ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าจะได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงผลไซต์โดยไม่ใช้รูปแบบและ JavaScript
วิธีการทางภูมิคุ้มกันและสเปกโตรเมทริกมวลใหม่สำหรับการวิเคราะห์ที่ซับซ้อนของโอลิโกแซกคาไรด์ที่คงอยู่ในฟางข้าวโพดที่ผ่านการบำบัดล่วงหน้าด้วย AFEX ชีวมวลลิกโนเซลลูโลสเป็นทางเลือกที่ยั่งยืนสำหรับเชื้อเพลิงฟอสซิลและใช้กันอย่างแพร่หลายในการพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพสำหรับการผลิตผลิตภัณฑ์ เช่น อาหาร อาหารสัตว์ เชื้อเพลิง และสารเคมี กุญแจสำคัญของเทคโนโลยีเหล่านี้คือการพัฒนากระบวนการที่มีต้นทุนที่สามารถแข่งขันได้สำหรับการแปลงคาร์โบไฮเดรตเชิงซ้อนที่มีอยู่ในผนังเซลล์ของพืชเป็นน้ำตาลธรรมดา เช่น กลูโคส ไซโลส และอะราบิโนส เนื่องจากชีวมวลลิกโนเซลลูโลสเป็นชีวมวลที่ดื้อรั้นมาก จึงต้องผ่านการบำบัดด้วยสารเคมีความร้อน (เช่น การลอกเส้นใยแอมโมเนีย (AFEX) กรดเจือจาง (DA) ไอออนิกของเหลว (IL)) และการบำบัดทางชีวภาพ (เช่น การไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์และการหมักจุลินทรีย์) ร่วมกันเพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ อย่างไรก็ตาม เมื่อใช้เอนไซม์เชื้อราเชิงพาณิชย์ในกระบวนการไฮโดรไลซิส น้ำตาลที่ละลายน้ำได้ที่เกิดขึ้นมีเพียง 75-85% เท่านั้นที่เป็นโมโนแซ็กคาไรด์ และอีก 15-25% ที่เหลือเป็นโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้และควบคุมยาก ซึ่งจุลินทรีย์ไม่สามารถหาได้เสมอไป ก่อนหน้านี้ เราได้แยกและทำให้โอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้ยากบริสุทธิ์ได้สำเร็จโดยใช้การรวมกันของการแยกคาร์บอนและดินไดอะตอมและโครมาโทกราฟีการแยกตามขนาด และยังได้ตรวจสอบคุณสมบัติการยับยั้งเอนไซม์ของโอลิโกแซ็กคาไรด์เหล่านี้ด้วย เราพบว่าโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีการแทนที่กรดยูโรนิกที่มีเมทิลเลตในระดับโพลีเมอไรเซชัน (DP) สูงกว่านั้นยากต่อการประมวลผลด้วยเอนไซม์ผสมเชิงพาณิชย์มากกว่าโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มี DP ต่ำและโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่เป็นกลาง ที่นี่เราจะรายงานการใช้หลายวิธีเพิ่มเติม รวมทั้งการจัดทำโปรไฟล์ไกลแคนโดยใช้แอนติบอดีโมโนโคลนัล (mAbs) ที่จำเพาะต่อไกลแคนในชีวมวลของพืชเพื่อกำหนดลักษณะพันธะไกลแคนในผนังเซลล์พืชและไฮโดรไลเสตด้วยเอนไซม์ การแตกตัวของไอออนด้วยเลเซอร์ช่วยด้วยเมทริกซ์ การตรวจวัดมวลแบบเวลาบิน MALDI-TOF-MS ใช้ค่าพีคการวินิจฉัยที่ให้ข้อมูลโครงสร้างซึ่งได้จากสเปกโตรสโคปีหลังจากการสลายตัวของไอออนลบรอง แก๊สโครมาโทกราฟีและแมสสเปกโตรเมตรี (GC-MS) เพื่อกำหนดลักษณะพันธะโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีและไม่มีอนุพันธ์ เนื่องจากโอลิโกแซ็กคาไรด์มีขนาดเล็ก (DP 4–20) จึงทำให้ยากต่อการใช้สำหรับการจับและการกำหนดลักษณะของ mAb เพื่อเอาชนะปัญหานี้ เราได้ใช้การตรึงโอลิโกแซ็กคาไรด์แบบคอนจูเกชันไบโอตินแบบใหม่ ซึ่งสามารถติดฉลากโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้ที่มีค่า DP ต่ำได้ส่วนใหญ่บนพื้นผิวไมโครเพลตสำเร็จ จากนั้นจึงนำไปใช้ในระบบ mAb ที่มีปริมาณงานสูงสำหรับการวิเคราะห์การผูกเฉพาะ วิธีใหม่นี้จะช่วยให้การพัฒนาการทดสอบไกลโคมที่มีปริมาณงานสูงที่ก้าวหน้ายิ่งขึ้นในอนาคต ซึ่งสามารถใช้ในการแยกและระบุลักษณะของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีอยู่ในไบโอมาร์กเกอร์เพื่อวัตถุประสงค์ในการวินิจฉัยโรคได้
ชีวมวลลิกโนเซลลูโลสประกอบด้วยวัสดุทางการเกษตร ป่าไม้ หญ้า และไม้ เป็นวัตถุดิบที่มีศักยภาพสำหรับการผลิตผลิตภัณฑ์จากชีวภาพ รวมถึงอาหาร อาหารสัตว์ เชื้อเพลิง และสารตั้งต้นทางเคมี เพื่อผลิตผลิตภัณฑ์ที่มีมูลค่าสูงขึ้น1 คาร์โบไฮเดรต (เช่น เซลลูโลสและเฮมิเซลลูโลส) ที่มีอยู่ในผนังเซลล์ของพืชจะถูกย่อยสลายเป็นโมโนแซ็กคาไรด์โดยกระบวนการทางเคมีและการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพ (เช่น การไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์และการหมักจุลินทรีย์) การบำบัดเบื้องต้นทั่วไป ได้แก่ การขยายตัวของเส้นใยแอมโมเนีย (AFEX) กรดเจือจาง (DA) ไอออนิกของเหลว (IL) และการระเบิดด้วยไอน้ำ (SE) ซึ่งใช้สารเคมีและความร้อนร่วมกันเพื่อลดการผลิตลิกโนเซลลูโลสโดยการเปิดผนังเซลล์ของพืช3,4 ความดื้อรั้นของสสาร 5. การไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์จะดำเนินการโดยมีปริมาณของแข็งสูงโดยใช้เอนไซม์ที่มีคาร์โบไฮเดรตเชิงพาณิชย์ (CAZymes) และการหมักจุลินทรีย์โดยใช้ยีสต์หรือแบคทีเรียทรานสเจนิกเพื่อผลิตเชื้อเพลิงและสารเคมีที่ใช้ชีวภาพ 6
