ่ม 5 ส่วน (D12 TD, D12 MC และ D12 MT) จากหมูต่างชนิดกัน ทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว #### p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ *p < 0.05 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl)对不同猪的heart脏组结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切ス/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试;#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl相比).对 不同 猪 的 heart脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工 智能量 化进行 单向 单向 测试 ; ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或***p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比).การวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจโดยใช้ปัญญาประดิษฐ์ในหมูที่แตกต่างกัน (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC และ D12 MT) ส่วนต่อกลุ่ม) ด้วยการทดสอบ ANOVA ทางเดียว#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl) #### p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ *p < 0.05 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) b ภาพตัวแทนและการวัดปริมาณสำหรับชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วยการย้อม Masson's trichrome (แถบมาตราส่วน = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC) ชิ้น/กลุ่มจำนวน 9 ชิ้น (D12 MT) จากหมูต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ####p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) b ภาพตัวแทนและการวัดปริมาณสำหรับชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วยการย้อม Masson's trichrome (แถบมาตราส่วน = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC) ชิ้น/กลุ่มจำนวน 9 ชิ้น (D12 MT) จากหมูต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ####p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl) b ภาพตัวแทนและการหาปริมาณส่วนของหัวใจที่ย้อมด้วยการย้อม Masson's trichrome (แถบมาตราส่วน = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 (D12 MT) ส่วนต่อกลุ่มจากหมูต่างชนิดกัน ทำการวิเคราะห์ทางสถิติแบบทางเดียว ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) b 用Masson 三色染料染色的的代表性和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切组，进行单因素方差分析;####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 ที่ D12 Ctrl 相比). b 用 แมสสัน 三 色 染料 的 heart脏 切โฟกัส 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切โฟกัส 切lust 切lust 切lust 切ئ 切ئ 切ئ 切ע 切ע 切文 切り 切ئ 切素 切 切ئ 切ئ 切ע/组,进行单因素方差分析;####p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001,或****p < 0.0001 ถึง D12 Ctrl 相比) b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка) = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 หรือ ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl) b ภาพตัวแทนและการหาปริมาณส่วนของหัวใจที่ย้อมด้วย Masson's trichrome (แถบมาตราส่วน = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 ส่วน (D12 MT) จากหมูที่แตกต่างกัน/กลุ่ม, วิธี ANOVA หนึ่งวิธี; ####p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D0, ***p < 0.001 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl)แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
ในที่สุด ความสามารถของ CTCM ในการเลียนแบบการไฮเปอร์โทรฟีของหัวใจได้รับการประเมินโดยการเพิ่มการยืดของเนื้อเยื่อหัวใจ ใน CTCM ความดันสูงสุดในห้องอากาศเพิ่มขึ้นจาก 80 mmHg เป็น 80 mmHg (การยืดปกติ) ขึ้นเป็น 140 mmHg (รูปที่ 6a) ซึ่งสอดคล้องกับการเพิ่มขึ้นของการยืด 32% (รูปที่ 6b) ซึ่งก่อนหน้านี้แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์การยืดที่สอดคล้องกันที่จำเป็นสำหรับส่วนของหัวใจเพื่อให้ได้ความยาวซาร์โคเมียร์ที่ใกล้เคียงกับที่พบในการไฮเปอร์โทรฟี การยืดและความเร็วของเนื้อเยื่อหัวใจในระหว่างการหดตัวและการคลายตัวยังคงที่ตลอดระยะเวลา 6 วันของการเพาะเลี้ยง (รูปที่ 6c) เนื้อเยื่อหัวใจจากสภาวะ MT ถูกทำให้ยืดตามปกติ (MT (ปกติ)) หรือสภาวะที่ยืดเกิน (MT (OS)) เป็นเวลา 6 วัน หลังจากผ่านไป 4 วันในการเพาะเลี้ยง ไบโอมาร์กเกอร์ไฮเปอร์โทรฟี NT-ProBNP ก็เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในอาหารเลี้ยงเชื้อภายใต้สภาวะ MT (OS) เมื่อเทียบกับสภาวะ MT (ปกติ) (รูปที่ 7a) นอกจากนี้ หลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 6 วัน ขนาดเซลล์ใน MT (OS) (รูปที่ 7b) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับส่วนของหัวใจ MT (ปกติ) นอกจากนี้ การเคลื่อนย้ายนิวเคลียสของ NFATC4 ยังเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเนื้อเยื่อที่ยืดเกิน (รูปที่ 7c) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงการพัฒนาอย่างค่อยเป็นค่อยไปของการปรับโครงสร้างทางพยาธิวิทยาหลังจากการขยายเกิน และสนับสนุนแนวคิดที่ว่าอุปกรณ์ CTCM สามารถใช้เป็นแพลตฟอร์มเพื่อศึกษาสัญญาณการไฮเปอร์โทรฟีของหัวใจที่เกิดจากการยืด
