Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň.Çäkli CSS goldawy bilen brauzer wersiýasyny ulanýarsyňyz.Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň).Mundan başga-da, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript-de görkezýäris.
Birbada üç slaýdyň karuselini görkezýär.Bir gezekde üç slaýddan geçmek üçin Öňki we Indiki düwmelerini ulanyň ýa-da bir gezekde üç slaýddan geçmek üçin slaýder düwmelerini ulanyň.
Gan-beýni päsgelçiligi we gan-beýni päsgelçiligi bioterapewtiki serişdeleriň merkezi nerw ulgamyndaky maksatlaryna ýetmeginiň öňüni alýar we şeýlelik bilen newrologiki keselleriň netijeli bejergisine päsgelçilik döredýär.“Vivo” -de täze beýni daşaýjylary ýüze çykarmak üçin T7 fazaly peptid kitaphanasyny hödürledik we syçanlaryň kanulirlenen uly howuz modelini ulanyp, gan we serebrospinal suwuklygy (CSF) yzygiderli ýygnadyk.Dört tapgyr saýlawdan soň CSF-de ýörite fage klonlary ýokary derejede baýlaşdyryldy.Aýry-aýry kandidat peptidleri barlamak CSF-de 1000 esse baýlaşdyryşy ýüze çykardy.Peptid bilen ara beýniniň gowşurylyşynyň bioaktiwligi, kesgitlenen täze tranzit peptidi bilen baglanyşykly BACE1 peptid inhibitoryny ulanyp, serebrospinal suwuklykda amiloid-level derejesiniň 40% peselmegi bilen tassyklandy.Bu netijeler, “vivo” fazany saýlamak usullary bilen kesgitlenen peptidleriň bejeriş täsiri bilen beýnine makromolekulalary yzygiderli eltip bermek üçin peýdaly ulag bolup biljekdigini görkezýär.
Merkezi nerw ulgamy (CNS) maksatly bejeriş gözlegleri, esasan, CNS-ni nyşana alýan häsiýetleri görkezýän optimallaşdyrylan dermanlary we serişdeleri kesgitlemäge, beýnine işjeň neşe serişdeleriniň iberilmegine itergi berýän mehanizmleri tapmak üçin az tagalla edýär.Neşe serişdeleriniň iberilmegi, esasanam uly molekulalar häzirki zaman neýro-ylym neşe serişdeleriniň ösüşiniň aýrylmaz bölegi bolany üçin indi üýtgäp başlaýar.Merkezi nerw ulgamynyň daşky gurşawy, gan-beýni barýerinden (BBB) ​​we gan-beýni barýerinden (BCBB) 1-den ybarat serebrowaskulýar barýer ulgamy bilen gowy goralýar, beýnine neşe serişdelerini ibermegi kynlaşdyrýar1,2.Largehli uly molekula dermanlarynyň we ownuk molekula dermanlarynyň 98% -den gowragynyň beýniden ýok edilýändigi çak edilýär.Şol sebäpli CNS 4,5-e bejeriş dermanlarynyň netijeli we anyk iberilmegini üpjün edýän täze beýni transport ulgamlaryny kesgitlemek gaty möhümdir.Şeýle-de bolsa, BBB we BCSFB giň damar damarlary arkaly beýniniň ähli gurluşlaryna aralaşyp, girip barýarka, neşe serişdelerini eltmek üçin ajaýyp mümkinçilik döredýär.Şeýlelik bilen, beýnimize invaziv däl eltiş usullaryny ulanmak boýunça häzirki tagallalar esasan endogen BBB6 reseptoryny ulanyp, reseptor-ara transport (PMT) mehanizmine esaslanýar.Transferrin reseptor ýoluny ulanyp, soňky möhüm öňegidişliklere garamazdan, gowulaşan häsiýetleri bolan täze gowşuryş ulgamlaryny mundan beýläk-de ösdürmek zerurdyr.Bu maksat bilen, maksadymyz CSF transportynda araçylyk etmäge ukyply peptidleri kesgitlemekdi, sebäbi olar makromolekulalary CNS-e ýetirmek ýa-da täze reseptor ýollaryny açmak üçin ulanylyp bilner.Hususan-da, serebrowaskulýar ulgamynyň (BBB we BSCFB) ýörite reseptorlary we daşaýjylary bioterapewtiki dermanlaryň işjeň we anyk iberilmegi üçin potensial maksat bolup biler.Serebrospinal suwuklyk (CSF) horoid pleksusyň (CS) sekretor önümidir we subarahnoid giňişligi we ventrikulýar giňişligi arkaly beýniniň interstisial suwuklygy bilen göni aragatnaşykda bolýar4.Recentlyakynda subarahnoid serebrospinal suwuklygyň beýniniň interstiumyna aşa ýaýraýandygy görkezildi9.Bu subarahnoid akym ýoluny ýa-da göni BBB arkaly parenhimal giňişlige girmäge umyt edýäris.Bu maksada ýetmek üçin, bu iki tapawutly ýoluň ikisi bilen daşalýan peptidleri ideal taýdan kesgitleýän “vivo” faza saýlamak strategiýasyny durmuşa geçirdik.
Indi iň ýokary kitaphananyň dürlüligi bilen başlangyç seçip alyş tapgyrlaryna gözegçilik etmek üçin CSF nusga alma we ýokary geçiş yzygiderliligi (HTS) bilen wivo fage ekrany barlamak usulyny yzygiderli suratlandyrýarys.Ganyň hapalanmagynyň öňüni almak üçin hemişelik oturdylan uly sisterna (CM) kanula bilen aňly syçanlarda barlag geçirildi.Möhümi, bu çemeleşme beýni-damar barýerinden transport işjeňligi bilen beýni nyşana alýan we peptidleri saýlaýar.Ujypsyzlygy (~ 60 nm) 10 sebäpli T7 tapgyrlaryny ulandyk we endotel we / ýa-da epitelial-medulla barýeriniň öýjükli geçmegine mümkinçilik berýän wezikulalary daşamak üçin amatlydygyny teklip etdik.Dört gezek gözden geçirilenden soň, wivo CSF ​​baýlaşdyryşda we beýni mikroelektrik birleşiginde güýçli görkezilen faza ilaty izolirlendi.Möhümi, ileri tutulýan we himiki taýdan sintez edilen iň oňat kandidat peptidleriniň belok ýüklerini serebrospinal suwuklyga daşap biljekdigini görkezmek bilen netijelerimizi tassyklap bildik.Ilki bilen, CNS-iň farmakodinamiki täsiri öňdebaryjy tranzit peptidini BACE1 peptidiniň inhibitory bilen birleşdirmek arkaly döredildi.“Vivo” funksional barlag strategiýalarynda täze beýni transport peptidlerini täsirli belok ýük göterijileri hökmünde kesgitläp biljekdigini görkezmekden başga-da, şuňa meňzeş funksional saýlama çemeleşmeleriň beýniniň täze transport ýollaryny kesgitlemekde hem möhüm bolmagyna garaşýarys.