CAZymes ในเอนไซม์เชิงพาณิชย์ประกอบด้วยเอนไซม์ผสมที่ซับซ้อนซึ่งทำหน้าที่แยกพันธะคาร์โบไฮเดรตเชิงซ้อน-น้ำตาลเพื่อสร้างโมโนแซ็กคาไรด์2,7 ดังที่เราได้รายงานไว้ก่อนหน้านี้ เครือข่ายเชิงซ้อนของพอลิเมอร์อะโรมาติกของลิกนินกับคาร์โบไฮเดรตทำให้ยากต่อการแก้ไข ซึ่งนำไปสู่การแปลงน้ำตาลที่ไม่สมบูรณ์ โดยสะสมโอลิโกแซ็กคาไรด์เพศ 15-25% ที่ไม่ได้ผลิตขึ้นระหว่างการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ของชีวมวลที่ผ่านการบำบัดล่วงหน้า นี่เป็นปัญหาทั่วไปของวิธีการบำบัดชีวมวลล่วงหน้าต่างๆ เหตุผลบางประการที่ทำให้เกิดคอขวดนี้ ได้แก่ การยับยั้งเอนไซม์ระหว่างการไฮโดรไลซิส หรือการขาดหรือมีเอนไซม์จำเป็นในระดับต่ำ ซึ่งจำเป็นต่อการแตกพันธะน้ำตาลในชีวมวลพืช การทำความเข้าใจองค์ประกอบและลักษณะโครงสร้างของน้ำตาล เช่น พันธะน้ำตาลในโอลิโกแซกคาไรด์ จะช่วยให้เราปรับปรุงการแปลงน้ำตาลในระหว่างการไฮโดรไลซิส ทำให้กระบวนการทางเทคโนโลยีชีวภาพมีต้นทุนที่สามารถแข่งขันได้กับผลิตภัณฑ์ที่ได้จากปิโตรเลียม
การกำหนดโครงสร้างของคาร์โบไฮเดรตเป็นเรื่องท้าทายและต้องใช้การผสมผสานวิธีการต่างๆ เช่น โครมาโทกราฟีของเหลว (LC)11,12, สเปกโตรสโคปีเรโซแนนซ์แม่เหล็กนิวเคลียร์ (NMR)13, อิเล็กโทรโฟรีซิสแคปิลลารี (CE)14,15,16 และแมสสเปกโตรเมทรี (MS)17 วิธีการ MS เช่น แมสสเปกโตรเมทรีแบบ Time-of-flight ร่วมกับการแยกตัวและการแตกตัวของไอออนด้วยเลเซอร์โดยใช้เมทริกซ์ (MALDI-TOF-MS) เป็นวิธีการที่หลากหลายสำหรับการระบุโครงสร้างของคาร์โบไฮเดรต เมื่อไม่นานมานี้ มีการใช้ MS แบบคู่ขนานของการแตกตัวที่เกิดจากการชน (CID) ของโซเดียมไอออนแอดดักต์อย่างแพร่หลายที่สุดในการระบุลายนิ้วมือที่สอดคล้องกับตำแหน่งการเกาะติดของโอลิโกแซ็กคาไรด์ การกำหนดค่าแบบอะโนเมอริก ลำดับ และตำแหน่งการแตกแขนง 20, 21
การวิเคราะห์ไกลแคนเป็นเครื่องมือที่ยอดเยี่ยมสำหรับการระบุพันธะคาร์โบไฮเดรตอย่างละเอียด22 วิธีนี้ใช้แอนติบอดีโมโนโคลนอล (mAbs) ที่มุ่งเป้าไปที่ไกลแคนในผนังเซลล์ของพืชเป็นโพรบเพื่อทำความเข้าใจการเชื่อมโยงคาร์โบไฮเดรตเชิงซ้อน มี mAbs มากกว่า 250 ตัวทั่วโลกที่ออกแบบมาเพื่อใช้กับโอลิโกแซกคาไรด์เชิงเส้นและแบบกิ่งต่างๆ โดยใช้แซกคาไรด์ต่างๆ24 mAbs หลายตัวถูกใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อระบุลักษณะโครงสร้าง องค์ประกอบ และการปรับเปลี่ยนของผนังเซลล์ของพืช เนื่องจากมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญขึ้นอยู่กับประเภทของเซลล์พืช อวัยวะ อายุ ระยะการพัฒนา และสภาพแวดล้อมการเจริญเติบโต25,26 เมื่อไม่นานมานี้ วิธีนี้ถูกนำมาใช้เพื่อทำความเข้าใจประชากรของถุงในระบบพืชและสัตว์และบทบาทที่เกี่ยวข้องในการขนส่งไกลแคน ซึ่งกำหนดโดยเครื่องหมายย่อยเซลล์ ระยะการพัฒนา หรือสิ่งกระตุ้นจากสิ่งแวดล้อม และเพื่อกำหนดกิจกรรมของเอนไซม์ โครงสร้างที่แตกต่างกันของไกลแคนและไซแลนที่ได้รับการระบุ ได้แก่ เพกติน (P) ไซแลน (X) แมนแนน (M) ไซโลกลูแคน (XylG) กลูแคนพันธะผสม (MLG) อะราบิโนซิแลน (ArbX) กาแลกโตแมนแนน (GalG) กรดกลูคูโรนิก-อะราบิโนซิแลน (GArbX) และอะราบิโน-กาแลกแทน (ArbG)29
อย่างไรก็ตาม แม้จะมีความพยายามในการวิจัยเหล่านี้ แต่มีการศึกษาเพียงไม่กี่ชิ้นที่เน้นที่ลักษณะของการสะสมโอลิโกแซ็กคาไรด์ระหว่างการไฮโดรไลซิสที่มีปริมาณของแข็งสูง (HSL) ซึ่งรวมถึงการปล่อยโอลิโกแซ็กคาไรด์ การเปลี่ยนแปลงความยาวของโซ่โอลิโกเมอร์ระหว่างการไฮโดรไลซิส โพลิเมอร์ DP ต่ำต่างๆ และกราฟของโพลิเมอร์เหล่านี้ การกระจาย 30,31,32 ในขณะเดียวกัน แม้ว่าการวิเคราะห์ไกลแคนจะพิสูจน์แล้วว่าเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการวิเคราะห์โครงสร้างไกลแคนอย่างครอบคลุม แต่การประเมินโอลิโกแซ็กคาไรด์ DP ต่ำที่ละลายน้ำได้โดยใช้แอนติบอดีนั้นเป็นเรื่องยาก โอลิโกแซ็กคาไรด์ DP ขนาดเล็กที่มีน้ำหนักโมเลกุลน้อยกว่า 5-10 kDa จะไม่จับกับเพลต ELISA 33, 34 และจะถูกชะล้างออกไปก่อนการเติมแอนติบอดี
นี่เป็นครั้งแรกที่เราได้สาธิตการทดสอบ ELISA บนเพลตเคลือบอะวิดินโดยใช้แอนติบอดีโมโนโคลนัล โดยผสมผสานขั้นตอนการไบโอตินิเลชันแบบขั้นตอนเดียวสำหรับโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้และไม่ตอบสนองต่อยาเข้ากับการวิเคราะห์ไกลโคม วิธีการวิเคราะห์ไกลโคมของเราได้รับการพิสูจน์แล้วโดยการวิเคราะห์การเชื่อมโยงโอลิโกแซ็กคาไรด์เสริมโดยใช้ MALDI-TOF-MS และ GC-MS โดยใช้การสร้างอนุพันธ์ของไตรเมทิลไซลิล (TMS) ขององค์ประกอบน้ำตาลไฮโดรไลซ์ แนวทางใหม่นี้สามารถพัฒนาเป็นวิธีการที่มีปริมาณงานสูงในอนาคตและสามารถนำไปประยุกต์ใช้ในงานวิจัยทางชีวการแพทย์ได้มากขึ้น35
การดัดแปลงเอนไซม์และแอนติบอดีภายหลังการแปล เช่น ไกลโคซิเลชัน36 ส่งผลต่อกิจกรรมทางชีวภาพของเอนไซม์และแอนติบอดี ตัวอย่างเช่น การเปลี่ยนแปลงในไกลโคซิเลชันของโปรตีนในซีรั่มมีบทบาทสำคัญในโรคข้ออักเสบ และการเปลี่ยนแปลงในไกลโคซิเลชันถูกใช้เป็นเครื่องหมายวินิจฉัย37 มีรายงานในเอกสารว่าไกลแคนต่างๆ มักปรากฏในโรคต่างๆ เช่น โรคอักเสบเรื้อรังของทางเดินอาหารและตับ การติดเชื้อไวรัส มะเร็งรังไข่ มะเร็งเต้านม และมะเร็งต่อมลูกหมาก38,39,40 การทำความเข้าใจโครงสร้างของไกลแคนโดยใช้วิธี ELISA ที่ใช้ไกลแคนเป็นพื้นฐานแอนติบอดี จะทำให้มั่นใจมากขึ้นในการวินิจฉัยโรคโดยไม่ต้องใช้วิธี MS ที่ซับซ้อน
