Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň. Ulanylýan brauzer wersiýaňyzda CSS-iň çäkli goldawy bar. Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de gabat geliş tertibini öçüriň). Şol aralykda, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript-de görkezeris.
Adamyň içege morfogenezi, 3D epitel mikroarhitekturasynyň we giňişlik guramasynyň kript-villus aýratynlyklaryny döredýär. Bu üýtgeşik gurluş, bazal kriptografiki öýjük ýerini ekzogen mikrob antigenlerinden we metabolitlerinden goramak arkaly içege gomeostazyny saklamak üçin zerurdyr. in vitro içege modelleriniň gurluşygy üçin örän möhümdir. Noteri gelende aýtsak, ösen fiziologiki funksiýalary we biomehanikasy bilen içegäniň epiteliniň öz-özünden 3D morfogenezini döredip biler. Bu ýerde, içegäniň içege morfogenezini berkitmek üçin mikrofliid çipi bilen birleşdirilen mikrofliid çipi bilen düşündirilýär. Caco-2 ýa-da içege organoid epitel öýjükleri adaty şertlerde, şeýle hem mikrofliid platformasynda, 3D morfogeneziň induksiýasy we köp sanly şekillendiriş usuly bilen döredilen 3D epiteliýanyň häsiýetlendirilmegi .Bu protokol 5 d. Bazolýar suwuklyk akymyna gözegçilik etmek arkaly funksional içege mikroarhitekturasynyň täzelenmegine ýetýär. bar bolan beýleki usullardan has ýokarydyr. Teklip edilýän teswirnamamyzyň biomedikal, kliniki we farmasewtiki goşundylar üçin vitroda 3D içege epitel gatlaklaryny täzeden dikeltmegiň usulyny hödürläp, biomedikal gözleg jemgyýeti üçin giň täsir edip biljekdigini göz öňüne getirýäris.
Geçirilen synaglar, içege epiteli Caco-2 öýjükleriniň içegede ösdürilip ýetişdirilen1,2,3,4,5 ýa-da bilýer mikrofliid enjamlarynda6,7 esasy mehanizme anyk düşünmezden vitroda öz-özünden 3D morfogenezini başdan geçirip biljekdigini görkezýär. Caco-2 we hassadan alnan içege organoidleri tarapyndan. Epitel öýjükleri tassyklandy. Bu gözlegde, “Gibrid çip” diýlip atlandyrylýan Transwell goşundylaryny öz içine alýan we üýtgedilen mikrofliid enjamlarynda güýçli Wnt garşydaş Dikkopf-1 (DKK-1) öýjük önümçiligine we konsentrasiýa paýlanyşyna aýratyn üns berdik. Biz ekzogen Wnt antressorlary bilen baglanyşykly, Wnt protezleri bilen baglanyşykly. 1, ýa-da Soggy-1) çipiň içegesine morfogeneziň öňüni alýar ýa-da 3D epitel gatlagyny bozýar, medeniýete garşy antagonistik stresiň in vitro içege morfogenezine sebäp bolýandygyny görkezýär. Şonuň üçin epitel interfeýsinde berk morfogenez gazanmak üçin amaly çemeleşme (meselem, Wnt antagonistlerdäki derejeleri aýyrmak ýa-da minimal derejede saklamak); ýa-da gibrid-on-çip platformalary) ýa-da diffuziýa .Basolýar metbugat (mysal üçin, Transwell guýularyndaky uly bazolitar suw howdanlaryna girýär).
Bu teswirnamada, polimimetilsiloksan (PDMS) esasly gözenekli membranalarda (6A, 7A, 8, 9 ädimler ýa-da Transwell 7B, 8B, 9B ädimler, 6-njy ädimler) 10). Şeýle hem, köp sanly şekillendiriş usullaryny (11-24-nji ädimler) ulanyp, dokumalara mahsus gistogeneziň we nesil bagly öýjükli tapawudyň görkezijisini görkezýän öýjükli we molekulýar aýratynlyklary kesgitledik .Kako-2 ýa-da içege organoidleri ýaly adam içege epitel öýjüklerini ulanyp, morfogeneziň iki sany medeni formatda, gözenekli membrananyň ýerüsti üýtgemegi we gözenekli membrananyň ýerüsti üýtgemegi, 2D monokroýlaryň döremegi biomehaniki mikro-daşky gurşaw.in vitro. 2D epitel monolaýerlerinden 3D morfogenezini ýüze çykarmak üçin, medeniýetiň esasy bölümine serişdäni akdyryp, iki medeniýetli görnüşde morfogen garşydaşlaryny aýyrdyk. Iň soňunda, dikeldilýän 3D epitel gatlagynyň, morfogen garaşly epitel gatlagynyň, morfogen garaşly epitel gatlagynyň peýdalydygyny görkezýäris. epitelial barýeriň işlemezligi we probiotik esasly bejergiler Mysal.influences.