Plakany emele getirýän birliklere (PFU) esaslanyp, faz gaplama ädiminden soň, takmynan 109 dürlüligi bolan tötänleýin 12 mer çyzykly T7 faza peptidleriniň kitaphanasy döredildi we döredildi (Seret materiallar we usullar).Bu kitaphanany öň “vivo panning” -da üns bilen seljerendigimizi bellemelidiris.Üýtgedilen primerleri ulanyp, faz kitaphanasynyň nusgalaryny PCR güýçlendirmek, HTS-e gönüden-göni ulanylýan amplikonlary döretdi (Goşmaça 1a surat).A) HTS11 yzygiderlilik säwlikleri, b) primerleriň (NNK) 1-12 hiline täsiri we c) garaşma kitaphanasynda ýabany görnüşli (wt) fazanyň (skelet goýulmalary) bolmagy sebäpli, diňe barlanylan yzygiderlilik maglumatlary almak üçin yzygiderli süzmek prosedurasy geçirildi (Goşmaça 1b surat).Bu süzgüç ädimleri HTS yzygiderlilik kitaphanalarynyň hemmesine degişlidir.Adaty kitaphana üçin jemi 233,868 okaldy, şolardan 39% -i süzgüç ölçeglerinden geçdi we indiki tapgyrlar üçin kitaphanany derňemek we saýlamak üçin ulanyldy (Goşmaça 1c - e).Okalýanlar, esasan, kitaphananyň dizaýnyny (NNK) 1-12 tassyklaýan iň ýokary 36 nukleotidde (1-nji goşmaça surat) iň uzynlygy 3 esasy jübütiň köpelmegi boldy.Ablyeri gelende aýtsak, kitaphananyň agzalarynyň takmynan 11% -inde 12 ölçegli ýabany görnüşli (wt) oňurgaly PAGISRELVDKL goýmasy bar we yzygiderliligiň ýarysynda (49%) goýmalar ýa-da öçürmeler bar.Kitaphana kitaphanasynyň HTS kitaphanadaky peptidleriň köpdürlüligini tassyklady: peptid yzygiderliliginiň 81% -den gowragy diňe bir gezek tapyldy we diňe 1,5% ≥4 nusgada ýüze çykdy (Goşmaça 2a surat).Repertuardaky 12 pozisiýadaky aminokislotalaryň (aa) ýygylyklary ýaramazlaşan NKK repertuarynyň döredýän kodlarynyň sanyna garaşylýan ýygylyklar bilen gowy baglanyşdyrylýar (Goşmaça 2b surat).Bu goýmalar bilen kodlanan aa galyndylarynyň synlanan ýygylygy hasaplanan ýygylyk (r = 0.893) bilen gowy baglanyşdyrylýar (Goşmaça 2c surat).Sanjym üçin tapgyr kitaphanalaryny taýýarlamak endotoksini güýçlendirmek we aýyrmak ädimlerini öz içine alýar.Munuň öň sahypadaky kitaphanalaryň dürlüligini azaltmak üçin 12,13 görkezildi.Şol sebäpden, endotoksin aýrylan plastinka güýçlendirilen faza kitaphanasyny yzygiderlilik etdik we AA-nyň ýygylygyna baha bermek üçin asyl kitaphanasy bilen deňeşdirdik.Asyl howuz bilen güýçlendirilen we arassalanan howuzyň arasynda güýçli arabaglanyşyk (r = 0.995) syn edildi (goşmaça surat 2d), bu T7 fazasyny ulanyp plitalarda güýçlendirilen klonlaryň arasyndaky bäsleşigiň uly ikitaraplaýyn sebäp bolmaýandygyny görkezýär.Bu deňeşdirme, her kitaphanada tripeptid motifleriniň ýygylygyna esaslanýar, sebäbi kitaphanalaryň dürlüligini (~ 109) HTS bilen hem doly ele alyp bolmaýar.Her pozisiýadaky ýygylygyň derňewi, giren repertuaryň soňky üç pozisiýasynda kiçijik bir pozisiýa baglylygy ýüze çykardy (Goşmaça 2e surat).Sözümiziň ahyrynda, kitaphananyň hili we dürlüligi kabul ederlikli we birnäçe tapgyryň arasynda faza kitaphanalarynyň güýçlendirilmegi we taýýarlanylmagy sebäpli dürlüligiň diňe ownuk üýtgeşmeleri hasaba alyndy.
Serebrospinal suwuklygyň yzygiderli nusgasy, BBB we / ýa-da BCSFB (1a-b surat) arkaly wena içine (iv) sanjym edilen T7 fazasyny kesgitlemegi aňsatlaşdyrmak üçin aňly syçanlaryň CM-sine kanula hirurgiki usulda ýerleşdirilip bilner.“Vivo” saýlamasynyň ilkinji üç tapgyrynda iki sany garaşsyz saýlama gol (A we B gollary) ulandyk (1-nji surat).Saýlawyň ilkinji üç tapgyrynda girizilen fazanyň umumy mukdaryny azaltmak bilen saýlamanyň berkligini kem-kemden ýokarlandyrdyk.Dördünji tapgyr üçin, A we B şahalaryndan nusgalary birleşdirdik we goşmaça üç sany garaşsyz saýlaw etdik.Bu modeldäki T7 faza bölejikleriniň wivo häsiýetlerini öwrenmek üçin guýruk damary arkaly syçanlara ýabany görnüşli faza (PAGISRELVDKL master goýmak) sanjym edildi.Dürli wagt nokatlarynda serebrospinal suwuklykdan we gandan tapgyrlaryň dikeldilmegi, T7 ikosaedral fazalarynyň gan bölüminden çalt başlangyç tapgyrynyň bardygyny görkezdi (Goşmaça 3-nji surat).Dolandyrylan titrlere we syçanlaryň ganyna esaslanyp, takmynan 1% wt hasapladyk.Dolandyrylan dozadan faza, damar sanjymyndan 10 minut soň ganda tapyldy.Bu başlangyç çalt peselenden soň, has haýal başlangyç arassalama ýarym ömri 27,7 minut bilen ölçenildi.Möhümi, CSF bölüminden diňe az sanly tapgyr alyndy, bu CSF bölümine ýabany görnüşli fazanyň göçmeginiň pes derejesini görkezýär (Goşmaça 3-nji surat).Ortaça, ganyň düzümindäki T7 fazasynyň takmynan 1 x 10-3% titrleri we başlangyç sepilen fazalaryň 4 x 10-8% -i tutuş nusga döwründe serebrospinal suwuklykda tapyldy (0-250 min).Eri gelende aýtsak, serebrospinal suwuklykdaky ýabany görnüşli fazanyň ýarym ömri (25,7 min) ganda görlen ýalydy.Bu maglumatlar, CSF bölümini gandan aýyrýan päsgelçiligiň CM-kanulirlenen syçanlarda üýtgemändigini görkezýär, bu bolsa fage kitaphanalaryny gandan CSF bölümine aňsatlyk bilen daşalýan klonlary kesgitlemäge mümkinçilik berýär.
(a) Uly howuzdan serebrospinal suwuklygy (CSF) gaýtadan nusga almagyň usulyny döretmek.(b) Merkezi nerw ulgamynyň (CNS) barýeriniň öýjükli ýerleşişini we gan-beýni barýerinden (BBB) ​​we gan-beýni barýerinden geçýän peptidleri kesgitlemek üçin ulanylýan saýlama strategiýasyny görkezýän diagramma.(c) “Vivo phage” ekrany görkeziş çyzgysy.Saýlawyň her tapgyrynda tapgyrlar (oklaryň içindäki haýwanlary kesgitleýjiler) wena içine sanjym edildi.Iki sany garaşsyz alternatiw şaha (A, B) 4-nji tapgyra çenli aýratyn saklanýar.3-nji we 4-nji saýlama tapgyrlary üçin CSF-den alnan her bir faza klony el bilen yzygiderlidi.(d) T7 peptid kitaphanasyna (2 x 1012 faza / haýwan) wena içine sanjymdan soň iki sany kanulirlenen syçanyň saýlanyşynyň birinji tapgyrynda gandan (gyzyl tegeleklerden) we serebrospinal suwuklykdan (ýaşyl üçburçluk) izolirlenen fazanyň kinetikasy.Mawy kwadratlar, ganyň umumy mukdaryny göz öňünde tutup, sanjylýan fazanyň mukdaryndan hasaplanylýan ganda fazanyň ortaça başlangyç konsentrasiýasyny görkezýär.Gara kwadratlar, gan fazasynyň konsentrasiýalaryndan ekstrapolýasiýa edilen y çyzygynyň kesiş nokadyny görkezýär.(e, f) Peptidde tapylan tripeptid sebäpleriniň deňeşdirilen ýygylygyny we paýlanyşyny görkeziň.1000 okalanda tapylan motifleriň sany görkezilýär.Möhüm (p <0,001) baýlaşdyrylan hereketler gyzyl nokatlar bilen bellendi.(e) Sanjym edilen kitaphananyň tripeptid motifiniň otnositel ýygylygyny deňeşdirip, 1.1 we # 1.2 haýwanlardan gan alýan faza bilen deňeşdirme.(f) Gan we serebrospinal suwuklykda izolirlenen # 1.1 we # 1.2 haýwan faza tripeptid hereketleriniň deňeşdirilen ýygylyklaryny deňeşdirip, korrelýasiýa ýaýradyjy.(g)Bir harply koduň ululygy, aminokislotanyň näçe gezek ýüze çykýandygyny görkezýär.Greenaşyl = polýar, gyrmyzy = bitarap, gök = esasy, gyzyl = kislotaly we gara = gidrofob aminokislotalar.1a, b suraty Eduard Uriç tarapyndan taslanyldy we öndürildi.