การศึกษาครั้งก่อนของเราแสดงให้เห็นว่าโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อรั้นยังคงไม่ผ่านกระบวนการไฮโดรไลซ์หลังจากการบำบัดเบื้องต้นและการไฮโดรไลซ์ด้วยเอนไซม์ (รูปที่ 1) ในงานที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ เราได้พัฒนาวิธีการสกัดแบบเฟสแข็งด้วยถ่านกัมมันต์เพื่อแยกโอลิโกแซ็กคาไรด์ออกจากไฮโดรไลเสตซังข้าวโพดที่ผ่านการบำบัดเบื้องต้นด้วย AFEX (ACSH)8 หลังจากการสกัดและการแยกเบื้องต้นแล้ว โอลิโกแซ็กคาไรด์จะถูกแยกส่วนเพิ่มเติมด้วยโครมาโทกราฟีการแยกตามขนาด (SEC) และรวบรวมตามลำดับน้ำหนักโมเลกุล โมโนเมอร์และโอลิโกเมอร์ของน้ำตาลที่ปล่อยออกมาจากการบำบัดเบื้องต้นต่างๆ ได้รับการวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์องค์ประกอบของน้ำตาล เมื่อเปรียบเทียบเนื้อหาของโอลิโกเมอร์ของน้ำตาลที่ได้จากวิธีการบำบัดเบื้องต้นต่างๆ พบว่าการมีอยู่ของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อรั้นเป็นปัญหาทั่วไปในการแปลงชีวมวลเป็นโมโนแซ็กคาไรด์ และอาจส่งผลให้ผลผลิตน้ำตาลลดลงอย่างน้อย 10-15% และสูงสุดถึง 18% วิธีนี้ใช้สำหรับการผลิตเศษส่วนโอลิโกแซกคาไรด์ในปริมาณมากต่อไป ACH ที่ได้และเศษส่วนที่ตามมาซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุลต่างกันจะถูกใช้เป็นวัสดุทดลองสำหรับการกำหนดลักษณะของโอลิโกแซกคาไรด์ในงานวิจัยนี้
หลังจากการบำบัดล่วงหน้าและการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ โอลิโกแซ็กคาไรด์ที่คงอยู่จะไม่ถูกไฮโดรไลซิส ในที่นี้ (A) เป็นวิธีการแยกโอลิโกแซ็กคาไรด์ โดยแยกโอลิโกแซ็กคาไรด์ออกจากไฮโดรไลเสตฟางข้าวโพดที่ผ่านการบำบัดล่วงหน้าด้วย AFEX (ACSH) โดยใช้ชั้นคาร์บอนกัมมันต์และดินไดอะตอมไมต์ที่อัดแน่น (B) วิธีการแยกโอลิโกแซ็กคาไรด์ จากนั้นจึงแยกโอลิโกแซ็กคาไรด์ออกด้วยโครมาโทกราฟีการแยกตามขนาด (SEC) (C) โมโนเมอร์และโอลิโกเมอร์ของแซ็กคาไรด์ที่ปลดปล่อยออกมาจากการบำบัดล่วงหน้าต่างๆ (กรดเจือจาง: DA, ของเหลวไอออนิก: IL และ AFEX) สภาวะการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์: ปริมาณของแข็งสูงที่ 25% (w/w) (ปริมาณกลูแคนประมาณ 8%) การไฮโดรไลซิส 96 ชั่วโมง ปริมาณเอนไซม์เชิงพาณิชย์ที่ 20 มก./ก. (อัตราส่วน Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) และ ( D) โมโนเมอร์น้ำตาลและโอลิโกเมอร์ของกลูโคส ไซโลส และอะราบิโนสที่ปล่อยออกมาจากซังข้าวโพดที่ผ่านการบำบัดล่วงหน้าด้วย AFEX (ACS)
การวิเคราะห์ไกลแคนได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการวิเคราะห์โครงสร้างอย่างครอบคลุมของไกลแคนในสารสกัดที่แยกจากเศษชีวมวลแข็ง อย่างไรก็ตาม แซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้นั้นไม่ค่อยมีการแสดงโดยใช้วิธีดั้งเดิมนี้41 เนื่องจากโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำนั้นยากที่จะทำให้เคลื่อนที่บนเพลต ELISA และจะถูกชะล้างออกไปก่อนที่จะเติมแอนติบอดี ดังนั้น สำหรับการจับแอนติบอดีและการจำแนกลักษณะ จึงใช้การไบโอตินิเลชันแบบขั้นตอนเดียวเพื่อเคลือบโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้และไม่เป็นไปตามข้อกำหนดบนเพลต ELISA ที่เคลือบอะวิดิน วิธีนี้ได้รับการทดสอบโดยใช้ ACSH ที่เราผลิตขึ้นก่อนหน้านี้และเศษส่วนตามน้ำหนักโมเลกุล (หรือระดับของการเกิดพอลิเมอไรเซชัน DP) การไบโอตินิเลชันแบบขั้นตอนเดียวถูกใช้เพื่อเพิ่มความสัมพันธ์ในการจับโอลิโกแซ็กคาไรด์โดยการเติมไบโอติน-LC-ไฮดราไซด์ที่ปลายรีดักชันของคาร์โบไฮเดรต (รูปที่ 2) ในสารละลาย กลุ่มเฮมิอะซีตัลที่ปลายรีดักชันจะทำปฏิกิริยากับกลุ่มไฮดราไซด์ของไบโอติน-LC-ไฮดราไซด์เพื่อสร้างพันธะไฮดราโซน ในสภาวะที่มีตัวรีดักชัน NaCNBH3 พันธะไฮดราโซนจะถูกรีดักชันจนกลายเป็นผลิตภัณฑ์ปลายที่ถูกไบโอตินิเลตที่เสถียร ด้วยการปรับเปลี่ยนปลายรีดักชันน้ำตาล ทำให้การจับกันของโอลิโกแซกคาไรด์ DP ต่ำกับเพลต ELISA เป็นไปได้ และในการศึกษาของเรา การจับกันนี้เกิดขึ้นบนเพลตเคลือบอะวิดินโดยใช้ mAb ที่กำหนดเป้าหมายที่ไกลแคน
การคัดกรองแอนติบอดีโมโนโคลนัลโดยใช้ ELISA สำหรับโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ถูกไบโอตินิเลต ที่นี่ (A) การไบโอตินิเลตโอลิโกแซ็กคาไรด์ร่วมกันและการคัดกรอง ELISA ตามมาด้วย mAb ที่กำหนดเป้าหมายไกลแคนบนแผ่นเคลือบ NeutrAvidin และ (B) แสดงขั้นตอนเดียวสำหรับการไบโอตินิเลตผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยา
จากนั้นจึงเติมเพลตเคลือบอะวิดินที่มีแอนติบอดีที่จับคู่กับโอลิโกแซ็กคาไรด์ลงในแอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิ แล้วล้างด้วยตัวกลางที่ไวต่อแสงและเวลา หลังจากการจับแอนติบอดีเสร็จสมบูรณ์แล้ว ให้เติมสารตั้งต้น TMB เพื่อฟักเพลต ในที่สุดปฏิกิริยาจะถูกหยุดด้วยกรดซัลฟิวริก เพลตที่ฟักแล้วจะถูกวิเคราะห์โดยใช้เครื่องอ่าน ELISA เพื่อกำหนดความแข็งแรงในการจับของแอนติบอดีแต่ละตัวเพื่อตรวจจับการเชื่อมโยงแบบจำเพาะต่อแอนติบอดี สำหรับรายละเอียดและพารามิเตอร์ของการทดลอง โปรดดูส่วนที่เกี่ยวข้อง "วัสดุและวิธีการ"
