ขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comเวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)ในระหว่างนี้ เพื่อให้แน่ใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
จำเป็นต้องมีระบบในหลอดทดลองที่เชื่อถือได้ซึ่งสามารถจำลองสภาพแวดล้อมทางสรีรวิทยาของหัวใจได้อย่างถูกต้องสำหรับการทดสอบยาระบบการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจของมนุษย์ที่มีอยู่อย่างจำกัดทำให้การตีความผลของยาต่อการเต้นของหัวใจไม่ถูกต้องที่นี่ เราได้พัฒนาแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจ (CTCM) ที่กระตุ้นชิ้นส่วนหัวใจด้วยระบบกลไกไฟฟ้าและผ่านการยืดทางสรีรวิทยาระหว่างระยะ systolic และ diastolic ของวงจรการเต้นของหัวใจหลังจากการเพาะเชื้อเป็นเวลา 12 วัน วิธีการนี้ปรับปรุงความมีชีวิตของส่วนต่างๆ ของหัวใจได้บางส่วน แต่ไม่สามารถรักษาความสมบูรณ์ของโครงสร้างได้อย่างเต็มที่ดังนั้น หลังจากการคัดกรองโมเลกุลขนาดเล็ก เราพบว่าการเติม 100 nM triiodothyronine (T3) และ 1 μM dexamethasone (Dex) ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อของเราจะรักษาโครงสร้างจุลภาคของส่วนต่างๆ ไว้เป็นเวลา 12 วันเมื่อใช้ร่วมกับการรักษาด้วย T3/Dex ระบบ CTCM จะรักษาโปรไฟล์การถอดรหัส ความมีชีวิต กิจกรรมการเผาผลาญ และความสมบูรณ์ของโครงสร้างที่ระดับเดียวกับเนื้อเยื่อหัวใจสดเป็นเวลา 12 วันนอกจากนี้ การยืดเนื้อเยื่อหัวใจมากเกินไปในการเพาะเลี้ยงทำให้เกิดการส่งสัญญาณการเต้นของหัวใจที่มีภาวะโภชนาการเกิน ซึ่งแสดงหลักฐานสำหรับความสามารถของ CTCM ในการเลียนแบบสภาวะที่มีภาวะโภชนาการเกินที่เกิดจากการยืดกล้ามเนื้อหัวใจสรุปได้ว่า CTCM สามารถจำลองสรีรวิทยาและพยาธิสรีรวิทยาของหัวใจในการเพาะเลี้ยงเป็นระยะเวลานาน ทำให้สามารถคัดกรองยาได้อย่างน่าเชื่อถือ
ก่อนที่จะมีการวิจัยทางคลินิก จำเป็นต้องมีระบบในหลอดทดลองที่เชื่อถือได้ซึ่งสามารถจำลองสภาพแวดล้อมทางสรีรวิทยาของหัวใจมนุษย์ได้อย่างแม่นยำระบบดังกล่าวควรเลียนแบบการยืดเชิงกล อัตราการเต้นของหัวใจ และคุณสมบัติทางไฟฟ้าสรีรวิทยาที่เปลี่ยนแปลงไปโมเดลสัตว์มักใช้เป็นแท่นคัดกรองสรีรวิทยาของหัวใจโดยมีความน่าเชื่อถือจำกัดในการสะท้อนผลกระทบของยาในหัวใจมนุษย์1,2ในที่สุด แบบจำลองการทดลองเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจในอุดมคติ (CTCM) เป็นแบบจำลองที่มีความไวสูงและเฉพาะเจาะจงสำหรับการรักษาและเภสัชวิทยาต่างๆ โดยจำลองสรีรวิทยาและพยาธิสรีรวิทยาของหัวใจมนุษย์อย่างถูกต้อง3การไม่มีระบบดังกล่าวจำกัดการค้นพบวิธีการรักษาใหม่สำหรับภาวะหัวใจล้มเหลว4,5 และนำไปสู่ความเป็นพิษต่อหัวใจของยาซึ่งเป็นเหตุผลหลักในการออกจากตลาด6
ในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา ยาที่ไม่ใช่ยารักษาโรคหัวใจและหลอดเลือด 8 ชนิดถูกถอนออกจากการใช้ทางคลินิก เนื่องจากยาเหล่านี้ทำให้ QT interval prolongation นำไปสู่ภาวะหัวใจห้องล่างเต้นผิดจังหวะและเสียชีวิตอย่างกะทันหัน7ดังนั้นจึงมีความจำเป็นเพิ่มขึ้นสำหรับกลยุทธ์การตรวจคัดกรองพรีคลินิกที่เชื่อถือได้เพื่อประเมินประสิทธิภาพและความเป็นพิษของหลอดเลือดหัวใจการใช้ cardiomyocytes ที่ได้จากเซลล์ต้นกำเนิด pluripotent (hiPS-CM) ที่เหนี่ยวนำโดยมนุษย์เมื่อเร็ว ๆ นี้ในการคัดกรองยาและการทดสอบความเป็นพิษเป็นวิธีแก้ปัญหานี้บางส่วนอย่างไรก็ตาม ลักษณะที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะของ hiPS-CMs และการขาดความซับซ้อนหลายเซลล์ของเนื้อเยื่อหัวใจเป็นข้อจำกัดที่สำคัญของวิธีนี้การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้แสดงให้เห็นว่าข้อจำกัดนี้สามารถเอาชนะได้บางส่วนโดยการใช้ hiPS-CM ในช่วงแรกเพื่อสร้างไฮโดรเจลของเนื้อเยื่อหัวใจหลังจากเริ่มหดตัวได้ไม่นาน และค่อยๆ เพิ่มการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าเมื่อเวลาผ่านไปอย่างไรก็ตาม microtissues hiPS-CM เหล่านี้ไม่มีคุณสมบัติทางไฟฟ้าและการหดตัวของกล้ามเนื้อหัวใจผู้ใหญ่นอกจากนี้ เนื้อเยื่อหัวใจของมนุษย์มีโครงสร้างที่ซับซ้อนกว่า ซึ่งประกอบด้วยส่วนผสมที่ต่างกันของเซลล์ชนิดต่างๆ รวมถึงเซลล์บุผนังหลอดเลือด เซลล์ประสาท และไฟโบรบลาสต์สโตรมัล ซึ่งเชื่อมต่อกันโดยชุดของโปรตีนเมทริกซ์นอกเซลล์ที่เฉพาะเจาะจงความแตกต่างของประชากรที่ไม่ใช่ cardiomyocyte ในหัวใจสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่โตเต็มวัยเป็นอุปสรรคสำคัญในการสร้างแบบจำลองเนื้อเยื่อหัวใจโดยใช้เซลล์แต่ละประเภทข้อจำกัดที่สำคัญเหล่านี้เน้นย้ำถึงความสำคัญของการพัฒนาวิธีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อหัวใจที่ไม่บุบสลายภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยาและพยาธิสภาพ
อวัยวะที่บาง (300 µm) ของหัวใจมนุษย์ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นแบบจำลองที่มีแนวโน้มของกล้ามเนื้อหัวใจมนุษย์ที่ไม่บุบสลายวิธีนี้ทำให้สามารถเข้าถึงระบบหลายเซลล์แบบ 3 มิติที่สมบูรณ์ซึ่งคล้ายกับเนื้อเยื่อหัวใจของมนุษย์อย่างไรก็ตาม จนถึงปี 2019 การใช้ชิ้นส่วนหัวใจเพาะเลี้ยงถูกจำกัดโดยระยะเวลาการเพาะเลี้ยงที่สั้น (24 ชั่วโมง)นี่เป็นเพราะปัจจัยหลายประการรวมถึงการขาดการยืดทางกายภาพและเชิงกล การเชื่อมต่อระหว่างอากาศกับของเหลว และการใช้สื่ออย่างง่ายที่ไม่รองรับความต้องการของเนื้อเยื่อหัวใจในปี 2019 กลุ่มวิจัยหลายกลุ่มแสดงให้เห็นว่าการรวมปัจจัยเชิงกลเข้ากับระบบการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจสามารถยืดอายุการเพาะเลี้ยง ปรับปรุงการแสดงออกของหัวใจ และเลียนแบบพยาธิสภาพของหัวใจการศึกษาที่สวยงามสองชิ้น 17 และ 18 แสดงให้เห็นว่าการโหลดเชิงกลแบบแกนเดียวมีผลในเชิงบวกต่อฟีโนไทป์ของหัวใจในระหว่างการเพาะเลี้ยงอย่างไรก็ตาม การศึกษาเหล่านี้ไม่ได้ใช้การโหลดวัฏจักรหัวใจทางฟิสิกส์และเชิงกลสามมิติแบบไดนามิก เนื่องจากส่วนของหัวใจถูกโหลดด้วยแรงดึงแบบสามมิติ 17 หรือการโหลด auxotonic เชิงเส้น 18วิธีการยืดเนื้อเยื่อเหล่านี้ส่งผลให้เกิดการยับยั้งยีนหัวใจหลายตัวหรือยีนที่แสดงออกมากเกินไปซึ่งเกี่ยวข้องกับการตอบสนองการยืดที่ผิดปกติโดยเฉพาะอย่างยิ่ง Pitoulis และคณะ19 ได้พัฒนาอ่างเพาะเลี้ยงชิ้นส่วนหัวใจแบบไดนามิกสำหรับการสร้างวงจรหัวใจใหม่โดยใช้ฟีดเดอร์ทรานสดิวเซอร์แรงและตัวขับเคลื่อนความตึงเครียดแม้ว่าระบบนี้จะช่วยให้การสร้างแบบจำลองวงจรการเต้นของหัวใจในหลอดทดลองมีความแม่นยำมากขึ้น แต่วิธีการที่ซับซ้อนและอัตราความเร็วต่ำจะจำกัดการประยุกต์ใช้ระบบนี้ห้องปฏิบัติการของเราเพิ่งพัฒนาระบบการเลี้ยงแบบง่ายโดยใช้การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าและสื่อที่เหมาะสมที่สุดเพื่อรักษาความมีชีวิตของส่วนต่างๆ ของเนื้อสุกรและเนื้อเยื่อหัวใจของมนุษย์ได้นานถึง 6 วัน20,21
ในต้นฉบับปัจจุบัน เราอธิบายแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจ (CTCM) โดยใช้ส่วนต่างๆ ของหัวใจสุกรที่รวมสัญญาณทางร่างกายเพื่อสรุปสรีรวิทยาของหัวใจแบบสามมิติและการขยายตัวทางพยาธิสรีรวิทยาในระหว่างวัฏจักรของหัวใจCTCM นี้สามารถเพิ่มความแม่นยำของการทำนายยาก่อนการตรวจทางคลินิกในระดับที่ไม่เคยมีมาก่อน โดยการจัดหาระบบหัวใจปริมาณปานกลางที่คุ้มค่าใช้จ่าย ซึ่งเลียนแบบสรีรวิทยา/พยาธิสรีรวิทยาของหัวใจสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมสำหรับการทดสอบยาก่อนการตรวจทางคลินิก
สัญญาณกลไกการไหลเวียนโลหิตมีบทบาทสำคัญในการรักษาการทำงานของ cardiomyocyte ในหลอดทดลอง 22,23,24ในต้นฉบับปัจจุบัน เราได้พัฒนา CTCM (รูปที่ 1a) ที่สามารถเลียนแบบสภาพแวดล้อมของหัวใจในผู้ใหญ่โดยการกระตุ้นทั้งไฟฟ้าและกลไกที่ความถี่ทางสรีรวิทยา (1.2 Hz, 72 ครั้งต่อนาที)เพื่อหลีกเลี่ยงการยืดของเนื้อเยื่อมากเกินไปในช่วงไดแอสโทล จึงมีการใช้อุปกรณ์การพิมพ์ 3 มิติเพื่อเพิ่มขนาดเนื้อเยื่อขึ้น 25% (รูปที่ 1b)จังหวะไฟฟ้าที่เหนี่ยวนำโดยระบบ C-PACE ถูกตั้งเวลาให้เริ่มต้น 100 มิลลิวินาทีก่อนที่ systole จะใช้ระบบเก็บข้อมูลเพื่อสร้างวงจรการเต้นของหัวใจอย่างสมบูรณ์ระบบการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อใช้แอคชูเอเตอร์แบบนิวเมติกที่ตั้งโปรแกรมได้ (LB Engineering ประเทศเยอรมนี) เพื่อขยายเยื่อหุ้มซิลิโคนที่ยืดหยุ่นเป็นวงกลมเพื่อทำให้เกิดการขยายตัวของชิ้นหัวใจในห้องบนระบบเชื่อมต่อกับสายอากาศภายนอกผ่านตัวแปลงแรงดัน ซึ่งทำให้สามารถปรับแรงดัน (± 1 mmHg) และเวลา (± 1 ms) ได้อย่างแม่นยำ (รูปที่ 1c)
a ติดส่วนเนื้อเยื่อเข้ากับวงแหวนรองรับขนาด 7 มม. ที่แสดงเป็นสีน้ำเงิน ภายในห้องเพาะเชื้อของอุปกรณ์ห้องเพาะเลี้ยงถูกแยกออกจากห้องปรับอากาศด้วยเมมเบรนซิลิโคนที่ยืดหยุ่นได้วางปะเก็นระหว่างแต่ละห้องเพื่อป้องกันการรั่วไหลฝาของอุปกรณ์ประกอบด้วยขั้วไฟฟ้ากราไฟต์ที่กระตุ้นด้วยไฟฟ้าb การแสดงแผนผังของอุปกรณ์เนื้อเยื่อขนาดใหญ่ แหวนนำ และแหวนรองรับส่วนเนื้อเยื่อ (สีน้ำตาล) จะวางอยู่ในอุปกรณ์ขนาดใหญ่โดยมีวงแหวนนำอยู่ในร่องที่ขอบด้านนอกของอุปกรณ์ใช้ตัวกั้น ค่อยๆ วางวงแหวนพยุงที่เคลือบด้วยกาวอะคริลิกสำหรับทิชชูเหนือส่วนของเนื้อเยื่อหัวใจc กราฟแสดงเวลาของการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าเป็นฟังก์ชันของความดันในห้องอากาศที่ควบคุมโดยแอคชูเอเตอร์นิวเมติกที่ตั้งโปรแกรมได้ (PPD)อุปกรณ์เก็บข้อมูลถูกใช้เพื่อซิงโครไนซ์การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าโดยใช้เซ็นเซอร์ความดันเมื่อความดันในห้องเพาะเชื้อถึงเกณฑ์ที่ตั้งไว้ สัญญาณพัลส์จะถูกส่งไปยัง C-PACE-EM เพื่อกระตุ้นการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าd รูปภาพของ CTCM สี่ตัวที่วางอยู่บนชั้นวางตู้อบอุปกรณ์สี่ชิ้นเชื่อมต่อกับ PPD เดียวผ่านวงจรนิวแมติกส์ และเซ็นเซอร์ความดันถูกใส่เข้าไปในวาล์วห้ามเลือดเพื่อตรวจสอบความดันในวงจรนิวแมติกส์อุปกรณ์แต่ละชิ้นประกอบด้วยเนื้อเยื่อหกส่วน