Fage peptid kitaphanasyny iki sany CM gural syçanjygyna (A we B klasslar) sanjym etdik we serebrospinal suwuklykdan we gandan izolirlenen faza (1d surat).Kitaphananyň başlangyç çalt arassalanylyşy, ýabany görnüş bilen deňeşdirilende az aýdylýar.Iki haýwanda sanjym edilen kitaphananyň ortaça ýarym ömri, ýabany görnüşe meňzeş ganda 24,8 minut, CSF-de 38,5 minut.Her haýwandan gan we serebrospinal suwuklyk faza nusgalary HTS-e sezewar edildi we gysga tripeptid sebäbiniň barlygy üçin kesgitlenen peptidleriň hemmesi derňeldi.Tripeptid hereketleri saýlandy, sebäbi gurluşyň emele gelmegi we peptid-belok täsiri üçin iň az esas döredýär14,15.Sanjym edilen fage kitaphanasy bilen iki haýwanyň ganyndan alnan klonlaryň arasynda motifleriň paýlanyşynda gowy arabaglanyşyk tapdyk (1-nji surat).Maglumatlar kitaphananyň düzüminiň diňe gan bölüminde baýlaşdyrylandygyny görkezýär.Aminokislotalaryň ýygylyklary we ylalaşyk yzygiderliligi Weblogo16 programma üpjünçiliginiň uýgunlaşmasy arkaly her pozisiýada hasam derňeldi.Gyzykly tarapy, ganyň glisin galyndylarynda güýçli baýlaşdyryş tapdyk (1-nji surat).Gany CSF-den saýlanan klonlar bilen deňeşdireniňde, güýçli saýlama we käbir sebäpleriň ýok edilmegi hasaba alyndy (1-nji surat) we käbir aminokislotalar 12 agzaly kesgitlenen ýerlerde has ileri tutulýardy (1-nji surat).Aýratyn-da, aýry haýwanlar serebrospinal suwuklykda ep-esli tapawutlanýar, glisiniň baýlaşdyrylmagy iki haýwanda-da bolýar (Goşmaça 4a - j).1.1 we # 1.2 haýwanlaryň serebrospinal suwuklygynda yzygiderli maglumatlary süzgüçden soň jemi 964 we 420 sany 12 mer mer peptidi alyndy (Goşmaça surat 1d - e).Izolirlenen faz klonlary güýçlendirildi we “vivo” saýlamasynyň ikinji tapgyryna sezewar edildi.Saýlawyň ikinji tapgyryndan alnan faza her haýwanda HTS-e sezewar edildi we kesgitlenen peptidleriň hemmesi tripeptid sebäpleriniň ýüze çykmagyny seljermek üçin motif tanamak programmasyna giriş hökmünde ulanyldy (2a surat, b, ef).CSF-den dikeldilen tapgyryň birinji aýlawy bilen deňeşdirilende, A we B şahalarynda CSF-de köp sebäpleriň saýlanylmagyny we aýrylmagyny gördük (2-nji surat).Ulgam kesgitleýiş algoritmi yzygiderli yzygiderliligiň dürli nagyşlaryny görkezýändigini ýa-da ýokdugyny kesgitlemek üçin ulanyldy.CSF tarapyndan alternatiw A (2-nji surat, d) we B klada (2-nji surat, h) 12 ölçegli yzygiderliligiň arasynda aýdyň meňzeşlik ýüze çykdy.Her şahada jemlenen derňewde 12 mer peptidler üçin goşmaça saýlama profilleri (goşmaça 5c, d) we saýlama birinji tapgyry bilen deňeşdirilende ikinji tapgyrdan soň ýygnanan klonlar üçin CSF / gan titriniň gatnaşygy ýokarlandy (Goşmaça 5e surat).).
Serebrospinal suwuklykda motifleri we peptidleri wivo funksional faza displeýini saýlamakda yzygiderli iki tapgyr bilen baýlaşdyrmak.
Her haýwanyň (1.1 we # 1.2 haýwanlar) birinji tapgyryndan dikeldilen ähli serebrospinal suwuklyk tapgyrlary birleşdirildi, güýçlendirildi, HT yzygiderliligi we birleşdirildi (2 x 1010 faza / haýwan) 2 SM kanulirlenen syçan (# 1.1 → #).2.1 we 2.2, 1.2 → 2.3 we 2.4).(a, b, e, f) Birinji we ikinji seçip alyş tapgyrlarynda ähli CSF-den alnan fazalaryň tripeptid motifleriniň deňeşdirilen ýygylygyny deňeşdirýän korrelýasiýa ýaýradyjylary.Iki ugurda peptidlerden tapylan mümkin bolup biljek bir-birine gabat gelýän tripeptidleri görkezýän motifleriň deňeşdirilen ýygylygy we paýlanyşy.1000 okalanda tapylan motifleriň sany görkezilýär.Deňeşdirilen kitaphanalaryň birinde ep-esli saýlanan (p <0,001) hereketler gyzyl nokatlar bilen görkezilýär.(c, d, g, h) “Vivo” saýlamasynyň 2-nji we 1-nji tapgyrlaryna esaslanýan CSF-e baý 12 aminokislotanyň uzyn yzygiderliliginiň yzygiderli nyşany.Bir harply koduň ululygy, aminokislotanyň näçe gezek ýüze çykýandygyny görkezýär.Logotipi görkezmek üçin, iki seçip alyş tapgyrynyň arasynda aýry haýwanlardan alnan CSF yzygiderliliginiň ýygylygy deňeşdirilýär we ikinji tapgyrda baýlaşdyrylan yzygiderlilik görkezilýär: (c) # 1.1– # 2.1 (d) # 1.1– # 2.2 (g) # 1.2– # 2.3 we (h) # 1.2– # 2.4.(C, d) haýwanlarda belli bir ýagdaýda iň baýlaşdyrylan aminokislotalar.2.1 we ýok.2.2 ýa-da (g, h) haýwanlarda.2.3 we ýok.2.4 reňkde görkezilýär.Greenaşyl = polýar, gyrmyzy = bitarap, gök = esasy, gyzyl = kislotaly we gara = gidrofob aminokislotalar.
Üçünji tapgyrdan soň, iki haýwandan izolirlenen 332 CSF-rekonstruksiýa edilen fage klonlaryndan 124 sany täsin peptid yzygiderliligini kesgitledik (Goşmaça 6a surat).Iň ýokary yzygiderlilik LGSVS (18,7%), iň ýokary degişlilikde PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) we SARGSWREIVSLS (2.2%).Dördünji tapgyra, üç aýry haýwandan garaşsyz saýlanan iki şahany jemledik (1-nji surat).CSF-den dikeldilen 925 yzygiderli faza klonlaryndan dördünji tapgyra 64 sany özboluşly peptid yzygiderliligini tapdyk (Goşmaça 6b surat), olaryň arasynda ýabany görnüşli fazanyň otnositel paýy 0,8% -e çenli azaldy.Dördünji tapgyrda iň köp ýaýran CSF klonlary LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) we RLS.%)).Saýlanan peptidleriň uzynlygy, NNK kitaphanasynyň dizaýny üçin ýaramaz kodlary ulananyňyzda, nukleotid goýulmagy / öçürilmegi ýa-da kitaphananyň desgalarynda wagtyndan öň saklanmak kodlary bilen baglanyşyklydyr.Wagtyndan öň saklaýyş kodlary has gysga peptidleri döredýär we amatly a motifini öz içine alýandygy sebäpli saýlanýar.Uzyn peptidler sintetiki kitaphanalaryň başlangyçlaryna goýulmagy / öçürilmegi netijesinde bolup biler.Bu dizaýn edilen stop koduny çarçuwanyň daşynda ýerleşdirýär we aşakda täze stop kodon peýda bolýança okaýar.Umuman alanyňda, giriş maglumatlaryny nusga çykyş maglumatlary bilen deňeşdirip, dört seçip alyş tapgyrynyň hemmesi üçin baýlaşdyryjy faktorlary hasapladyk.Gözlegiň birinji tapgyry üçin, belli bir fon salgylanmasy hökmünde ýabany görnüşli faza titrlerini ulandyk.Gyzykly tarapy, negatiw fazany saýlamak ilkinji CSF siklinde gaty güýçli boldy, ýöne ganda däl (3a surat), bu peptid kitaphanasynyň agzalarynyň köpüsiniň CSF bölümine passiw ýaýramagynyň ähtimallygynyň pes bolmagy ýa-da otnositel tapgyrlar bakteriofaglara garanyňda has täsirli saklanýar ýa-da aýrylýar.Şeýle-de bolsa, gözlegiň ikinji tapgyrynda CSF-de tapgyrlaryň güýçli saýlanylmagy iki klada-da syn edildi, bu öňki tapgyryň CSF-iň ýokarlanmagyna itergi berýän peptidleri görkezýän tapgyrlarda baýlaşdyrylandygyny görkezýär (3a surat).Bloodene-de gany ep-esli baýlaşdyrmazdan.Şeýle hem üçünji we dördünji tapgyrlarda faz klonlary CSF-de ep-esli baýlaşdyryldy.Saýlawyň soňky iki tapgyrynyň arasynda her täsin peptid yzygiderliliginiň deňeşdirilen ýygylygyny deňeşdirenimizde, yzygiderliligiň dördünji tapgyrynda yzygiderliligiň hasam baýlaşdyrylandygyny gördük (3b surat).Iki peptid ugruny ulanyp, 64 sany täsin peptid yzygiderliliginden jemi 931 tripeptid motiwleri alyndy.Dördünji tapgyra iň baýlaşdyrylan sebäpler, sanjym edilen kitaphana (kesilen: 10% baýlaşdyrmak) bilen deňeşdirilende, ähli tapgyrlardaky baýlaşdyryş profilleri üçin has ýakyndan gözden geçirildi (Goşmaça 6c surat).Saýlawyň umumy görnüşleri, öwrenilen maksatlaryň köpüsiniň iki seçip alyş şahasynyň öňki tapgyrlarynda baýlaşdyrylandygyny görkezdi.Şeýle-de bolsa, käbir sebäpler (mysal üçin SGL, VSG, LGS GSV) esasan A klassdan, beýlekiler (mysal üçin FGW, RTN, WGF, NTR) B alternatiw klada baýlaşdyryldy.
Streptawidin ýük göterijilerine birikdirilen CSF bilen baýlaşdyrylan faza görkezilen peptidleri we biotinilleşdirilen lider peptidlerini CSF transportynyň barlagy.