Protokolymyz esasy (mysal üçin, içegäniň mukozasy biologiýasy, öýjük biologiýasy we ösüş biologiýasy) we amaly gözlegler (mysal üçin, kliniki neşe barlagy, keselleri modellemek, dokuma in engineeringenerçiligi we gastroenterologiýa) giňişleýin alymlar üçin peýdaly bolup biler. Protokolymyzyň 3D morfogenezini öwrenýän, içerki öýjükli epiteliň tehniki dinamikasyny öwrenmek üçin protokolymyzyň 3D morfogenezini öwrenýän dinamikany öwrenýäris. Içegäniň ösmegi, täzelenmegi ýa-da gomeostaz döwründe .Bundan başga-da, teswirnamamyz Norowirus 8, Agyr ýiti dem alyş sindromy Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ýa-da Vibrio holera ýaly ýokanç serişdeleri soramak üçin peýdalydyr. Keseliň patologiýasy we patogeneziniň tomaşaçylary hem peýdalydyr. Çipli içege mikrofiziologiýa ulgamynyň ulanylmagy, uzyn boýly medeniýeti 10 we aşgazan-içege (GI) traktynda patogen bilen baglanyşykly şikesleri bejermek üçin 11 baha bermäge mümkinçilik döredip biler .Siz syzýan içege sindromy, içegäniň içege sindromy, içegäniň içege sindromy, içegäniň içege sindromy, aşgazan içege sindromy, çiş keseli, içege sindromy, içege sindromy, içegäniň içege sindromy, içegäniň içege sindromy, içegäniň içege sindromy, içegäniň içege sindromy, içegäniň içege sindromy, içegäniň içege sindromy, içegäniň içege sindromy, içegäniň içege sindromy, içegäniň içege sindromy, içegäniň içege sindromy bolup biler. epitel gatlaklary hassanyň 3D içege epitel gatlaklaryny ulanyp taýýarlanýar, bu kesellere erbet atrofiýa, kriptografiýa gysgalmagy, mukozanyň zeperlenmegi ýa-da epitelial päsgelçilik bar. Biopsiýa ýa-da öýjükden emele gelen içege organoidleri12,13. Kesel gurşawynyň has çylşyrymlylygyny has gowy modelirlemek üçin, okyjylar hassalyk periferiýa gan öýjükleri, öýjükli öýjükli öýjükler, öýjükli öýjükler; mikroarhitektura. dokumalara mahsus immun öýjükleri, 5.
3D epitel mikrostrukturasyny bölmek prosesi bolmazdan düzedip we wizuallaşdyryp bolýandygy sebäpli, giňişlikdäki transkriptomika we ýokary çözgütli ýa-da super çözgütli şekillendiriş üstünde işleýän tomaşaçylar genleriň we beloklaryň spatiotemporal dinamikasynyň epitelial ýerlerinde kartalaşdyrylmagymyz bilen gyzyklanyp bilerler. Tehnologiýa bilen gyzyklanýar. Mikrob ýa-da immun stimullaryna jogap. Mundan başga-da, içege gomeostazyny utgaşdyrýan uzyn boýly mikrobiome krosstalky 10, 14 dürli içege mukozasy gatlagynda dürli mikrob görnüşlerini, mikrob jemgyýetlerini ýa-da fekal mikrobiotany ösdürip, esasanam içege çipinde döredilip bilner. Bu çemeleşme mukoza immunologiýasyny, gastroenterologiýany, adam mikrobiomyny, kulturomikany we kliniki mikrobiologiýany öwrenýän tomaşaçylar üçin has özüne çekiji. Laboratoriýada ozal ösdürilmedik içege mikrobiotasyny ösdürip ýetişdirmäge synanyşýan. Witro morfogenez protokolyny ulaldylan medeni formatlara uýgunlaşdyryp bolýan bolsa, şol bir wagtyň özünde 24, 96 ýa-da 384 goşundylary goşup bilersiňiz. Azyk senagaty üçin derman, biomedikal ýa-da ýokary öndürijilikli barlag ýa-da tassyklaýyş platformalaryny ösdürmek. Principleörelge hökmünde, ýakynda 24 guýy plastinka görnüşinde ulaldylyp bilinýän köpsanly ýokary geçişli morfogenez ulgamynyň mümkinçiligini görkezdik. Mundan başga-da, çip önümleriniň köpüsi hökümet tarapyndan işlenip düzüldi ýa-da barlaglar geçirildi. neşe serişdelerini ýa-da bioterapewtikany barlamak üçin vitro içege morfogeneziniň öýjükli gaýtadan programmirlemegine düşünmek üçin gözegçilik ediji guramalar, neşe kandidatlarynyň siňdirilmegi we daşalmagy, içegäniň morfogenezi prosesiniň köpelmegine baha bermek üçin 3D içege sroogatlary ýa-da adaty ýa-da täjirçilik organlary arkaly baha berildi.
Içege epitelial morfogenezini öwrenmek üçin çäkli mukdarda adamda vitro morfogenezini ýüze çykarmak üçin durmuşa geçirilýän protokollaryň ýoklugy sebäpli ulanyldy. Aslynda, içege morfogenezi baradaky häzirki bilimleriň köpüsi haýwanlaryň gözleglerine esaslanýar (mysal üçin, zebrafiş20, syçanlar 21 ýa-da towuklar22). prosesler. Bu modeller köp taraplaýyn ulaldylyp bilinjek görnüşde synag etmek ukybynda-da gaty çäklidir. Şonuň üçin, wivo haýwan modellerinde we beýleki adaty statiki 2D öýjük medeniýeti modellerinde vitro dokuma gurluşlaryny täzeden dikeltmek baradaky teswirnamamyz. Öň düşündirilişi ýaly, 3D epitel gurluşlaryny ulanmak, dürli kelleli wirus epiteliniň dürli gatlaklarynyň immunizasiýa giňişligini öwrenmäge mümkinçilik berýär. mikrob öýjükleri kabul ediji faktorlara (meselem, daşky mukus gatlaklaryna garşy, IgA-nyň bölünip çykmagy we mikroblara garşy peptidler) jogap hökmünde giňişlik nokatlaryny we ekologiki ewolýusiýany emele getirmek üçin bäsleşýärler. Mundan başga-da, 3D epitel morfologiýasy içege mikrobiotalarynyň jemgyýetlerini nädip döredýändigine düşünmäge mümkinçilik berer we öýjükli gatlaklary emele getirýän gysga zynjyrly ýag kislotalary. in vitro görnüşinde döredilýär.