ร่องรอยที่เป็นตัวแทนของความดันในห้องอากาศ ความดันในห้องของเหลว และการวัดการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อ ยืนยันว่าความดันในห้องเปลี่ยนแปลงความดันในห้องของเหลว ส่งผลให้ชิ้นเนื้อเยื่อเคลื่อนที่ไปพร้อมกัน b กราฟเปอร์เซ็นต์การยืดและอัตราการยืดที่เป็นตัวแทนสำหรับส่วนเนื้อเยื่อที่ยืดตามปกติ (สีส้ม) และยืดมากเกินไป (สีน้ำเงิน) c กราฟแท่งแสดงเวลาของรอบการทำงาน (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูต่างสายพันธุ์), เวลาหดตัว (n = 18-19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูต่างสายพันธุ์), เวลาผ่อนคลาย (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูต่างสายพันธุ์)) แอมพลิจูดของการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อ (n = 14 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูต่างสายพันธุ์), ความเร็วซิสโตลิกสูงสุด (n = 14 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูต่างสายพันธุ์) และอัตราการผ่อนคลายสูงสุด (n = 14 (D0), 15 (D6)) ส่วน/กลุ่ม) จากหมูต่างสายพันธุ์), การทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองหางไม่พบความแตกต่างที่สำคัญในพารามิเตอร์ใดๆ ซึ่งบ่งชี้ว่าพารามิเตอร์เหล่านี้ยังคงที่ตลอดระยะเวลา 6 วันของการเพาะเลี้ยงที่มีแรงดันไฟฟ้าเกิน แถบข้อผิดพลาดแสดงค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
กราฟแท่งแสดงปริมาณความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในอาหารเลี้ยงเชื้อจากชิ้นหัวใจที่เลี้ยงภายใต้สภาวะ MT normal stretch (Norm) หรือ overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm และ D4 MTOS) ชิ้น/กลุ่มจากหมูต่างชนิดกัน ดำเนินการ ANOVA สองทาง **p < 0.01 เมื่อเปรียบเทียบกับการยืดปกติ) กราฟแท่งแสดงปริมาณความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในอาหารเลี้ยงเชื้อจากชิ้นหัวใจที่เลี้ยงภายใต้สภาวะ MT normal stretch (Norm) หรือการยืดเกิน (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm และ D4 MTOS) ชิ้น/กลุ่มจากหมูต่างชนิดกัน ดำเนินการ ANOVA แบบสองทาง **p < 0.01 เมื่อเปรียบเทียบกับการยืดปกติ)ฮิสโทแกรมเชิงปริมาณของความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในอาหารเลี้ยงเชื้อจากชิ้นหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะของการยืดตัวของ MT ตามปกติ (norm) หรือการยืดตัวมากเกินไป (os) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm และ D4.MTOS) ชิ้น/กลุ่มจากหมูต่างชนิดกัน ดำเนินการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองปัจจัย**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 เมื่อเปรียบเทียบกับการยืดปกติ) a ในMT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的heart脏切上培养基中NT-ProBNP 浓度的条形下化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm และ D4 MTOS） คำสั่งย่อย/组，进行双向方差分析;**与正常拉伸相比，p < 0.01） ปริมาณความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในชิ้นหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้เงื่อนไขการยืดปกติของ MT (Norm) หรือการยืดเกิน (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm และ D4 MTOS) จาก 猪的切/组，可以双向方方发发动; **เมื่อเทียบกับปกติ การยืดตัว, p < 0.01)ฮิสโทแกรม การหาปริมาณความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในชิ้นหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะของการยืดตัวของ MT ปกติ (ปกติ) หรือการยืดตัวเกิน (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) และ D4 MTOS) ชิ้น/กลุ่มจากหมูต่างชนิดกัน การวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทาง**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 เมื่อเปรียบเทียบกับการยืดปกติ) b ภาพตัวแทนของชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วย troponin-T และ WGA (ซ้าย) และการวัดปริมาณขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) เซลล์/กลุ่มจาก 10 ชิ้นที่แตกต่างกันจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ t-test แบบสองหาง ****p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับการยืดปกติ) b ภาพตัวแทนของชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วย troponin-T และ WGA (ซ้าย) และการวัดปริมาณขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) เซลล์/กลุ่มจากชิ้นหัวใจ 10 ชิ้นจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ t-test แบบสองหาง ****p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับการยืดปกติ) b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ภาพตัวแทนของส่วนต่างๆ ของหัวใจที่ย้อมด้วยโทรโปนินทีและ AZP (ซ้าย) และการวัดปริมาณขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) เซลล์/กลุ่มจาก 10 ส่วนที่แตกต่างกันจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ t แบบสองหางของ Student; ****p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับสายพันธุ์ปกติ) b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大右量化（右）染色的heart脏切的代表性代表性代表性代表性代表性代表性代不同猪的10 ดาวน์โหลด 369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验;与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b ภาพตัวแทนของชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วย calcarein-T และ WGA (ซ้าย) และขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 จาก 10 ชิ้นที่แตกต่างกัน (D6 MTNorm)) ทดสอบเซลล์/เนื้อเยื่อหัวใจผิดปกติสองชนิด t เมื่อเปรียบเทียบกับการยืดปกติ ****p < 0.0001) b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) หรือ 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние นักเขียน Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ภาพตัวแทนของส่วนต่างๆ ของหัวใจที่ย้อมด้วยโทรโปนินทีและ AZP (ซ้าย) และการวัดปริมาณขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) จาก 10 ส่วนที่แตกต่างกันจากหมูที่แตกต่างกัน) เซลล์ต่อกลุ่ม เกณฑ์สองหาง t ของนักเรียน; ****p < 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับสายพันธุ์ปกติ) c