(a) Sanjym (giriş = I) faza (PFU) titrleri we kesgitlenen CSF faza titrleri (çykyş = O) esasynda dört tapgyrda (R1-R4) hasaplanan baýlaşdyryş gatnaşygy.Soňky üç tapgyra baýlaşdyryş faktorlary (R2-R4) öňki tapgyr we birinji tapgyr (R1) bilen agram maglumatlary bilen deňeşdirilende hasaplandy.Açyk barlar serebrospinal suwuklyk, kölegeli barlar plazma.(*** p <0,001, Talyp synagyna esaslanýar).(b) Saýlawyň 4-nji tapgyryndan soň CSF-de toplanan ähli tapgyrlara degişlilikde deňeşdirilen iň köp faza peptidleriniň sanawy.Iň köp ýaýran alty fon klonlary reňkde, sanlanan we seçip almagyň 3-nji we 4-nji tapgyrlarynyň arasynda baýlaşdyryjy faktorlar bilen tapawutlanýar.(c, d) 4-nji tapgyra çenli iň baýlaşdyrylan alty sany fon klony, boş faza we ene-atalar fazasy peptid kitaphanalary CSF nusga alma modelinde aýratyn seljerildi.CSF we gan nusgalary görkezilen wagt nokatlarynda ýygnaldy.(c) Deň mukdarda 6 kandidat faz klony (2 x 1010 faza / haýwan), boş fazalar (# 1779) (2 x 1010 faza / haýwan) we ätiýaçlyk peptid kitaphanalary (2 x 1012 faza / haýwan) Iň azyndan 3 CM sanjym edilen haýwana guýruk damary arkaly aýratyn berilýär.Wagtyň geçmegi bilen her sanjym edilen fage klonynyň we fage peptid kitaphanasynyň CSF farmakokinetikasy görkezilýär.(d) nusga alnan wagtyň dowamynda ähli dikeldilen tapgyrlar / ml üçin ortaça CSF / gan gatnaşygy görkezilýär.)Iň azyndan üç sany syçan (N = 3).).CSF nusgalary görkezilen wagt nokatlarynda ýygnaldy we streptawidiniň konsentrasiýalary CSF anti-streptawidin ELISA bilen ölçeldi (nd = tapylmady).(* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0,001, ANOVA synagyna esaslanýar).f) Iň baýlaşdyrylan faza peptid klonynyň 2002-nji ýyldaky (gyrmyzy) aminokislotanyň yzygiderliligini 4-nji tapgyra saýlanan beýleki faza peptid klonlary bilen deňeşdirmek.Birmeňzeş we şuňa meňzeş aminokislotanyň bölekleri reňkli.
Dördünji tapgyra baýlaşdyrylan tapgyrlardan (3b surat), CSF nusga modelinde goşmaça derňew üçin alty kandidat klony saýlandy.Deň mukdarda alty kandidat tapgyry, boş faza (goýulmaýar) we köpelýän peptid kitaphanalary üç sany kanulirlenen CM haýwanyna sanjym edildi, CSF (3-nji surat) we gan (Goşmaça 7-nji surat) barlaglarynda farmakokinetika kesgitlenildi.Synag edilen ähli fon klonlary, boş dolandyryş fazasyndan (# 1779) 10-1000 esse ýokary derejede CSF bölümini nyşana aldy.Mysal üçin, 2020-nji we # 2077-nji klonlarda CSF titrleri dolandyryş tapgyryndan 1000 esse ýokarydy.Her saýlanan peptidiň farmakokinetiki tertibi başga, ýöne olaryň hemmesiniň ýokary CSF öý ukyby bar.1903 we # 2011 klonlar üçin wagtyň geçmegi bilen yzygiderli azalýandygyny gördük, 2077, # 2002 we # 2009 klonlar üçin bolsa ilkinji 10 minutda köpelmek işjeň transporty görkezip biler, ýöne tassyklanmaly.2020, # 2002 we # 2077 klonlary ýokary derejede durnuklaşdy, 2009-njy ýyldaky klonyň CSF konsentrasiýasy başlangyç ýokarlanandan soň ýuwaş-ýuwaşdan azaldy.Soňra her CSF dalaşgäriň ganyň konsentrasiýasy bilen deňeşdirilen ýygylygyny deňeşdirdik (3-nji surat).Her bir CSF dalaşgäriň ortaça titriniň ähli nusga alýan wagtlaryndaky gan titresi bilen arabaglanyşygy, alty kandidatyň üçüsiniň gan CSF-de ep-esli baýlaşdyrylandygyny görkezdi.Gyzykly tarapy, 2077-nji klon ganyň has ýokary durnuklylygyny görkezdi (Goşmaça 7-nji surat).Peptidleriň özleriniň faza bölejiklerinden başga ýükleri CSF bölümine işjeň daşamaga ukyplydygyny tassyklamak üçin, peptidleriň faza bölejigine birikdirilen N terminalynda biotin bilen bölünen dört sany öňdebaryjy peptidi sintez etdik.Biotinilleşdirilen peptidler (2002, 2009, 2020 we 2077 belgili) faza geometriýasyny birneme meňzeýän multimeriki görnüşleri almak üçin streptawidin (SA) bilen birleşdirildi.Bu format, ganyň we serebrospinal suwuklygyň SA täsirini ýük daşaýan belok peptidleri hökmünde ölçemäge mümkinçilik berdi.Möhümi, sintetiki peptidler bu SA-konýugirlenen formatda ulanylanda, fage maglumatlary köplenç köpeldilip bilner (3-nji surat).Düwürdilen peptidler 48 sagadyň içinde az täsir edip, CSF-den has çalt arassalanyldy.Bu peptid faza klonlarynyň CSF giňişligine eltiş ýollary barada düşünmek üçin, immunohistohimiýa (IHC) ulanyp, fiv bölejiklerini wivo içine damar sanjymyndan 1 sagat soň gönüden-göni kesgitlemek üçin aýratyn faza peptid hitleriniň lokalizasiýasyny seljerdik.Ablyeri gelende aýtsak, 2002, # 2077 we # 2009 klonlary beýni kapilýallarynda güýçli boýag bilen ýüze çykaryp bolýar, gözegçilik etaby (# 1779) we 2020-nji klon tapylmady (Goşmaça 8-nji surat).Bu, bu peptidleriň BBB-den geçip, beýnimize täsirine goşant goşýandygyny görkezýär.Bu çaklamany barlamak üçin has jikme-jik derňew gerek, sebäbi BSCFB ugry hem bolup biler.Iň baýlaşdyrylan klonyň aminokislotalar yzygiderliligini (# 2002) beýleki saýlanan peptidler bilen deňeşdireniňde, käbirleriniň meňzeş transport mehanizmini görkezip bilýän aminokislotanyň uzalmalarynyň bardygy bellendi (3-nji surat).
Özboluşly plazma profiliniň we wagtyň geçmegi bilen CSF-iň ep-esli ýokarlanmagy sebäpli, 2077-nji faza displeý klony 48 sagadyň dowamynda has köp öwrenildi we dowamly SA derejeleri bilen bilelikde synlanan CSF-iň çalt köpelmegini başardy (4a surat).Beýleki kesgitlenen fage klonlary barada aýdylanda, # 2077 beýni kapilýallary üçin güýçli boýaldy we has ýokary ölçegde we ähtimal parenhimal giňişlikde boýalananda kapilýar marker leksiýasy bilen ep-esli kolokalizasiýa görkezdi (4b surat).Peptid bilen baglanyşykly farmakologiki täsirleriň CNS-de alyp bolýandygyny ýa-da ýokdugyny anyklamak üçin synag geçirdik, i) # 2077 tranzit peptidi we ii) BACE1 inhibitor peptidi SA bilen iki dürli gatnaşygynda garyldy.Bir kombinasiýa üçin diňe BACE1 peptid inhibitory, beýlekisi üçin BACE1 peptid inhibitorynyň # 2077 peptidine 1: 3 gatnaşygy ulandyk.Iki nusga hem damar bilen geçirildi we wagtyň geçmegi bilen beta-amiloid peptid 40 (Abeta40) gany we serebrospinal suwuklyk derejesi ölçenildi.Abeta40 CSF-de beýni parenhimasyndaky BACE1 inhibisiýasyny görkezýänligi bilen ölçeldi.Garaşylyşy ýaly, iki toplum hem Abeta40-nyň ganyň derejesini ep-esli peseltdi (4c-nji surat, d).Muňa garamazdan, diňe peptidiň garyndysy bolan nusgalar.2077 we SA-a birikdirilen BACE1 peptidiň inhibitory serebrospinal suwuklykda Abeta40-yň ep-esli azalmagyna sebäp boldy (4-nji surat).Maglumatlar peptidiň ýokdugyny görkezýär.2077 60 kDa SA belogyny CNS-e daşamagy başarýar we BACE1 peptidiniň SA-konýugirlenen ingibitorlary bilen farmakologiki täsirleri döredýär.