3D içege epitel gurluşlaryny döretmek usulymyzdan başga-da, birnäçe in vitro usullary bar. Içege organoid medeniýeti, belli bir morfogen şertlerinde içegäniň kök öýjüklerini ösdürip ýetişdirmek esasynda iň häzirki zaman dokuma in engineeringenerçilik usulydyr 23,24,25. Şeýle-de bolsa, transport analizi ýa-da mikrobiome bilelikdäki medeniýetleri üçin 3D organoid modellerini ulanmak köplenç kyn, sebäbi içegäniň içegesi lokum. mikrob öýjükleri ýa-da ekzogen antigenler ýaly komponentler çäklidir. Organoid lýumenlere giriş 26,27 mikroinjektor arkaly gowulaşyp biler, ýöne bu usul invaziv we zähmeti köp talap edýär we ýerine ýetirmek üçin ýöriteleşdirilen bilimleri talap edýär. Mundan başga-da, statiki şertlerde gidrogel skaflarynda saklanýan adaty organoid medeniýetleri wivo biomehanikasynda işjeň görkezmeýär.
Birnäçe gözleg toparlarynyň ulanýan beýleki çemeleşmeleri, jeliň üstünde izolirlenen adam içege öýjüklerini ösdürip ýetişdirmek arkaly içegäniň epitel gurluşyny takyklamak üçin deslapky 3D gidrogel skaflaryny ulanýar. 3D çap edilen, mikro tegelek ýa-da daşbasma görnüşli galyndylary ulanyp, gidrogel skaflaryny öndüriň. stromal öýjükleri skafda goşmak arkaly stroma-epitelial pyýada ýörelgesi. Şeýle-de bolsa, deslapky skaflaryň tebigaty öz-özünden morfogenetiki prosesiň görkezilmeginiň öňüni alyp biler. Bu modeller dinamiki lýuminal ýa-da interstisial akymy üpjün etmeýär, içege öýjükleriniň morfogen funksiýasyny ulanmaly. we lazer bilen arassalamak usullaryny ulanyp, içege epitel gurluşlary. Syçan içege organoidleri içegäniň turba gurluşlaryny emele getirmek üçin çyzylan nagyşlara eýerýär we içegäniň suwuklyk akymy mikrofliid modulynyň kömegi bilen gaýtadan ulanylyp bilner. Şeýle-de bolsa, bu model öz-özünden morfogenetiki prosesleri görkezmeýär we içege mehanobiologiki hereketlerini öz içine alýar. Turbanyň içindäki dürli içege segmentleriniň çylşyrymly ýasalmagy, bu modelde lýuminal suwuklyk akymy we mehaniki deformasiýa ýetmezçilik edýär. Mundan başga-da, bioprintirlemek prosesi tamamlanandan soň, synag şertlerini ýa-da öýjükleriň özara täsirini bozup, modeliň işleýşi çäkli bolup biler. Munuň ýerine, teklip edilýän teswirnamamyz öz-özünden içege morfogenezini, fiziologiki taýdan degişli gyjyndyryjy stres, biomehaniki garaşsyzlygy, biomehanikany üpjün edýär; çylşyrymly biologiki mikro-gurşawy täzeden döretmek. Şonuň üçin in vitro 3D morfogenez protokolymyz bar bolan usullaryň kynçylyklaryny ýeňip geçmek üçin goşmaça çemeleşmäni üpjün edip biler.
Biziň teswirnamamyz bütinleý 3D epitel morfogenezine gönükdirilendir, diňe medeniýetde epitel öýjükleri we mesenjimal öýjükler, endotel öýjükleri we immun öýjükleri ýaly daş-töweregindäki öýjükleriň başga görnüşleri ýok. Öň beýan edilişi ýaly, teswirnamamyzyň özeni, girizilen orta çipiň esasy tarapynda ýerleşýän morfogen ingibitorlaryny aýyrmak arkaly epitelial morfogeneziň induksiýasydyr. gibrid-on-a-çip bize 3D epitel gatlagyny döretmäge mümkinçilik berýär, epitel-mesençimal täsirleşmeler ýaly goşmaça biologiki çylşyrymlylyklar 33,34, öýjükden daşary Matrix (ECM) depozit 35 we biziň modelimizde bazal kriptografiýalarda öýjük öýjüklerini görkezýän kriptografiki aýratynlyklar mundan beýläk göz öňünde tutulmalydyr. Stromal öýjükler (mes. “Vivo35,37,38” morfogenezi. Biziň modelimize mesenjimal öýjükleriň goşulmagy morfogenetiki prosesi we öýjükleriň birikdirilmeginiň netijeliligini ýokarlandyrdy. Endotel gatlagy (ýagny, kapilýar ýa-da limfatika) molekulýar transporty kadalaşdyrmakda möhüm rol oýnaýar39 we içegäniň mikro-gurşawynda immun öýjükleriniň işe alynmagy40. özara täsirler. Şol sebäpden, organ derejesindäki çözgüt bilen has takyk fiziologiki aýratynlyklary modellemek üçin endotel öýjükleri girizilmeli bolup biler. Näsaglardan emele gelen immun öýjükleri dogabitdi immun jogaplaryny, antigeniň görkezilmegini, dogabitdi adaptasiýa immunitetini we içege keselini meňzeş kontekstde dokumalara mahsus immuniteti görkezmek üçin zerurdyr.
Gibrid çipleri ulanmak içege çipine garanyňda has ýönekeý, sebäbi enjamy gurmak has ýönekeý we Transwell goýmalaryny ulanmak içege epiteliniň ulaldylan medeniýetine mümkinçilik berýär. Şeýle-de bolsa, poliester membranalary bilen söwda taýdan elýeterli Transwell goýmalary elastik däl we peristaltiki meňzeş hereketleri simulasiýa edip bilmeýär. Apikal bölümdäki statiki häsiýetler gibrid çiplerde uzak möhletli bakteriýalaryň birleşmegine seýrek mümkinçilik berýär. Gibrid çipleri ulananymyzda Transwell goýmalarynda 3D morfogenezini güýçlendirip bilsek-de, fiziologiki taýdan degişli biomehanikanyň ýetmezçiligi we suwuk suwuklyk akymy potensial programmalar üçin gibrid çip platformalarynyň mümkinçiligini çäklendirip biler.