ภาพตัวแทนของชิ้นหัวใจ MTOS ของวันที่ 0 และวันที่ 6 ที่มีฉลากภูมิคุ้มกันสำหรับโทรโปนินทีและ NFATC4 และการวัดปริมาณการเคลื่อนย้ายของ NFATC4 ไปยังนิวเคลียสของ CM (n = 4 (D0), ชิ้นหัวใจ MTOS 3 ชิ้น (D6) ต่อกลุ่มจากหมูต่างชนิดกัน ดำเนินการทดสอบ t-test แบบสองหางของนักเรียน *p < 0.05) c ภาพตัวแทนสำหรับชิ้นหัวใจ MTOS ของวันที่ 0 และวันที่ 6 ที่มีฉลากภูมิคุ้มกันสำหรับโทรโปนินทีและ NFATC4 และการวัดปริมาณการเคลื่อนย้ายของ NFATC4 ไปยังนิวเคลียสของ CMs (n = 4 (D0), 3 ชิ้น (D6 MTOS) ต่อกลุ่มจากหมูต่างชนิดกัน ดำเนินการทดสอบ t-test แบบสองหางของนักเรียน *p < 0.05) c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонинина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *พี < 0,05) c ภาพตัวแทนของส่วนตัดของหัวใจในวันที่ 0 และ 6 ของ MTOS ที่มีการติดฉลากภูมิคุ้มกันสำหรับโทรโปนินทีและ NFATC4 และการวัดปริมาณการเคลื่อนย้าย NFATC4 ในนิวเคลียสของเซลล์โพรง (n = 4 (D0), 3 ชิ้น (D6 MTOS) ต่อกลุ่มจากหมูต่างชนิดกัน) ทำการทดสอบ t แบบสองหางของ Student; *p < 0.05) c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS heart脏切上的代表性以及来自不同猪的NFATC4易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0),3 (D6 MTOS) 切ע/组, 进行双尾学生t 检验;*p < 0.05)。 c ภาพตัวแทนของ calcanin-T และ NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS ชิ้นหัวใจ และ NFATC4 จาก NFATC4 ที่แตกต่างกัน 易位至CM นิวเคลียสของเซลล์ 的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影;*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *พี < 0,05) c ภาพตัวแทนของชิ้นหัวใจ MTOS ในวันที่ 0 และ 6 สำหรับการติดฉลากภูมิคุ้มกันโทรโปนิน-T และ NFATC4 และการวัดปริมาณการเคลื่อนย้าย NFATC4 ในนิวเคลียสของ CM จากหมูที่แตกต่างกัน (n = 4 (D0), 3 ชิ้น (D6 MTOS) ต่อกลุ่ม เกณฑ์ t สองหางของนักเรียน; *p < 0.05)แถบข้อผิดพลาดแสดงค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
งานวิจัยด้านระบบหัวใจและหลอดเลือดแบบแปลผลต้องใช้แบบจำลองเซลล์ที่จำลองสภาพแวดล้อมของหัวใจได้อย่างแม่นยำ ในการศึกษานี้ ได้มีการพัฒนาและกำหนดลักษณะอุปกรณ์ CTCM ที่สามารถกระตุ้นส่วนที่บางมากของหัวใจได้ ระบบ CTCM ประกอบด้วยการกระตุ้นด้วยไฟฟ้ากลที่ซิงโครไนซ์ทางสรีรวิทยาและการเสริมด้วยของเหลว T3 และ Dex เมื่อส่วนหัวใจของสุกรได้รับปัจจัยเหล่านี้ ความสามารถในการดำรงชีวิต ความสมบูรณ์ของโครงสร้าง กิจกรรมการเผาผลาญ และการแสดงออกทางการถอดรหัสจะยังคงเหมือนเดิมกับเนื้อเยื่อหัวใจสดหลังจากการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน นอกจากนี้ การยืดเนื้อเยื่อหัวใจมากเกินไปอาจทำให้หัวใจโตเนื่องจากยืดเกิน โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนบทบาทสำคัญของสภาวะการเพาะเลี้ยงทางสรีรวิทยาในการรักษาฟีโนไทป์ของหัวใจปกติ และจัดเตรียมแพลตฟอร์มสำหรับการคัดกรองยา
ปัจจัยหลายประการมีส่วนช่วยในการสร้างสภาพแวดล้อมที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการทำงานและการอยู่รอดของกล้ามเนื้อหัวใจ ปัจจัยที่เห็นได้ชัดที่สุดเกี่ยวข้องกับ (1) ปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ (2) การกระตุ้นด้วยไฟฟ้ากล (3) ปัจจัยฮิวมอรัล และ (4) สารตั้งต้นของการเผาผลาญ ปฏิสัมพันธ์ทางสรีรวิทยาระหว่างเซลล์ต้องใช้เครือข่ายสามมิติที่ซับซ้อนของเซลล์หลายประเภทที่รองรับด้วยเมทริกซ์นอกเซลล์ ปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ที่ซับซ้อนดังกล่าวนั้นยากที่จะสร้างขึ้นใหม่ในหลอดทดลองโดยการเพาะเลี้ยงเซลล์แต่ละประเภทร่วมกัน แต่สามารถทำได้ง่ายโดยใช้ลักษณะออร์แกนิกของส่วนต่างๆ ของหัวใจ
การยืดกล้ามเนื้อหัวใจด้วยกลไกและการกระตุ้นไฟฟ้ามีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการรักษาฟีโนไทป์ของหัวใจ33,34,35 แม้ว่าการกระตุ้นด้วยกลไกจะถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการปรับสภาพและการทำให้สุกของ hiPSC-CM แต่การศึกษาที่มีความซับซ้อนหลายชิ้นได้พยายามใช้การกระตุ้นด้วยกลไกของชิ้นเนื้อหัวใจในการเพาะเลี้ยงโดยใช้แรงกดแกนเดียว การศึกษาเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าแรงกดเชิงกลแกนเดียวแบบ 2 มิติมีผลในเชิงบวกต่อฟีโนไทป์ของหัวใจในระหว่างการเพาะเลี้ยง ในการศึกษาเหล่านี้ ส่วนต่างๆ ของหัวใจได้รับการโหลดด้วยแรงดึงแบบไอโซเมตริก17 แรงกดแบบออโซโทนิกเชิงเส้น18 หรือวงจรของหัวใจถูกสร้างขึ้นใหม่โดยใช้การตอบรับของตัวแปลงแรงและแรงขับเคลื่อนของแรงดึง อย่างไรก็ตาม วิธีการเหล่านี้ใช้การยืดเนื้อเยื่อแบบแกนเดียวโดยไม่มีการปรับให้เหมาะสมในสภาพแวดล้อม ส่งผลให้ยีนของหัวใจจำนวนมากถูกระงับหรือยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองการยืดที่ผิดปกติแสดงออกมากเกินไป CTCM ที่อธิบายไว้ที่นี่ให้การกระตุ้นทางไฟฟ้ากล 3 มิติที่เลียนแบบรอบการเต้นของหัวใจตามธรรมชาติในแง่ของเวลาของรอบและการยืดตัวทางสรีรวิทยา (การยืดตัว 25%, ซิสโทล 40%, ไดแอสโทล 60% และ 72 ครั้งต่อนาที) แม้ว่าการกระตุ้นทางกล 3 มิติเพียงอย่างเดียวนี้จะไม่เพียงพอที่จะรักษาความสมบูรณ์ของเนื้อเยื่อ แต่จำเป็นต้องใช้การกระตุ้นทางของเหลวและทางกลร่วมกันโดยใช้ T3/Dex เพื่อรักษาความสามารถในการมีชีวิต การทำงาน และความสมบูรณ์ของเนื้อเยื่ออย่างเหมาะสม