(a) CSF peptid # 2077 (RLSSVDSDLSGC) we sanjym edilmedik dolandyryş fazasynyň (# 1779) uzak möhletli farmakokinetiki profilini görkezýän T7 fazasynyň klon sanjymy (2 × 10 faza / haýwan), azyndan üç sany CM-intubasiýa edilen syçanlarda.()Bu faz klonlary 3 syçana berildi we kämillikden 1 sagat öň aýlanmaga rugsat berildi.Beýni bölünip, T7 faza kapsidine garşy poliklonal FITC belgili antikorlary bilen boýaldy.Perfuziýadan we ondan soňky düzedişden on minut öň, DyLight594 belgili leksiýa damar bilen berildi.Kapilýarlaryň we periwaskulýar beýni dokumasynyň mikroelektrikleriniň we fazalarynyň (ýaşyl) lýuminal tarapynyň leksiýa boýagyny (gyzyl) görkezýän floresan şekiller.Tereziniň çyzgysy 10 µm gabat gelýär..Aβ40-da BACE1 peptid inhibitorynyň töwekgelçilikli azalmagy, görkezilen wagtlarda ganda (gyzyl) we serebrospinal suwuklykda (mämişi) Aβ1-40 ELISA bilen ölçenildi.Has düşnükli bolmagy üçin grafada 100% şkalada punktir çyzyk çyzylýar.(c) Ganda Aβ40 (gyzyl üçburçluk) we serebrospinal suwuklyk (mämişi üçburçluk), 2077 peptid we BACE1 inhibitor peptidi üstaşyr geçirmek üçin birleşdirilen streptawidin bilen bejerilen syçanlarda göterim azalmagy.(d) Gan Aβ40 (gyzyl tegelekler) we streptawidin bilen bejerilen syçanlaryň serebrospinal suwuklygy (mämişi tegelek) göteriminiň peselmegi diňe BACE1 inhibitor peptidi bilen birleşdirilýär.Dolandyryşdaky Aβ konsentrasiýasy 420 pg / ml (standart gyşarmak = 101 pg / ml) boldy.
Faza displeýi biomedikal gözlegleriň birnäçe ugurlarynda üstünlikli ulanyldy17.Bu usul wivo damar dürlüligini öwrenmek üçin 18,19, şeýle hem beýni damarlaryny nyşana alýan barlaglar üçin ulanyldy 20,21,22,23,24,25,26.Bu gözlegimizde, bu saýlama usulynyň diňe bir beýni damarlaryny nyşana alýan peptidleri gönüden-göni kesgitlemek bilen çäklenmän, eýsem gan-beýni barýerinden geçmek üçin işjeň transport häsiýetine eýe bolan dalaşgärleriň tapylmagyna-da giňeltdik.Indi CM intubated syçanlarda “vivo” saýlama prosedurasynyň ösüşini suratlandyrýarys we CSF öý aýratynlyklary bilen peptidleri kesgitlemek mümkinçiligini görkezýäris.12 mer tötänleýin peptidleriň kitaphanasyny görkezýän T7 fazasyny ulanyp, T7 fazasynyň gan-beýni barýerine uýgunlaşyp, gan-beýni barýerinden ýa-da horid pleksusyndan gönüden-göni geçip biljekdigini görkezip bildik.Kanulirlenen CM alakalaryndan CSF hasylynyň “wivo” funksional barlag usulynda gowy gözegçilikde saklanýandygyny we çykarylan fazanyň diňe damar damarlary bilen çäklenmän, gan-beýni barýerinden daşaýjy hökmünde hem işleýändigini gördük.Mundan başga-da, bir wagtyň özünde gan ýygnamak we HTS-ni CSF-den we gan alýan tapgyrlara ulanmak bilen, CSF saýlamagymyzyň gany baýlaşdyrmagy ýa-da seçip alyş tapgyrlarynyň arasynda giňelmek üçin fitnesiň täsir etmeýändigini tassykladyk.Şeýle-de bolsa, gan bölümi saýlama prosedurasynyň bir bölegidir, sebäbi CSF bölümine baryp bilýän fazalar beýnide baýamak üçin ýeterlik derejede ýaşap, gan aýlanyşynda aýlanmalydyr.Çig HTS maglumatlaryndan ygtybarly yzygiderlilik maglumatlary almak üçin, derňew işinde platforma aýratyn yzygiderlilik ýalňyşlyklaryna uýgunlaşdyrylan süzgüçleri amala aşyrdyk.Barlag usulyna kinetiki parametrleri goşmak bilen, 24, 27, 28 ganda ýabany görnüşli T7 fazalarynyň (t½ ~ 28 min) çalt farmakokinetikasyny tassykladyk we ýarym ömrüni minutda serebrospinal suwuklykda (t½ ~ 26 min) kesgitledik.Ganda we CSF-de şuňa meňzeş farmakokinetiki profillere garamazdan, CSF-de fazanyň ganyň konsentrasiýasynyň diňe 0,001% -i ýüze çykarylyp bilner, bu bolsa gan-beýni barýerinden ýabany görnüşli T7 fazasynyň pes fon hereketini görkezýär.Bu iş, esasanam aýlawdan çalt arassalanýan faza ulgamlary üçin “vivo panning” strategiýalaryny ulananyňyzda, birinji tapgyryň ähmiýetini görkezýär, sebäbi az sanly klon CNS bölümine baryp bilýär.Şeýlelik bilen, birinji tapgyrda kitaphananyň dürlüliginiň azalmagy gaty uly boldy, sebäbi bu gaty berk CSF modelinde diňe çäkli mukdarda klon ýygnaldy.“Vivo panning” strategiýasynda CSF bölüminde işjeň ýygnamak, gan bölüminde klonyň diri galmagy we ilkinji 10 minudyň içinde T7 faza klonlaryny gandan çalt aýyrmak ýaly birnäçe saýlama ädimleri bar (1d surat we goşmaça 4M surat).).Şeýlelik bilen, birinji tapgyrdan soň CSF-de dürli faza klonlary ýüze çykaryldy, şol bir başlangyç howuz aýry haýwanlar üçin ulanyldy.Bu, köp sanly kitaphanasy bolan çeşme kitaphanalary üçin birnäçe berk saýlama ädimleriniň dürlüligiň ep-esli azalmagyna sebäp bolýandygyny görkezýär.Şonuň üçin tötänleýin hadysalar, netijä uly täsir edip, başlangyç saýlama prosesiniň aýrylmaz bölegine öwrüler.Asyl kitaphanadaky klonlaryň köpüsinde CSF baýlaşdyryş ähtimallygy gaty meňzeş bolsa gerek.Şeýle-de bolsa, şol bir synag şertlerinde-de başlangyç howuzdaky her bir klonyň azlygy sebäpli saýlama netijeleri tapawutlanyp biler.
CSF-de baýlaşdyrylan sebäpler gandakylardan tapawutlanýar.Gyzykly tarapy, aýry-aýry haýwanlaryň ganynda glisine baý peptidlere tarap ilkinji üýtgeşmäni belledik.(1g surat, goşmaça suratlar 4e, 4f).Glisin peptidleri öz içine alýan faza has durnukly bolup, aýlanyşdan has az bolup biler.Şeýle-de bolsa, glisine baý peptidler serebrospinal suwuklyk nusgalarynda tapylmady, bu kitaphanalaryň iki dürli saýlama ädimini geçendigini görkezýär: biri ganda, beýlekisi serebrospinal suwuklykda ýygnanmaga rugsat berýär.Saýlawyň dördünji tapgyry netijesinde CSF bilen baýlaşdyrylan klonlar giň synagdan geçirildi.Aýry-aýry synag edilen klonlaryň hemmesiniň diýen ýaly boş dolandyryş tapgyry bilen deňeşdirilende CSF-de baýlaşdyrylandygy tassyklandy.Bir peptid urmagy (# 2077) has jikme-jik gözden geçirildi.Beýleki hitler bilen deňeşdirilende has uzyn plazma ýarym ömri görkezdi (3-nji surat we goşmaça 7-nji surat) we gyzykly tarapy, bu peptidiň C terminalynda sistein galyndysy bar.Recentlyakynda sisteiniň peptidlere goşulmagynyň 29-njy albom bilen baglanyşyk arkaly farmakokinetiki aýratynlyklaryny gowulaşdyryp biljekdigi görkezildi.Bu häzirki wagtda peptid # 2077 üçin belli däl we has köp öwrenilmegini talap edýär.Käbir peptidler, T7 kapsidiniň görkezilen ýerüsti geometriýasy bilen baglanyşykly bolup biljek CSF baýlaşdyryşda walent-baglylygy görkezdi (maglumatlar görkezilmeýär).Ulanylan T7 ulgamymyz, her bir bölejik üçin her peptidiň 5-15 nusgasyny görkezdi.IHC, syçanlaryň beýni korteksine wena içine sanjym edilen gurşun fage klonlarynda geçirildi (Goşmaça 8-nji surat).Maglumatlar azyndan üç klonyň (No. 2002, No. 2009 we 77 2077) BBB bilen täsirleşendigini görkezdi.Bu BBB täsiriniň CSF toplanmagyna ýa-da bu klonlaryň göni BCSFB-e geçmegine sebäp bolýarmy ýa-da ýokmy.Möhüm zat, saýlanan peptidleriň sintez edilende we belok ýüklerine bagly bolanda CSF transport kuwwatyny saklaýandygyny görkezýäris.N terminaly biotinilleşdirilen peptidleriň SA bilen baglanyşygy, ganda we serebrospinal suwuklykda degişli fage klonlary bilen alnan netijeleri esasan gaýtalaýar (3e surat).Netijede, 2077-nji ýyldaky gurşun peptidiniň SA-a birikdirilen BACE1-iň biotinilleşdirilen peptid inhibitorynyň beýniniň hereketini ösdürip biljekdigini görkezýäris, CSF-de Abeta40 derejesini ep-esli azaltmak bilen CNS-de aýdyň farmakodinamiki täsirleri döredýär (4-nji surat).Maglumatlar bazasyndaky haýsydyr bir gomology kesgitläp bilmedik, ähli hitleriň peptid yzygiderliligini gomologiýa gözlegini geçirip.T7 kitaphanasynyň ululygynyň takmynan 109, 12 metrlik teoretiki kitaphananyň ululygy 4 x 1015-e deňdigini bellemelidiris. Şonuň üçin 12 mer peptid kitaphanasynyň dürlülik giňişliginiň diňe bir bölegini saýladyk, bu kesgitlenen hitleriň goňşy yzygiderliligini bahalandyryp has optimallaşdyrylan peptidleriň kesgitlenip biljekdigini aňladyp biler.Gipotetiki taýdan, bu peptidleriň tebigy gomologlaryny tapmaýandygymyzyň sebäpleriniň biri, käbir peptid hereketleriniň beýnine gözegçiliksiz girmeginiň öňüni almak üçin ewolýusiýa wagtynda saýlanmagy bolup biler.