Çip we gibrid-çip medeniýetlerinde adam kript-villus okunyň doly göwrümli durkunyň täzelenmegi doly gurulmady. Morfogenez epitel monolaýerinden başlansoň, 3D mikroarhitektura wivo kriptografiýalaryna morfologik meňzeşligi üpjün etmeýär. Çipdäki ýokary ýokarky kanallar mikroenergetiki epiteliň beýikliginiň ýokarlanmagyna sebäp bolsa-da, iň ýokary beýiklik henizem ~ 300–400 µm bilen çäklenýär. Kiçijik we uly içegelerde adam içege kriptleriniň hakyky çuňlugy degişlilikde ~ 135 µm we ~ 400 µm, kiçi içege villiniň beýikligi ~ 600 µm41.
Surata düşüriş nukdaýnazaryndan, 3D mikroarhitekturanyň super çözgütli şekillendirişi, çipdäki içege bilen çäklendirilip bilner, sebäbi obýektiw obýektiwden epitel gatlagyna çenli zerur iş aralygy birnäçe millimetr tertipde bolýar. Bu meseläni ýeňip geçmek üçin uzak bir maksat talap edilip bilner. Mundan başga-da, PDMS.Frofrik gatlagynyň ýokary çeýeligi sebäpli mikrofab gatlagynyň hemişelik çeýeligi sebäpli inçe bölümleri düzmek kyn. her gatyň arasynda ýelmeşmek, epitel gatlagynyň üstki gurluşyny barlamak üçin ýokarky gatlagy açmak ýa-da aýyrmak gaty kyn. Mysal üçin, elektron mikroskopy (SEM) ulanyp.
PDMS-iň gidrofobikligi, gidrofobiki ownuk molekulalar bilen iş salyşýan mikrofliid esasly gözleglerde çäklendiriji faktor bolup durýar, sebäbi PDMS şeýle gidrofob molekulalaryny belli bir derejede adsorb edip bilýär. PDMS-iň üýtgeýjileri beýleki polimer materiallar bilen hem seredilip bilner. molekulalary.
Netijede, ýokary geçişli skrini ýa-da ulanyjy üçin amatly tejribe platformasy bilen üpjün etmek nukdaýnazaryndan gowy häsiýetlendirilmedi. Häzirki protokol bir mikrodewizada şpris nasosyny talap edýär, bu CO2 inkubatorda ýer alýar we uly göwrümli synaglaryň öňüni alýar. esasy metbugaty aýyrmak).
Witroda adam içege epiteliniň 3D morfogenezini ýüze çykarmak üçin, iki sany paralel mikrokanel we arasynda elastik gözenekli membranany öz içine alýan mikrofliid çip içege enjamyny ulanyp, lýumen-kapilýar interfeýsini döredýäris. Şeýle hem polýarizirlenen epitel gatlaklarynyň ikisinde bir kanaly mikrofliid enjamynyň (gibrid çip) yzygiderli bazolitiki akymlaryň üpjün edilmegini görkezýäris. epitel öýjükleri morfogen garşydaşlary esasy bölümden aýyrmak üçin akymyň ugrukdyryjy manipulýasiýasyny ulanmak arkaly görkezilip bilner. Synag tejribesiniň hemmesi (1-nji surat) bäş bölekden ybarat: (i) içege çipiniň ýa-da Transwell goýulýan gibrid çipiň mikrofabrikasiýasy (1-5 ädim; 1-nji gutu), (ii) içege epitel öýjükleri ýa-da adam içegeleri; gutular 2-5), (iii) içege çiplerindäki ýa-da gibrid çiplerdäki içege epitel öýjükleriniň medeniýeti (6-9 ädimler), (iv) 3D epitel mikrostrukturasyny häsiýetlendirmek üçin 3D morfogeneziň induksiýasy (11-24 ädimler). Iň soňunda giňişlik morfosynyň effektini barlamak üçin giňişleýin gözegçilik topary (aşaky arada ara alnyp maslahatlaşyldy), morfogeniň epitelini deňeşdirmek üçin giňişlikdäki morfogeniň netijeliligini barlamak üçin işlenip düzüldi. şertli ýa-da prosessual gözegçilikler.
Iki dürli medeni platforma ulandyk: göni kanallar ýa-da çyzykly däl kanallar bilen içege ýa-da 1-nji gutuda görkezilişi ýaly öndürilen mikrofliod enjamyna Transwell (TW) goýlan gibrid çipler we 1-nji ädim. "Enjam önümçiligi" bir çip ýa-da gibrid çip ýasamakdaky esasy ädimleri görkezýär. Bu teswirnamada ulanylýan medeni prosedura. "In vitro morfogenez", Caco-2 ýa-da organoid emele gelen epitel öýjükleriniň içegäniň çipinde ýa-da gibrid çipiň Transwell goýulmalarynda ösdürilip ýetişdirilişiniň umumy ädimlerini görkezýär. Soňra 3D morfogeneziň induksiýasy we häsiýetli epitel gurluşynyň emele gelmegi. tapawutlandyryş häsiýetnamasy, içege fiziologiýasy gözlegleri, mikrobiome ekosistemalaryny döretmek we keselleri modellemek. Içegäniň çipinde emele gelen 3D Caco-2 epitel gatlagynda görkezilen ýadrolary, F-aktin we MUC2 görkezýän “Öýjük tapawudy” şekilindäki immunofloresensiýa şekilleri. Floresan bugdaý mikroblary aglutinini ulanyp, N-asetilglukozamin galyndylary. 3D Caco-2 epitel öýjükleri, soň bolsa F-aktin (gyzyl) we ýadrolar (gök) bilen immunofloresensiýa boýag .Diz keseli modellemek, bakteriýa antigenleri (mysal üçin, lipopolisakkarid, LPS) we immun öýjükleri (mysal üçin, PBMC; ýaşyl) öýjükleri emele getirýän öýjükler bilen örtülen. aşaky hatarda: “Öýjükleriň tapawudy” salgylanmanyň rugsady bilen uýgunlaşdyryldy.2. Oksford uniwersitetiniň metbugaty; Ref.5-iň rugsady bilen köpeldilýär. NAS; “Host-Mikrob Bilelikdäki Medeniýet” 3-nji rugsadyň rugsady bilen uýgunlaşdyryldy. NAS; “Keselleri modellemek” salgylanmanyň rugsady bilen uýgunlaşdyryldy.5. NAS.