เราสาธิตประโยชน์ของวิธีการที่พัฒนาขึ้นใหม่นี้สำหรับการใช้งานเฉพาะโดยระบุลักษณะเฉพาะของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้ซึ่งมีอยู่ใน ACSH เช่นเดียวกับในเศษส่วนโอลิโกแซ็กคาไรด์ดิบและบริสุทธิ์ที่แยกได้จากไฮโดรไลเสตลิกโนเซลลูโลส ตามที่แสดงในรูปที่ 3 ไซแลนที่ทดแทนเอพิโทปที่พบมากที่สุดที่ระบุใน ACSH โดยใช้การวิเคราะห์ไกลโคมที่ไบโออะซิเลตมักเป็นยูโรนิก (U) หรือเมทิลยูโรนิก (MeU) และอะราบิโนกาแลกแทนเพกติก ส่วนใหญ่พบในงานวิจัยก่อนหน้านี้ของเราเกี่ยวกับการวิเคราะห์ไกลแคนของของแข็งที่ไม่ถูกไฮโดรไลซ์ (UHS)43
การตรวจจับเอพิโทปโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อต่อยาโดยใช้แอนติบอดีโมโนโคลนัลที่มุ่งเป้าไปที่ไกลแคนของผนังเซลล์ เศษส่วน "เป็นกลาง" คือเศษส่วน ACN และเศษส่วน "เป็นกรด" คือเศษส่วน FA สีแดงที่สว่างกว่าบนแผนที่ความร้อนบ่งชี้ว่ามีปริมาณเอพิโทปสูงกว่า และสีน้ำเงินที่สว่างกว่าบ่งชี้ว่ามีพื้นหลังว่างเปล่า ค่าสีบนมาตราส่วนนั้นอิงตามค่า OD ดิบสำหรับสูตร N=2 เอพิโทปหลักที่แอนติบอดีรู้จักจะแสดงอยู่ทางด้านขวา
โครงสร้างที่ไม่ใช่เซลลูโลสเหล่านี้ไม่สามารถถูกแยกออกได้โดยเซลลูเลสและเฮมิเซลลูเลสที่พบมากที่สุดในส่วนผสมเอนไซม์เชิงพาณิชย์ที่ทดสอบ ซึ่งรวมถึงเอนไซม์เชิงพาณิชย์ที่ใช้กันทั่วไปที่สุด ดังนั้น จึงจำเป็นต้องมีเอนไซม์เสริมใหม่สำหรับการไฮโดรไลซิส หากไม่มีเอนไซม์เสริมที่ไม่ใช่เซลลูโลสที่จำเป็น พันธะที่ไม่ใช่เซลลูโลสเหล่านี้จะป้องกันไม่ให้แปลงเป็นโมโนแซ็กคาไรด์อย่างสมบูรณ์ แม้ว่าพอลิเมอร์น้ำตาลต้นกำเนิดจะถูกไฮโดรไลซ์อย่างละเอียดเป็นชิ้นสั้นกว่าและละลายโดยใช้ส่วนผสมเอนไซม์เชิงพาณิชย์ก็ตาม
การศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับการกระจายสัญญาณและความแข็งแกร่งในการจับสัญญาณแสดงให้เห็นว่าเอพิโทปที่จับสัญญาณมีค่าต่ำกว่าในเศษส่วนน้ำตาล DP สูง (A, B, C, DP สูงถึง 20+) เมื่อเทียบกับเศษส่วน DP ต่ำ (D, E, F, DP) ในไดเมอร์ (รูปที่ 1) ชิ้นส่วนกรดพบได้บ่อยในเอพิโทปที่ไม่ใช่เซลลูโลสมากกว่าชิ้นส่วนที่เป็นกลาง ปรากฏการณ์เหล่านี้สอดคล้องกับรูปแบบที่สังเกตได้ในการศึกษาครั้งก่อนของเรา ซึ่งกลุ่มเอพิโทปกรดและ DP สูงมีความต้านทานต่อการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์มากกว่า ดังนั้น การมีเอพิโทปไกลแคนที่ไม่ใช่เซลลูโลสและการแทนที่ U และ MeU สามารถมีส่วนสนับสนุนต่อเสถียรภาพของโอลิโกแซ็กคาไรด์ได้อย่างมาก ควรสังเกตว่าประสิทธิภาพในการจับสัญญาณและการตรวจจับอาจเป็นปัญหาสำหรับโอลิโกแซ็กคาไรด์ DP ต่ำ โดยเฉพาะอย่างยิ่งหากเอพิโทปเป็นโอลิโกแซ็กคาไรด์ไดเมอร์หรือไตรเมอร์ สามารถทดสอบได้โดยใช้โอลิโกแซกคาไรด์เชิงพาณิชย์ที่มีความยาวต่างกัน โดยแต่ละโอลิโกแซกคาไรด์มีเพียงเอพิโทปเดียวที่จับกับ mAb เฉพาะ
ดังนั้น การใช้แอนติบอดีที่จำเพาะโครงสร้างจึงเผยให้เห็นพันธะที่ดื้อต่อชนิดต่างๆ ขึ้นอยู่กับประเภทของแอนติบอดีที่ใช้ รูปแบบการผูกที่เหมาะสม และความแรงของสัญญาณที่สร้างขึ้น (มากที่สุดและน้อยที่สุด) สามารถระบุเอนไซม์ใหม่และเพิ่มลงในส่วนผสมเอนไซม์แบบกึ่งปริมาณเพื่อการแปลงไกลโคที่สมบูรณ์ยิ่งขึ้น โดยใช้การวิเคราะห์โอลิโกแซกคาไรด์ ACSH เป็นตัวอย่าง เราสามารถสร้างฐานข้อมูลของพันธะไกลแคนสำหรับวัสดุชีวมวลแต่ละชนิดได้ ควรสังเกตว่าควรคำนึงถึงความสัมพันธ์ที่แตกต่างกันของแอนติบอดี และหากไม่ทราบความสัมพันธ์ของแอนติบอดี จะทำให้เกิดปัญหาบางประการเมื่อเปรียบเทียบสัญญาณของแอนติบอดีที่แตกต่างกัน นอกจากนี้ การเปรียบเทียบพันธะไกลแคนอาจได้ผลดีที่สุดระหว่างตัวอย่างสำหรับแอนติบอดีชนิดเดียวกัน จากนั้นสามารถเชื่อมโยงพันธะที่ดื้อรั้นเหล่านี้เข้ากับฐานข้อมูล CAZyme ซึ่งช่วยให้เราระบุเอนไซม์ เลือกเอนไซม์ที่เป็นผู้สมัคร และทดสอบเอนไซม์ที่ทำลายพันธะ หรือพัฒนาระบบจุลินทรีย์เพื่อแสดงเอนไซม์เหล่านี้สำหรับการใช้งานในโรงกลั่นชีวภาพ44
เพื่อประเมินว่าวิธีการทางภูมิคุ้มกันช่วยเสริมวิธีการทางเลือกในการกำหนดลักษณะของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำในไฮโดรไลเสตลิกโนเซลลูโลสได้อย่างไร เราจึงทำการวิเคราะห์ MALDI (รูปที่ 4, S1-S8) และวิเคราะห์แซ็กคาไรด์ที่ได้จาก TMS โดยอาศัย GC-MS บนส่วนโอลิโกแซ็กคาไรด์ในแผงเดียวกัน (รูปที่ 5) โดยใช้ MALDI เพื่อเปรียบเทียบว่าการกระจายมวลของโมเลกุลโอลิโกแซ็กคาไรด์ตรงกับโครงสร้างที่ต้องการหรือไม่ ในรูปที่ 4 แสดง MC ของส่วนประกอบที่เป็นกลาง ACN-A และ ACN-B การวิเคราะห์ ACN-A ยืนยันช่วงน้ำตาลเพนโทสตั้งแต่ DP 4–8 (รูปที่ 4) ถึง DP 22 (รูปที่ S1) ซึ่งน้ำหนักสอดคล้องกับโอลิโกแซ็กคาไรด์ MeU-xylan การวิเคราะห์ ACN-B ยืนยันกลุ่มเพนโทสและกลูโคซิลานด้วย DP 8-15 ในเอกสารเสริม เช่น รูปที่ S3 แผนที่การกระจายมวลของกลุ่มกรด FA-C แสดงช่วงของน้ำตาลเพนโทสที่ทดแทนด้วย (Me)U ที่มี DP 8-15 ซึ่งสอดคล้องกับไซแลนที่ทดแทนที่พบในการคัดกรอง mAb ที่ใช้ ELISA เอพิโทปมีความสอดคล้องกัน