ปัจจัยฮิวมอรัลมีบทบาทสำคัญในการปรับเปลี่ยนฟีโนไทป์ของหัวใจผู้ใหญ่ ซึ่งเน้นย้ำถึงเรื่องนี้ในการศึกษา HiPS-CM โดยที่ T3 และ Dex ถูกเติมลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อเร่งการเจริญเติบโตของเซลล์ T3 อาจส่งผลต่อการขนส่งกรดอะมิโน น้ำตาล และแคลเซียมผ่านเยื่อหุ้มเซลล์36 นอกจากนี้ T3 ยังส่งเสริมการแสดงออกของ MHC-α และการลดการแสดงออกของ MHC-β ซึ่งส่งเสริมการสร้างไมโอไฟบริลแบบกระตุกเร็วในคาร์ดิโอไมโอไซต์ที่โตเต็มที่เมื่อเปรียบเทียบกับไมโอไฟบริลแบบกระตุกช้าใน CM ของทารกในครรภ์ การขาด T3 ในผู้ป่วยที่มีภาวะไทรอยด์ทำงานน้อยส่งผลให้แถบไมโอไฟบริลหายไปและอัตราการพัฒนาโทนลดลง37 Dex ออกฤทธิ์ต่อตัวรับกลูโคคอร์ติคอยด์และได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเพิ่มการหดตัวของกล้ามเนื้อหัวใจในหัวใจที่ได้รับเลือดไหลเวียนเพียงส่วนเดียว38 การปรับปรุงนี้เชื่อว่าเกี่ยวข้องกับผลกระทบต่อการเข้า-ออกที่ขับเคลื่อนด้วยแคลเซียม (SOCE)39,40 นอกจากนี้ Dex ยังจับกับตัวรับ ทำให้เกิดการตอบสนองภายในเซลล์ในวงกว้างซึ่งระงับการทำงานของภูมิคุ้มกันและการอักเสบ30
ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่าการกระตุ้นทางกลทางกายภาพ (MS) ช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพการเพาะเลี้ยงโดยรวมเมื่อเทียบกับ Ctrl แต่ไม่สามารถรักษาความสามารถในการมีชีวิต ความสมบูรณ์ของโครงสร้าง และการแสดงออกของหัวใจได้นานกว่า 12 วันในการเพาะเลี้ยง เมื่อเปรียบเทียบกับ Ctrl การเติม T3 และ Dex ลงในวัฒนธรรม CTCM (MT) ช่วยปรับปรุงความสามารถในการมีชีวิต และรักษาโปรไฟล์การถอดรหัส ความสมบูรณ์ของโครงสร้าง และกิจกรรมการเผาผลาญที่คล้ายคลึงกันด้วยเนื้อเยื่อหัวใจสดเป็นเวลา 12 วัน นอกจากนี้ ด้วยการควบคุมระดับการยืดตัวของเนื้อเยื่อ จึงได้สร้างแบบจำลองการไฮเปอร์โทรฟีของหัวใจที่เหนี่ยวนำให้มีการยืดตัวมากเกินไปโดยใช้ STCM ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความคล่องตัวของระบบ STCM ควรสังเกตว่าแม้ว่าการปรับโครงสร้างหัวใจและการเกิดพังผืดมักจะเกี่ยวข้องกับอวัยวะที่สมบูรณ์ซึ่งเซลล์ที่หมุนเวียนสามารถให้ไซโตไคน์ที่เหมาะสม ตลอดจนการจับกินและปัจจัยการปรับโครงสร้างอื่นๆ แต่ส่วนต่างๆ ของหัวใจยังคงเลียนแบบกระบวนการเกิดพังผืดได้เพื่อตอบสนองต่อความเครียดและการบาดเจ็บ เข้าไปในไมโอไฟโบรบลาสต์ ซึ่งก่อนหน้านี้ได้มีการประเมินในแบบจำลองชิ้นหัวใจนี้แล้ว ควรสังเกตว่าพารามิเตอร์ CTCM สามารถปรับเปลี่ยนได้โดยการเปลี่ยนแรงดัน/แอมพลิจูดไฟฟ้าและความถี่เพื่อจำลองสภาวะต่างๆ เช่น หัวใจเต้นเร็ว หัวใจเต้นช้า และการสนับสนุนการไหลเวียนของโลหิตทางกล (หัวใจที่ไม่มีภาระทางกล) ซึ่งทำให้ระบบนี้เป็นสื่อกลางสำหรับการทดสอบยา ความสามารถของ CTCM ในการจำลองภาวะหัวใจโตที่เกิดจากการออกแรงมากเกินไปนั้นช่วยปูทางไปสู่การทดสอบระบบนี้สำหรับการบำบัดแบบเฉพาะบุคคล สรุปได้ว่า การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าการยืดด้วยกลไกและการกระตุ้นด้วยของเหลวมีความสำคัญต่อการรักษาการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจ
แม้ว่าข้อมูลที่นำเสนอที่นี่จะแนะนำว่า CTCM เป็นแพลตฟอร์มที่มีแนวโน้มดีมากสำหรับการสร้างแบบจำลองกล้ามเนื้อหัวใจที่สมบูรณ์ แต่วิธีการเพาะเลี้ยงนี้ก็มีข้อจำกัดบางประการ ข้อจำกัดหลักของการเพาะเลี้ยง CTCM คือการที่มันสร้างความเครียดเชิงกลแบบไดนามิกอย่างต่อเนื่องบนชิ้นเนื้อ ซึ่งทำให้ไม่สามารถตรวจสอบการหดตัวของชิ้นเนื้อหัวใจในแต่ละรอบได้อย่างแข็งขัน นอกจากนี้ เนื่องจากชิ้นส่วนหัวใจมีขนาดเล็ก (7 มม.) ความสามารถในการประเมินการทำงานของซิสโตลิกนอกระบบเพาะเลี้ยงโดยใช้เซ็นเซอร์แรงแบบดั้งเดิมจึงมีจำกัด ในต้นฉบับปัจจุบัน เราเอาชนะข้อจำกัดนี้บางส่วนโดยการประเมินแรงดันไฟฟ้าแสงเป็นตัวบ่งชี้การทำงานของการหดตัว อย่างไรก็ตาม ข้อจำกัดนี้จะต้องมีการทำงานเพิ่มเติมและอาจได้รับการแก้ไขในอนาคตโดยการแนะนำวิธีการสำหรับการตรวจสอบการทำงานของชิ้นเนื้อหัวใจในการเพาะเลี้ยงด้วยแสง เช่น การทำแผนที่แสงโดยใช้แคลเซียมและสีย้อมที่ไวต่อแรงดันไฟฟ้า ข้อจำกัดอีกประการหนึ่งของ CTCM คือแบบจำลองการทำงานไม่ได้ควบคุมความเครียดทางสรีรวิทยา (โหลดล่วงหน้าและโหลดภายหลัง) ใน CTCM แรงดันถูกเหนี่ยวนำในทิศทางตรงข้ามเพื่อสร้างการยืดตัวทางสรีรวิทยา 25% ในช่วงไดแอสโทล (ยืดเต็มที่) และซิสโทล (ความยาวของการหดตัวในระหว่างการกระตุ้นด้วยไฟฟ้า) ในเนื้อเยื่อขนาดใหญ่มาก ข้อจำกัดนี้ควรได้รับการขจัดออกไปในการออกแบบ CTCM ในอนาคตโดยการใช้แรงดันที่เหมาะสมกับเนื้อเยื่อหัวใจจากทั้งสองด้านและโดยการใช้ความสัมพันธ์ระหว่างแรงดันและปริมาตรที่แน่นอนที่เกิดขึ้นในห้องหัวใจ
การปรับเปลี่ยนโครงสร้างที่เกิดจากการยืดเกินที่รายงานในต้นฉบับนี้จำกัดอยู่เพียงการเลียนแบบสัญญาณการยืดเกินเท่านั้น ดังนั้น โมเดลนี้จึงสามารถช่วยในการศึกษาสัญญาณการยืดเกินที่เกิดจากการยืดได้โดยไม่ต้องใช้ปัจจัยฮิวมอรัลหรือนิวรอน (ซึ่งไม่มีอยู่ในระบบนี้) จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อเพิ่มความหลากหลายของ CTCM เช่น การเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ภูมิคุ้มกัน ปัจจัยฮิวมอรัลในพลาสมาที่ไหลเวียน และการสร้างเส้นประสาทเมื่อการเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ประสาทจะช่วยเพิ่มความเป็นไปได้ของการสร้างแบบจำลองโรคด้วย CTCM
ในการศึกษาครั้งนี้ใช้หมู 13 ตัว ขั้นตอนการทำหัตถการกับสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางของสถาบันและได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของสถาบันมหาวิทยาลัยหลุยส์วิลล์ ทำการหนีบส่วนโค้งของหลอดเลือดแดงใหญ่ และฉีดสารคาร์ดิโอเพลเจียปลอดเชื้อ 1 ลิตร (NaCl 110 มิลลิโมลาร์, CaCl2 1.2 มิลลิโมลาร์, KCl 16 มิลลิโมลาร์, MgCl2 16 มิลลิโมลาร์, NaHCO3 10 มิลลิโมลาร์, เฮปาริน 5 หน่วยต่อมิลลิลิตร, pH สูงถึง 7.4) เข้าไปยังหัวใจ หัวใจถูกเก็บรักษาในสารละลายหัวใจที่เย็นจัดจนกระทั่งนำส่งไปยังห้องปฏิบัติการด้วยน้ำแข็ง ซึ่งโดยปกติจะใช้เวลาน้อยกว่า 10 นาที หัวใจถูกเก็บรักษาในสารละลายหัวใจที่เย็นจัดจนกระทั่งนำส่งไปยังห้องปฏิบัติการด้วยน้ำแข็ง ซึ่งโดยปกติจะใช้เวลาน้อยกว่า 10 นาที сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 นาที หัวใจถูกเก็บไว้ในสารละลายหัวใจที่เย็นจัดจนกว่าจะขนส่งไปยังห้องปฏิบัติการด้วยน้ำแข็ง ซึ่งโดยปกติจะใช้เวลาไม่เกิน 10 นาที将heart脏保存在冰冷的heart脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将heart脏保存在冰冷的heart脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 นาที. ให้หัวใจอยู่ในน้ำแข็งจนกว่าจะนำส่งห้องปฏิบัติการด้วยน้ำแข็ง ซึ่งโดยปกติจะใช้เวลาไม่เกิน 10 นาที