ด้วยการใช้แอคชูเอเตอร์นิวเมติกตัวเดียว เราสามารถควบคุมอุปกรณ์ CTCM ได้ 4 ชิ้น ซึ่งแต่ละชิ้นสามารถเก็บเนื้อเยื่อได้ 6 ส่วน (รูปที่ 1d)ใน CTCM ความดันอากาศในห้องอากาศจะถูกแปลงเป็นความดันแบบซิงโครนัสในห้องของเหลวและทำให้เกิดการขยายตัวทางสรีรวิทยาของชิ้นหัวใจ (รูปที่ 2a และภาพยนตร์เสริม 1)การประเมินการยืดของเนื้อเยื่อที่ 80 มม.ปรอทศิลปะ.แสดงการยืดของส่วนเนื้อเยื่อ 25% (รูปที่ 2b)เปอร์เซ็นต์การยืดนี้แสดงให้เห็นว่าสอดคล้องกับความยาวของซาร์โคเมียร์ทางสรีรวิทยาที่ 2.2–2.3 µm สำหรับการหดตัวของส่วนหัวใจปกติ 17,19,25ประเมินการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อโดยใช้การตั้งค่ากล้องแบบกำหนดเอง (รูปที่ 1 เพิ่มเติม)แอมพลิจูดและความเร็วของการเคลื่อนที่ของเนื้อเยื่อ (รูปที่ 2c, d) สอดคล้องกับการยืดระหว่างรอบการเต้นของหัวใจและเวลาระหว่าง systole และ diastole (รูปที่ 2b)การยืดและความเร็วของเนื้อเยื่อหัวใจระหว่างการหดตัวและการคลายตัวยังคงที่เป็นเวลา 12 วันในการเพาะเลี้ยง (รูปที่ 2f)ในการประเมินผลของการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าต่อการหดตัวระหว่างการเพาะเลี้ยง เราได้พัฒนาวิธีการกำหนดความผิดปกติแบบแอคทีฟโดยใช้อัลกอริธึมการแรเงา (รูปที่ 2a, b) เพิ่มเติม และสามารถแยกความแตกต่างระหว่างความผิดปกติที่มีและไม่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าส่วนเดียวกันของหัวใจ (รูปที่ 2f)ในบริเวณที่สามารถเคลื่อนย้ายได้ของการตัด (R6-9) แรงดันไฟฟ้าระหว่างการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าจะสูงกว่าเมื่อไม่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าถึง 20% ซึ่งบ่งชี้ถึงการมีส่วนร่วมของการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าต่อการทำงานของการหดตัว
ร่องรอยของความดันห้องอากาศ ความดันห้องของเหลว และการวัดการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อยืนยันว่าความดันห้องเปลี่ยนความดันห้องของเหลว ทำให้เกิดการเคลื่อนที่ที่สอดคล้องกันของชิ้นเนื้อเยื่อb ร่องรอยของเปอร์เซ็นต์การยืด (สีน้ำเงิน) ของส่วนเนื้อเยื่อที่สอดคล้องกับเปอร์เซ็นต์การยืด (สีส้ม)c การเคลื่อนไหวที่วัดได้ของชิ้นหัวใจนั้นสอดคล้องกับความเร็วในการเคลื่อนที่ที่วัดได้(d) วิถีการเคลื่อนที่ที่เป็นตัวแทนของการเคลื่อนที่เป็นวงกลม (เส้นสีน้ำเงิน) และความเร็ว (เส้นประสีส้ม) ในส่วนของหัวใจe ปริมาณของรอบเวลา (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูที่แตกต่างกัน) เวลาหดตัว (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม) เวลาผ่อนคลาย (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูต่างชนิดกัน) การเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อ (n = 25 )ชิ้น)/กลุ่มจากหมูคนละตัว), ความเร็วซิสโตลิกสูงสุด (n = 24(D0), 25(D12) ชิ้น/กลุ่มจากหมูคนละตัว) และอัตราการผ่อนคลายสูงสุด (n=24(D0), 25(D12) ชิ้น/กลุ่มจากหมูต่างกัน)การทดสอบค่า t แบบสองด้านของนักเรียนไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในพารามิเตอร์ใดๆf การวิเคราะห์ความเครียดตัวแทนร่องรอยของส่วนเนื้อเยื่อที่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้า (สีแดง) และไม่มี (สีน้ำเงิน) พื้นที่ส่วนเนื้อเยื่อ 10 ส่วนจากส่วนเดียวกันแผงด้านล่างแสดงปริมาณของเปอร์เซ็นต์ความแตกต่างของความเครียดในส่วนเนื้อเยื่อที่มีและไม่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าในสิบส่วนจากส่วนต่างๆ (n = 8 ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ทำการทดสอบแบบสองด้านของนักเรียน ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05) (n = 8 ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ทำการทดสอบแบบสองด้านของนักเรียน ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05) (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 ส่วน/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน การทดสอบแบบสองด้านของนักเรียน ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05) （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 ส่วน/กลุ่ม จากหมูที่แตกต่างกัน การทดสอบแบบสองด้านของนักเรียน ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน
ในระบบการเพาะเลี้ยงชิ้นส่วนหัวใจแบบชีวเลียนแบบแบบคงที่ก่อนหน้านี้ [20, 21] เรารักษาความมีชีวิต การทำงาน และความสมบูรณ์ของโครงสร้างของชิ้นหัวใจเป็นเวลา 6 วันโดยการใช้การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าและปรับองค์ประกอบขนาดกลางให้เหมาะสมอย่างไรก็ตาม หลังจากผ่านไป 10 วัน ตัวเลขเหล่านี้ลดลงอย่างรวดเร็วเราจะอ้างถึงส่วนที่เพาะเลี้ยงในระบบการเพาะเลี้ยงทางชีวภาพแบบคงที่ก่อนหน้านี้ของเรา 20, 21 เงื่อนไขการควบคุม (Ctrl) และเราจะใช้สื่อที่ปรับให้เหมาะสมก่อนหน้านี้เป็นเงื่อนไขและการเพาะเลี้ยง MC ภายใต้การกระตุ้นเชิงกลและไฟฟ้าพร้อมกัน (CTCM)เรียกว่า .ขั้นแรก เราพิจารณาแล้วว่าการกระตุ้นเชิงกลโดยไม่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้านั้นไม่เพียงพอที่จะรักษาความมีชีวิตของเนื้อเยื่อเป็นเวลา 6 วัน (รูปที่ 3a, b เพิ่มเติม)ที่น่าสนใจ ด้วยการแนะนำการกระตุ้นทางกายภาพและทางกลและไฟฟ้าโดยใช้ STCM ความมีชีวิตของส่วนหัวใจ 12 วันยังคงเหมือนเดิมในส่วนของหัวใจสดภายใต้เงื่อนไข MS แต่ไม่อยู่ภายใต้เงื่อนไข Ctrl ดังที่แสดงโดยการวิเคราะห์ MTT (รูปที่ 1)3ก).สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าการกระตุ้นเชิงกลและการจำลองวัฏจักรของหัวใจสามารถทำให้ส่วนของเนื้อเยื่อทำงานได้สองเท่าตราบเท่าที่รายงานในระบบเพาะเลี้ยงแบบคงที่ก่อนหน้านี้ของเราอย่างไรก็ตาม การประเมินความสมบูรณ์ของโครงสร้างของส่วนต่างๆ ของเนื้อเยื่อโดยการสร้างอิมมูโนลาเบลของ cardiac troponin T และ connexin 43 แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ connexin 43 ในเนื้อเยื่อ MC ในวันที่ 12 สูงกว่ากลุ่มควบคุมในวันเดียวกันอย่างมีนัยสำคัญอย่างไรก็ตามการแสดงออกของ connexin 43 ที่เหมือนกันและการก่อตัวของดิสก์ Z นั้นไม่ได้รับการดูแลอย่างเต็มที่ (รูปที่ 3b)เราใช้เฟรมเวิร์กปัญญาประดิษฐ์ (AI) เพื่อหาปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อ26 ซึ่งเป็นไปป์ไลน์การเรียนรู้เชิงลึกตามภาพที่ใช้ troponin-T และการย้อมสี connexin43 เพื่อวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างและการเรืองแสงของชิ้นหัวใจโดยอัตโนมัติในแง่ของความแข็งแกร่งของการแปลวิธีการนี้ใช้ Convolutional Neural Network (CNN) และเฟรมเวิร์กการเรียนรู้เชิงลึกเพื่อหาปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างของเนื้อเยื่อหัวใจอย่างน่าเชื่อถือในลักษณะอัตโนมัติและไม่ลำเอียง ตามที่อธิบายไว้ในข้อมูลอ้างอิง26. เนื้อเยื่อ MC แสดงความคล้ายคลึงกันของโครงสร้างที่ดีขึ้นกับวันที่ 0 เมื่อเทียบกับส่วนควบคุมแบบคงที่นอกจากนี้ การย้อมด้วยไตรโครมของ Masson ยังเผยให้เห็นเปอร์เซ็นต์ของพังผืดที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญภายใต้สภาวะ MS เมื่อเทียบกับสภาวะควบคุมในวันที่ 12 ของการเพาะเลี้ยง (รูปที่ 3c)ในขณะที่ CTCM เพิ่มความมีชีวิตของส่วนเนื้อเยื่อหัวใจในวันที่ 12 จนถึงระดับที่ใกล้เคียงกับเนื้อเยื่อหัวใจสด แต่ก็ไม่ได้ปรับปรุงความสมบูรณ์ของโครงสร้างของส่วนหัวใจอย่างมีนัยสำคัญ
กราฟแท่งแสดงปริมาณความมีชีวิตของ MTT ของการเพาะเลี้ยงชิ้นหัวใจสด (D0) หรือการเพาะเลี้ยงชิ้นหัวใจเป็นเวลา 12 วันในการเพาะเลี้ยงแบบคงที่ (D12 Ctrl) หรือใน CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA ทางเดียว ####p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ **p < 0 .01 เทียบกับ D12 Ctrl) กราฟแท่งแสดงปริมาณความมีชีวิตของ MTT ของชิ้นหัวใจสด (D0) หรือการเพาะเลี้ยงชิ้นหัวใจเป็นเวลา 12 วันในวัฒนธรรมคงที่ (D12 Ctrl) หรือใน CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA ทางเดียว ####p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เทียบกับ D12 Ctrl)ฮิสโตแกรมแสดงปริมาณความมีชีวิตของส่วน MTT fresh heart (D0) หรือการเพาะเชื้อของส่วนหัวใจเป็นเวลา 12 วันในการเพาะเลี้ยงแบบคงที่ (กลุ่มควบคุม D12) หรือ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (กลุ่มควบคุม D12) ) ), 12 (D12 MC) ส่วน/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน การทดสอบความแปรปรวนแบบทางเดียวจะดำเนินการ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เทียบกับ D12 Ctrl) A 条形图在 (d12 ctrl) 或 ctcm (d12 mc) (n = 18 (d0), 15 (d12 ctrl) 中 (d0) 或进行进行进行进行进行进行； 进行进行进行进行天天天天天天相比， #### p <0.0001， 与 d12 ctrl 相比， ** p <0.01) 。