Netijelerimiz bilelikde alnanda, beýni-damar barýeriniň transport ulgamlaryny has jikme-jik kesgitlemek we häsiýetlendirmek üçin geljekki işler üçin esas döredýär.Bu usulyň esasy gurnamasy, diňe bir beýni damar baglaýjy häsiýetleri bolan klonlary kesgitlemän, eýsem üstünlikli klonlaryň biologiki päsgelçilikleri CNS bölümine geçirmek üçin içerki işjeňligi bolan möhüm ädim öz içine alýan funksional saýlama strategiýasyna esaslanýar.bu peptidleri daşamagyň mehanizmini we olaryň beýniniň sebtine mahsus mikrowaskulýator bilen baglanyşdyrmak islegini düşündirmekdir.Bu, BBB we reseptorlary daşamak üçin täze ýollaryň tapylmagyna sebäp bolup biler.Kesgitlenen peptidleriň serebrowaskulýar reseptorlary ýa-da BBB ýa-da BCSFB arkaly daşalýan aýlaw baglary bilen gönüden-göni baglanyşyp biljekdigine garaşýarys.Bu işde ýüze çykarylan CSF transport işjeňligi bolan peptid wektorlary hasam öwreniler.Häzirki wagtda bu peptidleriň BBB we / ýa-da BCSFB-den geçmek ukyby üçin beýniniň aýratynlygyny öwrenýäris.Bu täze peptidler täze reseptorlary ýa-da ýollary ýüze çykarmak we biologiýa ýaly makromolekulalary beýnimize ýetirmek üçin täze ýokary netijeli platformalary döretmek üçin örän gymmatly gural bolar.
Öň beýan edilen usulyň üýtgemegi bilen uly sisterany (CM) kanulirläp bilersiňiz.Anestizirlenen Wistar alakalary (200-350 g) stereotaksiki enjamda oturdyldy we kellesini açmak üçin syrylan we aseptiki taýdan taýýarlanan kelläniň üstünde orta kesik edildi.Upperokarky torbanyň meýdanynda iki deşik burawlaň we deşiklere berkidiji nurbatlary berkidiň.Poslamaýan polatdan ýasalan kanula CM-e stereotaktiki ýol görkezmek üçin gapdal oksipital krestde goşmaça deşik burawlandy.Diş sementini kanulanyň töweregine çalyň we nurbat bilen berkidiň.Surat bejermekden we sement gatylaşandan soň, deriniň ýarasy 4/0 supramid tikişi bilen ýapyldy.Cannulanyň dogry ýerleşdirilmegi serebrospinal suwuklygyň (CSF) öz-özünden syzmagy bilen tassyklanýar.Düwürtigi stereotaksiki enjamdan çykaryň, operasiýadan soňky ideg we agyry bejergisini alyň we serebrospinal suwuklykda gan alamatlary ýüze çykýança azyndan bir hepde dikelmegine rugsat beriň.Wistar alakalary (Crl: WI / Han) Çarlz derýasyndan (Fransiýa) alyndy.Atshli syçanlar belli bir patogen şertlerinde saklandy.Animalhli haýwan synaglary Şweýsariýanyň Bazel şäheriniň weterinariýa bölümi tarapyndan tassyklandy we 2474 belgili haýwan ygtyýarnamasyna (Serebrospinal suwuklyk we syçanyň beýnisinde bejeriş kandidatlarynyň derejelerini ölçemek arkaly işjeň beýni transportyna baha bermek) laýyklykda geçirildi.
Elindäki CM kanulasy bilen syçany ýuwaşlyk bilen saklaň.Daturany kanuladan çykaryň we öz-özünden akýan serebrospinal suwuklygy 10 µl ýygnaň.Kannulanyň patenti ahyrsoňy bozulandygy sebäpli, bu gözlegde diňe ganyň hapalanmagyna ýa-da reňklenmegine hiç hili subutnamasy bolmadyk arassa serebrospinal suwuklyk nusgalary girizildi.Muňa ugurdaşlykda, guýrugyň ujundaky kiçijik kesikden heparin (Sigma-Aldrih) turbalaryna takmynan 10–20 μl gan alyndy.CSF we gan T7 fazasyna wena içine sanjymdan soň dürli wagt nokatlarynda ýygnaldy.Her CSF nusgasy ýygnamazdan ozal takmynan 5-10 μl suwuklyk taşlandy, bu bolsa kateteriň ölen mukdaryna laýyk gelýär.
T7Select ulgam gollanmasynda görkezilişi ýaly T7Select 10-3b wektoryny ulanyp kitaphanalar döredildi (Nowagen, Rosenberg we başg., InNovations 6, 1-6, 1996).Gysgaça, tötänleýin 12 mer DNK goýulmagy aşakdaky formatda sintez edildi:
NNK kodony, goşa duralga kodlaryndan we aminokislotadan aşa aşa gysylmazlyk üçin ulanyldy.N her nukleotidiň el bilen garylan ekimolýar gatnaşygy, K bolsa adeniniň we sitosin nukleotidleriniň el bilen garylan ekimolýar gatnaşygydyr.Steke zolakly sebitler Klenow buferinde (Täze Angliýa Biolabs) 37 sagatda 3 sagatlap dNTP (Nowagen) we Klenow fermenti (Täze Angliýa Biolabs) bilen inkubasiýa arkaly iki hatar DNK-a öwrüldi.Reaksiýadan soň EtOH ýagyşy bilen iki hatar DNK dikeldildi.Alnan DNK EcoRI we HindIII çäklendiriji fermentleri bilen özleşdirildi (ikisi Roçeden)..Apylan we arassalanan (QIAquick, Qiagen) goýmasy (T4 ligase, Täze Angliýa Biolabs) soňra 10B kapsid geniniň 348 aminokislotasyndan soň öňünden ýapylan T7 wektoryna çarçuwa bilen birikdirildi.Kazyýet reaksiýalary in vitro gaplamadan 18 sagat öň 16 ° C inkubasiýa edildi.Witro-da faza gaplamasy, T7Select 10-3b klonlaşdyryş toplumy (Nowagen) bilen berlen görkezmelere laýyklykda ýerine ýetirildi we gaplama ergini Escherichia coli (BLT5615, Nowagen) ulanyp lizise bir gezek güýçlendirildi.Lizatlar gliserolyň ätiýaçlyk ergini hökmünde -80 ° C derejesinde merkezden gaçyryldy, titrlendi we doňdy.
Sahypa üýtgeýän sebitleriň göni PCR güýçlendirilmegi, 454 / Roche-amplikon birleşdiriş desgalaryny ulanyp, çorbada ýa-da tabakda güýçlendirilýär.Öňe süýşüriş desgasy üýtgeýän sebitiň (NNK) 12 (şablona mahsus), GS FLX Titan Adapter A we dört esasly kitaphananyň açar yzygiderliligi (TCAG) yzygiderliligini öz içine alýar (Goşmaça 1a surat):
Ters birleşdirme primerinde monjuklary ele almak üçin birikdirilen biotin we emulsiýa PCR wagtynda klon güýçlendirmek üçin zerur GS FLX Titan Adapter B bar:
Soňra amplikonlar 454 GS-FLX Titan protokolyna laýyklykda 454 / Roche pirosekwensiýasyna sezewar edildi.El bilen Sanger yzygiderliligi (amaly biosistemalar Hitachi 3730 xl DNK analizatory) üçin T7 faza DNK PCR tarapyndan güýçlendirildi we aşakdaky başlangyç jübütler bilen yzygiderlilik edildi:
Aýry-aýry nyşanlardan goýlan ýazgylar, “Roche Fast Start DNA polimeraza toplumy” (öndürijiniň görkezmesine laýyklykda) PCR güýçlendirilmegine sezewar edildi.Yssy başlangyjy (95 ° C-de 10 minut) we 35 güýçlendiriji sikl (95 ° C-de 50 s, 50 ° C-de 1 minut we 72 ° C-de 1 minut) ýerine ýetiriň.