อุปกรณ์ CTCM ได้รับการพัฒนาในซอฟต์แวร์การออกแบบด้วยคอมพิวเตอร์ช่วย (CAD) ของ SolidWorks ห้องเพาะเลี้ยง ตัวแบ่ง และห้องอากาศทำจากพลาสติกอะคริลิกใส CNC วงแหวนสำรองขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 7 มม. ทำจากโพลีเอทิลีนความหนาแน่นสูง (HDPE) ตรงกลางและมีร่องโอริงเพื่อรองรับโอริงซิลิโคนที่ใช้ปิดผนึกสื่อด้านล่าง เมมเบรนซิลิกาบางแยกห้องเพาะเลี้ยงออกจากแผ่นแยก เมมเบรนซิลิโคนตัดด้วยเลเซอร์จากแผ่นซิลิโคนหนา 0.02 นิ้ว และมีความแข็ง 35A ปะเก็นซิลิโคนด้านล่างและด้านบนตัดด้วยเลเซอร์จากแผ่นซิลิโคนหนา 1/16 นิ้ว และมีความแข็ง 50A สกรูและน็อตปีกสเตนเลส 316L ใช้สำหรับยึดบล็อกและสร้างซีลกันอากาศ
แผงวงจรพิมพ์เฉพาะ (PCB) ได้รับการออกแบบมาให้บูรณาการกับระบบ C-PACE-EM ได้ ขั้วต่อเครื่องสวิสบน PCB เชื่อมต่อกับอิเล็กโทรดกราไฟต์ด้วยสายทองแดงชุบเงินและสกรูบรอนซ์ 0-60 ที่ขันเข้ากับอิเล็กโทรด แผงวงจรพิมพ์วางอยู่บนฝาครอบของเครื่องพิมพ์ 3 มิติ
อุปกรณ์ CTCM ถูกควบคุมโดยตัวกระตุ้นลมแบบตั้งโปรแกรมได้ (PPD) ซึ่งสร้างแรงดันการไหลเวียนที่ควบคุมได้คล้ายกับวงจรการเต้นของหัวใจ เมื่อแรงดันภายในช่องอากาศเพิ่มขึ้น เมมเบรนซิลิโคนที่ยืดหยุ่นได้จะขยายตัวขึ้นด้านบน ทำให้ตัวกลางอยู่ใต้บริเวณเนื้อเยื่อ จากนั้นพื้นที่ของเนื้อเยื่อจะถูกยืดออกโดยการขับของเหลวออก ซึ่งเลียนแบบการขยายตัวทางสรีรวิทยาของหัวใจในช่วงไดแอสโทล เมื่อถึงจุดสูงสุดของการผ่อนคลาย การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าจะถูกใช้ผ่านอิเล็กโทรดกราไฟต์ ซึ่งจะลดแรงดันในห้องอากาศและทำให้เนื้อเยื่อหดตัว ภายในท่อมีวาล์วห้ามเลือดพร้อมเซ็นเซอร์วัดแรงดันเพื่อตรวจจับแรงดันในระบบอากาศ แรงดันที่เซ็นเซอร์วัดแรงดันรับรู้จะถูกนำไปใช้กับตัวรวบรวมข้อมูลที่เชื่อมต่อกับแล็ปท็อป ซึ่งช่วยให้สามารถตรวจสอบแรงดันภายในห้องแก๊สได้อย่างต่อเนื่อง เมื่อถึงความดันห้องสูงสุด (มาตรฐาน 80 mmHg, OS 140 mmHg) อุปกรณ์รวบรวมข้อมูลจะได้รับคำสั่งให้ส่งสัญญาณไปยังระบบ C-PACE-EM เพื่อสร้างสัญญาณแรงดันไฟฟ้าแบบสองเฟสเป็นเวลา 2 มิลลิวินาที โดยตั้งค่าไว้ที่ 4 V
ไทย ได้ทำการตัดส่วนของหัวใจและทำการเพาะเลี้ยงใน 6 หลุมดังนี้ ย้ายหัวใจที่เก็บมาจากภาชนะถ่ายโอนไปยังถาดที่มี cardioplegia เย็น (4°C) แยกหัวใจห้องล่างซ้ายด้วยใบมีดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วตัดเป็นชิ้นขนาด 1-2 cm3 ยึดบล็อกเนื้อเยื่อเหล่านี้กับตัวรองรับเนื้อเยื่อด้วยกาวเนื้อเยื่อและวางไว้ในอ่างเนื้อเยื่อไมโครโทมแบบสั่นสะเทือนที่มีสารละลาย Tyrode และเติมออกซิเจนอย่างต่อเนื่อง (2,3-butanedione monooxime (BDM) 3 g/L, NaCl 140 mM (8.18 g) . ), KCl 6 mM (0.447 g), D-glucose 10 mM (1.86 g), HEPES 10 mM (2.38 g), MgCl2 1 mM (สารละลาย 1 มล. 1 M), CaCl2 1.8 mM (สารละลาย 1.8 มล. 1 M) สูงสุด 1 L ddH2O) ไมโครโทมแบบสั่นสะเทือนถูกตั้งค่าให้ตัดชิ้นเนื้อหนา 300 µm ที่ความถี่ 80 Hz แอมพลิจูดการสั่นในแนวนอน 2 มม. และอัตราการเลื่อนล่วงหน้า 0.03 มม./วินาที อ่างเนื้อเยื่อถูกล้อมรอบด้วยน้ำแข็งเพื่อรักษาความเย็นของสารละลาย และรักษาอุณหภูมิไว้ที่ 4°C ย้ายชิ้นเนื้อจากอ่างไมโครโทมไปยังอ่างบ่มเพาะที่มีสารละลายไทโรดที่มีออกซิเจนอย่างต่อเนื่องบนน้ำแข็งจนกว่าจะได้ชิ้นเนื้อเพียงพอสำหรับเพลตเพาะเลี้ยงหนึ่งแผ่น สำหรับการเพาะเลี้ยงแบบทรานส์เวลล์ ชิ้นเนื้อจะถูกยึดกับตัวรองรับโพลียูรีเทนกว้าง 6 มม. ที่ปลอดเชื้อและวางในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ปรับให้เหมาะสม 6 มล. (อาหารเลี้ยงเชื้อ 199, อาหารเสริม ITS 1x, FBS 10%, VEGF 5 ng/ml, FGF-ด่าง 10 ng/ml และยาปฏิชีวนะ-ยาต้านเชื้อรา 2X) การกระตุ้นด้วยไฟฟ้า (10 V, ความถี่ 1.2 Hz) ถูกนำมาใช้กับชิ้นเนื้อผ่าน C-Pace สำหรับเงื่อนไข TD จะมีการเติม T3 และ Dex ใหม่ในอัตรา 100 nM และ 1 μM ในการเปลี่ยนตัวกลางแต่ละครั้ง จากนั้นจึงทำให้ตัวกลางอิ่มตัวด้วยออกซิเจนก่อนเปลี่ยนใหม่ 3 ครั้งต่อวัน เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อบางส่วนในตู้ฟักที่อุณหภูมิ 37°C และ CO2 5%
สำหรับการเพาะเลี้ยง CTCM ส่วนเนื้อเยื่อจะถูกวางบนเครื่องพิมพ์ 3 มิติที่ทำขึ้นเองในจานเพาะเชื้อที่มีสารละลาย Tyrode ที่ดัดแปลง อุปกรณ์นี้ได้รับการออกแบบมาให้เพิ่มขนาดของชิ้นส่วนของหัวใจขึ้น 25% ของพื้นที่วงแหวนรองรับ การทำเช่นนี้จะทำให้ส่วนของหัวใจไม่ยืดออกหลังจากถ่ายโอนจากสารละลาย Tyrode ไปยังตัวกลางและในช่วงไดแอสโทล โดยใช้กาวฮิสโตอะครีลิก ชิ้นส่วนที่มีความหนา 300 µm จะถูกยึดไว้กับวงแหวนรองรับที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 7 มม. หลังจากติดส่วนเนื้อเยื่อเข้ากับวงแหวนรองรับแล้ว ให้ตัดส่วนเนื้อเยื่อส่วนเกินออก แล้วนำส่วนเนื้อเยื่อที่ติดกลับเข้าไปในอ่างสารละลาย Tyrode บนน้ำแข็ง (4°C) จนกว่าจะเตรียมส่วนต่างๆ เพียงพอสำหรับอุปกรณ์หนึ่งชิ้น เวลาประมวลผลรวมสำหรับอุปกรณ์ทั้งหมดไม่ควรเกิน 2 ชั่วโมง หลังจากติดส่วนเนื้อเยื่อ 6 ส่วนเข้ากับวงแหวนรองรับแล้ว จึงประกอบอุปกรณ์ CTCM ห้องเพาะเลี้ยง CTCM จะถูกเติมด้วยตัวกลางที่มีออกซิเจนไว้ล่วงหน้า 21 มล. ย้ายส่วนเนื้อเยื่อไปยังห้องเพาะเลี้ยงและเอาฟองอากาศออกอย่างระมัดระวังด้วยปิเปต จากนั้นนำส่วนเนื้อเยื่อเข้าไปในรูและกดเข้าที่เบาๆ สุดท้ายวางฝาอิเล็กโทรดบนอุปกรณ์และย้ายอุปกรณ์ไปยังตู้ฟัก จากนั้นเชื่อมต่อ CTCM เข้ากับท่ออากาศและระบบ C-PACE-EM ตัวกระตุ้นลมจะเปิดขึ้นและวาล์วอากาศจะเปิด CTCM ระบบ C-PACE-EM ได้รับการกำหนดค่าให้ส่ง 4 V ที่ 1.2 Hz ระหว่างการกระตุ้นแบบสองเฟสเป็นเวลา 2 มิลลิวินาที เปลี่ยนตัวกลางวันละสองครั้งและเปลี่ยนอิเล็กโทรดวันละครั้งเพื่อหลีกเลี่ยงการสะสมของกราไฟต์บนอิเล็กโทรด หากจำเป็น สามารถถอดส่วนเนื้อเยื่อออกจากหลุมเพาะเลี้ยงเพื่อไล่ฟองอากาศที่อาจตกลงมาใต้ส่วนเนื้อเยื่อ สำหรับเงื่อนไขการบำบัดด้วย MT จะเติม T3/Dex ใหม่ทุกครั้งที่เปลี่ยนตัวกลางด้วย T3 100 nM และ Dex 1 μM อุปกรณ์ CTCM ได้รับการเพาะเลี้ยงในตู้ฟักที่อุณหภูมิ 37°C และ CO2 5%