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)ฮิสโทแกรมแสดงปริมาณของ MTT มีชีวิตในส่วนหัวใจสด (D0) หรือส่วนหัวใจที่เพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วันในการเพาะเลี้ยงแบบคงที่ (กลุ่มควบคุม D12) หรือ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (กลุ่มควบคุม D12)) , 12 (D12 MC) ส่วน/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน การทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 เทียบกับ D0, **p < 0.01 เทียบกับ D12 Ctrl)b Troponin-T (สีเขียว), connexin 43 (สีแดง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) ในส่วนหัวใจที่แยกได้ใหม่ (D0) หรือส่วนหัวใจที่เลี้ยงภายใต้สภาวะคงที่ (Ctrl) หรือเงื่อนไข CTCM (MC) เป็นเวลา 12 วัน) ของภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ที่เป็นตัวแทน (สเกลว่าง = 100 µm) ปริมาณปัญญาประดิษฐ์ของความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มแต่ละชิ้นจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ####p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ ****p < 0.0001 เทียบกับ D12 Ctrl) การวัดปริมาณปัญญาประดิษฐ์ของความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มแต่ละชิ้นจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ####p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ ****p < 0.0001 เทียบกับ D12 Ctrl) Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов /групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с Ctrl D12). การหาปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างของเนื้อเยื่อหัวใจโดยปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ส่วน/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ####p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ ****p < 0.0001 เทียบกับ D12 Ctrl)人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มหมูแต่ละตัวที่แตกต่างกัน, การทดสอบ ANOVA ทางเดียว;####p < 0.0001 与D0 相比，****p < 0.0001与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มของหมูแต่ละตัวที่แตกต่างกัน, การทดสอบ ANOVA ทางเดียว;####p < 0.0001 与D0相比，****p < 0.0001与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) сре зов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). ปัญญาประดิษฐ์เพื่อหาปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างของเนื้อเยื่อหัวใจ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ส่วน/กลุ่มของสุกรแต่ละตัว, การทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ####p<0.0001 เทียบกับ .D0 สำหรับการเปรียบเทียบ ****p < 0.0001 เทียบกับ D12 Ctrl) c ภาพตัวแทน (ซ้าย) และปริมาณ (ขวา) สำหรับชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วยคราบไตรโครมของ Masson (สเกลเปลือย = 500 µm) (n = 10 ชิ้น/กลุ่มแต่ละชิ้นจากหมูที่แตกต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ####p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เทียบกับ D12 Ctrl) c ภาพตัวแทน (ซ้าย) และปริมาณ (ขวา) สำหรับชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วยคราบ Trichrome ของ Masson (สเกลเปลือย = 500 µm) (n = 10 ชิ้น/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว #### p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ *** p < 0.001 เทียบกับ D12 Ctrl) c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Ма ссона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 และ ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c ภาพตัวแทน (ซ้าย) และปริมาณ (ขวา) ของส่วนหัวใจที่ย้อมด้วยคราบไตรโครมของ Masson (ขนาดไม่เคลือบผิว = 500 µm) (n = 10 ส่วน/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว #### p < 0 .0001 เทียบกับ D0 และ *** p < 0.001 เทียบกับ D12 Ctrl) c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 用masson 三色染料的心脏切片的代表性（左左）量化（右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Мас сона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного диспер сионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c ภาพตัวแทน (ซ้าย) และปริมาณ (ขวา) ของส่วนหัวใจที่ย้อมด้วยคราบไตรโครมของ Masson (ว่าง = 500 µm) (n = 10 ส่วน/กลุ่ม แต่ละชิ้นมาจากหมูคนละตัว ทดสอบโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว ;### # p < 0.0001 เทียบกับ D0, ***p < 0.001 เทียบกับ D12 Ctrl)แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน
เราตั้งสมมติฐานว่าการเพิ่มโมเลกุลขนาดเล็กลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ ความสมบูรณ์ของ cardiomyocyte สามารถปรับปรุงได้ และการพัฒนาพังผืดลดลงระหว่างการเพาะเลี้ยง CTCMดังนั้นเราจึงคัดกรองโมเลกุลขนาดเล็กโดยใช้วัฒนธรรมควบคุมแบบคงที่ของเรา 20,21 เนื่องจากมีปัจจัยรบกวนจำนวนน้อยDexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3) และ SB431542 (SB) ถูกเลือกสำหรับหน้าจอนี้ก่อนหน้านี้มีการใช้โมเลกุลขนาดเล็กเหล่านี้ในวัฒนธรรม hiPSC-CM เพื่อกระตุ้นการเจริญเติบโตของ cardiomyocytes โดยการเพิ่มความยาวของ sarcomere, T-tubules และความเร็วการนำไฟฟ้านอกจากนี้ทั้ง Dex (a glucocorticoid) และ SB ยังเป็นที่รู้กันว่าสามารถยับยั้งการอักเสบได้29,30ดังนั้นเราจึงทดสอบว่าการรวมโมเลกุลขนาดเล็กเหล่านี้หนึ่งหรือหลายตัวเข้าด้วยกันจะช่วยปรับปรุงความสมบูรณ์ของโครงสร้างของส่วนต่างๆของหัวใจสำหรับการคัดกรองเบื้องต้น ขนาดยาของสารประกอบแต่ละชนิดถูกเลือกตามความเข้มข้นที่ใช้โดยทั่วไปในแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเซลล์ (1 μM Dex27, 100 nM T327 และ 2.5 μM SB31)หลังจากการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน การรวมกันของ T3 และ Dex ทำให้เกิดความสมบูรณ์ของโครงสร้าง cardiomyocyte ที่เหมาะสมและการเปลี่ยนแปลงของเส้นใยน้อยที่สุด (รูปที่ 4 และ 5 เพิ่มเติม)นอกจากนี้ การใช้ความเข้มข้นของ T3 และ Dex เป็นสองเท่าหรือสองเท่าทำให้เกิดผลเสียเมื่อเปรียบเทียบกับความเข้มข้นปกติ (รูปที่ 6a, b เพิ่มเติม)
หลังจากการคัดกรองเบื้องต้น เราได้ทำการเปรียบเทียบแบบตัวต่อตัวของเงื่อนไขการเพาะเลี้ยง 4 แบบ (รูปที่ 4a): Ctrl: ส่วนหัวใจที่เพาะเลี้ยงในการเพาะเลี้ยงแบบคงที่ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยใช้สื่อที่ปรับให้เหมาะสมของเรา20.21 TD: T3 และ Ctrl เพิ่ม Dex ในวันพุธ;MC: เพาะเลี้ยงชิ้นส่วนหัวใจใน CTCM โดยใช้สื่อที่ปรับให้เหมาะสมก่อนหน้านี้และ MT: CTCM ที่เพิ่ม T3 และ Dex ลงในสื่อหลังจากการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน ความมีชีวิตของเนื้อเยื่อ MS และ MT ยังคงเหมือนเดิมในเนื้อเยื่อสดที่ประเมินโดย MTT assay (รูปที่ 4b)ที่น่าสนใจคือ การเพิ่ม T3 และ Dex เข้าไปใน transwell cultures (TD) ไม่ได้ส่งผลให้ความมีชีวิตดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับเงื่อนไข Ctrl ซึ่งบ่งชี้ถึงบทบาทสำคัญของการกระตุ้นเชิงกลในการรักษาความมีชีวิตของส่วนต่างๆ ของหัวใจ
แผนภาพการออกแบบการทดลองแสดงสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้งสี่ที่ใช้ในการประเมินผลของการกระตุ้นเชิงกลและการเสริม T3/Dex บนอาหารเลี้ยงเชื้อเป็นเวลา 12 วัน b กราฟแท่งแสดงปริมาณความมีชีวิตหลังการเลี้ยง 12 วันในสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 แบบ (Ctrl, TD, MC และ MT) เปรียบเทียบกับชิ้นหัวใจสด (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT), 12 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ####p < 0.0001, ###p < 0 .001 เทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เทียบกับ D12 Ctrl) b กราฟแท่งแสดงปริมาณความมีชีวิตหลังการเลี้ยง 12 วันในสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 แบบ (Ctrl, TD, MC และ MT) เปรียบเทียบกับชิ้นหัวใจสด (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT), 12 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ####p < 0.0001, ###p < 0 .001 เทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เทียบกับ D12 ctrl) b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT), 12 (D12 MC) срез ов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнени ю с D12 Ctrl). b กราฟแท่งแสดงปริมาณความมีชีวิตที่ 12 วันหลังการเลี้ยงในสภาวะการเลี้ยงทั้ง 4 แบบ (การควบคุม, TD, MC และ MT) เปรียบเทียบกับส่วนของหัวใจสด (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT), 12 (D12 MC) ส่วน/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน, การทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ####p < 0.0001, ###p < 0 .001 เทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เมื่อเปรียบเทียบกับ D12 Ctrl) b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比，**p < 0.01 与D12控制）。ข 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0 ) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по срав нению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b ฮิสโตแกรมแสดงเงื่อนไขการเพาะเลี้ยงทั้งหมด 4 เงื่อนไข (การควบคุม, TD, MC และ MT) เปรียบเทียบกับส่วนหัวใจสด (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT) จากสุกรที่แตกต่างกัน 12 (D12 MC) ส่วน/กลุ่ม, การทดสอบความแปรปรวนแบบทางเดียว ####p<0.0001, ###p<0.001 เทียบกับ D0, **p<0.01 เทียบกับการควบคุม D 12). c กราฟแท่งแสดงปริมาณของกลูโคสฟลักซ์ 12 วันหลังการเลี้ยงในสภาวะการเลี้ยงทั้ง 4 แบบ (Ctrl, TD, MC และ MT) เปรียบเทียบกับชิ้นหัวใจสด (D0) (n = 6 ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ###p < 0.001 เทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เทียบกับ D12 Ctrl) c กราฟแท่งแสดงปริมาณของกลูโคสฟลักซ์ 12 วันหลังการเลี้ยงในสภาวะการเลี้ยงทั้ง 4 แบบ (Ctrl, TD, MC และ MT) เปรียบเทียบกับชิ้นหัวใจสด (D0) (n = 6 ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ###p < 0.001 เทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เทียบกับ D12 Ctrl) ค Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условия к ультивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, одностор онний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 และ ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c ฮิสโตแกรมแสดงปริมาณของกลูโคสฟลักซ์ 12 วันหลังการเลี้ยงภายใต้สภาวะการเลี้ยงทั้ง 4 แบบ (การควบคุม, TD, MC และ MT) เทียบกับส่วนของหัวใจสด (D0) (n = 6 ส่วน/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน, การทดสอบ ANOVA แบบทางเดียวดำเนินการ ###p < 0.001 เทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เทียบกับ D12 Ctrl) c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通量定量（ n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 种条形图显示所有 4种条件（ctrl、td、mc和mt）新鲜心脏切片切片相比，培养后12天的通量 定量 （n = 6 片/组， 来自 猪， ，，，，，， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001与D12 Ctrl 相比）。 ค Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 усло вий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, од носторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c ฮิสโตแกรมแสดงปริมาณของกลูโคสฟลักซ์ที่ 12 วันหลังการเพาะเลี้ยงสำหรับสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 สภาวะ (การควบคุม TD MC และ MT) เปรียบเทียบกับส่วนของหัวใจสด (D0) (n = 6 ส่วน/กลุ่ม จากสุกรที่แตกต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA ฝ่ายเดียว ###p < 0.001 เทียบกับ D0, ***p < 0.001 เทียบกับ D12 (ควบคุม)d แผนการวิเคราะห์ความเครียดของเนื้อเยื่อสด (สีน้ำเงิน) วันที่ 12 MC (สีเขียว) และวันที่ 12 MT (สีแดง) ที่ส่วนเนื้อเยื่อภูมิภาค 10 จุด (n = 4 ชิ้น/กลุ่ม การทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม)e แผนภาพภูเขาไฟแสดงยีนที่แสดงออกแตกต่างกันในส่วนหัวใจสด (D0) เปรียบเทียบกับส่วนหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะคงที่ (Ctrl) หรือภายใต้สภาวะ MT (MT) เป็นเวลา 10-12 วันf แผนที่ความร้อนของยีน sarcomere สำหรับส่วนของหัวใจที่เลี้ยงภายใต้เงื่อนไขการเพาะเลี้ยงแต่ละอย่างแถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน
การพึ่งพาเมตาบอลิซึมในการเปลี่ยนจากปฏิกิริยาออกซิเดชันของกรดไขมันเป็นไกลโคไลซิสเป็นจุดเด่นของการลดความแตกต่างของคาร์ดิโอไมโอไซต์cardiomyocytes ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะใช้กลูโคสเป็นหลักสำหรับการผลิต ATP และมีไมโทคอนเดรียแบบไฮโปพลาสติกที่มี cristae น้อย 5,32การวิเคราะห์การใช้กลูโคสแสดงให้เห็นว่าภายใต้เงื่อนไข MC และ MT การใช้กลูโคสนั้นคล้ายคลึงกับในเนื้อเยื่อวันที่ 0 (รูปที่ 4c)อย่างไรก็ตาม ตัวอย่าง Ctrl แสดงการใช้กลูโคสเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับเนื้อเยื่อสดสิ่งนี้บ่งชี้ว่าการรวมกันของ CTCM และ T3/Dex ช่วยเพิ่มความสามารถในการมีชีวิตของเนื้อเยื่อและรักษาฟีโนไทป์ของเมแทบอลิซึมของส่วนหัวใจที่เพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วันนอกจากนี้ การวิเคราะห์ความเครียดพบว่าระดับความเครียดยังคงเท่าเดิมในเนื้อเยื่อหัวใจสดเป็นเวลา 12 วันภายใต้สภาวะ MT และ MS (รูปที่ 4d)
ในการวิเคราะห์ผลกระทบโดยรวมของ CTCM และ T3 / Dex ต่อภูมิทัศน์การถอดรหัสทั่วโลกของเนื้อเยื่อชิ้นหัวใจ เราได้ทำ RNAseq บนชิ้นหัวใจจากเงื่อนไขวัฒนธรรมที่แตกต่างกันทั้งสี่ (ข้อมูลเสริม 1)ที่น่าสนใจคือ ส่วน MT มีความคล้ายคลึงกันในการถอดเสียงสูงกับเนื้อเยื่อหัวใจสด โดยมีเพียง 16 ยีนที่แสดงออกแตกต่างกันจาก 13,642 ยีนอย่างไรก็ตาม อย่างที่เราแสดงให้เห็นก่อนหน้านี้ ชิ้น Ctrl แสดงยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน 1229 ยีนหลังจาก 10–12 วันในการเพาะเลี้ยง (รูปที่ 4e)ข้อมูลเหล่านี้ได้รับการยืนยันโดย qRT-PCR ของยีนหัวใจและไฟโบรบลาสต์ (รูปที่ 7a-c เพิ่มเติม)ที่น่าสนใจคือส่วน Ctrl แสดงการลดลงของยีนของวงจรการเต้นของหัวใจและเซลล์และการเปิดใช้งานโปรแกรมยีนอักเสบข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการแยกความแตกต่างซึ่งโดยปกติจะเกิดขึ้นหลังจากการเพาะเลี้ยงในระยะยาวนั้นถูกลดทอนอย่างสมบูรณ์ภายใต้เงื่อนไข MT (รูปที่ 8a,b เพิ่มเติม)การศึกษาอย่างรอบคอบของยีน sarcomere แสดงให้เห็นว่าเฉพาะภายใต้เงื่อนไข MT เท่านั้นที่ยีนเข้ารหัส sarcomere (รูปที่ 4f) และช่องไอออน (รูปที่ 9 เพิ่มเติม) ที่เก็บรักษาไว้ปกป้องพวกเขาจากการปราบปรามภายใต้เงื่อนไข Ctrl, TD และ MCข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าด้วยการผสมผสานระหว่างการกระตุ้นทางกลและทางร่างกาย (T3/Dex) การถอดเสียงของชิ้นเนื้อหัวใจจะยังคงคล้ายกับชิ้นหัวใจสดหลังจากผ่านไป 12 วันในการเพาะเลี้ยง
การค้นพบการถอดรหัสเหล่านี้ได้รับการสนับสนุนโดยข้อเท็จจริงที่ว่าความสมบูรณ์ของโครงสร้างของ cardiomyocytes ในส่วนของหัวใจนั้นได้รับการเก็บรักษาไว้อย่างดีที่สุดภายใต้สภาวะ MT เป็นเวลา 12 วัน ดังที่แสดงโดย connexin 43 ที่ไม่บุบสลายและแปลเป็นภาษาท้องถิ่น (รูปที่ 5a)นอกจากนี้ พังผืดในส่วนของหัวใจภายใต้สภาวะ MT ยังลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับ Ctrl และคล้ายกับส่วนของหัวใจสด (รูปที่ 5b)ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการผสมผสานของการกระตุ้นด้วยกลไกและการรักษาด้วย T3/Dex ช่วยรักษาโครงสร้างหัวใจในส่วนต่าง ๆ ของหัวใจได้อย่างมีประสิทธิภาพในการเพาะเลี้ยง
ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ที่เป็นตัวแทนของ troponin-T (สีเขียว), connexin 43 (สีแดง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) ในส่วนหัวใจที่แยกใหม่ (D0) หรือเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วันในสภาวะเพาะเลี้ยงส่วนหัวใจทั้งสี่ (สเกลบาร์ = 100 µm)). การวัดปริมาณปัญญาประดิษฐ์ของความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจ (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC และ D12 MT) ชิ้น/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ####p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ *p < 0.05 หรือ ****p < 0.0001 เทียบกับ D12 Ctrl) การวัดปริมาณปัญญาประดิษฐ์ของความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจ (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC และ D12 MT) ชิ้น/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA ทางเดียว #### p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ *p < 0.05 หรือ ****p < 0.0001 เทียบกับ D12 Ctrl) Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 (D12 T D, D12 MC และ D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). การหาปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างของเนื้อเยื่อหัวใจโดยใช้ปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC และ D12 MT) ส่วน/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว #### p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ *p < 0.05 หรือ ****p < 0.0001 เทียบกับ D12 Ctrl)对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组)进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对不同猪的心脏结构完整性（n=7（d0和d12 ctrl）（5（d12 td、d12 mc和 d12 mt）组）人工智能量化进行 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。การหาปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างของเนื้อเยื่อหัวใจโดยใช้ปัญญาประดิษฐ์ในสุกรที่แตกต่างกัน (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC และ D12 MT) ส่วน/กลุ่ม) ด้วยการทดสอบความแปรปรวนแบบทางเดียว#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ *p < 0.05 หรือ ****p < 0.0001 เทียบกับ D12 Ctrl) b ภาพตัวอย่างและปริมาณของชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วยคราบไตรโครมของ Masson (แถบมาตราส่วน = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 (D12 MT) ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA ทางเดียว ####p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 หรือ ****p < 0.0001 เทียบกับ D12 Ctrl) b ภาพตัวอย่างและปริมาณของชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วยคราบไตรโครมของ Masson (แถบมาตราส่วน = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 (D12 MT) ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ ANOVA ทางเดียว ####p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 หรือ ****p < 0.0001 เทียบกับ D12 Ctrl) b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масона (масштабна) я линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b ภาพตัวอย่างและปริมาณของชิ้นส่วนหัวใจที่ย้อมด้วยคราบไตรโครมของ Masson (แถบมาตราส่วน = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 (D12 MT) ส่วน/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ทำการวิเคราะห์วิเคราะห์แบบทางเดียว ####p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 หรือ ****p < 0.0001 เทียบกับ D12 Ctrl) b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用masson 三色染料的心脏切片的代表性和量化（比例尺尺=500 µm）（n=10（d0、d12 ctrl、d12 td和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 5 00 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, *** p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b ภาพตัวอย่างและปริมาณของส่วนหัวใจที่ย้อมด้วยไตรโครมของ Masson (สเกลบาร์ = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 ส่วน (D12 MT) จากสุกร/กลุ่มต่างกัน วิธี ANOVA หนึ่งวิธี ####p < 0.0001 เทียบกับ D0, ***p < 0.001 หรือ ****p < 0.0001 เทียบกับ D 12 Ctrl).แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน
ในที่สุดความสามารถของ CTCM ในการเลียนแบบการเจริญเติบโตของหัวใจได้รับการประเมินโดยการเพิ่มการยืดของเนื้อเยื่อหัวใจใน CTCM ความดันห้องอากาศสูงสุดเพิ่มขึ้นจาก 80 mmHg เป็น 80 mmHgศิลปะ.(ยืดปกติ) สูงถึง 140 mmHg ศิลปะ(รูปที่ 6a)สิ่งนี้สอดคล้องกับการยืดที่เพิ่มขึ้น 32% (รูปที่ 6b) ซึ่งก่อนหน้านี้แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์การยืดที่สอดคล้องกันซึ่งจำเป็นสำหรับส่วนของหัวใจเพื่อให้ได้ความยาว sarcomere คล้ายกับที่เห็นในการเจริญเติบโตมากเกินไปการยืดและความเร็วของเนื้อเยื่อหัวใจระหว่างการหดตัวและการคลายตัวยังคงที่ในช่วงหกวันของการเพาะเชื้อ (รูปที่ 6c)เนื้อเยื่อหัวใจจากสภาวะ MT ถูกยืดตามปกติ (MT (ปกติ)) หรือสภาวะยืดเกิน (MT (OS)) เป็นเวลาหกวันหลังจากผ่านไปสี่วันในการเพาะเลี้ยง NT-ProBNP ไบโอมาร์คเกอร์ไฮเปอร์โทรฟิคได้รับการยกระดับอย่างมีนัยสำคัญในตัวกลางภายใต้สภาวะ MT (OS) เมื่อเทียบกับสภาวะ MT (ปกติ) (รูปที่ 7a)นอกจากนี้ หลังจากการเพาะเลี้ยงหกวัน ขนาดเซลล์ใน MT (OS) (รูปที่ 7b) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับส่วนของหัวใจ MT (ปกติ)นอกจากนี้ การเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ NFATC4 ยังเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเนื้อเยื่อที่ยืดออกมากเกินไป (รูปที่ 7c)ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงการพัฒนาที่ก้าวหน้าของการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาหลังจากภาวะความดันโลหิตสูง และสนับสนุนแนวคิดที่ว่าอุปกรณ์ CTCM สามารถใช้เป็นแพลตฟอร์มเพื่อศึกษาการส่งสัญญาณการเจริญเกินของหัวใจที่เกิดจากการยืดกล้ามเนื้อ
ร่องรอยของความดันห้องอากาศ ความดันห้องของเหลว และการวัดการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อยืนยันว่าความดันห้องเปลี่ยนความดันห้องของเหลว ทำให้เกิดการเคลื่อนที่ที่สอดคล้องกันของชิ้นเนื้อเยื่อb เปอร์เซ็นต์การยืดที่เป็นตัวแทนและเส้นโค้งอัตราการยืดสำหรับส่วนเนื้อเยื่อที่ยืดตามปกติ (สีส้ม) และส่วนที่ยืดเกิน (สีน้ำเงิน)c กราฟแท่งแสดงรอบเวลา (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากสุกรต่างชนิดกัน) เวลาหดตัว (n = 18-19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากสุกรต่างชนิดกัน) เวลาคลายตัว (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากสุกรต่างชนิดกัน) ความกว้างของการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อ (n = 14 ชิ้น/กลุ่ม จากหมูต่างชนิดกัน) ความเร็วซิสโตลิกสูงสุด (n = 14 ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างชนิดกัน) และอัตราการคลายตัวสูงสุด (n = 14 (D0), 15 (D6) ) ส่วน/กลุ่ม) จากสุกรที่แตกต่างกัน) การทดสอบแบบ t-test ของนักเรียนแบบสองด้านไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในพารามิเตอร์ใดๆ ซึ่งบ่งชี้ว่าพารามิเตอร์เหล่านี้คงที่ตลอด 6 วันของการเพาะเลี้ยงที่มีแรงดันไฟฟ้าเกินแถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน
การหาปริมาณกราฟแท่งของความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในอาหารเลี้ยงเชื้อจากชิ้นหัวใจที่เลี้ยงภายใต้สภาวะยืดปกติ MT (Norm) หรือยืดเกิน (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm และ D4 MTOS) ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ทำการวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทาง **p < 0.01 เทียบกับการยืดปกติ) การหาปริมาณกราฟแท่งของความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในอาหารเลี้ยงเชื้อจากชิ้นหัวใจที่เลี้ยงภายใต้สภาวะยืดปกติ MT (Norm) หรือยืดเกิน (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm และ D4 MTOS) ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน ทำการวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทาง **p < 0.01 เทียบกับการยืดปกติ)ฮิสโทแกรมเชิงปริมาณของความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในอาหารเลี้ยงเชื้อจากชิ้นหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะ MT ยืดปกติ (ปกติ) หรือเกินขนาด (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm และ D4)MTOS) ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองปัจจัยถูกดำเนินการ**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 เมื่อเทียบกับการยืดปกติ) a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（ D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01）。 ปริมาณของความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในชิ้นเนื้อหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะยืดปกติ MT (Norm) หรือยืดเกิน (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) จาก 猪的切片/组，可以双向方方发发动 ** เปรียบเทียบกับการยืดปกติ หน้า < 0.01)ฮิสโทแกรม การหาปริมาณของความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในชิ้นหัวใจที่เลี้ยงภายใต้เงื่อนไขของการยืด MT ปกติ (ปกติ) หรือยืดเกิน (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) และ D4 MTOS) ชิ้น/กลุ่มจากสุกรที่แตกต่างกัน การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 เมื่อเทียบกับการยืดปกติ) b ภาพตัวแทนของชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วย troponin-T และ WGA (ซ้าย) และการวัดขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) เซลล์/กลุ่มจาก 10 ชิ้นที่แตกต่างกันจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ t แบบสองด้านของนักเรียน **** p < 0.0001 เทียบกับการยืดปกติ) b ภาพตัวแทนของชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วย troponin-T และ WGA (ซ้าย) และการวัดขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) เซลล์/กลุ่มจาก 10 ชิ้นที่แตกต่างกันจากหมูที่แตกต่างกัน ดำเนินการทดสอบ t แบบสองด้าน ****p <0.0001 เทียบกับการยืดปกติ) b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-кри терий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ภาพตัวแทนของส่วนหัวใจที่ย้อมด้วย troponin-T และ AZP (ซ้าย) และการวัดขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) เซลล์/กลุ่มจาก 10 ส่วนที่แตกต่างกันจากหมูที่แตกต่างกัน ทำการทดสอบแบบสองด้านของนักเรียน **** p <0.0001 เทียบกับสายพันธุ์ปกติ) b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b ภาพตัวแทนของชิ้นหัวใจที่ย้อมด้วย calcarein-T และ WGA (ซ้าย) และขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 จาก 10 ชิ้นที่แตกต่างกัน (D6 MTNorm)) ทดสอบเซลล์/组，两方法有尾学生 เปรียบเทียบกับการยืดปกติ ****p < 0.0001) b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клет ок (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ภาพตัวแทนของส่วนหัวใจที่ย้อมด้วย troponin-T และ AZP (ซ้าย) และปริมาณขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) จาก 10 ส่วนที่แตกต่างกันจากหมูที่แตกต่างกัน) เซลล์/กลุ่ม, เกณฑ์แบบสองด้านของนักเรียน t;****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับความเครียดปกติ) c ภาพตัวแทนสำหรับวันที่ 0 และวันที่ 6 MTOS ชิ้นส่วนหัวใจที่มีภูมิคุ้มกันสำหรับ troponin-T และ NFATC4 และปริมาณของการเคลื่อนย้ายของ NFATC4 ไปยังนิวเคลียสของ CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ชิ้น/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน ทำการทดสอบ t-test แบบสองด้านของนักเรียน * p <0.05) c ภาพตัวแทนสำหรับวันที่ 0 และวันที่ 6 MTOS ชิ้นส่วนหัวใจที่มีภูมิคุ้มกันสำหรับ troponin-T และ NFATC4 และปริมาณของการเคลื่อนย้าย NFATC4 ไปยังนิวเคลียสของ CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ชิ้น/กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน ทำการทดสอบ t-test แบบสองด้าน * p <0.05) c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 และ 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т และ NFATC4, และ количественная оце нка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c ภาพตัวแทนสำหรับส่วนของหัวใจที่ MTOS 0 และ 6 วัน immunolabeled สำหรับ troponin-T และ NFATC4 และปริมาณของการเคลื่อนย้าย NFATC4 ในนิวเคลียสของเซลล์โพรง (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ชิ้น / กลุ่มจากหมูที่แตกต่างกัน) ทำการทดสอบแบบสองด้านของนักเรียน*p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性 ภูมิภาครูปภาพ，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c ภาพตัวแทนของ calcanin-T และ NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS ชิ้นหัวใจ และ NFATC4 จาก NFATC4 ที่แตกต่างกัน 易位至CM นิวเคลียสของเซลล์的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组, 时间双尾学生et电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 และ количественная оц енка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,0 5). c ภาพตัวแทนของชิ้นหัวใจ MTOS ในวันที่ 0 และ 6 สำหรับการสร้างอิมมูโนลาเบลของ troponin-T และ NFATC4 และการหาปริมาณของการเคลื่อนย้าย NFATC4 ในนิวเคลียสของ CM จากสุกรที่แตกต่างกัน (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ชิ้น/กลุ่ม, สองด้าน t -เกณฑ์นักเรียน * p <0.05)แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน
การวิจัยเกี่ยวกับหัวใจและหลอดเลือดแบบแปลต้องการแบบจำลองเซลล์ที่สร้างสภาพแวดล้อมของหัวใจได้อย่างถูกต้องในการศึกษานี้ อุปกรณ์ CTCM ได้รับการพัฒนาและมีลักษณะเฉพาะที่สามารถกระตุ้นส่วนบางเฉียบของหัวใจได้ระบบ CTCM รวมถึงการกระตุ้นระบบเครื่องกลไฟฟ้าที่ซิงโครไนซ์ทางสรีรวิทยาและการเสริมประสิทธิภาพของของเหลว T3 และ Dexเมื่อชิ้นส่วนของหัวใจสุกรสัมผัสกับปัจจัยเหล่านี้ ความมีชีวิต ความสมบูรณ์ของโครงสร้าง กิจกรรมเมตาบอลิซึม และการแสดงออกของการถอดเสียงยังคงเหมือนเดิมในเนื้อเยื่อหัวใจสดหลังจาก 12 วันของการเพาะเลี้ยงนอกจากนี้การยืดเนื้อเยื่อหัวใจมากเกินไปอาจทำให้หัวใจโตมากเกินไปซึ่งเกิดจากภาวะ hyperextensionโดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนบทบาทที่สำคัญของสภาวะการเพาะเชื้อทางสรีรวิทยาในการรักษาฟีโนไทป์ของหัวใจให้เป็นปกติ และเป็นเวทีสำหรับการคัดกรองยา