สเปกตรัม MALDI-MS ของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ไม่เป็นไปตามข้อกำหนดที่ละลายน้ำได้ซึ่งมีอยู่ใน ACS โดยที่ (A) เศษส่วนที่มีช่วงน้ำหนักต่ำของ ACN-A ที่มีกรดยูโรนิกที่ถูกเมทิลเลต (DP 4-8) แทนที่โอลิโกแซ็กคาไรด์กลูคูโรซิลาน และ (B) ไซแลน ACN-B และโอลิโกแซ็กคาไรด์กรดยูโรนิกที่ถูกเมทิลเลตแทนที่ด้วยกลูคูโรซิลาน (DP 8-15)
การวิเคราะห์องค์ประกอบของสารตกค้างไกลแคนของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ทนต่อปฏิกิริยา ในที่นี้ (A) องค์ประกอบของแซ็กคาไรด์ TMS ของเศษส่วนโอลิโกแซ็กคาไรด์ต่างๆ ที่ได้จากการวิเคราะห์ GC-MS (B) โครงสร้างของน้ำตาลต่างๆ ที่ได้จาก TMS ที่มีอยู่ในโอลิโกแซ็กคาไรด์ ACN – เศษส่วนอะซีโตไนไตรล์ที่มีโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่เป็นกลาง และ FA – เศษส่วนกรดเฟอรูลิกที่มีโอลิโกแซ็กคาไรด์กรด
ข้อสรุปที่น่าสนใจอีกประการหนึ่งได้มาจากการวิเคราะห์ LC-MS ของเศษส่วนโอลิโกแซกคาไรด์ ดังที่แสดงในรูป S9 (สามารถดูวิธีการได้ในเอกสารเสริมอิเล็กทรอนิกส์) มีการสังเกตเศษส่วนของกลุ่มเฮกโซสและ -OAc ซ้ำแล้วซ้ำเล่าในระหว่างการเชื่อมเศษส่วน ACN-B การค้นพบนี้ไม่เพียงแต่ยืนยันการแตกตัวที่สังเกตได้ในการวิเคราะห์ไกลโคมและ MALDI-TOF เท่านั้น แต่ยังให้ข้อมูลใหม่เกี่ยวกับอนุพันธ์ของคาร์โบไฮเดรตที่มีศักยภาพในชีวมวลลิกโนเซลลูโลสที่ผ่านการบำบัดล่วงหน้าอีกด้วย
นอกจากนี้ เรายังวิเคราะห์องค์ประกอบของน้ำตาลในกลุ่มโอลิโกแซ็กคาไรด์โดยใช้อนุพันธ์ของน้ำตาล TMS โดยใช้ GC-MS เรากำหนดองค์ประกอบของน้ำตาลประสาท (ไม่ใช่อนุพันธ์) และน้ำตาลกรด (GluA และ GalA) ในกลุ่มโอลิโกแซ็กคาไรด์ (รูปที่ 5) กรดกลูคูโรนิกพบได้ในส่วนประกอบกรด C และ D ในขณะที่กรดกาแลกทูโรนิกพบได้ในส่วนประกอบกรด A และ B ซึ่งทั้งสองอย่างนี้เป็นส่วนประกอบ DP สูงของน้ำตาลกรด ผลลัพธ์เหล่านี้ไม่เพียงแต่ยืนยันข้อมูล ELISA และ MALDI ของเราเท่านั้น แต่ยังสอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ของเราเกี่ยวกับการสะสมของโอลิโกแซ็กคาไรด์ด้วย ดังนั้น เราจึงเชื่อว่าวิธีการทางภูมิคุ้มกันสมัยใหม่ที่ใช้ไบโอตินิเลชันของโอลิโกแซ็กคาไรด์และการคัดกรอง ELISA ในภายหลังนั้นเพียงพอที่จะตรวจจับโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ละลายน้ำได้และดื้อต่อปฏิกิริยาได้ในตัวอย่างทางชีวภาพต่างๆ
เนื่องจากวิธีการคัดกรอง mAb ที่ใช้ ELISA ได้รับการพิสูจน์แล้วด้วยวิธีการต่างๆ หลายวิธี เราจึงต้องการที่จะสำรวจศักยภาพของวิธีการเชิงปริมาณใหม่นี้เพิ่มเติม โอลิโกแซ็กคาไรด์เชิงพาณิชย์สองชนิด ได้แก่ ไซโลเฮกซาแซ็กคาไรด์โอลิโกแซ็กคาไรด์ (XHE) และ 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX) ได้รับการจัดซื้อและทดสอบโดยใช้แนวทาง mAb ใหม่ที่กำหนดเป้าหมายที่ไกลแคนของผนังเซลล์ รูปที่ 6 แสดงความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่างสัญญาณการจับที่ถูกไบโอตินิเลตและความเข้มข้นลอการิทึมของความเข้มข้นของโอลิโกแซ็กคาไรด์ ซึ่งชี้ให้เห็นถึงแบบจำลองการดูดซับของแลงเมียร์ที่เป็นไปได้ ในบรรดา mAb นั้น CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 และ CCRC-M151 มีความสัมพันธ์กับ XHE และ CCRC-M108, CCRC-M109 และ LM11 มีความสัมพันธ์กับ A2XX ในช่วง 1 นาโนเมตรถึง 100 นาโนเมตร เนื่องจากแอนติบอดีมีจำกัดในระหว่างการทดลอง จึงทำการทดลองกับความเข้มข้นของโอลิโกแซกคาไรด์แต่ละความเข้มข้นได้จำกัด ควรสังเกตว่าแอนติบอดีบางชนิดมีปฏิกิริยากับโอลิโกแซกคาไรด์ชนิดเดียวกันเป็นสารตั้งต้นแตกต่างกันมาก อาจเป็นเพราะแอนติบอดีจับกับเอพิโทปที่ต่างกันเล็กน้อยและอาจมีความสัมพันธ์ในการจับที่แตกต่างกันมาก กลไกและนัยของการระบุเอพิโทปที่แม่นยำจะซับซ้อนมากขึ้นเมื่อนำแนวทาง mAb ใหม่ไปใช้กับตัวอย่างจริง
โอลิโกแซ็กคาไรด์เชิงพาณิชย์สองชนิดถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดช่วงการตรวจจับของ mAb ที่กำหนดเป้าหมายไกลแคนต่างๆ ที่นี่ ความสัมพันธ์เชิงเส้นกับความเข้มข้นลอการิทึมของความเข้มข้นของโอลิโกแซ็กคาไรด์บ่งชี้รูปแบบการดูดซับของแลงเมียร์สำหรับ (A) XHE กับ mAb และ (B) A2XX กับ mAb เอพิโทปที่สอดคล้องกันบ่งชี้โครงสร้างของโอลิโกแซ็กคาไรด์เชิงพาณิชย์ที่ใช้เป็นสารตั้งต้นในการทดสอบ