เพื่อให้ได้เส้นทางที่ยืดออกของชิ้นหัวใจ จึงได้มีการพัฒนาระบบกล้องพิเศษ โดยใช้กล้อง SLR (Canon Rebel T7i, Canon, โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) ร่วมกับเลนส์มาโคร Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, ซานฟรานซิสโก รัฐแคลิฟอร์เนีย) การสร้างภาพจะดำเนินการที่อุณหภูมิห้องหลังจากเปลี่ยนสื่อเป็นสื่อใหม่ กล้องจะวางในมุม 51° และบันทึกวิดีโอด้วยความเร็ว 30 เฟรมต่อวินาที ขั้นแรก ใช้ซอฟต์แวร์โอเพ่นซอร์ส (MUSCLEMOTION43) กับ Image-J เพื่อวัดการเคลื่อนไหวของชิ้นหัวใจ มาสก์ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ MATLAB (MathWorks, Natick, MA, สหรัฐอเมริกา) เพื่อกำหนดบริเวณที่น่าสนใจสำหรับชิ้นหัวใจที่เต้นเพื่อหลีกเลี่ยงสัญญาณรบกวน มาสก์ที่แบ่งส่วนด้วยตนเองจะถูกนำไปใช้กับภาพทั้งหมดในลำดับเฟรม จากนั้นจึงส่งต่อไปยังปลั๊กอิน MUSCLEMOTION Muscle Motion จะใช้ความเข้มเฉลี่ยของพิกเซลในแต่ละเฟรมเพื่อวัดการเคลื่อนไหวของภาพเทียบกับเฟรมอ้างอิง ข้อมูลได้รับการบันทึก กรอง และนำไปใช้เพื่อวัดปริมาณเวลาของรอบการทำงานและประเมินการยืดตัวของเนื้อเยื่อระหว่างรอบการทำงานของหัวใจ วิดีโอที่บันทึกได้รับการประมวลผลภายหลังโดยใช้ตัวกรองดิจิทัลเฟสศูนย์ลำดับที่หนึ่ง เพื่อวัดปริมาณการยืดตัวของเนื้อเยื่อ (จุดสูงสุดถึงจุดสูงสุด) จะทำการวิเคราะห์จุดสูงสุดถึงจุดสูงสุดเพื่อแยกแยะระหว่างจุดสูงสุดและจุดต่ำสุดในสัญญาณที่บันทึก นอกจากนี้ ยังดำเนินการดีเทรนด์โดยใช้พหุนามลำดับที่ 6 เพื่อขจัดการดริฟต์ของสัญญาณ โค้ดโปรแกรมได้รับการพัฒนาใน MATLAB เพื่อกำหนดการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อโดยรวม เวลาของรอบการทำงาน เวลาผ่อนคลาย และเวลาหดตัว (โค้ดโปรแกรมเสริม 44)
สำหรับการวิเคราะห์ความเครียด โดยใช้วิดีโอเดียวกันที่สร้างขึ้นสำหรับการประเมินการยืดเชิงกล ก่อนอื่น เราจะติดตามภาพสองภาพที่แสดงถึงจุดสูงสุดของการเคลื่อนไหว (จุดการเคลื่อนไหวที่สูงที่สุด (ด้านบน) และต่ำสุด (ด้านล่าง)) ตามซอฟต์แวร์ MUSCLEMOTION จากนั้น เราจะแบ่งส่วนเนื้อเยื่อและใช้อัลกอริทึมการแรเงากับเนื้อเยื่อที่แบ่งส่วน (รูปเสริม 2a) จากนั้น เนื้อเยื่อที่แบ่งส่วนจะถูกแบ่งออกเป็น 10 ส่วนใต้ผิว และจะคำนวณความเครียดบนพื้นผิวแต่ละส่วนโดยใช้สมการต่อไปนี้: ความเครียด = (Sup-Sdown)/Sdown โดยที่ Sup และ Sdown คือระยะห่างของรูปร่างจากเงาบนและล่างของผ้าตามลำดับ (รูปเสริม .2b)
ส่วนหัวใจถูกตรึงในพาราฟอร์มาลดีไฮด์ 4% เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เนื้อเยื่อที่ตรึงไว้ถูกทำให้แห้งในซูโครส 10% และ 20% เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นในซูโครส 30% ค้างคืน จากนั้นฝังส่วนต่างๆ ในสารประกอบอุณหภูมิการตัดที่เหมาะสม (สารประกอบ OCT) และค่อยๆ แช่แข็งในอ่างไอโซเพนเทน/น้ำแข็งแห้ง เก็บบล็อกฝัง OCT ไว้ที่ -80 °C จนกว่าจะแยกออกจากกัน เตรียมสไลด์เป็นส่วนๆ โดยให้มีความหนา 8 μm
ในการนำ OCT ออกจากส่วนของหัวใจ ให้ทำการอุ่นสไลด์บนแท่นทำความร้อนที่อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที เติม PBS 1 มล. ในแต่ละสไลด์ แล้วฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นจึงทำให้สไลด์ซึมผ่านโดยตั้ง Triton-X 0.1% ใน PBS เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เพื่อป้องกันไม่ให้แอนติบอดีที่ไม่จำเพาะจับกับตัวอย่าง ให้เติมสารละลาย BSA 3% 1 มล. ลงในสไลด์ แล้วฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นจึงนำ BSA ออก และล้างสไลด์ด้วย PBS ทำเครื่องหมายแต่ละตัวอย่างด้วยดินสอ เติมแอนติบอดีปฐมภูมิ (เจือจาง 1:200 ใน BSA 1%) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) และ troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) เป็นเวลา 90 นาที จากนั้นจึงเติมแอนติบอดีทุติยภูมิ (เจือจาง 1:200 ใน BSA 1%) ต่อต้าน Alexa Fluor 488 ของเมาส์ (Thermo Scientific; #A16079) ต่อต้าน Alexa Fluor 594 ของกระต่าย (Thermo Scientific; #T6391) เป็นเวลาเพิ่มเติม 90 นาที ล้างด้วย PBS 3 ครั้ง เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างการย้อมเป้าหมายกับพื้นหลัง เราใช้เฉพาะแอนติบอดีทุติยภูมิเป็นตัวควบคุม ในที่สุด จึงเติมสีย้อมนิวเคลียร์ DAPI และวางสไลด์ไว้ในเวคตาชิลด์ (Vector Laboratories) แล้วปิดผนึกด้วยน้ำยาทาเล็บ กำลังขยาย -x) และกล้องจุลทรรศน์ Keyence ที่กำลังขยาย 40 เท่า
ใช้ WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ที่ความเข้มข้น 5 μg/ml ใน PBS สำหรับการย้อม WGA และทาลงบนส่วนที่ตรึงไว้เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นล้างสไลด์ด้วย PBS และเติม Sudan black ในแต่ละสไลด์และฟักเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นล้างสไลด์ด้วย PBS และเติมตัวกลางฝัง Vectashield สไลด์ถูกมองเห็นด้วยกล้องจุลทรรศน์ Keyence ที่กำลังขยาย 40 เท่า