มีหลายปัจจัยที่นำไปสู่การสร้างสภาพแวดล้อมที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการทำงานและการอยู่รอดของ cardiomyocytesปัจจัยที่ชัดเจนที่สุดของปัจจัยเหล่านี้เกี่ยวข้องกับ (1) ปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ (2) การกระตุ้นด้วยกลไกไฟฟ้า (3) ปัจจัยทางร่างกาย และ (4) สารตั้งต้นที่เผาผลาญปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ต่อเซลล์ทางสรีรวิทยาต้องการเครือข่ายสามมิติที่ซับซ้อนของเซลล์หลายประเภทที่สนับสนุนโดยเมทริกซ์นอกเซลล์ปฏิสัมพันธ์ของเซลล์ที่ซับซ้อนดังกล่าวเป็นเรื่องยากที่จะสร้างขึ้นใหม่ ในหลอดทดลอง โดยการเพาะเลี้ยงร่วมกันของเซลล์แต่ละประเภท แต่สามารถทำได้ง่ายโดยใช้ลักษณะออร์แกโนไทป์ของส่วนต่างๆ ของหัวใจ
การยืดทางกลและการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าของ cardiomyocytes มีความสำคัญต่อการรักษาฟีโนไทป์ของหัวใจ33,34,35ในขณะที่การกระตุ้นเชิงกลถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการปรับสภาพและการสุกของ hiPSC-CM การศึกษาที่สวยงามหลายชิ้นเมื่อเร็ว ๆ นี้พยายามกระตุ้นเชิงกลของชิ้นหัวใจในวัฒนธรรมโดยใช้การโหลดแกนเดียวการศึกษาเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการโหลดเชิงกลแกนเดียวแบบ 2 มิติมีผลในเชิงบวกต่อฟีโนไทป์ของหัวใจในระหว่างการเพาะเลี้ยงในการศึกษาเหล่านี้ ส่วนต่างๆ ของหัวใจถูกโหลดด้วยแรงดึงแบบไอโซเมตริก 17, โหลด auxotonic เชิงเส้น 18 หรือวัฏจักรการเต้นของหัวใจถูกสร้างขึ้นใหม่โดยใช้แรงป้อนกลับของทรานสดิวเซอร์และตัวขับแรงดึงอย่างไรก็ตาม วิธีการเหล่านี้ใช้การยืดเนื้อเยื่อแกนเดียวโดยไม่มีการปรับสิ่งแวดล้อมให้เหมาะสม ส่งผลให้ยีนหัวใจจำนวนมากถูกยับยั้งหรือมีการแสดงออกมากเกินไปของยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อการยืดที่ผิดปกติCTCM ที่อธิบายไว้ในที่นี้ให้เครื่องกระตุ้นระบบเครื่องกลไฟฟ้า 3 มิติที่เลียนแบบวงจรการเต้นของหัวใจตามธรรมชาติในแง่ของรอบเวลาและการยืดทางสรีรวิทยา (ยืด 25%, ซิสโตล 40%, ไดแอสโทล 60% และ 72 ครั้งต่อนาที)แม้ว่าการกระตุ้นเชิงกลสามมิตินี้เพียงอย่างเดียวไม่เพียงพอที่จะรักษาความสมบูรณ์ของเนื้อเยื่อ แต่จำเป็นต้องมีการผสมผสานระหว่างการกระตุ้นร่างกายและกลไกโดยใช้ T3/Dex เพื่อรักษาความมีชีวิต การทำงาน และความสมบูรณ์ของเนื้อเยื่ออย่างเพียงพอ
ปัจจัยทางร่างกายมีบทบาทสำคัญในการปรับฟีโนไทป์ของหัวใจผู้ใหญ่สิ่งนี้ถูกเน้นในการศึกษา HiPS-CM ซึ่งเพิ่ม T3 และ Dex ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อเร่งการเจริญเติบโตของเซลล์T3 อาจส่งผลต่อการขนส่งกรดอะมิโน น้ำตาล และแคลเซียมผ่านเยื่อหุ้มเซลล์36นอกจากนี้ T3 ยังส่งเสริมการแสดงออกของ MHC-α และการลดลงของ MHC-β ซึ่งส่งเสริมการก่อตัวของ myofibrils ที่กระตุกอย่างรวดเร็วใน cardiomyocytes ที่โตเต็มที่เมื่อเปรียบเทียบกับ myofibrils ที่กระตุกช้าใน CM ของทารกในครรภ์การขาด T3 ในผู้ป่วยไทรอยด์ต่ำส่งผลให้แถบ myofibrillar หายไปและอัตราการพัฒนาเสียงที่ลดลง37เด็กซ์ออกฤทธิ์ต่อตัวรับกลูโคคอร์ติคอยด์และแสดงให้เห็นว่าเพิ่มการหดตัวของกล้ามเนื้อหัวใจในหัวใจที่แยกตัวออกมา38 การปรับปรุงนี้ถูกคิดว่าเกี่ยวข้องกับผลกระทบต่อรายการแคลเซียมที่ขับเคลื่อนด้วยเงินฝาก (SOCE) 39,40นอกจากนี้ เด็กซ์ยังจับกับตัวรับ ทำให้เกิดการตอบสนองภายในเซลล์ในวงกว้างที่ยับยั้งการทำงานของภูมิคุ้มกันและการอักเสบ
ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่าการกระตุ้นเชิงกลทางกายภาพ (MS) ปรับปรุงประสิทธิภาพการเพาะเลี้ยงโดยรวมเมื่อเทียบกับ Ctrl แต่ล้มเหลวในการรักษาความมีชีวิต ความสมบูรณ์ของโครงสร้าง และการแสดงออกของหัวใจในช่วง 12 วันในการเพาะเลี้ยงเมื่อเปรียบเทียบกับ Ctrl แล้ว การเติม T3 และ Dex ลงใน CTCM (MT) เพาะเลี้ยงได้ปรับปรุงความมีชีวิตและรักษาโปรไฟล์การถอดความที่คล้ายกัน ความสมบูรณ์ของโครงสร้าง และกิจกรรมการเผาผลาญด้วยเนื้อเยื่อหัวใจใหม่เป็นเวลา 12 วันนอกจากนี้ โดยการควบคุมระดับการยืดของเนื้อเยื่อ แบบจำลองการเต้นของหัวใจที่กระตุ้นการเจริญเกินมากเกินไปถูกสร้างขึ้นโดยใช้ STCM ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความเก่งกาจของระบบ STCMควรสังเกตว่าแม้ว่าการเปลี่ยนแปลงของหัวใจและการเกิดพังผืดมักจะเกี่ยวข้องกับอวัยวะที่ไม่บุบสลายซึ่งเซลล์หมุนเวียนสามารถให้ไซโตไคน์ที่เหมาะสม ตลอดจนฟาโกไซโทซิสและปัจจัยการเปลี่ยนแปลงอื่นๆ ส่วนของหัวใจยังคงสามารถเลียนแบบกระบวนการไฟโบรติกเพื่อตอบสนองต่อความเครียดและการบาดเจ็บเป็นไมโอไฟโบรบลาสต์สิ่งนี้ได้รับการประเมินก่อนหน้านี้ในโมเดลชิ้นหัวใจนี้ควรสังเกตว่าพารามิเตอร์ CTCM สามารถมอดูเลตได้โดยการเปลี่ยนความดัน/แอมพลิจูดไฟฟ้าและความถี่เพื่อจำลองสภาวะต่างๆ เช่น หัวใจเต้นเร็ว หัวใจเต้นช้า และกลไกการไหลเวียนโลหิตสนับสนุน (หัวใจไม่โหลดทางกล)สิ่งนี้ทำให้ระบบมีปริมาณงานปานกลางสำหรับการทดสอบยาความสามารถของ CTCM ในการสร้างแบบจำลองภาวะหัวใจโตมากเกินไปซึ่งเกิดจากการออกแรงมากเกินไปจะช่วยปูทางสำหรับการทดสอบระบบนี้สำหรับการบำบัดเฉพาะบุคคลโดยสรุป การศึกษาปัจจุบันแสดงให้เห็นว่าการยืดกล้ามเนื้อและการกระตุ้นร่างกายมีความสำคัญต่อการรักษาวัฒนธรรมของเนื้อเยื่อหัวใจ
แม้ว่าข้อมูลที่นำเสนอนี้ชี้ให้เห็นว่า CTCM เป็นแพลตฟอร์มที่มีแนวโน้มสูงสำหรับการสร้างแบบจำลองกล้ามเนื้อหัวใจที่ไม่บุบสลาย แต่วิธีการเพาะเชื้อนี้มีข้อจำกัดบางประการข้อจำกัดหลักของวัฒนธรรม CTCM คือมันทำให้เกิดความเครียดเชิงกลแบบไดนามิกอย่างต่อเนื่องบนชิ้นส่วน ซึ่งทำให้ไม่สามารถตรวจสอบการหดตัวของชิ้นหัวใจในระหว่างแต่ละรอบได้นอกจากนี้ เนื่องจากส่วนของหัวใจมีขนาดเล็ก (7 มม.) ความสามารถในการประเมินการทำงานของซิสโตลิกนอกระบบการเพาะเลี้ยงโดยใช้เซ็นเซอร์วัดแรงแบบเดิมจึงมีจำกัดในต้นฉบับปัจจุบัน เราเอาชนะข้อจำกัดนี้ได้บางส่วนโดยการประเมินแรงดันไฟฟ้าออปติคอลเป็นตัวบ่งชี้การทำงานของการหดตัวอย่างไรก็ตาม ข้อจำกัดนี้จะต้องมีการทำงานเพิ่มเติมและอาจได้รับการแก้ไขในอนาคตโดยแนะนำวิธีการตรวจสอบการทำงานของชิ้นหัวใจในวัฒนธรรมด้วยแสง เช่น การทำแผนที่ด้วยแสงโดยใช้แคลเซียมและสีย้อมที่ไวต่อแรงดันไฟฟ้าข้อจำกัดอีกประการหนึ่งของ CTCM คือโมเดลการทำงานไม่ได้ควบคุมความเครียดทางสรีรวิทยา (พรีโหลดและอาฟเตอร์โหลด)ใน CTCM ความดันถูกเหนี่ยวนำในทิศทางตรงกันข้ามเพื่อสร้างการยืดทางสรีรวิทยา 25% ใน diastole (การยืดเต็มที่) และ systole (ความยาวของการหดตัวระหว่างการกระตุ้นด้วยไฟฟ้า) ในเนื้อเยื่อขนาดใหญ่มากข้อจำกัดนี้ควรถูกลบออกในการออกแบบ CTCM ในอนาคตโดยแรงกดที่เพียงพอบนเนื้อเยื่อหัวใจจากทั้งสองด้าน และโดยการใช้ความสัมพันธ์ของแรงดัน-ปริมาตรที่แน่นอนที่เกิดขึ้นในห้องของหัวใจ
การเปลี่ยนแปลงที่ทำให้เกิดการยืดมากเกินไปที่รายงานในต้นฉบับนี้ จำกัด อยู่ที่การเลียนแบบสัญญาณการยืดกล้ามเนื้อมากเกินไปดังนั้น แบบจำลองนี้สามารถช่วยในการศึกษาการส่งสัญญาณภาวะโภชนาการเกินที่เหนี่ยวนำให้เกิดภาวะยืดขยายได้ โดยไม่จำเป็นต้องมีปัจจัยทางร่างกายหรือระบบประสาท (ซึ่งไม่มีอยู่ในระบบนี้)จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อเพิ่มความหลากหลายของ CTCM เช่น การเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ภูมิคุ้มกัน ปัจจัยทางร่างกายของพลาสมาแบบหมุนเวียน และการปกคลุมด้วยเส้นเมื่อการเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ประสาทจะปรับปรุงความเป็นไปได้ของการสร้างแบบจำลองโรคด้วย CTCM
การศึกษาครั้งนี้ใช้สุกร 13 ตัวขั้นตอนสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางของสถาบันและได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันมหาวิทยาลัยหลุยส์วิลล์ส่วนโค้งของหลอดเลือดแดงใหญ่ถูกหนีบและหัวใจถูกเติมด้วย cardioplegia ที่ปราศจากเชื้อ 1 ลิตร (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH สูงถึง 7.4); หัวใจถูกเก็บรักษาไว้ในสารละลาย cardioplegic ที่เย็นจัดจนกระทั่งส่งไปยังห้องปฏิบัติการบนน้ำแข็ง ซึ่งโดยปกติจะใช้เวลาน้อยกว่า 10 นาที หัวใจถูกเก็บรักษาไว้ในสารละลาย cardioplegic ที่เย็นจัดจนกระทั่งส่งไปยังห้องปฏิบัติการบนน้ำแข็ง ซึ่งโดยปกติจะใช้เวลาน้อยกว่า 10 นาที <10 ми น. หัวใจถูกเก็บไว้ในสารละลาย cardioplegic ที่เย็นจัดจนกระทั่งส่งไปยังห้องปฏิบัติการบนน้ำแข็ง ซึ่งโดยปกติจะใช้เวลา <10 นาที将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. เก็บหัวใจไว้บนน้ำแข็ง cardioplegia จนกว่าจะส่งไปยังห้องปฏิบัติการบนน้ำแข็ง โดยปกติจะน้อยกว่า 10 นาที
อุปกรณ์ CTCM ได้รับการพัฒนาในซอฟต์แวร์ SolidWorks โดยใช้คอมพิวเตอร์ช่วยในการออกแบบ (CAD)ช่องเพาะเลี้ยง ตัวแบ่ง และช่องอากาศทำจากพลาสติกอะคริลิกใส CNCวงแหวนสำรองขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 7 มม. ทำจากโพลีเอทิลีนความหนาแน่นสูง (HDPE) ตรงกลางและมีร่องโอริงเพื่อรองรับโอริงซิลิโคนที่ใช้ปิดผนึกสื่อด้านล่างเยื่อซิลิกาบาง ๆ จะแยกห้องเพาะเชื้อออกจากจานแยกเมมเบรนซิลิโคนถูกตัดด้วยเลเซอร์จากแผ่นซิลิโคนหนา 0.02″ และมีความแข็ง 35Aปะเก็นซิลิโคนด้านล่างและด้านบนถูกตัดด้วยเลเซอร์จากแผ่นซิลิโคนหนา 1/16″ และมีความแข็ง 50Aสกรูและน็อตปีกสแตนเลส 316L ใช้สำหรับยึดบล็อกและสร้างซีลกันอากาศ
แผงวงจรพิมพ์ (PCB) เฉพาะได้รับการออกแบบให้รวมเข้ากับระบบ C-PACE-EMซ็อกเก็ตตัวเชื่อมต่อเครื่องสวิสบน PCB เชื่อมต่อกับขั้วไฟฟ้ากราไฟท์ด้วยสายทองแดงชุบเงินและสกรู 0-60 สีบรอนซ์ที่ขันเข้ากับขั้วไฟฟ้าแผงวงจรพิมพ์อยู่ในฝาครอบของเครื่องพิมพ์ 3 มิติ
อุปกรณ์ CTCM ถูกควบคุมโดยตัวกระตุ้นนิวแมติกที่ตั้งโปรแกรมได้ (PPD) ซึ่งสร้างแรงดันไหลเวียนโลหิตที่ควบคุมคล้ายกับวงจรการเต้นของหัวใจเมื่อความดันภายในห้องอากาศเพิ่มขึ้น เยื่อหุ้มซิลิโคนที่ยืดหยุ่นได้จะขยายตัวขึ้น บังคับให้ตัวกลางอยู่ใต้เนื้อเยื่อพื้นที่ของเนื้อเยื่อจะถูกยืดออกโดยการขับของเหลวออกโดยเลียนแบบการขยายตัวทางสรีรวิทยาของหัวใจในช่วงไดแอสโทลเมื่อถึงจุดสูงสุดของการผ่อนคลาย การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าจะถูกใช้ผ่านขั้วไฟฟ้ากราไฟท์ ซึ่งช่วยลดความดันในห้องอากาศและทำให้เกิดการหดตัวของเนื้อเยื่อส่วนต่างๆภายในท่อมีวาล์วห้ามเลือดพร้อมเซ็นเซอร์วัดแรงดันเพื่อตรวจจับแรงดันในระบบอากาศความดันที่เซ็นเซอร์วัดความดันสัมผัสได้จะนำไปใช้กับตัวรวบรวมข้อมูลที่เชื่อมต่อกับแล็ปท็อปทำให้สามารถตรวจสอบความดันภายในห้องแก๊สได้อย่างต่อเนื่องเมื่อถึงความดันห้องสูงสุด (มาตรฐาน 80 mmHg, 140 mmHg OS) อุปกรณ์เก็บข้อมูลได้รับคำสั่งให้ส่งสัญญาณไปยังระบบ C-PACE-EM เพื่อสร้างสัญญาณแรงดันไฟฟ้าแบบไบเฟสิกเป็นเวลา 2 มิลลิวินาที โดยตั้งค่าเป็น 4 V