การใช้แอนติบอดีโมโนโคลนัลที่กำหนดเป้าหมายไกลแคน (การวิเคราะห์ไกลโคโคมิกหรือการคัดกรอง mAb ตาม ELISA) เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการจำแนกลักษณะเชิงลึกของไกลแคนของผนังเซลล์หลักส่วนใหญ่ที่ประกอบเป็นชีวมวลของพืช อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ไกลแคนแบบคลาสสิกจะระบุลักษณะเฉพาะของไกลแคนของผนังเซลล์ขนาดใหญ่เท่านั้น เนื่องจากโอลิโกแซ็กคาไรด์ส่วนใหญ่ไม่ได้ถูกตรึงอย่างมีประสิทธิภาพบนแผ่น ELISA ในการศึกษานี้ ซังข้าวโพดที่ผ่านการบำบัดล่วงหน้าด้วย AFEX จะถูกไฮโดรไลซ์ด้วยเอนไซม์ที่ปริมาณของแข็งสูง การวิเคราะห์น้ำตาลถูกใช้เพื่อกำหนดองค์ประกอบของคาร์โบไฮเดรตผนังเซลล์ที่ดื้อต่อปฏิกิริยาในไฮโดรไลเซต อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ mAb ของโอลิโกแซ็กคาไรด์ขนาดเล็กในไฮโดรไลเซตยังถูกประเมินต่ำเกินไป และจำเป็นต้องมีเครื่องมือเพิ่มเติมเพื่อตรึงโอลิโกแซ็กคาไรด์อย่างมีประสิทธิภาพบนแผ่น ELISA
เราขอรายงานวิธีการตรึงโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีประสิทธิภาพและแปลกใหม่สำหรับการคัดกรอง mAb โดยการรวมไบโอตินิเลชันของโอลิโกแซ็กคาไรด์ตามด้วยการตรวจ ELISA บนแผ่นเคลือบ NeutrAvidin™ โอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ตรึงไบโอตินิเลชันแสดงความสัมพันธ์ที่เพียงพอกับแอนติบอดีเพื่อให้ตรวจจับโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ดื้อต่อยาได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ การวิเคราะห์องค์ประกอบของโอลิโกแซ็กคาไรด์ดื้อยาเหล่านี้โดยอาศัยการตรวจวัดมวลสารยืนยันผลของวิธีการใหม่นี้ในการคัดกรองภูมิคุ้มกัน ดังนั้น การศึกษาเหล่านี้จึงแสดงให้เห็นว่าการผสมผสานไบโอตินิเลชันของโอลิโกแซ็กคาไรด์และการคัดกรอง ELISA กับแอนติบอดีโมโนโคลนอลที่กำหนดเป้าหมายไกลแคนสามารถใช้เพื่อตรวจจับการเชื่อมโยงในโอลิโกแซ็กคาไรด์ และสามารถนำไปใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาด้านชีวเคมีอื่นๆ ที่กำหนดลักษณะของโครงสร้างของโอลิโกแซ็กคาไรด์
วิธีการสร้างโปรไฟล์ไกลแคนโดยใช้ไบโอตินนี้เป็นรายงานฉบับแรกที่สามารถตรวจสอบพันธะคาร์โบไฮเดรตที่ดื้อต่อปฏิกิริยาของโอลิโกแซกคาไรด์ที่ละลายน้ำได้ในชีวมวลพืช ซึ่งจะช่วยให้เข้าใจได้ว่าเหตุใดบางส่วนของชีวมวลจึงดื้อดึงมากเมื่อต้องผลิตเชื้อเพลิงชีวภาพ วิธีนี้ช่วยเติมเต็มช่องว่างที่สำคัญในวิธีการวิเคราะห์ไกลโคมและขยายขอบเขตการใช้งานไปยังสารตั้งต้นอื่นๆ นอกเหนือจากโอลิโกแซกคาไรด์ในพืช ในอนาคต เราอาจใช้หุ่นยนต์ในการไบโอตินิเลชัน และใช้กระบวนการที่เราพัฒนาขึ้นสำหรับการวิเคราะห์ตัวอย่างปริมาณมากโดยใช้ ELISA
ฟางข้าวโพด (CS) ที่ปลูกจากเมล็ดพันธุ์ลูกผสม Pioneer 33A14 ได้รับการเก็บเกี่ยวในปี 2010 จากฟาร์ม Kramer ในเมืองเรย์ รัฐโคโลราโด โดยได้รับอนุญาตจากเจ้าของที่ดิน ชีวมวลนี้สามารถนำมาใช้เพื่อการวิจัยได้ ตัวอย่างถูกเก็บรักษาไว้ในถุงซิปล็อกที่มีความชื้นน้อยกว่า 6% ในอุณหภูมิห้อง ตัวอย่างถูกเก็บรักษาไว้ในถุงซิปล็อกที่มีความชื้นน้อยกว่า 6% ในอุณหภูมิห้อง Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. ตัวอย่างถูกเก็บรักษาไว้ในถุงซิปล็อกให้แห้งโดยมีความชื้นน้อยกว่า 6% ที่อุณหภูมิห้อง样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. ตัวอย่างจะถูกเก็บไว้ในถุงซิปล็อคที่อุณหภูมิห้องโดยมีความชื้นน้อยกว่า 6%การศึกษานี้สอดคล้องกับแนวทางปฏิบัติในท้องถิ่นและระดับประเทศ การวิเคราะห์องค์ประกอบดำเนินการโดยใช้โปรโตคอล NREL พบว่าองค์ประกอบประกอบด้วยกลูแคน 31.4% ไซแลน 18.7% อะราบินัน 3.3% กาแลกแทน 1.2% อะซิติล 2.2% ลิกนิน 14.3% โปรตีน 1.7% และเถ้า 13.4%
Cellic® CTec2 (โปรตีน 138 มก./มล. ล็อต VCNI 0001) เป็นส่วนผสมที่ซับซ้อนของเซลลูเลส β-กลูโคซิเดส และ Cellic® HTec2 (โปรตีน 157 มก./มล. ล็อต VHN00001) จาก Novozymes (แฟรงคลินตัน นอร์ทแคโรไลนา สหรัฐอเมริกา) Multifect Pectinase® (โปรตีน 72 มก./มล.) ซึ่งเป็นส่วนผสมที่ซับซ้อนของเอนไซม์ที่ย่อยสลายเพกติน ได้รับการบริจาคโดย DuPont Industrial Biosciences (พาโลอัลโต แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) ความเข้มข้นของโปรตีนเอนไซม์ถูกกำหนดโดยการประมาณปริมาณโปรตีน (และลบส่วนร่วมของไนโตรเจนที่ไม่ใช่โปรตีน) โดยใช้การวิเคราะห์ไนโตรเจน Kjeldahl (วิธี AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., อิธากา นิวยอร์ก สหรัฐอเมริกา) ดินเบา 545 ซื้อจาก EMD Millipore (บิลเลอริกา แมสซาชูเซตส์) คาร์บอนกัมมันต์ (DARCO เม็ดขนาด 100 เมช), Avicel (PH-101), บีชไซแลน และสารเคมีอื่นๆ ทั้งหมดซื้อจาก Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์ รัฐมิสซูรี)
การบำบัดล่วงหน้าด้วย AFEX ดำเนินการที่ GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA) การบำบัดล่วงหน้าดำเนินการที่อุณหภูมิ 140°C เป็นเวลา 15 นาที เวลาในการคงอยู่ 46 นาทีในอัตราส่วน 1:1 ของแอมโมเนียที่ปราศจากน้ำต่อชีวมวลที่โหลด 60% (w/w) ในเครื่องปฏิกรณ์แบบตั้งโต๊ะสเตนเลส (Parr Instruments Company) ใช้เวลา 30 นาที นำเครื่องปฏิกรณ์ไปตั้งที่อุณหภูมิ 140°C และแอมโมเนียจะถูกปล่อยออกมาอย่างรวดเร็ว ทำให้ชีวมวลกลับสู่อุณหภูมิห้องได้อย่างรวดเร็ว องค์ประกอบของฟางข้าวโพดที่ผ่านการบำบัดล่วงหน้าด้วย AFEX (ACS) นั้นคล้ายคลึงกับองค์ประกอบของฟางข้าวโพดที่ไม่ได้รับการบำบัด (UT-CS)