Içegäniň içindäki we gibrid çipleriň ikisi hem kremniniň galyplaryndan ýumşak litografiýa1,44 bilen demlenen we SU-8 bilen nagyşlanan PDMS nusgalaryny ulanyp ýasaldy. Her çipdäki mikrokanelleriň dizaýny, gyrkym stresleri we gidrodinamiki basyş ýaly gidrodinamikany göz öňünde tutmak bilen kesgitlenýär. çylşyrymly içegäniň çipine öwrüldi (Giňeldilen maglumatlar 1-nji surat), suwuk ýaşaýyş wagtynyň, çyzykly däl akymlaryň we medeniýetli öýjükleriň köpugurly deformasiýasynyň döremegine itergi bermek üçin bir jübüt egri mikrokanelleri öz içine alýar (2a - f) 12. Has çylşyrymly içege biomehanikasynyň döredilmegi zerur, çylşyrymly içege çipleri. Medeni öýjük görnüşine garamazdan, asyl Gut-Çip bilen deňeşdirilende epitelial ösüş derejesi bilen meňzeş döwürde morfogenez. Şonuň üçin 3D morfogenezini ýüze çykarmak üçin çipli içege dizaýnlary biri-biri bilen çalşylýar. SU-8 nagyşlary bilen kremniniň galyplarynda bejerilen PDMS nusgalary, ýokarky gatlakda çyzylan PDMS (2-nji surat). gözenekli PDMS filmi, soňra bolsa korona bejergisini ulanyp yzyna gaýtaryp bolmajak baglanyşyk arkaly aşaky PDMS gatlagy bilen deňleşdirildi (2b - f) .Gibrid çipleri ýasamak üçin, Transwell goýulmalaryny ýerleşdirip bilýän bir kanally mikrofliod enjamlaryny döretmek üçin aýna slaýdlara birikdirildi (2-nji surat we uzaldylan maglumatlar 2-nji surat. PDMS plazma bilen bejermek prosesi). Silikon turba birikdirilen mikrofabriki enjamy sterilizasiýa etmek, enjam gurmak içege epiteliniň 3D morfogenezini ýerine ýetirmäge taýýardy (2g surat).
a, SU-8 nagyşly kremniniň galyndylaryndan PDMS bölekleriniň taýýarlanylyşynyň shematiki şekili. Kesilmedik PDMS ergini kremniniň galypyna (çepde) guýuldy, 60 ° C (ortada) bejerildi we aşakda (sagda) .Dimlen PDMS böleklere bölünip, mundan beýläk ulanmak üçin arassalanyldy. membrane.d, ýokarky we aşaky PDMS komponentleriniň we ýygnalan çip içege enjamynyň birnäçe suraty, ýokarky, membrananyň we aşaky PDMS komponentleriniň deňleşmeginiň shemasy. Her gatlak plazma ýa-da korona bejergisi bilen dolulygyna baglanyşdyrylýar. Medeniýet. Silikon turba we şpris bilen gurnalan çipiň üstünde öndürilen içege gapagyň üstünde goýuldy. Çip enjamy gaýtadan işlemek üçin 150 mm Petri tagamynyň gapagyna ýerleşdirildi. Baglaýjy silikon turbany ýapmak üçin ulanylýar. içege 3D morfogenezi. Orta, Transwell goýmasynda gurlan öýjük gatlagynyň aşagyndaky mikrokaneller arkaly kämilleşdirilýär. Skale çyzgysy, 1 sm.h salgylanmanyň rugsady bilen gaýtadan çap edilýär.4. Elsevier.
Bu teswirnamada epitel çeşmesi hökmünde Caco-2 öýjük çyzygy we içege organoidleri ulanyldy (3a surat). Iki öýjük hem özbaşdak ösdürilip ýetişdirildi (2-nji gutu we 5-nji gutu) we çip içegeleriniň ýa-da Transwell goşundylarynyň ECM bilen örtülen mikrokanellerini ekmek üçin ulanylýar. tripsinizasiýa suwuklygy (2-nji gutu) bilen bölünip aýrylan öýjük süspansiýalaryny taýýarlamak üçin ýygnaldy. Içege biopsiýasyndan ýa-da hirurgiki rezeksiýalardan adam içege organoidleri, gurluş mikro-gurşawy goldamak üçin 24 guýy tarelkadaky Matrigel skaf gümmezlerinde ösdürilip ýetişdirildi. Düwürtikli organoidler ýygnalyp, içege ýa-da çipdäki Transwell goýmak üçin bir öýjüklere bölünýär (5-nji gutu). Öň habar berşimiz ýaly, keseliň görnüşi 12,13 (meselem, ülseratif kolit, Crohn keseli, kolorektal rak ýa-da adaty donor), lezýon meýdançasy, lezion däl ýer, lezion ýok. jejunum, ileum, cekum, içege ýa-da rektum) .Koloniki organoidleri (koloidleri) ösdürip ýetişdirmek üçin 5-nji gutuda optimal protokol berýäris, adatça ownuk içege organoidlerinden has köp morfogen konsentrasiýasyny talap edýär.