Kitaphanalardan tapgyr, ýabany görnüşli faza, CSF we gandan halas edilen faza ýa-da aýry-aýry klonlar Escherichia coli BL5615 inçekesel çorbasynda (Sigma Aldrih) ýa-da 500 sm2 tagamda (Termo Scientific) 4 sagatda 37 ° C-de güýçlendirildi.Tabak, Tris-EDTA buferi (Fluka Analitik) bilen çaýkamak ýa-da steril turbanyň uçlary bilen plitalary ýygnamak arkaly tabaklardan alyndy.Fage, polietilen glikol (PEG 8000) ýagyşy (Promega) bilen medeni adatdan daşary ýa-da çykaryjy buferden izolirlenip, Tris-EDTA buferinde ýerleşdirildi.
Güýçlendirilen faza, wena içine (IV) sanjymdan (500 μl / haýwan) endotoksin aýyrmak monjuklaryny (Miltenyi Biotec) ulanyp, 2-3 gezek endotoksin aýryldy.Birinji tapgyrda 2 × 1012 tapgyr girizildi;ikinjisinde 2 × 1010 tapgyr;üçünji we dördünji saýlama tapgyrlarynda her haýwan üçin 2 × 109 tapgyr.CSF-de fazanyň mazmuny we görkezilen wagt nokatlarynda ýygnanan gan nusgalary öndürijiniň görkezmesine (T7Select system gollanmasy) laýyklykda nyşan sanamak arkaly kesgitlenildi.Fazany saýlamak, arassalanan kitaphanalaryň guýruk damaryna damar sanjylmagy ýa-da öňki seçip alyş tapgyryndan CSF-den alnan fazany täzeden sanjym etmek arkaly geçirildi we soňraky hasyllar degişlilikde CSF we gan nusgalarynda 10 minut, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, we 240 min.Jemi dört tapgyr wivo panning geçirildi, onda saýlanan iki şaha aýratyn saýlandy we ilkinji üç tapgyrda seljerildi.Saýlawyň ilkinji iki tapgyryndan CSF-den alnan ähli fazalar 454 / Roche pirosequensiasiýa edildi, soňky iki tapgyrda CSF-den alnan ähli klonlar el bilen yzygiderlilikde edildi.Saýlawyň birinji tapgyryndaky ähli gan tapgyrlary hem 454 / Roche pirosequencing edildi.Fage klonlaryna sanjym etmek üçin, saýlanan tapgyrlar E. coli (BL5615) 500 sm2 plastinkada 37 ° C-de 4 sagat güýçlendirildi.Aýry-aýry saýlanan we el bilen yzygiderli klonlar inçekesel ýaýrady.Fazany çykarmakdan, arassalamakdan we endotoksini aýyrandan soň (ýokarda görkezilişi ýaly), 300 μl-da 2 × 1010 faza / haýwan bir guýruk damaryna wena içine sanjym edildi.
Yzygiderlilik maglumatlaryny gaýtadan işlemek we hil taýdan süzmek.Çig 454 / Roche maglumatlary ikilik standart akym kartasy formatyndan (sff) satyjy programma üpjünçiligini ulanyp Pearson adam okalýan formata (fasta) öwrüldi.Nukleotid yzygiderliligini mundan beýläk-de gaýtadan işlemek, aşakda görkezilişi ýaly C programmalary we skriptleri (goýberilmedik programma üpjünçiligi bukjasy) ulanylyp geçirildi.Esasy maglumatlaryň derňewi gaty köp basgançakly süzgüç proseduralaryny öz içine alýar.Dogry 12merlik DNK yzygiderliligini öz içine almaýan okalanlary süzmek üçin, okalýan bellik (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), belligi duruzmak (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) we fon goýmak (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGACman)deňleşdirmek üçin 2-e çenli gapma-garşylyga ýol berýän31.Şonuň üçin bellikleri başlamazdan okaň we bellikleri duruzyň we fon ýazgylaryny öz içine alýan okalmalar, ýagny rugsat berlen gabat gelmeýän mukdardan köp hatarlary kitaphanadan aýryldy.Galan okalmalar barada aýdylanda bolsa, başlangyç bellikden uzalýan we togtadyş belgisiniň asyl okalýan yzygiderliliginden çykarylyp, mundan beýläk işlenip taýýarlanylýan (mundan beýläk “goýmak” diýilýär) N-mer DNK yzygiderliligi.Goýmanyň terjimesinden soň, primeriň 5 ′ ujundaky ilkinji duralga kodundan soň bölek goýulýar.Mundan başga-da, primeriň 3 ′ ujunda doly däl kodlara alyp barýan nukleotidler hem aýryldy.Diňe fon yzygiderliligini öz içine alýan goýmalary aýyrmak üçin “PAG” aminokislotanyň nagşy bilen başlanan terjime edilen ýazgylar hem aýryldy.Terjimeden soňky uzynlygy 3 aminokislotadan az bolan peptidler kitaphanadan çykaryldy.Ahyrynda, goýulýan howuzdaky artykmaçlygy aýyryň we her üýtgeşik goýmagyň ýygylygyny kesgitläň.Bu derňewiň netijelerine nukleotid yzygiderliliginiň sanawy (goýmalar) we olaryň (okalýan) ýygylyklary (goşmaça suratlar 1c we 2) goşuldy.
Topar N-mer DNK yzygiderliligi meňzeşligi boýunça goýýar: 454 / Roçe mahsus yzygiderlilik ýalňyşlyklaryny (meselem, gomopolimer giňeltmeleriniň yzygiderliligi bilen baglanyşykly meseleler) ýok etmek we az ähmiýetli artykmaçlyklary aýyrmak üçin öň süzülen N-mer DNK yzygiderliligi (goýmalary) meňzeşlik boýunça tertiplenýär.aşakdaky ýaly kesgitlenen iteratiw algoritmi ulanyp, goýmak (2 gabat gelmeýän esaslara rugsat berilýär): goýmalar ilki bilen ýygylygy (iň ýokarydan iň pes) boýunça tertiplenýär we birmeňzeş bolsa, ikinji derejeli görnüşi boýunça uzynlygy (iň uzynlygy we gysga) boýunça tertiplenýär.Şeýlelik bilen, iň ýygy we iň uzyn goýmalar ilkinji “topary” kesgitleýär.Topar ýygylygy esasy ýygylyga düzüldi.Soňra, tertiplenen sanawda galan her bir goşmaçany “Needleman-Wunsch” deňleşdirmek arkaly topara goşmak synanyşygy edildi.Düzedişdäki gabat gelmeýänleriň, goýulýanlaryň ýa-da pozulmalaryň sany 2 çäkden geçmese, topara bir goşma goşulýar we goýmagyň näçe ýygylygy bilen umumy toparyň ýygylygy ýokarlanýar.Topara goşulan goýmalar ulanylyşy ýaly bellik edilýär we mundan beýläk işlemekden aýrylýar.Goýmak yzygiderliligini eýýäm bar bolan topara goşup bolmaýan bolsa, goýmak yzygiderliligi degişli goýmak ýygylygy bilen täze topar döretmek üçin ulanylýar we ulanylyşy ýaly bellendi.Her goýma yzygiderliligi ýa-da täze topar döretmek üçin ulanylanda ýa-da eýýäm bar bolan topara goşulanda gaýtalama gutarýar.Galyberse-de, nukleotidlerden ybarat toparlaýyn goýmalar ahyrsoňy peptid yzygiderliligine (peptid kitaphanalary) terjime edilýär.Bu derňewiň netijesi yzygiderli okalýanlaryň sanyny düzýän goýmalar we degişli ýygylyklardyr (Goşmaça 2-nji surat).
Motif Generation: Üýtgeşik peptidleriň sanawyna esaslanyp, aşakda görkezilişi ýaly mümkin bolan aminokislotanyň nagyşlaryny (aa) öz içine alýan kitaphana döredildi.3 uzynlygyň mümkin bolan her bir nagşy peptidden alyndy we onuň ters nagşy ähli nagyşlary (tripeptidleri) öz içine alýan umumy motif kitaphanasy bilen bilelikde goşuldy.Gaty gaýtalanýan motifleriň kitaphanalary yzygiderli we artykmaçlyk aýryldy.Soň bolsa, motif kitaphanasyndaky her bir tripeptid üçin hasaplaýyş gurallaryny ulanyp kitaphanada bardygyny barladyk.Bu ýagdaýda tapylan motif tripeptidi öz içine alýan peptidiň ýygylygy goşulýar we motif kitaphanasyndaky motiflere bellenýär (“motifleriň sany”).Motif öndürmegiň netijesi, tripeptidleriň (motifleriň) ýüze çykmagy we degişli bahalary öz içine alýan iki ölçegli massiwdir, okalanlar süzülende, toparlananda we terjime edilende degişli sebäbe sebäp bolýan yzygiderliligiň sanydyr.Aboveokarda jikme-jik beýan edilişi ýaly ölçegler.