ACSH 25% (w/w) ของแข็งสูง (ประมาณ 8% ของเดกซ์แทรน) ถูกเตรียมเป็นวัสดุเริ่มต้นสำหรับการผลิตโอลิโกแซ็กคาไรด์ในปริมาณมาก การไฮโดรไลซิส ACS ด้วยเอนไซม์ดำเนินการโดยใช้เอนไซม์ผสมเชิงพาณิชย์ซึ่งรวมถึง Cellic® Ctec2 10 มก. โปรตีนต่อกลูแคน 1 กรัม (ในชีวมวลที่ผ่านการบำบัดล่วงหน้า), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 มก. โปรตีนต่อกลูแคน 1 กรัม และมัลติเฟกต์เพกติเนส (Genencor Inc, USA) ), 5 มก. โปรตีนต่อเดกซ์แทรน 1 กรัม การไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ดำเนินการในไบโอรีแอ็กเตอร์ขนาด 5 ลิตรที่มีปริมาตรการทำงาน 3 ลิตร pH 4.8, 50°C และ 250 รอบต่อนาที หลังจากไฮโดรไลซิสเป็นเวลา 96 ชั่วโมง ไฮโดรไลเซตจะถูกเก็บรวบรวมโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 6,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นที่ 14,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาที เพื่อแยกของแข็งที่ยังไม่ผ่านการไฮโดรไลเซตออก จากนั้นไฮโดรไลเซตจะถูกกรองแบบปลอดเชื้อผ่านบีกเกอร์กรองขนาด 0.22 มม. ไฮโดรไลเซตที่กรองแล้วจะถูกเก็บไว้ในขวดปลอดเชื้อที่อุณหภูมิ 4°C จากนั้นจึงแยกส่วนด้วยคาร์บอน
การวิเคราะห์องค์ประกอบของตัวอย่างชีวมวลจากสารสกัดตามขั้นตอนการวิเคราะห์ในห้องปฏิบัติการของ NREL: การเตรียมตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์องค์ประกอบ (NREL/TP-510-42620) และการกำหนดคาร์โบไฮเดรตโครงสร้างและลิกนินในชีวมวล (NREL/TP-510 – 42618)47.
การวิเคราะห์โอลิโกแซ็กคาไรด์ของกระแสไฮโดรไลเซตดำเนินการในระดับ 2 มล. โดยใช้วิธีการไฮโดรไลซิสด้วยกรดที่ใช้หม้ออัดไอน้ำ ผสมตัวอย่างไฮโดรไลเซตกับกรดซัลฟิวริก 72% 69.7 µl ในหลอดเพาะเลี้ยงที่มีฝาเกลียวขนาด 10 มล. แล้วฟักเป็นเวลา 1 ชั่วโมงบนโต๊ะที่อุณหภูมิ 121 °C ปล่อยให้เย็นบนน้ำแข็งแล้วกรองลงในขวดโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (HPLC) ความเข้มข้นของโอลิโกแซ็กคาไรด์ถูกกำหนดโดยการลบความเข้มข้นของโมโนแซ็กคาไรด์ในตัวอย่างที่ไม่ได้ไฮโดรไลซ์ออกจากความเข้มข้นของน้ำตาลทั้งหมดในตัวอย่างที่ไฮโดรไลซ์ด้วยกรด
ความเข้มข้นของกลูโคส ไซโลส และอะราบิโนสในชีวมวลที่ไฮโดรไลซ์ด้วยกรดถูกวิเคราะห์โดยใช้ระบบ Shimadzu HPLC ที่ติดตั้งเครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติ เครื่องทำความร้อนแบบคอลัมน์ ปั๊มไอโซเครติก และตัวตรวจจับดัชนีหักเหแสงบนคอลัมน์ Bio-Rad Aminex HPX-87H คอลัมน์ถูกคงอุณหภูมิไว้ที่ 50°C และชะออกด้วย H2SO4 5 mM 0.6 มล./นาทีในน้ำไหล
สารละลายไฮโดรไลเซตเจือจางและวิเคราะห์ปริมาณโมโนเมอร์และโอลิโกแซ็กคาไรด์ น้ำตาลโมโนเมอร์ที่ได้หลังจากการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์วิเคราะห์ด้วย HPLC ที่ติดตั้งคอลัมน์ Aminex HPX-87P ของ Bio-Rad (Hercules, CA) และคอลัมน์ป้องกันเถ้า อุณหภูมิของคอลัมน์รักษาไว้ที่ 80°C ใช้น้ำเป็นเฟสเคลื่อนที่ด้วยอัตราการไหล 0.6 มล./นาที โอลิโกแซ็กคาไรด์ถูกกำหนดโดยการไฮโดรไลซิสในกรดเจือจางที่ 121°C ตามวิธีการที่อธิบายไว้ในเอกสารอ้างอิง 41, 48, 49
การวิเคราะห์แซคคาไรด์ดำเนินการกับสารตกค้างชีวมวลดิบที่ผ่านการบำบัดล่วงหน้าด้วย AFEX และสารตกค้างชีวมวลที่ไม่ถูกไฮโดรไลซ์ทั้งหมด (รวมถึงการผลิตสารสกัดผนังเซลล์แบบต่อเนื่องและการคัดกรอง mAb) โดยใช้ขั้นตอนที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 27, 43, 50, 51 สำหรับการวิเคราะห์ไกลโคม สารตกค้างที่ไม่ละลายแอลกอฮอล์ของวัสดุผนังเซลล์พืชจะถูกเตรียมจากสารตกค้างชีวมวลและทำการสกัดแบบต่อเนื่องด้วยรีเอเจนต์ที่มีฤทธิ์กัดกร่อนมากขึ้น เช่น แอมโมเนียมออกซาเลต (50 มิลลิโมลาร์) โซเดียมคาร์บอเนต (50 มิลลิโมลาร์และ 0.5% w/v) CON (1M และ 4M ทั้งคู่มีโซเดียมโบโรไฮไดรด์ 1% w/v) และกรดคลอไรต์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้52,53 จากนั้นจึงนำสารสกัดไปทำการทดสอบ ELISA กับกลุ่มสาร mAb50 เชิงซ้อนที่มุ่งเป้าไปที่ไกลแคนของผนังเซลล์ และปฏิกิริยาการจับกับ mAb จะแสดงเป็นแผนที่ความร้อน mAbs ที่กำหนดเป้าหมายไกลแคนผนังเซลล์ของพืชถูกสั่งซื้อจากสต็อกในห้องปฏิบัติการ (ซีรีส์ CCRC, JIM และ MAC)
การไบโอตินิเลชันโอลิโกแซ็กคาไรด์แบบขั้นตอนเดียว การจับคู่คาร์โบไฮเดรตกับไบโอติน-LC-ไฮดราไซด์ดำเนินการโดยใช้ขั้นตอนต่อไปนี้ ไบโอติน-LC-ไฮดราไซด์ (4.6 มก./12 ไมโครโมล) ถูกละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO, 70 ไมโครโมล) โดยการคนอย่างแรงและให้ความร้อนที่ 65°C เป็นเวลา 1 นาที เติมกรดอะซิติกบริสุทธิ์ (30 ไมโครโมล) และเทส่วนผสมลงบนโซเดียมไซยาโนโบโรไฮไดรด์ (6.4 มก./100 ไมโครโมล) และละลายหมดหลังจากให้ความร้อนที่ 65°C เป็นเวลาประมาณ 1 นาที จากนั้นจึงเติมส่วนผสมปฏิกิริยา 5 ถึง 8 ไมโครลิตรลงในโอลิโกแซ็กคาไรด์แห้ง (1-100 นาโนโมล) เพื่อให้ได้ส่วนเกินของฉลากที่ปลายรีดักชันเป็นโมลหรือมากกว่า 10 เท่า ปฏิกิริยาเกิดขึ้นที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากนั้นตัวอย่างจะถูกทำให้บริสุทธิ์ทันที ไม่มีการใช้โซเดียมไซยาโนโบโรไฮไดรด์ในการทดลองการติดฉลากโดยไม่ใช้การรีดักชัน และตัวอย่างจะถูกทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 2.5 ชั่วโมง