a, Içege çipinde içege morfogeneziniň induksiýasy üçin iş prosesi. 3D morfogenezini görkezmek üçin bu protokolda adam içege epiteli we içege organoidleri ulanylýar. Izolirlenen epitel öýjükleri çip taýýarlanylan enjamda ekildi (çip taýýarlanylýar). ilkinji 2 günüň dowamynda başlandy we goldanyldy (akym, AP, D0-D2) .Basolýar (BL) akym, doly 2D monolaýer emele gelende siklik uzalma hereketleri (başlangyç, akym, AP we BL) bilen başlaýar. Içege 3D morfogenezi 5 günlük mikrofliid medeniýeti (morfogenez, D5) görkezilýär. nokat (çyzgy grafigi, 100 µm). Içege morfogeneziniň (ýokarky sagda) degişli kaskadlaryny görkezýän dört sany shematik diagramma .Shematikada çyzylan oklar suwuklyk akymynyň ugruny görkezýär. SEM şekili, döredilen 3D Caco-2 epiteliniň (çepde) üstki topologiýasyny görkezýän SEM şekili. Uly ulaldylan meýdany görkezýär Döredilen Caco-2 3D, klaudin (ZO-1, gyzyl) we F-aktin (ýaşyl) we ýadrolar (gök) bellikli üznüksiz çotga membranalarynyň keseligine daşky görnüşi, içege çiplerindäki epitel öýjükleriniň konokokal wizual görnüşi. Orta sxematikada görkezilen oklar, her bir konokok görnüşi boýunça fokus tekizliginde fokus tekizliginiň ýerleşýän ýerini görkezýär. 3, 7, 9, 11 we 13.Göçürme (ýokarky sagda) berlen şekiliň ýokary ulaldylyşyny görkezýär. Epitel gatlagynda (Çep) we 13 günlük (orta) organoidler. Şeýle hem, MUC2 duýduryşy bolmazdan LGR5 duýduryşyny görkezýän Giňeldilen Maglumatlara serediň. 13-nji günüň dowamynda CellMask boýagy bilen plazma membranasyny boýamak bilen, içegäniň içinde döredilen epitel mikrostrukturasyny (sagda) görkezýän floresan şekilleri. Oksford uniwersitetiniň metbugaty; c Salgylanmanyň rugsady bilen uýgunlaşdyryldy.2. Oksford uniwersitetiniň metbugaty; e we f salgylanma bilen rugsat bilen uýgunlaşdyryldy.12 Creative Commons Ygtyýarnamasy CC BY 4.0.
Çipdäki içegede, üstünlikli ECM örtügi üçin PDMS gözenekli membrananyň gidrofobiki ýüzüni üýtgetmeli. Bu teswirnamada PDMS membranalarynyň gidrofobikligini üýtgetmek üçin iki dürli usuly ulanýarys. Caco-2 öýjüklerini ösdürip ýetişdirmek üçin, diňe UV / ozon bejergisi bilen ýerüsti işjeňleşdirme, PDMS üstündäki gidrofobiýa, PDMS üstündäki gidrofobikligi peseltmek üçin ýeterlikdi. Organoid epiteliniň mikrofliid medeniýeti, polietilenine (PEI) we glutaraldegidleri PDMS mikrokanellerine yzygiderli ulanmak arkaly ECM beloklarynyň netijeli çökmegine ýetmek üçin himiki esasly ýerüsti işlemegi talap edýär. Surfaceerüsti üýtgäninden soň, işleýän PDMS üstüni ýapmak üçin ECM beloklary goýuldy, soň bolsa mikrofil öýjükleri birikdirildi. öýjükler doly monolaýer emele getirýänçä, aşaky mikrokannel statiki şertleri saklaýar. surfaceerüsti işjeňleşdirmek we ECM örtügi üçin bu optimallaşdyrylan usul, PDMS üstünde 3D morfogeneziň döremegine organoid epiteliniň birikdirilmegine mümkinçilik berýär.
Transwell medeniýetleri öýjük ekişinden öň ECM örtügini hem talap edýär; Şeýle-de bolsa, “Transwell” medeniýeti gözenekli goşgylaryň üstüni işjeňleşdirmek üçin çylşyrymly deslapky ädimleri talap etmeýär. Transwell goýmalarynda Caco-2 öýjükleriniň ösmegi üçin gözenekli ECM örtügi bölünen Caco-2 öýjükleriniň (<1 sagat) birikmesini çaltlaşdyrýar we berk birleşme barýeriniň emele gelmegini (<1-2 gün). we organoidler barýer bitewiligi bilen doly monolaýer emele getirýänçä saklanýar .Transwell medeniýetleri gibrid çipleri ulanman 24 guýy tarelkada ýerine ýetirilýär.
In vitro 3D morfogenezi, kesgitlenen epitel gatlagynyň esasy tarapyna suwuklyk akymyny ulanyp başlap bolar. Bir çipdäki içegede epitelial morfogenez orta we aşaky mikrokanellere goşulanda başlandy (3a surat). Öň beýan edilişi ýaly, aşaky (esasy bazal) bölünip çykýan öýjüklere suwuk akymyň girizilmegi möhümdir. gözenekli membranalarda we lýuminal gyrkym stresini döredýäris, adatça içegede goşa akymy çipde ulanýarys. Gibrid çiplerde gibrid çiplere epitel monolaýerleri bolan Transwell goýmalary girizildi. Soňra, mikrokanneliň üsti bilen gözenekli Transwell goýulmagynyň esasy tarapy astynda ulanyldy.