ได้รับส่วนของหัวใจและสภาวะการเพาะเชื้อใน 6 หลุม ดังนี้: ย้ายหัวใจที่เก็บเกี่ยวจากภาชนะถ่ายโอนไปยังถาดที่มีความเย็น (4° C.) cardioplegiaแยกช่องซ้ายด้วยใบมีดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วหั่นเป็นชิ้นขนาด 1-2 ซม. 3บล็อกเนื้อเยื่อเหล่านี้ติดอยู่กับส่วนรองรับเนื้อเยื่อด้วยกาวทิชชูและวางไว้ในอ่างทิชชู่ขนาดเล็กแบบสั่นที่มีสารละลายของ Tyrode และเติมออกซิเจนอย่างต่อเนื่อง (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-กลูโคส (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (สารละลาย 1 โมลาร์ 1 มล.), 1.8 มิลลิโมลาร์ CaCl2 (สารละลาย 1 โมลาร์ 1.8 มล.), จนถึง 1 ลิตร ddH2O)ไมโครโทมแบบสั่นถูกกำหนดให้ตัดชิ้นหนา 300 µm ที่ความถี่ 80 Hz แอมพลิจูดการสั่นสะเทือนในแนวนอน 2 มม. และอัตราการล่วงหน้า 0.03 มม./วินาทีอ่างทิชชูถูกล้อมรอบด้วยน้ำแข็งเพื่อให้สารละลายเย็นและรักษาอุณหภูมิไว้ที่ 4°ซย้ายส่วนเนื้อเยื่อจากอ่าง microtome ไปยังอ่างบ่มที่มีสารละลาย Tyrode เติมออกซิเจนอย่างต่อเนื่องบนน้ำแข็งจนกว่าจะได้ส่วนเพียงพอสำหรับจานเพาะเชื้อหนึ่งจานสำหรับการเพาะเลี้ยงทรานส์เวลล์ ส่วนต่างๆ ของเนื้อเยื่อถูกติดไว้กับที่รองรับโพลียูรีเทนกว้าง 6 มม. ที่ปลอดเชื้อและวางในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ปรับให้เหมาะสม 6 มล. (อาหารเลี้ยงเชื้อ 199 รายการ, อาหารเสริม ITS 1 รายการ, FBS 10%, VEGF 5 ng/ml, FGF-alkaline 10 ng/ml และยาปฏิชีวนะต้านเชื้อรา 2 เท่า)การกระตุ้นด้วยไฟฟ้า (10 V, ความถี่ 1.2 Hz) ถูกนำไปใช้กับส่วนเนื้อเยื่อผ่าน C-Paceสำหรับเงื่อนไข TD T3 และ Dex ใหม่ถูกเพิ่มที่ 100 nM และ 1 μM ที่การเปลี่ยนแปลงสื่อแต่ละครั้งสื่ออิ่มตัวด้วยออกซิเจนก่อนเปลี่ยน 3 ครั้งต่อวันเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อในตู้อบที่อุณหภูมิ 37°ซ และ 5% CO2
สำหรับการเพาะเลี้ยง CTCM ส่วนของเนื้อเยื่อจะถูกวางไว้บนเครื่องพิมพ์ 3 มิติที่สั่งทำขึ้นเองในจานเลี้ยงเชื้อที่มีสารละลายของ Tyrode ที่ดัดแปลงแล้วอุปกรณ์นี้ได้รับการออกแบบมาเพื่อเพิ่มขนาดของชิ้นส่วนของหัวใจ 25% ของพื้นที่ของวงแหวนรองรับสิ่งนี้ทำเพื่อไม่ให้ส่วนต่าง ๆ ของหัวใจยืดออกหลังจากถูกถ่ายโอนจากสารละลายของ Tyrode ไปยังตัวกลางและระหว่าง diastoleใช้กาวฮิสโตอะคริลิก ส่วนที่หนา 300 µm ยึดไว้กับวงแหวนรองรับที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 7 มม.หลังจากติดส่วนเนื้อเยื่อเข้ากับวงแหวนรองรับ ให้ตัดส่วนเนื้อเยื่อส่วนเกินออกและวางส่วนเนื้อเยื่อที่แนบมากลับเข้าไปในอ่างของสารละลาย Tyrode บนน้ำแข็ง (4°C) จนกว่าจะเตรียมส่วนเพียงพอสำหรับอุปกรณ์ชิ้นเดียวเวลาประมวลผลรวมสำหรับอุปกรณ์ทั้งหมดไม่ควรเกิน 2 ชั่วโมงหลังจากติดเนื้อเยื่อ 6 ส่วนเข้ากับวงแหวนพยุง อุปกรณ์ CTCM ก็ถูกประกอบขึ้นห้องเพาะเลี้ยง CTCM เติมอาหารเลี้ยงเชื้อก่อนออกซิเจน 21 มล.ย้ายส่วนเนื้อเยื่อไปที่ห้องเพาะเชื้อและใช้ปิเปตไล่ฟองอากาศออกอย่างระมัดระวังจากนั้นนำส่วนเนื้อเยื่อเข้าไปในรูและกดเบา ๆ ให้เข้าที่สุดท้าย วางฝาอิเล็กโทรดบนอุปกรณ์และถ่ายโอนอุปกรณ์ไปยังตู้อบจากนั้นเชื่อมต่อ CTCM เข้ากับท่ออากาศและระบบ C-PACE-EMตัวกระตุ้นนิวแมติกเปิดขึ้นและวาล์วอากาศเปิด CTCMระบบ C-PACE-EM ได้รับการกำหนดค่าให้ส่ง 4 V ที่ 1.2 Hz ระหว่างการเว้นจังหวะแบบ Biphasic เป็นเวลา 2 มิลลิวินาทีเปลี่ยนตัวกลางวันละสองครั้งและเปลี่ยนอิเล็กโทรดวันละครั้งเพื่อหลีกเลี่ยงการสะสมของกราไฟต์บนอิเล็กโทรดหากจำเป็น สามารถนำส่วนเนื้อเยื่อออกจากบ่อเพาะเลี้ยงเพื่อไล่ฟองอากาศที่อาจตกอยู่ใต้ส่วนนั้นสำหรับสภาวะการบำบัดด้วย MT T3/Dex ถูกเติมใหม่ด้วยการเปลี่ยนแปลงสื่อกลางแต่ละครั้งด้วย 100 nM T3 และ 1 μM Dexอุปกรณ์ CTCM ถูกเพาะเลี้ยงในตู้อบที่ 37°C และ 5% CO2
เพื่อให้ได้เส้นทางการเคลื่อนที่ของชิ้นหัวใจที่ยืดออก ระบบกล้องพิเศษได้รับการพัฒนากล้อง SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) ใช้กับเลนส์มาโคร Navitar Zoom 7000 18-108 มม. (Navitar, San Francisco, CA)การแสดงภาพได้ดำเนินการที่อุณหภูมิห้องหลังจากเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยอาหารสดตำแหน่งกล้องอยู่ที่มุม 51° และบันทึกวิดีโอที่ 30 เฟรมต่อวินาทีขั้นแรก ซอฟต์แวร์โอเพ่นซอร์ส (MUSCLEMOTION43) ใช้กับ Image-J เพื่อวัดปริมาณการเคลื่อนไหวของชิ้นหัวใจหน้ากากถูกสร้างขึ้นโดยใช้ MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) เพื่อกำหนดขอบเขตที่น่าสนใจสำหรับชิ้นส่วนหัวใจที่เต้นเพื่อหลีกเลี่ยงเสียงรบกวนมาสก์ที่แบ่งส่วนด้วยตนเองจะใช้กับภาพทั้งหมดในลำดับเฟรม จากนั้นจึงส่งต่อไปยังปลั๊กอิน MUSCLEMOTIONMuscle Motion ใช้ความเข้มเฉลี่ยของพิกเซลในแต่ละเฟรมเพื่อวัดจำนวนการเคลื่อนไหวที่สัมพันธ์กับกรอบอ้างอิงข้อมูลถูกบันทึก กรอง และใช้เพื่อหาปริมาณรอบเวลาและประเมินการยืดของเนื้อเยื่อระหว่างรอบการเต้นของหัวใจวิดีโอที่บันทึกได้รับการประมวลผลภายหลังโดยใช้ตัวกรองดิจิตอลเฟสศูนย์ลำดับที่หนึ่งในการหาปริมาณการยืดของเนื้อเยื่อ (จากยอดถึงยอด) การวิเคราะห์จากยอดถึงยอดได้ดำเนินการเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างยอดและรางในสัญญาณที่บันทึกไว้นอกจากนี้ การลดแนวโน้มยังดำเนินการโดยใช้พหุนามลำดับที่ 6 เพื่อกำจัดการเบี่ยงเบนของสัญญาณรหัสโปรแกรมได้รับการพัฒนาใน MATLAB เพื่อกำหนดการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อทั่วโลก รอบเวลา เวลาคลายตัว และเวลาหดตัว (รหัสโปรแกรมเสริม 44)
สำหรับการวิเคราะห์ความเครียด โดยใช้วิดีโอเดียวกันกับที่สร้างขึ้นสำหรับการประเมินการยืดเชิงกล อันดับแรก เราติดตามภาพสองภาพที่แสดงถึงจุดสูงสุดของการเคลื่อนไหว (จุดสูงสุด (บน) และจุดต่ำสุด (ล่าง) ของการเคลื่อนไหว) ตามซอฟต์แวร์ MUSCLEMOTIONจากนั้นเราแบ่งส่วนเนื้อเยื่อและใช้รูปแบบของอัลกอริธึมการแรเงากับเนื้อเยื่อที่แบ่งส่วน (รูปที่ 2a เพิ่มเติม)จากนั้นเนื้อเยื่อที่แบ่งส่วนจะถูกแบ่งออกเป็นพื้นผิวย่อย 10 ส่วน และความเครียดในแต่ละพื้นผิวคำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown โดยที่ Sup และ Sdown คือระยะห่างของรูปร่างจากเงาด้านบนและด้านล่างของผ้า ตามลำดับ (รูปที่ .2b เพิ่มเติม)
ส่วนของหัวใจได้รับการแก้ไขในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% เป็นเวลา 48 ชั่วโมงเนื้อเยื่อคงที่ถูกทำให้แห้งในซูโครส 10% และ 20% เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นในซูโครส 30% ข้ามคืนจากนั้นจึงฝังชิ้นส่วนในสารประกอบอุณหภูมิการตัดที่เหมาะสม (สารประกอบ OCT) และค่อยๆ แช่แข็งในอ่างไอโซเพนเทน/น้ำแข็งแห้งเก็บบล็อกฝัง OCT ไว้ที่ -80 °C จนกว่าจะแยกออกจากกันเตรียมสไลด์เป็นส่วนที่มีความหนา 8 μm
หากต้องการนำ OCT ออกจากส่วนของหัวใจ ให้อุ่นสไลด์บนบล็อกทำความร้อนที่อุณหภูมิ 95 °C เป็นเวลา 5 นาทีเติม PBS 1 มล. ในแต่ละสไลด์และบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นให้ซึมผ่านส่วนต่างๆ โดยตั้งค่า Triton-X 0.1% ใน PBS เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องเพื่อป้องกันไม่ให้แอนติบอดีที่ไม่จำเพาะจับกับตัวอย่าง ให้เติมสารละลาย BSA 3% 1 มล. ลงในสไลด์และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องจากนั้นนำ BSA ออกและล้างสไลด์ด้วย PBSทำเครื่องหมายแต่ละตัวอย่างด้วยดินสอแอนติบอดีปฐมภูมิ (เจือจาง 1:200 ใน 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) และ troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ถูกเพิ่มเข้าไปในเวลา 90 นาที จากนั้นแอนติบอดีทุติยภูมิ (เจือจาง 1:200 ใน 1% BSA) กับหนูเมาส์ Alexa Fluor 4 88 (Thermo Scientific; #A16079) กับกระต่าย Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) เป็นเวลาอีก 90 นาที ล้าง 3 ครั้งด้วย PBS เพื่อแยกการย้อมสีของเป้าหมายออกจากพื้นหลัง เราใช้เฉพาะ antibody ทุติยภูมิเป็นตัวควบคุม สุดท้าย เพิ่มคราบนิวเคลียร์ DAPI และสไลด์ถูกวางใน vectashield (Vector Laboratories) และปิดผนึกด้วยยาทาเล็บ กำลังขยาย -x) และ Keyence กล้องจุลทรรศน์กำลังขยาย 40 เท่า
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ที่ 5 ไมโครกรัม/มล. ใน PBS ใช้สำหรับการย้อมสี WGA และใช้กับส่วนที่คงที่เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องจากนั้นสไลด์จะถูกล้างด้วย PBS และเติม Sudan black ลงในแต่ละสไลด์และบ่มเป็นเวลา 30 นาทีจากนั้นสไลด์ถูกล้างด้วย PBS และเพิ่มตัวกลางฝังเวคทาชิลด์สไลด์ถูกแสดงภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ของ Keyence ที่กำลังขยาย 40 เท่า
OCT ถูกลบออกจากตัวอย่างตามที่อธิบายไว้ข้างต้นหลังจากนำ OCT ออกแล้ว ให้แช่สไลด์ในสารละลายของ Bouin ข้ามคืนจากนั้นล้างสไลด์ด้วยน้ำกลั่นเป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นนำไปแช่ในสารละลาย Bibrich aloe acid fuchsin เป็นเวลา 10 นาทีจากนั้นล้างแผ่นสไลด์ด้วยน้ำกลั่นและวางในสารละลาย 5% ฟอสโฟโมลิบดีนัม/5% กรดฟอสโฟทังสติก เป็นเวลา 10 นาทีย้ายสไลด์ลงในสารละลายสีน้ำเงินอะนิลีนโดยตรงเป็นเวลา 15 นาทีโดยไม่ต้องล้างออกจากนั้นล้างสไลด์ด้วยน้ำกลั่นและวางในสารละลายกรดอะซิติก 1% เป็นเวลา 2 นาทีแผ่นสไลด์ถูกทำให้แห้งในเอธานอล 200 นิวตันและถ่ายโอนไปยังไซลีนสไลด์ที่มีสีถูกทำให้มองเห็นได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ของ Keyence ที่มีวัตถุประสงค์ 10 เท่าเปอร์เซ็นต์ของพื้นที่พังผืดถูกหาปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ Keyence Analyzer