OCT ถูกเอาออกจากตัวอย่างตามที่อธิบายไว้ข้างต้น หลังจากเอา OCT ออกแล้ว ให้จุ่มสไลด์ในสารละลาย Bouin ข้ามคืน จากนั้นล้างสไลด์ด้วยน้ำกลั่นเป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วจึงนำไปใส่ในสารละลาย Bibrich Aloe Acid Fuchsin เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นล้างสไลด์ด้วยน้ำกลั่น แล้วนำไปใส่ในสารละลายฟอสโฟโมลิบดีนัม 5% และกรดฟอสโฟทังสติก 5% เป็นเวลา 10 นาที โดยไม่ต้องล้าง ให้ย้ายสไลด์ลงในสารละลายอะนิลีนบลูโดยตรงเป็นเวลา 15 นาที จากนั้นล้างสไลด์ด้วยน้ำกลั่น แล้วนำไปใส่ในสารละลายกรดอะซิติก 1% เป็นเวลา 2 นาที สไลด์ถูกทำให้แห้งในเอธานอล 200 N แล้วถ่ายโอนไปยังไซลีน สไลด์ที่ย้อมสีแล้วจะถูกมองเห็นโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Keyence ที่มีเลนส์วัตถุ 10 เท่า เปอร์เซ็นต์พื้นที่พังผืดจะถูกวัดปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ Keyence Analyzer
การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA) หมายเลขแค็ตตาล็อก V13154 ตามโปรโตคอลของผู้ผลิตโดยมีการปรับเปลี่ยนบางส่วน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง มีการใช้หัวเจาะผ่าตัดที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 6 มม. เพื่อให้แน่ใจว่าขนาดเนื้อเยื่อจะสม่ำเสมอระหว่างการวิเคราะห์ MTT เนื้อเยื่อแต่ละชิ้นจะถูกวางลงในหลุมของแผ่น 12 หลุมที่มีสารตั้งต้น MTT ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ส่วนต่างๆ จะถูกฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง และเนื้อเยื่อที่มีชีวิตจะเผาผลาญสารตั้งต้น MTT เพื่อสร้างสารประกอบฟอร์มาซานสีม่วง เปลี่ยนสารละลาย MTT ด้วย DMSO 1 มล. และฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 15 นาทีเพื่อแยกฟอร์มาซานสีม่วงออกจากส่วนของหัวใจ ตัวอย่างถูกเจือจาง 1:10 ใน DMSO ในแผ่นด้านล่างใส 96 หลุม และวัดความเข้มของสีม่วงที่ 570 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านแผ่น Cytation (BioTek) การอ่านค่าจะถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามน้ำหนักของแต่ละส่วนของหัวใจ
เปลี่ยนสื่อชิ้นหัวใจเป็นสื่อที่มีกลูโคส [5-3H] 1 μCi/ml (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) สำหรับการทดสอบการใช้กลูโคสตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ หลังจากฟักเป็นเวลา 4 ชั่วโมง ให้เติมสื่อ 100 µl ลงในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์แบบเปิดที่มี HCl 0.2 N 100 µl จากนั้นวางหลอดในหลอดประกายแสงที่มี dH2O 500 µl เพื่อระเหย [3H]2O เป็นเวลา 72 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37°C จากนั้นนำหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ออกจากหลอดประกายแสงและเติมของเหลวประกายแสง 10 มล. นับจำนวนประกายแสงโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ประกายแสงของเหลว Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) จากนั้นคำนวณการใช้กลูโคสโดยคำนึงถึงกิจกรรมเฉพาะกลูโคส [5-3H] สมดุลและพื้นหลังที่ไม่สมบูรณ์ การเจือจาง [5-3H] เป็นกลูโคสที่ไม่ได้ติดฉลาก และประสิทธิภาพการต่อต้านประกายไฟฟ้า ข้อมูลจะถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามมวลของส่วนต่างๆ ของหัวใจ
หลังจากการทำให้เนื้อเยื่อเป็นเนื้อเดียวกันใน Trizol แล้ว RNA จะถูกแยกออกจากส่วนของหัวใจโดยใช้ Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต การเตรียมห้องสมุด RNAsec การเรียงลำดับ และการวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการดังต่อไปนี้:
RNA 1 μg ต่อตัวอย่างถูกใช้เป็นวัสดุเริ่มต้นในการเตรียมคลัง RNA คลังการเรียงลำดับถูกสร้างขึ้นโดยใช้ชุดเตรียมคลัง RNA ของ NEBNext UltraTM สำหรับ Illumina (NEB, USA) โดยปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิต และรหัสดัชนีถูกเพิ่มลงในลำดับแอตทริบิวต์สำหรับแต่ละตัวอย่าง โดยสรุป mRNA จะถูกทำให้บริสุทธิ์จาก RNA ทั้งหมดโดยใช้ลูกปัดแม่เหล็กที่ติดอยู่กับโพลี-T โอลิโกนิวคลีโอไทด์ การแตกตัวจะดำเนินการโดยใช้ไอออนบวกที่มีประจุบวกสองประจุที่อุณหภูมิสูงในบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาการสังเคราะห์สายแรกของ NEBNext (5X) cDNA สายแรกถูกสังเคราะห์โดยใช้ไพรเมอร์เฮกซาเมอร์แบบสุ่มและ M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-) จากนั้น cDNA สายที่สองจะถูกสังเคราะห์โดยใช้ DNA โพลิเมอเรส I และ RNase H ส่วนยื่นที่เหลือจะถูกแปลงให้เป็นส่วนปลายทู่โดยกิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอส/โพลีเมอเรส หลังจากทำการอะดีไนเลชันที่ปลาย 3′ ของชิ้นส่วน DNA แล้ว จะทำการติดอะแดปเตอร์ NEBNext ที่มีโครงสร้างห่วงแบบกิ๊บติดผมเข้ากับชิ้นส่วนนั้นเพื่อเตรียมให้พร้อมสำหรับไฮบริดิเซชัน สำหรับการคัดเลือกชิ้นส่วน cDNA ที่มีความยาวที่ต้องการ 150-200 bp ชิ้นส่วนในห้องสมุดจะได้รับการทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ระบบ AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA) จากนั้นจึงใช้เอนไซม์ USER 3 μl (NEB, USA) ที่มี cDNA ที่เลือกขนาดแล้วผูกกับอะแดปเตอร์เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิ 37°C จากนั้นจึงใช้เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิ 95°C ก่อนทำ PCR จากนั้นจึงทำ PCR โดยใช้ Phusion High-Fidelity DNA polymerase ไพรเมอร์ PCR สากล และไพรเมอร์ Index (X) ในที่สุด ผลิตภัณฑ์ PCR จะได้รับการทำให้บริสุทธิ์ (ระบบ AMPure XP) และประเมินคุณภาพห้องสมุดโดยใช้ระบบ Agilent Bioanalyzer 2100 จากนั้นจึงทำการจัดลำดับห้องสมุด cDNA โดยใช้เครื่องจัดลำดับ Novaseq ไฟล์ภาพดิบจาก Illumina ถูกแปลงเป็นข้อมูลดิบโดยใช้ CASAVA Base Calling ข้อมูลดิบจะถูกเก็บไว้ในไฟล์รูปแบบ FASTQ(fq) ซึ่งประกอบด้วยลำดับการอ่านและคุณภาพเบสที่สอดคล้องกัน เลือก HISAT2 เพื่อจับคู่ข้อมูลการเรียงลำดับที่กรองแล้วกับจีโนมอ้างอิง Sscrofa11.1 โดยทั่วไป HISAT2 รองรับจีโนมทุกขนาด รวมถึงจีโนมที่มีขนาดใหญ่กว่า 4 พันล้านเบส และค่าเริ่มต้นจะถูกตั้งค่าสำหรับพารามิเตอร์ส่วนใหญ่ การอ่านแบบตัดต่อจากข้อมูล RNA Seq สามารถจัดตำแหน่งได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยใช้ HISAT2 ซึ่งเป็นระบบที่เร็วที่สุดในปัจจุบัน โดยมีความแม่นยำเท่ากันหรือดีกว่าวิธีการอื่นๆ