Mikro-injinirlenen 3D epitel gatlaklarynyň morfologiki aýratynlyklary, faza kontrastly mikroskopiýa, diferensial päsgelçilik kontrasty (DIC) mikroskopiýa, SEM ýa-da immunofloresensiýa konokok mikroskopiýasy (3-nji we 4-nji suratlar) ýaly dürli şekillendiriş usullaryny ulanmak arkaly seljerilip bilner. 3-nji we 4-nji suratlar. Çip we gibrid çip platformalary enjamy bölmek ýa-da sökmek zerurlygy bolmazdan situ şekillendirişde hakyky wagtda üpjün edip biler. Immunofloresensiýa şekillendiriş (1-nji surat, 3c, f we 4b, c) öýjükleri adatça 4% (wt / vol) paraformaldegid (PFA) bilen düzýär, soň bolsa Triton X-100 we 2% (wt) Öýjük görnüşinde dürli düzediji, permeabilizatorlar we bloklaýjy serişdeler ulanylyp bilner. Nesile bagly öýjüge ýa-da sebit belliklerine gönükdirilen başlangyç antikorlar, çipiň üstünde herekete getirilen öýjükleri görkezmek üçin ulanylýar, soňra ikinji derejeli antikorlary ýadro (meselem, 4 ′, 6-diamidino-2-fenil) phaloidin) .Floresensiýa esasly janly şekil, mukus önümçiligini (1-nji surat, "Öýjükleriň tapawudy" we "Gut fiziologiýasy"), mikrob öýjükleriniň tötänleýin kolonizasiýasy (1-nji surat, "Host-mikrob bilelikdäki medeniýeti"), immun öýjükleriniň işe alynmagy (1-nji surat, 'Keselleriň modeli') ýa-da 3-nji fb. ýokarky gatlagy aşaky mikrokannel gatlagyndan aýyrmak üçin çipdäki içege, 2-nji suratda görkezilişi ýaly, 3D epitel morfologiýasy, şeýle hem apikal çotga serhedindäki mikrowilli SEM (3b surat) şekillendirilip bilner. Differensiýa bellikleriniň aňlatmasy mukdar PCR5 ýa-da bir öýjükli RNK yzygiderliligi bilen bahalandyrylyp bilner. molekulýar ýa-da genetiki derňew üçin ulanylýar.
a, gibrid çipde içege morfogeneziniň induksiýasy üçin iş prosesi. Bu protokolda gibrid çip platformasynda 3D morfogenezini görkezmek üçin Kako-2 we içege organoidleri ulanylýar. Bölünen epitel öýjükleri taýýar Transwell goşundylaryna ekildi (TW taýýar; aşakdaky surata serediň) .Bir öýjükler ekildi (tohumlandyryldy) Medeniýet). 7 günden soň epitel öýjükleriniň 2D monolaýerini öz içine alýan ýekeje Transwell goşmaçasy esasy akymy (Flow, BL) girizmek üçin gibrid çipe birleşdirildi, netijede 3D epitel gatlagynyň (morfogenezi) döremegine sebäp boldy. her ädim.b üçin synag synag konfigurasiýasy, gibrid çipler (çep shematik) dürli Z pozisiýalarynda (ýokarky, orta we aşaky; sag shematiki we degişli punktir çyzyklara serediň) ýokarky konokok mikroskopiýa görnüşleri bilen organoid epitel öýjükleriniň 3D morfogenezine sebäp bolup biler. aç-açan morfologiki aýratynlyklary görkezdi. F-aktin (sian), ýadro (çal) .c, statiki Transwell (TW; ak reňkli gutujyga salynýar) bilen gibrid çip (iň uly doly ok) bilen deňeşdirilende 2D-den 3D morfologiýa bilen deňeşdirilýär. 2D wertikal kesiş sag tarapy (2D) bar, 100 µm.c salgylanmanyň rugsady bilen gaýtadan çap edildi.4. Elsevier.
Dolandyryşlar şol bir öýjükleri (Caco-2 ýa-da içege organoid epitel öýjükleri) adaty statiki medeni şertlerde iki ölçegli monolaýerlere ösdürip ýetişdirmek arkaly taýýarlanyp bilner. Mikrokanelleriň çäkli göwrümi sebäpli ýokumly maddalaryň azalmagy bolup biler (ýagny, içegäniň çip dizaýnynyň ýokarky kanalynda ~ 4 µL), şonuň üçin epitelial morfologiýa bolup biler.
Softumşak daşbasma prosesi arassa otagda ýerine ýetirilmelidir. Çipdäki (ýokarky we aşaky gatlaklar we membranalar) we gibrid çipler üçin dürli fotomaskalar ulanyldy we aýry-aýry kremniý wafli ýasaldy, sebäbi mikroelektrikleriň beýikligi dürli-dürli boldy.
3 dýuým kremniý wafli asetonly tabaga goýuň. Tabagy 30 sekunt ýuwaşlyk bilen aýlaň, soňra wafli guradyň. Wafli IPA bilen bir tabaga geçiriň, arassalamak üçin tabagy 30 s aýlaň.
Piranha ergini (wodorod peroksidiň we konsentrirlenen kükürt kislotasynyň garyndysy, 1: 3 (vol / vol)) kremniniň gabygynyň üstündäki organiki galyndylary ýok etmek üçin ulanylyp bilner.