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), หมายเลขแค็ตตาล็อก V13154 ตามระเบียบการของผู้ผลิตที่มีการปรับเปลี่ยนบางอย่างโดยเฉพาะอย่างยิ่ง ใช้หมัดผ่าตัดที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 6 มม. เพื่อให้แน่ใจว่าเนื้อเยื่อมีขนาดสม่ำเสมอในระหว่างการวิเคราะห์ MTTเนื้อเยื่อถูกชุบแยกกันในหลุมของเพลต 12 หลุมที่มีซับสเตรต MTT ตามโปรโตคอลของผู้ผลิตชิ้นส่วนจะถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37° C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง และเนื้อเยื่อที่มีชีวิตจะเผาผลาญสารตั้งต้น MTT เพื่อสร้างสารประกอบฟอร์มาซานสีม่วงแทนที่สารละลาย MTT ด้วย DMSO 1 มล. และบ่มที่อุณหภูมิ 37 °C เป็นเวลา 15 นาทีเพื่อแยกฟอร์มาซานสีม่วงออกจากส่วนของหัวใจตัวอย่างถูกเจือจาง 1:10 ใน DMSO ในเพลตก้นใส 96 หลุม และวัดความเข้มของสีม่วงที่ 570 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านเพลต Cytation (BioTek)การอ่านถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามน้ำหนักของหัวใจแต่ละชิ้น
สื่อชิ้นหัวใจถูกแทนที่ด้วยสื่อที่มีกลูโคส 1 μCi / ml [5-3H] (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) สำหรับการทดสอบการใช้กลูโคสตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้าหลังจากการบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมง ให้เติมอาหารเลี้ยงเชื้อ 100 µl ลงในหลอดไมโครเซนติฟิวจ์ที่เปิดอยู่ซึ่งมี 0.2 N HCl 100 µlจากนั้น หลอดถูกวางในหลอดที่เรืองแสงวาบซึ่งมี dH2O 500 ไมโครลิตรเพื่อระเหย [3H]2O เป็นเวลา 72 ชั่วโมงที่ 37°ซจากนั้นถอดหลอดไมโครเซนติฟิวจ์ออกจากหลอดที่เรืองแสงวาบแล้วเติมของเหลวที่เรืองแสงวาบ 10 มล.การนับประกายแวววาวดำเนินการโดยใช้เครื่องวิเคราะห์การเรืองแสงวาบของเหลว Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA)จากนั้นจึงคำนวณการใช้กลูโคสโดยคำนึงถึง [5-3H] - กิจกรรมเฉพาะของกลูโคส สมดุลและพื้นหลังที่ไม่สมบูรณ์ การเจือจาง [5-3H] - ต่อกลูโคสที่ไม่มีฉลาก และประสิทธิภาพเคาน์เตอร์ที่เรืองแสงวาบข้อมูลจะถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามมวลของส่วนต่างๆ ของหัวใจ
หลังจากการทำให้เนื้อเยื่อเป็นเนื้อเดียวกันใน Trizol RNA จะถูกแยกออกจากส่วนของหัวใจโดยใช้ Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 ตามโปรโตคอลของผู้ผลิตการเตรียมไลบรารี RNAsec การจัดลำดับและการวิเคราะห์ข้อมูลได้ดำเนินการดังนี้:
1 ไมโครกรัมของ RNA ต่อตัวอย่างถูกใช้เป็นวัสดุเริ่มต้นสำหรับการเตรียมไลบรารี RNAไลบรารีการจัดลำดับถูกสร้างขึ้นโดยใช้ NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit สำหรับ Illumina (NEB, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต และมีการเพิ่มรหัสดัชนีลงในลำดับแอตทริบิวต์สำหรับแต่ละตัวอย่างโดยสังเขป mRNA ถูกทำให้บริสุทธิ์จาก RNA ทั้งหมดโดยใช้เม็ดแม่เหล็กที่ติดอยู่กับโพลี-ที โอลิโกนิวคลีโอไทด์การแยกส่วนดำเนินการโดยใช้ไอออนบวกคู่ที่อุณหภูมิสูงใน NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X)cDNA สายแรกถูกสังเคราะห์โดยใช้ไพรเมอร์ hexamer แบบสุ่มและ M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-)จากนั้น cDNA สายที่สองจะถูกสังเคราะห์โดยใช้ DNA polymerase I และ RNase H ส่วนยื่นที่เหลือจะถูกแปลงเป็นปลายทู่โดยกิจกรรม exonuclease/polymeraseหลังจาก adenylation ของส่วนปลายของ DNA 3 ′แล้วจะมีการต่ออะแดปเตอร์ NEBNext ที่มีโครงสร้างห่วงกิ๊บเพื่อเตรียมพร้อมสำหรับการผสมพันธุ์สำหรับการเลือกชิ้นส่วน cDNA ที่มีความยาวที่ต้องการ 150-200 bpชิ้นส่วนของไลบรารีถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ระบบ AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA)จากนั้น เอ็นไซม์ USER 3 ไมโครลิตร (NEB, USA) ที่มี cDNA ที่เลือกตามขนาดที่จับกับอะแด็ปเตอร์ถูกใช้เป็นเวลา 15 นาทีที่ 37°C และจากนั้นเป็นเวลา 5 นาทีที่ 95°C ก่อน PCRจากนั้นทำ PCR โดยใช้ Phusion High-Fidelity DNA polymerase, ไพรเมอร์ Universal PCR และไพรเมอร์ Index (X)ในที่สุด ผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการทำให้บริสุทธิ์ (ระบบ AMPure XP) และประเมินคุณภาพห้องสมุดด้วยระบบ Agilent Bioanalyzer 2100ไลบรารี cDNA ถูกจัดลำดับโดยใช้ Novaseq sequencerไฟล์ภาพ Raw จาก Illumina ถูกแปลงเป็น Raw Read โดยใช้ CASAVA Base Callingข้อมูลดิบถูกจัดเก็บไว้ในไฟล์รูปแบบ FASTQ(fq) ซึ่งมีลำดับการอ่านและคุณภาพพื้นฐานที่สอดคล้องกันเลือก HISAT2 เพื่อให้ตรงกับการอ่านลำดับที่กรองกับจีโนมอ้างอิง Sscrofa11.1โดยทั่วไปแล้ว HISAT2 รองรับจีโนมทุกขนาด รวมถึงจีโนมที่ใหญ่กว่า 4 พันล้านเบส และมีการตั้งค่าเริ่มต้นสำหรับพารามิเตอร์ส่วนใหญ่การประกบอ่านจากข้อมูล RNA Seq สามารถจัดแนวได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยใช้ HISAT2 ซึ่งเป็นระบบที่เร็วที่สุดที่มีอยู่ในปัจจุบัน โดยมีความแม่นยำเท่ากันหรือดีกว่าวิธีอื่นๆ
ความอุดมสมบูรณ์ของการถอดเสียงสะท้อนถึงระดับการแสดงออกของยีนโดยตรงระดับการแสดงออกของยีนได้รับการประเมินโดยปริมาณการถอดเสียง (จำนวนลำดับ) ที่เกี่ยวข้องกับจีโนมหรือ exonsจำนวนการอ่านเป็นสัดส่วนกับระดับการแสดงออกของยีน ความยาวของยีน และความลึกของลำดับFPKM (แฟรกเมนต์ต่อพันคู่ฐานของลำดับการถอดเสียงต่อล้านคู่ฐาน) ถูกคำนวณและค่า P ของนิพจน์ที่แตกต่างกันถูกกำหนดโดยใช้แพ็คเกจ DESeq2จากนั้นเราคำนวณอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR) สำหรับค่า P แต่ละค่าโดยใช้วิธีการของ
RNA ที่แยกได้จากส่วนของหัวใจถูกแปลงเป็น cDNA ที่ความเข้มข้น 200 ng/μl โดยใช้ส่วนผสม SuperScript IV Vilo Master จาก Thermo (Thermo, cat. no. 11756050)RT-PCR เชิงปริมาณดำเนินการโดยใช้เพลตปฏิกิริยาโปร่งใส Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 หลุม (Thermo, cat. no. 4483319) และกาวออปติคัล microamp (Thermo, cat. no. 4311971)ส่วนผสมของปฏิกิริยาประกอบด้วย 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer และ 3.5 µl H2O ผสมกันต่อหลุมวงจร qPCR มาตรฐานถูกเรียกใช้และวัดค่า CT โดยใช้เครื่องมือ PCR แบบเรียลไทม์ Quantstudio 5 ของ Applied Biosystems (โมดูล 384 หลุม; ผลิตภัณฑ์ # A28135)ซื้อไพรเมอร์ Taqman จาก Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), G ATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) ค่า CT ของตัวอย่างทั้งหมดถูกทำให้เป็นมาตรฐานกับยีนการดูแลทำความสะอาด GAPDH
การเผยแพร่สื่อของ NT-ProBNP ได้รับการประเมินโดยใช้ชุด NT-ProBNP (หมู) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิตโดยสังเขป มีการเพิ่ม 250 µl ของแต่ละตัวอย่างและมาตรฐานซ้ำกันในแต่ละหลุมทันทีหลังจากเพิ่มตัวอย่าง ให้เติม Assay Reagent A 50 µl ลงในแต่ละหลุมเขย่าแผ่นเบา ๆ และปิดผนึกด้วยสารเคลือบหลุมร่องฟันจากนั้น ยาเม็ดแบนถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37°ซ เป็นเวลา 1 ชั่วโมงจากนั้นดูดสารละลายและล้างบ่อ 4 ครั้งด้วยสารละลาย 1X 350 µl บ่มน้ำยาล้าง 1-2 นาทีในแต่ละครั้งจากนั้นเติม Assay Reagent B 100 µl ต่อหลุมและปิดผนึกด้วยแผ่นซีลแลนท์ยาเม็ดแบนถูกเขย่าเบา ๆ และบ่มที่ 37°ซ เป็นเวลา 30 นาทีดูดสารละลายและล้างหลุม 5 ครั้งด้วยสารละลาย 1X Wash 350 µlเติมสารละลายซับสเตรต 90 µl ลงในแต่ละหลุมและปิดผนึกแผ่นอบจานที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 10-20 นาทีเติม Stop Solution 50 µl ลงในแต่ละหลุมเพลตถูกวัดทันทีโดยใช้เครื่องอ่านเพลต Cytation (BioTek) ที่ 450 นาโนเมตร
การวิเคราะห์กำลังดำเนินการเพื่อเลือกขนาดกลุ่มซึ่งจะให้พลังงาน >80% เพื่อตรวจจับการเปลี่ยนแปลงสัมบูรณ์ 10% ในพารามิเตอร์โดยมีอัตราข้อผิดพลาด Type I 5% การวิเคราะห์กำลังดำเนินการเพื่อเลือกขนาดกลุ่มซึ่งจะให้พลังงาน >80% เพื่อตรวจจับการเปลี่ยนแปลงสัมบูรณ์ 10% ในพารามิเตอร์โดยมีอัตราข้อผิดพลาด Type I 5% Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. การวิเคราะห์พลังงานดำเนินการเพื่อเลือกขนาดกลุ่มที่จะให้พลังงาน >80% เพื่อตรวจจับการเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์สัมบูรณ์ 10% โดยมีอัตราข้อผิดพลาด Type I 5%进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 80% мощности для обнаружения 10% абсолю тного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа ฉัน. การวิเคราะห์กำลังดำเนินการเพื่อเลือกขนาดกลุ่มที่จะให้กำลัง >80% เพื่อตรวจจับการเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์สัมบูรณ์ 10% และอัตราข้อผิดพลาดประเภท I 5%ส่วนเนื้อเยื่อถูกสุ่มเลือกก่อนการทดลองการวิเคราะห์ทั้งหมดเป็นแบบตาบอดเงื่อนไขและตัวอย่างถูกถอดรหัสหลังจากวิเคราะห์ข้อมูลทั้งหมดแล้วเท่านั้นซอฟต์แวร์ GraphPad Prism (ซานดิเอโก แคลิฟอร์เนีย) ถูกใช้เพื่อทำการวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมด สำหรับสถิติทั้งหมด ค่า p ถือว่ามีนัยสำคัญที่ค่า <0.05 สำหรับสถิติทั้งหมด ค่า p ถือว่ามีนัยสำคัญที่ค่า <0.05 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. สำหรับสถิติทั้งหมด ค่า p ถือว่ามีนัยสำคัญที่ค่า <0.05对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. สำหรับสถิติทั้งหมด ค่า p ถือว่ามีนัยสำคัญที่ค่า <0.05การทดสอบแบบสองด้านของนักเรียนดำเนินการกับข้อมูลที่มีการเปรียบเทียบเพียง 2 ครั้งการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวหรือสองทางถูกใช้เพื่อกำหนดนัยสำคัญระหว่างหลายกลุ่มเมื่อทำการทดสอบหลังการทดสอบ การแก้ไขของ Tukey ถูกนำไปใช้กับการเปรียบเทียบหลายรายการข้อมูล RNAsec มีข้อควรพิจารณาทางสถิติพิเศษเมื่อคำนวณ FDR และ p.adjust ตามที่อธิบายไว้ในส่วนวิธีการ
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการออกแบบการศึกษา โปรดดูบทคัดย่อรายงานการวิจัยธรรมชาติที่เชื่อมโยงกับบทความนี้