ความอุดมสมบูรณ์ของทรานสคริปต์สะท้อนถึงระดับการแสดงออกของยีนโดยตรง ระดับการแสดงออกของยีนได้รับการประเมินโดยความอุดมสมบูรณ์ของทรานสคริปต์ (จำนวนการเรียงลำดับ) ที่เกี่ยวข้องกับจีโนมหรือเอกซอน จำนวนการอ่านจะแปรผันตามระดับการแสดงออกของยีน ความยาวของยีน และความลึกของการเรียงลำดับ FPKM (ชิ้นส่วนต่อพันคู่เบสของทรานสคริปต์ที่เรียงลำดับต่อล้านคู่เบส) ได้รับการคำนวณและค่า P ของการแสดงออกที่แตกต่างกันถูกกำหนดโดยใช้แพ็คเกจ DESeq2 จากนั้นเราคำนวณอัตราการค้นพบเท็จ (FDR) สำหรับค่า P แต่ละค่าโดยใช้เมธอด Benjamini-Hochberg9 โดยอิงตามฟังก์ชัน R ในตัว “p.adjust”
RNA ที่แยกจากส่วนของหัวใจถูกแปลงเป็น cDNA ที่ความเข้มข้น 200 ng/μl โดยใช้ SuperScript IV Vilo Master mix จาก Thermo (Thermo, cat. no. 11756050) RT-PCR เชิงปริมาณดำเนินการโดยใช้เพลตปฏิกิริยาโปร่งใส 384 หลุมของ Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, cat. no. 4483319) และกาวออปติกไมโครแอมป์ (Thermo, cat. no. 4311971) ส่วนผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย Taqman Fast Advanced Master mix 5 µl (Thermo, cat. # 4444557), Taqman Primer 0.5 µl และ H2O 3.5 µl ผสมกันต่อหลุม ดำเนินการรอบมาตรฐาน qPCR และวัดค่า CT โดยใช้เครื่องมือ Applied Biosystems Quantstudio 5 แบบเรียลไทม์ PCR (โมดูล 384 หลุม; ผลิตภัณฑ์ # A28135) ไพรเมอร์ Taqman ถูกซื้อจาก Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) ค่า CT ของตัวอย่างทั้งหมดได้รับการทำให้เป็นมาตรฐานตามยีนดูแลบ้าน GAPDH
การเผยแพร่ NT-ProBNP จะถูกประเมินโดยใช้ชุดทดสอบ NT-ProBNP (หมู) (หมายเลขแคตตาล็อก MBS2086979, MyBioSource) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต โดยย่อ ให้เติมตัวอย่างและมาตรฐานแต่ละชนิด 250 µl ในแต่ละหลุมเป็น 2 ครั้ง หลังจากเติมตัวอย่างแล้ว ให้เติม Assay Reagent A 50 µl ในแต่ละหลุมทันที เขย่าแผ่นเบาๆ และปิดผนึกด้วยสารปิดผนึก จากนั้นฟักเม็ดยาที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นดูดสารละลายออกและล้างหลุมด้วยสารละลายล้าง 1X 350 µl 4 ครั้ง โดยฟักสารละลายล้างแต่ละครั้งเป็นเวลา 1-2 นาที จากนั้นเติม Assay Reagent B 100 µl ต่อหลุมและปิดผนึกด้วยสารปิดผนึกแผ่น เขย่าเม็ดยาเบาๆ และฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 30 นาที ดูดสารละลายออกและล้างหลุมด้วยสารละลายล้าง 1X 350 µl 5 ครั้ง เติมสารละลายซับสเตรต 90 µl ลงในแต่ละหลุมแล้วปิดแผ่น ฟักแผ่นที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 10-20 นาที เติมสารละลายหยุดการตกตะกอน 50 µl ลงในแต่ละหลุม วัดแผ่นทันทีโดยใช้เครื่องอ่านแผ่น Cytation (BioTek) ที่ตั้งค่าไว้ที่ 450 นาโนเมตร
มีการดำเนินการวิเคราะห์กำลังเพื่อเลือกขนาดกลุ่มที่จะให้กำลังมากกว่า 80% เพื่อตรวจจับการเปลี่ยนแปลงสัมบูรณ์ 10% ในพารามิเตอร์พร้อมอัตราข้อผิดพลาดประเภท I 5% มีการดำเนินการวิเคราะห์กำลังเพื่อเลือกขนาดกลุ่มที่จะให้กำลังมากกว่า 80% เพื่อตรวจจับการเปลี่ยนแปลงสัมบูรณ์ 10% ในพารามิเตอร์พร้อมอัตราข้อผิดพลาดประเภท I 5% Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. ดำเนินการวิเคราะห์กำลังเพื่อเลือกขนาดกลุ่มที่จะให้กำลังมากกว่า 80% เพื่อตรวจจับการเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์สัมบูรณ์ 10% พร้อมอัตราข้อผิดพลาดประเภท I 5%进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5％I型错误率的组大化。进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5％I型错误率的组大化。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. มีการดำเนินการวิเคราะห์กำลังเพื่อเลือกขนาดกลุ่มที่จะให้กำลังมากกว่า 80% เพื่อตรวจจับการเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์สัมบูรณ์ 10% และอัตราข้อผิดพลาดประเภท I 5%ส่วนเนื้อเยื่อถูกเลือกแบบสุ่มก่อนการทดลอง การวิเคราะห์ทั้งหมดเป็นแบบปิดเงื่อนไข และตัวอย่างจะถูกถอดรหัสหลังจากวิเคราะห์ข้อมูลทั้งหมดแล้วเท่านั้น ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism (ซานดิเอโก แคลิฟอร์เนีย) ถูกใช้เพื่อดำเนินการวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมด สำหรับสถิติทั้งหมด ค่า p ถือว่ามีความสำคัญเมื่อค่า <0.05 สำหรับสถิติทั้งหมด ค่า p ถือว่ามีนัยสำคัญที่ค่า <0.05 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. สำหรับสถิติทั้งหมด ค่า p ถือว่ามีนัยสำคัญที่ค่า <0.05对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. สำหรับสถิติทั้งหมด ค่า p ถือว่ามีนัยสำคัญที่ค่า <0.05การทดสอบ t-test แบบสองหางของนักเรียนดำเนินการกับข้อมูลโดยมีการเปรียบเทียบเพียง 2 ครั้ง ใช้ ANOVA แบบทางเดียวหรือสองทางเพื่อกำหนดความสำคัญระหว่างกลุ่มต่างๆ เมื่อทำการทดสอบภายหลัง จะใช้การแก้ไขของ Tukey เพื่ออธิบายการเปรียบเทียบหลายครั้ง ข้อมูล RNAsec มีข้อควรพิจารณาทางสถิติพิเศษเมื่อคำนวณ FDR และ p.adjust ตามที่อธิบายไว้ในส่วนวิธีการ
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการออกแบบการศึกษา โปรดดูบทคัดย่อรายงานการวิจัยธรรมชาติที่ลิงก์กับบทความนี้