Piranha ergini gaty poslaýjy we ýylylyk öndürýär. Goşmaça howpsuzlyk çäreleri zerurdyr. Galyndylary zyňmak üçin, çözgüdi arassa we gury galyndy konteýnerine sowatmaga we geçirmäge mümkinçilik beriň. Ikinji gaplary ulanyň we galyndy gaplaryny dogry belläň. Has jikme-jik amallar üçin desganyň howpsuzlyk görkezmelerine eýeriň.
Wafli 200 ° C gyzgyn tabakda 10 minut goýup, suwsuzlandyryň. Suwsuzlykdan soň wafli sowatmak üçin howada bäş gezek silkildi.
Arassalanan kremniý wafliniň merkezine ~ 10 g fotorezist SU-8 2100 guýuň. Fotorezisti wafli deň derejede ýaýratmak üçin jüpdekleri ulanyň. Fotorezistiň has ýelmeşmegi we ýaýramagynyň aňsat bolmagy üçin wafli käwagt 65 ° C gyzgyn plastinka goýuň. Waferi göni gyzgyn tabakda goýmaň.
SU-8 aýlaw örtügi bilen wafli boýunça deň paýlandy. SU-8-iň 5-10 s aralygynda gelýän aýlawy 100 rpm / s tizliginde 500 aýlawda köpeltmek üçin programma düzüň. Esasy aýlawy 1500 aýlawda 200 µm galyňlykda kesgitläň ýa-da 250 µm galyňlyga ýetiň (çipiň ýokary gatlagynda 500 µm beýiklik); 1200 aýlawda sekunt.
Esasy aýlaw tizligi kremniý wafli boýunça SU-8 nagşynyň maksatly galyňlygyna görä sazlanyp bilner.
Çipdäki içegäniň ýokarky gatlagy üçin 500 µm beýiklikdäki SU-8 nagyşlaryny ýasamak üçin, bu gutynyň egirme örtügi we ýumşak çörek ädimleri (7-nji we 8-nji ädimler) yzygiderli gaýtalanýardy (9-njy ädime serediň) 250 µm galyňlykdaky SU-8 gatlagy, bu gatlagyň 12-nji ädiminde UV täsiri bilen birleşdirilip, 500 µm beýiklik bolup biler.
Wafleri gyzgyn tabakda 65 ° C-de 5 minutlap seresaplylyk bilen SU-8 örtülen wafli bişiriň, soňra sazlamany 95 ° C-e geçiriň we goşmaça 40 minut inkubasiýa ediň.
Upperokarky mikrokanelde SU-8 nagşynyň 500 μm beýikligine ýetmek üçin iki 250 μm galyňlykdaky SU-8 gatlak döretmek üçin 7 we 8 ädimleri gaýtalaň.
UV Mask Aligner ulanyp, wafliň täsir ediş wagtyny hasaplamak üçin öndürijiniň görkezmesine laýyklykda lampa synagyny geçiriň. (Ekspozisiýa wagty, ms) = (täsir ediş dozasy, mJ / cm2) / (çyra güýji, mW / cm2).
Ekspozisiýa wagtyny kesgitläniňizden soň, fotomaskany UV maska ​​düzüjisiniň maska ​​saklaýjysyna goýuň we fotomaskany SU-8 örtülen wafli ýerleşdiriň.
UV dispersiýasyny azaltmak üçin fotomaskanyň çap edilen ýüzüni kremniniň wafli bilen SU-8 örtülen tarapyna goýuň.
SU-8 örtülen wafli we fotomaskany öňünden kesgitlenen wagt üçin UV ýagtylygynyň 260 mJ / cm2 dikligine açyň (şu gutujygyň 10-njy ädimine serediň).
UV täsirinden soň, SU-8 bilen örtülen kremniý wafli 65 ° C-den 5 minut, 95 ° C-den bolsa her gyzgyn tabakda 200 μm beýiklikdäki nagyşlary ýasamak üçin bişirildi. Bişirilenden soňky wagty 95 ° C-den 30 minuta çenli 500 µm beýiklikdäki nagyşlary taýýarlaň.
Öndüriji aýna tabaga guýulýar we bişirilen wafli tabaga ýerleşdirilýär. SU-8 öndürijisiniň göwrümi aýna plastinkanyň ululygyna görä üýtgäp biler. Mysal üçin, garaşylmadyk SU-8-ni doly aýyrmak üçin ýeterlik SU-8 öndürijisini ulanyň. Mysal üçin, 1 L kuwwatlylygy 150 mm diametrli aýna tagamy ulananyňyzda, 25 minutlyk ýumşak öwrüň.
Öndürilen galyby 10 ml ml täze öndüriji bilen ýuwuň, soň bolsa turbany ulanyp, ergini sepiň.
Wafli plazma arassalaýjy ýerde goýuň we kislorod plazmasyna (atmosfera gazy, maksat basyşy 1 × 10−5 Torr, kuwwaty 125 W) 1,5 minut täsir ediň.
Wafli wakuum desikatorda aýna slaýd bilen ýerleşdiriň. Waferler we slaýdlar gapdalda ýerleşdirilip bilner. Eger vakuum desikator bir tabak bilen birnäçe gatlaga bölünen bolsa, slaýdlary aşaky kamerada we wafli ýokarky kamerada ýerleşdiriň.
Doňdurylan Caco-2 öýjüklerini 37 ° C suw wannasynda eritiň, soňra eredilen öýjükleri 15 ml 37 ° C öňünden taýýarlanan Caco-2 gurşawyny öz içine alýan T75 flakasyna geçiriň.
Caco-2 öýjüklerini ~ 90% aralykda geçmek üçin, 37 ° C suw wannasynda ilki ýyly Caco-2 orta, PBS we 0,25% tripsin / 1 mM EDTA.
Wakuum aspirasiýasy bilen gurşawy isläň. Wakuum islegini gaýtalap we täze PBS goşup, öýjükleri 5 ml ýyly PBS bilen iki gezek ýuwuň.