การเคลือบและการล้างตัวอย่างโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ถูกไบโอตินิเลตด้วยวิธี ELISA เติมตัวอย่างที่ถูกไบโอตินิเลต 25 μl (ตัวอย่างเข้มข้นแต่ละตัวอย่างเจือจางในสารละลายบัฟเฟอร์ Tris 0.1 M 5 มล. 100 μl) ลงในแต่ละหลุมของแผ่นเคลือบอะวิดิน หลุมควบคุมเคลือบด้วยไบโอติน 50 μl ที่ความเข้มข้น 10 μg/มล. ใน TBS 0.1 M ใช้น้ำดีไอออนไนซ์เป็นสารเคลือบสำหรับการวัดแบบว่างเปล่า บ่มเม็ดยาไว้ที่อุณหภูมิห้องในที่มืดเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ล้างแผ่นด้วยนมพร่องมันเนย 0.1% ใน TBS 0.1 M โดยใช้โปรแกรมหมายเลข 11 สำหรับ Grenier flat 3A
การเติมและการล้างแอนติบอดีปฐมภูมิ เติมแอนติบอดีปฐมภูมิ 40 µl ลงในแต่ละหลุม ฟักไมโครเพลทเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในที่มืด จากนั้นล้างเพลทด้วยนม 0.1% ใน 0.1 M TBS 3 ครั้งโดยใช้โปรแกรมการล้าง #11 สำหรับ Grenier Flat 3A
เติมแอนติบอดีรองและล้าง เติมแอนติบอดีรองของหนู/หนูทดลอง 50 µl (เจือจาง 1:5000 ในนม 0.1% ใน 0.1 M TBS) ลงในแต่ละหลุม ฟักไมโครเพลทเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในที่มืด จากนั้นล้างไมโครเพลท 5 ครั้งด้วยนม 0.1% ใน 0.1 M TBS โดยใช้โปรแกรมล้างเพลท Grenier Flat 5A #12
การเติมสารตั้งต้น เติม 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) 50 µl ลงในสารตั้งต้นฐาน (โดยเติมบัฟเฟอร์ 2 หยด TMB 3 หยด ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 2 หยดลงในน้ำดีไอออนไนซ์ 15 มล.) เตรียมสารตั้งต้น TMB แล้วปั่นก่อนใช้) ฟักไมโครเพลทที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที ในที่มืด
ทำตามขั้นตอนให้ครบถ้วนแล้วอ่านแท็บเล็ต เติมกรดซัลฟิวริก 1 N ปริมาตร 50 µl ลงในแต่ละหลุม แล้วบันทึกค่าการดูดกลืนแสงจาก 450 ถึง 655 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่าน ELISA
เตรียมสารละลาย 1 มก./มล. ของสารวิเคราะห์เหล่านี้ในน้ำดีไอออนไนซ์ ได้แก่ อาราบิโนส แรมโนส ฟิวโคส ไซโลส กรดกาแลกทูโรนิก (GalA) กรดกลูคูโรนิก (GlcA) แมนโนส กลูโคส กาแลกโทส แล็กโทส N-อะซิติลแมนโนซามีน (manNAc) N-อะซิติลกลูโคซามีน (glcNAc) N-อะซิติลกาแลกโทซามีน (galNAc) อิโนซิทอล (มาตรฐานภายใน) เตรียมสารมาตรฐานสองชนิดโดยเติมสารละลายน้ำตาล 1 มก./มล. ตามที่แสดงในตารางที่ 1 ตัวอย่างจะถูกแช่แข็งและทำให้แห้งแบบแห้งที่อุณหภูมิ -80° C จนกระทั่งน้ำทั้งหมดถูกกำจัดออก (โดยปกติจะใช้เวลาประมาณ 12-18 ชั่วโมง)
เติมตัวอย่าง 100–500 µg ลงในหลอดที่มีฝาเกลียวบนเครื่องชั่งวิเคราะห์ บันทึกปริมาณที่เติมลงไป ควรละลายตัวอย่างในตัวทำละลายที่มีความเข้มข้นที่กำหนด แล้วเติมลงในหลอดเป็นของเหลวบางส่วน ใช้สารมาตรฐานภายใน 20 µl ของ 1 มก./มล. สำหรับหลอดตัวอย่างแต่ละหลอด ปริมาณสารมาตรฐานภายในที่เติมลงในตัวอย่างจะต้องเท่ากับปริมาณสารมาตรฐานภายในที่เติมลงในหลอดมาตรฐาน
เติมเมทานอลไร้น้ำ 8 มล. ลงในขวดที่มีฝาเกลียว จากนั้นเติมสารละลายเมทานอล HCl 3 N 4 มล. ปิดฝาแล้วเขย่า กระบวนการนี้ไม่ใช้น้ำ
เติมเมทานอล 1 M HCl 500 µl ลงในตัวอย่างโอลิโกแซ็กคาไรด์และหลอด TMS มาตรฐาน ฟักตัวอย่างค้างคืน (168 ชั่วโมง) ที่อุณหภูมิ 80° C ในบล็อกความร้อน ทำให้ผลิตภัณฑ์เมทานอลไลซิสแห้งที่อุณหภูมิห้องโดยใช้ท่อร่วมสำหรับทำให้แห้ง เติม MeOH 200 µl แล้วทำให้แห้งอีกครั้ง ทำซ้ำขั้นตอนนี้สองครั้ง เติมเมทานอล 200 µl ไพริดีน 100 µl และอะซิติกแอนไฮไดรด์ 100 µl ลงในตัวอย่างแล้วผสมให้เข้ากัน ฟักตัวอย่างที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที แล้วทำให้แห้ง เติมเมทานอล 200 µl แล้วทำให้แห้งอีกครั้ง
เติม Tri-Sil 200 µl แล้วให้ความร้อนกับหลอดที่ปิดฝาเป็นเวลา 20 นาที ที่อุณหภูมิ 80°C จากนั้นจึงปล่อยให้เย็นลงจนถึงอุณหภูมิห้อง ใช้ท่อร่วมสำหรับอบแห้งเพื่อทำให้ตัวอย่างแห้งต่อไปจนมีปริมาตรประมาณ 50 µl สิ่งสำคัญที่ต้องทราบคือเราไม่ได้ปล่อยให้ตัวอย่างแห้งสนิท
เติมเฮกเซน 2 มล. แล้วผสมให้เข้ากันโดยใช้เครื่องวอร์เท็กซ์ เติมใยแก้วลงในปลายปิเปตปาสเตอร์ (5-8 มม.) โดยใส่ใยแก้วไว้ด้านบนของปิเปตขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 5-3/4 นิ้ว ปั่นตัวอย่างด้วยความเร็ว 3,000 กรัมเป็นเวลา 2 นาที ตกตะกอนสารตกค้างที่ไม่ละลายน้ำ ทำให้ตัวอย่างแห้งเหลือ 100-150 µl ฉีดปริมาตรประมาณ 1 µl เข้าไปใน GC-MS ที่อุณหภูมิเริ่มต้น 80 °C และเวลาเริ่มต้น 2.0 นาที (ตารางที่ 2)