Motifleriň we degişli ýaýradylan ýerleriň sanyny kadalaşdyrmak: Her nusga üçin motifleriň sany ulanylyp kadalaşdyryldy
bu ýerde ni mowzugy öz içine alýan okalýanlaryň sany.Şeýlelik bilen, vi nusgadaky i motifini öz içine alýan okalýan göterimleriň (ýa-da peptidleriň) göterim ýygylygyny görkezýär.Adaty bolmadyk sebäpler üçin P-bahalar Fişeriň takyk synagyndan peýdalanyp hasaplandy.Sebäpleriň sanynyň korrelogrammalary barada aýdylanda, Spearmanyň korrelýasiýalary R. bilen kadalaşdyrylan sebäpleriň kömegi bilen hasaplandy.
Peptid kitaphanasyndaky her bir ýagdaýda aminokislotalaryň mazmunyny göz öňüne getirmek üçin 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) web logogrammalary döredildi.Ilki bilen, 12 mer peptidiň her ýagdaýynda aminokislotalaryň düzümi 20 × 12 matrisada saklanýar.Soňra, her pozisiýada birmeňzeş aminokislotany öz içine alýan 1000 peptidler toplumy fasta yzygiderlilik görnüşinde döredilýär we her pozisiýada otnositel aminokislotanyň grafiki şekillendirilişini döredýän web-logo 3-e giriş hökmünde berilýär.berlen peptid kitaphanasy üçin.Köp ölçegli maglumat bazalaryny göz öňüne getirmek üçin R-da içerki ösen gural (biosHeatmap, entek çykarylmaýan R bukjasy) arkaly ýylylyk kartalary döredildi.Heatylylyk kartalarynda görkezilen dendrogrammalar Wardyň ucewklid aralygy ölçegi bilen iýerarhiki toparlanyş usuly bilen hasaplandy.Motif skoring maglumatlarynyň statistik derňewi üçin, Fişeriň takyk synagyndan peýdalanyp, adaty bolmadyk gol üçin P bahalary hasaplandy.Beýleki maglumatlar bazalary üçin P-bahalar R-da Talyp synagy ýa-da ANOVA ulanyp hasaplandy.
Saýlanan fage klonlary we goýulmazdan tapgyrlar, guýruk damaryna (300 μl PBS-de 2 × 1010 faza / haýwan) sanjym edildi.Perfuziýadan we ondan soňky düzedişden on minut öň, şol haýwanlara 100 μl DyLight594 belgili leksiýa (Vektor Laboratories Inc., DL-1177) sanjym edildi.Fage sanjymyndan 60 minut soň, alakalar ýüregiň üsti bilen 50 ml PBS, soňra bolsa 50 ml 4% PFA / PBS bilen arassalandy.Beýni nusgalary 4% PFA / PBS-de bir gije goşmaça düzüldi we bir gije 30 ° sukrozada 4 ° C-e çümdi.OCT garyndysynda nusgalar doňduryldy.Doňdurylan nusgalaryň immunohistohimiki derňewi, 1% BSA bilen bloklanan 30 mk krioseksiýada otag temperaturasynda geçirildi we 4 ° C-de T7 fazasyna (Nowus NB 600-376A) garşy poliklonal FITC belgili antikorlary bilen inkubasiýa edildi.Bir gije inkubasiýa.Ahyrynda bölümler PBS bilen 3 gezek ýuwuldy we konokok lazer mikroskopy (Leica TCS SP5) bilen gözden geçirildi.
Iň az arassalygy 98% bolan ähli peptidler GenScript USA tarapyndan sintez edildi, biotinilleşdirildi we lýofilizasiýa edildi.Biotin, N-terminusda goşmaça üç sany glisin spacer arkaly baglanyşdyrylýar.Masshli spektrometri ulanyp, ähli peptidleri barlaň.
Streptawidin (Sigma S0677), biotinilleşdirilen peptidiň 5 esse ekimolýar artykmaçlygy, biotinilleşdirilen BACE1 inhibitor peptidi ýa-da biotinilleşdirilen BACE1 inhibitor peptidi we BACE1 inhibitor peptidi 5-10% DMSO / inkubasiýa bilen garyndy.Sanjymdan öň otag temperaturasynda 1 sagat.Streptawidin-konýugirlenen peptidler 10 mg / kg dozada, beýni boşlugy bilen syçanlaryň guýruk damarlarynyň birine sanjym edildi.
Streptawidin-peptid toplumlarynyň konsentrasiýasy ELISA tarapyndan bahalandyryldy.Nunc Maxisorp mikrotiter plitalary (Sigma) bir gije 4 ° C-de 1,5 μg / ml syçanjyga garşy streptawidine garşy antikor bilen örtüldi (Termo, MA1-20011).Blokdan soň (blokirleme buferi: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0,25% jelatin, 1% BSA) otag temperaturasynda 2 sagatlap, plastinkany 0,05% Tween-20 / PBS (ýuwujy bufer) bilen 3 sekuntlap ​​ýuwuň, blokirleme buferi (plazma 1: 10,000, CSF 1: 115).Soňra tabak kesgitleýji antikor bilen 4 ° C-den bir gije inkubasiýa edildi (1 μg / ml, anti-streptawidin-HRP, Nowus NB120-7239).Üç ýuwujy ädimden soň, streptawidin TMB substrat ergininde (Roçe) 20 minuda çenli inkubasiýa arkaly ýüze çykaryldy.1M H2SO4 bilen reňk ösüşini togtatanyňyzdan soň, sorulmagy 450 nm ölçäň.
Streptawidin-peptid-BACE1 inhibitor toplumynyň işine öndürijiniň teswirnamasyna (Wako, 294-64701) laýyklykda Aβ (1-40) ELISA baha berildi.Gysgaça, CSF nusgalary adaty diluentde (1:23) suwuklandyryldy we BNT77 antikor bilen örtülen 96 guýy tarelkede bir gije 4 ° C inkubasiýa edildi.Bäş ýuwulandan soň, HRP-konýugirlenen BA27 antikor goşuldy we 4 ° C-de 2 sagatlap inkubasiýa edildi, soň bolsa bäş ýuwmak basgançagy boldy.Aβ (1–40), TMB ergininde otag temperaturasynda 30 minutlap inkubasiýa arkaly ýüze çykaryldy.Stop ergini bilen reňkiň ösüşi togtadylandan soň, sorulmagy 450 nm ölçäň.Plazma nusgalary Aβ (1–40) ELISA-dan öň gaty faza çykarylýar.Plazma 96 guýy tarelkede 0,2% DEA (Sigma) goşuldy we otag temperaturasynda 30 minut inkubasiýa edildi.SPE plitalaryny (Oazis, 186000679) yzygiderli suw we 100% metanol bilen ýuwandan soň, SPE plitalaryna plazma nusgalary goşuldy we ähli suwuklyk aýryldy.Nusgalar ýuwuldy (ilki 5% metanol, soň 30% metanol bilen) we 2% NH4OH / 90% metanol bilen uzaldyldy.Elýady 55 ° C-de 99 minut hemişelik N2 tokda guradylandan soň, nusgalar adaty erginlerde azaldyldy we Aβ (1–40) ýokarda görkezilişi ýaly ölçenildi.
Bu makalany nädip getirmeli: Uriç, E. we ş.m.“Vivo” -de kesgitlenen tranzit peptidleri ulanyp beýnimize ýük eltmek.Ylym.5, 14104;doi: 10.1038 / srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB we Moos T. Makromolekulýar dermanlary maksatly bejergini ulanyp beýnimize gowşurmak.Neýrohimiýa 3urnaly 113, 1–13, 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjewiç, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. we Martinez-Martinez, P. Gan-beýni barýerinden peptid we belok dermanlaryny eltip bermek.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016 / j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Gan-beýni päsgelçiligi: beýniniň neşe serişdeleriniň ösmegindäki päsgelçilik.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602 / neurorx.2.1.3 (2005).
Ansohanson, KE, Dankan, JA, Stopa, EG we Byrd, A. Horoid pleksus-CSF ýoly arkaly neşe serişdelerini gowulaşdyrmagyň we beýnini nyşana almagyň geljegi.Derman gözlegleri, 1011–1037, 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Beýni gowşurmak üçin molekulýar Troýan atlary bilen biofarmasewtikany döwrebaplaşdyrmak.Biokonjug himiýasy 19, 1327–1338, 10.1021 / bc800148t (2008).
Pardridge, WM reseptor-araçy peptid gan-beýni barýerinden geçýär.Endokr Ylham 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. we ş.m.Monowalent molekulýar ştutlary ulanyp, beýniniň aralaşmagyny we bejeriş antikorlarynyň netijeliligini ýokarlandyrmak.Neýron 81, 49–60, 10.1016 / j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Li, N. we ş.m.Transferrin reseptorlary (TfR) transporty, TfR antikorlarynyň ýakynlyk görnüşleriniň beýniniň siňmegini kesgitleýär.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084 / jem.20131660 (2014).